purificação e determinação estrutural de substâncias bioativas...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Química
Coordenação de Pós-graduação em Química Orgânica
Purificação e Determinação Estrutural de Substâncias Bioativas em Três Espécies de Osteocephalus
(Amphibia:Anura:Hylidae)
TÚLIO DE ORLEANS GADELHA COSTA
Orientadores: Prof° Dr. Angelo da Cunha Pinto (UFRJ/IQ)
Prof° Dr. Carlos Bloch Júnior (Embrapa/Cenargen-BSB)
Rio de Janeiro 2005
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Purificação e Determinação Estrutural de Substâncias Bioativas em Três Espécies de Osteocephalus
(Amphibia:Anura:Hylidae)
TÚLIO DE ORLEANS GADELHA COSTA
Orientadores: Prof° Dr. Angelo da Cunha Pinto (UFRJ/IQ)
Prof° Dr. Carlos Bloch Júnior (Embrapa/Cenargen-BSB)
Rio de Janeiro 2005
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FOLHA DE APROVAÇÃO
Purificação e Determinação Estrutural de Substâncias Bioativas em Três
Espécies de Osteocephalus (Amphibia:Anura:Hylidae)
TÚLIO DE ORLEANS GADELHA COSTA
Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor. Aprovada por:
Prof. Dr. Angelo da Cunha Pinto - Orientador
Prof. Dr. Carlos Bloch Júnior - Orientador
Prof. Dr. Carlos Roland Kaiser - Membro
Profa. Dra Claudia M. Rezende - Membro
Prof. Dr. Elias Walter Alves - Membro
Prof. Dr. Gilberto B. Dumont - Membro
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Costa, Túlio de Orleans Gadelha.
Purificação e Determinação Estrutural de Substâncias Bioativas em Três Espécies de Osteocephalus (Amphibia:Anura:Hylidae)/Túlio de Orleans Gadelha Costa.
Rio de Janeiro: UFRJ, 2005. xxxi, 201p.
Tese de Doutorado em Ciencias – Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2005. Orientadores: Angelo da Cunha Pinto e Carlos Bloch Júnior.
1. Anfíbio 2. Osteocephalus 3. Peptídeo I. Título
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Aos meus pais, Altemir e Erycéa, a minha avó, Nathércia (In memoriam), a minha adorável esposa, Andréia e ao meu amado filho, Victor.
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“Assim como falham as palavras quando querem exprimir qualquer
pensamento, assim falham os pensamentos quando querem exprimir
qualquer realidade.”
Fernando Pessoa
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Agradecimentos
Ao Prof° Dr. Angelo da Cunha Pinto, por fazer parte da sua “escola” desde 1993, da qual me orgulho. Ao Prof° Dr. Carlos Bloch Júnior, pelo incentivo e oportunidade na iniciação de trabalhar com anfíbios. Ao Professor MSc. Marcelo Gordo pelo primeiro contato com anfíbios, agora uma paixão. À Universidade Federal do Amazonas-Propesp/Diretória de Pós-Graduação, pelo Programa de Capacitação de docentes. Aos Professores Dr. Luis Juliano e Dra. Maria Aparecida Juliano e sua equipe do Departamento de Biofísica da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo, EPM/UNIFESP, pela síntese do peptídeo Ota 09. Ao amigo Luciano Ptzer que fez a ponte para a colaboração com a EPM/UNIFESP. Ao amigo, Janderson Brito ex-bolsista de iniciação científica Embrapa-Cenargen/UNB, pela contribuição na parte experimental desta tese. Aos professores do Departamento de Química da Universidade Federal do Amazonas, em especial aos Professores Ayssor Paulo Mourão, Jefferson Rocha, Kelson Mota e Maria Lúcia Belém Pinheiro. Aos professores do Instituto de Química/UFRJ: Claudia Moraes de Rezende, Simon J. Garden, Marcio Contrucci Saraiva, Joel Jones Jr, Warner Bruce Kover, Edson Luiz da Silva, pelos conhecimentos transmitidos, de grande importância para minha formação acadêmica. À Nádia e ao Pedro da Secretaria do Curso de Pós-Graduação em Química Orgânica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pelo prestimoso atendimento às inúmeras solicitações.
