raquitismo e osteomalácia hipofosfatêmicos de origem ... · programa de endocrinologia....
TRANSCRIPT
!
Guido de Paula Colares Neto
Raquitismo e osteomalácia hipofosfatêmicos
de origem genética mediados por FGF23:
caracterização molecular, óssea e renal
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Programa de Endocrinologia
Orientadora: Dra. Regina Matsunaga Martin
São Paulo
2015
!
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Colares Neto, Guido de Paula Raquitismo e osteomalácia hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 : caracterização molecular, óssea e renal / Guido de Paula Colares Neto. -- São Paulo, 2015.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Endocrinologia.
Orientadora: Regina Matsunaga Martin. Descritores: 1.Raquitismo 2.Osteomalácia 3.Raquitismo hipofosfatêmico
familiar 4.Hipofosfatemia 5.Hipofosfatemia familiar 6.Endopeptidase neutra reguladora de fosfato PHEX 7.Densitometria 8.Nefrocalcinose 9.Nefrolitíase 10.Ultrassonografia 11.Tomografia computadorizada por raios X 12.Densidade óssea
USP/FM/DBD-305/15
!
Este trabalho foi realizado na Unidade de
Doenças Osteometabólicas e no
Laboratório de Hormônios e Genética
Molecular (LIM/42) da disciplina de
Endocrinologia do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo.
!
Dedicatória
Dedico esta tese à minha família pelo apoio constante.
Sem ele, nada disto seria possível.
!
Agradecimentos À equipe da Unidade de Doenças Osteometabólicas:
À minha orientadora, Dra. Regina Matsunaga Martin, por seu
brilhantismo, simplicidade e dedicação na condução deste projeto. Foram
cinco anos de convivência e amizade, nos quais aprendi a ter curiosidade
pelo conhecimento científico e entendi que todo aprendizado deve ser
revertido na melhoria do cuidado dos pacientes. Obrigado por ser um
modelo e inspiração no meu dia a dia.
Ao Dr. Pedro Henrique Silva Corrêa pelo estímulo na busca do
conhecimento através das suas perguntas perspicazes.
Ao Dr. Bruno Ferraz de Souza pelas valiosas discussões científicas e
conselhos que engrandeceram meu aprendizado.
À Mariana Tenório Antunes Reis e Marcela Paula Ferraz pelo convívio
nos ambulatórios.
Ao grupo do Laboratório de Hormônios e Genética Molecular/LIM-42:
À Dra. Berenice Bilharinho de Mendonça pela acolhida e apoio
durante todo este trabalho.
Ao Dr. Ivo Jorge Prado Arnhold pela generosidade e auxílio no início
deste projeto.
Ao Dr. Vinicius Nahime Brito por compartilhar os seus conhecimentos
em estatística e descomplicar este campo tão árduo.
À Mariana Funari, Mirian Nishi, Maria Aparecida Medeiros, Andresa
de Santi, Cristina Rossi e Denise Aragão por toda assistência e paciência
comigo durante a execução do trabalho de bancada.
À Helena Valassi, Luciana Leopoldino, Giselle Yuri, Fran Pereira e a
todos os funcionários do Laboratório de Hormônios e Genética
Molecular/LIM-42 pela colaboração nos exames laboratoriais e pelo convívio
sempre agradável.
!
À Nilda Oliveira e Maria Aparecida da Silva pela eficiência, cuidado e
disponibilidade constante em ajudar.
Aos colaboradores desta tese:
Aos pacientes e seus familiares pela oportunidade de conhecer suas
histórias.
À Dra. Rosa Maria Pereira Rodrigues pela receptividade no
Laboratório de Metabolismo Ósseo da Disciplina de Reumatologia da
FMUSP/LIM-17 e pelas sugestões na avaliação dos parâmetros
densitométricos e estruturais ósseos.
À Liliam Takayama, Jackeline Couto Alvarenga e a todos do LIM-17
pela cooperação na realização dos exames de densitometria e HR-pQCT.
Ao Dr. Ronaldo Hueb Baroni e ao Dr. Fernando Ide Yamauchi pelo
auxílio na obtenção dos dados tomográficos.
À Dra. Maria Cristina Chammas, Dra. Andrea Cavalanti Gomes e ao
Dr. Igor Fontenele pela colaboração com os dados de ultrassonografia.
Ao Dr. Alexander Jorge e à Dra. Maria Helena Vaisbich pelas críticas
e sugestões na banca de qualificação.
A todos os assistentes e colaboradores do serviço de Endocrinologia
Pediátrica do Instituto da Criança - HCFMUSP, por terem despertado em
mim todo o fascínio e entusiasmo pela endocrinologia. Em especial,
agradeço ao Dr. Durval Damiani pelo estímulo e ao Dr. Hamilton Cabral de
Menezes Filho por ter me ensinado os primeiros conhecimentos do
metabolismo ósseo.
Àqueles que vivenciaram esta jornada comigo:
À minha mãe, Maiza Colares de Carvalho, exemplo de médica e
profissional, pelo seu incentivo constante para que eu pudesse ir além dos
meus limites.
Ao meu pai, Raimundo Ernando de Carvalho, pela sua confiança no
meu potencial e comemorações a cada vitória conquistada.
!
À minha irmã, Marina Colares de Carvalho, pelo seu carinho e torcida
em todos os momentos e à minha sobrinha, Ana Maiza, por todos os
sorrisos que me proporciona.
Aos meus avós maternos, Guido de Paula Colares (in memoriam) e
Monisa Gomes Colares, avós paternos, João e Rita (in memoriam), tias, tios,
primos e todos meus familiares por compreenderem a minha distância e por
manterem seus braços sempre abertos aos meus retornos.
À Adriana Braz pelo incentivo para o início desta pós-graduação e por
possibilitar o primeiro contato com minha orientadora.
Ao Leonardo Falangola pelo companheirismo e apoio durante esta
jornada.
A todos os amigos, particularmente a JB Uchôa, Luiza Lins, Carlos
Júnior, Haniery, André, Darlan, Fláubert, Gustavo, Sidnei, Peterson e
Alexandre pelo carinho, acolhimento e simples gestos de solidariedade nos
momentos nos quais eu mais precisei.
Aos colegas do Centro de Triagem Neonatal Dr. Tatuya Kawakami,
Hospital Infantil Márcia Braido e Hospital Infantil Darcy Vargas por todo apoio
e incentivo para a conclusão deste trabalho.
Finalmente, a Deus, pelo dom da vida e por esta conquista.
!
“Entender é sempre limitado. Mas não entender pode não ter fronteiras.”
Clarice Lispector
!
Normalização Adotada
Esta tese está de acordo com as seguintes normas em vigor no momento
desta publicação:
! Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver).
! Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de
Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações,
teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria
Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão,
Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de
Biblioteca e Documentação; 2011.
! Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals
Indexed in Index Medicus.
!
Sumário Lista de abreviaturas e siglas Lista de figuras e gráficos Lista de tabelas Lista de anexos Resumo Summary
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 01
1.1. Metabolismo do fósforo .................................................................... 02
1.2. Raquitismo e osteomalácia .............................................................. 06
1.2.1. Raquitismo por aumento do PTH ........................................... 07
1.2.2. Raquitismo por defeitos nos NaPi-IIa e NaPi-IIc .................... 08
1.2.3. Raquitismo por aumento do FGF23 ....................................... 08
1.2.3.1. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos
ligado ao X (XLHR) ..................................................... 09
1.2.3.2. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos
autossômico dominante (ADHR) ................................. 10
1.2.3.3. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos
autossômico recessivo (ARHR) ................................... 11
1.3. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos ................ 12
1.4. Nefrocalcinose e nefrolitíase ........................................................... 13
2. OBJETIVOS ........................................................................................... 17
3. METODOLOGIA .................................................................................... 19 3.1. Considerações éticas ....................................................................... 20
3.2. Casuística ........................................................................................ 20
3.2.1. Pacientes ............................................................................... 20
3.2.2. Grupo controle ....................................................................... 21
3.3. Avaliação clínica e laboratorial ........................................................ 21
!
3.4. Avaliação genotípica ........................................................................ 25
3.4.1. Pesquisa de mutações por PCR e sequenciamento
automático ............................................................................. 25
3.4.1.1. Gene PHEX ................................................................. 25
3.4.1.2. Gene FGF23 ............................................................... 28
3.4.2. Pesquisa de número de cópias nos genes PHEX e
FGF23 por MLPA ................................................................... 28
3.5. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos ............... 29
3.6. Avaliação de nefrocalcinose e nefrolitíase ....................................... 30
3.7. Análise estatística ............................................................................ 32
4. RESULTADOS ....................................................................................... 33 4.1. Avaliação clínica e laboratorial ........................................................ 34
4.2. Avaliação genotípica ........................................................................ 38
4.2.1. Avaliação do gene PHEX ....................................................... 38
4.2.2. Avaliação do gene FGF23 ..................................................... 41
4.3. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos ................ 41
4.3.1. Avaliação da DMOa por DXA ................................................. 42
4.3.2. Avaliação dos parâmetros geométricos, da DMOv e da
microarquitetura óssea obtidos por HR-pQCT ....................... 44
4.4. Avaliação de nefrocalcinose e nefrolitíase ....................................... 51
5. DISCUSSÃO .......................................................................................... 55 5.1. Estatura nos RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética
mediados por FGF23 ....................................................................... 56
5.2. Etiologia molecular dos pacientes com RQ/OM
hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 .......... 58
5.3. DMO e os parâmetros estruturais ósseos nos XLHR ..................... 59
5.4. Nefrocalcinose e nefrolitíase nos XLHR ......................................... 63
6. CONCLUSÕES ..................................................................................... 67
7. ANEXOS ............................................................................................... 70
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS!..................................................... 80
!
Listas
Lista de abreviaturas e siglas
1,25(OH)2D 1,25 diidroxivitamina D = calcitriol
25OHD 25 hidroxivitamina D = calcidiol
aa Aminoácido
ADHR Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos autossômicos
dominantes
ARHR Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos autossômicos
recessivos
ASARM Acidic Serine and Aspartic Acid-Rich Motif
ATP Trifosfato de adenosina
BV/TV Relação entre o volume ósseo e o volume total
Ca Cálcio
CAPPesq Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa
CASR Receptor sensível ao cálcio
CDC Centers for Disease Control and Prevention
Ct vBMD Densidade volumétrica cortical
Ct.area Área cortical
Ct.Th Espessura média da cortical
CTx Telopeptideo carboxiterminal do colágeno tipo 1
DMO Densidade mineral óssea
DMOa Densidade mineral óssea areal
DMOv Densidade mineral óssea volumétrica
DMP1 Dentin Matrix Phosphoprotein 1
DNA Ácido desoxirrinucleico
DP Desvio padrão
DXA Densitometria óssea de dupla emissão com fontes de raios-X
ENPP1 Ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1
!
Es/E Relação estatura sentada/estatura
FGF23 Fibroblast Growth Factor 23
FGFR1 Fibroblast Growth Factor Receptor type 1
FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
GALNT3 UDP-N-acetyl-alpha-d-GALactosamine-polypeptide N-
acetylgalactosaminyl-Transferase 3
HA Hidroxiapatita
HC Hospital das Clínicas
HR-pQCT High Resolution peripheral Quantitative Computed Tomography
IC Intervalo de confiança
KDOQI Kidney Disease Outcomes Quality Initiative
MDP-99mTc Metil-difosfonato ligado ao tecnécio radioativo
MEPE Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NaPi-IIa Cotransportadores de sódio-fósforo tipo IIa
NaPi-IIb Cotransportadores de sódio-fósforo tipo IIb
NaPi-IIc Cotransportadores de sódio-fósforo tipo IIc
NC Nefrocalcinose
NL Nefrolitíase
P Fósforo
P1NP Propetideo aminoterminal do colágeno tipo 1
pb Pares de base
PCR Polymerase chain reaction
PHEX Phosphate-regulating gene with Homologies to
Endopepatidases on the X chromosome
PO4 Fosfato
PTH Paratormônio
RANKL Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand
RQ/OM Raquitismo e/ou osteomalácia
RX Raio-X
SD.1/Tb.N Falta de homogeneidade da rede trabecular
Tb vBMD Densidade volumétrica trabecular
!
Tb.area Área trabecular
Tb.N Número médio das trabéculas
Tb.Sp Espaço médio entre as trabéculas
Tb.Th Espessura média das trabéculas
TC Tomografia computadorizada
TIO Tumor indutor de osteomalácia
Total vBMD Densidade volumétrica total
TRP Taxa de reabsorção tubular de fosfato
US Ultrassonografia
vs versus
XLHR Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos ligados ao X
Z Desvio padrão para a mesma faixa etária e sexo
!
Lista de figuras e gráficos
Figura 1 - Regulação da homeostase do fósforo......................................
Figura 2 - Vias de ação dos ASARMs......................................................
Figura 3 - Manifestações clínicas e radiológicas do raquitismo................
Figura 4 - O papel da fosfatúria na litíase renal........................................
03
05
07
15
Gráfico 1 - Comparação do Z de estatura dos pacientes com RQ/OM
hipofosfatêmicos segundo a faixa etária ..................................................... 35
Gráfico 2 - Comparação do Z de estatura dos pacientes com RQ/OM
hipofosfatêmicos adultos segundo o uso de fosfato de sódio e potássio na
infância e adolescência ............................................................................... 36
Gráfico 3 – Comparação da DMOa de L1-L4 obtida por DXA entre o grupo
de pacientes com XLHR e o grupo controle ................................................ 42
Gráfico 4 – Comparação da DMOa de L1-L4 obtida por DXA entre os
pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e seus respectivos
controles ...................................................................................................... 43
Gráfico 5 – Comparação da DMOa de 1/3 distal do rádio obtida por DXA
entre o grupo de pacientes com XLHR e o grupo controle
...................................................................................................................... 44
Gráfico 6 – Comparação da DMOv total de rádio distal obtida por HR-pQCT
entre os pacientes com XLHR e seus respectivos controles
...................................................................................................................... 45
!
Gráfico 7 – Comparação da DMOv trabecular e cortical de rádio distal
obtidas por HR-pQCT entre os pacientes com XLHR estratificados por faixa
etária e seus respectivos controles ............................................................. 46
Gráfico 8 – Comparação da DMOv total de tíbia distal obtida por HR-pQCT
entre os pacientes com XLHR e seus respectivos controles
...................................................................................................................... 47
Gráfico 9 – Comparação das DMOv trabecular e cortical de tíbia distal
obtidas por HR-pQCT entre os pacientes com XLHR e seus respectivos
controles ...................................................................................................... 47
Gráfico 10 – Comparação da Tb.N de rádio distal obtida por HR-pQCT entre
os pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e seus respectivos
controles ...................................................................................................... 48
Gráfico 11 – Comparação da Tb.Sp de rádio distal obtida por HR-pQCT
entre os pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e seus
respectivos controles ................................................................................... 49
Gráfico 12 – Comparação da SD.1/Tb.N de rádio distal obtida por HR-pQCT
entre os pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e seus
respectivos controles ................................................................................... 49
Gráfico 13 – Comparação das DMOv trabecular e cortical de tíbia distal
obtidas por HR-pQCT entre os pacientes com XLHR estratificados por status
metabólico e seus respectivos controles ..................................................... 50
Gráfico 14 - Distribuição dos graus de NC de acordo com a US e a TC de
rins e vias urinárias nos 39 pacientes com XLHR estratificados por faixa
etária ............................................................................................................ 52
!
Lista de tabelas
Tabela 1 - Exames laboratoriais: método de dosagem e coeficientes de
variação intraensaio e interensaio ............................................................... 24
Tabela 2 - Valores de referência para os parâmetros avaliados em urina de
24h ............................................................................................................... 24
Tabela 3 - Parâmetros fornecidos pela HR-pQCT ...................................... 30
Tabela 4 - Mutações no gene PHEX em 21 casos familiais e 20 casos
esporádicos de XLHR .................................................................................. 40
Tabela 5 - Avaliação da função renal e dos fatores de risco para NC e NL
nos pacientes com XLHR estratificados por faixa etária ............................. 53
Lista de anexos
ANEXO A - Primers para a avaliação da região codificadora dos genes
PHEX e FGF23 (tabelas 1 e 2) .................................................................... 71
ANEXO B - Dados clínicos, laboratoriais e de imagem dos pacientes com
RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 (figuras 1
e 2; tabelas 3 e 4) ........................................................................................ 73
ANEXO C - DMO, parâmetros geométricos e dados de microarquitetura
óssea obtidos por DXA e HR-pQCT: comparação entre pacientes com XLHR
e controles saudáveis (tabelas 4 a 8) .......................................................... 76
!
Resumo
Colares Neto GP. Raquitismo e osteomalácia hipofosfatêmicos de origem
genética mediados por FGF23: caracterização molecular, óssea e renal
[Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo;
2015.
Introdução: raquitismo e osteomalácia hipofosfatêmicos de origem genética
mediados por FGF23 (RQ/OM-FGF23) são caracterizados pelo aumento
patológico dos níveis séricos de FGF23 com consequentes hiperfosfatúria e
hipofosfatemia. A forma hereditária mais comum é a ligada ao X dominante
(XLHR) ocasionada por mutações inativadoras no gene PHEX. Objetivos: identificar a etiologia molecular; avaliar a densidade mineral óssea (DMO) e
a microarquitetura óssea e, determinar a prevalência de nefrocalcinose (NC),
nefrolitíase (NL) e de alterações metabólicas urinárias em 47 pacientes com
RQ/OM-FGF23 (16 crianças e 31 adultos). Métodos: as análises dos genes
PHEX e FGF23 foram realizadas pelos métodos de Sanger e MLPA. A DMO
areal (DMOa) foi avaliada por densitometria óssea (DXA), enquanto a DMO
volumétrica (DMOv) e os parâmetros de microarquitetura óssea foram
analisados por HR-pQCT. A NC foi classificada segundo uma escala de 0-3
(0 = ausência de NC; 3 = NC grave) pelas ultrassonografia (US) e tomografia
computadorizada (TC) renais. A presença de NL foi analisada pela TC renal.
Fatores de risco para NC e NL foram avaliados pela urina de 24 horas.
Resultados: foram identificadas mutações no PHEX em 41 pacientes
(87,2%). A avaliação óssea foi realizada em 38 pacientes com XLHR que
foram comparados a controles saudáveis. Os pacientes tiveram maior DMOa
em L1-L4 (p=0,03) e menor DMOa em 1/3 distal do rádio (p<0,01). Em rádio
distal, a DMOv total (Total.vBMD) e os componentes trabecular (Tb.vBMD) e
cortical (Ct.vBMD) foram semelhantes entre os grupos. Na tíbia distal, os
pacientes apresentaram menor Total.vBMD em relação aos controles devido
ao déficit no Tb.vBMD (p<0,01). Além do mais, ao separarmos por status
!
metabólico, os pacientes descompensados tiveram menor Ct.vBMD em tíbia
distal comparados aos controles (p=0,02). Quanto aos parâmetros
estruturais, em rádio distal, os pacientes apresentaram menor número de
trabéculas (Tb.N; p=0,01), maior espessura trabecular (Tb.Th; p<0,01) e
maior falta da homogeneidade trabecular (SD.1/Tb.N; p=0,02). Na tíbia
distal, eles tiveram menor Tb.N (p<0,01), maior separação trabecular (Tb.Sp;
p<0,01) e maior SD.1/Tb.N (p<0,01). A avaliação renal foi feita em 39
pacientes com XLHR. A NC foi diagnosticada em 15 (38,5%) pacientes pelas
US e TC, principalmente no grupo pediátrico em uso intensivo de fosfato. A
US detectou NC em 37 (94,8%), majoritariamente como grau 1 (97%),
enquanto a TC identificou NC medular em 15 (38,5%): 10 (66,7%) como
grau 1 e cinco (33,3%) como grau 2. Quatro (10,2%) pacientes adultos
tinham NL determinada pela CT. Além da hiperfosfatúria presente em todos
os pacientes, a hipocitratúria foi a alteração metabólica mais comum
(30,7%); somente dois pacientes apresentaram hipercalciúria (5,1%) e
nenhum apresentou hiperoxalúria. Conclusões: nesta casuística, a XLHR
foi a principal forma hereditária de RQ/OM-FGF23. A HR-pQCT foi mais
informativa do que a DXA e o compartimento ósseo trabecular foi mais
afetado pela doença, particularmente na tíbia distal. Finalmente, a NC foi
mais prevalente que a NL; o principal fator de risco metabólico foi a
hiperfosfatúria e o tratamento intensivo com fosfato parece ser um agravante
na formação da NC.
