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QBQ4020 – Bioquímica Metabólica Início: 03/08/2015 Fim: 08/12/2015 Dias e horário: sextas-feiras das 19hs às 22h40 Local: sala 04 B6 inferior Professor: Roberto K. Salinas Contato: roberto@iq.usp.br; sala 1001 do bloco 10 inferior Disciplina obrigatória para “Licenciatura Noturno” (sexto semestre) e “Química Ambiental” (sexto semestre) Pré-requisitos: Introdução à bioquímica e Química orgânica II Bibliografia: Stryer e Lehninger

Mês Dia Assunto Agosto 7 Hemoglobina e mioglobina, cooperatividade

14 Cinética enzimática, equação de Michaelis-Menten 21 Cinética enzimática

Mecanismos de catálise e tipos de inibição 28 Cinética

Membrana biológica Compostos ricos em energia (ex. ATP, GTP)

Setembro 4 Transporte de membrana Revisão de estruturas de carboidratos Introdução ao metabolismo dos carboidratos

11 Semana da Pátria 18 Revisão para Prova 1 25 Semana da Química

Outubro 02 Prova 1 09 Via glicolítica

Ciclo de Krebs 16 Cadeia de transporte de elétrons e fosforilação oxidativa 23 Degradação e síntese de glicogênio

Neoglicogênese Regulação, enzimas alostéricas Integração do metabolismo de carboidratos, sinalização por insulina e glucagon

30 Metabolismo de ácidos graxos Fotossíntese

Novembro 06 Revisão 13 Prova 2 – não cai fotossíntese 20 Dia da consciência negra 27 Ação hormonal e integração metabólica/Biossíntese de

carboidratos em plantas e bactérias Dezembro 04 Prova 3 Dezembro 11 Prova substitutiva (aberta) Dezembro 15 Data máxima para cadastro de notas Média Final = (P1 + P2 + P3)/3 Observação: 1) Os alunos que entregarem os exercícios obterão até 0.25 pontos na média final caso necessitem.

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2) A nota da prova substitutiva substitui a menor nota. Introdução à Bioquímica

Roberto Salinas – roberto@iq.usp.br

Instituto de Química - USP 21 de outubro de 2015

1. Estrutura de proteínas Proteínas são polímeros de aminoácidos conectados por ligações peptídicas. A ligação peptídica ocorre devido a uma reação de condensação entre o grupo amino do primeiro aminoácido e a extremidade carboxila do segundo aminoácido (Figura 1):

Figura 1: Reação de condensação entre Alanina e Serina formando um dipeptídeo Ala-Ser com eliminação de uma molécula de H2O. As cargas líquidas do peptídeo e dos aminoácidos não estão mostradas. A ligação peptídica é planar devido à existência de delocalização de elétrons do nitrogênio e do oxigênio da ligação amida. A planaridade da ligação peptídica possui enormes consequências conformacionais. A primeira delas é que a conformação do esqueleto polipeptídico pode ser descrita por apenas três ângulos diedrais: o ângulo ω ao redor da ligação peptídica, e os ângulos φ e Ψ do carbono alfa. Os ângulos φ e Ψ são correlacionados e nem todas as combinações são permitidas devido ao impedimento esterico gerado entre a carbonila e o N-H da ligação peptídica, e entre as cadeias laterais de aminoácidos vizinhos. O gráfico de correlação entre φ e Ψ é chamado de Diagrama de Ramachandran em homenagem ao biofísico indiano que o desenvolveu, e ainda é a principal ferramenta utilizada para avaliar a qualidade estereoquímica das estruturas de proteínas (Figura 2).

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Figura 2. Diagrama de Ramachandran. As regiões delimitadas pelas linhas verdes demarcam combinações permitidas de Ψ e Φ. Pontos fora das regiões delimitadas pelas linhas verdes indicam um aminoácido com algum problema ou correspondem a glicinas. Estruturas tridimensionais de proteínas com resolução atômica podem ser obtidas experimentalmente através de cristalização e Difração de Raios-X, Ressonância Magnética Nuclear em solução, e mais recentemente Crio-Microscopia Eletrônica. Conservação e homologia de sequências Proteínas são polímeros de aminoácidos. A sequência de aminoácidos de uma proteína é chamada estrutura primária. A estrutura tridimensional de uma proteína é determinada pela sequência de aminoácidos. A função biológica de uma proteína está intimamente relacionada com a estrutura tridimensional. A predição da estrutura tridimensional de uma proteína a partir da sequência de aminoácidos não é tarefa simples, especialmente para moléculas com mais de 100 aa. No entanto, a análise da estrutura primária pode oferecer pistas importantes sobre topologia (presença de hélices transmembranares), estrutura secundária e grau de desordem. A relação evolutiva entre proteínas de diferentes organismos pode ser inferida a partir de comparações entre sequências de aminoácidos. Famílias de proteínas que compartilham a mesma estrutura e a mesma função podem ser facilmente identificadas com base em similaridades entre sequências de aminoácidos. Membros de uma mesma família são chamados de proteínas homólogas. A função de uma

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proteína desconhecida pode eventualmente ser deduzida a partir da comparação de sua sequência de aminoácidos com milhares de sequências de proteínas contidas nos bancos de dados (por exemplo UNIPROT). Duas proteínas contendo ao menos 30% de identidade de sequência geralmente compartilham a mesma estrutura e função. Aminoácidos conservados são geralmente importantes para a função. Geralmente, quando estes aminoácidos são alterados no decorrer da evolução as propriedades físico-químicas são mantidas. Este fenômeno é chamado de mutação conservativa. Por exemplo, a mutação de uma Ile por uma Val na mesma posição pode ser tolerável pois trata-se de dois aminoácidos hidrofóbicos. Ou a mutação de um aspartato por um um ácido glutâmico também pode ser tolerável pois trata-se de dois aminoácidos com carga negativa na cadeia lateral. As alterações Ile – Val e Asp - Glu seriam duas mutações conservativas (Figura 3).

Proteína A GVDEQRFRIEVIDDDVFEEDECFYIRLFN-------PSEGVK----------LAVPMIAT Consenso G ++ R+ +IDDD+FEEDE F + L N EG+ L P AT Proteína B GETQKEIRVGIIDDDIFEEDENFLVHLSNIRVSTEASDEGILEASRVSTLACLGSPSTAT

Figura 3. Exemplo de alinhamento de sequências de duas proteínas “A” e “B” de organismos diferentes mas com a mesma função, detectar a concentração de Ca2+ intracelular. Note que “gaps” foram introduzidos na sequência da proteína “A” para optimizar o alinhamento com a proteína “B”. Função: proteínas que ligam Oxigênio (O2) Proteínas assumem diversas funções, mas uma das funções mais comuns é a ligação específica e reversível de outras moléculas. A molécula que se liga à proteína é chamada de ligante. O ligante liga-se a um sítio de ligação, o qual deve ser complementar em forma, tamanho, carga e hidrofilicidade ou hidrofobicidade ao ligante (modelo chave-fechadura). A interação entre o ligante e a proteína é específica, de forma que a proteína pode distinguir o ligante entre milhares de outras moléculas parecidas. Exemplo: enzimas reconhecem especificamente o substrato. No caso das enzimas, o sítio de ligação ao ligante é conhecido como sítio catalítico. Enzimas frequentemente reconhecem um substrato de acordo com um modelo de complementariedade espacial, chave-fechadura. Proteínas são flexíveis, isto é, experimentam conformações distintas que se interconvertem em diferentes escalas de tempo. A interação com um ligante frequentemente induz uma mudança conformacional na proteína de forma a tornar o sítio de ligação o mais complementar possível ao ligante, um processo conhecido como “induced fit”. Alternativamente, a proteína em solução está em equilíbrio entre distintas conformações sendo que apenas uma delas é espacialmente complementar ao ligante. A interação com o ligante desloca o equilíbrio conformacional no sentido da conformação complementar, um processo conhecido como “seleção de confôrmeros” ou “modelo sequencial”. A hemoglobina e a mioglobina foram as duas primeiras proteínas cuja estrutura tridimensional foi determinada experimentalmente. Elas transportam oxigênio. Proteínas não são capazes de coordenar oxigênio, para isso elas utilizam íons metálicos como Fe(II). O Fe(II) normalmente liga-se à proteína na forma complexada a um grupo prostético chamado Heme. O heme é uma protoporfirina que liga um íon

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Fe2+ (Figura 4). O grupo Heme está ligado não covalentemente à proteína (veja PDB 1MBO).

Figura 4. Grupo Heme encontrado na mioglobina e na hemoglobina. O íon Fe2+ faz ligações de coordenação com os quatro átomos de nitrogênio do anel. O Fe2+ ainda pode formar duas outras ligações de coordenação que são formadas com as histidinas proximal e distal (veja PDB 1MBO). A mioglobina consiste de um único polipeptídeo de 153 aminoácidos. O equilíbrio de associação entre a mioglobina e uma molécula de O2 é descrito como:

𝐾𝑎 = [!"]! [!]

= !!!!

(1) onde P é a proteína, L é o ligante, e ka e kd são as constantes de velocidade de associação (segunda ordem) e de dissociação (primeira ordem) do complexo. A fração de sítios ocupados pelo ligante é dada por θ: 𝜃 = !"#çã!  !"  !"#$%í!"#  !"#$%$&

!"#$%í!"  !"!#$= [!"]

!" ![!]= !" ! [!]

!" ! ! ![!]= !"[!]

!" ! !!= [!]

! !!! , (2)

em que [L] é a concentração de ligante total. O comportamento de θ em função de [L] é uma hipérbole (Figura 5). É fácil observar que quando a proteína possui menor afinidade (maior Kd) é necessário adicionar maior quantidade de ligante para atingir saturação (Figura 5). Note que Kd (constante de dissociação) é equivalente à concentração de ligantes necessária para saturar 50% dos sítios de ligação. Portanto o valor de Kd é uma medida clara da afinidade de uma proteína pelo ligante.

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Figura 5. Simulação da curvas de ligação para um complexo ligante:proteína com afinidade estimada por um Kd de 10 µM (azul) e 100 µM (vermelho). Em água, o grupo heme liga-se ao monóxido de carbono (CO) com 20 mil vezes maior afinidade do que ao oxigênio. Por outro lado, quando o heme está ligado na mioglobina a diferença de afinidade cai para 200 vezes. Detalhes estruturais, em particular a interação com a histidina distal explicam porque a afinidade do grupo heme pelo CO diminui. A hemoglobina possui estrutura quaternária, ela é um tetrâmero formado por duas subunidades α e duas subunidades β. Ambas as subunidades α e β são homólogas à mioglobina, mas mesmo assim apresentam baixa identidade de sequência (Figura 6). 1MBO:mioglobina -VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE cadeia alfa -VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFD------LSHGSA beta beta VHLTPEEKSAVTALWGKVNV--DEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNP *: : * *.** . * : * *:: .* * * * .. 1MBO:mioglobina DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH cadeia alfa QVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHL beta beta KVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHF .:* ** .* *: : : . : *:: *. * :: :.::.. :: .* : 1MBO:mioglobina PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKE cadeia alfa PAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR- beta beta GKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH- :* .:.: :* : . . :: **:

Figura 6. Alinhamento de sequência da mioglobina (PDB 1MBO) com as cadeias alfa e beta da hemoglobina (PDB 1HGA).

0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1isoterma de ligacao

concentracao de ligante total (mol/l)

thet

a (%

siti

os o

cupa

dos

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Apesar de diferenças na sequência de aminoácidos, as estruturas tridimensionais da mioglobina (PDB 1MBO) e da hemoglobina (PDB 1HGA) são muito parecidas. A hemoglobina possui quatro grupos heme, um em cada subunidade, podendo transportar até 4 moléculas de O2.

