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Receptores 5HT1 e 5HT2 modulam a atividade simpática e os efeitos cardiorespiratórios induzidos
pela administração central de serotonina
Maya Sampaio Garcia
Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Centro de Ciências da Saúde Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, junho de 2007
Livros Grátis
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1
Receptores 5HT1 e 5HT2 modulam a atividade simpática e os efeitos cardiorespiratórios induzidos
pela administração central de serotonina
Maya Sampaio Garcia
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 22/06/2007 por:
__________________________________________________ Prof. Dr. Henrique de Azevedo Futuro Neto - Orientador, UFES
__________________________________________________ Prof. Dr. José Guilherme Pinheiro Pires - Co-orientador, UFES
_________________________________________________ Prof. Dr. Nyam Florencio da Silva, UFES
_________________________________________________ Prof. Drª. Cássia Marta de Toledo Bergamashi, UNIFESP, SP
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
Vitória, junho de 2007
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Garcia, Maya Sampaio, 1981. Receptores 5HT1 e 5HT2 modulam a atividade simpática e os efeitos cardiorespiratórios induzidos pela administração central de serotonina. [Vitória] 2007. xviii, 99p., 29,7 cm (UFES, M. Sc., Ciências Fisiológicas, 2007 ). Dissertação, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF.
3
Aos meus pais Antônio Carlos
Garcia e Marisa Sampaio, pelo
incentivo, amor e dedicação que tanto
me influenciaram para o crescimento
pessoal, espiritual e profissional. Ao
meu noivo Sergio Dias que acreditou
na minha competência, me
depositando coragem e perseverança
para a conclusão desse trabalho.
4
AGRADECIMENTOS
• Ao meu orientador Prof. Henrique de Azevedo Futuro Neto, pela sua
amizade, competência, disponibilidade em me orientar e pelas
condições oferecidas para a realização desse trabalho.
• Ao Prof. José Guilherme Pinheiro Pires, pela sua grande simpatia e a
importante ajuda técnica e didática.
• Ao Prof. Nyam Florencio da Silva, pela amizade e a valiosa ajuda e
atenção a mim concedida durante a execução dos experimentos.
• A Drª Rosimar Alvarenga e Maria das Graças Corrêa pela grande
simpatia, amizade, acolhimento, carinho e ensino que muito contribuiu
para o avanço da minha pesquisa.
• Ao biólogo Mario Dantas, pela sua amizade, disponibilidade e ajuda
técnica proporcionada durante a realização desse trabalho.
• Aos amigos do laboratório de neurofisiologia, pela amizade e pelos bons
momentos de convívio, na qual sentirei saudades.
• A todos os funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo pela dedicação e
incentivo oferecido aos alunos.
• Aos meus pais, familiares, amigos e meu noivo por todo o incentivo,
carinho e amor dedicado durante toda a minha vida.
• Aos animais, na qual através de suas vidas temos a oportunidade de
evoluir na ciência. Sem vocês não conseguiríamos adquirir novas
descobertas.
5
• A CAPES, pela bolsa de mestrado concedida durante a realização desse
projeto.
6
“Determinação, coragem e
autoconfiança são fatores decisivos para
o sucesso. Não importam quais sejam
os obstáculos e as dificuldades. Se
estivermos possuídos de uma inabalável
determinação, conseguiremos superá-
los. Independente das circunstâncias
devemos ser sempre humildes,
recatados e despidos de orgulho.”
Dalai Lama
7
RESUMO
Ativações de receptores serotoninérgicos centrais estão envolvidas na gênese
das respostas cardiovasculares e respiratórias. Diversos trabalhos têm
demonstrado que aplicação de serotonina (5HT) intracerebroventricular (i.c.v)
promove hipertensão, justificada pelos receptores: 5HT1A 1D, e 5HT2A,2B. Pouco
se conhecem sobre a participação do nervo renal nas respostas a 5HT i.c.v,
assim como as respostas cardiorespiratórias e renais às injeções intracisternais
(i.c). Devido a isso, esse trabalho propôs avaliar a participação dos receptores
5HT1 e 5HT2 nos efeitos cardiorespiratórios e atividades de nervo renal frente à
aplicação de 5HT i.c e i.c.v. A 5HT foi utilizada em concentrações de 4, 40 e
120 nmol/kg. Com intuito de estudar a participação de receptores
serotoninérgicos 5HT1 e 5HT2 na indução de respostas cardiorespiratórias,
aplicou-se metiotepina (MT-0,44 µmol/kg), antagonista dos receptores 5HT 1A ,
1D, e 5HT2 a qual foi administrada 15 min antes da 5HT (120 nmol/kg).
Usaram-se ratos machos, Wistar (250 g), inicialmente anestesiados com éter
etílico e posteriormente mantidos sob anestesia endovenosa com Uretana (1,2
g/kg). Foram registradas as seguintes variáveis: PAM (pressão arterial média),
FC (freqüência cardíaca), FR (freqüência respiratória), IRNA (atividade
integrada de nervo renal) e área do nervo renal (aRNA). A significância
estatística foi p < 0,05 e os resultados foram expressos como média ± EPM
(ANOVA). A administração de 5HT i.c e i.c.v , promoveu elevação da PAM (4
nmol/kg: i.c.: 77,86 ± 1,56 para 84,43 ± 2,05; i.c.v.: 76,57 ± 2,59 para 83,00 ±
2,56; 40 nmol/kg; i.c: 74,00 ± 1,53 para 87,57 ± 1,51; i.c.v.: 78,86 ± 3,27 para
96,57 ± 2,42; 120 nmol/kg; i.c.: 75,00 ± 5,81 para 84,29± 5,53; i.c.v.: 98,14 ±
8,10 para 118,43 ± 5,00) mmHg e da RNA (4 nmol/kg; i.c.: 1,99 ± 0,16 para
3,10 ± 0,25.; i.c.v.: 2,11 ± 0,13 para 3,56 ± 0,11.; 40 nmol/kg; i.c.: 1,75 ± 0,08
para 3,29 ± 0,22.; i.c.v.: 1,66 ± 0,05 para 3,88 ± 0,05.; 120 nmol/kg; i.c.: 1,92 ±
0,06 para 3,56 ± 0,09.; i.c.v.: 1,87± 0,08 para 4,94 ± 0,22) U.A, não ocorrendo
alterações significativas da FR. Com relação a FC, a dose menor de 5HT
causou taquicardia (i.c.: 373,29 ± 7,78 para 388,14 ± 9,67; i.c.v.: 370,71 ± 8,36
para 404,14 ± 9,37) bpm, enquanto bradicardia foi observada nas doses
maiores (i.c.: 40 nmol/kg: 369,29 ± 7,93 para 355,29 ± 8,25; i.c.v: 382,43 ±
8
12,36 para 332,86 ± 13,09; 120 nmol/kg ic: 364,57 ± 12,46 para 349,86 ±
12,78; i.c.v.: 396,14 ± 16,58 para 328,00 ± 16,12) bpm. A MT, nas duas vias
atenuou as respostas da 5HT (i.c.: PAM : 77,29 ± 3,91 para 46,43 ± 2,91
mmHg; FC: 374,86 ± 12,27 para 399,71 ± 10,73 bpm; RNA: 1,89 ± 0,14 para
1,15 ± 0,12 U.A) e ( icv: PAM : 83,29 ± 3,01 para 54,43 ± 2,65 mmHg; FC:
361,43 ± 8,08 para 388,43 ± 10,27 bpm; RNA: 1,96 ± 0,17 para 1,39 ± 0,12
U.A. Estes resultados sugerem que receptores 5HT1A/1D e 5HT2 localizados em
áreas prosencefálicas e do tronco cerebral, participem nas modificações
hemodinâmicas e simpaticoexcitação renal no rato anestesiado. Experimentos
de microinjeções poderão indicar os sítios anatômicos envolvidos nestas
respostas.
Palavras chaves: Serotonina, nervo renal, metiotepina e respostas simpáticas.
9
ABSTRACT
Activation of central serotonergic receptors are involved in the genesis of
cardiovascular and respiratory responses to various stimuli. Various
publications have demonstrated that intracerebroventricular (i.c.v) serotonin
(5HT) administration induces pressor responses, due to 5HT 1A, 1D and 5HT 2A,
2B activation. Nevertheless, information concerning the participation of the renal
nerve in the responses is lacking. The same applies to the cardiovascular and
respiratory responses to intracisternaly (i.c) 5HT administration. Therefore, the
present work was designed to evaluate the participation of 5HT1 and 5HT2
receptors on the cardio respiratory responses due to i.c.v and i.c 5HT
administration. Serotonin was administered in doses of 4, 40,120 nmol/kg.
Methiotepin (MT-0.44 µmol/kg) antagonist of 5HT1 and 5HT2 was employed 15
min before 5HT to evaluate the participation of the receptors in the
cardiovascular and respiratory responses . Male rats (Wistar, 250g) were used,
initially anesthetized with ether and later kept under intravenous anesthesia
(Uretana, 1,2 g/kg). The following variables were registered: MAP (mean arterial
pressure), HR (heart rate), RR (respiratory rate), IRNA (integrated activity of
renal nerve) and area of the renal nerve (aRNA). The statistic significance was
act at p < 0,05 and the results had been expressed as mean ± EPM (ANOVA).
The administration of 5HT i.c and i.c.v, promoted rise in MAP (4 nmol/kg: i.c.:
77,86 ± 1,56 to 84,43 ± 2,05; i.c.v.: 76,57 ± 2,59 to 83,00 ± 2,56; 40 nmol/kg;
i.c: 74,00 ± 1,53 to 87,57 ± 1,51; i.c.v.: 78,86 ± 3,27 to 96,57 ± 2,42; 120
nmol/kg; i.c.: 75,00 ± 5.81 to 84,29± 5,53; i.c.v.: 98,14 ± 8,10 to 118,43 ± 5,00)
mmHg and in aRNA (4 nmol/kg; i.c.: 1,99 ± 0,16 to 3,10 ± 0,25. ; i.c.v.: 2,11 ±
0,13 to 3,56 ± 0,11. ; 40 nmol/kg; i.c.: 1,75 ± 0,08 to 3,29 ± 0,22. ; i.c.v.: 1,66 ±
0,05 to 3,88 ± 0,05. ; 120 nmol/kg; i.c.: 1,92 ± 0,06 to 3,56 ± 0,09. ; i.c.v.: 1,87±
0,08 to 4,94 ± 0,22) U.A, not occurring significant alterations RR . Regarding
HR, the low dose of 5-HT i.c caused tachycardia (373,29 ± 7,78 to 388,14 ±
9,67; i.c.v.: 370,71 ± 8,36 to 404,14 ± 9,37) beats/min, whilst bradycardia was
observed in the higher doses (i.c.: 40 nmol/kg: 369,29 ± 7,93 to 355,29 ± 8,25;
i.c.v: 382,43 ± 12,36 to 332,86 ± 13,09; 120 nmol/kg ic: 364,57 ± 12,46 to
349,86 ± 12,78; i.c.v.: 396,14 ± 16,58 to 328,00 ± 16,12) beats/min. Methiotepin
attenuated i.c.v and i.c 5-HT effects (i.c.: PAM: 77,29 ± 3.91 to 46,43 ± 2.91
10
mmHg; FC: 374,86 ± 12,27 to 399,71 ± 10,73 beats/min RNA: 1,89 ± 0,14 to
1,15 ± 0,12 U.A) and (icv: PAM: 83,29 ± 3.01 to 54,43 ± 2,65 mmHg; HR:
361,43 ± 8,08 to 388,43 ± 10,27 beats/min; RNA: 1,96 ± 0,17 to 1,39 ± 0,12
U.A. These results suggest that activation 5HT 1A,1D and 5HT2 receptors, located
in forebrain areas and of the medulla , induce hemodynamic modifications and
renal sympathoexcitation in the urethane anesthetized rat. Further experiments
using microinjections techniques are necessary to precisely identifier the nuclei
involved in the responses.
Words keys: Serotonin, renal nerve, methiotepin, sympathetic activity.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação esquemática: RVLM, CVLM, APC, IML e NTS.......21
Figura 2 - Representação esquemática do ciclo da serotonina........................25
Figura 3- Organização anatômica dos núcleos da rafe e das projeções
serotoninérgicas no cérebro de um rato (vista lateral).......................................26
Figura 4 - Esquema da aplicação de serotonina..............................................52
Figura 5 - Esquema da aplicação de metiotepina.............................................53
Figura 6 - Gráficos de linhas das variáveis estudadas (Grupos: salina NaCI a
0,9%, serotonina 4 nmol, serotonina 40 nmol e serotonina 120 nmol)
intracisternal.......................................................................................................61
Figura 7 - Gráficos de linhas das variáveis estudadas (Grupos: salina NaCI a
0,9% e metiotepina 0,44µmol/kg) intracisternal................................................62
Figura 8 - Gráficos de linhas das variáveis estudadas (Grupos: salina NaCI a
0,9%, serotonina 4, 40, 120 nmol/kg) intracerebroventricular...........................67
Figura 9- Gráficos de linhas das variáveis estudadas (Grupos: salina NaCI a
0,9% e metiotepina 0,44 µmol/kg) intracerebroventricular.................................68
Figura 10- Gráficos de linhas ao longo dos tempos para as variáveis estudadas
(IC e ICV) serotonina.........................................................................................71
Figura 11- Gráficos de linhas ao longo dos tempos para as variáveis estudadas
(IC e ICV) metiotepina 0,44 µmol/kg..................................................................74
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- valores das variáveis basais (PAM, FC, FR, IRNA e aRNA) e suas
mudanças com aplicação i.c de serotonina nas concentrações 4, 40, 120
nmol/kg e metiotepina........................................................................................60
Tabela 2- valores das variáveis basais (PAM, FC, FR, IRNA e aRNA) e suas
mudanças com aplicação i.c.v de serotonina nas concentrações 4, 40, 120
nmol/kg e metiotepina........................................................................................66
Tabela 3- comparação das médias e EPM dos resultados obtidos pelos grupos
IC e ICV de serotonina em cada tempo experimental......................................70
Tabela 4- comparação das médias e EPM dos resultados obtidos pelos grupos
IC e ICV de metiotepina em cada tempo experimental....................................73
13
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ADH - Hormônio antidiurético
ANSER – Atividades nervosa simpática eferente renal
APC– Área pressora Caudal
aRNA - Área do nervo renal
BJ – Reflexo de Bezold-Jarisch
CVLM – Bulbo caudo ventrolateral
FR– Freqüência respiratória
FC– Freqüência cardíaca
HA/PO – Hipotálamo anterior/ área pré-optica
5HT – Serotonina
IC– Intracisternal
ICV – Intracerebroventricular
IML– Coluna intermediolateral
IRNA – Atividade integrada do nervo renal
LM – Linha mediana
NRO – Núcleo da rafe obscuro
14
NTS– Núcleo do trato solitário
NPV – Núcleo paraventricular
PA– Pressão arterial
PAP– Pressão arterial pulsátil
PAM– Pressão arterial média
RVLM – Bulbo rostro ventrolateral
SNS – Sistema nervoso simpático
SCP – Substância cinzenta periaquedutal
U.A– Unidade arbitrária
15
SUMÁRIO
FOLHA DE ROSTO ................................................................................................. i
FICHA CATALOGRÁFICA ....................................................................................... ii
DEDICATÓRIA ......................................................................................................... iii
AGRADECIMENTOS ............................................................................................... iv
EPÍGRAFE................................................................................................................ vi
RESUMO ................................................................................................................. vii
ABSTRACT .............................................................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. xi
LISTA DE TABELAS................................................................................................. xii
LISTA DE SIGLAS.................................................................................................... xiii
SUMÁRIO................................................................................................................. xv
1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 19
1.1 SISTEMA RENAL......................................................................................... 19
1.2 SEROTONINA.............................................................................................. 24
1.2.1 Histórico...................................................................................................... 24
1.2.2 Síntese, degradação e localização........................................................... 25
1.2.3 Funções....................................................................................................... 28
1.2.4 Receptores.................................................................................................. 31
1.2.5 Adminstração de serotonina intracerebroventricular............................ 37
1.2.6 Administração de serotonina intracisternalmente................................. 39
2 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................... 44
2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS........................................................................ 44
2.2 ANESTESIA................................................................................................. 44
2.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS.............................................................. 45
2.3.1 Canulação .................................................................................................. 45
2.3.2 Traqueostomia............................................................................................ 45
2.3.3 Craneotomia............................................................................................... 46
16
2.3.4 Exposição do rim esquerdo para posteriores registros do nervo
renal.............................................................................................................