Descritores: raquitismo; osteomalácia; raquitismo hipofosfatêmico familiar;
hipofosfatemia; hipofosfatemia familiar; endopeptidase neutra reguladora de
fosfato PHEX; densitometria; nefrocalcinose; nefrolitíase; ultrassonografia;
tomografia computadorizada por raios X; densidade óssea.
!
Summary
Colares Neto GP. FGF23-mediated inherited hypophosphatemic rickets:
molecular characterization, bone analysis and renal evaluation [Thesis]. São
Paulo: "Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo"; 2015.
Background: FGF23-mediated hypophosphatemic rickets is a group of
diseases characterized by a pathological increase of FGF23 serum levels,
resulting in hyperphosphaturia and hypophosphatemia. In this group, the
most common form of inheritance is the X-linked dominant (XLHR) caused by
inactivating mutations in the PHEX gene. Aims: to identify the molecular
basis; to evaluate the bone mineral density and bone microarchitecture; to
determinate the prevalence of nephrocalcinosis (NC), nephrolithiasis (NL)
and their related metabolic factors in 47 patients with FGF23-mediated
hypophosphatemic rickets (16 children and 31 adults). Methods: PHEX and
FGF23 were analyzed by conventional Sanger sequencing and MLPA. The
areal BMD (aBMD) was evaluated by dual-energy x-ray absorptiometry
(DXA), while the volumetric BMD (vBMD) and the bone microarchitecture
were analyzed by high-resolution peripheral quantitative computed
tomography (HR-pQCT). NC was investigated by renal ultrasonography (US)
and computed tomography (CT) and classified using a 0–3 scale (0= no NC
and 3= severe NC). The presence of NL was determined by renal CT. Risk
factors for NC and NL were evaluated by 24-hour urinary samples. Results: 41 patients (87.2%) presented mutations in PHEX. The bone analysis was
made in 38 XLHR patients compared to healthy controls. XLHR patients
presented higher aBMD at L1-L4 (p=0.03) and lower aBMD at the distal third
of the radius (p<0.01). At the distal radius, HR-pQCT showed no differences
in the vBMD neither in its trabecular (Tb.vBMD) and cortical (Ct.vBMD)
components. At the distal tibia, the XLHR patients showed lower Total.vBMD
(p<0.01) compared to controls due to decreased Tb.vBMD (p<0.01).
!
Moreover, after XLHR patients were sorted by metabolic status, the non-
compensated ones revealed lower Ct.vBMD at the distal tibia compared to
their respective controls (p=0.02). Regarding to the microarchitectural
parameters, at the distal radius, XLHR patients showed lower trabecular
number (Tb.N; p=0.01), greater trabecular thickness (Tb.Th; p<0.01) and
more inhomogeneous trabecular network (SD.1/Tb.N; p=0.02). At the distal
tibia, they had lower Tb.N (p<0.01), larger trabecular separation (Tb.Sp;
p<0.01) and greater SD.1/Tb.N (p<0.01). The renal assessment was done in
39 XLHR patients. NC was diagnosed in 15 (38.5%) patients by US and CT,
mainly in the pediatric group that was in phosphate treatment. US identified
NC in 37 (94.8%), mostly as grade 1 (97%), meanwhile CT determined
medullary NC in 15 (38.5%) patients: 10 (66.7%) as grade 1 and five (33.3%)
as grade 2. Four (10.2%) adults patients had NL determined by CT. Besides
hyperphosphaturia present in all XLHR patients, hypocitraturia was the most
common metabolic factor (30.7%); hypercalciuria occurred in only two
patients (5.1%) and none had hyperoxaluria. Conclusions: in our cohort,
XLHR was the most prevalent form of FGF23-mediated inherited
hypophosphatemic rickets. HR-pQCT was more informative than DXA and
the cancellous bone compartment was the most affected by the disease
particularly at the distal tibia. Finally, NC was more prevalent than NL; the
main metabolic risk factor was hyperphosphaturia and the intensive
treatment with phosphate seems to be an aggravating factor in the formation
of NC.
Descriptors: rickets; osteomalacia; familial hypophosphatemic rickets;
hypophosphatemia; familial; PHEX phosphate regulating neutral
endopeptidase; densitometry; nephrocalcinosis; nephrolithiasis;
ultrasonography; tomography, X-ray computed; bone density.
!
1. INTRODUÇÃO
! 2
1.1. Metabolismo do fósforo
O fósforo é um dos principais elementos do organismo humano. Está
presente nos cristais de hidroxiapatita do esqueleto, na estrutura base do
DNA (ácido desoxirribonucleico), na membrana plasmática e nos ATPs
(trifosfatos de adenosina); participa de reações enzimáticas e age na
sinalização intracelular. Oitenta por cento do fósforo corpóreo encontra-se no
esqueleto, cerca de 15% encontra-se no meio intracelular e o restante está
no fluido extracelular (1).
A regulação do fósforo ocorre pelo balanço entre a absorção dietética
no trato gastrointestinal e a excreção renal. Cerca de 60% do fósforo
dietético é absorvido no duodeno e jejuno por meio do transporte ativo pelos
cotransportadores de sódio-fósforo tipo IIb (NaPi-IIb) presentes na
membrana apical dos enterócitos, além da difusão passiva nos espaços
intercelulares. Oitenta a noventa por cento do fósforo excretado na urina é
reabsorvido na membrana apical do túbulo proximal pelos cotransportadores
de sódio e fósforo tipo IIa (NaPi-IIa) e cotransportadores de sódio e fósforo
tipo IIc (NaPi-IIc). Estes são importantes para a captação de fósforo pelas
células ósseas também (2) – figura 1.
Os principais reguladores do metabolismo do fósforo são o PTH
(paratormônio) e o FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) (3).
O PTH é produzido pelas paratireoides e eleva a calcemia ao
estimular: a reabsorção óssea, a reabsorção tubular e a absorção intestinal
de cálcio através do aumento da 1,25(OH)2D (1,25 diidroxivitamina D ou
calcitriol). É um importante hormônio fosfatúrico ao promover a endocitose e
degradação lisossomal dos cotransportadores sódio e fósforo no túbulo
proximal renal (3).
! 3
Figura 1 - Regulação da homeostase do fósforo. Enquanto uma pequena parte do fósforo (P) dietético absorvido pelo intestino é responsável por suas concentrações extracelulares, a maior fração é depositada no esqueleto e o excedente é excretado pelos rins. O calcitriol [1,25(OH)2D] estimula a absorção do fósforo ingerido e a produção de FGF23. Por sua vez, o FGF23 aumenta a fosfatúria, inibe a síntese de calcitriol e provavelmente exerce uma ação supressora sobre as concentrações de PTH via receptor FGFR/KL. O PTH aumenta a fosfatúria e estimula a síntese de calcitriol. FGFR/KL refere-se ao complexo formado pelo FGFR1 e pelo Klotho, enquanto PTH1R representa o receptor de PTH. Adaptado de Bergwitz et al (3).
O FGF23 é uma glicoproteína constituída por 251 aa (aminoácidos) e
codificada pelo gene FGF23, constituído por três éxons e situado no locus
12p13.3 (3). É um hormônio produzido majoritariamente pelos osteoblastos e
osteócitos em áreas de remodelação ativa nos ossos. Também é expresso
em outros tecidos como o coração, fígado, tireoide, paratireoides e intestino
(4).
Para a formação da proteína madura, o FGF23 perde sua porção
aminoterminal (sequência sinalizadora composta por 24 aa) e sofre
glicosilação na região 162-228 aa pela enzima GALNT3 (UDP-N-acetyl-
! 4
alpha-d-GALactosamine-polypeptide N-acetylgalactosaminyl-Transferase 3).
O FGF23 circulante (25-251 aa) forma um complexo ternário com o FGFR1
(Fibroblast Growth Factor Receptor type 1) e a proteína Klotho, cofator
necessário para a sua ação tecidual. Este complexo está expresso no túbulo
distal renal predominantemente. Como o principal sítio de ação do FGF23
está no túbulo proximal, acredita-se que este efeito é parácrino intermediado
por outra(s) fosfatonina(s) (3).
O FGF23 acelera a endocitose e a degradação lisossomal dos NaPi-
IIa e NaPi-IIc na membrana tubular com consequente aumento da fosfatúria.
Também, reduz a formação de 1,25(OH)2D por inibição da atividade da 1α-
hidroxilase e estímulo da 24-hidroxilase (3, 4). Seu efeito sobre osso ainda
permanece incerto, sendo considerado um possível modulador de
mineralização nos osteoblastos durante a formação óssea (1, 3).
A produção de FGF23 é regulada pelas proteínas PHEX (Phosphate-
regulating gene with Homologies to Endopepatidases on the X chromosome)
e DMP1 (Dentin Matrix Phosphoprotein 1) (3, 5) – figura 1.
O PHEX é uma endopeptidase homóloga da família M13 das
metaloproteases, composta por 749 aa e codificada por um gene de mesmo
nome, composto por 22 éxons, localizado no locus Xp22.1. Está presente na
membrana dos osteoblastos, odontoblastos e condrócitos da placa de
crescimento, nas paratireoides, nos pulmões, no cérebro, nos músculos, nas
gônadas e na pele. Uma de suas funções é controlar os níveis circulantes de
FGF23 (6, 7).
O DMP1 é uma proteína SIBLING formada por 513 aa e codificada
por um gene de mesmo nome, formado por seis éxons, situado no locus
4q21. É expressa nos tecidos ósseo e dentário, além de estar presente no
cérebro, glândulas salivares, fígado, músculo, pâncreas e rins. Sua principal
função é suprimir a secreção de FGF23, mas o seu mecanismo de ação não
está totalmente esclarecido (8).
! 5
Os últimos 23 aa da porção carboxiterminal de proteínas da família
SIBLING, que incluem o DMP1 e o MEPE (Matrix Extracellular
Phosphoglycoprotein with ASARM motif), compõem o peptídeo ASARM
(Acidic Serine and Aspartic Acid-Rich Motif).
Figura 2 – Vias de ação dos ASARMs. (A) Via indireta: o PHEX interage com DMP1 através da sua região ASARM, promovendo a redução da expressão do FGF23. Por outro lado, a ligação do PHEX com os peptídeos ASARMs promove a degradação destes últimos. (B) Via direta: os peptídeos ASARMs estimulam a produção de FGF23 e tem uma ação direta sobre os rins com aumento da fosfatúria e diminuição da produção de calcitriol. Adaptado de David et al (9).
A degradação de proteínas SIBLING por proteases osteoblásticas,
como a catepsina B, libera peptídeos ASARM fosforilados resistentes a
proteases na circulação e no osso. Estes peptídeos aumentam a expressão
do FGF23 e inibem a reabsorção tubular de fósforo com consequente
prejuízo da mineralização óssea (9, 10) - figura 2.
Ao se unir a DMP1 pela região ASARM, o PHEX diminui a transcrição
gênica de FGF23. Além disso, o PHEX promove a clivagem dos peptídeos
! 6
ASARM com diminuição da sua ação fosfatúrica direta e estímulo a
homeostase do FGF23 (9, 10) - figura 2.
1.2. Raquitismo e osteomalácia
O raquitismo é uma doença da placa de crescimento, exclusiva da
criança e do adolescente até a fusão epifisária. A hipofosfatemia, fator
comum de todos os tipos de raquitismos, promove um defeito na apoptose
dos condrócitos hipertróficos terminais da placa por não ativar a via
mitocondrial caspase-9 dependente e impede a adequada mineralização e
formação ósseas (2).
Em contraste, a osteomalácia é um defeito de mineralização dos
ossos cortical e trabecular com acúmulo de tecido osteoide não
mineralizado. Durante a infância e a puberdade, ela pode coexistir com o
raquitismo (2).
Na infância, via de regra, o quadro clínico envolve deformidades em
membros inferiores (geno varo, geno valgo e joelhos em vendaval) com o
início da deambulação, alargamento de punhos e joelhos, torção
anteromedial da tíbia, retardo no crescimento com baixa estatura
desproporcionada e alterações odontológicas (taurodontismo e abscessos
dentários) (11). Na criança, as imagens radiológicas características são o
alargamento metafisário e o encurvamento lateral de fêmures e/ou tíbias –
figura 3.
Quando a apresentação clínica tem início na fase adulta, os pacientes
podem apresentar: redução de estatura por colapso vertebral, fraqueza
muscular, fraturas de fragilidade, dores ósseas e articulares, entesopatias e
alterações dentárias. Radiologicamente, a osteomalácia é caracterizada por
pseudofraturas, trabeculação grosseira e rarefação óssea (1, 12, 13).
O padrão-ouro para diagnóstico de osteomalácia é a histomorfometria
da biópsia de crista ilíaca, que mostra uma taxa de formação óssea
! 7
reduzida, hipomineralização irregular difusa e aumento do rebordo osteoide
(1).
Figura 3 – Manifestações clínicas e radiológicas do raquitismo. (A) Geno varo; (B) Alargamento de punhos; (C) Encurvamento de fêmures e alterações metafisárias na radiografia simples de membros inferiores.
Os raquitismos e/ou osteomalácias podem ser classificados pelos
mecanismos que levam à hipofosfatemia:
1.2.1. Por aumento do PTH
Nestes casos, a baixa ingestão ou má absorção de cálcio e as
alterações no metabolismo da vitamina D diminuem os níveis de cálcio
extracelular com consequente aumento do PTH via CASR (receptor sensível
ao cálcio). Valores elevados de PTH aumentam a expressão do RANKL
(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand) pelos osteoblastos
que estimula a maturação dos osteoclastos culminando com o aumento da
reabsorção óssea e liberação de cálcio e o fósforo do esqueleto para o fluido
extracelular. No entanto, a diminuição da reabsorção renal de fósforo pelo
PTH leva a hipofosfatemia associada ao raquitismo e/ou osteomalácia (2).
! 8
1.2.2. Por defeitos nos NaPi-IIa e NaPi-IIc
Algumas doenças genéticas, como a cistinose (OMIM 219800),
comprometem os túbulos renais de modo mais amplo e afetam os NaPi-IIa e
os NaPi-IIc em diferentes graus com consequente aumento da excreção
renal de fósforo, bicarbonato, aa, glicose etc. O indivíduo acometido
desenvolve raquitismo e/ou osteomalácia como resultado da hipofosfatemia
crônica (2). Nestes casos, outras manifestações, como a acidose metabólica
e o diabetes insípido nefrogênico, costumam ser encontradas (14).
Mais especificamente, o defeito genético pode comprometer
exclusivamente o gene SLC34A3 que codifica os NaPi-IIc (OMIM 241530).
Nesta situação, a perda renal é exclusiva de fósforo gerando hipofosfatemia,
aumento da produção de calcitriol e consequente hipercalciúria (2).
1.2.3. Por aumento do FGF23
Neste grupo, destacam-se doenças genéticas com forma de
transmissão distintas: o raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos
ligado ao X (XLHR), o raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos
autossômico dominante (ADHR) e o raquitismo e/ou osteomalácia
hipofosfatêmicos autossômico recessivo (ARHR) (2).
Adicionalmente, o FGF23 pode ser produzido ectopicamente por
tecidos fibrodisplásicos na displasia fibrosa poliostótica (OMIM 174800) ou
por tecidos tumorais na osteomalácia oncogênica, a qual é mais frequente
em adultos (2).
Do ponto de vista laboratorial, os níveis elevados de FGF23
determinam níveis reduzidos ou inapropriadamente normais de 1,25(OH)2D
por inibição da 1α-hidroxilase, além de diminuírem a taxa de reabsorção
tubular de fosfato (TRP; valores inferiores a 95% em vigência de
hipofosfatemia) com consequente hiperfosfatúria (15). Observa-se um
! 9
aumento dos marcadores de formação óssea, mas a calcemia, as
concentrações de PTH e de 25 hidroxivitamina D (25OHD) estão normais
geralmente (13).
O tratamento de escolha para pacientes sintomáticos é a reposição
de calcitriol e fosfato. Na faixa pediátrica, o tratamento promove correção
parcial das deformidades, diminui o número de cirurgias e melhora a
estatura final. Nos adultos, diminui as dores ósseas e a extensão da
osteomalácia, melhora a cicatrização óssea e acelera a recuperação
cirúrgica. Os principais efeitos colaterais são: hipercalcemia, hipercalciúria,
nefrocalcinose (NC), nefrolitíase (NL) e hiperparatireoidismo. Apesar do
tratamento clínico, cirurgias corretivas em membros são necessárias
geralmente (13).
Estudos iniciais em humanos com o KRN23, anticorpo humano anti-
FGF23, sugerem um benefício potencial no tratamento dos pacientes com
XLHR. A medicação mostrou-se segura e não foram relatados efeitos
adversos significativos. Foram demonstradas melhora da TRP, do fósforo
sérico e dos níveis de 1,25(OH)2D sem aumento da prevalência de NC e
hiperparatireoidismo terciário (16, 17). Apesar disso, esta medicação ainda
está indisponível para uso comercial.
1.2.3.1. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos ligado ao X (XLHR)
O XLHR (OMIM 307800) é a forma hereditária mais comum de
raquitismo. Entretanto, é uma doença rara com incidência de 3,9:100.000
nascidos vivos e prevalência de 4,8:100.000. Tem herança dominante ligada
ao X e é ocasionado por mutações distribuídas ao longo dos 22 éxons do
gene PHEX sem zona de hotspot. O gene defeituoso produz uma proteína
pouco ativa ou inativa determinando a elevação dos níveis de FGF23 (12,
13).
! 10
O quadro clínico inicia-se na infância e a fraqueza muscular, sintoma
esperado nas hipofosfatemias, está habitualmente ausente, diferenciando-a
dos demais tipos de raquitismo. A ausência de fraqueza muscular ainda tem
causa incerta e, por ser um sintoma subjetivo, pode ser um fator de confusão
na classificação dos raquitismos hipofosfatêmicos (12, 13).
1.2.3.2. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos autossômico dominante (ADHR)
Diferente da forma ligada ao X, a fraqueza muscular é um sintoma
comumente relatado no ADHR (OMIM 193100). Uma peculiaridade desta
forma é a possibilidade de início das manifestações clínicas na infância ou
na fase adulta. Em 1997, Econs et al descreveram uma família com 23
membros portadores de ADHR distribuídos em sete gerações.
Surpreendentemente, eles identificaram dois grupos de pacientes: o primeiro
com início dos sintomas na infância e o segundo com apresentação mais
tardia, durante a adolescência e a fase adulta (18). Para os casos
esporádicos de início tardio, o principal diagnóstico diferencial deve ser feito
com pacientes portadores de osteomalácia hipofosfatêmica oncogênica.
Nos pacientes com ADHR, a causa molecular envolve mutações
missense, particularmente nos códons 176 e 179 do FGF23: p.R176Q,
p.R176W, p.R179Q e p.R179W (19, 20). Esses códons são bastante
conservados e dão origem a duas argininas (RXXR motif) fundamentais para
o reconhecimento do FGF23 pela enzima responsável pela sua proteólise.
Apesar da manutenção da sua bioatividade, o FGF23 mutante torna-se
menos sensível à clivagem proteica do que o FGF23 selvagem (21). Além
disso, a mutação não interfere na mensuração do FGF23 pelos ensaios
disponíveis (22).