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Aos amigos, Anderson e Fred, pelo convívio, principalmente, nos primeiros meses de Rio de Janeiro, onde a saudade de Manaus era grande. Ao amigo Ricardo Coelho, pelo seu grande espírito de companheirismo. É sem dúvida um grande agregador. Aos colegas do laboratório LEM-Embrapa/Cenargen-Brasília, Natacha, Jorge, Janderson, Rodrigo, Maura, Lindomar, Ribamar Júnior, Beatriz, Clarisse, Fernanda, Mariama, Mariana, Guilherme, Zé e Bilu, pela paciência na iniciação das técnicas de purificação, identificação e sequenciamento de peptídeos e pela convivência. Aos colegas do laboratório 621 do Instituto de Química/Universidade Federal do Rio de Janeiro, Júnior (Valdir), Adriana, Marilza, Rita, Tereza, Núbia e André pela convivência. Ao jovem casal, Vanja e Marco, que me recebeu em seu apartamento na minha primeira ida a Brasília. Ao amigo, Luis Lozano, que tantas vezes me recebeu em seu “apertamento” e que tinha que dormir ouvindo meus sonoros roncos. A amiga, Edileuza, pela hospedagem e agradáveis conversas nas caminhadas pelas arborizadas alamedas de Brasília. A Túlia, Rubens, Victória e Nathália que depois que foram morar em Brasília meus dias foram mais tranqüilos. A todos que direta ou indiretamente ajudaram na realização deste trabalho.
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Abreviações e Símbolos
δ Deslocamento químico α-ciano Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico µL Microlitro AMPS Peptídeos Antimicrobianos BTX Batracotoxina CL Cromatografia Líquida CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência ESI/MS Electrospray Mass Spectrometry COSY Correlation Spectroscopy d Dubleto dd Duplo-dubleto Da Dalton DHB Ácido diidrobenzóico DHQ Decaidroquinolina EM Espectrometria de Massa eV EletronVolt FR Fase Reversa g Grama HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography IV Infravermelho kv Quilovolt M Molar m/z Massa/carga M + H+ Massa + próton MALDI-TOF Matrix Assited Laser Desorption Ionization- Time of Flight PSD Post Sourse Decay PTX Pumiliotoxina RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13C RP Reverse Phase (Fase Reversa) t Tripleto TFA Ácido trifluoroacético TRH Hormonio Liberador de Tireotropina TR Tempo de retenção TTX Tetrodotoxina UV Ultravioleta
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Aminoácidos
Nome 1 / 3 letras Massa Estrutura Alanina A / Ala 71,08
Arginina R / Arg 156,20
Asparagina N / Asn 114,10
Ácido Aspártico D / Asp 115,10
Ác. Glutâmico E / Glu 129,05
Cisteína C / Cys 103,10
Fenilalanina F /Phe 147,20
Glicina G / Gly 57,05
Glutamina Q / Gln 128,10
Histidina H / His 137,05
Isoleucina I / Ile 113,20
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O
NH2
CH3OH
NH
O
NH
NH2
NH2
OH
O
O
NH2
NH2
OH
O
NH2
OH
O
NH2OH
O
O
NH2
NH2
OH
O
NH2
NH
N
OH
O
NH2
CH3
CH3OH
OHOH
NH2O
O
O O
OHOH
NH2
O
NH2
SH OH
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Leucina L / Leu 113,20
Lisina K / Lys 128,09
Metionina M / Met 131,20
Prolina P / Pro 97,12
Serina S / Ser 87,08
Tirosina Y / Tyr 163,20
Treonina T / Thr 101,10
Triptofano W / Trp 186,20
Valina V / Val 99,07
NH2
CH3
CH3
OH
NH2
NH2OH
O
NH2
SCH3 OH
O
NH
OH
O
NH2
OH OH
O
NH2OH
OH
O
NH2
OH
CH3
OH
O
NH2NH
OH
O
NH2
CH3
CH3 OH
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Índice de Figuras Figura 1- Densidade de Espécies de Anfíbio por País .......................................... 22 Figura 2- Distribuição Global de Anfíbios. ............................................................. 24 Figura 3 - Biossíntese das Indolalquilaminas de pele de anfíbios. ........................ 31 Figura 4- Estruturas de indolalquilaminas bioativas. ............................................. 33 Figura 5- Biossíntese das imidazolalquilaminas de pele de anfíbios.................... 34 Figura 6- Biossíntese e estruturas das hidroxifenilalquiaminas de anfíbios .......... 37 Figura 7- Exemplos de alcalóides de acordo com o precursor.............................. 41 Figura 8- Estruturas básicas (I e II) e exemplos das batracotoxinas de anfíbios... 45 Figura 9- Exemplos das indolizidinas isoladas de anfíbios. .................................. 47 Figura 10- Estruturas de Pumiliotoxina isoladas de anfíbios ................................. 50 Figura 11- Estruturas de cis-decaidroquinolinas. .................................................. 51 Figura 12- Estrutura da epibatidina e análogos sintéticos. .................................... 53 Figura 13- Tetrodotoxina e derivados isolados de fonte naturais .......................... 57 Figura 14- Estruturas de algumas histrionitoxinas................................................. 58 Figura 15- Estruturas da Gephyrotoxina e diidroGephyrotoxina ........................... 