A presença de quatro sítios de ligação e 4 subunidades afeta profundamente as características da hemoglobina como molécula carreadora de oxigênio. A curva de ligação do oxigênio na hemoglobina é sigmoide, indicando que oxigênio liga-se cooperativamente à proteína (Figura 7). Em um processo cooperativo, a interação do ligante com o primeiro sítio altera a afinidade do segundo sítio e assim por diante.

Como consequência da cooperatividade observada na curva de ligação a oxigênio, a porcentagem de saturação da hemoglobina varia muito mais rapidamente com a concentração de oxigênio do que no caso da mioglobina que não é cooperativa. Por exemplo, no equilíbrio de ligação mostrado na Figura 7, nota-se que para ir de 20% a 80% de saturação seria necessário aumentar a concentração de ligante apenas duas vezes, de 12.6 para 25.2 nM (Figura 7). Enquanto que no caso de um equilíbrio não cooperativo como exemplificado na Figura 5, a concentração de ligante deveria ser aumentada aproximadamente 10 vezes para aumentar a fração de sítios ocupados de 20 a 80%. Portanto, uma proteína cooperativa é muito mais sensível a pequenas alterações na concentração de ligante. Esta característica torna a hemoglobina capaz de captar oxigênio nos pulmões, onde a pressão de O2 é maior, e liberar nos tecidos onde a pressão de O2 é menor.

Figura 7. Curva de Hill para uma proteína com 4 sítios de ligação e Kd 0.1 µM. A concentração total de proteína é 1 mM.

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.040

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4curva de Hill

concentracao de ligante (mol/l)

v (n

umer

o de

siti

os o

cupa

dos

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A ligação cooperativa de um ligante com oxigênio em uma consequência da interação entre as subunidades. A estrutura quaternária da hemoglobina envolve um grande número de interações fracas (eletrostática, ligação de hidrogênio e van der Waals) entre as subunidades alfa e beta. Estas interações são cruciais para modular a afinidade dos diferentes sítios de ligação pelo oxigênio. Como ? Monod, Wyman e Changeaux propuseram um modelo para explicar a cooperatividade da hemoglobina. Este modelo, chamado de “concerted model”, propõe que a hemoglobina está em equilíbrio entre um estado tenso (“T”) e outro relaxado (“R”):

O O2 liga-se mais fortemente ao estado R deslocando o equilíbrio na direção da forma “T”. Assim, quando O2 liga-se à primeira subunidades todas as outas subunidades mudam de conformação para a forma “R” concomitantemente. Exercícios para a aula 1

1. A proteína A interage com o ligante X com Kd 10-6 M. A proteína B interage com o mesmo ligante mas com Kd 10-9 M. Qual proteína possui maior afinidade pelo ligante X? Explique.

2. A proteína calcineurina liga-se à calmodulina com uma velocidade de

associação de 103 M-1s-1, e uma constante de dissociação, Kd, de 10 nM. Calcule a velocidade de dissociação do complexo (koff), inclua as unidades adequadas.

3. Desenhe a curva de desnaturação de uma proteína A em função da

temperatura. Assuma que a proteína A seja pequena, e portanto o equilíbrio de desnaturação envolve apenas dois estados. Em seguida, suponha que um mutante foi construído. Este mutante envolve a troca de dois resíduos de Ser por Cys, de tal forma que as duas cisteínas estão próximas uma da outra na estrutura tridimensional da proteína, e formam uma ponte dissulfeto estabilizando a estrutura. Desenhe sobre o mesmo gráfico, a curva de desnaturação do mutante.

4. Estudos de transporte de oxigênio em fêmeas grávidas mostraram que as

curvas de saturação com oxigênio do sangue do feto e do sangue materno são diferentes. Os eritrócitos do feto contém uma variante estrutural da hemoglobina (HbF), que consiste de duas subunidades α e duas γ (a2g2). Enquanto que a hemoglobina da mãe (HbA) consiste de α2β2. Qual hemoglobina possui maior afinidade pelo oxigênio nas condições nativas? Explique.

   

  9  

     

5. Depois de passar alguns dias em altitudes muito elevadas, a concentração de BPG nos eritrócitos aumenta. Qual será o efeito do aumento da concentração de BPG na curva de saturação da hemoglobina? Proponha uma explicação para porque essa adaptação seria benéfica para o funcionamento do organismo em altas altitudes. Desenhe gráficos para fundamentar a sua resposta. 2. Cinética enzimática Enzimas são catalisadores em sistemas biológicos. As características mais notáveis das enzimas são o seu poder catalítico e a sua especificidade. Quase a totalidade das enzimas são proteínas, porém algumas moléculas de RNA também são capazes de promover catalise. O exemplo mais conhecido de riboenzima é o RNA ribossomal. Uma das funções mais importantes desempenhadas pelas proteínas é o reconhecimento específico de ligantes através da formação de interações não covalentes. Enzimas utilizam esta capacidade para interagir com o substrato (ligante) posicionando-o de forma adequada para que reações químicas possam ocorrer. Enzimas catalisam reações químicas porque estabilizam o estado de transição. Elas catalisam apenas uma reação química, sendo que a ocorrência de reações colaterais é rara em comparação com reações não catalisadas. A tabela 1 ilustra o ganho em velocidade de reação promovido por enzimas selecionadas: Tabela 1: Aumento de velocidade de reação proporcionado por certas enzimas

Enzima Velocidade da reação não catalisada

Velocidade da reação catalisada

Anidrase carbonica 1.3×10-1 s-1 1×106 s-1 Triose fosfato isomerase 4.3×10-6 s-1 4.3×103 s-1 Carboxipeptidase A 3.0×10-9 s-1 578 s-1 Enzimas são altamente específicas para o substrato. Um exemplo desta especificidade são as proteases, enzimas que catalisam a reação de clivagem da ligação peptídica. A papaína é uma protease que não discrimina o aminoácido adjacente à ligação peptídica, assim ela reconhece diferentes sequências de aminoácidos. A tripsina, por outro lado, cliva somente ligações peptídicas adjacentes a lisinas ou argininas, que são aminoácidos de cadeia lateral longa e carregados positivamente. Outro exemplo é a DNA polimerase, uma enzima que catalisa a formação da ligação fosfodiéster para

Chapter 5 Protein Function S-55

(a) Which hemoglobin has a higher affinity for oxygen under physiological conditions, HbA or HbF?Explain.

(b) What is the physiological significance of the different O2 affinities?(c) When all the BPG is carefully removed from samples of HbA and HbF, the measured O2-saturation

curves (and consequently the O2 affinities) are displaced to the left. However, HbA now has agreater affinity for oxygen than does HbF. When BPG is reintroduced, the O2-saturation curvesreturn to normal, as shown in the graph. What is the effect of BPG on the O2 affinity of hemoglobin?How can the above information be used to explain the different O2 affinities of fetal and maternalhemoglobin?

Answer The affinity of hemoglobin for O2 is regulated by the binding of the ligands H!, CO2,and BPG. The binding of each ligand shifts the O2-saturation curve to the right—that is, theO2 affinity of hemoglobin is reduced in the presence of ligand. (a) decreases the affinity; (b) increases the affinity; (c) decreases the affinity; (d) decreases the affinity.

4. Reversible Ligand Binding The protein calcineurin binds to the protein calmodulin with an associationrate of 8.9 " 103 M#1s#1 and an overall dissociation constant, Kd, of 10 nM. Calculate the dissociationrate, kd, including appropriate units.

Answer Kd, the dissociation constant, is the ratio of kd, the rate constant for the dissociationreaction, to ka, the rate constant for the association reaction.

Kd $ kd!ka

Rearrange to solve for kd and substitute the known values.

kd $ Kd " ka $ (10 " 10#9 M)(8.9 " 103 M#1s#1) $ 8.9 " 10#5 s#1

5. Cooperativity in Hemoglobin Under appropriate conditions, hemoglobin dissociates into its foursubunits. The isolated a subunit binds oxygen, but the O2-saturation curve is hyperbolic rather than sig-moid. In addition, the binding of oxygen to the isolated a subunit is not affected by the presence of H!,CO2, or BPG. What do these observations indicate about the source of the cooperativity in hemoglobin?

Answer These observations indicate that the cooperative behavior—the sigmoid O2-bindingcurve and the positive cooperativity in ligand binding—of hemoglobin arises from interactionbetween subunits.

6. Comparison of Fetal and Maternal Hemoglobins Studies of oxygen transport in pregnant mammalsshow that the O2-saturation curves of fetal and maternal blood are markedly different when measuredunder the same conditions. Fetal erythrocytes contain a structural variant of hemoglobin, HbF, consistingof two a and two g subunits (a2g2), whereas maternal erythrocytes contain HbA (a2b2).

1.0

0.5

0

v

42 6 8 10pO2 (kPa)

HbF!BPG

HbA!BPG

2608T_ch05sm_S54-S62 2/1/08 5:56PM Page S-55 ntt 102:WHQY028:Solutions Manual:Ch-05:

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formar uma nova dupla-fita de DNA. Ela é praticamente insensível a erros incorporando menos de um nucleotídeo errado a cada mil. Dessa forma a DNA polimerase é uma enzima altamente específica para a fita de DNA molde. Equilíbrio O sentido de uma reação química depende da variação da energia livre de Gibbs envolvida (∆G = Gprodutos - Greagentes). Reações com ∆G negativo são espontâneas, enquanto que reações com ∆G positivo não são espontâneas e precisam de energia para ocorrer. Reações com ∆G = 0 estão no equilíbrio. O valor do ∆G depende apenas dos estados inicial e final, independe do caminho. A magnitude e o sinal do ∆G nada informam sobre a velocidade com que as reações ocorrem. Por exemplo, a reação de oxidação de glicose (C6H6O6) a CO2 e H2O é espontânea, mas não ocorre a taxas perceptíveis na ausência de enzimas. O ∆G de combustão da glicose é o mesmo caso a reação seja catalisada ou não. O grau de espontaneidade de uma reação química depende do valor do ∆G, o qual depende, por sua vez, das concentrações de reagentes e produtos conforme a equação 3:

∆𝐺 =  ∆𝐺°+ 𝑅𝑇𝑙𝑛 !"#$%&#'!"#$"%&"'

, (3) sendo que

∆𝐺° = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾!" . (4) A Tabela 2 mostra a correlação entre constantes de equilíbrio e ∆G. Note como reações com ∆G positivo não ocorrem na direção esperada, ao contrário de reações com ∆G negativo (Tabela 2).

Tabela 2. Relação entre Keq e ∆G. Keq ∆G (kJ/mol) 10-6 34.2 10-3 17.1 1.00 0.00 101 -5.7 103 -17.1

6. Reações químicas que não são espontâneas (∆G0 > 0) podem tornar-se espontâneas ajustando-se as concentrações de reagentes e produtos. Este aspecto é determinante em condições celulares. Por exemplo, considere a reação de isomerização de dihidroxicetona-fosfato (DHAP) em gliceraldeido-3-fosfato (GAP) que ocorre durante a via glicolítica. A razão entre as concentrações de DHAP e GAP no equilíbrio é 0.0475 a 298 K e pH 7 (R = 8315 JK-1mol-1). Pergunta-se:

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i) A reação de isomerização de DHAP em GAP nas condições de equilíbrio é espontânea?

ii) A reação será espontânea quando as concentrações de DHAP e GAP forem 200 µM e 3 µM, respectivamente?