! 11
1.2.3.3. Raquitismo e/ou osteomalácia hipofosfatêmicos autossômico recessivo (ARHR)
Os primeiros relatos de ARHR por mutação inativadora no gene
DMP1 (OMIM 241520) datam de 2006 (23, 24). Uma particularidade desta
forma, segundo a descrição de dois irmãos finlandeses por Makitie et al em
2010, é o agravamento da doença na vida adulta caracterizada por
hiperostose craniana, artrite generalizada, entesopatias e calcificações dos
ligamentos espinhais (25). Em outra publicação, também foram relatadas
falanges distais displásicas, anormalidades faciais e dentárias, além de
surdez neurossensorial manifesta tardiamente (26).
Mutações inativadoras do gene ENPP1 (Ecto-nucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase 1), localizado no cromossomo 6q22-
q23, são relatadas como causa da calcificação arterial generalizada da
infância (GACI) (OMIM 208000). O ENPP1 codifica uma proteína envolvida
na regulação do pirofosfato inorgânico que é inibidor fisiológico da
calcificação (27).
Nos últimos anos, algumas mutações inativadoras no ENPP1 têm sido
descritas como causas de ARHR (OMIM 613312). Os pacientes com esta
forma de ARHR podem apresentar deformidades ósseas, arteriosclerose e
surdez progressiva associada (28-30).
A distinção entre XLHR, ADHR e ARHR é baseada na história clínica
do paciente e seus antecedentes familiares e, por isso, está sujeita a
limitações nos casos esporádicos e erros pela subjetividade na
caracterização de sintomas. Diante destes fatos, a análise genotípica dos
pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos foi uma das propostas do presente
trabalho, pois permite uma classificação fidedigna e a homogeneização da
casuística de acordo com o gene envolvido, o que contribui para a
compreensão de diferenças fisiopatológicas das diferentes etiologias. Além
! 12
disso, a identificação da base molecular de um caso-índice permite o
rastreamento de casos familiares e o aconselhamento genético.
1.3. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos
A massa óssea aumenta progressivamente do nascimento até a
terceira década de vida, quando atinge o seu pico. Ela sofre influência de
fatores genéticos, nutricionais, endócrinos e mecânicos que, do ponto de
vista histológico, determinarão sua geometria, sua microarquitetura e o seu
grau de mineralização (31).
Na infância e adolescência as necessidades metabólicas ósseas para
um esqueleto em crescimento são aumentadas e o tratamento é
imprescindível em pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos mediados por
FGF23. Nesta fase, os marcadores ósseos são de extrema utilidade para
avaliação do sucesso terapêutico, refletindo melhor ou pior controle.
No entanto, na fase adulta, as necessidades metabólicas são
menores e os marcadores ósseos, geralmente normais, nem sempre
refletem o real status de atividade da doença de base. Assim, a análise da
massa e da microarquitetura ósseas pode fornecer dados importantes para o
seguimento destes pacientes.
Quanto à microarquitetura, os ossos podem ser classificados em
cortical e trabecular. O osso trabecular é mais interno, apresenta aspecto
esponjoso e é mais ativo metabolicamente. Por sua vez, o osso cortical é
mais externo, formado por lamelas ósseas compactas, conferindo
propriedades de resistência e sustentação. Por estas características, suas
análises devem ser particularizadas durante a avaliação da massa óssea
(32).
A DXA (densitometria óssea de dupla emissão com fontes de raios-X)
é a técnica mais utilizada para avaliação da densidade mineral óssea (DMO)
embora apresente algumas limitações. Por se tratar de uma técnica
! 13
bidimensional, avalia a densidade mineral óssea areal (DMOa) e está sujeita
à influência de fatores antropométricos, hormonais e extra-esqueléticos. Por
isso, pacientes com baixa estatura ou atraso puberal podem ter valores de
DMOa subestimados. Enquanto a presença de calcificações extra-
esqueléticas, na região de aquisição de imagem pela DXA, costumam
resultar em valores de DMOa superestimados. Além do mais, este exame
não distingue os componentes trabecular e cortical, nem fornece dados
sobre a microarquitetura óssea (31).
A HR-pQCT (High Resolution peripheral Quantitative Computed
Tomography), ainda pouco disponível na prática clínica, é um método novo e
mais acurado para a aquisição simultânea de dados fornecidos pela DXA e
histomorfometria ósseas. Ela mensura a densidade mineral óssea
volumétrica (DMOv) e por isso, sofre menor influência de fatores de
confusão na análise. O seu grande diferencial é a construção digital
tridimensional da microarquitetura óssea com a obtenção de dados sobre o
componente trabecular (número, espessura e separação das trabéculas
ósseas) e cortical (a espessura e porosidade) (31, 33, 34).
Tradicionalmente as informações sobre qualidade óssea de pacientes
com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética foram geradas por
estudos histomorfométricos. Neste contexto, por ser um método não
invasivo, a HR-pQCT mostra-se como um ferramenta importante para a
obtenção de dados para a melhor avaliação da doença e do tratamento
neste grupo de pacientes (31, 33, 34). Assim, devido às poucas informações
disponíveis por HR-pQCT em pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos, um
dos objetivos deste trabalho foi a análise dos parâmetros densitométricos e
estruturais ósseos por meio deste método de imagem.
1.4. Nefrocalcinose e nefrolitíase
A NC é a deposição de cálcio no parênquima renal, enquanto a NL é
a calcificação dentro do sistema coletor renal (35, 36).
! 14
A NC é listada como uma doença rara pelo Office of Rare Diseases of
National Institutes of Health (http://rarediseases.info.nih.gov/), porém, a
prevalência na população geral ainda não foi definida. Em um estudo italiano
recente, Piccoli et al identificaram uma prevalência de 2,4% de NC em
pacientes de um único centro de referência em Nefrologia (37). Por sua vez,
a incidência de NL em adultos é de 3-5% (38, 39), enquanto é dez vezes
menor nas crianças (35, 40).
Tanto a NC como a NL são multifatoriais. Os principais fatores de
risco envolvidos são as alterações metabólicas primárias ou secundárias, as
infecções urinárias de repetição, as malformações gênito-urinárias e o uso
de medicações como as suplementações de cálcio e fósforo (41-44). Outro
fator importante é a predisposição genética. Aproximadamente, 20-29% dos
diagnosticados com NC (42, 45) e 40% dos portadores de NL (36, 46)
apresentam história familiar positiva (42, 45).
Quanto às alterações metabólicas associadas, a hipercalciúria é o
principal fator de risco para a NC (42, 43), enquanto a hipocitratúria e a
hiperoxalúria dividem a importância com a hipercalciúria na NL (36, 46, 47).
A hiperfosfatúria é considerada um fator de risco independente para a
formação de calcificações no trato urinário. Fisiologicamente, ela leva à
hipofosfatemia com estímulo da produção de calcitriol que aumenta a
absorção intestinal de cálcio e fósforo. A formação de cristais ocorre
principalmente no segmento descendente da alça de Henle, onde há maior
reabsorção de água com aumento da concentração dos íons cálcio e fosfato.
Assim, os cristais de hidroxiapatita migram do epitélio para o interstício da
papila renal, mais precisamente nas placas de Randall, local ideal para o
crescimento do cálculo – figura 4 (48, 49).
Por estimular a hiperfosfatúria, o FGF23 tem papel importante na
patogênese das calcificações do trato urinário (48). Portanto, os RQ/OM
hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 são considerados
um grupo de risco para estas complicações.
! 15
Figura 4 – O papel da fosfatúria na litíase renal. O fosfato (PO4) não reabsorvido no túbulo proximal concentra-se no segmento descendente da alça de Henle devido à maior reabsorção de água nesta região. Com o aumento da concentração, o fosfato liga-se ao cálcio (Ca) e precipita. Os cristais de cálcio e fósforo são atraídos pela membrana basal e migram através do interstício para a papila onde há a formação dos cálculos renais. Adaptado de Prie et al (49).
Enquanto a NC é silenciosa, a NL pode ter sintomas como a dor
lombar e/ou abdominal, hematúria e disúria (36, 46). Na grande maioria dos
casos, os exames de imagem tem papel decisivo no diagnóstico da NC e
NL.
Para o diagnóstico de NC, alguns consideram que a US de rins e vias
urinárias é o exame de eleição (13, 35, 50). Enquanto a US apresenta uma
maior sensibilidade (96% vs 64%), a TC apresenta uma melhor
especificidade (96% vs 85%) (50). Segundo Cheidde et al, a maior
sensibilidade (92%) e especificidade (89%) são atingidas com a detecção de
! 16
NC em dois dos exames de imagem devido às eventuais discordâncias entre
os resultados da US e da TC (43).
Para a detecção da NL, a tomografia computadorizada (TC) sem
contraste de rins e vias urinárias é o método mais sensível e específico (36,
46).
Não há relatos na literatura da avaliação de calcificações renais por
US e TC de rins e vias urinárias conjuntamente, incluindo a identificação dos
fatores de risco metabólicos para NC e NL em pacientes com RQ/OM
hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 com diagnóstico
molecular definido. Diante deste fato, um dos objetivos do presente estudo
foi a determinação da prevalência de NC e NL e seus fatores de risco a fim
de obter dados para otimizar a vigilância destas comorbidades e prevenir
possíveis complicações nesta população.
!
2. OBJETIVOS
! 18
Em uma coorte de pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem
genética mediados por FGF23, nossos objetivos foram:
2.1. Identificar a etiologia molecular;
2.2. Avaliar a DMO e os parâmetros estruturais ósseos e
2.3. Avaliar a presença de NC e/ou NL e seus fatores de risco
associados.
!
3. MÉTODOS
! 20
3.1. Considerações éticas
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de
Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP) - CAAE:
15774113.7.0000.0068; registro online número 10683.
Termos de consentimentos, por escrito, foram obtidos de todos os
pacientes e controles ou pais/tutores antes do início do estudo.
3.2. Casuística
3.2.1. Pacientes
Todos os pacientes estudados foram provenientes do ambulatório de
doenças osteometabólicas do Serviço de Endocrinologia do HC-FMUSP.
A seleção foi realizada a partir do histórico médico, achados de
exame físico e exames complementares consistentes com raquitismo e/ou
osteomalácia hipofosfatêmicos. Os critérios laboratoriais de inclusão, no
momento do diagnóstico, foram: hipofosfatemia com fração de excreção de
excreção de fósforo superior a 5% (15), valores aumentados de FGF23 e/ou
marcadores ósseos elevados como a fosfatase alcalina, P1NP (propetideo
aminoterminal do colágeno tipo 1), osteocalcina e CTx (telopeptideo
carboxiterminal do colágeno tipo 1). A pesquisa de sinais de raquitismo foi
feita através de radiografias simples de punho e/ou joelhos nas crianças,
enquanto, nos adultos, a cintilografia óssea com MDP-99mTc direcionou a
! 21
realização de radiografias simples para a pesquisa de pseudofraturas.
Foram excluídos os pacientes com outras tubulopatias e osteomalácia
hipofosfatêmica oncogênica.
Foram selecionados 47 pacientes (16 crianças e 31 adultos; 11
homens e 36 mulheres), sendo 26 casos esporádicos e 21 casos familiais
compreendendo nove casos índice. Todas as crianças (≤ 18 anos) estavam
em uso intensivo de fosfato de sódio e potássio (30-60 mg/kg/dia) e calcitriol,
enquanto a maior parte dos adultos utilizaram apenas o calcitriol. Todos os
casos de insuficiência de vitamina D foram prontamente corrigidos. Os
pacientes foram acompanhados por, aproximadamente, cinco anos em
intervalos regulares: crianças a cada quatro meses e adultos a cada seis
meses.
3.2.2. Grupo controle
Um grupo composto por 44 indivíduos saudáveis, maiores de 5 anos,
provenientes do banco de dados do LIM-17, foi pareado por sexo, idade e
estádio puberal com o grupo de pacientes que realizou DXA e HR-pQCT.
3.3. Avaliação clínica e laboratorial
A avaliação clínica foi baseada em informações obtidas dos
prontuários durante o seguimento ambulatorial e complementada por
questionamento ativo.
Na anamnese, foram investigados o histórico pessoal e familiar de
raquitismo e/ou osteomalácia, presença de consanguinidade, além de NC
e/ou NL, presença de malformações urinárias, infecções urinárias de
repetição (superior a duas por ano) e uso de medicamentos. Quanto ao
! 22
tratamento, foram avaliados principalmente: o uso de fosfato de sódio e
potássio na infância, além da idade de início e o tempo total de uso.
No exame físico, destaque foi dado para a aferição de estatura,
estatura sentada e avaliação de deformidades ósseas (dados não
mostrados).
Utilizamos como critério de baixa estatura, valores inferiores a dois
escores de desvio padrão para a mesma faixa etária e sexo (escore Z de
estatura < -2) calculado de acordo com as curvas de crescimento do CDC de
2000 (http://www.cdc.gov/growthcharts/). O escore Z da relação estatura
sentada/estatura (Es/E) foi calculado (51) e o valor > +2 foi considerado
indicativo de baixa estatura desproporcional por comprometimento do
crescimento dos membros (52).
As dosagens bioquímicas e hormonais foram realizadas no
Laboratório Central e no Laboratório de Hormônios e Genética Molecular
LIM/42 do HC-FMUSP a partir de amostras de sangue venoso periférico e de
urina.
As coletas de sangue venoso periférico ocorreram no período
matutino e foram realizados exames referentes ao metabolismo ósseo que
são utilizados para a rotina do acompanhamento do paciente: cálcio total,
cálcio iônico, fósforo, creatinina, PTH, 25 hidroxivitamina D e marcadores do
metabolismo ósseo (fosfatase alcalina, P1NP, osteocalcina e CTx).
Para as dosagens de FGF23, optamos pela dosagem da molécula
intacta com Acs monoclonais (Kainos, Tóquio, Japão), pela sua melhor
performance (53).
Baseado em critérios clínicos, laboratoriais e radiológicos, todos os
pacientes foram categorizados, segundo seu status metabólico, em
compensados e não compensados. Na faixa etária pediátrica, foram
analisados a velocidade de crescimento para o sexo e idade, os valores de
fosfatase alcalina e a presença de sinais de raquitismo nas RX de punhos
e/ou joelhos. Nos adultos, ambos os valores de fosfatase alcalina e P1NP
! 23
elevados foram os critérios utilizados para a determinação da
descompensação metabólica.
Por não dispormos da dosagem da fração óssea, a fosfatase alcalina
dosada é total, que inclui uma fração hepática. Assim, os aumentos desta
dosagem só foram valorizados na presença de valores normais de enzimas
hepáticas (alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e de gama
glutamiltransferase).
Coletas de urina de 24 horas foram realizadas para as dosagens de
cálcio, fósforo, creatinina, citrato e oxalato. De acordo com os resultados
encontrados, foram determinados os números de episódios de hipercalciúria,
hipocitratúria e hiperoxalúria para cada paciente no período estudado.
Os exames realizados, a metodologia empregada e seus respectivos
coeficientes de variação intraensaio e interensaio estão descritos na tabela
1. Os valores de referência para os exames urinários estão apresentados na
tabela 2 (36).
Para os pacientes até 18 anos, a função renal foi estimada pelo
cálculo da taxa de filtração glomerular determinada pela fórmula de
Schwartz. Para os pacientes acima de 18 anos, foi utilizada a fórmula de
Cockcroft-Gault. Os resultados foram classificados segundo as diretrizes do
KDOQI e considerados normais com valores ≥ 90 ml/min/1,73 m2 (36, 54).
! 24
Tabela 1 - Exames laboratoriais: método de dosagem e coeficientes de
variação intraensaio e interensaio
Analito Método de dosagem Variação intraensaio
Variação interensaio
Cálcio total Colorimétrico automatizado < 3,1% < 3,5%
Cálcio iônico Eletrodo íon seletivo < 0,7% < 0,3%
Fósforo Colorimétrico enzimático < 3,0% < 4,4%
Magnésio Colorimétrico automatizado < 2,1% < 2,4%
Creatinina Colorimétrico cinético < 3,2% < 2,3%
Fosfatase alcalina Cinético automatizado < 2,1% < 1,8%
P1NP Eletroquimioluminométrico < 7,0% < 5,1%
Osteocalcina Eletroquimioluminométrico < 7,0% < 4,3%
CTx Eletroquimioluminométrico < 10,0% < 4,3%
PTH Imunoquimioluminométrico < 15% < 6,7%
25OHD Quimioimunoensaio < 3,2% < 7,6%
FGF23 Enzimaimunoensaio < 5,2% < 10,5%
Cálcio urinário Colorimétrico automatizado < 4,6% < 5,9%
Creatinina urinária Colorimétrico automatizado < 3,8% < 5,9%
Fósforo urinário Colorimétrico automatizado < 9,2% < 10,6%
Citrato urinário Enzimático UV <6,4% <12,4%
Oxalato urinário Colorimétrico enzimático ND <6,8%
ND: não disponível.
Tabela 2 - Valores de referência para parâmetros avaliados em urina de 24h
Parâmetro Sexo Valores de referência
Creatinúria Ambos Crianças: 2 mg/kg ± 0,8 mg/kg Adultos:15-25 mg/kg
Calciúria Ambos 1,5-4 mg/kg/d
Citratúria Masculino > 365 mg/1,73 m2
Feminino > 310 mg/1,73 m2
Oxalúria Ambos ≤ 45 mg/1,73 m2
! 25
3.4. Avaliação genotípica
Foram coletados 10 mL de sangue, de cada paciente, em dois tubos
contendo anticoagulante EDTA a partir dos quais o DNA genômico foi
extraído. A identificação de familiares afetados também pode ser realizada
através de amostra de sangue, de raspado de mucosa oral ou de cordão
umbilical.
A extração de DNA de sangue e de raspado de mucosa oral foi
realizada segundo o procedimento padronizado pelo LIM-42, baseado na
técnica salting out adaptada de Miller et al (55).
A extração de DNA a partir de cordão umbilical foi realizada com o
Wizard® Genomic DNA purification kit (Promega Corporation, Madison,
EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
3.4.1. Pesquisa de mutações por PCR e sequenciamento automático
3.4.1.1. Gene PHEX
A partir do DNA genômico de cada paciente, foi amplificada toda a
região codificadora do gene PHEX através da técnica de PCR. De acordo
com a sequência da região codificadora do PHEX depositada no Genebank,
foram desenhados primers específicos flanqueando cada um dos 22 éxons
deste gene. As sequências de todos esses primers e os tamanhos dos
respectivos amplicons esperados estão descritos no ANEXO A.
Para a amplificação de cada fragmento, foram preparadas reações
com um volume final de 25 µL, utilizando-se: cerca de 100 ng de DNA
genômico, 200 µmol/L de cada desoxinucleotídeo, 10 pmol de primer F e 10
pmol de primer R referente ao éxon de interesse, 1 unidade da enzima Taq
! 26
DNA polimerase (Promega Corporation, Madison, EUA), tampão 5x de
reação Green Go TaqTM fornecido pelo fabricante da enzima e água
ultrapura para completar o volume.
Todos os éxons foram amplificados com o mesmo protocolo que
consistiu de uma pré-desnaturação a 94ºC por 3 minutos, seguida por 35
ciclos de PCR (desnaturação a 94ºC por 30 segundos, hibridação a 54ºC por
30 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto) e uma extensão final a 72ºC
por 10 minutos. Todas as reações foram realizadas em termociclador
automático Mastercycler (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha) ou Veriti 96
Thermal Cycler (Life Technologies Corporation, Carlsbad, EUA).
