UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FISIOLOGIA VEGETAL

Fred Augusto Lourdo de Brito

RELATRIO DE AULAS PRTICAS

Relatrio apresentado disciplina BVE 687 Mtodos Experimentais em Fisiologia Vegetal, do Programa de Ps-Graduao em Fisiologia Vegetal, como parte dos requisitos para obteno de nota referente s avaliaes.

Docente: Prof. Dr. Cleberson Ribeiro

Viosa MG 2014

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SUMRIO

EXPERIMENTO I - NUTRIO MINERAL EM PLANTAS DE MILHO ........... 3 1 - INTRODUO ..................................................................................................... 3 2 - MATERIAL E MTODOS .................................................................................. 4

2.1 - Obteno e Preparo de Material Vegetal...................................................... 4 2.2 Preparo de Soluo Nutritiva ........................................................................ 5 2.3 Avaliaes ........................................................................................................ 6 2.4 Delineamento Experimental e Tratamento Estatstico ............................... 6

3 RESULTADOS E DISCUSSO .......................................................................... 6 3.1 O pH em solues nutritivas .......................................................................... 6 3.2 Efeito da Omisso e Excesso de Elementos Minerais.................................. 8

Ausncia de Nitrognio ......................................................................................... 8

Ausncia de Fsforo ............................................................................................ 11 Ausncia de Potssio ........................................................................................... 13

Ausncia de Magnsio ......................................................................................... 15 Excesso de Alumnio ............................................................................................ 16

4 CONCLUSES ................................................................................................... 18 5 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. 18 ANEXO 1 ................................................................................................................... 21

EXPERIMENTO II CINTICA DE ABSORO DE NITRATO ..................... 24 1 INTRODUO ................................................................................................... 24 2 MATERIAL E MTODOS ............................................................................... 26

2.1 - Obteno e Preparo de Material Vegetal.................................................... 26 2.2 - Solues nutritivas e Steady Staty ............................................................... 26 2.3 Determinao de absoro inica ............................................................... 27 2.4 Determinao de constantes cinticas ........................................................ 28

3 RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................ 28 4 CONCLUSES ................................................................................................... 33 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................. 33 ANEXO 2 ................................................................................................................... 35

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EXPERIMENTO I - NUTRIO MINERAL EM PLANTAS DE MILHO

1 - INTRODUO

As plantas, ao longo de todos os estgios de desenvolvimento e reproduo, necessitam de uma gama de nutrientes, que so elementos qumicos providos, em grande parte, da matriz do solo (Taiz e Zeiger, 2013). Tais nutrientes, absorvidos da soluo do solo so denominados de elementos minerais essenciais, pois atuam em diversas funes metablicas, de acordo com certos critrios propostos por Arnon e Stout (1939), citado por Barker e Pilbeam (2007). O primeiro critrio que o elemento requerido pela planta para completar seu ciclo. O segundo considera que tal elemento essencial no pode ser substitudo por outro e o terceiro critrio se refere a participao direta desse elemento no metabolismo do vegetal. Nem todos os nutrientes so requeridos em mesmas quantidades, estando classificados em Macronutrientes (queles que so requeridos em maior quantidade - 99,5% da matria seca), so eles em ordem decrescente: N, P, K, Ca, Mg e S; e os Micronutrientes (em menor quantidade 0,03%), sendo: B, Cl, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Zi. Sendo tambm considerados benficos os nutrientes, Na, Se, Si e Co (Epstein e Bloom, 2006). Para as culturas agrcolas, a falta ou excesso de algum desses nutrientes pode acarretar prejuzos s colheitas, j que estes so responsveis por todos os processos metablicos que determinam seu potencial de produo. A capacidade de absorver nutrientes e metaboliz-los determina a eficincia de absoro dos solutos pela planta, convertendo esses elementos em matria seca e possivelmente aumentando a produtividade agrcola (Gondim et al. 2010). A omisso ou o suprimento inadequado de um nutriente faz com que ocorra um distrbio no metabolismo e no funcionamento normal das plantas, externando sintomas de deficincia ou toxidez caractersticos em determinados rgos (Epstein e Bloom, 2006). Esse diagnstico essencial para caracterizar sintomas tpicos de insuficincia ou excesso de certos nutrientes e corrigi-los, quando possvel, em campo. Solues nutritivas, contendo os sais inorgnicos essenciais para as culturas agrcolas (mais conhecidas como hidroponia), fazem parte dos principais mtodos para os estudos sobre a nutrio mineral. Pois a partir das solues com concentraes conhecidas, podem-se aferir as exigncias gerais daquela cultura e determinar quo

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eficiente a absoro e a dinmica dos ons, bem como posteriores ganhos pelas plantas. Dessa forma, podendo inferir as melhores respostas disponibilizao de nutrientes entre diferentes cultivares, garantindo ganhos futuros de produtividade e reduo de custos de produo (Fageria, 1998). Alm de que, o cultivo das plantas sem solos apresentam vantagens devido a praticidade, otimizao de operaes e garantia de respostas ao suprimento nutricional pela soluo nutritiva. Agregando-se a esse fator, est a diagnose dos sintomas pela omisso e/ou excesso de alguns nutrientes, j que no solo ocorre uma heterogeneidade de componentes, podendo haver muitos fatores simultneos (biticos e abiticos) relacionados aos sintomas apresentados, como interao entre nutrientes na matriz do solo, deficincias ou acmulo de elementos na planta induzidos por outros e doenas (Taiz e Zeiger, 2013). Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi de avaliar o efeito da omisso e do excesso de alguns elementos minerais sob o crescimento de plntulas de milho em sistema hidropnico; identificar e caracterizar os sintomas de tais efeitos sob as plantas.

2 - MATERIAL E MTODOS

O experimento foi realizado no Laboratrio de Fisiologia Vegetal, do centro de Cincias Biolgicas e da Sade, da Universidade Federal de Viosa, Viosa, Minas Gerais, no perodo de 05 a 20 de agosto de 2014.