Enzimas aceleram reações químicas mas não alteram o equilíbrio da reação, que é dado apenas em função da diferença de energia livre entre produtos e reagentes (Figura 8). A velocidade das reações químicas é expressa a partir de uma medida da variação da concentração de produtos ou reagentes em função do tempo. Considere o equilíbrio entre dihidroxicetona-fosfato (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (GAP) ilustrado abaixo:

Este equilíbrio possui velocidades no sentido da formação de gliceraldeido-3-fosfato ou dihidroxicetona-fosfato. A velocidade da reação direta é expressa como:

𝑣 = ![!"#$]!"

= 𝑘[𝐷𝐻𝐴𝑃] (5) onde a constante de velocidade “k” é expressa em s-1. Reações que são diretamente proporcionais à concentração do reagente são chamadas de “reações de primeira ordem”. Reações bimoleculares e cuja velocidade é proporcional à concentração de dois reagentes são chamadas “reações de segunda ordem”, neste caso a constante cinética é expressa em M-1s-1. Catálise enzimática A velocidade de uma reação química é diretamente proporcional à energia de ativação. Enzimas agem como catalisadores biológicos, e atuam para diminuir a barreira de energia de ativação conforme mostrado na Figura 8, acelerando a reação. A forma pela qual enzimas diminuem a barreira de energia é através da estabilização do estado de transição. A primeira etapa de uma reação catalítica é a formação de um complexo específico entre enzima e substrato. Dessa forma, a enzima é capaz de orientar o(s) substrato(s) adequadamente para que a reação química ocorra.

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Figura 8. Diagrama de energia livre em função da coordenada de reação para uma reação na ausência (preto) e presença da enzima (vermelho). A enzima estabiliza a o estado de transição, diminuindo a barreira de energia de ativação. A velocidade das reações químicas depende da constante de velocidade e das concentrações dos reagentes. Portanto, não é de estranhar que a velocidade de uma reação enzimática, medida a partir da taxa de formação do produto “P”, aumente com a concentração de enzima:

v = k[E]total . (6) A velocidade da reação também aumenta com a concentração de substrato como seria de esperar. O curioso é que a velocidade de reação aumenta linearmente para baixas concentrações de substrato, mas deixa de aumentar em altas concentrações de substrato e atingir um valor máximo (Vmax) (Figura 9). Com certeza, a velocidade de uma reação não catalisada não apresenta este efeito de saturação.

Figura 9. Velocidade inicial (v0) em função da concentração de substrato (azul). Comparação com enzimas diferentes apresentando menor KM (verde) ou maior Vmax (vermelho). Para compreendermos a origem deste efeito de saturação é preciso considerar as condições em que as medidas foram realizadas. Medidas de velocidades de reações enzimáticas são geralmente realizadas nos intervalos de tempo iniciais da reação, e

Produtos

Reagentes

ET‡G0

Coordenada de reação

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

[Substrato] (M)

v 0

controlemaior Vmaxmenor KM

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em condições de baixíssima concentração de enzima e um excesso de substrato. Quando a enzima é misturada com um excesso de substrato, há um período inicial durante o qual as concentrações de intermediários, de complexo enzima-substrato (ES) aumentam até atingir valores estacionários. Uma vez que os intermediários atingiram concentrações estacionarias, as velocidades de reação alteram-se muito pouco com o tempo. Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram em 1913 um modelo simples para explicar as características cinéticas observadas na Figura 9. O modelo de Michaelis-Menten pressupõe que o complexo ES é um intermediário da reação catalítica. O complexo enzima-substrato também costuma ser chamado de “complexo de Michaelis”:

A reação catalítica é dividida em duas etapas. Inicialmente ocorre a interação entre uma molécula da enzima e outra do substrato, formando o complexo “ES”. Este primeiro equilíbrio é considerado rápido e reversível, e não envolve alterações das ligações químicas. O complexo ES é mantido por interações não covalentes. As reações químicas ocorrerão em uma segunda etapa, na qual o complexo ES se decompõe em enzima livre e produto. Esta segunda etapa segue uma cinética de primeira ordem, dependente da constante k2 ou kcat. O complexo ES também pode ser formado a partir da reação reversa entre enzima e produto. Mas como as medidas são realizadas nos instantes iniciais em que a concentração de produto é muito pequena, a reação reversa pode ser ignorada. Esta análise também assume que a decomposição de ES em enzima e produto livres é rápida, e portanto pode ser ignorada. O esquema final é:

Com um pouquinho de álgebra e assumindo-se a condição de estado estacionário, é possível chegar a uma equação simples para a velocidade inicial de reação em função da concentração de substrato e das constantes cinéticas. Esta é a chamada “equação de Michaelis-Menten”, e reproduz muito bem o comportamento ilustrado na Figura 9:

𝑣! =!![!]![!]

!!!!!!!!

![!]= !!"#[!]

!!![!] . (7)

A constante cinética k2 ou kcat é frequente chamada de “turnover”. Ela representa o número máximo de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo. A constante kcat é uma constante de velocidade de primeira ordem. Na presença de excesso de substrato, a velocidade inicial v0 atinge o valor máximo (Vmax) que depende apenas da constante catalítica kcat.

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𝑉!"# = 𝑘![𝐸]!"!#$ (8) KM é igual à concentração de substrato na qual a metade da velocidade máxima (v0 = Vmax/2) é atingida. Dessa forma KM representa a concentração de substrato necessária para se atingir uma taxa razoável de conversão de substratos em produtos. E na situação particular em que k2 << k-1, KM representa a constante de dissociação do complexo ES. As tabelas 3 e 4 apresentam os valores do turnover e de KM para algumas enzimas.

A Figura 9 ilustra o efeito de variações de KM e Vmax sobre o comportamento cinético de uma enzima. Tabela 3. Turnover de algumas enzimas

Enzima kcat (s-1) Anidrase carbonica 6.0×105 Acetilcolinesterase 2.5×104

Lactato desidrogenase 1.0×103 Tabela 4. KM de algumas enzimas

Enzima Substrato (s-1) KM (µM) Anidrase carbonica CO2 8.0×103 β-galactosidase Lactose 4.0×103

Arginina-tRNA-sintetase Arginina 3 Normalmente, em condições fisiológicas, a velocidade de uma reação enzimática é dada pela razão kcat/KM, que é uma constante de velocidade de segunda ordem aparente:

𝑣! =!!"#!!

𝐸 [𝑆]. (9)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

[Substrato] (M)

v 0

controlemaior Vmaxmenor KM

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Em uma condição em que a concentração de substrato for muito menor do que o KM,

𝑣! =!!"#!!

[𝐸]!"!#$[𝑆]. (10) A razão kcat/KM depende tanto da eficiência da reação catalítica kcat, como da afinidade entre enzima e substrato, KM. Esta razão é uma boa medida da especificidade da interação entre enzima e substrato como mostra a Tabela 5. Neste caso , fica evidente que a quimotripsina possui preferência por substratos volumosos como a fenilalanina. Tabela 5. Preferências da quimotripsina pelo substrato

Ester de amino ácido kcat/KM (M-1s-1) Glicina 1.3×10-1 Valina 2.0

Fenilalanina 1.0×105 É interessante imaginar o quão eficiente uma enzima pode ser. A resposta para essa pergunta depende do limite da razão kcat/KM. Suponha que a decomposição do complexo ES em enzima e produtos seja muito mais rápida do que a velocidade de dissociação do complexo (k2 >> k-1), neste caso o limite é dado por k1, a constante de velocidade de formação do complexo “ES”. O limite para k1 é a velocidade de difusão das moléculas em solução, um número da ordem de 108 a 109 M-1s-1. Enzimas que possuem valor kcat/KM nesta faixa são ditas “perfeitas”, pois atingiram a perfeição catalítica (Tabela 6). Tabela 6 Enzimas que atingiram perfeição catalítica Enzima kcat/KM (M-1s-1)

Acetilcolinesterase 1.6×108 Anidrase carbônica 8.3×107

Catalase 4.0×107 Representação gráfica dos dados É muito útil linearizar a equação de Michaelis-Menten para determinar os valores de kcat e KM, e também para examinar desvios da idealidade. Dessa forma, um gráfico de 1/v em função de 1/[S] obedeceria a uma equação de reta igual a:

!!= !!

!!"#

![!]+ !

!!"#. (11)

A análise dessa equação indica que o ponto em que o gráfico cruza o eixo das ordenadas equivale a 1/Vmax e que o coeficiente angular é dado por KM/Vmax. Inibição Enzimas podem ser inativadas pelo aumento da temperatura, ou pela interação não covalente com inibidores, pequenas moléculas que competem com o substrato pelo sítio ativo. Estes inibidores são chamados de “competitivos”. No caso de um inibidor competitivo, o mecanismo de Michaelis-Menten teria que ser alterado para:

  16  

E não é difícil derivar a equação de Michaelis-Menten levando em conta o equilíbrio entre a enzima e o inibidor competitivo:

𝑣 = !!"#[!]

!! !! !!!

![!]. 12

Observa-se que o KM aparente aumentou por um fator de (1+[I]/KI), ou seja, a afinidade aparente entre enzima e substrato diminuiu. Note que o inibidor competitivo não afeta o Vmax, apenas KM. Mecanismos De onde vem o poder catalítico e a especificidade das enzimas? Nós já vimos que as enzimas formam um complexo com o substrato através da formação de interações não covalente, e que elas interagem melhor com o estado de transição. Como isto ocorre? Estruturas cristalográficas e ensaios de mutação sítio-dirigida permitiram obter a resposta em alguns casos. Os mecanismos descritos abaixo trazem exemplos de um ou mais tipos de catálise: a)catálise covalente: em que o sítio ativo contem um núcleofilo poderoso que liga-se covalentemente a parte do substrato durante a catálise b)catálise ácido-base: uma molécula que não seja a água assume o papel de doador/aceptor de prótons c)catálise por aproximação: enzimas facilitam proximidade entre os substratos trazendo-os para uma mesma superfície de interação d)catálise por íon metálico: íons metálicos agem cataliticamente, por exemplo ao facilitar a formação de nucleófilos. Proteases Enzimas proteolíticas possuem a tarefa de acelerar a reação de hidrólise da ligação peptídica.

  17  

Embora esta reação seja termodinamicamente favorável, ela é extremamente lenta na ausência de um catalisador. Para promover a clivagem da ligação peptídica a enzima deve facilitar um ataque nucleofílico no grupo carbonila da ligação peptídica. A quimotripsina emprega um nucleofico forte capaz de fazer este ataque nucleofilico. Este nucleofilo é o grupo hidroxil da cadeia lateral de uma serina extraordinariamente reativa. A reatividade extraordinária da Ser195 vem do fato de que o grupo OH da cadeia lateral forma uma ligação de hidrogênio com a His57. O grupo NH da His57 forma, por sua vez, uma ligação de hidrogênio com a cadeia lateral do Asp102. Este arranjo, conhecido como “tríade catalítica”, estabiliza uma carga negativa na cadeia lateral da Ser195, que se torna extraordinariamente ácida (Figura 10).