O tamanho e a concentração dos amplicons foram determinados
através da comparação com fragmentos do marcador de peso molecular 1
Kb (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de concentração conhecida, após
eletroforese em gel de agarose a 1% (Invitrogen, Carlsbad, EUA) preparado
com tampão TAE 1x (Tris 0,004 mol/L; ácido acético glacial; EDTA 0,001
mol/L pH 8,0), corado com corante fluorescente SYBR Safe DNA Stain (Life
Technologies Corporation, Carlsbad, EUA) e observado em transiluminador
ultravioleta.
Após confirmação da amplificação, cerca de 30 ng dos produtos de
PCR foram purificados com 10 U das enzimas exonuclease I e shrimp
alcaline phosphatase do kit EXO-SAP (GE Healthcare Life Sciences,
Buckinghamshire, Reino Unido) por meio de incubação a 37ºC por 15
minutos seguida por inativação das enzimas a 80ºC por 15 minutos.
Os produtos purificados foram sequenciados com o kit ABI PrismTM
BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 3.1 (PE Applied
Biosystems, Foster City, EUA). Utilizaram-se 30 ng de produto de PCR
purificado, 1 µL de BigDye Terminator, 3 µL de tampão de sequenciamento,
5 pmol de um dos primers específicos para cada éxon (ANEXO A) e água
ultrapura para completar o volume de 10 µL. Todas as reações de
sequenciamento foram realizadas nos termocicladores citados anteriormente
e seguiram o mesmo protocolo de amplificação independente do éxon em
! 27
questão: 25 ciclos sendo cada ciclo constituído por uma etapa de
desnaturação a 96ºC por 10 segundos, hibridação a 50ºC por 5 segundos e
extensão a 60ºC por 4 minutos.
O material resultante da reação de sequenciamento foi transferido
para uma placa de 96 poços (MicroAmp optical 96-well Reaction Plate, PE
Applied Biosystems, CA, EUA) e precipitado seguindo o protocolo de
isopropanol/etanol (PE Applied Biosystems, Foster City, EUA). Após a
adição de 15 µL de formamida (PE Applied Biosystems, Foster City, EUA)
em cada poço da placa, o produto foi submetido a uma eletroforese capilar
no equipamento ABI Prism Genetic Analyzer 3100 automatic DNA sequencer
(PE Applied Biosystems, Foster City, EUA). A análise dos dados foi realizada
com auxílio do programa Sequencher v.4.8 (Gene Codes Corporation, Ann
Arbor, EUA) e as sequências obtidas foram comparadas com as descritas no
Ensembl (Transcript ENST00000379374.4).
Quando foi identificada alguma mutação conhecida, a mesma foi
confirmada por meio de uma nova reação de PCR e de sequenciamento
automático. Para verificar se já estavam descritas, as variantes alélicas
encontradas foram pesquisadas nos bancos de dados: 1000 Genomes
(http://www.1000genomes.org/), Ensembl (http://www.ensembl.org), PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) e PHEXdb (http://www.phexdb.mcgill.ca/).
No caso de variantes alélicas não descritas do tipo missense, foi feita uma
predição in silico do impacto da troca de aminoácido na estrutura e função
da proteína, por meio dos programas computacionais PolyPhen-2
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e MutationTaster. Para variantes
alélicas com alterações no sítio de splicing, foram utilizados os programas
MutationTaster (http://www.mutationtaster.org) e Human Splicing Finder
(http://www.hmd.be/HSF/).
! 28
3.4.1.2. Gene FGF23
Para os casos sem alterações no estudo do gene PHEX, foi avaliado
apenas o éxon 3 do gene FGF23 (região hotspot para mutações ativadoras)
pelas técnicas de PCR e sequenciamento automático descritas
anteriormente para o gene PHEX. As sequências dos primers e os tamanhos
dos amplicons esperados estão descritos no ANEXO A.
3.4.2. Pesquisa de número de cópias nos genes PHEX e FGF23 por MLPA
Nos casos em que não foram encontradas mutações na região
codificadora do PHEX nem no éxon 3 do FGF23, foi realizada a pesquisa de
número de cópias para estes genes através da técnica de MLPA (Multiplex
Ligation-dependent Probe Amplification) por meio do kit comercial MLPA
P223-B1 PHEX (MCR Holland, Amsterdam, Holanda). O kit disponibiliza:
! 28 sondas específicas complementares ao PHEX (1 sonda para cada um
dos 22 éxons e 1 sonda adicional para os éxons 1, 3, 5, 11, 12 e 15);
! 4 sondas específicas complementares ao FGF23 (1 sonda para cada um
dos 3 éxons e 1 sonda adicional para o éxon 1) e
! 10 sondas de referência (1 sonda no Xp11.23 e as demais localizadas
em autossomos).
Para cada ensaio de MLPA, foram incluídas, no mínimo, três
amostras de DNA de indivíduos controle do mesmo sexo que os pacientes
estudados.
Foram utilizados cerca de 100 ng de DNA genômico de cada amostra
(pacientes ou indivíduos controle) e a reação foi realizada de acordo com as
instruções do fabricante.
! 29
Os produtos resultantes foram detectados e quantificados por
eletroforese capilar no sequenciador automático ABI Prism 3100 Genetic
Analyzer (PE Applied Biosystems, Foster City, EUA) e analisados pelo
programa Coffalyser.NET (MRC-Holland, Amsterdam, Holanda) fornecido
pelo fabricante.
3.5. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos
Todos os pacientes, maiores de cinco anos, realizaram a DXA e a
HR-pQCT no mesmo dia no Laboratório de Metabolismo Ósseo da Disciplina
de Reumatologia da FMUSP (LIM-17).
A DXA foi feita com o aparelho Hologic DXA Scanner (QDR 4500;
Hologic, Waltham, EUA) para a avaliação da DMOa em coluna lombar (L1-
L4), fêmur proximal (colo de fêmur e fêmur total) e antebraço distal esquerdo
(rádio distal total, 1/3 distal do rádio e rádio ultradistal); nas crianças,
também foi avaliada a DMOa de corpo inteiro subtotal.
A HR-pQCT foi realizada com o aparelho Xtreme CT II (SCANCO
Medical AG, Brüttisellen, Suíça) em rádio e tíbia distais esquerdos para a
avaliação de parâmetros de DMOv e estruturais ósseos, utilizando as
recomendações definidas pelo fabricante (33, 34). O estudo de cada sítio
dura três minutos e é realizado separadamente em antebraço e perna
imobilizados em uma concha de fibra de carbono para evitar artefatos
decorrentes de movimentação. É realizado um RX simples de rádio e tíbia
distais para determinação de planos padronizados de início e término da TC
(scout view). Para que as áreas de interesse de pacientes e controles
representem regiões semelhantes, a aquisição de imagem guarda uma
mesma proporção em relação às extremidades ósseas de rádio e tíbia. São
realizadas 110 fatias compreendendo 9,02 mm ao longo do eixo axial do
osso. Posteriormente, os dados digitais são transformados em imagens
seccionais e é feita uma reconstrução tridimensional. Para que o sistema
reconheça o volume total do tecido e realize as análises, são necessárias as
! 30
determinações do perímetro externo da cortical óssea e da divisão entre os
compartimentos cortical e trabecular. Com isso, através de algoritmos
matemáticos, os principais parâmetros ósseos são calculados - tabela 3 (33,
34).
Tabela 3 - Parâmetros fornecidos pela HR-pQCT
Sigla Parâmetros Unidade
- Área óssea total mm2
- Perímetro médio mm
Tb.area Área trabecular mm2
Ct.area Área cortical mm2
Total vBMD Densidade volumétrica total mg HA/cm3
Tb vBMD Densidade volumétrica trabecular mg HA/cm3
Ct vBMD Densidade volumétrica cortical mg HA/cm3
BV/TV Relação entre o volume ósseo e o volume total -
Tb.N Número médio das trabéculas mm-1
Tb.Th Espessura média das trabéculas mm
Tb.Sp Espaço médio entre as trabéculas mm
SD.1/Tb.N Falta de homogeneidade da rede trabecular mm
Ct.Th Espessura média da cortical mm
HA: hidroxiapatita.
3.6. Avaliação de nefrocalcinose e nefrolitíase
Todos os pacientes foram submetidos a exames de US e TC de rins e
vias urinárias, realizados no Instituto de Radiologia do HC-FMUSP (InRad).
As USs foram realizadas com os aparelhos GE LOGIQ E9 with XDclear
ultrasound system (General Eletric Company, Fairfield, EUA) e Phillips iU22
ultrasound system (Phillips Heathcare, Andover, EUA) e as TCs com os
aparelhos Phillips CT Brilliance 64 channel (Phillips Heathcare, Cleveland,
! 31
EUA) e Toshiba Aquillion 64 channel (Toshiba Medical Systems, Otawara,
Japão). As TCs foram feitas multislice sem contraste que representa um
avanço tecnológico em relação à helicoidal (56).
As imagens obtidas pelas USs foram analisadas independentemente
por dois radiologistas com experiência no diagnóstico de NC e classificadas
segundo o escore abaixo (35):
! Escore 0: ausência de ecogenicidade;
! Escore 1: moderada ecogenicidade ao redor das pirâmides medulares;
! Escore 2: moderada ecogenicidade ao redor e dentro das pirâmides;
! Escore 3: grave ecogenicidade em todas as pirâmides.
As imagens obtidas pelas TCs de rins e vias urinárias multislice sem
contraste foram analisadas independentemente por outros dois radiologistas,
sem conhecimento dos resultados das USs, e com experiência no
diagnóstico de NC e NL por este método. A classificação da NC foi feita de
acordo com o seguinte escore (35):
! Escore 0: ausência de calcificações;
! Escore 1: uma a três calcificações pontuais;
! Escore 2: aumento da densidade das pirâmides;
! Escore 3: calcificações das pirâmides.
A presença de qualquer papila envolvida forneceu um escore maior
que 0, sem número mínimo de papilas exigidas. Quando houve a presença
de características de vários níveis ou a extensão da doença diferiu entre os
dois rins, prevaleceu o maior escore (35).
A confirmação de NC foi determinada com o resultado positivo em
ambos os métodos de imagem (43), US e TC, enquanto o diagnóstico de NL
foi realizado apenas pela TC (47).
! 32
3.7. Análise estatística
A análise estatística foi realizada com o programa SPSS Statistics
software versão 22.0 (SPSS Inc, Chicago, EUA). Foi realizado o teste de
normalidade Shapiro-Wilk para os dados de cada variável quantitativa
estudada. Segundo o tipo de distribuição, os dados foram apresentados
como média ± desvio padrão ou mediana com valores mínimo e máximo. As
diferenças entre grupos foram testadas quanto à significância através dos
testes T-student (distribuição normal) e Mann-Whitney (distribuição não
normal). Conforme a normalidade da distribuição da variável, as correlações
foram realizadas pelos coeficientes de Spearman ou de Pearson. Para as
variáveis qualitativas, foi utilizado o teste qui-quadrado ou o teste exato de
Fisher de acordo com as frequências esperadas. A significância foi
considerada pelo valor de p < 0,05.
!
4. RESULTADOS
! 34
4.1. Avaliação clínica e laboratorial
Foram estudados 47 pacientes com RQ/OM hipofofosfatêmicos
mediados por FGF23, compreendendo 26 casos esporádicos e 21 casos
familiais pertencentes a nove famílias não relacionadas. Os heredogramas
das famílias I e II estão representados nas figuras 1 e 2 do ANEXO B,
respectivamente. A família III foi composta por dois irmãos, enquanto as
famílias IV a VII foram constituídas por mães e filhos.
Trinta e seis pacientes eram do sexo feminino (76,5%) e 11 do sexo
masculino (23,5%), sendo 12 mulheres e 4 homens com idade igual ou
inferior a 18 anos e 24 mulheres e 7 homens com idade superior a 18 anos.
A média de idade para os pacientes ≤ 18 anos foi de 10,9±5,0 anos
enquanto a média de idade para os pacientes > 18 anos foi de 41,8±14,7
anos. Foram calculados os escores Z de estatura e da relação estatura
sentada/estatura para cada paciente – tabela 3 do ANEXO B.
Todos os pacientes na faixa etária pediátrica estavam em uso de
fosfato de sódio e potássio na dose de 30-60 mg/kg/d, mas, entre os 31
pacientes adultos, 13 não usaram fosfato durante a infância e puberdade.
No que se refere à estatura, 38 dos 47 pacientes analisados têm
baixa estatura (80,8%): 12/16 (75%) com idade ≤ 18 anos e 26/31 (83,8%)
com idade > 18 anos. Apesar da frequência de baixa estatura ter sido alta
em ambas as faixas etárias, a média do Z de estatura dos pacientes com
idade ≤ 18 anos foi superior à média do Z de estatura dos adultos (-2,4±1,4
vs -3,5±1,5; p = 0,01) – gráfico 1.
! 35
Além disso, a média do Z de estatura dos adultos que usaram fosfato
durante a infância e adolescência foi superior à média do Z de estatura dos
que não utilizaram o medicamento (-3,0±1,3 vs -4,2±1,5; p = 0,04) – gráfico
2. Embora não tenha sido estatisticamente significante, a média do Z de
estatura dos adultos que fizeram uso de fosfato durante a infância e
adolescência tendeu a ser inferior a dos pacientes pediátricos (-3,0±1,4 vs
-2,4±1,4; p = 0,17).
Para os pacientes na faixa etária pediátrica (idade ≤ 18 anos), não
houve correlação entre a estatura e a idade de início (p=0,408) ou duração
do tratamento com fosfato (p=0,206).
Quanto à relação Es/E, três pacientes adultos com baixa estatura não
conseguiram realizar a mensuração da estatura sentada devido às
deformidades ósseas em membros inferiores.
! 36
Trinta e um dos 35 pacientes com baixa estatura (88,5%)
apresentaram desproporção corporal (Z > +2). Nove dos 12 pacientes
pediátricos (75%) com baixa estatura eram desproporcionados, enquanto 22
dos 26 (84,6%) pacientes adultos com baixa estatura tinham desproporção
corporal. Seis dos nove pacientes com estatura normal também
apresentaram-se desproporcionados (66,6%). Além disso, a frequência de
baixa estatura desproporcionada foi 9/11 (81,8%) nos adultos que não
usaram fosfato na infância e adolescência e 13/17 (76,4%) nos que usaram
a medicação.
Em relação às deformidades ósseas, elas estiveram presentes desde
a infância em todos os pacientes e particularmente nos membros inferiores
(dados não mostrados). Trinta e cinco pacientes foram submetidos a
! 37
correções ortopédicas, seis deles durante a infância e puberdade e 29 após
término do crescimento longitudinal.
Na tabela 3 do ANEXO B, além de dados demográficos, são expostos
os perfis laboratoriais individualizados dos pacientes estudados. Todos
apresentaram níveis séricos elevados de FGF23, taxa de reabsorção tubular
de fosfato aumentada e hipofosfatemia. Os níveis de cálcio eram normais e
24/47 pacientes apresentaram hiperparatireoidismo secundário decorrente
da insuficiência de vitamina D e/ou baixa ingestão de cálcio. Estas
deficiências foram prontamente corrigidas no decorrer do acompanhamento
com normalização dos níveis de PTH.
Cinco adultos foram diagnosticados com hiperparatireoidismo
terciário: quatro durante o seguimento e um caso anteriormente ao estudo.
Em três pacientes, o diagnóstico do hiperparatireoidismo terciário ocorreu na
sexta década de vida (aos 50, 55 e 58 anos); todos com histórico de uso de
fosfato na vida adulta. Uma paciente foi diagnosticada aos 29 anos e
relatava uso de fosfato apenas na infância. O tratamento cirúrgico foi bem
sucedido nos quatro casos com consequente normalização bioquímica.
Apenas uma paciente não tinha histórico de tratamento com fosfato ou
calcitriol; seu diagnóstico foi feito aos 75 anos de idade e a apresentação do
hiperparatireoidismo era assintomática com hipercalcemia e aumento de
PTH discretos. Neste caso, a abordagem cirúrgica foi contraindicada devido
à hipertensão arterial de difícil controle.
Quanto aos marcadores laboratoriais, no período estudado, a
compensação metabólica não foi alcançada em 15 de 16 pacientes
pediátricos mesmo com o uso de doses altas de fosfato (60 mg/kg/d) e
calcitriol. Nos adultos, 10 de 31 pacientes estavam descompensados
metabolicamente.
A maioria dos indivíduos teve função renal normal. Apenas três
pacientes idosas apresentaram diminuição da taxa de filtração glomerular,
sendo uma em estágio 2 e duas em estágio 3 de acordo com a National
! 38
Kidney Foundation (54). As três pacientes apresentavam hipertensão
arterial, das quais duas eram mal controladas.
4.2. Avaliação genotípica
4.2.1. Avaliação do gene PHEX
O estudo do gene PHEX através de PCR e sequenciamento
automático, pelo método de Sanger, possibilitou a determinação da base
molecular em 35 dos 47 pacientes (18 casos familiais com sete casos índice
e 17 casos esporádicos) com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética
mediados por FGF23, classificando-os como XLHR.
Entre os pacientes identificados como XLHR, foram encontradas 24
mutações, sendo 14 inéditas na literatura: três do tipo nonsense; cinco com
microdeleções e uma com inserção de 79 pb implicando na formação de
frameshifts; uma do tipo missense e quatro na região de sítio de splicing –
tabela 4. Todas as mutações encontradas estavam distribuídas ao longo dos
22 éxons ou em suas sequências intrônicas. Além disso, nenhuma mutação
foi encontrada na região 3’-UTR.
As mutações novas do tipo nonsense e resultantes em frameshifts
foram consideradas deletérias por implicarem na formação de uma proteína
truncada.
A variante alélica p.G575R do tipo missense foi identificada em uma
paciente sem história familiar e não foi testada em seus pais. Ela foi
descartada como polimorfismo por não estar descrita nos bancos de dados
dos sites: 1000 Genomes, Ensembl, PubMed e PHEXdb. Posteriormente, foi
testada in silico (programas de predição PolyPhen-2 e MutationTaster),
considerada danosa para a proteína pelos dois programas e, portanto,
indicada como causa da doença.
! 39
As variantes alélicas c.350-2A>G, c.1302+1G>A, c.2070+5G>A e
c.2071-1G>C, localizadas em sítios de splicing também pertencem a casos
esporádicos e não foram testadas em seus pais. Elas foram descartadas
como polimorfismos pelos mesmos motivos citados acima. Todas estavam
localizadas entre -2 e +5 pb das regiões dos sítios de splicing. A seguir,
foram testadas in silico (programas de predição MutationTaster e Human
Splicing Finder) e, por apresentarem alta probabilidade de mudança de sítio
de splicing, também foram consideradas responsáveis pela doença.
Em três casos esporádicos, sem mutações detectadas pelo método
de Sanger, a análise pela técnica de MLPA identificou deleções em
heterozigose em duas mulheres (éxons 1-19 e éxon 16) e deleção em
hemizigose, em um homem (éxons 15-22). Neste último caso, a falha na
amplificação destes éxons por PCR já levantava esta suspeita. Não foi
realizada análise de MLPA de familiares destes casos – tabela 4.
Em uma família, mãe e filha compartilharam a duplicação no éxon 12.
Adicionalmente, em outro caso com apresentação familial foi encontrada
uma deleção em heterozigose dos éxons 13-15. O pai desta menina
apresenta XLHR, porém seu DNA não foi acessível para o mesmo estudo.
Desta forma, em seis casos esporádicos com RQ/OM
hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23, não foram
identificadas alterações nas regiões codificadora e de splicing do PHEX
pesquisadas pelos métodos de Sanger e MLPA.
Além do esclarecimento etiológico de grande parte dos casos (41/47),
o estudo genético do PHEX permitiu excluir o filho da paciente 7 da família II
(figura 2 do ANEXO B) como portador de XLHR o qual nasceu no decorrer
do estudo. A análise foi realizada nos primeiros meses de vida da criança,
por meio do DNA genômico obtido do seu coto umbilical.