2.1 - Obteno e Preparo de Material Vegetal

Sementes de milho foram selecionadas quanto ao tamanho e forma, tratadas com soluo de cido sulfrico a 98% durante por aproximadamente 1 minutos. Foram lavadas com gua corrente de torneira e posteriormente com gua deionizada. Em seguida, as sementes foram colocadas para germinar em cartuchos de papel Germitest, sendo estes imersos na posio vertical em tubos de PVC contendo 2 litros de soluo de CaCl2 a 0,1 mM. Durante 5 dias at a germinao os vasos foram arejados e permaneceram cobertos com saco plstico preto, para criar condies de umidade apropriadas. A partir da germinao, os vasos foram submetidos radiao fotossinteticamente ativa de 230 moles.m-2.s-1 por um perodo de 16h.

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Aps 8 dias da germinao, 12 plntulas foram selecionadas conforme a uniformidade e tamanho entre raiz e parte area; medidos o comprimento total da planta, da parte area e o comprimento da raiz seminal com auxlio de rgua milimetrada, e distribudas em vasos contendo solues nutritivas.

2.2 Preparo de Soluo Nutritiva

As solues nutritivas foram preparadas de acordo com a soluo de Clark (1975) (Tabela 1), em que os elementos minerais foram colocados, seguidamente aps cada solubilizao, em um recipiente contendo gua deionizada (com 80% do volume final de 5 litros). Foi ajustado o pH da soluo para 5,5 e posteriormente foi completado para o volume final.

Tabela 1. Soluo nutritiva completa de Clark (1975). Macronutrientes (mM)

N-NH4+ N-NO3- Ca K Mg S P 1,0 7,0 2,6 1,8 0,6 0,6 0,069

Micronutrientes (M) Mn Mo B Zn Cu Fe

0,007 0,0006 0,019 0,002 0,0005 0,045

Para determinar os sintomas de deficincia, a soluo nutritiva de Clark foi alterada a partir da omisso de um macronutriente separadamente (ausncia de N; ausncia de P; ausncia de K; ausncia de Mg), e com excesso do elemento txico (Al 200 M) (Ver Anexo I). Cada soluo nutritiva foi colocada em 3 vasos com volume de 1,5 litros. Cada vaso continha 4 plntulas de milho previamente uniformizadas, suspensas em uma superfcie de poliestireno e mantidas com aerao das razes. As plntulas permaneceram em crescimento por 7 dias em soluo nutritiva sob radiao de 230 moles.m-2.s-1 em um fotoperodo de 16 horas. A cada dia o pH das solues era ajustado para 5,5, no entanto o pH dos vasos com Al3+ era ajustado para 4,0.

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2.3 Avaliaes

Aps 7 dias de crescimento em solues nutritivas, foram medidas, com auxlio de rgua milimetrada, o comprimento total da planta, o comprimento da parte area (da regio do coleto at a altura da folha maior e da regio do coleto at a bainha) e o comprimento da raiz seminal. Foram feitas as tipologias dos sintomas externos da parte area e do sistema radicular durante os dias de crescimento. As plntulas foram pesadas sua matria fresca e colocados em estufa a aproximadamente 80 C por 7 dias e posteriormente foram obtidas as matrias secas.

2.4 Delineamento Experimental e Tratamento Estatstico

O delineamento utilizado foi Inteiramente Casualisado (DIC) com trs repeties (trs vasos) com 4 plantas em cada vaso. O experimento contou com 6 tratamentos: Soluo Completa de Clark; Solues com omisso de N; P; K e Mg separadamente e Soluo completa com excesso de Al. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade com auxlio do programa estatstico ASSISTAT 7.7 Beta, para assim comparar as mdias pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

3 RESULTADOS E DISCUSSO

3.1 O pH em solues nutritivas

Ao longo dos 7 dias de aferio do pH, pode-se perceber uma certa tendncia de acidificao da soluo nutritiva (Figura 1) para todos os tratamentos at o 3 dia de avaliao. Este fato pode estar relacionado ao aumento da atividade da H+-ATPase, que por sua vez, pode haver aumentado a extruso de prtons para o meio, aumentando a absoro de ons atravs de canais e transportadores do tipo antiporte ativados pelo potencial de membrana (Marschner, 2012).

7

Dias0 1 2 3 4 5 6 70 1 2 3 4 5 6 7

pH

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

Completo- N- P- K- Mg+ Al

Figura 1 - Valores de pH das solues nutritivas ao longo de 8 dias de crescimento de plntulas de milho.

Pode-se perceber que a partir de 4 dias de crescimento das plntulas, houve um leve aumento dos valores de pH de todas as solues nutritivas com deficincia em macronutrientes, tendo maior aumento do pH para a soluo nutritiva completa. Isso est possivelmente relacionado a atuao de transportadores de alta afinidade, como os de NO3-. Para este caso (nas solues contendo NH4+ e NO3-), o suprimento de nitrognio nas formas NH4+ pode haver reduzido o pH da soluo e quando este estiver absorvido, o pH voltou a subir devido aos transportadores NO3-, que operam em baixas concentraes do on, fazendo que haja o co-transporte de 2H+ / NO3- do meio externo para o interior da clula, basificando o meio (Fernandes, 2006). Para os valores de alumnio na soluo no foram observadas significativas alteraes, contundo observou-se a leve tendncia para diminuio do pH do meio, provavelmente devido a acidificao adicional gerada pela hidrlise do Al em soluo (Vicente et al., 1998).

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3.2 Efeito da Omisso e Excesso de Elementos Minerais

Ausncia de Nitrognio

A omisso de nitrognio na soluo foi o fator que mais restringiu no crescimento da parte area em relao soluo nutritiva completa e outras solues, como quelas em ausncia fsforo e alumnio (Figura 2). Apresentando apenas 36% de crescimento em relao ao seu sistema radicular (Tabela 2). Pode-se perceber que o crescimento das razes em soluo sem nitrognio apresentou crescimento relativamente igual, quando comparado com a ausncia de outros nutrientes.

Elementos

Completo - N - P - K - Mg + Al

RW

(cm

di

a

-1 )

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20P.ARaiz

Figura 2. Taxa de Crescimento Relativo (Rw) da parte area (P.A.) e de raz em plntulas de milho cultivada em soluo nutritiva de Clark (completo) e com omisso de Macronutrientes (N, P, K, Mg) e excesso de Al aps 8 dias de crescimento.