Figura 10. Tríade catalítica da quimotripsina formada pela Ser195, His57 e Asp102. A rede de ligações de hidrogênio torna o grupo OH da Ser195 extremamente reativo e estabiliza um oxiânion. O mecanismo proposto para a reação catalítica envolve um ataque nucleofilico do oxigênio da cadeia lateral da Ser195 sobre a carbonila do substrato, que assume configuração teatraédrica intermediário e uma carga negativa no oxigênio da carbonila. Esta carga negativa será estabilizada por grupos NH da proteína, que formam o chamado “oxyanion hole”. O passo seguinte envolve a clivagem da ligação peptídica ao mesmo tempo em que o próton ligado à His57 é transferido para o grupo amino da cadeia polipeptídica livre. Como resultado, a enzima permaneceu acilada por parte da cadeia polipeptídica. Portanto, este mecanismo envolve a formação de um intermediário covalente, e a próxima etapa deve se a hidrólise desse

  18  

intermediário covalente. Na próxima etapa uma molécula de água ocupa o lugar do grupo amino do substrato. A His57 age como uma base e abstrai um próton da água, enquanto o grupo hidroxila ataca a carbonila do intermediário que colapsa liberando a segunda metade do peptídeo e regenerando a enzima. Este mecanismo não explica a especificidade da enzima. A quimiotripsina cliva ligações peptídicas adjacentes a cadeias laterais grandes e volumosas, como fenilalanina. O reconhecimento do substrato envolve a interação da cadeia lateral na posição amino-terminal à ligação que será clivada, com um bolsão hidrofóbico. Este bolso hidrofóbico possui, no caso da quimiotripsina, maior afinidade por cadeias laterais aromáticas e volumosas. A quimiotripsina é uma protease da classe das serino-proteases, pois utiliza a cadeia lateral de uma Serina para fazer o ataque nucleofílico na carbonila. Outras classes de proteases utilizam uma estratégia semelhante, as cisteíno-proteases, aspartil-proteases e as metalo-proteases. Nestas três classes de proteases, o mecanismo de catálise segue o mesmo padrão. Primeiro ocorre a ativação de um agente nucleofílico capaz de realizar um ataque sobre a carbonila da ligação peptídica que será clivada. No caso das cisteíno-proteases, esse agente será uma cisteína que assume a função da serina. No caso das metaloproteases ou aspartil-proteases, o ataque nucleofílico é efetuado por uma molécula de água reativa. Frequentemente, o grupo carbonila que sofre o ataque também é polarizado, de forma a assumir menor densidade eletrônica. O terceiro aspecto importante é a estabilização do intermediário teatraédrico através da formação do “oxyanion hole”. No caso das metalo-proteases, um íon metálico, por exemplo Zn2+, interage com uma molécula de água polarizando-a e tornando-a altamente reativa. Anidrase carbônica A anidrase carbônica é uma enzima cuja função é acelerar a reação de hidratação de CO2 formando o ânion bicarbonato:

As constantes k1 (pseudo-primeira ordem) e k-1 (primeira ordem) são 0.15 s-1 e 50 s-1, respectivamente, na ausência de catalisador. Portanto o equilíbrio da reação é deslocado no sentido da formação de CO2. Anidrase carbônica acelera a reação de hidratação de CO2 para velocidades kcat = 106 s-1. A enzima possui um íon Zn2+ coordenado por três histidinas, o quarto ponto de coordenação do Zn2+ é satisfeito por uma molécula de H2O. O turnover da anidrase-carbônica é altamente dependente do pH, e apresenta uma transição de um estado de baixa atividade em pH baixo para um estado de alta atividade em pHs maiores que 9, sendo que o ponto médio dessa transição é o pH 7. O

  19  

grupo responsável por essa transição é uma molécula de água que está coordenada pelo Zn2+. A interação com o Zn2+ faz com que o pKa da molécula de água diminuísse de 15.7 para 7.0. Esta molécula de água é capaz de perder um próton facilmente devido ao pKa mais baixo, formando um radical hidroxila que é capaz de realizar um ataque nucleofílico no CO2 gerando um íon bicarbonato. Exercícios 1. Uma enzima que catalisa a reação de conversão entre duas moléculas “X” e “Y” é isolada de duas espécies de bactérias. As enzimas possuem o mesmo Vmax, mas possuem valores de KM diferentes. A enzima A possui KM = 2.0 µM, enquanto que a enzima B possui KM = 0.5 µM. A gráfico abaixo mostra a cinética de duas reações efetuadas com a mesma concentração de enzima e [X] = 1 µM. Qual curva corresponde a qual enzima?

2. O exame da estrutura de uma enzima permite formular hipóteses sobre a contribuição de cada aminoácidos para a estrutura e para a atividade da enzima. Uma forma de testar essas hipóteses é usar técnicas de DNA recombinante para gerar mutantes, e examinar os efeitos das mutações sobre a estrutura e atividade da enzima. A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima que catalisa a redução de piruvato com NADH para formar lactato. Um esquema do sítio ativo da enzima, contendo piruvato e NADH ligados, está mostrado abaixo:

O mecanismo da reação é similar ao mecanismo de outras reduções por NADH. O estado de transição envolve o grupo carbonil do piruvato fortemente polarizado:

S-66 Chapter 6 Enzymes

(c) An enzyme that catalyzes the reaction X zy Y is isolated from two bacterial species. The enzymeshave the same Vmax, but different Km values for the substrate X. Enzyme A has a Km of 2.0 !M,while enzyme B has a Km of 0.5 !M. The plot below shows the kinetics of reactions carried outwith the same concentration of each enzyme and with [X] ! 1 !M. Which curve corresponds towhich enzyme?

Answer(a) Here we want to find the value of [S] when V0 ! 0.25 Vmax. The Michaelis-Menten

equation is

V0 ! Vmax[S]/(Km " [S])

so V0 ! Vmax when [S]/(Km " [S]) ! 0.25; or

[S] ! 0.33Km ! 0.33(0.0050 M) ! 1.7 # 10$3 M

(b) The Michaelis-Menten equation can be rearranged to

V0/Vmax ! [S]/(Km " [S])

Substituting [S] ! %12% Km into the equation gives

V0/Vmax ! 0.5 Km/1.5Km ! 0.33

Similarly, substituting [S] ! 2Km gives

V0/Vmax ! 0.67

And substituting [S] ! 10Km gives

V0/Vmax ! 0.91

(c) The upper curve corresponds to enzyme B ([X] is greater than the Km for this enzyme),and the lower curve corresponds to enzyme A. When the initial concentration of sub-strate is greater than Km, the rate of the reaction is less sensitive to the depletion of substrate at early stages of the reaction and the rate remains approximately linear for alonger time.

9. Applying the Michaelis-Menten Equation I A research group discovers a new version of happyase,which they call happyase*, that catalyzes the chemical reaction

HAPPY 88zy88 SAD

The researchers begin to characterize the enzyme.(a) In the first experiment, with [Et] at 4 nM, they find that the Vmax is 1.6 !M s$1. Based on this ex-

periment, what is the kcat for happyase*? (Include appropriate units.)

Time

[Y]

2608T_ch06sm_S63-S77 2/1/08 1:11PM Page S-66 ntt 102:WHQY028:Solutions Manual:Ch-06:

(b) Using the Living Graph for Equation 6–30 and the kinetic parameters in (a), create a plot inwhich both a and a! are 1.0. Now observe how the plot changes when a " 2.0; when a! " 3.0;and when a " 2.0 and a! " 3.0.

(c) Using the Living Graphs for Equation 6–30 and the Lineweaver-Burk equation in Box 6–1, createLineweaver-Burk (double-reciprocal) plots for all the cases in (a) and (b). When a " 2.0, doesthe x intercept move to the right or to the left? If a " 2.0 and a! " 3.0, does the x interceptmove to the right or to the left?

Answer(a) When [S] increases from 0.2 to 0.4 mM, V0 increases by a factor of 1.96. When [S] " 10

mM, V0 " 50 mM s#1. When [S] increases from 100 to 200 mM, V0 increases by a factor of1.048.

(b) When a " 2.0, the curve is shifted to the right as the Km is increased by a factor of 2.When a! " 3.0, the asymptote of the curve (the Vmax) declines by a factor of 3. Whena " 2.0 and a! " 3.0, the curve briefly rises above the curve where both a and a! " 1.0,due to a decline in Km. However, the asymptote is lower because Vmax declines by afactor of 3.

(c) When a " 2.0, the x intercept moves to the right. When a " 2.0 and a! " 3.0, the xintercept moves to the left.

Data Analysis Problem23. Exploring and Engineering Lactate Dehydrogenase Examining the structure of an enzyme re-

sults in hypotheses about the relationship between different amino acids in the protein’s structure andthe protein’s function. One way to test these hypotheses is to use recombinant DNA technology togenerate mutant versions of the enzyme and then examine the structure and function of these alteredforms. The technology used to do this is described in Chapter 9.

One example of this kind of analysis is the work of Clarke and colleagues on the enzyme lactatedehydrogenase, published in 1989. Lactate dehydrogenase (LDH) catalyzes the reduction of pyruvatewith NADH to form lactate (see Section 14.3). A schematic of the enzyme’s active site is shown below;the pyruvate is in the center:

Chapter 6 Enzymes S-75

NH2

H3C

OC H

HC

CH3

O(NADH)Pyruvate

O

CO

N

C

H

H3C CH2

CH3

Ile250

Lactate dehydrogenase

Gln102

OH

H

C

Thr246

–

H

C

OO

Asp168

His195 +

–

HN

N

CNHH

HNH

NH

Arg109

+

C

HNH

NH

HHN

Arg171

+

2608T_ch06sm_S63-S77 2/1/08 7:34AM Page S-75 ntt 102:WHQY028:Solutions Manual:Ch-06:

  20  

Pergunta-se: i) Um mutante da LDH no qual a Arg109 foi substituída por Gln mostra apenas 5 % de ligação a piruvato e 0.07 % da atividade da enzima selvagem. Proponha uma explicação para os efeitos desta mutação ii) Você espera que a substituição da Arg171 por uma lisina afete a afinidade da enzima pelo piruvato? Por quê? 3. Uma enzima recém descoberta catalisa a reação descrita abaixo.

O valor do turnover encontrado para esta enzima é 600 s-1. Quando [E]T = 20×10-9 M e [T] = 40 µM, a velocidade da reação é v0 = 9.6 µMs-1. Calcule o KM para o substrato. 4. A hidrólise de pirofosfato a ortofosfato é uma reação acoplada importante para deslocar o equilíbrio de reações biossintéticas, por exemplo a síntese de DNA. Esta reação de hidrólise é catalisada por uma pirofosfatase que possui massa de 120 kDa e consiste de seis subunidades idênticas. Para esta enzima, a unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 10 µmol de pirofosfato em 15 minutos a 37 0C. A enzima purificada possui Vmax = 2800 unidades por miligrama de enzima. a) Quantos mols de substrato são hidrolisados por segundo por miligrama de enzima quando a concentração do substrato for muito maior do que o Km? b) Quantos mols de sítios ativos existem em 1 mg de enzima? Assuma que cada subunidade possui um sítio ativo. c) Qual é o turnover da enzima? 5. Suponha que uma enzima mutante ligue-se com o substrato com uma afinidade 100x maior do que a enzima selvagem. Qual é o efeito desta mutação sobre o turnover (kcat) considerando-se que a interação com o estado de transição não foi afetada? 6. Para uma enzima que segue a equação de Michaelis-Menten, qual é o valor de Vmax considerando-se que v0=1µM/min a 1/10 KM?

S-76 Chapter 6 Enzymes

The reaction mechanism is similar to many NADH reductions (Fig. 13–24); it is approximately thereverse of steps 2 and 3 of Figure 14–7. The transition state involves a strongly polarized carbonylgroup of the pyruvate molecule as shown below:

(a) A mutant form of LDH in which Arg109 is replaced with Gln shows only 5% of the pyruvate bind-ing and 0.07% of the activity of wild-type enzyme. Provide a plausible explanation for the effectsof this mutation.

(b) A mutant form of LDH in which Arg171 is replaced with Lys shows only 0.05% of the wild-typelevel of substrate binding. Why is this dramatic effect surprising?