47
2.4 ESTEREOTAXIA.......................................................................................... 47
2.4.1 Posicionamento do animal........................................................................ 47
2.4.2 Acesso à cisterna magna para injeções intracisternais........................ 47
2.4.3 Implantação de cânula guia de metal para injeções ICV via ventrículo
lateral direito............................................................................
48
2.4.4 Exposição do nervo renal......................................................................... 49
2.5 TEMPERATURA CORPORAL..................................................................... 50
2.6 REGISTROS HEMODINÂMICOS................................................................ 50
2.7 DROGAS UTILIZADAS................................................................................ 50
2.8 ANÁLISE HISTOLÓGICA............................................................................ 51
2.9 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS............................................................. 52
2.9.1 Aplicação de serotonina ( 4, 40, 120 nmol/kg)........................................ 52
2.9.2 Aplicação de metiotepina (0,44 µmol/kg) seguido de serotonina 120
nmol/kg.........................................................................................................
53
2.9.3 Grupos experimentais............................................................................... 54
2.9.4 Análise estatística...................................................................................... 55
3. RESULTADO............................................................................................... 57
3.1 GRUPO DE INJEÇÃO IC............................................................................. 57
3.1.1 Grupo salina controle................................................................................ 57
3.1.2 Grupo serotonina 4 nmol/kg..................................................................... 57
3.1.3 Grupo serotonina 40 nmol/kg................................................................... 58
3.1.4 Grupo serotonina 120 nmol/kg................................................................. 58
3.1.5 Grupo metiotepina 0,44 µmol/kg.............................................................. 59
3.2 GRUPO DE INJEÇÃO ICV........................................................................... 63
3.2.1 Grupo salina controle................................................................................ 63
3.2.2 Grupo serotonina 4 nmol/kg..................................................................... 63
3.2.3 Grupo serotonina 40 nmol/kg................................................................... 64
3.2.4 Grupo serotonina 120 nmol/kg................................................................. 64
17
3.2.5 Grupo metiotepina 0,44 µmol/kg.............................................................. 65
3.3 COMPARAÇÃO DOS GRUPOS IC E ICV EM CADA TEMPO
EXPERIMENTAL..........................................................................................
69
3.3.1 Serotonina .................................................................................................. 69
3.3.2 Metiotepina................................................................................................. 72
4 DISCUSSÃO............................................................................................... 76
5 CONCLUSÃO.............................................................................................. 82
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 85
18
INTRODUÇÃO
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 SISTEMA RENAL
Para o adequado funcionamento do organismo é necessário que todas as
células e tecidos permaneçam em estado de equilíbrio com o meio extracelular
e que, este por sua vez, seja mantido em condições ideais para a
sobrevivência celular. Para isso é fundamental a participação de órgãos e
sistemas do corpo, sobretudo os rins para a manutenção da homeostasia
(DIBONA, 1986; GUYTON, 2002).
Os rins, por sua vez são órgãos homeostáticos responsáveis por manter dentro
de uma faixa estreita de variação, um grande número de componentes do meio
interno do organismo (AIRES, 1999; DANGELO,2000). A participação renal
nestes processos está centralizada, principalmente, na capacidade dos rins de
regular a excreção de água e solutos e sobre a capacidade de controlar a
pressão arterial, cujos mecanismos sofrem influências de diversos fatores
neurais e humorais. Dentre estes podemos mencionar, a vasopressina ou
hormônio antidiurético (ADH), o sistema renina-angiotensina-aldosterona e a
participação do sistema nervoso simpático (SNS). Esses componentes, agem
de forma harmônica potencializando a capacidade dos rins em controlar a
diurese, a natriurese e consequentemente o controle da pressão arterial
(COSTANZO, 1999; GREENE, 1963; OLDS & OLDS, 1979).
A participação do SNS sobre a função renal tem sido bastante estudada, uma
vez que a hipertensão essencial em humanos, bem como em, vários modelos
de hipertensão experimental em animais, o aumento da atividade nervosa
simpática eferente renal (ANSER) ocorre acompanhado por alterações
subsequentes na função renal, visto que os rins recebem extensa inervação
simpática, que influencia na excreção renal de sódio (DIBONA,1995). A
participação neural no controle da excreção renal envolve mecanismos
complexos, os quais também dependem da frequência de estimulação de
nervos renais (DIBONA & KOPP ,1997).
20
O nervo renal é a comunicação entre o sistema nervoso central e os rins. Em
resposta a múltiplos inputs centrais e periféricos, a atividade eferente simpática
do nervo renal é alterada, transmitindo informações via sinapse química para
os vasos, glomérulos e túbulos. Isso contribui para regulação homeostática do
fluxo sanguíneo renal, freqüência da filtração glomerular, transporte de água e
solutos pelas células epiteliais do túbulo renal e liberação hormonal (DIBONA &
KOPP, 1997; DIBONA & KOPP, 1992; HÖFLING, 1995).
Os nervos renais apresentam fibras eferentes simpáticas, importantes na
regulação da função renal, e fibras aferentes, que transmitem informação
sensitiva dos rins para o sistema nervoso central. Estão localizados
aproximadamente no entroncamento da aorta abdominal e artéria renal,
entrando no hilo em associação com a artéria e a veia renal (DIBONA & RIOS,
1980).
A descoberta do trajeto da inervação simpática desde o SNC até os rins em
coelhos, ratos e hamsters se deu pelo surgimento de técnicas de traçadores
retrógrados tais como HRP e o vírus do herpes (DEHAL,1993; CIRIELLO &
CALARESU, 1983). Quanto à localização neuroanatômica dos neurônios pré-
ganglionares simpáticos renais, estão predominantemente na cadeia
intermediolateral (IML) ao nível de T5,T10,T13 de onde partem, fazendo sinapses
com os neuronios pós-ganglionares que estão ao nível de T13 e L1. Estudos
realizados pelo Ding e colaboradores (1993) em coelhos mostraram que no
SNC, há vários grupos de células que se projetam da região do tronco cerebral
até a coluna IML. Neste estudo as estruturas foram classificadas quanto à
porcentagem de atuação na regulação da ANSER e foi observado que são
provenientes dos núcleos da rafe-13%, da região bulbar rostro ventrolateral
(RVLM)-47% , células noradrenérgicas da área A5-37%, dos núcleos
paraventriculares-2% e hipotálamo-1%.
O RVLM é a região mais importante na gênese e na modulação da atividade
simpática eferente ( BARMAN,1984; ROSS et al. 1984; GUYENET,1985). Sua
destruição acarreta queda da pressão arterial (PA) e interfere nas funções
21
reflexas cardiovasculares, já que seus neurônios respondem indiretamente à
estimulação dos baroreceptores aórticos e carotídeos, e de receptores
sensoriais renais. O RVLM recebe projeções do bulbo caudo ventrolateral
(CVLM), área pressora caudal (APC), núcleo do trato solitário (NTS),
importante para a regulação da homeostasia, substância cinzenta
periaquedutal e dos núcleos paraventriculares ( figura 1A). Sendo assim, dos
núcleos que modulam a atividade eferente simpática , o RVLM é o mais
importante para a integração dos reflexos cardiovasculares e é a maior fonte
excitatória e moduladora da ANSER (CIRIELLO & CALARESU,1983;
AICHER,1995; BACHELARD, 1990; BRODAL, 1960).
A B
Figura 1 A - Representação esquemática modificada proposta por Horiuchi & Dampney (2002). RVLM –bulbo rostro ventrolateral; CVLM- bulbo caudo ventrolateral; CPA-área pressora caudal; IML-células da coluna intermediolateral; NTS-núcleo do trato solitário; SCP-Substância cinzenta periaquedutal; NPV-núcleo paraventricular, NRO-núcleo da rafe obscuro.
B - Diagrama da superfície ventral bulbar mostrando bulbo rostro ventrolateral (RVLM), bulbo caudo ventrolateral (CVLM) e área pressora caudal (APC); XII-décimo segundo par de nervos cranianos; C1- primeira raiz cervical (SILVA, 2003).
O RVLM recebe aferências do CVLM de caráter inibitório, além disso, o CVLM
apresenta ligação com o hipotálamo, mais especificamente com o núcleo
paraventricular e com o núcleo supra-óptico, modulando a secreção de
vasopressina principalmente em caso de hemorragias e hipotensão. O núcleo
Hipotálamo NPV SCP NTS
NRO
RVLM
22
paraventricular, é uma região conhecida como participante na geração do tônus
simpático, pois faz sinapse excitatória com o RVLM e consequentemente com
a coluna IML tóraco-lombar (CRAVO et. al, 2006). Além de sua importante
função no controle do tono vasomotor simpático, o CVLM também participa na
modulação do arco reflexo ativado pelos baroreceptores, sendo que em
situações de grande aumento da pressão arterial, o NTS capta essa
informação ativando o CVLM, na qual inibe o RVLM e consequentemente reduz
a simpaticoexcitação sobre a coluna IML (OHTA & TALMAN,1996). A APC
também é uma região bulbar que se conecta ao RVLM, através do
interneurônio inibitório, inibindo-o, assim como faz sinapse com o CVLM
inativando-o, o que permite a liberação do RVLM e consequentemente uma
maior atividade simpática. A APC, por sua vez, se situa inferiormente à CVLM
entre o 12º par de nervo craniano e a 1º raíz cervical ( figura 1 B). Essas três
regiões bulbares se interligam para a manutenção da homeostase (CAMPOS et
al, 2001; HORIUCHI & DAMPNEY,2002). Aparentemente a ação da APC
depende do RVLM, sendo que a inibição do RVLM bloqueia a resposta
mediada pela APC, todavia, inibição da APC não bloqueia ações
cardiovasculares mediadas pelo RVLM. Esses resultados sugerem uma
hierarquia entre essas duas regiões, com a predominância do RVLM (SILVA et.
al, 2001).
O RVLM contém neurônios pré-motores simpáticos, enviando projeções
monossinápticas para a coluna intermediolateral tóraco-lombar, onde se
localizam os neurônios pré-ganglionares simpáticos. Esses neurônios pré-
ganglionares simpáticos são os que levam tônus simpático para o coração,
vasos de resistência e medula adrenal (CAMPOS et. al, 2001).
Além do RVLM, alguns autores têm evidenciado que o NTS também merece
atenção, visto que é a estrutura que recebe a primeira sinapse das aferências
dos reflexos cardiovasculares (CRILL & REIS, 1968; MACHADO &
BONAGAMBA, 1992; OHTA & TALMAN, 1996).
O NTS é constituído por diferentes grupos neuronais, na qual se estendem
dorsalmente ao bulbo. No NTS ocorre integração das informações
cardiorespiratórias, relevantes a pressão arterial, freqüência cardíaca,
23
enchimento venoso, atividade cardíaca, composição química do sangue etc.
Depois que essa informação é analisada e processada, a mesma é
encaminhada a outras regiões do SNC, em especial as áreas ventrolaterais do
bulbo (RVLM, CVLM, APC) para que as variáveis desses sistemas possam ser
controladas para a manutenção da homeostasia. Lesão eletrolítica unilateral no
NTS abole respostas reflexas da pressão arterial e freqüência cardíaca,
produzidas pela estimulação elétrica do nervo do seio carotídeo ipsilateral
(CAMPOS et. al, 2001). Lesões bilaterais promovem em poucas horas
deterioração da atividade cardiovascular seguida de falência ventricular aguda,
edema pulmonar e morte do animal. Frente a isso está bem demonstrado que o
NTS constitui o sítio primário para o qual se projetam as aferências do baro e
quimiorreceptores arteriais (CAMPOS et. al, 2001)
Através de estudos imunohistoquímicos e eletrofisiológicos foi possível
identificar no NTS, a participação de um grande número de neurotransmissores
e/ou neuromoduladores envolvidos no controle cardiovascular e na modulação
da atividade eferente simpática. As maiores classes são as aminas biogênicas
(dopamina, epinefrina, histamina, serotonina, acetilcolina); aminoácidos
(glutamato, aspartato, glicina, GABA); neuropepitídeos (vasopressina,
angiotensina, encefalinas, neuropeptídeo Y, bradicinina) (AMSTRONG et al,
1982; CASSEL et. al, 1992). Dentre os neuromoduladores, a serotonina foi o
alvo da pesquisa, devido a poucos estudos relacionados à sua participação na
regulação da atividade simpática renal.