Os mesmos parmetros foram encontrados por Godim et al. (2010) para milho, Prado e Vidal (2008) com cultivo de milheto e em por Avalhaes et al. (2009) no cultivo de capim elefante, ambos em solues nutritivas.

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Tabela 2 Taxa de crescimento relativo (Rw) da parte area (P.A), da Raiz e da Planta Inteira (P.I.) em plantas de milho aos 8 dias em soluo nutritiva de Clark completa e com omisso de Macronutrientes (N, P, K, Mg) e excesso de Al.

*Anlise estatstica a partir do teste de Kruskal Wallis para dados no paramtricos 1Valores seguidos da mesma letra na coluna no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey ao nvel de 5% de probabilidade.

Isso se deve ao fato de que o nitrognio est inteiramente relacionado com a composio de aminocidos, aminas, peptdeos, composio de protenas e cidos nucleicos e constituintes da membrana, bem como participa de diversos processos de absoro e demais processos metablicos: respirao, fotossntese e diferenciao celular (Marschner, 2012), influenciando no crescimento das plantas. Na ausncia do nitrognio, as plantas respondem com diminuio da parte area afetada pela fotossntese, entretanto continuam o consumo de nutrientes pelas razes (Richard-Molard et al., 2008), podendo aumentar o tamanho do sistema radicular. Em relao a matria fresca, as plantas de milho com ausncia em nitrognio tiveram menor contedo de matria fresca da parte area, em relao s outras plantas em soluo nutritiva contendo outros elementos (Figura 3). Esse fato pode estar relacionado ao baixo crescimento ocasionado pela omisso do nitrognio da soluo.

O N intermediador de quase todos os processos metablicos, regulando tambm a absoro de outros ons para dentro da soluo (Prado e Vidal, 2008), bem como no aumento da superfcie da folha e da matria seca da planta, atravs da maior assimilao do CO2 (Khamis, et al. 1990). Esse fator pode ter refletido na biomassa ou menor peso de matria seca da parte area da planta (Figura 4).

Rw (cm dia -1) P.A./RAIZ Solues P.A. Raiz* P.I.

Completo 0,167 a1 0,137 a 0,141 a 0,490 b S/ Nitrognio 0,094 d 0,111 ab 0,107 b 0,357 c

S/Fsforo 0,158 a 0,12 ab 0,13 ab 0,512 b S/ Potssio 0,133 b 0,11 bc 0,11 b 0,516 b

S/ Magnsio 0,114 c 0,113 bc 0,11 b 0,421 bc C/ Alumnio 0,156 a 0,093 c 0,11 ab 0,669 a

CV (%) 9,66 20,16 15,39 18,55

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Completo - N - P - K - Mg + Al

Ma

ssa

Fr

esca

(g)

0

1

2

3

4

5

P.A.Raiz

Figura 3 - Massa Fresca em gramas (g) da parte area (P.A.) e de raz em plntulas de milho cultivada em soluo nutritiva de Clark (Completo) e com omisso de macronutrientes (N, P, K, Mg) e excesso de Al aps 8 dias de crescimento.

Completo - N - P - K - Mg + Al

Ma

ssa

Se

ca (g)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

P.A.Raiz

Figura 4 - Massa seca em gramas (g) da da parte area (P.A.) e de raz em plntulas de milho cultivada em soluo nutritiva de Clark (Completo) e com omisso de macronutrientes (N, P, K, Mg) e excesso de Al aps 8 dias de crescimento.

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O sintoma mais observado nas plantas de milho contendo soluo sem nitrognio, alm de o fentipo apresentar parte area reduzida, foi o desenvolvimento de clorose nas folhas mais velhas, com aparecimento de tons arroxeados seguido para as folhas mais novas; e nas razes ocorreu o desenvolvimento de colorao arroxeada, provavelmente pelo maior acmulo de antocianinas produzidas nas folhas e realocadas nas razes. Sintomas de necrose na folha foram observados a partir do 5 dia de crescimento da planta (Figura 5). Malavolta et al. (1974) afirma que para plantas de cana de acar com deficincia de nitrognio podem apresentar folhas mais velhas menores e avermelhadas.

Figura 5 - Sintomas de omisso de nitrognio (- N) em plantas de milho, comparados com a soluo nutritiva completa de Clark (C), aps 8 dias de crescimento.

Ausncia de Fsforo

A ausncia de fsforo na soluo no afetou significativamente o crescimento da parte area das plntulas de milho durante uma semana em relao ao controle (Figura 2), apresentando o crescimento da parte area foi de 51% em relao raiz (Tabela 2). Possivelmente a ausncia de fsforo no foi fator limitante ao crescimento das plntulas de milho nos dias iniciais de crescimento, pois podem haver utilizado das reservas iniciais providas da semente.

-N C -N C -N C

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Dessa forma, o fsforo pode ser armazenado nas sementes principalmente sob a forma de cido ftico. Em sementes maduras de milho, os teores desse cido confere um contedo de 75 a 80 % de fsforo inorgnico total nas sementes, localizado geralmente no germe (embrio) e em menor quantidade na camada de aleurona (Raboy et al., 2000).

Fernandes (2008) afirma que os sintomas da deficincia de P no apresentam tanta representatividade em relao a ausncia de outros macronutrientes. Afetando principalmente no crescimento tanto de parte area quanto radicular. Em relao massa fresca, a omisso de P na soluo resultou em menores acmulos de massa em relao aos tratamentos com soluo completa e de magnsio, contudo apresentando-se maior que as solues com ausncia de nitrognio e potssio (Figura 3). O mesmo comportamento fora observado para a massa seca da parte area e raiz (Figura 4). Embora com elevado crescimento, o tratamento sem P pode ter causado reduo da expanso foliar, mediado pela decrscimo de diviso celular constituinte essencial da bicamada lipdica da membrana plasmtica (Assuero et al., 2004), resultando em menores massas em relao ao controle. Marschner (2012), aponta que a expanso demasiado prejudicada pela deficincia de P, devido reduo da condutividade hidrulica causado pela menor expresso de genes que codificam aquaporinas. Os sintomas que mais destacaram nas plntulas de milho em soluo sem P foram: aparecimento de tons arroxeados nas nervuras centrais das folhas mais velhas a partir do segundo dia, bem como da colorao verde escura nas folhas a partir do quarto dia (Figura 6). Leves sintomas de reas necrosadas tambm foram localizadas e aparecimento de pequena estria arroxeada nas extremidades das folhas (Anexo 1).