(c) In the crystal structure of LDH, the guanidinium group of Arg171 and the carboxyl group of pyru-vate are aligned as shown in a co-planar “forked” configuration. Based on this, provide a plausibleexplanation for the dramatic effect of substituting Arg171 with Lys.

(d) A mutant form of LDH in which Ile250 is replaced with Gln shows reduced binding of NADH. Pro-vide a plausible explanation for this result.

Clarke and colleagues also set out to engineer a mutant version of LDH that would bind and re-duce oxaloacetate rather than pyruvate. They made a single substitution, replacing Gln102 with Arg;the resulting enzyme would reduce oxaloacetate to malate and would no longer reduce pyruvate tolactate. They had therefore converted LDH to malate dehydrogenase.

(e) Sketch the active site of this mutant LDH with oxaloacetate bound.(f) Provide a plausible explanation for why this mutant enzyme now “prefers” oxaloacetate instead

of pyruvate.(g) The authors were surprised that substituting a larger amino acid in the active site allowed a

larger substrate to bind. Provide a plausible explanation for this result.

Answer(a) In the wild-type enzyme, the substrate is held in place by a hydrogen bond and an ion-

dipole interaction between the charged side chain of Arg109 and the polar carbonyl ofpyruvate. During catalysis, the charged Arg109 side chain also stabilizes the polarizedcarbonyl transition state. In the mutant, the binding is reduced to just a hydrogen bond,substrate binding is weaker, and ionic stabilization of the transition state is lost, reducingcatalytic activity.

(b) Because Lys and Arg are roughly the same size and have a similar positive charge, theyprobably have very similar properties. Furthermore, because pyruvate binds to Arg171 by(presumably) an ionic interaction, an Arg to Lys mutation would probably have littleeffect on substrate binding.

(c) The “forked” arrangement aligns two positively charged groups of Arg residues with thenegatively charged oxygens of pyruvate and facilitates two combined hydrogen-bond andion-dipole interactions. When Lys is present, only one such combined hydrogen-bondand ion-dipole interaction is possible, thus reducing the strength of the interaction. Thepositioning of the substrate is less precise.

(d) Ile250 interacts hydrophobically with the ring of NADH. This type of interaction is notpossible with the hydrophilic side chain of Gln.

!OOC"ACH3

AC

OGG

O–

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  21  

7. A penicilina é hidrolisada por uma enzima beta-lactamase que está presente em algumas cepas de bactérias resistentes a antibióticos. A massa desta enzima é 29.6 kDa. A quantidade de enzima hidrolisada em 1 minuto em uma solução de 10 ml contendo 10-9 gramas de beta-lactamase purificada foi medida em função da concentração de penicilina (tabela abaixo). Assuma que a concentração de penicilina não se altera apreciavelmente durante o ensaio.

[Penicilina] µM Quantidade hidrolisada (nanomols)

1 0.11 3 0.25 5 0.34

10 0.45 30 0.58 50 0.61

a) Faça um gráfico de V0 em função de [S] e de 1/V0 em função de 1/[S]. Responda: a beta-lactamase parece seguir a cinética de Michaelis-Menten? Neste caso, qual é o valor do KM? Observação: abaixo é dada a equação da reta do segundo gráfico:  

𝑦 = 4.6×10! + 8.8×10!"  b) Qual é o valor do Vmax? c) Qual é o turnover da enzima nestas condições experimentais? Assuma a presença de um sítio ativo por molécula de enzima.  

  8. A cinética de uma enzima foi medida em função da concentração de substrato na presença e ausência de 2 mM do inibidor “I”.

[S] (µM) Velocidade (µmol/minuto) Sem inibidor Com inibidor

3 10.4 4.1 5 14.5 6.4

10 22.5 11.3 30 33.8 22.6 90 40.5 33.8

a) Quais são os valores de Vmax e KM na ausência e presença de inibidor? São

dadas as seguintes quações de reta:

0 10 20 30 40 500

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

[S]*1e6 (M)

v 0 (nan

omol

/seg

undo

)

−2 0 2 4 6 8 10x 105

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5 x 1011

1/[S] M−1

1/v 0 (s

/mol

)

  22  

Azul (sem inibidor): 𝑦 = 13𝑥 + 1.3×10! Vermelho (com inibidor): 𝑦 = 40𝑥 + 1.3×10!

b) Qual é o tipo de inibição? c) Qual é a constante de afinidade do inibidor? d) Se [S] = 10 µM e [I] = 2 mM, qual é a fração de moléculas de enzima ligadas

ao substrato? E com o inibidor? e) Se [S] = 30 µM, qual é a fração de moléculas de enzima que estão ligadas com

o substrato na presença e na ausência de 2 mM de inibidor? Compare esta razão com a razão entre as velocidades nas mesmas condições.

3. Metabolismo Fermentação alcoólica Em aulas anteriores vimos como a hidrólise de ATP formando ADP e fosfato inorgânico libera uma grande quantidade de energia (Figura 11) que será utilizada para promover processos celulares que requerem o fornecimento de energia. Estes processo podem ser: i) contração muscular e movimentos celulares, ii) transporte ativo de íons e moléculas através da membrana, iii) síntese de aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, DNA e outros compostos necessários à célula. Como exemplo de transporte ativo, lembrem-se daquele promovido pela bomba de Na+/K+ para a manutenção do gradiente iônico através da membrana plasmática (aulas anteriores).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[S]*1e6 (M)

v 0 (mic

rom

ol/m

inut

o)

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5x 105

0

5

10

15x 106

1/[S] M−1

1/v 0 (s

/mol

)

  23  

∆𝐺° = −30.5  𝑘𝑗.𝑚𝑜𝑙!!

Figura 11. Reação de hidrólise de ATP formando ADP e fosfato inorgânico (Pi). A variação de energia livre nas condições padrão (ΔG0) está indicada. Esta reação possui um ΔG ainda mais negativo nas condições celulares devido às concentrações fora do equilíbrio de ADP e ATP (veja a equação 3, pág. 10)!! Estrutura dos compostos fosforilados ATP, ADP e AMP.

O metabolismo celular é voltado para dois aspectos fundamentais: i) produção

de ATP para fornecer energia para os processos celulares e ii) síntese de intermediários de biossíntese (ác. graxos, lipídeos, hormônios, aminoácidos, nucleotídeos, etc). O metabolismo degradativo é chamado de catabolismo, enquanto que o metabolismo biosintético é conhecido como anabolismo. Organismos que obtém energia livre a partir da luz do sol são chamados de fótotropicos, enquanto que

6

C

C

CC

C

H

H

HH

H

H

N

N

N

N

HO OH

NH2

O-O-P-O-P-O-P-O-CH2

OOO

O-O-O-

Adenina

Ribose

AMP

ADP

ATP

ATP = Adenosina 5'-trifosfato

ALGUNS TIPOS DE ENZIMAS

Quinases: São enzimas que catalisam a transferência de um grupo fosfato de um composto de alta energia (em geral do ATP) para um aceptor. Isomerases: São enzimas que catalisam reações de isomerização de função. Mutases: São isomerases que catalisam a transferência de grupos fosfatos de baixa energia de uma posição para a outra, dentro da mesma molécula. Desidrogenases: São enzimas que catalisam reações de óxido-redução, por transferência de hidrogênio do substrato para uma coenzima, geralmente NAD

+ ou FAD.

Essas reações, na maioria dos casos são reversíveis. Aldolases: São enzimas que cindem açúcares fosforilados, dando origem a diidroxiacetona-fosfato e a outro açúcar, com 3 átomos de carbono a menos que o substrato original. Fosfatases: São enzimas que catalisam reações de hidrólise de ésteres de fosfato.

GLICÓLISE E GLICONEOGÊNESE

INTRODUÇÃO

Os objetivos de números 1 a 12 devem ser respondidos utilizando apenas o mapa da glicólise.

  24  

organismos que obtém energia livre através da oxidação de moléculas (exemplo açúcares) são chamados de quimiotrópicos.

Células clivam e oxidam moléculas glicose para produzir energia na forma de moléculas de ATP e intermediários para as reações de biossíntese. A principal via para obtenção de ATP é o metabolismo de glicose que se inicia através da quebra da glicose pela via glicolítica, na qual uma molécula de glicose é clivada em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico) com a concomitante formação de duas moléculas de ATP.

A descoberta da via glicolítica (ou glicólise) está intimamente relacionada ao estudo da fermentação alcóolica promovida por leveduras. De fato, uma parte da bioquímica tal qual conhecemos hoje originou-se a partir do estudo da fermentação alcoólica durante o final do século XIX e a primeira metade do século XX. Nessa época, sabia-se que leveduras eram capazes de fermentar açúcar para produzir etanol (Figura 12), e percebeu-se que tanto o extrato de levedura como as células vivas possuíam a mesma atividade. Uma fração do extrato de leveduras que era não dializável e sensível à temperatura foi chamada de zymase, enquanto que outra fração que era dializável e insensível à temperatura foi chamada de cozymase. Mais tarde descobriu-se que zymase e cozymase eram, respectivamente, uma mistura de enzimas e de co-fatores como NAD+, ATP, ADP e íons metálicos.

Pesquisas realizadas para compreender este fenômeno acabaram conduzindo à descoberta da sequência de reações de envolvidas na quebra anaeróbica de glicose (hexose; açúcar de 6 carbonos) em etanol e gás carbônico, e à identificação e isolamento das enzimas que catalisam estas reações. Estes estudos, realizados simultaneamente tanto em leveduras como em extratos de músculo, mostraram que a glicólise é uma via comum a todos os organismos, de procariotos às nossas células humanas.

A glicólise quebra duas moléculas de glicose (uma hexose) em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico). O catabolismo anaeróbico do piruvato em células de levedura leva à formação de etanol, enquanto que em células musculares leva à formação de ácido lático (Figura 13). O ácido lático é formado no músculo quando a quantidade de oxigênio disponível é insuficiente para promover o metabolismo aeróbico (por exemplo, uma situação de exercício físico intenso). O ácido lático formado no músculo pode ser convertido novamente em glicose nas células do fígado pelo chamado “ciclo de Cori”.

A sequência de reações enzimáticas da via glicolítica tal como a conhecemos hoje pode ser observada na Figura 14.

  25  

Figura 12. Destino dos átomos de carbono da glicose durante a fermentação em leveduras. Baseado em Barnett (2003) Yeast 20: 509-543.

Figura 13. Catabolismo do piruvato a etanol (levedura) ou ácido lático no músculo em condições anaeróbicas. Retirado de Barnett (2003) Yeast 20: 509-543.

C C C C C Chexose

C C C C C Ctriose triose

CO2CO2 CH3 CH2 OHCH3 CH2 OH

History of research on yeasts 5 513

enzyme action in the yeast cells, nor did he visualize thepossibility of extracting fermentation enzymes, even thoughan ever-increasing number of cell-free enzyme actions werebeing reported. Pasteur’s chemical training and experimen-tal skill would have given a high chance of success to suchexperiments ([224] p. 253).