24
1.2 SEROTONINA
1.2.1 Histórico
A serotonina, ou 5-hidroxitriptamina (5HT) em latim “Serum tônica”, devido a
sua ação tônica sobre a musculatura dos vasos, é uma monoamina biogênica,
encontrada extensamente no organismo, identificada primeiramente nas
plaquetas e posteriormente no SNC como um neurotransmissor (FOZARD,
1984; HAMLIM & FISCHER, 1951). Sua fórmula química é C10H12N2O, uma das
menores moléculas neuroativas. Hoje se sabe que 90% da serotonina do
organismo encontram-se no trato gastrintestinal, 8% no interior de vesículas
plaquetárias e apenas 2% no sistema nervoso central (SNC) (COTE et. al,
2004; BARNES et al,1999).
Em termos evolutivos, a serotonina surge muito precocemente: está presente
em plantas e organismos mais primitivos, como alguns protozoários e quase
todos os metazoários. Acredita-se que seu papel mais antigo seja o de
regulador de atividades celulares: ao agir diretamente sobre alguns sistemas
internos de sinalização, ela provoca alterações ao longo prazo no estado
funcional da célula, para adaptar o organismo ao ambiente. No passo seguinte
da escala evolutiva, observado em organismos mais desenvolvidos, a
serotonina adquire função de hormônio, apresentando-se como uma molécula
externa que atua sobre receptores específicos da membrana celular. Essa
ação faz das monoaminas importante para a morfogênese e nutrição celular:
elas controlam e coordenam a proliferação e diferenciação de vários tipos de
células. Já a função de neurotransmissor é tida como a mais recente na
evolução (NOGUEIRA et. al, 2004).
A serotonina foi obtida sinteticamente pela primeira vez por Hamlin e Fischer
em 1951, sendo que em meados dessa década sugeriu-se que ela poderia
atuar como neurotransmissor a nível do SNC. Mesmo apresentando apenas
2% ao nível central, ela participa de importantes funções no SNC, razão pela
qual foi reconhecida como neurotransmissor (NOGUEIRA et. al, 2004).
25
1.2.2 Síntese, degradação e localização
A serotonina é sintetizada a partir do aminoácido triptofano, adquirido pela
alimentação. No SNC o triptofano quando encontrado na circulação sanguínea
atravessa a barreira hematoencefálica através de transportadores específicos,
atingindo o neurônio serotoninérgico. Esse aminoácido é captado para dentro
da célula pela bomba transportadora de triptofano. No interior do neurônio
serotoninérgico o triptofano é hidroxilado e carboxilado pelas enzimas triptofano
hidroxilase e triptofano carboxilase respectivamente, convertendo-o em 5-
hidroxitriptamina e em seguida armazenadas em vesículas (Figura 2). A
degradação da serotonina é dependente das atividades das enzimas
monoaminas oxidases: MAO-A e MAO-B (NOGUEIRA et. al, 2004; HAMLIN &
FISCHER,1951). A maior parte da síntese da serotonina ocorre a nível
periférico, especificamente nos intestinos. O triptofano é captado pelas células
enterocromafinas localizadas na mucosa intestinal, repetindo-se os mesmo
processos a nível central com hidroxilação e carboxilação até a formação da
serotonina.
Figura 2: Representação esquemática do ciclo da serotonina, desde seu precursor, o aminoácido triptofano, até a sua formação. Fonte: NOGUEIRA et. al, 2004.
No SNC a maior densidade de neurônios serotoninérgicos localiza-se nos
núcleos da rafe. Os núcleos da rafe são grupos de neurônios situados na
porção mediossagital do tronco cerebral, que se apresentam com o aspecto de
linha ou sutura, na qual se estendem desde os núcleos interpenduculares até a
decussação das pirâmides no tronco cerebral. Ocupam ao longo do tronco
26
cerebral uma área que vai desde o bulbo até o mesencéfalo, passando pela
ponte. Os núcleos da rafe estão organizados por dois grupos distintos: o rostral
constituído pelos núcleos: linear, paramediano, dorsal, mediano e pontino,
situados no mesencéfalo e ponte e o grupo caudal constituído pelos núcleos:
magno, pálido e obscuro, situados no bulbo. Enquanto que os corpos celulares
dos neurônios dos núcleos da rafe encontram-se na linha mediana, ou muito
próximos desta, seus axônios distribuem-se amplamente ao longo do neuro-
eixo, atingindo a formação reticular e outras áreas do tronco cerebral, cerebelo,
medula espinhal, tálamo, hipotálamo, gânglios da base, sistema límbico e
neocórtex , vide figura 3 (BRODAL et al., 1960; ROBINSON et al, 1985; SMITS
et al, 1978; AGHAJANIAN,1978).
Figura 3: Organização anatômica dos núcleos da rafe e suas projeções no cérebro de um rato
(vista lateral). O maior número de projeções desses núcleos (em azul) parte: dos núcleos caudais (magno-3, pálido-1 e obscuro-2) para a medula espinhal, do núcleo pontino-4 para o cerebelo e dos núcleos rostrais (mediano-5, paramediano-6, dorsal-7 e linear-8) para o prosencéfalo. Há um feixe dorsal específico (em vermelho) que vai dos núcleos mediano-5 e dorsal-7 para o tálamo e hipocampo. Fonte: modificado de NOGUEIRA et. al , 2004.
27
Os neurônios dos núcleos caudais da rafe projetam-se para núcleos e áreas da
formação reticular e outros núcleos do tronco cerebral e intensamente para a
medula espinhal, fazendo sinapse, respectivamente com neurônios das
lâminas I, II e V e com grupos de neurônios pré-ganglionares simpáticos
(coluna intermédio lateral). A ligação dos núcleos bulbares da rafe com grupos
de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula espinhal sugere sua
participação na regulação autonômica. Por outro lado, a importância de cada
um dos núcleos bulbares da rafe no controle e modulação de vários
componentes fisiológicos também pode ser sugerida pelas diversas conexões
suprassegmentares existentes (AMENDT et al, 1979; ARBORELIUS et al,1994;
LOEWY,1981; BACON et. al, 1990; SMITS et. al, 1978).
Dentre os núcleos caudais da rafe, o núcleo da rafe obscuro (NRO) é o que
mais apresenta neurônios serotoninérgicos. Nos diferentes estudos existentes
na literatura, respostas predominantemente pressoras e poucas respostas
depressoras, acompanhadas de bradicardia ou não, têm sido evidenciados
durante a estimulação do NRO (SILVA, 2003; CAMPOS, 1993; CHEN &
ASTON-JONES, 1996).
Diversos trabalhos demonstram que os três núcleos caudais da rafe (pálido,
obscuro e magno) se projetam para a medula espinhal e que muitas dessas
funções são mediadas, em parte, por essas conexões. Por outro lado, há
pesquisadores com opiniões divergentes quanto as possíveis conexões entre o
NRO e sítios de neurônios pré-ganglionares simpáticos da medula. Haselton et
al. (1988), utilizando técnica de marcação anterógrada e ativação antidrômica
de centros medulares e bulbares de coelhos, obtiveram um único registro de
ativação antidrômica e esparsas marcações no NRO após a estimulação e
injeção de “Horseradish peroxidase” na medula, respectivamente. Bacon et al.
(1990) obtiveram resultados semelhantes em ratos e concluíram que o NRO
apresenta poucas projeções à coluna IML.
Além da possibilidade, ainda que controversa, do NRO participar nas respostas
autonômicas através de projeções espinhais, existem ainda importantes
conexões em diversos centros bulbares do tronco cerebral que impedem uma
28
análise simplista do envolvimento deste núcleo no controle de muitas funções
(SILVA, 2003).
A rede interneuronal do NRO para os núcleos bulbares poderia ser a
justificativa dos resultados de trabalhos que demonstram o envolvimento deste
núcleo na modulação tônica da atividade simpática (ADAIR et al., 1977;
BERNARD,1998) na regulação central da respiração (HOLTMAN et al., 1988;
JACOBS & AZMITIA, 1992) e cardiovascular (FUTURO NETO et al., 1990;
1996; CAMPOS et al., 1993, HOLMAN et. al, 1990). A regulação cardiovascular
e respiratória pode ser sugerida pelas projeções para a superfície ventral
bulbar (CHEN & ASTON-JONES, 1996) onde existem importantes centros
integradores das respostas pressoras, cardíacas e respiratórias.
Na superfície ventral bulbar estas projeções estariam ligadas a três principais
centros de controle cardiovascular e respiratório: a área simpaticoexcitatória
rostral ventrolateral, área simpaticoinibitória caudal ventrolateral e área
pressora caudal (conhecidas como RVLM, CVLM, APC respectivamente),
principais responsáveis pela manutenção do tônus vasomotor simpático (YEN
et. al, 1983; FUTURO NETO et. al, 1990).
Já o grupo rostral como foi visto é constituído pelos núcleos: pontino, mediano,
paramediano, dorsal e linear e esses fazem conexões com o cerebelo,
hipotálamo, tálamo, hipocampo, córtex cerebral, gânglios da base, substância
cinzenta periaquedutal (figura 3), o que demonstra a importância desses
grupos celulares para o processo integrativo do SNC (BRODAL,1960;
NOGUEIRA et. al, 2004).
1.2.3 Funções
Um dos aspectos que contribui para tornar a serotonina tão especial para o ser
vivo é a imensa variedade de funções a que está atribuída. Essa molécula atua
no desempenho motor de músculos e vísceras (BERNIK, 2003), na regulação
dos sistemas cardiorespiratório e endócrino (DEAKIN et. al, 1991), na
regulação da temperatura (YOUNG et. al, 1985), na percepção sensorial, nos
mecanismos de regulação da nocicepção (BLIER et. al, 1998), na
29
aprendizagem, na memória, no comportamento alimentar e sexual e mesmo
em estados psíquicos como humor, vício e depressão, dentre outros
(GRAEFF,2003). Além das funções fisiológicas e comportamentais, a
serotonina também participa do desenvolvimento do organismo. Pesquisas
feitas com ratos comprovaram que, nos estágios embrionários iniciais, ela
apresenta alta concentração e funciona como fator nutricional, estimulando a
proliferação, migração e diferenciação celular. Sua remoção ou inativação,
nessa fase, provoca alterações morfogenéticas. Após o nascimento, no
entanto, o nível de serotonina cai, mantendo-se estável no animal adulto, com
pequenas variações relacionadas ao ritmo biológico de sono-vigília
(NOGUEIRA et al, 2004).
Dentre essas funções podemos citar:
a- Ciclo sono e vigília: o controle desse ciclo é uma das primeiras ações
que se identificou para a serotonina. Sabe-se que o ritmo sono e vigília é
regulado pelo equilíbrio adrenérgico - serotoninérgico e que a
administração de antagonistas do 5HT2 como, por exemplo, a ritanserina
aumenta o sono de ondas lentas ou sono Delta ( ALOÉ et al, 2000).
b- Agressividade: Diversos autores têm demonstrado que em ratos ao
aplicar agonistas de 5HT1B geram agressividade, assim como em
humanos observou-se que a mutação do ponto do gen que codifica a
MAO A se relaciona com o retardo mental e agressividade (GRAEFF,
2003).
c- Ansiedade: Estímulos ambientais que possam indicar perigo ou
ameaça, desencadeiam uma série de reações cognitivas, sensório-
perceptivas e neurovegetativas. O conjunto dessas reações designa o
medo, principal emoção envolvida nas experiências de ansiedade. A
serotonina é uma substância importantíssima no estudo neuroquímico
da ansiedade, tanto o bloqueio de seus receptores quanto o bloqueio da
sua síntese, produzem efeitos ansiolíticos. Comprovou-se, também, que
a 5HT exerce um duplo papel na regulação da ansiedade. Ela exerce um
30
papel ansiogênico na amigdala e ansiolítico na matéria cinzenta
periaquedutal dorsal (GRAEFF, 1993).
d- Depressão: sabe-se que os fármacos eficazes contra a depressão são
na maioria inibidores seletivos da recaptação da serotonina, assim como
também se sabe que a ação direta da serotonina em receptores 5HT1A e
5HT2 , causa ansiedade e depressão (GRAY, 2000).
e- Apetite: a serotonina é o principal mediador inibidor do núcleo
hipotalâmico ventro - medial que regula a ingesta de alimentos e a
saciedade. A hiperserotonergia produz anorexia e hiposerotonergia o
excesso de peso (NOGUEIRA et. al, 2004). Agonistas da serotonina com
ação direta sobre os receptores serotoninérgicos 5HT1A (8-OH-DPAT),
por exemplo, produzem hiperfagia por estímulo dos auto-receptores, na
qual uma vez estimulados diminuem a liberação de serotonina
(NOGUEIRA et al, 2004).
f- Sistema cardiovascular: A influência dos diversos subtipos de
receptores serotoninérgicos na regulação cardiovascular vem sendo
explorada por diversos cientistas. No núcleo dorsal da rafe, por exemplo,
encontram-se os autoreceptores 5HT1A e 5HT1D (BRUINVELS et
al.,1993; FARIA et. al, 1996) , que quando estimulados promovem
diminuição da pressão arterial (GALLACHER & RAMAGE, 1995). Foi
demonstrado também que a ketanserina, um antagonista de receptores
5HT2, é capaz de baixar a pressão arterial em pacientes e em animais,
no entanto, este efeito foi atribuído à ação antagonista da ketanserina
nos receptores α1, sendo ainda demonstrado que os receptores 5HT2
parecem não estar sob uma ativação tônica constante no sistema
nervoso central. Embora a participação da 5HT na regulação da pressão
arterial tenha sido demonstrada, drogas que interferem com receptores
5HT1 e 5HT2 não se apresentaram como alternativas viáveis para o
tratamento da hipertensão arterial. Uma possível razão para o fracasso
na terapêutica anti-hipertensiva de agonistas 5HT1 e antagonistas de
31
5HT2 pode ser devido ao desconhecimento sobre o exato papel destes
receptores e de outros subtipos de receptores 5HT na regulação
cardiovascular.
g- Outros: Ritmo circadiano e funções neuroendócrinas: A serotonina é um
dos principais neurotransmissores do núcleo supraquiasmático
hipotalamico, regulador central de todos os ritmos endógenos
circadianos. Influi assim, na regulação do eixo hipotálamo-periférico.