Tais sintomas so tpicos nas fases iniciais de crescimento de plantas sob estas condies de deficincia. Fredeen et al. (1989) aponta que o teor de clorofila por unidade de rea em uma folha no reduzido com a deficincia de fsforo, aumentando sua concentrao na folha, deixando-a com colorao mais escura e sem brilho. A mesma deficincia gera modificaes em rotas biosintticas, aumento a produo de metablitos secundrios, como antocianinas e outros (Malavolta et al., 1997).

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- P C - P C - P C

Figura 6 - Sintomas de omisso de fsforo (- P) em plantas de milho, comparados com a soluo nutritiva completa de Clark (C), aps 8 dias de crescimento.

Ausncia de Potssio

Em se tratando da soluo com omisso de potssio pode-se constatar que influenciou no crescimento relativo da parte area das plantas de milho em comparao com as solues completas e com ausncia de fsforo, e alumnio (Figura 2). Em relao ao crescimento das razes, a ausncia do elemento proporcionou perdas significativas na taxa de crescimento, contudo no variando demasiado em relao s solues com ausncia de outros macronutrientes e ao excesso de alumnio (Tabela 2). A ausncia de potssio na soluo nutritiva causou diminuio da massa fresca da parte area quando comparada as solues completa e com ausncia de P, Mg e Al, apresentando valores aproximados a matria fresca das plantas com omisso de nitrognio (Figura 3). Quando comparado as mdias da matria seca, constatou-se que as razes tiveram menores massas em relao a todos os outros tratamentos (Figura 4). Apresentando tambm baixos valores de massa seca da parte area, embora se igualando a ausncia de nitrognio. Esses dados podem estar relacionados a grande importncia do potssio atuante em importantes rotas do metabolismo, como fotossntese e ativao de enzimas. Gondim et al. (2010) constaram significativas

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reduo do crescimento e massa seca de plantas de milho submetidas a ausncia de potssio. Prado e Vidal (2008) obtiveram perdas significativas do crescimento total e acmulo de biomassa em plntulas de milheto. O mesmo foi observado por Prado et al. (2007), em plantas de sorgo e Avalhaes et al. (2009), para o capim elefante. Os principais sintomas apresentados pelas plntulas de milho foram: ao segundo dia foram observados clorose nas folhas mais velhas, iniciando das pontas e desenvolvendo-se pelas extremidades; colmo e folhas mais curtos que as do tratamento controle; ao terceiro e quarto dia, houve a presena de gutao na maioria das plantas dos trs vasos (Anexo 1). O avano dos sintomas se prolongou, havendo incio de necrose aos 7 dias de manuteno em soluo nutritiva (Figura 7).

Figura 7 - Sintomas de omisso de Potssio (- K) em plantas de milho, comparados com a soluo nutritiva completa de Clark (C), aps 8 dias de crescimento.

A partir desses resultados se podem inferir sobre a elevada importncia desse nutriente na planta, agindo sobre a ativao de enzimas, sntese proteica e fotossntese, e contribuindo para a entrada de outros ons para o protoplasto, regulando substancialmente o potencial osmtico das clulas e manuteno da turgescncia (Marschner, 2012).

Dessa forma, a ausncia desse nutriente, reduz expressivamente a presso de turgor, o tamanho das clulas e expanso da rea foliar. Associado a isso, a omisso do potssio pode ser um dos fatores responsveis pela gutao, que possivelmente

- K C - K C - K C

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contribuiu para o desajuste osmtico (entrada desregulada de ons e gua), acompanhado de uma alta umidade relativa do ambiente e elevada concentrao de solutos nas razes.

Ausncia de Magnsio

Plntulas de milho mantidas em soluo nutritiva com omisso de Mg apresentaram, ao oitavo dia, reduo significativa da taxa de crescimento da parte area em relao as plntulas em soluo completa, com omisso de P, K e com excesso de Al (Figura 2). J em relao taxa de crescimento do sistema radicular, observou-se que houve reduo do crescimento em relao ao tratamento controle, contudo mantendo-se igual aos tratamentos com ausncia de K e P (Tabela 2). A ausncia de magnsio pode ocasionar reduo da taxa fotossinttica pela inibio da assimilao de CO2, mesmo com contedo de clorofila suficiente; alm de reduzir a atividade de enzimas, como a ATPase (Marschner, 2012; Fernandes, 2006). Pode observar que mesmo com o pouco crescimento relativo das plntulas submetidas s condies de ausncia de tal elemento, no afetou perda da matria fresca e seca da parte area e da raiz quando comparados com o tratamento com soluo completa de Clark (Figura 3 e 4). Gondim et al (2010), aponta efeitos negativos da omisso de Mg em relao ao acmulo de biomassa em plantas de milho. O mesmo foi observado por Prado et al. (2010) em plantas de soja e Prado et al. (2007) em plntulas de sorgo. Contudo, a ausncia do Mg no afetou a massa seca e nmero de folhas em plntulas de milheto, reduzindo apenas a altura das mesmas (Prado e Vidal, 2008). Os sintomas caractersticos apresentados no crescimento inicial do milho sob ausncia de Mg foram: Incio de clorose internerval nas folhas velhas aos 3 dias em soluo nutritiva, avanando-se para necrose do tecido. A ausncia desse nutriente tambm influenciou no desenvolvimento das razes, deixando-as com menor nmero de razes secundrias (Figura 8).

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Figura 8 - Sintomas de omisso de Magnsio (- Mg) em plantas de milho, comparados com a soluo nutritiva completa de Clark (C), aps 8 dias de crescimento.