59 Figura 16- Estruturas básicas dos esteróides ....................................................... 61 Figura 17- Estruturas básicas dos cardenolídeos e bufadienolídeos. ................... 63 Figura 18- Estruturas das bufogeninas e seus derivados. .................................... 64 Figura 19- Esteróides não cardiotônicos isolados de anfíbios............................... 65 Figura 20- Proteínas e Peptídeos Bioativas. ......................................................... 68 Figura 21- Formação das Angiotensinas............................................................... 87 Figura 22- Distribuição Geográfica das Espécies do Gênero Osteocephalus. ...... 93 Figura 23- Osteocephalus taurinus ....................................................................... 94
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Figura 24- Osteocephalus oophagus .................................................................... 95 Figura 25- Osteocephalus langsdorffii ................................................................... 96 Figura 26- Obtenção das secreções por estimulação elétrica............................... 99 Figura 27- Fragmento de íons observados em espectro de EM/EM. .................. 104 Figura 28- Fluxograma dos processos realizados nos extratos EXTTA, EXTOO e EXTLA................................................................................................................. 110 Figura 29- Espectro de massas do extrato total de O. taurinus........................... 112 Figura 30- Espectro de massas do extrato total de O. oophagus........................ 113 Figura 31- Espectro de massas do extrato total de O. langsdorffii. ..................... 114 Figura 32– Cromatograma do extrato total da secreção da pele de O. taurinus . 116 Figura 33 – Cromatograma do extrato total da secreção de O. oophagus .......... 117 Figura 34– Cromatograma do extrato total da secreção de O. langsdorffii ......... 117 Figura 35- Cromatogramas dos extratos EXTTA (Ota 06), EXTOO (Oop 06) e EXTLA (Ola 06). .................................................................................................. 118 Figura 36- Cromatorama (CLAE) da fração ota 06.............................................. 119 Figura 37- Espectro de IV da fração ota 06......................................................... 121 Figura 38- Espectro de UV da fração ota 06 ....................................................... 121 Figura 39- Espectro de RMN de 1H de ota 06 ..................................................... 122 Figura 40- Expansão do espectro de RMN de 1H de ota 06................................ 123 Figura 41- Expansão do espectro de RMN de 1H de ota 06 ............................... 123 Figura 42- Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H -COSY de ota 06 . ................................................................................................................ 124 Figura 43- Expansão do espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H –COSY. ............................................................................................................... 124 Figura 44- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC de Ota 06.................................................................................................................. 125
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Figura 45- Expansão do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC de Ota 06 ......................................................................................... 126 Figura 46- Espectros de ESI-MS e ESI-EM/EM da amostra ota 06. .................. 128 Figura 47- Fragmentação da cadeia lateral da bufotenina. ................................. 129 Figura 48- Espectro de ESI-EM/EM da fração oop 06. ....................................... 130 Figura 49- Espectro de ESI-EM/EM da fração ola 06......................................... 131 Figura 50- Cromatograma (CLAE) de ota 08....................................................... 134 Figura 51- Espectro de massas MALDI-TOF da fração ota 08............................ 135 Figura 52- Espectro de massa MALDI-TOF da fração ota 08 alquilada. ............. 136 Figura 53- Espectro de fragmento tríptico de ota 08 . ......................................... 137 Figura 54- Sensograma de interação de ota 08 com tripsina . ............................ 138 Figura 55- Cromatograma (CLAE) de ota 09....................................................... 141 Figura 56- Espectro de massas MALDI-TOF/MS da fração ota 09 . ................... 142 Figura 57- Espectro de fragmentação EM/EM do íon 1706,48 (m/z) . ................ 143 Figura 58 – Espectro EM/EM do peptídeo sintético ota 09.................................. 