Aula 6 – Eletroforese Capilar (EC)

Julio C. J. Silva

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas

Depto. de Química

Juiz de Fora, 2016

QUI 154 – Química Analítica V Análise Instrumental

Introdução • O fenômeno denominado eletroforese é definido como sendo a

migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada.

• Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948;

• Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos.

• Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído.

Introdução

• Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente

• A eletroforese capilar (EC) é uma técnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método analítico.

• Em sua forma mais simples a EC é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius, porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, conforme o próprio nome sugere.

Introdução

• EC separações de ânions e cátions inorgânicos,

• EC aminoácidos, catecolaminas, drogas, vitaminas, carboidratos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, polinucleotídeos , entre outras.

• EC Separação de proteínas (enzimas, hormônios, anticorpos) e ácidos nucléicos (DNA, RNA)

Instrumentação

• Capilar sílica fundida preenchido (d.i. entre 10-100 µm), comprimento de 40-100 cm,

• Capilar preenchido com tampão e estendido entre dois reservatórios de tampão que também contêm eletrodos de platina.

• Introdução/detecção da amostras em uma das extremidades e a detecção na outra.

Instrumentação

• A introdução da amostra injeção sob pressão (o frasco é elevado por curto intervalo de tempo acima do nível do capilar para forçar a amostra para dentro do tubo)

• A introdução da amostra aplicação de vácuo no tubo, na extremidade do detector.

• A introdução da amostra fluxo eletroosmótico (FEO)

• Volumes típicos 10 – 100 nL

• Separação um potencial de 5 - 30 kV (cc) é aplicado entre os eletrodos.

Instrumentação

Instrumentação

Introdução

Fluxo Eletroosmótico

• A parede do capilar de sílica contém grupos silanóis (SiOH) os quais se ionizam (SiO- + H+) quando em contato com soluções tampão com pH altos.

• Esta dissociação produz uma superfície carregada negativamente.

• Uma camada de contra-íon (cátions) é então formada próxima à parede do capilar a fim de manter a eletroneutralidade.

• Isto forma a dupla camada e cria uma diferença de potencial muito próxima à parede e este fenômeno é conhecido como potencial zeta.

Fluxo Eletroosmótico

Fluxo Eletroosmótico

Fluxo Eletroosmótico

v = velocidade de migração µe = mobilidade eletroforética V = Voltagem aplicada L = Comprimento do tubo entre os dois eletrodos

Fluxo Eletroosmótico

Vtotal = Veo + Ve

Separações Eletroforéticas

Separações Eletroforéticas

N= Números de pratos D = Coeficiente de difusão (cm2 s-1) µe

= Mobilidade eletroforética

Modos de Separação

• Eletroforese nome genérico

Eletroforese Capilar em Solução Livre (ECSL)

Eletroforese Capilar por Zona (ECZ)

• A separação de íons é a forma mais simples de EC e é denominada eletroforese capilar em solução livre. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta técnica.

• A separação em ECSL é baseada nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão, contido dentro do capilar.

• O mecanismo de separação é baseado nas diferenças de razão massa/carga dos solutos em um dado pH. Na ECSL espécies neutras não são separadas, porém permite a separação de cátions e ânions na mesma corrida

Modos de Separação

Eletroforese Capilar em Gel (ECG)

• A separação de biomoléculas grandes, tais como DNA, por ECSL, às vezes é muito difícil de se obter devido à similaridade nas razões massa/carga.

• Assim ECSL muitas vezes não é suficiente para separar estes tipos de substâncias.

• Uma alternativa é preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separação está baseado nas diferenças nos tamanhos dos solutos que migram através dos poros do polímero. Esta técnica é denominada eletroforese capilar em gel.

Modos de Separação

Análise de DNA, RNA e Proteínas

• Composição de aminoácidos:

– Um aminoácido é composto por um grupo amino

(NH2) e um grupo carboxil (COOH), ligados a um átomo de carbono.

– Um grupo “R”, também ligado a este átomo de

carbono,(dependendo da composição do grupo R), formam diferentes tipos de aminoácidos

Análise de DNA, RNA e Proteínas

• Fatores que afetam a migração de fragmento de DNA em géis

– Tamanho do DNA

– Concentração

– Conformação do DNA

Análise de DNA, RNA e Proteínas

• Meio alcalino (pH > 7):

– negativamente carregados por se comportarem como um ácido.

• Meio ácido (pH < 7)

- positivamente carregados por se comportarem como uma base.

• Solução neutra:

– Estado de equilíbrio formando íon dipolar (negativas e positivas ao mesmo tempo)

Análise de DNA, RNA e Proteínas

Análise de DNA, RNA e Proteínas

Hemoglobina Proteínas DNA

Modos de Separação Eletrocromatografia Capilar Micelar (ECCM)

• A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resolução de compostos neutros, os quais não podem ser separados usando simplesmente a ECSL.

• As condições de separação envolvem o uso de eletrólitos contendo níveis relativamente altos de surfactantes, tal como dodecilssulfato de sódio (SDS).

• Acima de uma determinada concentração, denominada de concentração micelar crítica (CMC), as moléculas de surfactante começam a agregar-se, formando micelas.

• A separação é baseada na partição das moléculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionária) e o tampão aquoso. As micelas de SDS têm carga negativa e migram contra o FEO.

Modos de Separação (ECCM)

Outros Modos de Separação

• Eletroforese Capilar com Focalização Isoelétrica (ECFI)

• Isotacoforese Capilar (IC)

Aplicações (Separações de íons pequenos

• Separação de íons pequenos

Aplicações (separações de íons pequenos)

Aplicações (separações de espécies moleculares)

Aplicações (separações de espécies moleculares)

Aplicações (separações de espécies moleculares)

Vantagens e Limitações Vantagens:

• Rapidez;

• Versatilidade;

• Baixo custo por análise;

• Alto poder se separação (resolução);

• Consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes.

• Possibilidade de automação e detecção on-line.

Limitações:

• Não é adequada para:

– Compostos voláteis;

– Não-polares e de massa molar baixa (GC melhor opção)

– polímeros não iônicos de massa molar alta

– Não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta eficiência.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008.

2. Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004.

3. SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, 2006.

4. COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.

5. Queiroz, S.C.N., Jardim, I.C.S.F. Eletroforese Capilar, chemkeys.co 6. Vivas, W. L. P., Notas de Aula. Proead. UNIT. 2009. 7. Fernandes, A. Notas de Aula. Fundamentos de Extração de DNA. UFSC. 2010