Temperatura corporal: A serotonina produz um efeito duplo sobre a
temperatura corporal, de acordo com o tipo de receptor estimulado. O
receptor 5HT1 produz hipotermia e o receptor 5HT2 hipertermia. Dor: A
serotonina é um modulador das vias senso-perceptivas. A depressão
diminui o limiar de recepção à dor e a administração de agonistas da
serotonina produz analgesia em animais de laboratório (SAAVEDRA et
al, 1974; MORIN, 1999).
1.2.4 Receptores
A variedade de funções atribuída à serotonina é mais bem compreendida
quando se considera, além dessa molécula e do neurônio serotoninérgico,
também o circuito neuronal em que ela atua: a estrutura onde se origina seu
alvo, a organização sináptica e o tipo de receptor na membrana pós-sináptica
(BRADLEY, 1986; DUMUIS, 1988).
A classificação e nomenclatura dos receptores serotoninérgicos tem evoluído
nos últimos anos, sobretudo na última década do século XX, em resposta a
uma rápida extensão de informações sobre a estrutura e função a nível
molecular.
Sabe-se atualmente que existem sete tipos de receptores para a serotonina
(5HT1-7), alguns são divididos em diferentes subtipos, segundo sua afinidade
por ligantes serotoninérgicos : 5HT1, 5HT2, 5HT3, 5HT4, 5HT5, 5HT6, e 5HT7.
Dentro do grupo 5HT1 existem os subtipos 5HT1A, 5HT1B, 5HT1D, 5HT1E, e
5HT1F. Existem três subtipos 5HT2, o 5HT2A, o 5HT2B, e 5HT2C assim como dois
32
subtipos 5HT5, o 5HT5A e o 5HT5B. A maioria desses receptores está acoplada
a proteínas G, com exceção da classe dos receptores 5HT3 que são canais
iônicos (BARD et al, 1993). Esses receptores podem ser encontrados em
diversas regiões do sistema nervoso central e em tecidos periféricos.
A- 5HT1
Sugeriram que as respostas mediadas pelos receptores do tipo 5HT1 são de
natureza inibitória, tanto que a administração da flesinoxana, classificada como
um agonista de receptores 5HT1A, em pacientes hipertensos promove, uma
queda da pressão arterial. (RAMAGE, 2001; ARTIGAS et al , 1996; BLIER et al,
1990; COSTALL et al, 1989).
Recentemente em relação à função dos receptores 5HT1A foi demonstrado, em
ratos anestesiados e acordados (ANDERSON et al., 1992), que a ativação
destes receptores, situados no prosencéfalo, causava excitação simpática ao
invés da inibição previamente descrita. Atualmente foi demonstrado também
que o receptor 5HT1D tem ações semelhantes ao 5HT1A em relação a pressão
arterial, ou seja quando ativados no prosencéfalo promove aumento de pressão
arterial, e quando ativados no romboencéfalo observa-se uma queda da
pressão arterial (GALLACHER & RAMAGE, 1995).
O hipocampo é a região do sistema nervoso central que apresenta a maior
concentração de receptores 5HT1A. Estes receptores são encontrados também
no septo, núcleo da rafe, particularmente o núcleo dorsal da rafe (HOYER et
al., 1993).
No hipocampo, os receptores 5HT1A são pós-sinápticos (WRIGHT, 1995) e em
ratos a estimulação destes receptores promove o aparecimento de uma
síndrome denominada “síndrome serotoninérgica”, que se caracteriza por
hipertermia, rigidez muscular, mioclonia e alterações rápidas no estado mental
e sinais vitais, com aumento da liberação do hormônio adrenocorticotrópico.
No núcleo dorsal da rafe esses receptores atuam como autoreceptores
33
somatodendriticos e quando estimulados diminuem o disparo da célula
neuronal (HOYER et. al, 1993).
Alguns trabalhos feitos com estimulação de receptores 5HT1A pré-sinápticos
determinaram uma hiperfagia e efeitos do tipo ansiolitico em ratos. A eficácia
ansiolítica dos agonistas dos receptores 5TH1A (buspirona, gepirona) é
explicada com base na ação dessas drogas nos receptores 5HT1A pré-
sinapticos (BRONOWSKA, 2001; DAVIDSON, 1995).
B- 5HT 2
Os receptores 5HT2A encontram-se distribuídos em grande quantidade nos
tecidos periférico (BRADLEY et al., 1986) mediando as respostas contrateis do
músculo liso vascular, da aorta do coelho, da artéria caudal de rato, na
contração do músculo brônquico e musculatura lisa urinária. A agregação
plaquetária e o aumento da permeabilidade capilar são efeitos que também são
mediados por esses receptores (HOYER et al., 1993).
Centralmente estão localizados no córtex cerebral e gânglios da base (HOYER
et al., 1993). Recentes dados indicam que os receptores 5HT2A estão
presentes também nos neurônios piramidais (BURNET et al., 1995, WRIGHT et
al., 1995), no núcleo dorsal da rafe (BLUE et al., 1988) e nos neurônios do
núcleo acumbens do rato (NORTH & UCHIMURA, 1989).
Agonistas destes receptores como DOI (1-(4-iodo-2,5-dimetoxifenil)- 2-
aminopropano hidrocloridrato) e o LSD, em roedores, promovem contorções na
cabeça com aumento acentuado da atividade motora, e em humanos
determinam alucinações. Em níveis centrais causa também uma ativação
simpática, com aumento da pressão arterial. Estudos clínicos vêm
demonstrando que estes receptores medeiam as respostas alucinógena do
LSD (KREBS & GEYER, 1998). Recentemente tem sido demonstrado que
drogas antagonistas destes receptores (clozapina, olanzepina, risperidona),
classificadas como neurolépticos atípicos e que são usadas para tratar
esquizofrenias, podem ter seu efeito terapêutico baseado no bloqueio destes
34
receptores (BUSATTO & KERVIN, 1997; KEHNE et al., 1996).
Alguns pesquisadores têm demonstrado que a ativação dos receptores 5HT2A
promove um aumento de temperatura corporal (GUDESKY et al., 1986) e que o
aumento da temperatura corporal observada em usuários de “ecstazy” (MDMA)
é atribuída a ação desta anfetamina via receptores serotonérgicos 5HT2A
(SEMPLE et al., 1999) .
Os receptores 5HT2B foram detectados no estômago e quando estimulados
promoviam uma contração da musculatura do fundo do estômago (VANE,
1959). Recentemente através do uso de anticorpos marcados, esses
receptores foram localizados no septum, amigdala, hipotálamo e no cerebelo
do rato (DUXON et al., 1997). A estimulação destes receptores em roedores
tem promovido uma pequena ansiedade, hiperfagia e redução no crescimento
(KENNET et al., 1996). Eles também estão envolvidos no aparecimento de
enxaqueca, sendo utilizado seus antagonistas (ciproeptadina, pizotifeno e
mianserina) profilaticamente no tratamento da enxaqueca.
O receptor 5HT2C com a utilização de anticorpos específicos ficou
demonstrado que o plexo coróide apresenta uma elevada concentração
enquanto que córtex cerebral, hipocampo, estriado e a substância negra
apresentam baixa concentração desse receptor (PAZOS et al., 1984;
PALÁCIOS et al., 1991; RADJA et al., 1991). A presença desses receptores no
plexo coróide sugere a participação dos mesmos na composição e produção do
líquor (PAZOS et al., 1984). Está presente também no sistema límbico, em
regiões envolvidas com a atividade motora, nos gânglios da base, mais
especificamente no globo pálido e na substância negra em humanos (PAZOS
et al., 1984; CURZON et al., 1990).
C- 5HT3
Os receptores 5HT3 estão distribuídos perifericamente e centralmente. No SNC
estão localizados na área postrema, no núcleo do trato solitário, na substância
gelatinosa no núcleo trigêmio, no complexo núcleo dorsal motor do vago, no
35
córtex e hipocampo. Perifericamente são encontrados nos neurônios
sensoriais, sistema nervoso entérico e nos neurônios pós e pré-sinápticos do
sistema nervoso autônomo (FOZARD, 1984; HOYER et al., 1989).
Diferentemente dos outros receptores serotoninérgicos as subunidades dos
rerceptores 5HT3 formam um canal catiônico sendo seletivamente permeável
ao Na+, K+ . A abertura do canal promove uma rápida despolarização e um
aumento do cálcio intracelular (FOZARD, 1984).
A administração in vivo de agonistas destes receptores pode tanto estimular
como inibir as funções cardíacas, induzir vasodilatação, causar dor e
sensibilização de receptores nocioceptivos, induzir náuseas e vômitos
(ANDREWS et al., 1988, HOYER et al., 1993). No sistema gastrintestinal os
receptores 5HT3 estão envolvidos com o controle do tônus intestinal (COSTALL
& NAYLOR, 1990).
A quimioterapia e a radioterapia desencadeiam náuseas e vômitos via
receptores 5HT3 (ANDREWS et al., 1988). Para combater os efeitos eméticos
da quimioterapia e radioterapia são utilizados os agentes anti-eméticos
classificados como antagonistas dos receptores 5HT3 (HOYER et al., 1993).
Os antagonistas de receptores 5HT3 no sistema nervoso central em alguns
roedores apresentam ação ansiolítica e reduzem a ação da dopamina,
conseqüentemente estes receptores podem estar envolvidos em respostas
comportamentais do sistema nervoso central, participando dos processos de
psicose e dos processos de recompensa e de retirada (COSTALL et al., 1989,
BARNES et al., 1992). Tem sido levantada a hipótese de se usar este grupo de
drogas como agentes antipsicóticos (HOYER et al., 1993).
D- 5HT4
Estes receptores foram primeiramente descritos em cérebro de rato (DUMUIS
et al., 1988), sendo posteriormente identificados no íleo (CRAIG & CLARKE,
1989), coração humano (KAUMANN et al., 1989) e coração de porco (BOM et
al., 1988). No coração é responsável pelo efeito cronotrópico positivo, devido a
36
sua presença no miocárdio e nos átrios. Seus antagonistas são tratamentos
eficientes para a fibrilação atrial.
Esses receptores também foram encontrados no cérebro em áreas de elevada
concentração de dopamina como estriado, gânglios da base e núcleo
acumbens (PATEL et al., 1995). A presença de elevada concentração destes
receptores no hipocampo e nos colículos sugere uma possível participação
destes receptores nas desordens afetivas, psicoses e coordenação motora
(CRAIG & CLARKE 1989). Perifericamente o 5HT4 encontra-se nos vasos
mesentéricos, no esôfago do rato (CRAIG & CLARKE, 1989), no músculo
cardíaco humano (KAUMANN et al., 1998). Na musculatura do colon do rato
estes receptores promovem contrações, e podem estar envolvidos na síndrome
do colon irritável (TAM et al., 1992). Estes receptores presentes no trato
alimentar do rato estão envolvidos com processos secretórios e com reflexos
peristálticos (BUNCE et al., 1991).
E- 5HT5
Através da técnica de clonagem foram detectados dois tipos de receptores
5HT5, denominados de 5HT5A e 5HT5B. Pouco se sabe a respeito destes
receptores. Através da técnica de hibridização os receptores 5HT5A foram
encontrados no córtex cerebral, hipocampo, habênula, bulbo olfatório e no
cerebelo (REES et al., 1994).
A distribuição de receptores 5HT5B, é mais limitada do que a distribuição dos
receptores 5HT5A, sendo encontrada na habênula e no hipocampo por meio da
técnica de hibridização (HOYER et al., 1993).
F- 5HT6
Estes receptores são formados por 438 aminoácidos com sete domínios
transmembranares apresentando-se acoplados positivamente a adenilil ciclase
via proteína GS. Em humanos eles também foram clonados e são similares ao
do rato. Em ratos e em humanos são encontrados no striatum, amigdala,
37
núcleos acumbens, hipocampo, córtex e no tubérculo olfatorio, não
apresentando estudos que identifiquem estes receptores perifericamente
(KOHEN et al., 1996; SEBBEN et al., 1994).
G-5HT7
Atualmente foi demonstrado que esses receptores 5HT7 centrais estão
envolvidos na bradicardia vagal durante o reflexo cardiopulmonar, baroreflexo e
quimioreflexo. Os RNAm para esses receptores estão localizados no núcleo do
trato solitário, que é o local da terminação aferente vagal ( KELLET et al, 2005).
1.2.5 Administração de serotonina intracerebroventricular
Segundo Ramage e colaboradores (1996) administração intracerebroventricular
de serotonina em ratos conscientes causa elevação da pressão arterial nos
primeiros 5 minutos com liberação de vasopressina, adrenalina e aumento da
atividade renal. A elevação da pressão arterial e a liberação de hormônios são
abolidas pelo pré-tratamento com antagonista do receptor 5HT2. A resposta
pressora era abolida também quando os animais eram previamente
adrenalectomizados ou tratados com antagonistas de receptores da
vasopressina (receptores V1).
Em altas doses de serotonina 40nmol/kg e 120 nmol/kg promoveu uma
resposta pressora acompanhada com uma bradicardia, ao contrário em baixas
doses 4 nmol/kg acarretou também uma resposta pressora , porém
acompanhado com uma taquicardia. Em ratos conscientes observou-se
também que ativação dos receptores centrais 5HT1A causa liberação de
adrenalina e uma ação simpaticoexcitatória.
Nos estudos mais recentes de Ramage e colaboradores (2000) constatou que
a liberação de vasopressina envolve a estimulação de vias hipotalâmicas, pela
ativação de receptores 5HT2A. Observou também que injeção de agonistas de
outro subtipo de receptor serotoninérgico: 5HT2B intracerebroventricular em
38
ratos anestesiados, promove um incremento na atividade do nervo renal, como
também mudança na freqüência cardíaca e atividade do nervo frênico.
A pequena latência das respostas após injeções intracerebroventriculares de
agonistas 5HT sugerem que as áreas envolvidas nestas respostas sejam
próximas ao ventrículo lateral ou terceiro ventrículo, tais como órgão
subfornical, e regiões hipotalâmicas como o núcleo paraventricular (NPV) e
hipotálamo anterior/ área pré-optica (HA/PO) (COOTE, 1990). Estas áreas são
inervadas por neurônios serotoninérgicos dos núcleos mediano e dorsal da rafe
(JACOB e AZIMITIA, 1992), e estudos de autorradiografia demonstraram a
presença de receptores de 5HT nessas regiões (LAMBERT, 1975).