Figure 2. Path of carbon atoms in the conversion ofglucose to ethanol and carbon dioxide. Each carbon atomof a glucose molecule is numbered to show its fate duringfermentation

As a result of biochemical studies of yeastand, later, of muscle, the pathway of glycolysis(Figure 1) was worked out in the first half ofthe twentieth century (although its regulation wasonly understood subsequently). When pyruvate, theend-product of glycolysis, is metabolized anaerobi-cally, yeasts convert it to ethanol; but muscles con-vert it to lactate (Figure 3): ‘. . . a muscle resting innitrogen’, Meyerhof explains, ‘produces lactic acidsteadily; in oxygen no lactic acid accumulates’12

([157] p. 1415). Indeed, there have been many par-allels and interconnexions in the research on thetwo kinds of eukaryotic cell, those of yeasts andthose of muscles.13

Notes on some of the most exceptionalinvestigators

By 1940, the complete pathway of glycolysishad been elicited, largely by a few remarkablebiochemists, of whom five were of Jewish origin,as was an astonishing number of other outstanding

12Lactic acid is formed in muscle when the amount of oxygen is limiting; this occurs during great muscular activity and is a majorfactor limiting achievements by athletes and ballet dancers. Lactic acid formed in muscle is converted back into glucose by liver cells;this cycle of glucose → lactate → glucose is the ‘Cori cycle’ [48].13Valuable reviews of the history of research on glycolysis are to be found in the four editions of Harden’s Alcoholic Fermentation[94,95,96,98], Dorothy Needham’s Machina Carnis [177], Fruton’s Proteins, Enzymes, Genes [80] and volume 31 of ComprehensiveBiochemistry by Florkin and Stotz [74].

Figure 3. The catabolism of pyruvate to ethanol by yeasts, or to lactic acid by muscle

Copyright © 2003 John Wiley & Sons, Ltd. Yeast 2003; 20: 509–543.

  26  

Figura 14. Sequência de reações que compõem a glicólise e a fermentação láctica.

8

O

OHOH

OHHO

ATP

ADP

O

OHOH

OHHO

ATP

ADP

OP -O-CH2 CH2O- P

OH

HO

H2C-O- PC=O

H2C-OH

HC=O

HC-OH

H2C-O- P

HOCH2

P -OCH2

O=C-O- P

HC-OH

H2C-O- P

NAD+

NADH

Pi

O=C-O-

HC-OH

H2C-O- P

COO-

HC-O- P

H2C-OH

H2O

COO-

C-O- P

CH2

ATP

ADP

COO-

C=O

CH3

COO-

HC-OH

CH3 NAD+ NADH

OP -O-CH2 CH2OH

OHHO

HO

ATP

ADP

NAD+

NADH

Pi

ATP

ADP

Glicose

Glicose 6-fosfato

Frutose 6-fosfato

ATP

ADP

Frutose 1,6 bisfosfato

Diidroxiacetonafosfato

Gliceraldeído3-fosfato

1,3 Bisfosfoglicerato

3-Fosfoglicerato

2-Fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

PiruvatoLactato

GLICÓLISE

HO

NAD+ NADH

ADPATP

ADPATP

  27  

Todas as reações ocorrem no citosol das células eucarióticas. A glicose não atravessa a membrana celular, entra na célula com auxílio de uma proteína carreadora específica. Imediatamente, é possível notar que: i) a glicólise envolve duas etapas de fosforilação por ATP, formando ADP e fosfato inorgânico (Pi); ii) cada molécula de glicose contendo 6 átomos de carbono é convertida em duas moléculas de ácido pirúvico, mais oxidado; iii) o processo global envolve a formação de 4 moléculas de ATP, ou seja, produção líquida de duas moléculas de ATP; iv) ocorre uma reação de oxido-redução quando gliceraldeído-3-fosfato é convertido em 1,3-bifosfoglicerato, os elétrons são transferidos para a coenzima NAD+ formando NADH.

Vamos analisar estas reações em mais detalhe. Reação 1: Fosforilação de glicose por ATP formando glicose-6-fosfato e ADP. Essa reação é catalisada pela hexoquinase.

Figura 15. Reação de fosforilação da glicose por ATP formando glicose-6-fosfato e ADP. Essa reação é catalisada pela hexoquinase. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = -16.7 kJ.mol-1.

É interessante notar que já no início do século XX era sabido que glicose-6-fosfato (hexose fosfato) não era fermentada ou hidrolisada por leveduras. A explicação para essa observação é que as células não possuem proteínas de membrana transportadores de glicose-6-fosfato (ou frutose 1,6 bifosfato). Portanto, o açúcar fosforilado é incapaz de entrar ou sair da célula.1

A enzima que catalisa esta reação é chamada hexoquinase. Quinases são enzimas que catalisam a adição de um grupo fosforil do ATP para outra molécula. A reação de fosforilação da glicose formando glicose-6-fosfato ilustra um dos aspectos principais do metabolismo: reações endergônicas (que requerem o fornecimento de energia livre para ocorrer) são tornadas espontâneas através do acoplamento com outra reação altamente exergônica (que libera uma grande                                                                                                                1 Note que a célula possui transportadores de glicose (exemplo GLUT1, GLUT2, etc). Estes transportadores são específicos para glicose.

  28  

quantidade de energia livre). A reação entre glicose e fosfato inorgânico (PO4-3)

formando glicose-6-fosfato consome uma grande quantidade de energia e não ocorreria caso não fosse acoplada à reação de hidrólise de ATP: Glicose + Pi à glicose-6-fosfato + H2O ΔG0 = + 13.8 kJ.mol-1

ATP + H2O à ADP + Pi ΔG0 = - 30.5 kJ.mol-1 Glicose + ATP à glicose-6-fosfato + ADP ΔG0 = - 16.7 kJ.mol-1 Evidentemente estas duas reações não ocorrem isoladamente em água, mas uma enzima, a hexoquinase aproxima os reagentes de propicia um ambiente adequado para a reação ocorrer. Da mesma forma, a formação de ATP somente é possível porque está acoplada a outra reação mais exergônica (ver abaixo): Fosfoenolpiruvato + H2O à piruvato + Pi ΔG0 = - 61.9 kJ.mol-1 ADP + Pi à ATP + H2O ΔG0 = + 30.5 kJ.mol-1 Fosfoenolpiruvato + ADP à ATP + piruvato ΔG0 = - 31.4 kJ.mol-1 Logicamente que se as reações de hidrólise de fosfoenolpiruvato e fosforilação de ATP ocorressem isoladamente em água uma não influenciaria a outra. A enzima piruvato kinase liga fosfoenolpiruvato e ADP no seu sítio ativo proporcionando condições para que a reação acoplada ocorra. Reação 2. Isomerização da glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato, catalisada pela enzima fosfoglico isomerase (Figura 16).

Figura 16. Reação de isomerização de glicose-6-fofato, uma aldose, em frutose-6-fosfato, uma cetose. Essa reação é catalisada pela enzima phosphohexose isomerase. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = +1.7 kJ.mol-1, o que indica que a reação é reversível. Reação 3. Fosforilação da frutose-6-fosfato por ATP formando frutose 1,6 bifosfato. Essa reação é catalisada pela enzima fosfofrutoquinase 1 (PFK1, do inglês phosphofructo kinase).

  29  

Figura 17. Reação de fosforilação da frutose-6-fosfato catalisada pela enzima fosfofrutoquinase 1 (PFK1) com o consumo de uma molécula de ATP. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = -14.2 kJ.mol-1. A variação de energia livre envolvida na reação de fosforilação de frutose-6-fosfato catalisada pela fosfofrutoquinase-1 é altamente negativa, indicando que esta é uma reação praticamente irreversível. Reações irreversíveis costumam ser pontos de regulação no metabolismo. A fosfofrutoquinse-1 é uma enzima alostérica e está sujeita à regulação a partir de uma série de fatores alostericos como ATP/ADP e frutose-2,6-bifosfato. A figura 18 mostra a estrutura da PFK1 em complexo com os produtos da reação. A estrutura consiste de duas cadeias polipeptídicas cada qual contendo um sítio ativo e um sítio para ligação do efetor alostérico ADP.

Figura 18. Estrutura tridimensional da PFK1 (PDB PFK1) em complexo com os produtos da reação, frutose 1,6 bifosfato e ADP no sítio ativo, e o ativador alosterico ADP. Esta estrutura mostra duas subunidades da enzima, que é tetramérica. Reação 4. A quarta reação corresponde à clivagem da frutose 1,6 bifosfato em dois compostos de 3 átomos de carbono: gliceraldeido 3-fosfato e di-hidroxi-acetona fosfato (Figura 19):

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Figura 19. Reação de clivagem da frutose 1,6 bifosfato em dois compostos de 3 átomos de carbono, gliceraldeído 3-fosfato e dihidroxiacetona-fosfato. Essa reação é catalisada pela enzima aldolase. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = +23.8 kJ.mol-1. Apesar de que a variação de energia livre envolvida é positiva, nas condições celulares os produtos da reação são rapidamente consumidos o que faz com que o ΔG da reação seja menor e ela torne-se praticamente reversível. Apenas o gliceraldeído-3-fosfato será utilizado para as próximas etapas da glicólise. Com a finalidade de não perder um composto de 3 carbonos, as células produzem uma isomerase (triose-fosfato isomerase – TPI ou TIM), que é capaz de catalisar a reação de isomerização de uma cetose (dihidroxiacetona fosfato) em uma aldose (gliceraldeído-3-fosfato) (Figura 20):

Figura 20. Reação de isomerização entre gliceraldeído-3-fosfato e dihidroxi-acetona-fosfato. A variação de energia livre envolvida é ΔG0 = +7.5 kJ.mol-1. Apesar de que o ΔG0 da reação é positivo, nas condições celulares esta reação também é praticamente reversível. Esta etapa conclui a conversão de uma molécula de glicose em duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato, um composto de 3 átomos de carbono e mais oxidado do que a glicose. Para tanto foi necessário a hidrólise de duas moléculas de ATP formando ADP. As próximas etapas envolvem a oxidação de gliceraldeído-3-fosfato em piruvato, um ácido carboxílico e portanto um composto mais oxidado. A conversão de gliceraldeído-3-fosfato envolverá perda de elétrons (oxidação) e a formação de duas moléculas de ATP (quatro moléculas no computo geral). Reação 5. A reação de oxidação do gliceraldeído-3-fosfato formando 1,3-bifosfo-glicerato (1,3-BPG) é catalisada pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Esta reação depende da presença de uma coenzima, NAD+. Historicamente, NAD+ foi

  31  

chamado de co-fermento ou co-enzima. O papel do NAD como carreador de hidrogênio foi sugerido em torno de 1920, mas a natureza química da coenzima somente foi elucidada nos anos 30. NAD (Figura 21) é um dinucleotídeo de nicotinamida e adenina. Ele funciona como um carreador de átomos de hidrogênio em uma ampla série de reações de oxido-redução ao aceitar um íon hidreto (H-; um próton e 2 elétrons). NAD e NADH são solúveis, e podem mover-se de uma enzima para outra. Reações de oxido-redução:

Figura 21. Estrutura da coenzima nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD) nas formas oxidada (NAD) e reduzida (NADH). Um grande número de enzimas utiliza NAD como co-enzima carreadora de elétrons, catalisando reações nas quais NAD aceita um íon H- do substrato (oxidação) ou doa um íon H- ao substrato (redução). Estas enzimas são chamadas de oxidoredutases ou desidrogenases. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase utiliza a coenzima NAD+ para receber um íon H- do gliceraldeído-3-fosfato que é oxidado a 3-fosfoglicerato formando NADH. O domínio responsável por ligar NAD+ ou NADH é chamado de Rossmann fold. A coenzima NAD (e NADP) é fracamente associada à enzima e pode difundir-se de uma enzima para a outra funcionando como um composto carreador de elétrons solúvel. O NADH formado como resultado da ação da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase difunde-se até encontrar a álcool desidrogenase que promoverá a redução de acetaldeído à etanol durante a fermentação alcoólica:

A reação catalisada pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser compreendida como a soma de dois processos (Figura 22):

  32  

Figura 22. Reação de oxidação e adição de ortofosfato catalisada pela gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Reação 6. A próxima reação envolve a transferência de um grupo fosforil do 1,3-bifosfoglicerato (1,3 BPG) para ADP formando ATP e 3-fosfoglicerato. Essa reação é catalisada pela enzima fosfoglicerato quinase (Figura 23).