! 40
Tabela 4 – Mutações no gene PHEX em 21 casos familiais e 20 casos
esporádicos de XLHR
Apresentação Localização DNA Proteína dbSNP ID/HGMD Mutações nonsense
F (n = 5) Éxon 1 c.623C>T p.R20* CM971148 F (n = 2) Éxon 5 c.1076G>T p.E171* Nova E Éxon 5 c.1105G>A p.W180* Nova E Éxon 15 c.2210C>T p.R549* CM973083 F (n = 2) Éxon 16 c.2264C>T p.R567* CM060430 E Éxon 20 c.2545G>A p.W660* Nova F (n = 4) Éxon 22 c.2804C>T p.R747* CM981530
Frameshift: inserções e deleções F (n = 2) Éxon 9 c.1550_1550delC p.H329Ifs*2 Nova E Éxon 11 c.1854_1854delA p.D430Vfs*5 Nova E Éxon 16 c.2226_2236del11nt p.E554Afs*24 Nova E Éxon 18 c.2461_2462ins79 p.N633Ifs*6 Nova E Éxon 20 c.2589_2589delG p.G675Afs*12 Nova E Éxon 21 c.2669_2669delC p.R702Efs*38 Nova
Mutações missense E Éxon 12 c.1914T>C p.L450P CM111057 E Éxon 13 c.2035A>T p.E490D rs371934258 E Éxon 17 c.2288G>C p.G575R Nova E Éxon 17 c.2300G>C p.G579R CM971166 E Éxon 22 c.2810T>C p.W749R CM981531
Mutações em sítios de splicing E Intron 3 c.350-2A>G NA Nova E Intron 11 c.1302+1G>A NA Nova F (n = 1)# Intron 14 c.1586_1586+1delAG NA Gaucher et al (57) F (n = 2) Intron 18 c.1899+1G>A NA CS092782 E Intron 20 c.2070+5G>A NA Nova E Intron 20 c.2071-1G>C NA Nova
Análise pelo MLPA E Deleção éxon 1-19 NA Nova F (n=2) Duplicação éxon 12 NA Nova F (n=1)## Deleção éxon 13-15 NA Nova E Deleção éxon 15-22 NA Nova E Deleção éxon 16 NA Nova F: familial; E: esporádica; n: número de membros afetados; NA: não se aplica; #paciente possui dois filhos afetados que não pertencem à nossa casuística; ##pai da paciente é afetado e não pertence à casuística.
! 41
4.2.2. Avaliação do gene FGF23
Nos seis pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética
mediados por FGF23 e pesquisa negativa para mutações no PHEX, a
avaliação do éxon 3 do gene FGF23 (região hotspot para mutações
ativadoras) pelas técnicas de PCR e sequenciamento automático não
evidenciou alterações. O estudo do MLPA também não identificou alterações
no número de cópias do FGF23.
4.3. Avaliação da DMO e dos parâmetros estruturais ósseos
Com o intuito de homogeneizar a casuística, seis pacientes foram
excluídos da análise por não apresentarem mutações inativadoras no gene
PHEX. Adicionalmente, foram excluídas três crianças por terem idade
inferior a seis anos quando a reprodutibilidade da HR-pQCT não é confiável
(58). Desta forma, 38 pacientes (28 mulheres e 10 homens; 13 crianças e 25
adultos) com XLHR, confirmados com mutação no PHEX, foram
selecionados para a análise dos resultados de DXA e HR-pQCT.
Devido às deformidades esqueléticas, particularmente em membros
inferiores, e/ou a presença de objetos metálicos (placas, pinos e parafusos)
nos sítios a serem analisados, nem todos os pacientes realizaram a DXA em
fêmur proximal (n=33) e a HR-pQCT de tíbia distal (n=34).
Todos os pacientes foram pareados para a idade, sexo e estádio
puberal com indivíduos saudáveis provenientes do banco de dados do LIM-
17.
! 42
4.3.1. Avaliação da DMOa por DXA
Os valores absolutos de DMOa obtidos pela DXA nos diferentes sítios
estudados estão mostrados nas tabelas 5 e 6 do ANEXO C.
Os pacientes com XLHR apresentaram maior DMOa em L1-L4
comparados aos seus respectivos controles (p=0,03) – gráfico 3 e tabela 5
do ANEXO C. Após a estratificação dos pacientes por faixa etária, esta
diferença desapareceu na faixa pediátrica (p=0,14) enquanto os adultos
mantiveram maior DMOa comparados aos seus controles (p<0,01) – gráfico
4 e tabela 6 do ANEXO C.
! 43
Em colo de fêmur e fêmur total, não houve diferenças quanto à DMOa
entre os grupos (p=0,58 e p=0,83, respectivamente) - tabela 5 do ANEXO C.
Quanto ao rádio distal total, não houve diferenças na DMOa entre os
grupos estudados (p=0,19). Ao analisarmos as diferentes regiões do rádio,
os pacientes tiveram menor DMOa em 1/3 distal do rádio comparados aos
seus respectivos controles (p<0,01) sem alterações no rádio ultradistal
(p=0,38) - gráfico 5 e tabela 5 do ANEXO C. Esta menor DMOa em 1/3 distal
do rádio esteve presente nas crianças e nos adultos - tabela 6 do ANEXO C.
! 44
A DMOa de corpo inteiro subtotal foi avaliada na faixa etária pediátrica
e não houve diferença significativa entre os grupos (p=0,39) - tabela 6 do
ANEXO C.
4.3.2. Avaliação dos parâmetros geométricos, da DMOv e da microarquitetura óssea obtidos por HR-pQCT
Os parâmetros geométricos, dados de DMOv e parâmetros referentes
à microarquitetura óssea dos grupos de pacientes com XLHR e controles
obtidos por HR-pQCT, bem como as análises estratificadas por faixa etária e
compensação metabólica, estão apresentados nas tabelas 7-9 do ANEXO C.
Quanto aos parâmetros geométricos (área óssea total, perímetro
médio, área trabecular e área cortical), não houve diferenças significativas
entre os grupos no rádio (p=0,22; p=0,63; p=0,20 e p=0,55 respectivamente)
! 45
e na tíbia distais (p=0,27; p=0,33; p=0,32 e p=0,18 respectivamente) – tabela
7 do ANEXO C.
No rádio distal, não houve diferenças entre os grupos quanto à
densidade volumétrica total (Total vBMD; p=0,89) ou aos seus
compartimentos trabecular (Tb vBMD; p=0,31) e cortical (Ct vBMD; p=0,65) -
gráfico 6 e tabela 7 do ANEXO C. Entretanto, ao dividirmos o grupo de
pacientes por faixa etária, o grupo pediátrico apresentou maior Tb vBMD
(p<0,01) do que seus controles, sem diferenças no Total vBMD (p=0,12) e
no Ct vBMD (p=0,62). Por sua vez, os adultos não diferiram quanto ao Total
vBMD (p=0,36), à Tb vBMD (p=0,70) e à Ct vBMD (p=0,52) – gráfico 7 e
tabela 8 do ANEXO C.
! 46
Na tíbia distal, os pacientes apresentaram menor Total vBMD
(p=0,02) do que os controles e a análise compartimental mostrou que esta
diferença ocorreu às custas de um déficit do Tb vBMD (p<0,01) uma vez que
não houve diferença da Ct vBMD (p=0,27) entre os grupos – gráficos 8 e 9 e
tabela 7 do ANEXO C.
! 47
Ainda em relação à tíbia distal, na divisão por faixa etária, ambos os
grupos etários mantiveram menor Tb vBMD (p<0,01), sem alterações na Ct
vBMD nas crianças (p=0,64) e nos adultos (p=0,49) - tabela 8 do ANEXO C.
! 48
Quanto às alterações da microarquitetura óssea do rádio distal, o
grupo de pacientes apresentou: menor número de trabéculas (Tb.N; p=0,01),
maior espessura das trabéculas (Tb.Th; p<0,01) e maior falta da
homogeneidade trabecular (SD.1/Tb.N; p=0,02) - tabela 7 do ANEXO C. Não
houve diferenças quanto à relação entre o volume ósseo e o volume total
(BV/TV; p=0,31), ao espaço médio entre as trabéculas (Tb.Sp; p=0,24) e à
espessura cortical (Ct.Th; p=0,70) – tabela 7 do ANEXO C.
A análise da microarquitetura do rádio de crianças e adultos revelou
algumas particularidades. Enquanto o grupo pediátrico teve maior BV/TV
(p<0,01) e maior Tb.Th (p<0,01) do que os seus controles sem outras
alterações, o grupo adulto apresentou déficits mais significativos: menor
Tb.N (p<0,01), maior Tb.Sp (p<0,01) e maior SD.1/Tb.N (p<0,01) – gráficos
10 a 12 e tabela 8 do ANEXO C.
! 49
As alterações da microarquitetura óssea da tíbia distal foram mais
evidentes do que no rádio. Os pacientes com XLHR mostraram menor
BV/TV (p<0,01), menor Tb.N (p<0,01), maior Tb.Sp (p<0,01) e maior
! 50
SD.1/Tb.N (p<0,01) com preservação das espessuras das trabéculas (Tb.Th;
p=0,52) e da cortical (Ct.Th; p=0,77) - tabela 7 do ANEXO C. Estas mesmas
diferenças se mantiveram com a estratificação nos grupos pediátrico e
adulto: menor BV/TV (p<0,01), menor Tb.N (p=0,04 nas crianças e p<0,01
nos adultos), maior Tb.Sp (p=0,03 nas crianças e p<0,01 nos adultos) e
maior SD.1/Tb.N (p=0,01 nas crianças e p<0,01 nos adultos) – tabela 8 do
ANEXO C.
Por último, foi realizada a estratificação quanto ao status metabólico
apenas para os pacientes adultos com XLHR, pois a maioria dos pacientes
pediátricos estava descompensada metabolicamente. Após análise das
DMOv, dos parâmetros geométricos e microestruturais de rádio e tíbia
distais, não houve diferenças entre os resultados dos pacientes
compensados e os dos pacientes descompensados com exceção da
Ct.vBMD de tíbia distal – tabela 9 do ANEXO C.
Curiosamente, os pacientes descompensados apresentaram menor
Ct vBMD do que os seus controles (p=0,02), enquanto esta diferença não foi
observada no grupo de pacientes compensados (p=0,49) – gráfico 13 e
tabela 9 do ANEXO C.
! 51
4.4. Avaliação de nefrocalcinose e nefrolitíase
Cinco pacientes foram excluídos da análise por não apresentarem
mutações inativadoras no gene PHEX. Outros três indivíduos não realizaram
a US de rins e vias urinárias e foram retirados da avaliação também.
Portanto, 39 pacientes (30 mulheres e 9 homens; 16 crianças e 23 adultos)
com XLHR, confirmados com mutação no PHEX, foram selecionados para a
avaliação renal.
A US constatou que 37 (94,9%) indivíduos com XLHR (16 crianças e
21 adultos) apresentavam NC: 36 (97%) como grau 1 e um (3%) como grau
2 - gráfico 14. Apenas dois homens adultos, ambos com 30 anos de idade,
não apresentaram sinais de NC vistos pela US. Eles não tinham outras
alterações metabólicas exceto a hiperfosfatúria inerente ao XLHR. Além
disso, iniciaram o tratamento com fosfato tardiamente e irregularmente
conforme atestado pela baixa estatura e deformidades importantes em
membros inferiores apresentadas por ambos.
Em contrapartida, a TC identificou NC medular em 15 (38,5%)
pacientes (nove crianças e seis adultos): 10 (66,7%) como grau 1 e cinco
(33,3%) como grau 2. Nenhum paciente apresentou NC cortical nem NC
grau 3. Vinte e dois pacientes com TC normal tiveram NC diagnosticada pela
US como grau 1 principalmente. Todos os casos de NC detectados pela TC
também tinham alterações na US - gráfico 14.
! 52
Quinze pacientes (38,5%) com XLHR foram diagnosticados com NC
considerando sua presença confirmada conjuntamente pela US e TC de rins
e vias urinárias alteradas. Curiosamente, a estratificação por faixa etária
mostrou maior prevalência de NC nas crianças (9/16 = 56,3%) em relação
aos adultos (6/23 = 26,1%), mas os graus de NC foram similares entre os
grupos.
Os dois grupos etários diferiram particularmente quanto ao tratamento
com fosfato. No momento do estudo, todas as crianças estavam em uso
intensivo de fosfato, enquanto nenhum adulto fazia uso desta medicação.
Isto explica a média da fosfatúria maior no grupo pediátrico comparado ao
grupo adulto (p<0,01). Esta diferença persistiu após a correção da fosfatúria
pela creatinina urinária (p<0,01), descartando possíveis problemas na coleta
das amostras urinárias – tabela 5.
! 53
Tabela 5 – Avaliação da função renal e dos fatores de risco para NC e NL
nos pacientes com XLHR estratificados por faixa etária
Parâmetros analisados XLHR (n=39)
Crianças (n=16)
Adultos (n=23)
p
RFG (ml/min/1,73 m2) 152±46 186±43 128±31 <0,01*
Pu (mg/kg/d) 14,7±11,5 24,1±12,9 8,2±2,5 <0,01*
Relação Pu/Cru 1,02±0,72 1,66±0,70 0,55±0,19 <0,01*
Pacientes com hipocitratúria 11 (28,2%) 5 (31,3%) 6 (26,1%) 0,73
Pacientes com hipercalciúria 2 (5,1%) 1 (6,3%) 1 (4,3%) 1,0
Pu: fósforo urinário; Cru: creatinina urinária. Valores expressos em média±DP;*p <0,05 foi
considerado estatisticamente significante.
É importante saber que parte dos adultos não fez tratamento com
fosfato na infância e adolescência (9/23 = 39,1%). Entre os adultos que
usaram fosfato na infância (14/23 = 60,9%), o início do seu tratamento foi
mais tardio do que nas crianças (8,0±3,2 vs 2,8±2,3 anos; p<0,01).
Adicionalmente, a dose de fosfato utilizada pelos adultos quando crianças foi
menor do que a utilizada na faixa pediátrica atualmente, mas ela não pôde
ser estimada em mg/kg/peso por falta de informações nos prontuários e
pelas diferentes durações de tratamento.
Em contraste, quatro pacientes adultos sem uso de fosfato na infância
e adolescência desenvolveram NC; dos quais dois nunca utilizaram esta
medicação mesmo na fase adulta. Nenhum deles teve evidências de
hipocitratúria e/ou hipercalciúria - tabela 4 do ANEXO B.
Quanto aos fatores de risco metabólico, 12 dos 39 (30,8%) indivíduos
estudados possuíam alterações em mais de uma amostra de urina de 24
horas – tabela 5 e tabela 4 do ANEXO B. Nenhum paciente apresentou
hiperoxalúria.
A hipocitratúria foi o fator de risco mais comum (28,2%), enquanto a
hipercalciúria foi detectada em apenas uma criança sem evidências de NC e
em uma adulta (paciente 16). Hipercalciúria e hipocitratúria foram
identificadas conjuntamente somente na paciente 16. Não houve diferença
! 54
quanto à presença de hipercalciúria e hipocitratúria entre os grupos com e
sem NC (p=1,0 em ambas as comparações).
Duas famílias estudadas (famílias I e VI – tabela 3 do ANEXO B)
tiveram mais de um membro com diagnóstico de NC. Na família I, o pai tinha
NC grau 1 e as duas filhas foram detectadas com NC grau 2 (pacientes 2, 3
e 4 – tabela 3 do ANEXO B). Nenhum deles tinha outras alterações
metabólicas com exceção da hiperfosfatúria. Na família VI, a mãe e o seu
filho (pacientes 16 e 17 - tabela 3 do ANEXO B) foram diagnosticados com
NC grau 2 e ambos apresentavam hipocitratúria. A mãe também
apresentava NL diagnosticada pela TC e, teve diagnóstico de
hiperparatireoidismo terciário no decorrer do estudo, aos 29 anos. Ela foi
tratada cirurgicamente com sucesso e consequente normalização da
calciúria.
Além deste caso, outra mulher (paciente 47 - tabela 3 do ANEXO B)
tinha antecedente de hiperparatireoidismo terciário tratado cirurgicamente
antes do estudo. Ela não apresentou hipercalciúria no decorrer da avaliação,
mas teve o diagnóstico de NC grau 1.
Em relação à pesquisa de NL, quatro adultos (10,3%) foram
identificados pela TC, dos quais duas tinham NC associada (pacientes 16 e
18 – tabela 3 do ANEXO B). Somente a paciente 16 tinha histórico de cólica
nefrética, enquanto os demais eram assintomáticos. Além dessa paciente
com alterações metabólicas urinárias, apenas uma adulta foi detectada com
hipocitratúria. Nenhuma criança foi diagnosticada com NL - tabela 4 do
ANEXO B.
Apesar da presença de NC e NL, a maioria dos indivíduos tinha
função renal normal. Somente uma idosa (paciente 1 - tabela 3 do ANEXO
B) possuía diminuição da RFG - estágio 3 de acordo com o National Kidney
Foundation (54). Ela apresentou NC grau 1 apenas pela US, nunca fez uso
de fosfato e era hipertensa mal controlada.
!
5. DISCUSSÃO
! 56
5.1. Estatura nos RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23
A baixa estatura foi uma característica fenotípica marcante nos
nossos pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos. Após a estratificação dos
pacientes por faixa etária e uso de fosfato na infância e adolescência, o
grupo de pacientes pediátricos, em uso intensivo de fosfato, apresentou a
maior média do Z de estatura (-2,4±1,4). Além disso, observou-se menor
média do Z de estatura no grupo de adultos que não fizeram uso de fosfato
em comparação aos que utilizaram esta medicação (-4,2±1,5 vs -3,0±1,3).
Estes dados demonstram o impacto positivo do emprego do fosfato durante
a infância e adolescência na melhora da estatura dos pacientes com RQ/OM
hipofosfatêmicos de origem genética. Dados similares já haviam sido
descritos por Reusz et al (59).
A diferença entre as médias do Z de estatura dos adultos que fizeram
uso de fosfato durante a infância e adolescência e dos pacientes pediátricos
pode estar relacionada à dose, início e/ou duração de tratamento com
fosfato. Apesar disso, não foi possível confirmar esta hipótese devido à falta
de informações em alguns prontuários e à imprecisão nos relatos dos
adultos sobre o uso de fosfato.
Neste sentido, em seus relatos, tanto Makitie et al como Vaisbich et al
alertam para a importância da precocidade no início do tratamento (60, 61).
No entanto, em nossa casuística pediátrica, não encontramos correlações
entre o Z de estatura e o início do tratamento com fosfato, nem com sua
duração. Os principais motivos para estes resultados devem estar
relacionados à casuística pequena e ao fato de não conseguirmos estimar a
aderência do paciente ao uso do fosfato. Segundo Makitie et al, a falta de
! 57
vigilância dos pais, o gosto ruim das soluções de fosfato e a falta de
sintomas exuberantes contribui para a baixa adesão em jovens (60). A estes
fatores, acrescentamos a posologia da medicação em quatro tomadas
diárias longe das refeições preferencialmente.
Apesar do ganho estatural com melhora da velocidade de
crescimento e dos sinais de raquitismo (dados não mostrados) durante o
tratamento com fosfato de sódio e potássio, a normalização estatural não
aconteceu na maioria dos casos à semelhança do relato de Cho et al (62).
Segundo Verge et al, estes pacientes não atingem seu potencial estatural
total, pois o tratamento aparentemente não promove a cura histológica da
doença (63).
Quanto à relação Es/E, a maior parte dos pacientes estudados com
baixa estatura (88,5%) apresentou desproporção corporal devido às
deformidades em membros inferiores, principalmente os adultos que não
fizeram uso de fosfato na infância e tinham a menor média do Z de estatura.