No rato anestesiado, microinjeções de 5HT no HA/PO resultam em intensas
respostas pressoras (SMITS et al., 1978; ROBINSON et al., 1985). Estimulação
elétrica ou química do núcleo dorsal da rafe causa elevações similares da
pressão arterial, que parece ser acompanhada por um aumento da atividade do
nervo renal. Esta resposta pressora foi atenuada pela microinjeção no HA/PO
do antagonista não seletivo de receptores 5HT, 2-bromo dietilamida ácido
lisergico (BOL) e reduzida quando os níveis de 5HT foram depletados (SMITS
et al., 1978) ou quando os neurônios serotoninérgicos do núcleo dorsal da rafe
foram lesados quimicamente (ROBINSONS et al., 1985). Estes resultados
sugerem que as estimulações de vias serotoninérgicas ascendentes induzem
respostas pressoras através da ativação de receptores de 5HT situados no
HA/PO.
1.2.6 Administração de serotonina intracisternalmente
Poucos estudos foram realizados com aplicação de serotonina IC, encontrando
na literatura apenas injeções de agonistas de alguns receptores
serotoninérgicos.
Segundo Pires et. al (1998) aplicações intracisternais de agonistas de
receptores 5HT3 promovem uma tríade de respostas como bradicardia,
hipotensão e apnéia, conhecido como reflexo cardiopulmonar de Bezold-
39
Jarisch (BJ). A tríade depende do nervo vago intacto, sendo mediada através
de centros bulbares de controle respiratório e cardiovascular (freqüência
cardíaca e tônus simpático). Os efeitos respiratórios são mediados através de
aferentes vagais pulmonares, a bradicardia e a hipotensão através de aferentes
vagais cardíacos. Os receptores cardiopulmonares localizam-se em diferentes
estruturas da região cardiopulmonar, incluindo átrios, ventrículos, artérias
coronárias, além do pulmão. Assim, os estímulos capazes de ativarem o reflexo
de Bezold-Jarisch incluem estímulos mecânicos (ex: variações de pressão
intraventricular e intracoronariana), bem como sustâncias químicas exógenas
como: nicotina, capsaicina, veratridina, fenilbiguanida e endógenas como:
serotonina, histamina, bradicinina e algumas prostaglandinas. A ativação do
reflexo Bezold-Jarisch, química ou mecanicamente, elicita as respostas
características de apnéia, bradicardia cardio-vagal e hipotensão, sendo esta
última, parcialmente devido à retirada simpática e conseqüente diminuição do
débito cardíaco (BOGLE et.al, 1990).
Em estudos recentes constataram a presença de receptores serotoninérgico
(5HT1, 5HT2, 5HT3, 5HT4 e 5HT7) no tronco encefálico. Aplicações
intracisternais de antagonistas do 5HT1 atenuaram a bradicardia evocada pela
estimulação de baroreceptores e aferências cardiopulmonares (JORDAN,
2004), o que demonstra a participação dos receptores serotoninérgicos do
tronco encefálico no controle hemodinâmico. Segundo Dedeoglo & Fischer
(1991) aplicações ICV de agonistas do 5HT1A (8-OH-DPAT) promove excitação
simpática, com elevação da pressão arterial. Frente a poucos estudos da
aplicação da serotonina via cisterna magna, esse trabalho propôs avaliar seus
efeitos no sistema cardiorespiratório e na atividade simpática do nervo renal,
comparando com as aplicações via intracerebroventricular.
40
OBJETIVOS
41
OBJETIVO GERAL:
Elucidar a participação dos receptores serotoninérgicos do prosencéfalo e do
tronco cerebral na regulação cardiorespiratória e autonômica.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1- Determinar os efeitos da serotonina MW: 452,64 (sulfato de creatinina)
nas doses de 4, 40 e 120 nmol/kg por via intracisternal e
intracerebroventricular sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca,
freqüência respiratória e atividade de nervo renal em ratos anestesiados.
2- Estudar os efeitos de injeções intracerebroventriculares e intracisternais
de metiotepina MW: 472,61 (methiothepin mesylate, RBI, 0,44 µmol/kg,
antagonista dos receptores: 5HT 1A, 1D, e 5HT2 com intuito de desvendar
se esses subtipos de receptores serotoninérgicos estão envolvidos nas
respostas cardiorrespiratórias e autonômicas.
42
MATERIAIS E MÉTODOS
43
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar, machos, hígidos, com massa igual a 250
gramas, criados e fornecidos pelo biotério do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo.
Os animais foram mantidos em gaiolas de polietileno, em média cinco ratos por
gaiola, com água tratada e alimento “ad libitum”. O controle da luminosidade
era próximo às condições naturais, com ciclo de 12 horas, respeitando o artigo
nº 10 dos princípios éticos na experimentação com animais que diz que os
alojamentos devem propiciar condições adequadas de saúde e conforto,
conforme as necessidades das espécies animais mantidas para
experimentação (UNIFESP,2004).
2.2 ANESTESIA
No início do experimento cada animal foi introduzido em uma cuba de vidro
(3 dm3) contendo algodão hidrófilo embebido com éter etílico PA, para indução
anestésica por inalação. Esse procedimento se justifica para que se torne
possível a canulação da veia femoral e assim seja administrado o anestésico
geral intravenosamente (i.v).
Depois de anestesiados com o éter etílico os animais foram colocados a uma
tábua cirúrgica de madeira, em decúbito dorsal, e mantidos sob anestesia por
inalação através de uma máscara feita com béquer de 125ml revestido
internamente com algodão embebido em éter etílico. Durante todo o período de
canulação da veia femoral esse béquer foi mantido nas narinas do animal para
que o mesmo permanecesse anestesiado.
Após a canulação da veia femoral o béquer foi retirado e a anestesia mantida
com uretana (ethyl carbamate – Sigma Chemical) na dose de 1,2 g kg-1 pela
44
via endovenosa. A escolha desse anestésico foi devido ao fato do mesmo
provocar uma pequena depressão dos reflexos cardiovasculares e respiratórios
do animal, mantendo um longo período de anestesia (MAGGI & MELI, 1986).
Durante a realização do experimento sempre que necessário eram
administradas doses suplementares de uretana para manutenção de um plano
anestésico adequado. O plano anestésico, por sua vez, foi avaliado por meio
de reflexos da córnea e o reflexo de retirada, de modo a respeitar o artigo nº 8
do código de ética na experimentação com animais que diz que se deve
assegurar sedação, analgesia ou anestesia quando se estabelecer o
desencadeamento de dor ou angústia, rejeitando sob qualquer argumento ou
justificativa, o uso de agentes químicos e/ou físicos paralisantes ou não
anestésicos (UNIFESP,2004).
2.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
2.3.1 Canulação
Cada animal foi submetido a uma incisão cutânea de aproximadamente 8 mm,
na linha mediana ventral da região inguinal esquerda, próximo a virilha do
animal, com a finalidade de dissecar, a veia e a artéria femoral.
Para a canulação da veia femoral, foi inserido um cateter de polietileno PE-50,
preenchido com solução salina-heparina (0,9%, 100:1/UI, respectivamente)
acoplado a uma seringa de 1 ml. Posteriormente a artéria femoral foi canulada
utilizando-se também um cateter de polietileno (PE 50) preenchido com salina
heparina 100:1 UI (solução fisiológica heparinizada) acoplado a uma seringa de
1 ml.
2.3.2 Traqueostomia
Após a canulação da veia e artéria femoral respectivamente, foi realizada a
traqueostomia com uma cânula traqueal de polietileno com intuito de melhorar
a ventilação pulmonar do animal durante a realização do experimento.
45
Para a colocação da cânula traqueal, foi concretizada uma incisão de
aproximadamente 5 cm na linha mediana cervical, com exposição e
afastamento dos músculos esterno-hioídeo e tireo-hioídeo, para a visualização
da traquéia . A incisão cirúrgica foi feita entre os anéis traqueais cartilaginosos
e em seguida, inserido o tubo de polietileno com 0,2 mm de diâmetro interno e
6,0 cm de comprimento, interiorizando aproximadamente 1 cm na traquéia.
O registro de volumes respiratório foi realizado conectando-se a cânula
traqueal a um pneumotacógrafo (Fleish 0000) ligado a um transdutor de baixa
pressão (Validyne DP45) e um amplificador (Carrier Amplifier, Gould 20-4615),
conectado ao polígrafo (Gould RS 3400).
2.3.3 Craneotomia
Após a intubação o animal foi colocado em decúbito ventral na tábua cirúrgica
de madeira, para a realização da craneotomia com exposição da calota
craniana e do tronco cerebral.
Para os grupos de ratos que receberiam doses intracisternais de serotonina foi
realizada uma incisão, no sentido antero-posterior, da linha mediana do crânio
do animal, com exposição da calota craniana e dos músculos esplênico da
cabeça, do semi-espinhal cefálico e trapézio. Esses eram cortados com um
bisturi elétrico (BM-250-Medcir) na porção mediana no sentido antero-posterior,
para tornar possível a visualização da membrana atlanto occipital.
Em grupos de ratos que receberiam doses intracerebroventriculares
concretizou-se exposição da calota craniana de maneira a visualizar as
referências anatômicas e suas respectivas suturas craniais.
46
2.3.4 Exposição do rim esquerdo para posteriores registros do nervo
renal
Para expor o nervo renal, o animal foi colocado em decúbito lateral direito para
uma incisão retro-peritoneal no flanco esquerdo. Para isso, concretizou uma
abertura abaixo da costela e acima da crista ilíaca superior, respectivamente na
região lombar. Cuidadosamente as membranas foram retiradas, assim como a
fáscia tóraco-lombar até alcançar os músculos espinhais. Esses músculos, por
sua vez, foram desprendidos da coluna lombar, afastando-os até a chegada
nos órgãos retroperitoneais, sobretudo os rins.
2.4 ESTEREOTAXIA
2.4.1 Posicionamento do animal
Os animais foram posicionados em decúbito ventral em um aparelho
estereotáxico para pequenos animais (Stoelting Wood Dale, IL, USA)
proporcionando firme inserção e simetria bilateral do crânio, com barras de
fixação auriculares colocadas no meato auditivo externo e a barra incisiva
ajustada em -11 mm em grupos de ratos para injeções intracisternais de
serotonina. Para injeções intracerebroventriculares a torre do estereotáxico foi
colocada em posição vertical (angulação zero) e a barra incisiva ajustada em -3
mm, de modo que aos pontos do bregma e lâmbda da calota craniana ficassem
no mesmo nível horizontal. Para certificar sobre o correto posicionamento das
barras auriculares analisava-se se o olho ipsilateral à barra fixada apresentava
tremores e piscadelas, caso apresentasse, provavelmente o posicionamento
estava correto.
2.4.2 Acesso à cisterna magna para injeções intracisternais
Fixado crânio do animal no estereotáxico, visualizou-se a cisterna magna,
localizada inferiormente ao osso occipital. As injeções intracisternais foram
feitas com uma agulha Mizze introduzida na cisterna magna, conectada a uma
cânula de polietileno PE 10 (25 cm de comprimento) preenchida com a
47
solução-teste, por meio de uma microsseringa (Hamilton), nos volumes de
10µl para grupos de serotonina, salina e metiotepina em um tempo de 30
segundos.
2.4.3 Implantação de cânula guia de metal para injeções ICV via ventrículo
lateral direito
Para implantação de cânula guia de metal concretizou-se inicialmente uma
pequena abertura no osso frontal, com o auxílio da broca dentária de aço,
esférica nº 3 adaptada a um motor odontológico (em baixa velocidade).
Com o auxilio de uma torre extra do estereotáxico implantou-se uma cânula de
metal feita com agulha BD 25x7 que teve sua extremidade seccionada,
medindo aproximadamente 2,5 cm. A cânula de metal foi colocada nas
coordenadas em relação ao bregma de 4 mm ventral, 1,5 mm lateral e 1 mm
posterior ( RAMAGE et. al, 1996).
Para certificar que a mesma estava posicionada no ventrículo lateral direito,
conectava-se a cânula de metal na cânula de polietileno (PE 50) que no seu
prolongamento encontrava-se unida a uma outra agulha de injeção (BD 25x7).
Esta agulha, por sua vez se apresentava acoplada na extremidade inferior de
uma pipeta volumétrica com capacidade para 0,2 ml. A pipeta era fixada
aproximadamente 100 cm acima da cabeça do animal. Na extremidade
superior da pipeta havia um pedaço de tubo (10 cm) de látex que era vedado
por uma pinça anatômica. O conjunto de pipeta, cânula PE 50 e cânula
metálica eram preenchidos com soro fisiológico. Quando mantínhamos o tubo
de látex pinçado o soro fisiológico permanecia dentro do sistema e quando
retirávamos a pinça o soro fisiológico vazava. Obedecida as coordenadas, foi
concretizada a descida da cânula de metal a mais ou menos 2 mm, e o
desbloqueio da compressão do látex, retirando a pinça anatômica. Quando
retirávamos à pinça a resistência oferecida pelo tecido cerebral fazia com que o
soro fisiológico ficasse retido no sistema. À medida que aprofundávamos o
eletrodo de metal, com o auxílio do micromanipulador do extereotáxico, íamos
48
observando a coluna de soro fisiológico dentro da pipeta. Quando a ponta da
pipeta de metal atingia o ventrículo cerebral à coluna de soro fisiológico
declinava. Ao detectarmos o deslocamento inferior da coluna de soro
fisiológico, imediatamente pinçava-se o tubo de látex, de maneira que somente
um pequeno volume de soro penetrasse no ventrículo cerebral (não mais que
2µl), e dessa maneira era confirmado a presença da cânula de metal no interior
do ventrículo lateral cerebral direito.
Para injeção de drogas utilizou-se agulha de microinjeção Mizze com 0,2mm de
diâmetro interno, que era colocada dentro da cânula guia de metal. A agulha de
microinjeção encontrava-se conectada a uma seringa Hamilton 10 µl para
grupos de serotonina, salina e metiotepina por meio de uma cânula de
polietileno PE 10 preenchida com a substância a ser injetada.