Figura 23. Reação catalisada pela fosfoglicerato quinase. A variação de energia livre dessa reação nas condições padrão é ΔG0 = -18.8 kcal.mol-1, no entanto nas condições celulares a reação é reversível com ΔG = + 1.3 kcal.mol-1. Reações 7 a 9: As próximas reações envolverão a conversão de 3-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato, um composto com alto potencial de transferência de um grupo fosforil, e finalmente a piruvato com a concomitante formação de uma molécula de ATP (Figura 24):

  33  

Figura 24. Reações de isomerização de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato (ΔG0 = +4.6 kJ.mol-1); de desidratação de 2-fosfoglicerato formando uma dupla ligação e o composto fosfoenolpiruvato (ΔG0 = +1.7 kJ.mol-1); e de transferência de um grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP formando ATP e piruvato (ΔG0 = -31.4 kJ.mol-

1). É interessante notar que a reação de transferência do grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP é extremamente favorável. Uma explicação para essa observação é que a forma enólica do piruvato é altamente instável e converte-se espontaneamente para a forma cetônica, piruvato. A reação completa da quebra de glicose em duas moléculas de piruvato é:

Esta reação envolve uma variação de energia livre da ordem de ΔG0 = -73.1 kJ.mol-1, e resulta na formação de duas moléculas de ATP e na redução de duas moléculas de NAD+. Esse processo poderia seguir indefinidamente não fosse o fato de que a disponibilidade de NAD+ na célula é finita. Conforme já discutido acima, em condições anaeróbicas, o piruvato é reduzido a lactato (células musculares) ou a etanol (levedura) regenerando NAD+. Esse processo é conhecido como fermentação (Figura 25):

  34  

Figura 25. Reações enzimáticas que ocorrem nas células de levedura ou do músculo durante a fermentação e levam à regeneração de NAD+. A eficiência da glicólise expressa em termos de conversão de energia armazenada na forma de glicose para moléculas de ATP é muito baixa. A fermentação alcoólica gera um total de -235 kJ.mol-1 de glicose (-196 kJ.mol-1 para a fermentação láctica) sendo que aproximadamente 61 kJ.mol-1 de energia livre são necessários para a síntese de duas moléculas de ATP. Ou seja, apenas 1/3 da energia liberada pela fermentação é utilizada para a síntese de ATP. O resto é dissipado na forma de calor ! À medida em que as reações da fermentação foram sendo elucidadas, outros bioquímicos voltaram sua atenção ao metabolismo aeróbico em levedura (após 1930). Na presença de oxigênio, as células são capazes de oxidar a glicose completamente a CO2 e H2O extraindo muito mais energia e formando um número muito maior de moléculas de ATP a partir de uma única molécula de glicose. Este processo é conhecido por respiração celular, e envolve duas vias metabólicas que vamos discutir em detalhes: o ciclo de Krebs ou ciclo do ácido cítrico, a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa. Uma das principais diferenças entre a glicólise, o ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa é que enquanto a primeira via metabólica ocorre no citoplasma da célula, as duas outras ocorrem dentro da mitocôndria. Esta diferença de compartimentos irá auxiliar a regulação das duas vias.

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Glicólise exercícios

1. Complete o mapa metabólico mostrado na Figura 14 indicando quais são as enzimas responsáveis por catalisar cada reação, os efetuadores alostericos e o número de carbonos de cada metabolito.

2. Responda: i) Quais os passos irreversíveis que aparecem no mapa? ii) Quantas moléculas de piruvato se formam a partir de uma molécula de

glicose? iii) Qual hexose da origem a trioses? iv) Indicar as reações de oxido-redução que aparecem no mapa. v) Sabendo-se que a concentração celular de NAD+ é da ordem de 10-5M, é

possível estimar a quantidade de glicose que pode ser convertida a lactato? vi) Verificar no mapa os compostos que apresentam ligações do tipo:

a) fosfoenol b) anidrido fosfórico c) éster fosfórico

vii) Identificar no mapa as reações catalisadas pelas seguintes enzimas a) quinase b) mutase c) isomerase d) aldolase e) desidrogenase 3) Considerando-se o número de moléculas de ATP consumidas e formadas, estabelecer o saldo final de ATP na oxidação de uma molécula de glicose pela via glicolítica 4) Qual a porcentagem de energia que a célula armazena, a partir de um mol de glicose, pela sua degradação através da via glicolítica? Sabe-se que: Glicose à Lactato ΔG0’ = -195 kJ/mol 5) Citar os compostos que devem ser fornecidos à via glicolítica para: a) iniciá-la (haver formação de lactato) b) mantê-la em funcionamento 6) Indicar a função da via glicolítica    

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Ciclo de Krebs O ciclo de Krebs é uma espécie de ponto de encontro metabólico da célula. Todas as moléculas que podem ser convertidas em um grupo acetil ou em intermediários do ciclo podem ser aproveitadas e oxidadas completamente a CO2 gerando elétrons (na forma de NADH ou FADH2) que depois serão transferido ao oxigênio pela fosforilação oxidativa gerando água e promovendo a síntese de ATP (vide infra). De forma geral, o ciclo de Krebs oxida o grupo acetil da Acetil-CoA em duas moléculas de CO2 com a geração concomitante de três NADHs, um FADH2 e um GTP.

O piruvato gerado pela via glicolítica é transportado para dentro da mitocondria por um carreador específico. Na matriz mitocondrial, o piruvato será descarboxilado oxidativamente pelo complexo piruvato desidrogenase gerando um grupo acetil. Este grupo acetil é ativado por esterificação com a Coenzima-A, formando o grupo acetil-CoA. Este é o ponto de partida para entrada no ciclo de Krebs (Figura 26):

Figura 26. Destino do piruvato que entra na mitocôndria. A primeira reação do ciclo de Krebs envolve a condensação de um grupo acetil proveniente do piruvato, com oxaloacetato, formando citrato. Para que esta reação possa ocorrer, o grupo acetil precisa ser ativado pela ligação à Coenzima A. A elucidação da estrutura da Coenzima-A e a comprovação de que o grupo acetil precisa ser ativado para reagir com oxaloacetato formando citrato foram fundamentais para a elucidação das reações do ciclo de Krebs. O complexo piruvato desidrogenase catalisa a reação de descarboxilação oxidativa do piruvato, transferindo um par de elétrons para o NAD+ e gerando acetil-CoA (Figura 27):

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Figura 27. Reação de descarboxilação oxidativa de piruvato formando NADH e um radical acetil ativado através da ligação com a Coenzima A (acima). Estrutura molecular da Coenzima A (abaixo). Esta reação é irreversível como indica a descarboxilação. O complexo piruvato desidrogenase é formado por três enzimas que promovem a descarboxilação e oxidação do piruvato formando um grupo acetil, e promovem ainda a reação de condensação entre o grupo acetil e o grupo sulfidril da Coenzima-A gerando, através de uma ligação tio-éster, Acetil-CoA (Figura 28). Uma das co-enzimas importantes nesse processo chama-se FAD, um grupo prostético associado fortemente a uma das enzimas do complexo piruvato desidrogenase e que aceita um um par de elétrons (dois prótons e dois elétrons) assumindo a forma reduzida, FADH2 (Figura 29). As enzimas associadas a um grupo FAD são chamada de flavoproteínas. Ao contrário do NAD, o FAD associa-se fortemente à enzima e é incapaz de difundir-se livremente em solução.

Figura 28. Sequência de reações promovidas pelo complexo piruvato desidrogenase.

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Figura 29. Estrutura do grupo prostético FAD na forma oxidada (esquerda) e na forma reduzida, FADH2 (direita). A formação de Acetil-CoA é o ponto de partida para a entrada de piruvato no ciclo de Krebs. As reações seguintes envolvem a condensação de Acetil-CoA com oxaloacetato formando citrato, um composto de 6 átomos de carbono. Essa reação é catalisada pela enzima citrato sintase (Figura 30). Em seguida, o citrato sofre uma reação de isomerização que altera a posição do radical OH. Essa reação de isomerização que é realizada através de uma desidratação seguida de uma hidratação, é catalisada pela enzima aconitase (Figura 30). A posição do radical OH no carbono-2 do isocitrato permite a próxima reação, que é a descarboxilação oxidativa do isocitrato formando alfa-cetoglutarato. Os elétrons do átomo de carbono que é oxidado são transferidos para NAD+ formando a coenzima reduzida NADH. Note que nesta reação de descarboxilação, o átomo de carbono que é eliminado na forma de CO2 não pertence ao grupo Acetil-CoA (Figura 30).

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Figura 30. As três primeiras reações do ciclo de Krebs. A entrada de Acetil-CoA no ciclo da-se pela condensação com oxaloacetato (um alfa-ceto ácido) formando citrato. Em seguida o citrato sofre uma isomerização formando isocitrato, que é oxidado e descarboxilado gerando alfa-cetoglutarato.

O alfa-cetoglutarato sofre uma reação de descarboxilação oxidativa catalisada pelo complexo alfa-cetoglutarato desidrogenase, gerando succinil-CoA e outra molécula de NADH. Note que succinil-CoA é um composto de 4 átomos de carbono (Figura 31). A hidrólise de succinil-CoA a succinato libera uma grande quantidade de energia livre, que é mais do que suficiente para permitir a fosforilação de GDP formando GTP, o único nucleotídeo trifosfato formado pelo ciclo de Krebs (Figura 31).

Figura 31. Reações de descaboxilação oxidativa do alfa-cetoglutarato formando succinil-CoA, e de hidrólise do succinil-CoA gerando succinato. Esta última reação é acoplada à fosforilação de GDP gerando GTP.

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Succinato é um composto de 4 átomos de carbono que deve ser oxidado a oxaloacetato. A forma para fazer isso é primeiro oxidar succinato a fumarato gerando FADH2, seguido de uma reação de hidratação que forma malato, este por sua vez pode ser oxidado a oxaloacetato completando o ciclo de Krebs e gerando a terceira molécula de NADH (Figura 32). A enzima succinato desidrogenase distingui-se das outras enzimas do ciclo de Krebs pois utiliza FAD como grupo aceptor de elétrons, além disso ela esta embebida na membrana mitocondrial interna onde ocorrem as reações da cadeia de transporte de elétrons. Dessa forma, a succinato desidrogenase faz o link entre o ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa responsável pela formação de ATP.

Figura 32. Motivo de três reações necessárias para oxidar succinato a oxaloacetato. Este motivo consiste de uma reação de oxidação catalisada pela enzima succinato desidrogenase, seguido de uma reação de hidratação catalisada pela enzima fumarase e outra oxidação que finalmente converte malato em oxaloacetato. Duas coenzimas reduzidas são produzidas neste processo, FADH2 e NADH. Olhando estas reações de forma global, vemos que elas perfazem um ciclo em que uma unidade de dois carbonos entra (Acetil-CoA) e sai completamente oxidada na forma de duas moléculas de CO2. Note que os átomos de carbono da Acetil-CoA somente irão sair na forma de CO2 após a quarta volta no ciclo. A cada volta, são formadas coenzimas reduzidas NADH e FADH2 (Figura 33). Seguramente, o ciclo pode ser alimentado por unidades de Acetil-CoA provenientes da quebra de glicose pela via glicolítica, ou provenientes de outras vias metabólicas como a oxidação de ácidos graxos e a degradação de certos aminoácidos. Subprodutos do metabolismo também podem alimentar o ciclo de Krebs, como succinato ou oxaloacetato provenientes do metabolismo de aminoácidos, assim como o ciclo de Krebs também fornecerá esqueletos de carbono para outras reações biossintéticas.