Excesso de Alumnio

Em se tratando do excesso de alumnio em soluo, pode-se inferir que a presena desse elemento, quando comparado soluo completa de Clark com ausncia do mesmo, no influenciou na taxa de crescimento relativo da parte area. Apresentando tamanho semelhante tambm ao tratamento com ausncia de P (Tabela 2). Entretanto, o crescimento de razes foi severamente afetado quando comparado aos outros tratamentos com ausncia desse elemento. A massa fresca das plantas obtidas sob estresse do alumnio em soluo apresentou reduo, ao final de 8 dias de crescimento, em relao ao tratamento controle. Logo, sempre apresentando massa fresca de raiz mais baixa que na parte area (Figura 3).

A simples presena do alumnio pode causar uma srie de danos fisiolgicos as plantas, pois este elemento ao ser absorvido, pode se acumular nas razes, causando inicialmente reduo da elongao celular do meristema do sistema radicular em plantas de milho aps apenas 30 min de exposio ao alumnio (Llugany et al., 1995), havendo posteriormente reduo do crescimento das razes, mudana na arquitetura das mesmas e absoro de nutrientes, afetando pois o crescimento da parte area (Fageria et al., 1988; Vicente et al., 1998).

- Mg C - Mg C - Mg C

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+ Al C + Al C + Al C

O excesso do alumnio provocou a reduo da massa seca das razes, quando comparado a tratamento controle e as demais solues nutritivas, apresentando-se apenas superior ao tratamento com ausncia de potssio em soluo (Figura 4). Esse um sintoma tpico de plantas afetadas por elevadas concentraes de alumnio, pois este afeta diretamente a biomassa radicular, nmero de razes, podendo-se pois aumentar o raio mdio das razes pelo engrossamento das mesmas, deixando tambm as razes laterais mais quebradias, pequenas e arredondadas (Braccini et al., 1998; iamporov, 2002) Os sintomas apresentados pelas plantas submetidas ao estresse de alumnio ao longo de oito dias foram o aparecimento geral de clorose nas folhas mais velhas nos primeiros dias de cultivo, se intensificando, apresentando cloroses internervais nas folhas mais velhas 5 dia em soluo (Figura 9). O desenvolvimento das razes foi totalmente comprometido, apresentando poucas razes laterais pequenas, que se apresentaram finas e quebradias de colorao mais amarelada, em relao ao tratamento controle e pontas mais arredondadas (Figura 9).

Figura 9 - Sintomas de omisso de Magnsio (- Mg) em plantas de milho, comparados com a soluo nutritiva completa de Clark (C), aps 8 dias de crescimento.

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4 CONCLUSES

Diante do exposto pode-se concluir que a omisso de elementos essenciais N, P, K, Mg e a presena em elevadas concentraes de Al afeta diretamente o crescimento e desenvolvimento de plntulas de milho em soluo nutritiva, a curto ou a longo prazo. Destacando-se a importncia de tais elementos nos processos bioqumicos e fisiolgicos para completar as etapas metablicas. A ausncia de macronutrientes e a toxidez de alumnio resultaram na expresso fenotpica de sintomas caractersticos de plantas nessas condies de estresse, podendo identifica-los e distingui-los, podendo associar cada sintoma com a funcionalidade do elemento mineral no metabolismo vegetal.

5 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Assuero et al., The decrease in growth of phosphorus-deficient maize leaves is related to a lower cell production. Plant Cell Environ. 27. 887-895. 2004.

Avalhaes, C. C.; Prado, R. M.; Rozane, D. E.: Romualdo, L. M.; Correia, M. A. R. Omisso de macronutrientes no crescimento e no estado nutricional de capim-elefante (cv. Mott) cultivado em soluo nutritiva. Scientia Agraria, Curitiba, v. 10, n. 3, p. 215-222, Maio/Jun. 2009.

Barber, A.V. & Pilbeam, D.J. Handbook of Plant Nutrition. 2007. 613 p.

Braccini, M.C.L.; Martinez, H. E. P.; Pereira, P. R. G.; Sampaio, N. F.; Silva, E. A. M. Tolerncia de gentipos de cafeeiro ao alumnio em soluo nutritiva. I. Crescimento e desenvolvimento da parte area e sistema radicular. R. Bras. Ci. Solo, v. 22, p. 435-442, 1998.

iamporov, M. Morphological and structural responses of plant roots to aluminium at organ, tissue and cellular levels. Biol. Plant. 45:161-171, 2002.

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19

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21

ANEXO 1

1 - SINTOMAS DE DEFICINCIA DE NUTRIENTES Soluo sem Fsforo

Figura Sintoma de deficincia em fsforo. Setas indicam arroxeamento do pecodo e inccio do arroxeamento nas extemidades das folhas mais velhas.

Soluo sem Potssio

Figura Gutao em folhas de milho (indicadas em setas) cultivadas em soluo de Clark com omisso de potssio.

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2 - CLCULO DE SOLUO NUTRITIVA COM AUSNCIA DE FSFORO

Para a soluo de Clark foi utilizado o os seguintes sais para os macronutrientes:

Tabela Peso molecular de respectivos sais utilizados em soluo de Clark com omisso de Fsforo.

SAIS MINERAIS PM Ca(NO3)2.4H2O 236,16

NH4NO3 80,04

KNO3 101,10

KCl 74,55

MgSO4.7H2O 246,50

A partir da frmula abaixo, obtm-se a massa do sal correspondente:

=

Macronutrientes

1) Ca(NO3)2.4H2O = 0,0026 * 236,16* 5 = 3,07 g 2) NH4NO3 = 0,001 * 80,046 * 5 = 0,4002 g 3) KNO3 = 0,0008 * 101,10 * 5 = 0,4044 g 4) MgSO4.7H2O = 0,0006 * 246,50 * 5 = 0,740 g 5) KCl = 0,001 * 74,55 * 5 = 0,37275 g

Micronutrientes

Sem Ferro

1 mL de soluo estoque (1000 vezes concentrada) / 1 L soluo V(L) = 5 mL/ 5 L soluo

FeNa EDTA (Soluo estoque 90 mM, PM = 367,10) Fe = 0,045 mM

C1V1 = C2V2

90 * V1 = 0,045 mM * 5 (L) V1 = 2,5 mL

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Tabela - Peso e volume de sais minerais utilizados em solues nutritivas.