2.4.4 Exposição do nervo renal
Como descrito anteriormente para expor o nervo renal, foi concretizado em
decúbito lateral direito uma incisão retro-peritoneal no flanco esquerdo, com a
localização do rim esquerdo e da artéria renal correspondente, para posterior
acesso ao nervo renal. Para isso isolou-se o rim, afastando-o das demais
estruturas com afastadores cirúrgicos, expondo dessa maneira o nervo renal,
localizado aproximadamente no entroncamento da aorta abdominal e artéria
renal. Esse nervo, por sua vez foi dissecado sob magnificação de 16 a 32x
(microscópio cirúrgico Zeiss), colocado sobre um eletrodo de prata recoberto
com silicone (President, Coltene) para evitar o ressecamento e a
movimentação do mesmo. Depois de isolado o nervo, os potenciais de ação
extracelulares foram registrados em um amplificador (NL 104, Neurolog,
Digitimer). Os sinais amplificados foram filtrados (NL 126), conectados a um
amplificador de áudio (NL 120) e a atividade elétrica do nervo observada no
osciloscópio (Tektronix 2205). Os dados foram digitalizados (Acqknowledge for
Windows; Biopac Inc.) e armazenados no disco rígido de um computador (PC)
para avaliações posteriores.
49
2.5 TEMPERATURA CORPORAL
Durante todo o experimento, a temperatura corporal do animal foi mantida em
37± 0,5ºC, por meio de uma manta térmica (Harvard- Homeothermic Blanket
Control Unit), com o sensor (par termoelétrico) posicionado no reto do animal.
2.6 REGISTROS HEMODINÂMICOS
A pressão arterial pulsátil (PAP) e a pressão arterial média (PAM) foram
registradas através de uma cânula inserida na artéria femoral esquerda, ligada
a um transdutor de pressão (Viggo-Spectramed, P 23 XL), conectado a um
amplificador (Pressure Processor, Gould, 20-4615-526611). Os registros
desses sinais foram feitos por um polígrafo de quatro canais (Gould RS 3400),
previamente calibrado. A frequência cardíaca (FC) foi medida com um
frequencímetro (Biotach , Gould 13-64615 – 66) a partir da onda de pulso de
pressão arterial. Os registros da PAP, PAM, e FC foram digitalizados (Biopac
MP100) e armazenados no disco rígido de um computador.
2.7. DROGAS UTILIZADAS
Foram utilizadas as seguintes drogas para injeção intracerebroventricular e
intracisternal (todas com o com pH ajustado entre 7,2 e 7,4 com adição de
Pontamine Sky Blue a 2% de concentração final):
1. NaCl a 0,9% como controle;
2. Serotonina Sulfato de Creatinina (5HT; BDH, Poole ,Dorset,UK) em
doses de 4nmol,40nmol e 120nmol/kg. Todas foram dissolvidas em NaCl
0,9% e administradas em um volume de injeção de 10 µl;
3. Metiotepina (Methiothepin Mesylate, RBI), 0,44 µmol/kg, na qual foi
dissolvida em NaCl 0,9% e administrada em um volume de injeção
de10µl.
50
As injeções só eram administradas quando o animal apresentava parâmetros
cardiorespiratórios estáveis.
2.8 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Ao final dos experimentos, os animais ainda vivos e profundamente
anestesiados foram submetidos a uma abertura da região torácica para a
exposição do coração e ligadura da aorta descendente. Foi introduzida uma
agulha no ventrículo esquerdo do rato, na qual estava conectada a uma seringa
de 60 ml, contendo salina (NaCl 0,9%) ou solução de formaldeído 10%. O átrio
esquerdo era então cortado e o animal seqüencialmente perfundido com 100
ml de salina e 100 ml de formaldeído. O cérebro foi removido e fixado em
formaldeído a 10% para a localização da propagação da droga no cérebro do
animal. A analise histológica da propagação da droga podia ser observada
devido ao corante Pontamine Sky Blue que era misturado à solução injetada
intracerebroventricular e intracisternal.
Cinco dias após a fixação, o cérebro foi congelado e seccionado coronalmente
em fatias de aproximadamente 40 µm, colocados em lâminas, corados e
observados sob microscopia óptica para a confirmação histológica. Foram
descartados animais nos quais não foi possível observar a divisão do
Pontamine Sky Blue a partir do ventrículo lateral ou da cisterna magna.
51
2.9 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
2.9.1 Aplicação de serotonina (4 nmol/kg, 40 nmol/kg, 120 nmol/Kg) IC e
ICV
Para todos os experimentos esperou-se a estabilização hemodinâmica do
animal. Quinto minuto após a estabilização injetou-se a serotonina com a
seringa Hamilton 10 µl em um período de 30 segundos. Após a injeção
aguardou-se 5 minutos para a coleta de respostas (CR), seguido de 15 min, 30
min e 60 mim (figura 4). Foram coletadas para avaliação a pressão arterial
média, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e atividade renal (IRNA e
aRNA).
Figura 4: O esquema acima demonstra a aplicação de serotonina após a estabilização hemodinâmica do animal e a coleta de respostas (CR) no 5º, 15º, 30º e 60º min após aplicação da droga.
52
2.9.2. Aplicação de metiotepina 0,44 µmol/kg seguido de serotonina 120
nmol/Kg
Para todos os experimentos esperou-se a estabilização hemodinâmica do
animal. Quinto minuto após a estabilização injetou-se a droga metiotepina 0,44
µmol/kg em 10 µl em um período de 30 segundos, 5 minutos após a injeção
fez-se a coleta de respostas (figura 5A). Em seguida esperou-se 15 minutos
após aplicação de metiotepina para uma nova injeção de droga, porém agora a
serotonina 120 nmol/Kg a 10 µl em um período de 30 segundos (figura 5A).
Logo após a aplicação da serotonina, coletaram-se os dados no 5º, 15º, 30º
min (figura 5B).
A
B
Figura 5: A - O esquema demonstra a aplicação de metiotepina (M) após a estabilização hemodinâmica do animal, a coleta de respostas (CR) 5 minutos depois da aplicação de metiotepina e um espaço de tempo de 15 minutos para aplicação de serotonina 120 nmol/Kg.
B – O esquema demonstra a aplicação de serotonina e a coleta de respostas no 5º, 15º, 30º min.
53
2.9.3 Grupos experimentais
A pesquisa foi realizada utilizando-se os seguintes grupos experimentais: (N de
7 ratos para cada grupo)
a) Grupos de injeção ic:
1. Grupo salina- controle ( NaCl a 0,9 %)
2. Grupo serotonina 4 nmol/Kg
3. Grupo serotonina 40 nmol/Kg
4. Grupo serotonina 120 nmol/Kg
5. Grupo metiotepina 0,44 µmol/kg
b) Grupos de Injeção icv:
1. Grupo salina- controle ( NaCl a 0,9 %)
2. Grupo serotonina 4 nmol/Kg
3. Grupo serotonina 40 nmol/Kg
4. Grupo serotonina 120 nmol/Kg
5. Grupo metiotepina 0,44 µmol/kg
N total: 70 ratos
54
2.9.4 Análise estatística
Técnicas utilizadas:
• Estatísticas Descritivas
• Gráficos de Linhas
• ANOVA para Medidas Repetidas
Programas computacionais utilizados:
• SPSS 11.5
• STATISTICA 6.0
• Excel 2000
• Word 2000
Os resultados foram expressos como média ± erro-padrão da média (EPM). A
estatística utilizada foi Análise da Variância (ANOVA) para medidas repetidas e
quando necessário foi realizado o teste de Duncan a posteriori. O nível de
significância adotado foi de 5%, ou seja, o p-valor menor do que 0,05.
As influências dos fatores grupo e tempo sobre as variáveis estudadas foram
analisadas dentro de dois diferentes grupos de injeção: Intracisternal (IC) e
Intracerebroventricular (ICV), todos comparados com o grupo controle: salina.
Os grupos de serotonina não foram comparados com o grupo de metiotepina
devido aos diferentes tempos em que as observações foram coletadas.
55
RESULTADOS
56
3. RESULTADOS
3.1 GRUPOS DE INJEÇÃO INTRACISTERNAL (IC)
3.1.1 Grupo salina- controle
Aplicações de salina pela via IC não acarretaram alterações significativas na
pressão arterial média, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e atividade
do nervo renal. Esse grupo foi usado como controle.
3.1.2 Grupo serotonina 4 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina na dose de 4 nmol/kg pela via IC
foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM, FC, FR,
IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram: 77,86 ± 1,56 mmHg;
373,29 ± 7,78 bpm; 97,29 ± 2,18 rpm; 49,71 ± 0,81 U.A- IRNA e 1,99 ± 0,16
U.A- aRNA respectivamente ( tabela 1) . A aplicação de serotonina nessa dose
só foi significativa (p< 0,05) no tempo de 15 min para as variáveis: PAM, FC,
IRNA e aRNA, com elevação da PAM (84,43 ± 2,05 mmHg), com aumento de
+6,57 ± 0,49 mmHg ; taquicardia (388,14 ± 9,67 bpm), ∆ de + 14,95 ± 1,89 bpm
e aumento da atividade simpática do nervo renal : ( 52,86 ± 0,74 U.A- IRNA e
3,10 ± 0,25 U.A- aRNA), com ∆ de + 3,15 ± 0,07 U.A - IRNA e + 1,11 ± 0,09
U.A - aRNA vide tabela 1 e figura 6. Quanto a FR não houve alteração
significativa em nenhum dos tempos estudados com aplicação de serotonina.
57
3.1.3 Grupo serotonina 40 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina na dose de 40 nmol/kg pela via IC
foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM, FC, FR,
IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram:74,00 ± 1,53 mmHg; 369,29
± 7,93 bpm; 98,43 ± 1,93 rpm; 51,71 ± 1,11 U.A- IRNA e 1,75 ± 0,08 U.A-
aRNA respectivamente ( tabela 1). A aplicação de serotonina nessa dose
acarretou logo nos primeiros 5 minutos uma elevação significativa (p< 0,05) da
PAM (83,00 ± 1,83 mmHg) , ∆ de + 9 ± 0,3 mmHg uma bradicardia ao invés de
taquicardia observada em doses baixas de 4 nmol/ kg ( 361,86 ± 7,96 bpm),
com queda de – 7,43 ± 0,58 e aumento da atividade simpática renal ( 54,57 ±
1,56 U.A- IRNA e 2,55 ± 0,22 U.A- aRNA ), com ∆ de +2,86 ± 0,45 U.A- IRNA
e + 0,8 ± 0,14 U.A- aRNA respectivamente. Depois de 15 min da
administração de serotonina a resposta tornou-se mais acentuada com
elevação da PAM (87,57 ± 1,51 mmHg), um aumento de + 13,57 ± 0,02 mmHg;
bradicardia ( 355,29 ± 8,25 bpm), representando uma queda de -14 ± 0,32 bpm
e aumento da atividade simpática do nervo renal : ( 54,57 ± 1,56 U.A- IRNA e
3,29 ± 0,22 U.A- aRNA), com ∆ de + 2,86 ± 0,45 U.A- IRNA e + 1,54 ± 0,14
U.A- aRNA respectivamente vide tabela 1 e figura 6. Quanto a FR não houve
alteração significativa em nenhum dos tempos estudados.
3.1.4 Grupo serotonina 120 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina na dose de 120 nmol/kg pela via IC
foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM, FC, FR,
IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram: 75,00 ± 5,81 mmHg;
364,57 ± 12,46 bpm; 96,29 ± 2,63 rpm; 50,29 ± 0,68 U.A- IRNA e 1,92 ± 0,06
U.A- aRNA respectivamente ( tabela 1). A aplicação de serotonina nessa dose
só foi significativa (p< 0,05) depois de 15 min da administração de serotonina,
na qual houve uma elevação da PAM (84,29 ± 5,53 mmHg), um aumento de +
9, 29 ± 0,28 mmHg; bradicardia (349,86 ± 12,78 bpm), com queda de – 14,71
± 0,32 bpm e aumento da atividade simpática do nervo renal : ( 54,86 ± 1,44
U.A- IRNA e 3,56 ± 0,09 U.A- aRNA), com ∆ de + 4,57 ± 0,76 U.A- IRNA e +
58
1,64 ± 0,03 U.A- aRNA, vide tabela 1 e figura 6. Quanto a FR não houve
alteração significativa em nenhum dos tempos estudados.
3.1.5 Grupo metiotepina: 0,44 µmol/kg
Os efeitos da administração de metiotepina, antagonista de 5HT 1A , 1D e 5HT 2
na dose 0,44 µmol/kg via IC foram estudados em 7 ratos anestesiados. Esse
fármaco, por sua vez foi aplicado 15 minutos antes da maior dose de
serotonina : 120 nmol/kg , com intuito de observar seus efeitos sobre a
simpaticoexcitação observada com a aplicação da serotonina IC. A injeção de
metiotepina não acarretou alterações significativas.
Os valores basais da PAM, FC, FR, IRNA e aRNA, apresentados por esse
grupo foram: 77,29 ± 3,91 mmHg; 374,86 ± 12,27 bpm; 96,71 ± 1,49 rpm; 51,57
± 1,02 U.A- IRNA e 1,89 ± 0,14 U.A- aRNA respectivamente ( tabela 1). A
metiotepina , foi aplicada 5 minutos depois da estabilização hemodinâmica do
animal , esperou-se 15 minutos após a sua administração e aplicou-se em
seguida a serotonina na maior dose. 5 minutos após a aplicação de serotonina
ocorreu uma queda significativa (p< 0,05) da PAM (68,86 ± 3,74 mmHg), queda
de – 8,43 ± 1,00 mmHg, taquicardia ( 383,57 ± 12,23 bpm), + 8,71 ± 0,04 bpm
e diminuição da atividade do nervo renal (48,57 ± 0,37 U.A- IRNA e 1,66 ±
0,16 U.A- aRNA), com ∆ de – 3 ± 0,65 U.A- IRNA e – 0,23 ± 0,02 U.A- aRNA
respectivamente, exatamente a resposta oposta observada com a injeção de
serotonina nas maiores doses ( 40 e 120 nmol/kg). Depois de 15 min da
administração de serotonina houve uma queda mais acentuada da PAM (46,43
± 2,91 mmHg) , com ∆ de – 30, 86 ± 1,00 mmHg , um aumento da FC ( 399, 71
± 10,73 bpm) + 24,85 ± 1,54 bpm e diminuição da atividade do nervo renal
(46,00 ± 2,23 U.A- IRNA e 1,15 ± 0,12 U.A- aRNA), com ∆ de – 5,57 ± 1,21
IRNA e – 0,74 ± 0,02 aRNA respectivamente, vide tabela 1 e figura 7. Quanto a
FR não houve alteração significativa em nenhum dos tempos estudados.
62
Tabela 1 : valores das variáveis basais (PAM, FC, FR, IRNA e a RNA) e suas mudanças com aplicação i.c de serotonina nas concentrações 4, 40, 120 nmol/kg e metiotepina.