À semelhança dos nossos resultados, Zivcnjak et al comprovaram maior
desproporção corporal com maiores valores do Z da relação Es/E em
pacientes com menor estatura (64). Estas alterações antropométricas
ocorrem por um maior comprometimento da doença nos ossos longos dos
membros inferiores e superiores em comparação ao esqueleto axial, mesmo
em pacientes com estatura normal (12, 65).
A desproporção corporal foi identificada em parte da nossa casuística
pediátrica, particularmente em adolescentes com menor estatura.
Aparentemente, esta desproporção entre os segmentos corpóreos em
pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos tem piora progressiva com o
avançar da idade e persiste apesar do controle metabólico com o tratamento
intensivo com fosfato e calcitriol (64).
! 58
5.2. Etiologia molecular dos pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23
Ao limitarmos a população estudada aos casos de origem genética
mediados por FGF23, com base em dados clínicos e laboratoriais, houve a
constituição de um grupo relativamente homogêneo que aumentou a
probabilidade de determinação da sua etiologia molecular.
Em nossa casuística, a principal forma hereditária encontrada em
casos familiares e esporádicos foi o XLHR devido à presença de mutações
inativadoras no PHEX em 87,2% dos pacientes. Este resultado é consistente
com o percentual de mutações detectadas neste gene, 25-87%, em relatos
prévios, confirmando o XLHR como a forma mais comum de RQ/OM
hipofosfatêmico de origem genética (66-68). Portanto, neste grupo de
pacientes, o início do estudo molecular pelo PHEX constitui uma estratégia
racional.
Através da PCR e do sequenciamento automático, foram detectadas
24 mutações no PHEX dispersas ao longo de toda sua região codificadora e
sítios de splicing, sinalizando a importância de cada éxon na função do gene
e a necessidade de investigação de toda a sua extensão. Apesar de
existirem, aproximadamente, mais de 300 diferentes mutações no PHEX
descritas, os principais mecanismos envolvidos incluem mutações de ponto,
microdeleções e microinserções facilmente detectáveis pelo método de
Sanger (66, 68, 69). Desta forma, estes devem ser os primeiros tipos de
mutações a serem investigadas no gene PHEX.
Devido à localização deste gene no cromossomo X e à sua herança
dominante, pacientes do sexo feminino com deleções e/ou duplicações em
um único ou vários éxons podem não ser identificadas pelo método de
Sanger. Portanto, evidencia-se a importância de técnicas, como o MLPA, na
identificação das alterações do número de cópias em heterozigose do PHEX
no XLHR. Nesta casuística, o emprego do MLPA contribuiu para o aumento
do percentual de mutações detectadas ao identificar cinco mutações
! 59
(12,1%): quatro deleções e uma duplicação. Este percentual foi semelhante
ao relatado por Beck-Nielsen et al (70).
Apesar dos diferentes tipos de mutações encontradas, todos os
pacientes estudados apresentaram o fenótipo clássico do XLHR, visto que o
PHEX apresenta alta penetrância (66). Variações fenotípicas foram
preferencialmente influenciadas pelo tratamento com fosfato e calcitriol.
Entretanto, há raros relatos da literatura que descrevem discordância
genótipo-fenótipo. Por exemplo, em um trabalho, enquanto o caso índice
apresentava o fenótipo evidente de XLHR, seus familiares com o mesmo
genótipo tinham apenas alterações laboratoriais (66). Diante deste fato, o
envolvimento de genes moduladores e de elementos regulatórios do PHEX
não pode ser descartado na patogênese do XLHR e no desfecho clínico das
mutações.!(9, 66, 71).!
5.3. DMO e os parâmetros estruturais ósseos nos XLHR
Nossos resultados mostraram maior DMOa em L1-L4 nos pacientes
com XLHR em relação a controles saudáveis à semelhança dos relatos de
Beck Nielsen et al (12, 65). Ao estratificarmos os pacientes por faixa etária,
este achado se manteve apenas no grupo adulto da nossa casuística.
Tipicamente, este aumento de DMOa é justificado pela presença de
calcificações extra-esqueléticas (12), particularmente representadas por
entesopatias ligamentares. Estas foram confirmadas na maioria dos
pacientes adultos estudados por meio do RX de coluna lombar (dados não
mostrados).
Geralmente, as crianças e adolescentes não apresentam estas
alterações extra-esqueléticas. Rauch explica este padrão baseado na teoria
do mecanostato, na qual o aumento da DMOa é uma consequência do
aumento da formação de osso trabecular pelo estímulo dos osteócitos como
adaptação às maiores cargas mecânicas (72).
! 60
Por sua vez, a DMOa no colo de fêmur e fêmur total não diferiu entre
os grupos, como relatado por Beck Nielsen et al. (12). O aumento da DMOa
consequente à formação de osso trabecular contrabalança a subestimação
da DMOa pelo menor tamanho dos ossos dos pacientes com XLHR,
resultando em valores normais nestes sítios (65).
Finalmente, no rádio distal total, não houve diferenças entre os grupos
quanto à DMOa. Shore et al também relataram valores normais de DMOa no
rádio distal total de pacientes com XLHR (73), embora outros estudos
tenham demonstrado menor DMOa neste sítio (74, 75).
Apesar da ausência de alterações em rádio distal total, os pacientes
com XLHR apresentaram menor DMOa em 1/3 distal de rádio, sem
alterações da DMOa em rádio ultradistal, comparados aos controles. Dados
referentes à DMOa em 1/3 distal do rádio e rádio ultradistal no XLHR são
escassos na literatura. Considerando que a composição do 1/3 distal de
rádio é de 13% de osso trabecular e 87% de osso cortical e que a
composição do rádio ultradistal é de 55% de osso trabecular e 45% de osso
cortical (76), esse achado pode ser um reflexo dos diferentes efeitos da
doença nos componentes trabecular e cortical (77).
Diante destes fatos, a interpretação dos resultados de DXA deve ser
feita com cautela devido à interferência de fatores anatômicos e
antropométricos (78). Por outro lado, a HR-pQCT avalia a DMOv em áreas
distais e sofre menor influência do tamanho do ossos longos e da presença
de alterações extra-esqueléticas (33).
Apesar de não termos encontrado alterações geométricas na análise
da HR-pQCT de rádio e tíbia distais dos pacientes com XLHR, estudos
prévios relatam maior área total no rádio distal decorrente do aumento da
área trabecular como uma adequação para a preservação da resistência
óssea (77, 79).
No rádio distal dos nossos pacientes com XLHR, não foram
encontradas alterações na DMOv total nem nos seus componentes
trabecular e cortical. Após a estratificação dos pacientes por faixa etária, as
! 61
crianças apresentaram maior DMOv trabecular em comparação aos seus
controles, enquanto esta alteração não foi observada nos adultos. Não foi
identificada alteração da DMOv cortical em ambos os grupos etários.
Resultados similares foram relatados por Cheung et al que
identificaram maior DMOv trabecular no rádio distal de pacientes com XLHR,
particularmente naqueles em uso de fosfato e calcitriol comparados aos que
não usaram as medicações (79). Estes dados assemelham-se aos
observados em nossa casuística, visto que as crianças estudadas estavam
em uso intensivo de fosfato e que os adultos não usavam a medicação.
Segundo Cheung et al, o aumento da DMOv trabecular seria um reflexo do
aumento da mineralização deste compartimento estimulado pelo uso de
fosfato e calcitriol e este mecanismo estaria perdido com a descontinuação
das medicações (79).
Na tíbia distal, os pacientes com XLHR apresentaram menor DMOv
total do que seus controles às custas do componente trabecular sem
alterações do componente cortical. Este déficit foi observado nas crianças e
nos adultos com XLHR. Diferentemente, Veilleux et al referem redução da
DMOv cortical sem comprometimento da DMOv trabecular em tíbia distal de
pacientes com XLHR (58).
Estas diferenças na DMOv de rádio e tíbia distais podem ser
atribuídas às cargas mecânicas distintas presentes nestes sítios. Ossos em
regiões de maior carga mecânica, como a tíbia, apresentam um maior
impacto das alterações ósseas do que as regiões com menor carga
mecânica, como o antebraço (78). Além disso, as deformidades em
membros inferiores, presentes no XLHR, modificam os pontos de tensão e
resultam na distribuição heterogênea da carga mecânica com consequente
formação óssea heterogênea e assimétrica. Desta forma, elas contribuem
para um maior déficit na aquisição de massa óssea na tíbia.
Quanto à análise da microarquitetura óssea, alterações estruturais
trabeculares foram encontradas em ambos os sítios dos pacientes com
XLHR. No rádio, os pacientes apresentaram menor número de trabéculas e
! 62
maior perda da homogeneidade da rede trabecular; na tíbia, foram
demonstrados menor número de trabéculas, maior separação das trabéculas
e maior perda da homogeneidade trabecular. Estes achados são
consistentes com um estudo prévio com microTC de alta resolução em Hyp
mouse (modelo murino equivalente ao PHEX humano deficiente) (80) e in
vivo (77) e reforçam o efeito deletério da doença no componente trabecular
nos diferentes sítios no XLHR.
Ao separarmos os pacientes com XLHR por faixa etária, as alterações
de microarquitetura no rádio foram predominantes nos adultos, os quais não
estavam em vigência de fosfato. Ao contrário, as crianças, em tratamento
intensivo com fosfato, não apresentaram os mesmos déficits. Na tíbia, as
alterações na estrutura trabecular estiveram presentes nos dois grupos.
Estes achados podem sugerir o efeito benéfico do tratamento com fosfato na
microarquitetura óssea, sendo mais evidente no rádio pelo menor impacto
das cargas mecânicas.
Após a estratificação dos adultos pelo status metabólico, não houve
diferenças entre os pacientes com XLHR compensados e os não
compensados quanto às alterações na DMOv trabecular e aos parâmetros
estruturais encontrados em rádio e tíbia distais.
Curiosamente, na tíbia distal, os pacientes descompensados
apresentaram menor DMOv cortical do que os controles, enquanto os
pacientes compensados tiveram resultados similares aos controles. Cheung
et al comentam sobre o efeito positivo da aderência ao tratamento na
melhoria da mineralização dos componentes ósseos (79). Desta forma, em
nossa casuística, este achado indica que o tratamento efetivo pode
recuperar a mineralização nos pacientes com XLHR. Além disso, a região
óssea cortical seria restabelecida primariamente pelo tratamento, ao mesmo
tempo em que o componente trabecular teria menor capacidade de
regeneração por sofrer maior efeito deletério da doença.
Um diferencial deste estudo é a avaliação de parâmetros ósseos com
o uso conjunto de duas técnicas de imagem diferentes em uma casuística de
! 63
pacientes com mutações no PHEX confirmadas por técnicas de biologia
molecular. Além do mais, a estratificação por grupos etários e status
metabólico trouxe novas informações sobre o XLHR. Entretanto, é
importante notar algumas limitações. Por exemplo, o tamanho da amostra e
a falta de um número maior de homens não permitiu a análise de possíveis
diferenças de gênero. Além disso, o desenho transversal do estudo limita a
interpretação das alterações a longo prazo com o manejo do tratamento.
5.4. Nefrocalcinose e nefrolitíase nos XLHR
Neste trabalho, a prevalência de NC confirmada pelos dois métodos
de imagem (US e TC) foi de 38,5% e, após a estratificação por faixa etária, o
grupo pediátrico teve maior prevalência de NC que o grupo adulto (56,3% vs
26,1%).
Na literatura médica, a prevalência de NC variou de 17 a 80% em
séries de pacientes com diagnóstico clínico de XLHR (61, 63, 81). Nestes
trabalhos, o diagnóstico de NC foi baseado apenas nos resultados da US, o
que confere menores sensibilidade e especificidade para o diagnóstico
comparada à utilização de duas técnicas radiológicas conjuntamente (43).
Ao analisar os resultados fornecidos por cada método de imagem,
notou-se que a US diagnosticou majoritariamente a NC em estágios mais
precoces (grau 1), enquanto a TC identificou maior proporção de casos mais
avançados (grau 2). Esta diferença se deve à maior sensibilidade da US e à
maior especificidade da TC no diagnóstico da NC (35, 43, 50).
Boyce et al explicam que pequenas agregações de cálcio e fosfato
atuam como fortes refletores de ondas sonoras, sendo assim detectadas
mais facilmente pelo US. Apesar disso, elas não possuem densidade
suficiente para absorver a radiação emitida pela TC e serem identificadas
neste estágio inicial de NC (35).
Embora o uso de ambos os métodos de imagem forneça maior
! 64
acurácia no diagnóstico da NC (43), uma vantagem da US, particularmente
na faixa pediátrica, é a ausência dos efeitos deletérios a longo prazo
causados pela radiação empregada na TC (82). Assim, acreditamos que a
US é importante para a triagem e avaliação evolutiva dos casos de NC,
enquanto a TC tem papel fundamental na confirmação do diagnóstico.
Em relatos prévios, um dos principais fatores de risco considerados
para o desenvolvimento de NC é a hipercalciúria (61-63, 83). Entretanto,
nestes estudos, a maior parte dos pacientes teve o diagnóstico baseado
somente em dados clínicos e laboratoriais, podendo ter incluído outros tipos
de tubulopatias perdedoras de fósforo que cursam naturalmente com
hipercalciúria.
Diferentemente destes trabalhos, em nossa coorte, a hipercalciúria foi
encontrada em apenas uma paciente com NC durante o período no qual ela
desenvolveu hiperparatireoidismo terciário. Além disso, esta paciente
apresentava hipocitratúria e NL.
O baixo consumo de cálcio na dieta, a irregularidade no uso de
carbonato de cálcio e calcitriol pelos pacientes e o monitoramento constante
(medidas frequentes de calcemia, PTH e calciúria com ajustes das doses de
calcitriol e/ou sais de cálcio quando necessários) devem explicar este
resultado.
Embora a hipocitratúria seja considerada fator de risco para a
formação de NC (84), esta alteração metabólica não tem sido pesquisada
em indivíduos com XLHR. Apesar da detecção em um terço dos nossos
pacientes, a hipocitratúria esteve igualmente presente nos grupos com e
sem NC.
Nesta série, o principal fator de risco metabólico para a formação de
NC foi a sobrecarga renal de fosfato agravada pelo tratamento. Este dado é
realçado pela diferença da prevalência de NC entre o grupo pediátrico e o
grupo adulto (56,3% vs 26,1%). Além do mais, parte dos adultos não usaram
fosfato na infância e adolescência (39,1%) e aqueles que tomaram fosfato
! 65
tiveram o início de tratamento mais tardio com o uso de doses menores que
as utilizadas atualmente e com menor regularidade.
Dados experimentais em coelhos, nos quais a gravidade da NC foi
diretamente proporcional às doses de fosfato ingeridas, confirmam in vivo o
efeito deletério da hiperfosfatúria sobre o tecido renal (85). Como em nossos
resultados, casuísticas menores e mais antigas sem o diagnóstico molecular
de XLHR também sugerem as repercussões danosas do uso do fosfato in
vivo (63, 83).
Apesar da importância da hiperfosfatúria na gênese da NC, não foi
possível estabelecer um valor de corte para a fosfatúria, a partir do qual
houvesse um maior risco de desenvolvimento de NC, particularmente nas
crianças em tratamento intensivo com fosfato. Isto deve ter ocorrido pelo
número limitado de pacientes e pelo desenho transversal do estudo, no qual
a análise da fosfatúria por um curto período de tempo não permite a
avaliação do efeito cumulativo desta.
O uso de fosfato agrava a hiperfosfatúria ao estimular a produção de
FGF23, mas é fundamental para a melhora da estatura final e atenuação das
deformidades esqueléticas dos pacientes com XLHR. Nossa paciente mais
jovem detectada com NC tinha três anos de idade. Nesse e em outros casos
de crianças com NC, consideramos a redução das doses do fosfato, mas a
manutenção das dosagens foram necessárias para a preservação da
velocidade de crescimento adequada, manutenção dos níveis dos
marcadores de formação óssea próximos aos valores de normalidade e
ausência de sinais radiológicos de raquitismo. A continuidade deste estudo,
por meio da avaliação evolutiva da US renal destas crianças, deve revelar
mais informações da história natural da NC em pacientes com XLHR.
Quatro pacientes adultos (4/15 = 26,7%), que não fizeram uso de
fosfato na infância e adolescência, desenvolveram NC; dos quais dois nunca
utilizaram esta medicação e não tinham hipocitratúria e/ou hipercalciúria.
Estes dados sugerem a influência da doença per si na gênese da NC no
XLHR pelo comprometimento da reabsorção de fosfato no túbulo proximal e
! 66
consequente maior exposição do tecido renal ao fosfato independente do
tratamento.
Em contraste aos 38,5% de NC, 10,3% dos pacientes com XLHR
estudados tiveram NL, frequência superior à prevalência de NL na
população geral (37-39). Curiosamente, nenhuma criança foi diagnosticada
com NL, o que sugere uma menor influência da hiperfosfatúria no
desenvolvimento deste tipo de calcificação renal. Dos quatro pacientes com
NL, uma exibia hipocitratúria e outra tinha hipocitratúria e hipercalciúria
associadas. Apesar da amostra pequena, estes dados sugerem maior
impacto da hipocitratúria e da hipercalciúria na gênese da NL do que na
formação de NC em pacientes com XLHR. Adicionalmente, estudo recente
mostrou maior frequência de NL (15,3%) em relação à NC (10,2%)
associada à maior relação cálcio/creatina urinária em 177 pacientes com
hiperparatireoidismo primário (86).
A despeito da presença de NC e NL, a maioria dos pacientes não teve
alteração da função renal, o que indica um provável curso benigno dessas
calcificações. Mesmo com dados sugestivos da influência da doença per si
na gênese da NC e o agravo desta complicação pelo tratamento, a história
natural da NC e NL no XLHR ainda não está totalmente esclarecida.
Estudos longitudinais com o uso de anticorpo humano anti-FGF23
(KRN23) em pacientes com XLHR têm mostrado uma maior segurança e
efetividade deste novo recurso terapêutico (16, 17). Assim, esta nova
medicação deve mudar a história natural das calcificações renais
encontradas no XLHR devido à correção da hiperfosfatúria.
Os pontos fortes deste estudo foram: o maior tamanho da amostra
comparado a estudos prévios, o estudo de imagem realizado pela US e TC
conjuntamente, a homogeneidade da casuística devido à análise molecular e
o seguimento em um centro único. Entretanto, o desenho transversal limitou
a avaliação dos efeitos a longo prazo das complicações renais encontradas.
!
6. CONCLUSÕES
! 68
Nos nossos pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem
genética mediados por FGF23:
• A baixa estatura desproporcionada foi uma característica fenotípica
marcante e a falta do uso de fosfato na infância e adolescência foi
determinante na sua ocorrência.
• O tratamento com fosfato na infância e adolescência teve um impacto
positivo na estatura dos pacientes embora a normalização estatural não
tenha sido atingida na maioria dos casos.
• A forma hereditária mais comum foi a XLHR devido à alta prevalência de
mutações identificadas no PHEX e este deve ser o primeiro gene
investigado neste grupo de pacientes.
Nos nossos pacientes com XLHR:
• Os valores de DMOa obtidos pela DXA devem ser analisados com
cautela devido às interferências de alterações anatômicas e
antropométricas.
• Segundo os dados obtidos por HR-pQCT, os comprometimentos da
DMOv e da microarquitetura óssea ocorreram principalmente às custas
do compartimento trabecular, sendo mais acentuados em tíbia em
relação ao rádio. Estas diferenças devem estar relacionadas às distintas
cargas mecânicas presentes nestes sítios.
• O tratamento intensivo com fosfato e/ou calcitriol parece ter um impacto
positivo na mineralização óssea, principalmente no compartimento
cortical.
! 69
• Apesar da prevalência de NC e de NL serem superiores às encontradas
na população geral, seus portadores não cursam com prejuízo
significativo da função renal.
• O principal fator de risco metabólico associado à formação de NC foi a
hiperfosfatúria inerente à doença agravada pelo tratamento intensivo com
fosfato.