Sais Minerais Soluo Completa -N -P -K -Mg +Al

Ca(NO3).4H20 3,07 - 3,07 3,07 3,07 3,07 NH4NO3 0,4 - 0,4 0,4 0,4 0,4

KNO3 0,404 - 0,404 - 0,404 0,404

KH2PO4 0,047 0,047 - - 0,047 0,047

MgSO4.7H20 0,739 0,739 0,739 0,739 - 0,739

KCl 0,347 0,645 0,373 - 0,347 0,347

Na2SO4 - - - - 0,426 -

NaSO3 - - - 0,340 - -

NaH2PO4 - - - 0,048 - -

CaCl2 - 1,911 - - - -

AlCl3 - - - - - 0,136

FeNa-EDTA (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Micronutrientes

(mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

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EXPERIMENTO II CINTICA DE ABSORO DE NITRATO

1 INTRODUO

Os principais mecanismos que regulam a absoro de ons atravs das membranas plasmticas se do atravs de protenas de transporte que facilitam a passagem dos ons pela bicamada fosfolipdica (poro apolar) das clulas.

Segundo Taiz e Zeiger (2013), esses mecanismos podem estar envolvendo dois tipos de protenas transportadoras, que so os canais, que atuam no transporte massivo de ons atravs da abertura ou um poro em um stio da protena, que controlado pelo potencial de membrana, gerado pelo gradiente de prtons a partir da bomba H+ATPase. Este processo se d pelo transporte de ons a favor do seu gradiente de potencial eletroqumico, no sendo saturvel com a concentrao do on.

Outro mecanismo se d pelos transportadores ou carregadores. So protenas que possuem elevada especificidade em relao ao transporte dos ons. Estas possuem a capacidade de mudana conformacional para transportar as substncias contra os seus potenciais eletroqumicos (transporte ativo). Utilizam da energia gerada pela fora-motriz de prtons produzida pela bomba H+ATPase (Marschner, 2012). Geralmente atuam em baixas concentraes do on na soluo, de modo que o aumento da absoro do on no linear ao aumento da concentrao, havendo saturao da protena e diminuio velocidade de absoro do on. Certa absoro de ons para o interior das clulas por transportadores foi relacionada por Epstein e Hagen (1952), com o mecanismo de cintica da interao enzima-substrato executada por Michaelis e Menten (1913). De tal forma que foi estabelecido que:

= []

+ []

Onde: v velocidade de absoro do on ou influxo de ons; Km - Constante de Michaelis e Menten (concentrao do ons que corresponte a metade da velocidade mxima); Reflete o grau de afinidade do on com o transportador. Vmax - velocidade mxima de absoro. Indicativo de que todos os stios de ligao esto saturados.

25

O influxo de nutrientes pode ser afetado por distintos padres morfolgicos das razes, que, por sua vez, podem alterar os parmetros cinticos de espcies e cultivares quanto a absoro dos ons, podendo estabelecer relao direta com a rea e o comprimento das razes (Baptista, et al. 2000). Outros fatores tambm influenciam no processo de absoro inica, como exemplo: idade da planta; concentrao de ons nas plantas; inibio pela ausncia de outros elementos; presena de elementos txicos e gentipos vegetais (Horn et al. 2006; Rufty Jr et al., 1990). Entre as tcnicas mais utilizadas para observar e estimar constantes cinticas em plantas est a tcnica proposta por Epstein et al., (1963) e por Claassen e Barber (1974). A primeira consiste em um mtodo rpido de avaliao da absoro de diferentes concentraes um istopo radioativo em pequenos segmentos de razes (aproximadamente 1 cm) em um breve intervalo de tempo. Por outro lado, a segunda tcnica baseia-se na taxa de depleo de um nutriente (tcnica de esgotamento) em soluo a partir de uma srie de intervalos de tempo, caracterizando o fluxo de absoro de nutrientes pelas razes de plantas inteiras.

Dentre os elementos essenciais absorvidos pelas razes, o NO3- absorvido atravs das membranas contra o gradiente de potencial eletroqumico, que por meio de um mecanismo simporte, atua no aumento do pH da soluo nutritiva pela absoro de 2H+ (Marschner, 2012).

A taxa de absoro de NO3- em soluo depende da concentrao desse nutriente no meio. De modo que a absoro do on, por tais transportadores especficos, em plantas de pequeno porte, se d em concentraes abaixo de 100 M (Steingrobe e Schenk, 1993). Isso permite o uso de parmetros cinticos de Michaelis-Menten para o estudo da absoro desse elemento em plantas cultivadas. Diante disso, o objetivo desse experimento foi caracterizar os parmetros cinticos da absoro de Nitrato em plntulas inteiras de milho atravs da tcnica de esgotamento, destacando a importncia desses parmetros para absoro especfica de ons.

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2 MATERIAL E MTODOS

O experimento foi realizado no Laboratrio de Fisiologia Vegetal, do centro de Cincias Biolgicas e da Sade, da Universidade Federal de Viosa, Viosa, Minas Gerais, no perodo de 20 de agosto a 03 de setembro de 2014.

2.1 - Obteno e Preparo de Material Vegetal

Sementes de milho foram selecionadas quanto ao tamanho e forma, tratadas com soluo de cido sulfrico a 98% durante por aproximadamente 1 minutos. Foram lavadas com gua corrente de torneira e posteriormente com gua deionizada. Em seguida, as sementes foram colocadas para germinar em cartuchos de papel Germitest, sendo estes imersos na posio vertical em tubos de PVC contendo aproximadamente 2 litros de soluo de CaCl2 a 0,1 mM. Os vasos foram arejados e permaneceram cobertos com saco plstico preto, para criar condies de umidade apropriadas durante 5 dias para germinar. A partir da germinao, os vasos foram submetidos radiao fotossinteticamente ativa de aproximadamente 230 moles.m-2.s-1 por um perodo de 16h.