145 Figura 59- Espetros de massas de ota 09 (M), M+Li, M+Na e M+K.................... 147 Figura 60- Peptídeo ota 09 + Metal ..................................................................... 160 Figura 61- Espectros de massas de ota 09, Ota 09 + Ca, Ota 09 + Fe e Ota 09 + Co........................................................................................................................ 161 Figura 62- Espectros de massas de ota 09, Ota 09 + Cd, Ota 09 + Cu e Ota 09 + Ni......................................................................................................................... 162 Figura 63- Cromatorama (CLAE) da fração ota 18.............................................. 168 Figura 64- Espectro de massas MALDI-TOF da fração ota 18 ........................... 169
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Índice de Tabelas
Tabela 01- Exemplos de compostos com atividades farmacológicas de anfíbios . 28 Tabela 02– Avaliação da ação farmacológica da bufotenina ................................ 32 Tabela 03- Diferentes classes de alcalóides de acordo com o precursor ............. 40 Tabela 04– Distribuição de batracotoxinas em espécies de Phyllobates .............. 44 Tabela 05– Toxicidade da Batracotoxina e vários análogos naturais e sintéticos. 44 Tabela 06- Exemplos de TTX e derivados identificados em anuros...................... 56 Tabela 07- Taquicininas de diferentes origens...................................................... 73 Tabela 08- Taquicininas aromáticas isoladas de anfíbios .................................... 73 Tabela 09- Taquicininas alifáticas isoladas de anfíbios......................................... 73 Tabela 10- Exemplos de Bradicininas isoladas de anfíbios .................................. 74 Tabela 11- Exemplos de Ceruleínas isoladas de anfíbios..................................... 75 Tabela 12- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Bombesina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-His-Leu-Met-NH2 isoladas de anfíbios ...................................... 78 Tabela 13- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Litorina-Ranatensina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-His-Phe-Met-NH2 isoladas de anfíbios........................ 78 Tabela 14- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Filolitorina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-Ser-Phe(Leu)-Met-NH2 isoladas de anfíbios............................. 78 Tabela 15- Exemplos de Sauvaginas.................................................................... 80 Tabela 16- Exemplos de Dermorfinas (µ-seletiva) isoladas de anfíbios................ 82 Tabela 17- Exemplos de Deltorfinas (δ-seletivas) isoladas de anfíbios................. 82 Tabela 18- Exemplos de alguns membros da família Xenopsina/Neurotensina.... 84 Tabela 19- Exemplos de Triptofilinas isoladas de anfíbios.................................... 86 Tabela 20- Estrutura da adenoregulina e da dermaseptina................................... 88
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Tabela 21- Exemplos de alguns Peptídeos Antimicrobianos de anfíbios .............. 91 Tabela 22- Principais características dos recentes Peptídeos Antimicrobianos ... 91 Tabela 23- N° de individuos e local de coleta das espécies de Osteocephalus .... 98 Tabela 24- Extratos obtidos por estimulação elétrica de O. taurinus- EXTTA..... 100 Tabela 25- Frações da Cromatografia (CLAE) do Extrato EXTTA ...................... 115 Tabela 26- Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C da fração 0ta 06.......... 126 Tabela 27- Fragmentos confirmados da Fração ota 08....................................... 136 Tabela 28 - Íons a, b, y e z do Espectro de Fragmentação EM/EM de ota 09 .... 143 Tabela 29- Estrutura primária do peptídeo ota 09. .............................................. 144 Tabela 30- Predição de estrutura secundária do peptídeo ota 09....................... 144 Tabela 31- Análise dos íons do espectro de massas MALDI-TOF/MS de ota 09 146 Tabela 32- Atividade antimicrobiana do peptídeo ota 09 .................................... 163 Tabela 33- Atividade antifúngica do peptídeo ota 09 .......................................... 164 Tabela 34- Estrutura primária do peptídeo ota 18 ............................................... 170 Tabela 35- Predição de estrutura secundária do peptídeo ota 18 ...................... 170
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Resumo
Secreções de pele de anfíbios são fontes ricas de substâncias
biologicamente ativas com diversas funções fisiológicas e de defesa, a maioria de
baixa massa molecular como as aminas biogênicas, alcalóides, esteróides e
pequenos peptídeos, além de polipeptídeos, proteínas e glicoproteínas de massa
molecular mais elevada.
Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático das secreções de três
espécies Hylidae do gênero Osteocephalus: O. taurinus, O. oophagus (Floresta
Amazônica) e O. langsdorffii (Mata Atlântica). As secreções, obtidas por contração
muscular induzida por choque elétrico, passaram por procedimentos
cromatográficos, CLAE-FR preparativa e analítica. Os cromatogramas das três
espécies apresentaram semelhanças, possuindo cerca de 20 componentes cada.
Nas três espécies, foi identificada uma amina biogênica, a bufotenina (OTA
06, OOP 06 e OLA 06) usando técnicas espectrométricas (IV, UV, EM e RMN de
1H e 13C). Da espécie O. taurinus foram isolados dois peptídeos, OTA 09 (1706
Da) e OTA 18 (3226 Da), e um inibidor de tripsina, OTA 08 (6670 Da) que tiveram
suas estruturas identificadas por uma combinação de degradação automática de
Edman e espectrometria de massa.
O peptídeo OTA 09, após síntese química, apresentou ação antibacteriana
(Escherichia coli e Staphylococcus aureus) e antifúngica (Candida albicans e
Candida tropicalis). Experimentos de espectrometria de massa mostraram que
OTA 09 possui fortes sítios de ligações com metal, confirmando uma característica
dos peptídeos acídicos.
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Abstract
Amphibian skin secretion is a rich source of biologically active compounds
that have a great number of physiological and defense functions, the majority of
low molecular mass as the biogenic amines, alkaloids, steroids and small peptides,
beyond polypeptides, proteins and glycoprotein’s of raised molecular mass.
In this present work, we report a systematic study of secretions of three
Hylidae species of the Osteocephalus genus: O. Taurinus, O. oophagus
(Amazonian Forest) and O. langsdorffii (Atlantic Forest). The secretions, obtained
by applying mild electric shocks in adult’s specimens, underwent chromatographic
procedures, RP-HPLC preparative and analytical C18 column. The chromatograms
of the three species presented similarities, possessing about 20 components each.
In the three species the bufotenine, a biogenic amine, was identified (OTA
06, OOP 06 and OLA 06) using a combination of different spectroscopic
techniques (IV, UV, MS and NMR of 1H and 13C). Of the species O. taurinus two
peptides, OTA 09 (1704 Da) and OTA 18 (3226 Da), and an inhibitor, OTA 08
(6670 Da) were isolated. The peptides and inhibitor were purified using analytical
RP-HPLC and sequenced by a combination of automatic degradation of Edman
and spectrometry of mass.
The peptide OTA 09, after chemical synthesis, presented antimicrobial
activities (Escherichia coli and Staphylococcus aureus) and antifungal (Candida
albicans e Candida tropicalis). Mass spectrometry experiments have demonstrated
that OTA9 binds very tightly metal ions, confirming a characteristic of acidic
peptides.