• A hipercalciúria e a hipocitratúria devem ser consideradas na gênese da
NL.
!
7. ANEXOS
! 71
ANEXO A - Primers para a avaliação da região codificadora dos genes
PHEX e FGF23 (tabelas 1 e 2)
Tabela 1 – Sequência dos primers para a avaliação da região codificadora
do gene PHEX, éxons amplificados e tamanho dos amplicons
Primers Sequência nucleotídea dos primers Éxon Tamanho dos amplicons
Phex 1F 5’ TTTCCTGACGGCAGTTTCTT 3’ 1 373 pb
Phex 1R 5’ ACCTATGAACGCAGGCAAAC 3’
Phex 2F 5’ TGGGTTTTGGAATACCGTGT 3’ 2 374 pb
Phex 2R 5’ GCTCCACTGTTTCACACCAA 3’
Phex 3F 5’ AAGGCTTGGAAACTGGTTGA 3’ 3 352 pb
Phex 3R 5’ AGTCATGCTTCAAATCCCAAA 3’
Phex 4F 5’ GTCTTTTCCAGGGTTGTCTGT 3’ 4 364 pb
Phex 4R 5’ TCCAGTCTTTCACAATCATTCC 3’
Phex 5F 5’ CCACCCCACCTCTTTTACCT 3’ 5 455 pb
Phex 5R 5’ ATGAGTCTCTTTCCCCAGGA 3’
Phex 6F 5’ AATATGGCTGGGATGCAGAC 3’ 6 294 pb
Phex 6R 5’ TCCTGCATTGGGAATATGGT 3’
Phex 7F 5’ GCACCATACTTTGAGTACAGAGTGA 3’ 7 398 pb
Phex 7R 5’ CAATGGGCAATGACACAAAA 3’
Phex 8F 5’ ATGCAGATGTTTTGGCACAT 3’ 8 339 pb
Phex 8R 5’ GGCATCCCAATACACAGACA 3’
Phex 9F 5’ GGATGGCAATGATCAGGAGT 3’ 9 444 pb
Phex 9R 5’ ACCGGGATTTTCCCTATGAC 3’
Phex 10F 5’ GGAGCTTTGCCAACTGTTTC 3’ 10 340 pb
Phex 10R 5’ GGCACACACACACACACAAA 3’
continua
! 72
continuação
Primers Sequência nucleotídea dos primers Éxon Tamanho dos amplicons
Phex 11F 5’ GGGTTAGGGTGTGCAGTGTT 3’ 11 355 pb
Phex 11R 5’ GACAATACCCACAGGCCACT 3’
Phex 12F 5’ CAGAGCATGGAGTCAAGCTG 3’ 12 366 pb
Phex 12R 5’ TCTGGGGTCATTCAGAGTCA 3’
Phex 13F 5’ ATTTTTGCCCTTCACAGTGG 3’ 13 378 pb
Phex 13R 5’ CCTGGCATATTCAGGCTCAT 3’
Phex 14F 5’ CATGGCTTTGTGACTTCTGG 3’ 14 372 pb
Phex 14R 5’ AACTGGCAAGCCAGCTACTC 3’
Phex 15F 5’ GTCCAACATCCCCATTGTTC 3’ 15 312 pb
Phex 15R 5’ CAACCTTCCTTCACCAGCAT 3’
Phex 16F 5’ GAGGAGTGCCTTTCAGATGG 3’ 16 278 pb
Phex 16R 5’ TTCCATGGCTTCTTTCTGCT 3’
Phex 17F 5’ GCAGTTTATCTTGGCTTTCCA 3’ 17 338 pb
Phex 17R 5’ TTATTGCAAGCCATCACAGC 3’
Phex 18F 5’ TTTTGAAGGCTTGTCGAGGT 3’ 18 379 pb
Phex 18R 5’ TTCAGCAGGTATGGGGTAGG 3’
Phex 19F 5’ GCTGAGGATAGTTTGCCATCTT 3’ 19 398 pb
Phex 19R 5’ GGTCAATGGGGAGACACACT 3’
Phex 20F 5’ GGTGTACCTGCCTCACTGGT 3’ 20 391 pb
Phex 20R 5’ TGCTGAAAATCAAAGTCATGC 3’
Phex 21F 5’ CCTTCTACTCTGGGGATCAGA 3’ 21 393 pb
Phex 21R 5’ ATGGAAATCACACGTCCACA 3’
Phex 22F 5’ GGGCTTTAGTTGTCTCCCTGT 3’ 22 332 pb
Phex 22R 5’ TCTCCAGGCCTAAAGCAATG 3’
Tabela 2 - Sequência dos primers para a amplificação do éxon 3 do gene
FGF23 e tamanho do amplicon gerado
Primers Sequência nucleotídea dos primers Éxon Tamanho do amplicon
FGF23 3F 5’ GCTCAACGCCCTAAGAACTG 3’ 3 696 pb
FGF23 3R 5’ CCCAGAGAAGCAGCAAATTC 3’
! 73
ANEXO B – Dados clínicos, laboratoriais e de imagem dos pacientes com
RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23 (figuras 1
e 2; tabelas 3 e 4)
Figura 1 - Heredograma da família I
Figura 2 - Heredograma da família II
! 74
Tabela 3 – Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com RQ/OM hipofosfatêmicos de origem genética mediados por FGF23
Família Paciente Sexo Idade (anos)
Estatura (Z)
Es/E (Z)
FGF23 (pg/mL)
P (mg/dL)
TRP (%)
FA (UI/L)
P1NP (ng/mL)
OC (ng/mL)
CTx (ng/mL)
RFG (ml/min/1,73 m2)
Ca (mg/dL)
Cai (mg/dL)
PTH (pg/mL)
25OHD (ng/mL)
1 F 76 -5,5 ND 152 2,3 70 110 88,7 24 0,29 60 10,0 5,6 90 432 M 39 -2,8 5,6 64 1,9 89 75 57,2 15 0,41 119 9,7 5,1 58 313 F 15 -2,2 1,5 81 2,8 76 213 292 49 2,06 142 9,3 4,8 83 284 F 11 -2,2 3,1 92 3,2 83 716 1038 119 3,56 185 9,8 5,2 102 175 F 7 -1,2 2,2 150 3,1 74 350 874 84 2,53 172 9,6 4,6 91 376 F 52 -3,6 4,6 58 2,2 84 78 31,2 17 0,25 112 9,0 4,7 105 267 F 33 -2,8 2,3 113 2,6 94 67 34,3 14 0,21 131 9,6 5,3 19 418 M 30 -4,0 8,9 64 2,1 80 180 92,3 50 0,75 149 9,6 5,1 111 239 F 4 0,8 1,4 68 3,0 94 403 1121 138 1,46 285 9,6 4,9 83 31
10 M 57 -3,2 8,0 89 1,7 85 114 43,5 26 0,48 126 9,0 4,6 87 3411 M 51 -2,6 7,0 99 1,9 78 93 60,8 29 0,53 108 9,5 4,6 90 4112 F 56 -5,1 6,0 65 2,4 89 171 73,7 19 0,40 119 9,8 5,1 137 2613 F 18 -3,9 3,7 98 2,2 86 209 143 53 0,91 138 9,2 4,8 88 2414 F 40 -2,4 3,7 72 2,5 94 69 35,1 13 0,18 133 9,4 5,2 43 3015 F 3 -2,3 1,2 79 3,0 90 533 1042 79 2,86 175 9,5 4,9 34 5416 F 32 -2,4 4,3 464 2,4 87 105 39,5 17 0,40 132 9,5 4,6 40 3517 M 12 -2,5 3,1 135 2,8 79 421 686 175 4,33 237 9,4 4,7 70 3718 F 41 -3,1 2,2 67 2,1 83 116 56,2 20 0,61 142 9,3 4,8 53 3819 M 7 -4,7 3,0 149 2,7 80 332 777 72 3,02 205 9,3 4,9 23 32
VIII 20 F 51 -3,7 3,7 53 1,9 62 107 48,4 29 0,68 117 9,4 4,8 118 12IX 21 F 3 -2,3 1,0 178 2,9 79 588 3132 176 2,43 252 9,7 5,2 72 59
22 M 9 -2,2 2,4 129 3,1 82 400 1116 143 3,10 149 9,8 5,0 26 4123 F 10 -1,5 6,3 129 2,8 69 434 928 99 3,23 212 9,4 4,9 157 3924 F 12 -0,4 2,1 197 2,8 64 416 821 103 2,11 167 9,8 4,6 46 4025 F 15 -4,3 4,7 60 2,9 86 436 988 116 5,01 149 9,2 5,0 141 4226 M 15 -2,8 7,6 108 2,0 64 733 1089 221 3,45 199 9,3 5,1 101 2727 F 17 -3,6 5,4 257 2,0 79 129 89,1 35 0,93 156 9,0 4,9 66 3628 F 17 -3,3 4,0 182 1,9 77 271 291 70 1,64 149 9,5 5,1 72 2029 F 21 -3,6 4,3 58 2,2 87 68 48,9 25 0,45 161 8,9 4,8 39 2530 F 23 -0,8 0,4 67 2,1 93 162 95,9 52 0,96 176 9,6 5,1 73 2131 M 23 -4,9 6,7 87 1,9 87 152 178 44 1,45 165 9,9 5,1 28 3932 F 25 -1,9 2,7 62 2,3 81 85 85,8 25 0,87 141 8,6 4,7 57 2933 F 27 -4,5 4,7 107 2,4 89 133 90,8 30 0,74 189 8,9 4,8 48 2434 F 29 -3,0 4,0 86 2,4 93 65 52,8 16 0,29 132 9,0 5,1 28 3335 F 29 -1,4 1,4 113 2,1 69 146 187 46 1,27 129 8,7 5,0 46 4636 M 30 -3,6 3,9 128 1,6 61 87 82,9 33 0,81 171 9,8 4,8 63 4537 F 31 -0,7 2,4 68 2,0 75 51 27,4 9 0,34 173 8,6 4,8 98 3438 F 32 -2,2 3,0 80 2,3 90 110 59,9 36 0,52 114 10,1 5,1 56 2939 F 37 -5,1 ND 89 2,5 93 193 59,7 17 0,32 158 8,5 5,3 40 2440 F 40 -5,2 3,7 77 2,2 91 45 28,4 11 0,26 115 9,2 4,6 54 2741 F 43 -6,2 ND 120 1,7 89 96 34,1 10 0,26 142 9,3 5,1 41 2042 F 45 -1,3 4,4 63 2,1 80 72 23,9 16 0,17 114 9,1 4,9 85 2243 M 54 -5,9 3,7 1241 1,4 76 164 91,2 13 0,30 140 10,1 5,2 86 2344 F 57 -5,8 7,2 800 1,5 61 58 30,0 20 0,30 92 9,6 4,9 42 5745 F 58 -5,2 4,5 107 2,3 87 67 41,5 15 0,38 115 9,4 4,9 30 2946 F 63 -3,4 0,1 94 2,8 74 43 30,6 11 0,35 39 8,6 4,9 77 3747 F 71 -4,5 4,2 487 2,7 76 100 40,0 24 0,43 77 9,8 5,1 18 40
10-50 1-12a: 3,4-6,2>12a: 2,7-4,5 >95
4-6a: < 2697-12a: < 300
13-17a: < 187 (F) e < 390 (M)>18a: 35-104 (F) e 40-129 (M)
Para adultos: F: 15,1-58,6M: 13,9-85,5
Para adultos: F: 11-43 M: 14-42
Para adultos: F: <0,57 M:<0,70
>902 a 12 a: 8,8-10,8
13 a 60 a: 8,4-10,261 a 90 a: 8,8-10,2
< 12a: 4,8-5,5 > 12a:4,6-5,3 15-65 >30Valores de referência:
I
II
III
IV
V
VI
VII
Esporádico
! 75
Tabela 4 - Avaliação dos pacientes com XLHR e diagnóstico de NC e/ou NL e seus fatores de risco metabólicos
Nome NC NL Hipercalciúria Hipocitratúria Tratamento com fosfato
Na infância e adolescência
Idade de início (anos)
Duração (anos)
Crianças e adolescentes (n=9 de um total de 16) Paciente 3 Presente Não Não Não Presente 1 12 Paciente 4 Presente Não Não Não Presente 1 10 Paciente 9 Presente Não Não Presente Presente 1 3 Paciente 17 Presente Não Não Presente Presente 9 3 Paciente 21 Presente Não Não Não Presente 1 2 Paciente 22 Presente Não Não Presente Presente 2 7 Paciente 24 Presente Não Não Não Presente 5 7 Paciente 27 Presente Não Não Não Presente 3 15 Paciente 28 Presente Não Não Não Presente 4 13
Adultos (n=8 de um total de 23) Paciente 2 Presente Não Não Não Não 0 0 Paciente 11 Não Presente Não Não Presente 13 21 Paciente 16 Presente Presente Presente Presente Presente 3 9 Paciente 18 Presente Presente Não Não Não 0 0 Paciente 30 Presente Não Não Não Presente 5 15 Paciente 32 Não Presente Não Presente Presente 5 14 Paciente 44 Presente Não Não Não Não 49 6 Paciente 47 Presente Não Não Não Não 42 4
! 76
ANEXO C – DMO, parâmetros geométricos e dados de microarquitetura óssea obtidos por DXA e HR-pQCT: comparação entre pacientes com XLHR e controles saudáveis (tabelas 5 a 9) Tabela 5 – DMOa obtida por DXA: comparação entre pacientes com XLHR e controles saudáveis
Sítios Pacientes (n)/Controles (n) DMOa (g/cm2) XLHR
DMOa (g/cm2) Controles p
L1-L4 38/38 1,17 [0,56;1,96] 0,99 [0,47;1,69] 0,03* Colo de fêmur 33/33 0,79±0,19 0,81±0,12 0,58 Fêmur total 33/33 0,91±0,17 0,90±0,13 0,83 Rádio ultradistal 37/37 0,44±0,10 0,42±0,09 0,38 1/3 distal de rádio 37/37 0,55±0,11 0,65±0,10 <0,01* Rádio distal total 37/37 0,50±0,11 0,54±0,09 0,19 Valores expressos em média±DP ou mediana [mínimo;máximo]; *p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
Tabela 6 – DMOa obtida por DXA: comparação entre pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e controles saudáveis
Sítios Crianças Adultos
XLHR (n)/ Controles (n)
DMOa (g/cm2) XLHR
DMOa (g/cm2) Controles
p XLHR (n)/
Controles (n) DMOa (g/cm2)
XLHR DMOa (g/cm2)
Controles p
L1-L4 13/13 0,89±0,20 0,77±0,18 0,14 25/25 1,29 [0,76;1,96] 1,03 [0,82;1,69] <0,01* Colo de fêmur 11/11 0,72±0,12 0,73±0,11 0,74 22/22 0,83±0,20 0,85±0,11 0,63
Fêmur total 11/11 0,84±0,14 0,79±0,12 0,36 22/22 0,94±0,18 0,96±0,09 0,74
Rádio UD 12/12 0,38±0,08 0,33±0,07 0,14 25/25 0,46±0,10 0,46±0,06 0,81
1/3 distal de rádio 12/12 0,44±0,07 0,57±0,10 <0,01* 25/25 0,62 [0,33;0,82] 0,67 [0,55;0,86] <0,01* Rádio distal total 12/12 0,41±0,07 0,45±0,09 0,27 25/25 0,46±0,10 0,46±0,06 0,81
Corpo inteiro subtotal 12/12 0,73±0,12 0,78±0,14 0,39 - - - - Valores expressos em média±DP ou mediana [mínimo;máximo]; *p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
! 77
Tabela 7 – Parâmetros geométricos, DMOv e dados de microarquitetura
óssea de rádio e tíbia distais obtidos por HR-pQCT: comparação entre
pacientes com XLHR e controles saudáveis
Parâmetros XLHR Controles p
Rádio distal n=38 n=38
Área óssea total (mm2) 293,4 [116,4;741,5] 281,3 [102,4;415,7] 0,22
Perímetro médio (mm) 72,8±13,9 71,4±10,7 0,63
Tb.area (mm2) 250,6 [83,4;661,4] 233,1 [82,2;356,6] 0,20
Ct.area (mm2) 46,8±25,1 43,6±22,8 0,55
Total vBMD (mg HA/cm3) 297,3±89,5 299,6±65,8 0,89
Tb vBMD (mg HA/cm3) 186,1±67,5 174,2±24,6 0,31
Ct vBMD (mg HA/cm3) 840,1 [401,7;1004,8] 850,0 [406,7;977,6] 0,65
BV/TV 0,15±0,05 0,14±0,02 0,31
Tb.N (mm-1) 1,90±0,51 2,13±0,26 0,01*
Tb.Th (mm) 0,07 [0,03;0,14] 0,06 [0,05;0,10] <0,01*
Tb.Sp (mm) 0,42 [0,26;0,97] 0,40 [0,29;0,51] 0,24
SD.1/Tb.N (mm) 0,21 [0,09;0,68] 0,16 [0,09;0,23] 0,02*
Ct.Th (mm) 0,62±0,32 0,60±0,30 0,70
Tíbia distal n=34 n=34
Área óssea total (mm2) 630,7±170,5 685,5±184,3 0,27
Perímetro médio (mm) 98,5±13,7 101,8±13,7 0,33
Tb.area (mm2) 524,6±168,9 566±169,5 0,32
Ct.area (mm2) 103,7±33,4 115,6±38,2 0,18
Total vBMD (mg HA/cm3) 261,4±78,9 297,4±43,2 0,02*
Tb vBMD (mg HA/cm3) 126,9±49,9 174,3±26,3 <0,01*
Ct vBMD (mg HA/cm3) 869,6 [649,6;1035,4] 895,7 [548,4;977] 0,27
BV/TV 0,10±0,04 0,14±0,02 <0,01*
Tb.N (mm-1) 1,31±0,50 1,86±0,39 <0,01*
Tb.Th (mm) 0,08 [0,04;0,12] 0,08 [0,06;0,11] 0,52
Tb.Sp (mm) 0,63 [0,33;1,94] 0,44 [0,30;0,74] <0,01*
SD.1/Tb.N (mm) 0,34 [0,13;1,99] 0,20 [0,11;0,43] <0,01*
Ct.Th (mm) 1,06±0,33 1,09±0,34 0,77 Valores expressos em média±DP ou mediana [mínimo;máximo];*p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
! 78
Tabela 8 – Parâmetros geométricos, DMOv e dados de microarquitetura
óssea de rádio e tíbia distais obtidos por HR-pQCT: comparação entre
pacientes com XLHR estratificados por faixa etária e controles saudáveis
Valores expressos em média±DP ou mediana [mínimo;máximo];*p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.!! !
! 79
Tabela 9 – Parâmetros geométricos, DMOv e dados microarquitetura óssea
de rádio e tíbia distais obtidos por HR-pQCT: comparação entre pacientes
com XLHR estratificados por status metabólico e controles saudáveis
Valores expressos em média±DP ou mediana [mínimo;máximo];*p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.
!
8. REFERÊNCIAS
! 81
1. Carpenter TO. Primary disorders of phosphate metabolism. 2010.
2. Tiosano D, Hochberg Z. Hypophosphatemia: the common
denominator of all rickets. Journal of bone and mineral metabolism
2009;27(4):392-401.
3. Bergwitz C, Juppner H. Regulation of phosphate homeostasis by PTH,
vitamin D, and FGF23. Annual review of medicine 2010;61:91-104.
4. Yu X, White KE. FGF23 and disorders of phosphate homeostasis.
Cytokine & growth factor reviews 2005 Apr;16(2):221-32.
5. Weber TJ, Liu S, Indridason OS, Quarles LD. Serum FGF23 levels in
normal and disordered phosphorus homeostasis. Journal of bone and
mineral research: the official journal of the American Society for Bone and
Mineral Research 2003 Jul;18(7):1227-34.