70
75
80
85
90
95
P A M ( m m H g ).. *
*****
340
350
360
370
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390
400
410
F C ( b p m )..
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***
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94
96
98
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102
104
106
108
110
112
F R ( r p m )
44
46
48
50
52
54
56
58
I R N A ( U. A )....
***
***
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1,00
2,00
3,00
4,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A ).
Salina (NaCI a 0,9%) Serotonina 4 nmol
Serotonina 40 nmol Serotonina 120 nmol
5HTII IIIIII
***
***
Figura 6: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas nos grupos i.c de salina-controle e serotonina: 4, 40 e 120 nmol/kg. ( 5HT- serotonina ; II- tempos em que foram coletados os resultados). A serotonina foi aplicada 5 min depois da estabilização hemodinâmica do animal. A significância (p < 0,05) está representada por asterisco (*).
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
P A M ( m m H g )
* *
340
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380
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410
F C ( b p m )
*
*
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F R ( r p m )
42
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46
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52
54
I R N A ( U. A )...
**
0,00
1,00
2,00
3,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A )..
Salina (NaCI a 0,9%) Metiotepina
MII IIIIII
5HT
**
Figura 7: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas nos grupos i.c salina-controle e metiotepina 0, 44µmol/kg.( M- metiotepina; 5HT- serotonina ; II- tempos em que foram coletados os resultados). A 5HT foi aplicada 15 min depois da M. A significância (p < 0,05) está representada por asterisco (*).
3.2. GRUPOS DE INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR (ICV)
3.2.1 Grupo salina- controle
Aplicações de salina pela via ICV não acarretaram alterações significativas na
pressão arterial média, freqüência cardíaca, freqüência respiratória e atividade
do nervo renal. Esse grupo foi usado como controle.
3.2.2 Grupo serotonina 4 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina na dose de 4 nmol/kg pela via ICV
foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM, FC, FR,
IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram: 76,57 ± 2,59 mmHg;
370,71 ± 8,36 bpm; 96,00 ± 1,76 rpm; 51,43 ± 0,95 U.A- IRNA e 2,11 ± 0,13
U.A- aRNA respectivamente (tabela 2) . A aplicação de serotonina nessa dose
acarretou logo nos primeiros 5 minutos elevação significativa (p < 0,05) da
PAM (83,00 ± 2,56 mmHg) , um aumento de + 6,43 ± 0,03 mmHg aumento da
FC de + 2,15 ± 0,0 bpm porém não significativo e aumento significativo ( p<
0,05) da atividade simpática renal ( 53,43 ± 0,57 U.A- IRNA e 3,56 ± 0,11 U.A-
aRNA), com ∆ + 2 ± 0,38 U.A- IRNA e + 1, 45 ± 0,02 U.A- aRNA
respectivamente, vide tabela 2 e figura 8. Depois de 15 min da administração
de serotonina a taquicardia aumentou significativamente (404,14 ± 9,37 bpm),
uma elevação de + 33,43 ± 1,00 e as outras variáveis continuaram elevadas
significativamente quando comparadas com os valores basais (81,14 ± 2,76
mmHg; 52,57± 1,43 U.A- IRNA e 3,22 ± 0,16 U.A-aRNA), com ∆ de + 4,57 ±
0,17 mmHg, + 1,14 ± 0,48 U.A -IRNA e + 1,11 ± 0,03 U.A -aRNA
respectivamente, vide tabela 2 e figura 8 . Quanto a FR não houve alteração
significativa em nenhum dos tempos estudados com aplicação de serotonina.
3.2.3 Grupo serotonina 40 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina em doses altas de 40 nmol/kg pela
via ICV foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM,
FC, FR, IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram:78,86 ± 3,27
mmHg; 382,43 ± 12,36 bpm; 97,86 ± 2,23 rpm; 51,43 ± 1,21 IRNA e 1,66 ±
0,05 aRNA respectivamente (tabela 2). A aplicação de serotonina nessa
concentração acarretou logo nos primeiros 5 minutos uma elevação
significativa (p < 0,05) da PAM (94,57 ± 2,56 mmHg) , um aumento de + 15,71
± 0,03 mmHg uma bradicardia ao invés de taquicardia observada na
concentração baixa de 4 nmol/ kg ( 365,86 ± 12,46 bpm), apresentando uma
queda de - 16.57 ± 0,1 mmHg e aumento da atividade simpática renal ( 54,29
± 1,71 U.A- IRNA e 3,35 ± 0,13 U.A- aRNA ), com ∆ de 2,86 ± 0,5 U.A- IRNA
e + 1,69 ± 0,08 U.A- aRNA respectivamente. Depois de 15 min da
administração de serotonina houve uma resposta mais acentuada com
elevação da PAM (96,57 ± 2,42 mmHg), um aumento de + 17,71 ± 0,85 mmHg;
bradicardia (332,86 ± 13,09 bpm), representando uma queda de – 49,57 ± 0,73
bpm e aumento da atividade simpática do nervo renal : (55,43 ± 2,17 U.A-
IRNA e 3,88 ± 0,05 U.A- aRNA), com ∆ de + 4 ± 0,96 U.A- IRNA e + 2,22 ±
0,00 U.A- aRNA respectivamente, vide tabela 2 e figura 8. Quanto a FR não
houve alteração significativa em nenhum dos tempos estudados.
3.2.4 Grupo serotonina 120 nmol/Kg
Os efeitos da administração de serotonina na dose de 120 nmol/kg pela via ICV
foram estudados em 7 ratos anestesiados. Os valores basais da PAM, FC, FR,
IRNA e aRNA, apresentados por esse grupo foram: 98,14 ± 8,10 mmHg;
396,14 ± 16,58 bpm; 96,29 ± 2,63 rpm; 51,43 ± 0,95 U.A- IRNA e 1,87 ± 0,08
U.A- aRNA respectivamente (tabela 2). A aplicação de serotonina nessa dose
acarretou logo nos primeiros 5 minutos uma elevação significativa (p< 0,05) da
PAM (118,43 ± 5,25 mmHg) , um aumento de + 20,29 ± 2,85 mmHg,
diminuição não significativa da FC de – 1,57 ± 0,57 bpm e aumento
significativo ( p < 0,05) da atividade simpática renal (52,57 ± 1,29 U.A- IRNA e
4,82 ± 0,17 U.A- aRNA ), com ∆ de + 1,14 ± 0,34 U.A- IRNA e + 2,95 ± 0,09
U.A- aRNA respectivamente. Depois de 15 min da administração de serotonina
houve uma resposta significativa (p < 0,05) com bradicardia (328,00 ± 16,12
bpm), queda de – 68,14 ± 0,46 bpm e aumento significativo (p <0,05) da
atividade simpática do nervo renal: (55,14± 0,59 U.A- IRNA e 4,94 ± 0,22 U.A-
aRNA), com ∆ de + 3,71 ± 0,36 U.A- IRNA e + 3,07 ± 0,14 U.A- aRNA
respectivamente. Quanto à pressão arterial o valor manteve-se igual ao tempo
de 5 minutos após a aplicação de serotonina, vide tabela 2 e figura 8 e a FR
não houve alteração significativa em nenhum dos tempos estudados.
3.2.5 Grupo metiotepina: 0,44 µmol/kg
Os efeitos da administração de metiotepina, antagonista de 5HT 1A , 1D e 5HT 2
na dose de 0,44 µmol/kg via ICV foram estudados em 7 ratos anestesiados.
Esse fármaco, por sua vez foi aplicado 15 minutos antes da maior
concentração de serotonina: 120 nmol/kg , com intuito de observar seus efeitos
sobre a simpaticoexcitação detectada com a aplicação da serotonina ICV. A
injeção de metiotepina não acarretou alterações significativas.
Os valores basais da PAM, FC, FR, IRNA e aRNA, apresentados por esse
grupo foram: 83,29 ± 3,01 mmHg; 361,43 ± 8,08 bpm; 94,00 ± 3,12 rpm; 53,43
± 1,43 U.A- IRNA e 1,96 ± 0,17 U.A- aRNA respectivamente ( tabela 2). A
metiotepina, foi aplicada 5 minutos depois da estabilização hemodinâmica do
animal, esperou-se 15 minutos após a sua administração e aplicou-se em
seguida a serotonina na maior dose. As respostas só foram significativas (p <
0,05) nos primeiros 5 minutos após a aplicação de serotonina, com uma queda
da PAM (54,43 ± 2,65 mmHg), queda essa de – 28, 86 ± 0,36 mmHg,
taquicardia ( 388,43 ± 10,27 bpm), com elevação da FC de + 27 ± 2,19 bpm e
diminuição da atividade do nervo renal( 49,14 ± 0,86 U.A- IRNA e 1,39 ± 0,12
U.A- aRNA), com ∆ de -4,29 ± 0,57 U.A- IRNA e – 0,57 ± 0,05 U.A- aRNA,
vide tabela 2 e figura 9. Depois de 15 min as respostas tenderam aos valores
basais. Quanto a FR não houve alteração significativa em nenhum dos tempos
estudados.
Tabela 2 : valores das variáveis basais (PAM, FC, FR, IRNA e a RNA) e suas mudanças com aplicação i.c.v de serotonina nas concentrações 4, 40,
120 nmol/kg e metiotepina.
70
80
90
100
110
120
130
P A M ( m m H g )
***
***
325
335
345
355
365
375
385
395
405
415
425
F C ( b p m )
***
***
88
90
92
94
96
98
100
102
104
106
108
110
F R ( r p m )
44
46
48
50
52
54
56
58
60
I R N A ( U. A ).. *
**
***
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A ).
Salina (NaCI a 0,9%) Serotonina 4 nmol
Serotonina 40 nmol Serotonina 120 nmol
5HTII IIIIII
***
***
Figura 8: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas nos grupos i.c.v de salina-controle e serotonina: 4, 40 e 120 nmol/kg. ( 5HT- serotonina ; II- tempos em que foram coletados os resultados). A serotonina foi aplicada 5 min depois da iniciação experimental. A significância (p < 0,05) está representada por asterisco (*).
50
55
60
65
70
75
80
85
90
P A M ( m m H g )
*
350
355
360
365
370
375
380
385
390
395
400
F C ( b p m )
*
88
90
92
94
96
98
100
102
104
F R ( r p m )
44
46
48
50
52
54
56
I R N A ( U. A )..
*
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A ).
Salina (NaCI a 0,9%) Metiotepina
MII IIIIII5HT
*
Figura 9: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas nos grupos i.c.v salina-controle e metiotepina 0,44 µmol/kg.( M- metiotepina; 5HT- serotonina ; II- tempos em que foram coletados os resultados). A 5HT foi aplicada 15 min depois da metiotepina. A significância (p < 0,05) está representada por asterisco (*).
3.3 COMPARAÇÃO DOS GRUPOS DE INJEÇÃO (INTRACISTERNAL E
INTRACEREBROVENTRICULAR) EM CADA TEMPO EXPERIMENTAL
3.3.1 Serotonina
Com o propósito de comparar a intensidade dos efeitos em cada tempo
estudado com a aplicação de serotonina pelas vias intracisternal e
intracerebroventricular, foram concretizadas tabelas contendo estatísticas
descritivas (n, mínimo, máximo, média e erro padrão da média) e gráficos de
linhas vide tabela 3 e figura 10. A tabela 3 mostra as médias ± EPM em cada
tempo experimental nas vias IC e ICV. Na figura 10 observamos que para o
grupo ICV ocorreu um aumento da média da variável PAM após o tempo 5 min
(+ 11 ± 0,42 mmHg) e para o grupo Intracisternal ocorreu um aumento após o
tempo de 15 min (+7 ± 0,38 mmHg). Quanto a variável FC em ambos os grupos
a menor média ocorreu no tempo de 15 min (- 21,11 ± 2,01 bpm) para os
grupos ICV e (- 4 ± 0,91 bpm) para os grupos IC. Já a atividade do nervo renal,
levando em conta a área do nervo renal tanto em injeções IC como para
injeções ICV a maior média ocorreu no tempo de 15 min (+ 1,6 ± 0,2 U.A-
aRNA ) em grupos ICV ( + 1,08 ± 0,12 aRNA U.A) em grupos IC ,ocorrendo
uma queda após o mesmo.
Tabela 3: comparação das médias e EPM dos resultados obtidos pelos grupos i.c e i.c.v de serotonina em cada tempo experimental.
7 7 7 7 7
7 7 7 7 7
75
80
85
90
95
100
P A M ( m m H g )
355
360
365
370
375
380
F C ( b p m )
96
97
98
99
100
F R ( r p m )
46,0
48,0
50,0
52,0
54,0
I R N A ( U. A )
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A )..
Injeção ic Injeção icv
5HTII IIIIII
Figura 10: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas,
comparando os grupos i.c e i.c.v com aplicação de serotonina em todas as doses.
3.3.2 Metiotepina
Com o intuito de comparar a intensidade dos efeitos em cada tempo estudado
com a aplicação de metiotepina e serotonina 120 nmol/kg pelas vias
intracisternal e intracerebroventricular, foram concretizadas tabelas contendo
estatísticas descritivas (n, mínimo, máximo, média e erro padrão da média) e
gráficos de linhas vide tabela 4 e figura 11. A tabela 4 mostra as médias ± EPM
em cada tempo experimental nas vias IC e ICV. Na figura 11 podemos
observar que as respostas inibidoras da metiotepina sobre a serotonina
obedecem o mesmo tempo de 05 minutos para injeções ICV e 15 min para
injeções IC, ambos já encontrados nas aplicações de serotonina para todas as
concentrações. A diminuição da PAM e a redução da atividade simpática renal
obtiveram respostas semelhantes tanto para injeções IC como para injeções
ICV, com ∆ para IC de -16,21 ± 3,2 mmHg e - 0,38 ± 0,01 U.A- aRNA e para
grupos ICV de – 15,14 ± 2,16 mmHg e – 0,29 ± 0,02 U.A- aRNA. Quanto a
taquicardia observada com aplicação de metiotepina junto a serotonina na
maior dose , também acarretou respostas semelhantes , tendo ∆ para IC de +
12.15 ± 0,81 bpm e ∆ para ICV de + 13.43 ± 1,61 bpm.
Tabela 4: comparação das médias e EPM dos resultados obtidos pelos grupos i.c e i.c.v de metiotepina em cada tempo experimental.