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Sumário
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 21 1.1. AMINAS BIOGÊNICAS ........................................................................... 29
1.1.1. INDOLALQUILAMINAS ................................................................... 29 1.1.1.1. BUFOTENINA .............................................................................. 30
1.1.2. IMIDAZOLALQUILAMINAS.............................................................. 34 1.1.3. HIDROXIFENILALQUILAMINAS ..................................................... 35
1.2. ALCALÓIDES.......................................................................................... 38 1.2.1. BATRACOTOXINAS (BTXS) ........................................................... 43 1.2.2. INDOLIZIDINAS............................................................................... 45 1.2.3. PUMILIOTOXINA (PTXs)................................................................. 47 1.2.4. DECAIDROQUINOLINA (DHQ) ....................................................... 50 1.2.5. EPIBATIDINAS ................................................................................ 52 1.2.6. TETRODOTOXINAS (TTX).............................................................. 53 1.2.7. HISTRIONICOTOXINAS (HTX) ....................................................... 58 1.2.8. GEPHYROTOXINAS ....................................................................... 59
1.3. ESTERÓIDES......................................................................................... 60 1.4. PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS DE ANFÍBIOS............................................ 66
1.4.1. PEPTÍDEOS DE ANFÍBIOS............................................................. 69 1.4.2. PEPTÍDEOS FARMACOLOGICAMENTE ATIVOS ......................... 70
1.4.2.1. TAQUICININAS............................................................................ 71 1.4.2.2. BRADICININAS............................................................................ 74 1.4.2.3. CERULEÍNAS .............................................................................. 75 1.4.2.4. BOMBESINAS.............................................................................. 76 1.4.2.5. SAUVAGEÍNAS............................................................................ 79 1.4.2.6. PEPTÍDEOS OPIÓIDES............................................................... 80 1.4.2.7. HORMÔNIO LIBERADOR DE TIREOTROPINA (TRH) ............... 83 1.4.2.8. XENOPSINA ................................................................................ 83 1.4.2.9. TRIPTOFILINAS........................................................................... 85 1.4.2.10. ANGIOTENSINAS........................................................................ 86 1.4.2.11. ADENOREGULINA ...................................................................... 88 1.4.2.12. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS (AMPS)................................. 89
1.5. ANUROS HYLIDAE................................................................................. 92 1.5.1. GÊNERO OSTEOCEPHALUS......................................................... 92
1.5.1.1. OSTEOCEPHALUS TAURINUS .................................................. 94 1.5.1.2. OSTEOCEPHALUS OOPHAGUS ................................................ 95 1.5.1.3. OSTEOCEPHALUS LANGSDORFFII .......................................... 96
2. OBJETIVOS................................................................................................... 97 2.1. GERAL.................................................................................................... 97 2.2. ESPECÍFICOS........................................................................................ 97
3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 98
xix
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3.1. COLETA DO MATERIAL......................................................................... 98 3.2. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS............................................................... 99
3.2.1. ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA............................................................. 99 3.3. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES .................... 100 3.4. ESPECTROMETRIA DE MASSA.......................................................... 101
3.4.1. ESPECTROMETRIA DE MASSA SISTEMA MALDI-TOF ............. 101 3.4.2. ESPECTROMETRIA DE MASSA SISTEMA “ELECTROSPRAY IONIZATION” (ESI) ...................................................................................... 102 3.4.3. ESPECTROMETRIA DE MASSA SISTEMA “QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT” (Q-TOF)................................................................................... 103 3.4.4. SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS POR PSD ........................ 103
3.5. ESPECTROMETRIA DE IV, UV E RMN DE 1H E 13C .......................... 104 3.6. SEQUENCIAMENTO DOS PEPTÍDEOS .............................................. 105 3.7. ALQUILAÇÃO DAS CISTEÍNAS ........................................................... 106 3.8. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA POR SPR................... 106 3.9. SÍNTESE QUÍMICA............................................................................... 107 3.10. INTERAÇÕES COM METAIS................................................................ 108 3.11. TESTES ANTIMICROBIANOS.............................................................. 108
3.11.1. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA.................................................... 108 3.11.2. ATIVIDADE ANTIFÚNGICA........................................................... 109
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 111 4.1. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA FRAÇÃO OTA 06, OOP 06 E OLA 06 ............................................................................................ 119 4.2. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA FRAÇÃO OTA 08 134
4.2.1. ESTUDOS DE INTERAÇÃO BIOMOLECULAR ............................ 138 4.3. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE OTA 09. ......... 141
4.3.1. SÍNTESE QUÍMICA DE OTA 09 .................................................... 144 4.3.2. PEPTÍDEO OTA 09 C0M METAL .................................................. 146 4.3.3. TESTES ANTIMICROBIANOS ...................................................... 163
4.4. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE OTA 18 .......... 168 5. CONCLUSÃO .............................................................................................. 172 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 175
xx
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1. INTRODUÇÃO
A compreensão da natureza pelo homem se faz cada vez mais necessária
e urgente para a sua sobrevivência no planeta. O ritmo com que algumas
vegetações estão sendo eliminadas é assustador. As florestas tropicais no mundo
foram reduzidas em quase 50% de seu tamanho em apenas um século, o que é
mais grave, elas continuam sendo destruídas à razão de 130.000 km2 por ano
(CÂMARA, 2001), o que leva milhares de espécies de todos os reinos a
desaparecerem, algumas que nem chegaram a ser catalogadas, causando
prejuízos incalculáveis.