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Figura 33. Visão global do ciclo de Krebs. O tipo de cada reação está indicado em vermelho. Os compostos que depois serão úteis para a síntese de ATP estão indicados em azul.

A reação global do ciclo de Krebs é mostrada abaixo. Note que a oxidação completa de uma molécula de glicose a CO2 pela via glicolítica e pelo ciclo de Krebs leva à formação de duas moléculas de ATP, duas moléculas de GTP, 6 moléculas de NADH e duas moléculas de FADH2.

Qual é o destino dos elétrons de alta energia contidos em NADH e FADH2? Esses elétrons serão transferidos para a cadeia de transporte de elétrons e depois finalmente transferidos para uma molécula de oxigênio que será reduzida formando

C4oxaloacetato

C2acetil-CoA

C6citrato

condensação

C6isocitrato

C5α-cetoglutarato

CO2NADH

C4Succinil-CoA

CO2NADH

C4Succinato

GTP

C4Fumarato

C4Malato

FADH2

H2O

NADHisomerização

descarboxilaçãooxidativa

descarboxilaçãooxidativa

hidróliseoxidação

hidratação

oxidação

Ciclo de Krebs

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água. Um gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndria é gerado à medida em que os elétrons são transportados pela cadeia de transporte de elétrons. Esse gradiente será utilizado para promover a síntese de ATP. Exercícios sobre o ciclo de Krebs

1. Desenhe o ciclo de Krebs, indique as enzimas que catalisam cada reação. Comece a partir de Acetil-CoA

2. Na oxidação de uma molécula de acetil-CoA no ciclo de Krebs, indicar a enzima que catalisa a reação onde há produção ou consumo de:

a) CO2 b) GTP c) NADH d) FADH2 e) H2O

3. Indicar o composto rico em energia do ciclo de Krebs e a reação que o produz 4. Citar as vitaminas que participam do ciclo de Krebs 5. Indicar a localização do ciclo de Krebs 6. Na reação catalisada pela aconitase indicar o composto predominante no

equilíbrio 7. Esquematizar a reação catalisada pela piruvato carboxilase e citar o seu

efetuador alostérico 8. Citar as funções do ciclo de Krebs 9. Mostras as consequências metabólicas da ativação da piruvato carboxilase por

acetil-CoA 10. Descrever a regulação do ciclo de Krebs em função das relações ATP/ADP e

NAD+/NADH 11. Relacionar a velocidade da via glicolitica com a atividade da isocitrato

desidrogenase

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Fosforilação oxidativa Glicose é completamente oxidada a CO2 através das reações da via glicolítica e do ciclo de Krebs. Os elétrons retirados da glicose são utilizados para reduzir O2 formando H2O culminando o fim do processo oxidativo. Fosforilação oxidativa é o processo pelo qual ATP é formado como resultado de uma série de reações de transferência de elétrons das coenzimas reduzidas NADH e FADH2 para O2 formando H2O. As moléculas carreadoras de elétrons são proteínas de membrana localizadas na membrana interna da mitocôndria e formam a cadeia de transporte de elétrons. O fluxo de elétrons através dos carreadores provoca a saída de prótons da matriz mitocondrial para o espaço inter-membrana. A distribuição desigual de H+ nos dois lados da membrana interna gera um gradiente de pH e uma diferença de potencial elétrico através da membrana interna. O retorno dos íons H+ para a membrana interna através de uma proteína transportadora de H+ (ATP sintase) é altamente exergônico (ΔG << 0). Essa variação de energia livre será suficiente para tornar termodinamicamente favorável a reação de síntese de várias ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico pelo complexo ATP-sintase (Figura 34). A mitocôndria possui duas membranas: membrana interna e membrana externa. O compartimento interno, delimitado pela membrana interna, é chamado de matriz mitocondrial. A matriz contém todas as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas que catalisam a oxidação de ácidos graxos. A membrana interna contém 75% de proteínas em massa. Todas as enzimas envolvidas na cadeia de transporte de elétrons estão localizadas na membrana interna, bem como uma série de proteínas transportadoras para permitir a entrada de metabólitos essenciais na matriz. Entre estes metabolitos encontra-se NADH produzido no citosol durante a glicólise. A membrana interna também contem um transportador de ADP/ATP, de forma que o ATP produzido na matriz possa ser transportado onde ele será utilizado para fornecer energia para outros processos celulares.

Figura 34. Elétrons provenientes das coenzimas reduzidas NADH e FADH2 (provenientes do ciclo de Krebs) são transferidos para as proteínas carreadoras da cadeia de transporte de elétrons através de uma série de reações de oxido-redução. Estes elétrons são utilizados para reduzir O2 formando H2O. O fluxo de elétrons

I II III IV

H+ H+ H+

NADH NAD+FADH2FAD O2 H2O

matriz

espaço inter-membrana

H+

H+

ADP + Pi ATP

e-

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através dos carreadores é acoplado ao transporte de prótons através da membrana, gerando uma força próton-motriz que é suficiente para promover a síntese de ATP pela enzima ATP-sintase. Vamos ver detalhes sobre como funciona a cadeia de transporte de elétrons. A direção do equilíbrio de uma reação química deve ser examinada de acordo com a variação de energia livre envolvida na reação. No caso de reações de oxidoredução, DG depende da diferença de potencial de oxidoredução da seguinte forma:

ΔG0 = -nFΔE0 onde DE é proporcional à afinidade por elétrons do substrato oxidado. Por exemplo, considere as duas meias reações de oxidoredução: (1) 2H+ +1/2 O2 + 2e- à H2O E0 = +0.82 V (2) NAD+ + H+ + 2e- à NADH E0 = -0.32V Claramente, como o oxigênio possui maior potencial de redução ele irá oxidar o NADH. Dessa forma, o NADH será doador e o O2 acceptor de elétrons e a reação global deve ser escrita como: No caso da transferência de elétrons de NADH e FADH2 para o O2, é possível calcular a variação de energia livre através da diferença de potencial de redução envolvida. Por exemplo, os potenciais de redução de oxigênio e NAD+ são dados por: (1) 2H+ +1/2 O2 + 2e- à H2O E0 = +0.82 V (2) NADH à NAD+ + H+ + 2e- E0 = +0.32V A soma das duas meias reações resulta: (3) H+ +1/2 O2 + NADH à NAD+ + H2O ΔE0 = +0.82 +0.32 = +1.12V Considerando-se que a variação de energia livre envolvida em uma reação de oxido-redução é dada por:

∆𝐺! = −𝑛𝐹∆𝐸 onde n é o número de elétrons envolvido, F é a constante de Faraday e ΔE é a diferença de potencial de redução, a variação de energia livre envolvida na reação de redução de oxigênio por NADH é:

∆𝐺! = −𝑛𝐹∆𝐸 = −2 96.48  𝑘𝐽𝑚𝑜𝑙!!𝑉!! 1.12𝑉 = −220.1  𝑘𝐽𝑚𝑜𝑙!! Considerando-se que para sintetizar uma molécula de ATP a partir de ADP e Pi (PO4

-3) são necessários 30.5 kJ/mol, se acoplada à síntese de ATP, a oxidação do NADH fornecerá energia suficiente para a síntese de vários mols de ATP. Este acoplamento é realizado pelos componentes da chamada cadeia de transporte de elétrons, centros redox com afinidades crescentes por elétrons, ao invés de transferir os elétrons diretamente para o O2 (Figura 34).

A quantidade de energia livre liberada a partir da transferência de elétrons para o O2 é inicialmente utilizada para criar um gradiente de H+ através da membrana

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interna da mitocôndria (Figura 34). A fim de calcular qual é a variação de energia livre associada ao transporte de prótons para fora da matriz podemos fazer:

∆𝐺 = 𝑅𝑇𝑙𝑛 [!]!"#$[!]!"#$%&

+ 𝑛𝐹∆𝐸 (4) Em condições típicas, o pH no espaço inter-membrana é 1.4 unidades menor do que na matriz mitocondrial, portanto 𝑙𝑜𝑔 [!]!"#$

[!]!"#$%&= 1.4 , ΔE = 0.14V e Z=+1 (H+).

Considerando-se a temperatura como 310K, e substituindo-se os valores na equação acima encontramos que ΔG para mover um H+ para fora da matriz é 21.8 kJ.mol-1. Portanto a redução de O2 por uma molécula de NADH produzirá energia suficiente para o transporte de vários íons H+ para fora da matriz mitocontrial. O retorno de H+ para dentro da matriz e a síntese de ATP são acoplados pela enzima ATPsintase (Figura 35). A oxidação de um NADH resulta em 2.5 ATPs, enquanto que a oxidação de um FADH2 resulta em 1.5 ATP.

Figura 35. Estrutura da ATP-sintase. Considerando-se que estes valores estão corretos podemos estimar a quantidade de moléculas de ATP geradas a partir da oxidação completa de uma molécula de glicose a CO2 e H2O: [8NADH/Glicose (Krebs) + 2NADH/Glicose (glicólises)]x2.5 ATP/NADH + [2FADH2/Glicose]x1.5ATP/FADH2 + 2ATP/Glicose (Krebs) + 2ATP/Glicose (glicólise) = 32 ATP/Glicose.

F0

F1

AxleStator

doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2005_12

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Exercícios sobre fosforilação oxidativa

1. Citar os compostos que fazem parte da cadeia de transporte de elétrons 2. Esquematizar a sequência dos complexos da cadeia, indicando os

transportadores de elétrons, os transportadores de prótons e elétrons, bem como o composto doador dos elétrons

3. Citar a localização celular da cadeia de transporte de elétrons 4. Citar 3 inibidores da cadeia de transporte de elétrons, indicando os complexos

sobre os quais atuam 5. Os compostos seguintes, localizados na membrana interna da mitocôndria,

fazem parte de uma cadeia que transfere elétrons do NADH (E0’ = -0,315 V) para o oxigênio molecular, O2 (E0’ = +0,815 V): Coenzima Q (E0’ = +0,04 V) Citocromo a-a3 (E0’ = +0,55 V) Citocromo b (E0’ = +0,06 V) Citocromo c (E0’ = +0,235 V) Citocromo c1 (E0’ = +0,215 V) Os potenciais de óxido-redução destes compostos dão alguma indicação sobre a sequência que eles se encontram na cadeia de transporte de elétrons?

03. Uma suspensão de mitocôndrias foi incubada em diferentes condições, medindo-se a formação de NAD+,, o consumo de oxigênio, a produção de ATP, e a diferença de pH entre o interior e o exterior da organela. Os resultados encontrados estão apresentados na tabela abaixo:

Tubo Condição NAD+ Consumo de O2

Produção de ATP

ΔpH

1 Com NADH +++ +++ +++ 1.4 2 Com NADH e

droga A +++ +++ 0

3 Sem NADH 0 4 Com NADH e

pH externo mantido constante

+++ +++ 0

5 Sem NADH mas mantendo ΔpH

+++ 1.4

a. Verificar se é possível: a1. oxidação de NADH sem síntese de ATP. a2. oxidação de NADH sem consumo de oxigênio. a3. consumo de oxigênio sem síntese de ATP. a4. consumo de oxigênio sem formação de gradiente de H+. a5. consumo de oxigênio sem oxidação de NADH.