7 7 7 7 7
7 7 7 7 7
65
70
75
80
85
90P A M ( m m H g )
350
355
360
365
370
375
380
385
F C ( b p m )
92
94
96
98
100
F R ( r p m )
44,0
46,0
48,0
50,0
52,0
54,0
I R N A ( U. A ).
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Tempo (minutos)
a R N A ( U. A )..
Injeção ic Injeção icv
MII IIIIII
5HT
Figura 11: Gráficos de linhas ao longo do tempo para as variáveis estudadas, comparando os grupos i.c e i.c.v com aplicação de metiotepina 0,44 µmol/kg.
DISCUSSÃO
4. DISCUSSÃO
O encéfalo humano como de todos os outros vertebrados, apresenta três
divisões, cada um possuindo componentes e subdivisões relativamente
constantes, são eles o prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. Na
embriologia o prosencéfalo se diferenciou em mais duas subdivisões: o
telencéfalo, na qual seu termo é virtualmente sinônimo de hemisférios cerebrais
e abrange todo o córtex cerebral e a sua segunda subdivisão é o diencéfalo,
situado entre o mesencéfalo e o telencéfalo. O diencéfalo inclui os tálamos,
corpos geniculados lateral e medial, hipotálamo, relacionado com funções
autonômicas e neuroendócrinas, epitálamo e subtálamo. A segunda divisão do
encéfalo, chamado de mesencéfalo não se diferenciou na embriologia e sua
função é relacionada aos movimentos dos olhos, visão, movimentos do corpo e
audição. Já o rombencéfalo se subdividiu em metencéfalo, abrangendo o
cerebelo e a ponte e o mielencéfalo, abrangendo o bulbo. Quando aplicamos
qualquer substância por via intracerebroventricular, ou seja, no interior do
ventrículo cerebral, a mesma se dispersa por todo o prosencéfalo. Inicialmente
a substância entra em contato com o líquor nas cavidades ventriculares laterais
(direito e esquerdo), sendo que na pesquisa aplicou-se serotonina e
metiotepina no ventrículo lateral direito. Esses ventrículos se comunicam com o
III ventrículo através do forame interventricular. O III ventrículo se comunica
com o IV ventrículo através do aqueduto cerebral e é continuado pelo canal
central da medula, na qual se comunica com o espaço subaracnóide
(DANGELO, 2000; MACHADO, 2000).
Segundo Ramage e colaboradores (1996) administração intracerebroventricular
de serotonina em ratos conscientes causa elevação da pressão arterial nos
primeiros minutos com liberação de vasopressina, adrenalina e aumento da
atividade renal, na qual ambos são abolidos pelo pré-tratamento com
antagonista do receptor 5HT2. A resposta pressora era abolida também quando
os animais eram previamente adrenalectomizados ou tratados com
antagonistas de receptores da vasopressina (receptores V1).
Com essa pesquisa constatou-se que a aplicação de serotonina ICV em ratos
anestesiados em altas doses: 40nmol/kg e 120 nmol/kg também promove uma
resposta pressora acompanhado com uma bradicardia, ao contrário em baixas
doses (4 nmol/kg) acarreta uma resposta pressora , porém acompanhado com
uma taquicardia. Ramage e colaboradores obtiveram as mesmas respostas,
porém em ratos conscientes. A diferença seria nos tempos das respostas, na
qual com essa pesquisa constatou que em ratos anestesiados aplicação de
serotonina ICV surte os efeitos pressóricos nos primeiros 5 minutos, persistindo
aumento até o tempo de 15 minutos para todas as doses.
A pequena latência das respostas (5 a 15 min) após injeções
intracerebroventriculares de 5HT sugere-se que as áreas envolvidas sejam
próximas ao ventrículo lateral ou terceiro ventrículo, tais como órgão
subfornical, e regiões hipotalâmicas como o núcleo paraventricular (NPV) e
hipotálamo anterior/ área pré-optica (HA/PO) (COOTE, 1990). Estas áreas são
inervadas por neurônios serotoninérgicos dos núcleos mediano e dorsal da rafe
(JACOB e AZIMITIA, 1992), e estudos de autorradiografia demonstraram a
presença de receptores de 5HT nestas regiões (LAMBERT,1975).
O núcleo paraventricular do hipotálamo (NPV) é uma das fontes reconhecidas
como participantes da geração do tônus simpático, pois a mesma se conecta
com o RVLM e consequentemente com a coluna IML, na qual contém
neurônios pré-ganglionares simpáticos que quando estimulados levam
simpaticoexcitação para o coração, vasos de resistência e adrenais. Além
disso, apresenta também uma importante participação no controle do balanço
hidroeletrolítico estando envolvido também na regulação da ingestão de água e
sódio. Pesquisas recentes mostraram a presença de receptores do tipo 5HT1,
destacando-se os subtipos 5HT1A, 5HT1B, 5HT1C e 5HT1D. O receptor 5HT1A foi
um dos primeiros a ser identificado e é encontrado nas formas
somatodendrítica e pós sináptica. Estudos anteriores demonstraram o
envolvimento dos receptores 5HT1A do NPV do hipotálamo no controle do
equilíbrio hidroeletrolítico. Em estudos mais recentes constataram uma grande
presença também de receptores do tipo 5HT2, na qual quando ativados
estimulam essa estrutura a liberar a vasopressina, acarretando a
simpaticoexcitação (CHAOULOFF, 1993).
Estudos concretizados por Ramage et al (1996) constataram que a
simpaticoexcitação encontrada com aplicações de serotonina ICV se dá pela
estimulação de receptores 5HT1A e 5HT2 situados no prosencéfalo,
provavelmente no hipotálamo (diencéfalo) na qual o primeiro receptor quando
estimulado faz liberar adrenalina, um neuro-hormônio produzido e secretado
pelas supra renais e o segundo receptor quando estimulado faz liberar a
vasopressina, um potente vasoconstrictor produzido e liberado pelo hipotálamo.
Acredita-se que ativação do receptor 5HT1A localizado nas áreas próximas ao
ventrículo lateral, estimule o hipotálamo, na qual esse faz conexão com o
RVLM ativando-o e consequentemente excitando neurônios pré-ganglionares
da coluna IML. Esses neurônios promovem ativação do coração, vasos de
resistência e por fim as glândulas adrenais. A simpaticoexcitação ativa as
adrenais a liberarem o hormônio adrenalina, que se liga ao B2 adrenoreceptor
localizado no quarto posterior vascular, acarretando uma vasodilatação.
Segundo Ramage e colaboradores (1996) a baixa dose de serotonina faz
liberar mais adrenalina do que vasopressina, provavelmente por ativarem
menos áreas do diencéfalo do que em altas doses e essas pequenas áreas
ativadas provavelmente são portadoras de receptores do tipo 5HT1. A
vasodilatação promovida pela adrenalina mascara os efeitos vasoconstrictores
da vasopressina acarretando uma taquicardia ao invés de bradicardia,
encontrado com aplicação de altas doses de serotonina. A vasopressina, como
visto é liberada com ativação de receptores 5HT2, provavelmente também
encontrada no diencéfalo. Esse é um potente vasoconstrictor também
conhecido como hormônio anti-diurético, sendo sintetizado nos núcleos
supraópticos e paraventriculares do hipotálamo e transportado para a hipófise
posterior, onde é armazenado. Pelos estudos de Pérgola e Alper (1992) a
bradicardia encontrada em altas doses de serotonina é meramente reflexa dos
baroreceptores , que detectam o aumento da atividade simpática e compensa
com uma bradicardia. Isso ocorre pelo fato dos baroreceptores localizados no
arco aórtico e no seio carotídeo detectarem variações de pressão, na qual essa
informação trafega pelos nervos glossofaríngeo e vago convergindo para a
região do NTS. A partir daí os neurônios se projetam para a área bulbar
ventrolateral , mais especificamente o CVLM , que inibe o RVLM , resultando
em diminuição do tônus simpático para o coração e vasos ( CRAVO et. al,
2006). A ação da vasopressina na FC seria de potencializar os efeitos dos
baroreceptores, visto que em ratos conscientes pré-tratados com antagonistas
dos receptores V1 da vasopressina, houve bradicardia, porém menos
acentuada. A ação desse hormônio com os baroreceptores remanesce a ser
esclarecida (RAMAGE et. al, 1996; PERGOLA & ALPER, 1992).
A perfusão do leito vascular capilar constitui um elemento essencial da
homeostasia. É através do fluxo sanguíneo que percorre este território e das
trocas que aí se realizam, que o interstício pode ser renovado, mantendo-se
nas condições ideais para a homeostasia celular. A perfusão do leito capilar
depende de níveis adequados de pressão sanguínea arterial, uma vez que esta
constitui a força motriz que propulsiona o sangue até o território capilar. Há
mais de um século, sabe-se que o tronco cerebral e mais especificamente o
bulbo (ou medula oblonga) constitui o segmento crítico para a regulação neural
da pressão arterial (CRAVO et al, 2006; CAMPAGNOLE & HAIBARA, 2001).
Devido a importância do tronco encefálico para o controle da pressão arterial e
pelos inúmeros receptores serotoninérgicos na sua estrutura, aplicou-se a
serotonina e a metiotepina no rombencéfalo através da cisterna magna,
localizada inferiormente ao osso occipital. Com essa pesquisa pode-se notar
que injeção de serotonina IC surte os mesmos efeitos quando comparados com
as respostas de injeções ICV. Ou seja aplicações de serotonina em baixa dose
promove aumento da PAM , taquicardia , acompanhado com aumento da
atividade simpática do nervo renal e em altas doses promove os mesmos
efeitos porém com uma bradicardia, todos no tempo de 15 minutos.
Provavelmente essas respostas estejam sendo mediadas por liberações dos
mesmos hormônios: vasopressina e adrenalina.
Sabe-se na literatura que o núcleo dorsal da rafe apresenta conexões com
núcleo paraventricular (NPV) e hipotálamo anterior/ área pré-optica. Na
estrutura desse núcleo, localizado no tronco encefálico, encontram-se
receptores 5HT1A e 5HT2. Sua ativação poderia estar acarretando a liberação
de vasopressina pelas estruturas do diencéfalo. Conclui-se que em injeções
ICV a resposta é mais rápida, pois o ventrículo lateral é bem próximo das
estruturas hipotalâmicas e em injeções IC depende da ativação de regiões do
tronco encefálico para depois ativarem essas estruturas. A hipótese seria que
esses receptores localizados no núcleo dorsal da rafe estariam ativando a
estrutura hipotalâmica e com isso haveria liberação de vasopressina e ativação
do RVLM para o aumento da pressão arterial.
Provavelmente o receptor envolvido nessas respostas seria o 5HT2, pois o
5HT1 no rombencéfalo, mais especificamente no núcleo dorsal da rafe atua
como autoreceptor somatodendrítico e quando estimulados diminuem o disparo
da célula neuronal, enquanto que antagonistas seletivos e não seletivos desses
receptores determinam um bloqueio do efeito mencionado (HOYER et. al,
1993).
Aplicações de metiotepina, antagonista dos receptores 5HT 1A, 1D e 5HT2
promoveu uma queda da PAM, queda da atividade simpática renal e
taquicardia, sendo que esses resultados foram encontrados em maior destaque
5 minutos após aplicação de serotonina para grupos ICV e 15 minutos após
aplicação de serotonina para grupos IC. Com isso sugere-se que realmente o
5HT2 esteja envolvido nas respostas tanto em aplicações ICV como em
aplicações IC, porém também deve haver outros subtipos de receptores
serotoninérgicos envolvidos nessas respostas e que merecem serem
explorados.
Com essa pesquisa observou-se a importância dos receptores serotoninérgicos
na regulação da pressão arterial, tanto em nível de prosencéfalo como em nível
do rombencéfalo, proporcionando condições ideais para a homeostasia celular.
Estudos adicionais com diferentes antagonistas dos receptores
serotoninérgicos são necessários para elucidar de forma definitiva a
participação da serotonina no controle central cardiovascular.
CONCLUSÃO
5. CONCLUSÃO
• Aplicação de serotonina intracisternal ma dose de 4nmol/kg
acarretou 15 min após a injeção um aumento de PAM, taquicardia,
elevação da atividade simpática renal. Quanto a FR não houve
alteração significativa em nenhum dos tempos estudados com
aplicação de serotonina.
• Aplicação de serotonina intracisternal nas doses de 40 e 120 nmol/kg
acarretou 15 min após a injeção um aumento da PAM, com maior
destaque para a dose de 40 nmol/kg, elevação da atividade
simpática do nervo renal, com uma maior resposta para dose de 120
nmol/kg e queda da FC, na qual as duas doses obtiverem respostas
semelhantes. Quanto a FR não houve alteração significativa em
nenhum dos tempos estudados com aplicação de serotonina.
• Aplicação de serotonina intracerebroventricular na dose de 4nmol/kg
acarretou 5 min após a injeção um aumento de PAM, um aumento
não significativo da FC e elevação significativa da atividade simpática
renal. 15 min após a aplicação de serotonina houve uma elevação
mais acentuada da FC, agora de valor significativo. Quanto a FR não
houve alteração significativa em nenhum dos tempos estudados com
aplicação de serotonina.
• Aplicações de serotonina intracerebroventricular nas doses: 40 e 120
nmol/kg acarretaram 5 min após a injeção um aumento da PAM,
bradicardia e aumento da atividade simpática do nervo renal, porém
a resposta mais acentuada ocorreu no 15º minutos após aplicação
de serotonina. Quanto a FR não houve alteração significativa em
nenhum dos tempos estudados com aplicação de serotonina.
• Comparando as duas vias de injeções as respostas foram mais
acentuadas quando a serotonina era aplicada intracerebroventricular.
• Aplicações de metiotepina, antagonista dos receptores 5HT 1A, 1D e
5HT2 promoveu uma queda da PAM, queda da atividade simpática
renal e taquicardia, sendo que esses resultados foram encontrados
em maior destaque 5 minutos após aplicação de serotonina para
grupos ICV e 15 minutos após aplicação de serotonina para grupos
IC. Quanto a FR não houve alteração significativa em nenhum dos
tempos estudados com aplicação de serotonina.
• Comparando as duas vias de injeções: IC e ICV para aplicações de
metiotepina, as respostas foram semelhantes, porém em tempos
diferentes.
Os resultados obtidos nesse estudo sugerem uma importante participação dos
subtipos de receptores 5HT1 e 5HT2 localizados no prosencéfalo e participação
do 5HT2 e outros subtipos de receptores no rombencéfalo na modulação da
homeostasia e da atividade simpática renal.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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