6. Bielesz B, Klaushofer K, Oberbauer R. Renal phosphate loss in
hereditary and acquired disorders of bone mineralization. Bone 2004
Dec;35(6):1229-39.
7. Pettifor JM. What's new in hypophosphataemic rickets? European
journal of pediatrics 2008 May;167(5):493-9.
8. Quarles LD. Endocrine functions of bone in mineral metabolism
regulation. The Journal of clinical investigation 2008 Dec;118(12):3820-8.
9. David V, Martin A, Hedge AM, Drezner MK, Rowe PS. ASARM
peptides: PHEX-dependent and -independent regulation of serum phosphate.
American journal of physiology Renal physiology 2011 Mar;300(3):F783-91.
10. Kiela PR, Ghishan FK. Recent advances in the renal-skeletal-gut axis
that controls phosphate homeostasis. Laboratory investigation; a journal of
technical methods and pathology 2009 Jan;89(1):7-14.
! 82
11. Foster BL, Nociti FH, Jr., Somerman MJ. The rachitic tooth. Endocr
Rev 2014 Feb;35(1):1-34.
12. Beck-Nielsen SS, Brusgaard K, Rasmussen LM, Brixen K, Brock-
Jacobsen B, Poulsen MR, et al. Phenotype presentation of
hypophosphatemic rickets in adults. Calcified tissue international 2010
Aug;87(2):108-19.
13. Carpenter TO, Imel EA, Holm IA, Jan de Beur SM, Insogna KL. A
clinician's guide to X-linked hypophosphatemia. Journal of bone and mineral
research: the official journal of the American Society for Bone and Mineral
Research 2011 Jul;26(7):1381-8.
14. Ivanova E, De Leo MG, De Matteis MA, Levtchenko E. Cystinosis:
clinical presentation, pathogenesis and treatment. Pediatric endocrinology
reviews: PER 2014 Sep;12 Suppl 1:176-84.
15. Leaf DE, Pereira RC, Bazari H, Juppner H. Oncogenic osteomalacia
due to FGF23-expressing colon adenocarcinoma. The Journal of clinical
endocrinology and metabolism 2013 Mar;98(3):887-91.
16. Imel EA, Zhang X, Ruppe MD, Weber TJ, Klausner MA, Ito T, et al.
Prolonged correction of serum phosphorus in adults with X-linked
hypophosphatemia using monthly doses of KRN23. The Journal of clinical
endocrinology and metabolism 2015 Apr 28:jc20151551.
17. Carpenter TO, Imel EA, Ruppe MD, Weber TJ, Klausner MA,
Wooddell MM, et al. Randomized trial of the anti-FGF23 antibody KRN23 in
X-linked hypophosphatemia. The Journal of clinical investigation 2014
Apr;124(4):1587-97.
18. Econs MJ, McEnery PT. Autosomal dominant hypophosphatemic
rickets/osteomalacia: clinical characterization of a novel renal phosphate-
wasting disorder. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 1997
Feb;82(2):674-81.
19. Consortium A. Autosomal dominant hypophosphataemic rickets is
associated with mutations in FGF23. Nature genetics 2000 Nov;26(3):345-8.
! 83
20. Gribaa M, Younes M, Bouyacoub Y, Korbaa W, Ben Charfeddine I,
Touzi M, et al. An autosomal dominant hypophosphatemic rickets phenotype
in a Tunisian family caused by a new FGF23 missense mutation. Journal of
bone and mineral metabolism 2010;28(1):111-5.
21. White KE, Carn G, Lorenz-Depiereux B, Benet-Pages A, Strom TM,
Econs MJ. Autosomal-dominant hypophosphatemic rickets (ADHR)
mutations stabilize FGF-23. Kidney international 2001 Dec;60(6):2079-86.
22. Imel EA, Hui SL, Econs MJ. FGF23 concentrations vary with disease
status in autosomal dominant hypophosphatemic rickets. Journal of bone and
mineral research: the official journal of the American Society for Bone and
Mineral Research 2007 Apr;22(4):520-6.
23. Feng JQ, Ward LM, Liu S, Lu Y, Xie Y, Yuan B, et al. Loss of DMP1
causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in
mineral metabolism. Nature genetics 2006 Nov;38(11):1310-5.
24. Lorenz-Depiereux B, Bastepe M, Benet-Pages A, Amyere M,
Wagenstaller J, Muller-Barth U, et al. DMP1 mutations in autosomal
recessive hypophosphatemia implicate a bone matrix protein in the regulation
of phosphate homeostasis. Nature genetics 2006 Nov;38(11):1248-50.
25. Makitie O, Pereira RC, Kaitila I, Turan S, Bastepe M, Laine T, et al.
Long-term clinical outcome and carrier phenotype in autosomal recessive
hypophosphatemia caused by a novel DMP1 mutation. Journal of bone and
mineral research: the official journal of the American Society for Bone and
Mineral Research 2010 Oct;25(10):2165-74.
26. Turan S, Aydin C, Bereket A, Akcay T, Guran T, Yaralioglu BA, et al.
Identification of a novel dentin matrix protein-1 (DMP-1) mutation and dental
anomalies in a kindred with autosomal recessive hypophosphatemia. Bone
2010 Feb;46(2):402-9.
27. Razali NN, Hwu TT, Thilakavathy K. Phosphate homeostasis and
genetic mutations of familial hypophosphatemic rickets. Journal of pediatric
endocrinology & metabolism: JPEM 2015 Apr 18.
! 84
28. Brachet C, Mansbach AL, Clerckx A, Deltenre P, Heinrichs C. Hearing
loss is part of the clinical picture of ENPP1 loss of function mutation.
Hormone research in paediatrics 2014;81(1):63-6.
29. Levy-Litan V, Hershkovitz E, Avizov L, Leventhal N, Bercovich D,
Chalifa-Caspi V, et al. Autosomal-recessive hypophosphatemic rickets is
associated with an inactivation mutation in the ENPP1 gene. American
journal of human genetics 2010 Feb 12;86(2):273-8.
30. Steichen-Gersdorf E, Lorenz-Depiereux B, Strom TM, Shaw NJ. Early
onset hearing loss in autosomal recessive hypophosphatemic rickets caused
by loss of function mutation in ENPP1. Journal of pediatric endocrinology &
metabolism: JPEM 2015 Mar 4.
31. Stagi S, Cavalli L, Iurato C, Seminara S, Brandi ML, de Martino M.
Bone health in children and adolescents: the available imaging techniques.
Clinical cases in mineral and bone metabolism: the official journal of the
Italian Society of Osteoporosis, Mineral Metabolism, and Skeletal Diseases
2013 Sep;10(3):166-71.
32. Lian JB. Biology of bone mineralization. Current Opinion in
Endocrinology & Diabetes 2006;13:1–9.
33. Cheung AM, Adachi JD, Hanley DA, Kendler DL, Davison KS, Josse
R, et al. High-resolution peripheral quantitative computed tomography for the
assessment of bone strength and structure: a review by the Canadian Bone
Strength Working Group. Current osteoporosis reports 2013 Jun;11(2):136-
46.
34. Cohen A, Dempster DW, Muller R, Guo XE, Nickolas TL, Liu XS, et al.
Assessment of trabecular and cortical architecture and mechanical
competence of bone by high-resolution peripheral computed tomography:
comparison with transiliac bone biopsy. Osteoporosis international : a journal
established as result of cooperation between the European Foundation for
Osteoporosis and the National Osteoporosis Foundation of the USA 2010
Feb;21(2):263-73.
! 85
35. Boyce AM, Shawker TH, Hill SC, Choyke PL, Hill MC, James R, et al.
Ultrasound is superior to computed tomography for assessment of medullary
nephrocalcinosis in hypoparathyroidism. The Journal of clinical endocrinology
and metabolism 2013 Mar;98(3):989-94.
36. Hoppe B, Kemper MJ. Diagnostic examination of the child with
urolithiasis or nephrocalcinosis. Pediatric nephrology 2010 Mar;25(3):403-13.
37. Piccoli GB, De Pascale A, Randone O, Vigotti FN, Priola AM, Naretto
C, et al. Revisiting nephrocalcinosis: A single-center perspective. Nephrology
2015 Jun 8.
38. Stamatelou KK, Francis ME, Jones CA, Nyberg LM, Curhan GC. Time
trends in reported prevalence of kidney stones in the United States: 1976-
1994. Kidney international 2003 May;63(5):1817-23.
39. Park S, Pearle MS. Pathophysiology and management of calcium
stones. The Urologic clinics of North America 2007 Aug;34(3):323-34.
40. Trapote RA, Garagorri MAU, Arrieta MU, Monge TM, Lizarraga DA.
Evaluacion de la enfermedad renal litiasica. Estudio metabólico. An Pediatr
(Barc) 2004;61(5):418-27.
41. Patzer L, van't Hoff W, Shah V, Hallson P, Kasidas GP, Samuell C, et
al. Urinary supersaturation of calcium oxalate and phosphate in patients with
X-linked hypophosphatemic rickets and in healthy schoolchildren. The
Journal of pediatrics 1999 Nov;135(5):611-7.
42. Ronnefarth G, Misselwitz J. Nephrocalcinosis in children: a
retrospective survey. Members of the Arbeitsgemeinschaft fur padiatrische
Nephrologie. Pediatric nephrology 2000 Sep;14(10-11):1016-21.
43. Cheidde L, Ajzen SA, Tamer Langen CH, Christophalo D, Heilberg IP.
A critical appraisal of the radiological evaluation of nephrocalcinosis.
Nephron Clinical practice 2007;106(3):c119-24.
44. Stechman MJ, Loh NY, Thakker RV. Genetic causes of hypercalciuric
nephrolithiasis. Pediatric nephrology 2009 Dec;24(12):2321-32.
! 86
45. Mantan M, Bagga A, Virdi VS, Menon S, Hari P. Etiology of
nephrocalcinosis in northern Indian children. Pediatric nephrology 2007
Jun;22(6):829-33.
46. Copelovitch L. Urolithiasis in children: medical approach. Pediatric
clinics of North America 2012 Aug;59(4):881-96.
47. Sakhaee K, Maalouf NM, Sinnott B. Clinical review. Kidney stones
2012: pathogenesis, diagnosis, and management. The Journal of clinical
endocrinology and metabolism 2012 Jun;97(6):1847-60.
48. Rendina D, Mossetti G, De Filippo G, Cioffi M, Strazzullo P. Fibroblast
growth factor 23 is increased in calcium nephrolithiasis with
hypophosphatemia and renal phosphate leak. The Journal of clinical
endocrinology and metabolism 2006 Mar;91(3):959-63.
49. Prie D, Friedlander G. Genetic disorders of renal phosphate transport.
The New England journal of medicine 2010 Jun 24;362(25):2399-409.
50. Cramer B, Husa L, Pushpanathan C. Nephrocalcinosis in rabbits--
correlation of ultrasound, computed tomography, pathology and renal
function. Pediatr Radiol 1998 Jan;28(1):9-13.
51. Gerver WJ BR. Paediatric morphometrics - a reference manual. 2nd
edition ed: Universitaire Pers Maastricht, Maastricht; 2001.
52. Malaquias AC, Scalco RC, Fontenele EG, Costalonga EF, Baldin AD,
Braz AF, et al. The sitting height/height ratio for age in healthy and short
individuals and its potential role in selecting short children for SHOX analysis.
Hormone research in paediatrics 2013;80(6):449-56.
53. Imel EA, Peacock M, Pitukcheewanont P, Heller HJ, Ward LM,
Shulman D, et al. Sensitivity of fibroblast growth factor 23 measurements in
tumor-induced osteomalacia. The Journal of clinical endocrinology and
metabolism. [Research Support, N.I.H., Extramural]. 2006 Jun;91(6):2055-
61.
! 87
54. National Kidney F. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic
kidney disease: evaluation, classification, and stratification. American journal
of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation
2002 Feb;39(2 Suppl 1):S1-266.
55. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic acids research 1988
Feb 11;16(3):1215.
56. Knollmann F, Coakley F, editors. Multislice CT: Principles and
Protocols. First edition ed: Hardcover; 2005.
57. Gaucher C, Walrant-Debray O, Nguyen TM, Esterle L, Garabedian M,
Jehan F. PHEX analysis in 118 pedigrees reveals new genetic clues in
hypophosphatemic rickets. Human genetics 2009 May;125(4):401-11.
58. Veilleux LN, Cheung MS, Glorieux FH, Rauch F. The muscle-bone
relationship in X-linked hypophosphatemic rickets. The Journal of clinical
endocrinology and metabolism 2013 May;98(5):E990-5.
59. Reusz GS, Hoyer PF, Lucas M, Krohn HP, Ehrich JH, Brodehl J. X
linked hypophosphataemia: treatment, height gain, and nephrocalcinosis.
Archives of disease in childhood 1990 Oct;65(10):1125-8.
60. Makitie O, Doria A, Kooh SW, Cole WG, Daneman A, Sochett E. Early
treatment improves growth and biochemical and radiographic outcome in X-
linked hypophosphatemic rickets. The Journal of clinical endocrinology and
metabolism 2003 Aug;88(8):3591-7.
61. Vaisbich MH, Koch VH. Hypophosphatemic rickets: results of a long-
term follow-up. Pediatric nephrology 2006 Feb;21(2):230-4.
62. Cho HY, Lee BH, Kang JH, Ha IS, Cheong HI, Choi Y. A clinical and
molecular genetic study of hypophosphatemic rickets in children. Pediatric
research 2005 Aug;58(2):329-33.
63. Verge CF, Lam A, Simpson JM, Cowell CT, Howard NJ, Silink M.
Effects of therapy in X-linked hypophosphatemic rickets. The New England
journal of medicine 1991 Dec 26;325(26):1843-8.
! 88
64. Zivicnjak M, Schnabel D, Billing H, Staude H, Filler G, Querfeld U, et
al. Age-related stature and linear body segments in children with X-linked
hypophosphatemic rickets. Pediatric nephrology 2011 Feb;26(2):223-31.
65. Beck-Nielsen SS, Brixen K, Gram J, Molgaard C. High bone mineral
apparent density in children with X-linked hypophosphatemia. Osteoporosis
international: a journal established as result of cooperation between the
European Foundation for Osteoporosis and the National Osteoporosis
Foundation of the USA 2013 Aug;24(8):2215-21.
66. Ruppe MD, Brosnan PG, Au KS, Tran PX, Dominguez BW, Northrup
H. Mutational analysis of PHEX, FGF23 and DMP1 in a cohort of patients
with hypophosphatemic rickets. Clinical endocrinology 2011 Mar;74(3):312-8.
67. Rowe PS, Oudet CL, Francis F, Sinding C, Pannetier S, Econs MJ, et
al. Distribution of mutations in the PEX gene in families with X-linked
hypophosphataemic rickets (HYP). Human molecular genetics 1997
Apr;6(4):539-49.
68. Francis F, Strom TM, Hennig S, Boddrich A, Lorenz B, Brandau O, et
al. Genomic organization of the human PEX gene mutated in X-linked
dominant hypophosphatemic rickets. Genome research 1997 Jun;7(6):573-
85.
69. Kinoshita Y, Saito T, Shimizu Y, Hori M, Taguchi M, Igarashi T, et al.
Mutational analysis of patients with FGF23-related hypophosphatemic
rickets. European journal of endocrinology / European Federation of
Endocrine Societies 2012 Aug;167(2):165-72.
70. Beck-Nielsen SS, Brixen K, Gram J, Brusgaard K. Mutational analysis
of PHEX, FGF23, DMP1, SLC34A3 and CLCN5 in patients with
hypophosphatemic rickets. Journal of human genetics 2012 Jul;57(7):453-8.
71. Bastepe M, Juppner H. Inherited hypophosphatemic disorders in
children and the evolving mechanisms of phosphate regulation. Rev Endocr
Metab Disord 2008 Jun;9(2):171-80.
! 89
72. Rauch F. Material matters: a mechanostat-based perspective on bone
development in osteogenesis imperfecta and hypophosphatemic rickets.
Journal of musculoskeletal & neuronal interactions 2006 Apr-Jun;6(2):142-6.
73. Shore RM, Langman CB, Poznanski AK. Lumbar and radial bone
mineral density in children and adolescents with X-linked hypophosphatemia:
evaluation with dual X-ray absorptiometry. Skeletal radiology 2000
Feb;29(2):90-3.
74. Baroncelli GI, Bertelloni S, Ceccarelli C, Saggese G. Effect of growth
hormone treatment on final height, phosphate metabolism, and bone mineral
density in children with X-linked hypophosphatemic rickets. The Journal of
pediatrics 2001 Feb;138(2):236-43.
75. Oliveri MB, Cassinelli H, Bergada C, Mautalen CA. Bone mineral
density of the spine and radius shaft in children with X-linked
hypophosphatemic rickets (XLH). Bone and mineral 1991 Feb;12(2):91-100.
76. Baroncelli GI, Federico G, Bertelloni S, Sodini F, De Terlizzi F,
Cadossi R, et al. Assessment of bone quality by quantitative ultrasound of
proximal phalanges of the hand and fracture rate in children and adolescents
with bone and mineral disorders. Pediatric research 2003 Jul;54(1):125-36.
77. Shanbhogue VV, Hansen S, Folkestad L, Brixen K, Beck-Nielsen SS.
Bone Geometry, Volumetric Density, Microarchitecture and Estimated Bone
Strength Assessed by HR-pQCT in Adult Patients with Hypophosphatemic
Rickets. Journal of bone and mineral research: the official journal of the
American Society for Bone and Mineral Research 2014 Jul 10.
78. Reid IR, Murphy WA, Hardy DC, Teitelbaum SL, Bergfeld MA, Whyte
MP. X-linked hypophosphatemia: skeletal mass in adults assessed by
histomorphometry, computed tomography, and absorptiometry. The
American journal of medicine 1991 Jan;90(1):63-9.
! 90
79. Cheung M, Roschger P, Klaushofer K, Veilleux LN, Roughley P,
Glorieux FH, et al. Cortical and trabecular bone density in X-linked
hypophosphatemic rickets. The Journal of clinical endocrinology and
metabolism 2013 May;98(5):E954-61.
80. Li H, Martin A, David V, Quarles LD. Compound deletion of Fgfr3 and
Fgfr4 partially rescues the Hyp mouse phenotype. American journal of
physiology Endocrinology and metabolism 2011 Mar;300(3):E508-17.
81. Kooh SW, Binet A, Daneman A. Nephrocalcinosis in X-linked
hypophosphataemic rickets: its relationship to treatment, kidney function, and
growth. Clinical and investigative medicine Medecine clinique et
experimentale 1994 Apr;17(2):123-30.
82. Colagrande S, Origgi D, Zatelli G, Giovagnoni A, Salerno S. CT
exposure in adult and paediatric patients: a review of the mechanisms of
damage, relative dose and consequent possible risks. La Radiologia medica
2014 Oct;119(10):803-10.
83. Taylor A, Sherman NH, Norman ME. Nephrocalcinosis in X-linked
hypophosphatemia: effect of treatment versus disease. Pediatric nephrology
1995 Apr;9(2):173-5.
84. Sikora P, Roth B, Kribs A, Michalk DV, Hesse A, Hoppe B.
Hypocitraturia is one of the major risk factors for nephrocalcinosis in very low
birth weight (VLBW) infants. Kidney international 2003 Jun;63(6):2194-9.
85. Cramer B, Husa L, Pushpanathan C. Pattern and permanence of
phosphate-induced nephrocalcinosis in rabbits. Pediatr Radiol 1998
Jan;28(1):14-9.
86. Starup-Linde J, Waldhauer E, Rolighed L, Mosekilde L, Vestergaard P.
Renal stones and calcifications in patients with primary hyperparathyroidism:
associations with biochemical variables. European journal of endocrinology /
European Federation of Endocrine Societies 2012 Jun;166(6):1093-100.