2.2 - Solues nutritivas e Steady Staty

Aps 8 dias da germinao, foram selecionadas plntulas conforme a uniformidade e tamanho entre raiz e parte area; distribudas em vaso (12 plntulas por vaso) contendo soluo nutritiva de Clark (1975) (pH 5,5; 1,6 L por vaso) por 5 dias (com uma reposio ao 3 dia), com aclimatao a um fotoperodo de 12 horas sob radiao fotossinteticamente ativa de aproximadamente 230 moles.m-2.s-1, aerao das razes.

Aps o 5 dia a soluo nutritiva completa foi substituda por uma soluo de Clark modificada, contendo apenas 100 M de NO3- pelo perodo de um dia. Logo aps esse perodo as plantas foram transferidas a um recipiente de vidro (pintado de preto), colocadas em 500 mL de soluo contendo 100 M de KNO3 e CaCl2 (pH 5,5). Essa soluo foi reposta a cada 8 horas em um perodo de um dia, para obteno da condio de Steady State (Figura 1).

27

Figura 1. Plntulas de milho em soluo de Steady State.

2.3 Determinao de absoro inica

Aps 3 reposies da soluo de Steady State, as plntulas de milho foram selecionadas e distribudas em grupos de 6 e 9 plntulas, de acordo com o peso das razes, e foi feita a ultima reposio da soluo de 100 M de KNO3 e CaCl2 (pH 5,5), determinando-se o tempo inicial de absoro do NO3-. Foi determinado o peso do recipiente/soluo, para possvel aferio da perda por evatotranspirao.

Para cada tempo determinado, foi retirado uma alquota de 2 mL da soluo de KNO3 e feitos as leituras em espectrofotmetro a 210 nm. Com os resultados das leituras, foi quantificada a concentrao de NO3- a partir da curva padro de KNO3 (Anexo 2). Os tempos de amostragem para cada alquota de 2 mL, para grupo contendo 6 plntulas foi de 0; 15; 30; 45; 60; 90; 120; 180; 240; 300; 360; 420 e 480 min. Para cada amostragem foi reposta 2 mL de gua deionizada. Aps leituras das amostras foi determinado o peso final do recipiente de vidro/soluo; feito a pesagem da matria seca das razes para determinao das constantes cinticas de absoro.

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2.4 Determinao de constantes cinticas

A partir das leituras espectrofotomtricas foi determinada a quantidade (Q) de NO3- (mol) naquela soluo e confeccionado a curva de esgotamento pelo mtodo grfico-matemtico (Ruiz, 1985). A partir dos valores de amostragem, peso inicial e final das solues, volume total da alquota e peso de matria seca foi estimado as constantes cinticas Vmax, Cmin e Km. Todos esses parmetros cinticos foram determinados com auxlio do software CinticaWin (verso 1.0), tendo por base a curva de esgotamento, com o melhor ajuste da reta.

Os dados para a elaborao da curva de esgotamento e estimativa das constantes cinticas esto dispostos na tabela 1.

Tabela 1. Parmetros necessrios para elaborao de curva de esgotamento e clculo de constantes cinticas.

Volume Inicial (L)

Volume Final (L)

Vol. total amostra (L)

Vol. /hora (L) Durao (h)

Massa seca

Raiz (g) 0,497 0,489 0,024 8,0 0,002 0,561

3 RESULTADOS E DISCUSSO

De acordo com os resultados obtidos das concentraes do on em soluo a cada tempo estabelecido, observou-se que o perodo de estabilizao ou de concentrao mnima do NO3- em soluo para razes de 6 plntulas foi de aproximadamente as 7 horas aps o incio da absoro (Tabela 2).

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Tabela 2. Concentrao de nitrato em soluo, em funo do tempo de absoro por razes de 6 plntulas de milho.

Tempo (horas) NO3- (M) 0,0 100,12

0,25 97,59 0,50 94,81 0,75 94,45 1,0 85,54 1,5 77,83 2,0 70,36 3,0 58,07 4,0 44,09 5,0 34,22 6,0 30,24 7,0 25,06 8,0 23,97

Os dados obtidos a partir das concentraes do nutriente e o tempo de amostragem permitem a elaborao da curva de esgotamento do elemento na soluo. A curva foi gerada a partir do mtodo de Ruiz (1985) e mostra a quantidade de nutrientes absorvidos por uma massa de razes conhecida em um determinado volume do recipiente (Figura 2). A equao que apresentou melhor ajuste foi o linear e exponencial.

Figura 2. Curva de esgotamento de NO3-, em funo da concentrao Q (mol) e Tempo de absoro (horas) para uma massa de razes de 6 plntulas de milho.

Linear: Q = 49,7783 - 5,26 t R2 = 0,999 Exponencial: Q = 51,7065* e (t* - 0,199) R2 = 0,986

30

Relacionando os mesmos parmetros de absoro inica de 9 plntulas de milho (dados no mostrados), pode-se observar que o tempo mdio para a estabilizao das concentraes (regio de patamar) de 4 horas. Isso significa que a concentrao mnima foi atingida mais rapidamente quando comparado ao tratamento com 6 plntulas em vaso. Dessa forma, este fator pode estar diretamente relacionado ao volume e matria seca radicular. Destacando-se que o volume de 9 plntulas pode permitir uma disponibilidade de transportadores e rea superficial de absoro maiores que em 6 plntulas.

A obteno das constantes cinticas de absoro inica para razes de 6 e 9 plntulas esto dispostas na tabela 3 e expressam o grau de afinidade entre os transportadores e o nitrato em soluo sob baixas concentraes.

Tabela 3. Constantes cinticas de Michaelis-Menten (1913) obtidos pelo mtodo Grfico-Matemtico (Ruiz, 1985) a partir do software CinticaWin.

6 plntulas 9 plntulas1

Vmax (mol g-1 h-1) 9,3761 25,2491 Cmin (mol L-1) 23,97 10,361

tm (h) 6,85 2,13 Qm (mol) 13,16 10,7775

Km (mol L-1) 26,47 21,68 1Ajuste linear (Q = 49,9757 18,6086*t R2 = 0,9994) e exponencial-recproco (Q= 1,7115* e (3,9221/t) R2= 0,9377).

Com tais resultados pode-se destacar que o Vmax atingido pela absoro de nitrato por 6 plntulas foi de 9,37 mol.g-1h-1, estando aproximadamente 2,7 vezes com menor velocidade que a velocidade apresentada por 9 plntulas em soluo de esgotamento. Os valores de Km tambm refletem o grau de afinidade entre os tratamentos apresentando volume radicular por 9 plntulas de milho. Embora que numericamente, tais valores apresentam-se aproximados, o nmero de 6 plntulas proporcionou um menor grau de afinidade ou especificidade entre a protena transportadora e o on. De acordo com a aplicao dos parmetros cinticos enzimticos propostos por Michaeli-Menten foi possvel demonstrar a estimativa da absoro do Nitrato em

31

pequenas concentraes. Este modelo permitiu o preparado da isoterma de absoro para um volume radicular contendo 6 plntulas e 9 plntulas (Figura 3).

Nitrato (M)0 20 40 60 80 100

v (

mo

les

g-1

h-1 )

0

2

4

6

8

Km

0,5 Vmax

Vmax

26,47

9,37

A

Nitrato (M)0 20 40 60 80 100

v (

mo

les

g-1

h-1 )

0

5

10

15

20

25

Km

0,5 Vmax

Vmax

21,68

25,25

B

Figura 3. Isoterma de absoro de nitrato - v (velocidade de absoro - moles g-1h-1) e concentrao de nitrato (M) - para volumes contendo seis plntulas (A) e nove plntulas (B).

Nota-se, pois uma expressiva diferena na velocidade de absoro do nitrato quando ocorre o aumento da massa das razes (Figura 3). Isso pode est relacionado a atividade diferenciada das protenas carregadoras, pois estas apresentam comportamento de absoro variada, embora apresentem mesmas concentraes. Esse fato pode tambm est relacionado ao fator correspondente entre o volume das razes, bem como a possibilidade de algum estresse causado por danos mecnicos no sistema radicular, ou outra parte do vegetal de tal forma que induziu menor afinidade de ligao entre os stios das protenas e, sobretudo menor velocidade de absoro. Esse fator pode ser comparativo a um mesmo grupo de 6 plntulas de milho que quando avaliado a cintica de absoro de ons (dados no mostrados), observou-se que o Vmax atingiu valores de 26,61 mol.g-1h-1, com Km relativamente semelhante (27,08 mol.L-1). Alves et al. (1998) caracterizaram gentipos de milho quanto a cintica de absoro de nitrato e observaram que o valor mdio de absoro foi de 30,98 moles g-1h-1, no entanto a aplicao de alumnio em soluo reduziu essa taxa de absoro a

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13,57 moles g-1h-1. Destacando-se o efeito do estresse causado pela toxidez de alumnio.

Para Horn et al. (2006), o influxo mximo (Vmax) de nitrato em gentipos diferentes de milho foi de 63 moles g-1h-1, apresentando Km variante de 5 a 17 mol.L-1, podendo-se inferir que diferenas morfolgicas afetam tambm a absoro de ons.

Hole et al. (1990) afirma que a velocidade de absoro de nitrato por razes de milho depende provavelmente da atividade do transportador, bem como a velocidade mxima (Vmax) pode estar relacionado com o maior volume de protenas transportadoras, ou atravs da maior sntese das protenas por unidade de peso das razes.

A principal forma de absoro de nitrato ocorre a partir da transportadores de alta e baixa afinidade. Alguns desses transportadores j fazem parte da constituio da membrana e outros so induzidos pela concentrao de nitrato na parte area, que favorecem o aumento de expresso gnica dos transportadores de alta afinidade (Santos, 2006). Existem trs transportadores de absoro de nitrato que apresentam diferenas entre suas propriedades cinticas. Um sistema de transporte de baixa afinidade (LATS Low Affinity Transport System), sob concentraes em soluo de 1 mmol L-1, e dois sistemas de alta afinidade (HATS High Affinity Transport System) que esto subdivididos de acordo com a concentrao externa do nitrato, podendo ser estes constituintes da membrana plasmtica (cHATS) e os induzidos por concentraes de nitrato em soluo muito baixas (iHATS). Os cHATS possuem maior afinidade (Km em torno de 6 a 20 M) quando comparado ao iHATS (Km entre13-79 M). (Aslam et al., 1992; King et al., 1993; Forde, 2000). Dessa forma, analisando as caractersticas de tais transportadores, pode haver ocorrido atuao das protenas HATS, pois estas apresentam-se com maior atividade em baixas concentraes de Nitrato, no se podendo afirmar com exatido sobre a atuao de qual transportador est em maior atuao, tendo em vista que a massa de razes de 6 e 9 plntulas partiram de um mesmo volume e concentrao inicial de nitrato.

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4 CONCLUSES

Diante do exposto pode-se concluir que a absoro de nitrato ajustou-se ao modelo proposto por Michaelis-Menten (1913), e como implicao prtica obteve-se os valores de parmetros cinticos de absoro (Vmax, Cmin e Km) e a isoterma de absoro de nitrato.

O volume de razes em soluo influenciou diretamente na velocidade mxima de absoro de nitrato em soluo. Embora que baixos valores de Vmax em soluo contendo 6 plntulas podem tambm estar relacionados com danos causados nas razes ou em parte area da planta.

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ANEXO 2

1 - CURVA PADRO DE KNO3

A curva padro de KNO3 foi preparada a partir de uma soluo de 100 mL contendo 10 mM, em que foram retirados os padres nas concentraes de: 12,5; 25; 50; 75 e 100 M. Lidos em espectrofotmetro a uma absorbncia de 210 nm.

Os valores de absorbncia foram tratados estatisticamente atravs da equao de regresso (Figura).

Figura - Curva padro de concentrao de KNO3 em funo de valores de absorbncia a 210 nm.

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2 ABSORO DO NITRATO (TCNICA DO ESGOTAMENTO)

Figura Retirada de alquota de 2 mL da soluo de KNO3 (A); Leitura de alquota em cubeta de quartzo por meio de espectrofometria (B e C).