A Amazônia é reconhecida como a maior floresta tropical existente.
Equivale a 1/3 das florestas tropicais úmidas e é detentora do maior banco
genético do planeta (CAPOBIANCO, 2001).
A Floresta Amazônica tem uma extensão total de 5.500.000 Km2. Destes,
cerca de 60% em território brasileiro é conhecido como Amazônia Legal, que
juntamente com a Mata Atlântica, Pantanal, Cerrado, Caatinga, Campos e
Florestas Meridionais contribui para que o Brasil seja detentor de uma
megadiversidade, possuindo entre 10 e 20% das 1,5 milhões de espécies já
catalogadas. São 55 mil espécies de plantas com sementes, 502 de mamíferos,
1.677 de aves, 2.657 de peixes e, isso representa respectivamente 22%, 10,8%,
17,2% e 10,7% das espécies existentes no mundo (CAPOBIANCO, 2001). Em
relação aos anfíbios, os números também são extraordinários. São cerca de 600
espécies, equivalente a 10,5% das 5.479 espécies estimadas no mundo (Figura
1), que estão agrupadas em três ordens: Anura (sapos, rãs e pererecas), Caudata
22
ou Urodela (salamandras) e Gymnophiona (cecílias ou cobras-cegas)
correspondendo 88%, 9% e 3%, respectivamente (AMPHIBIAWEB, 2003).
Número total de espécies / área em km2
Figura 1- Densidade de Espécies de Anfíbio por País- Mapa elaborado por Tiwari, Gross, Vredenbur e Van der Meijden (AMPHIBIANWEB, 2003).
Historicamente os anfíbios estão associados às magias, aos mitos, às
crenças e às lendas. Esses animais eram venerados pelas civilizações antigas; os
egípcios atribuíram à criação do homem e de certos deuses a Heket, deusa que
era representada por uma mulher com cabeça de rã. As mulheres, como gratidão,
usavam um amuleto de metal na forma de rã pelos favores prestados; os chineses
e indianos acreditavam que o mundo apoiava-se nas costas de um sapo gigante e
que os terremotos eram provocados pela movimentação desse sapo. Os maias
23
associavam as rãs ao deus Chac, responsável pela chuva. As civilizações
contemporâneas os vêem com certo asco, nojo e desprezo. Essa rejeição
começou na Idade Média com os europeus que relacionavam esses animais com
“coisas” do mal: bruxaria, pecado, hipocrisia, infertilidade e feiúra. Hoje, em
processo de desmistificação, sabemos que são animais extremamente
interessantes por sua grande diversidade de formas corporais, estratégias de vida
e colorido, aspectos não observados em nenhum outro grupo de vertebrado
(LAMAR, 1997; DUELLMAN & TRUEB, 1986).
A classe dos Anfíbios (Amphibia) é uma das mais ameaçadas do planeta,
fato que já vem preocupando as comunidades científica e conservacionista.
Espécies de anfíbios vêm sofrendo com a perda ou modificação de seu hábitat
natural causadas pelo desmatamento, erosão e assoreamentos (HECNAR &
M’CLOSKEY, 1996); com sérios problemas de poluição conseqüente do uso
indiscriminado de inseticida, herbicida, resíduo industrial e emissão de gases
tóxicos (GILLILLAND et al., 2001; HAYES et al, 2002); com aumento da radiação
ultravioleta (BROOMHALL et al, 2000); com chuva ácida (BEATTIE et al, 1992), e
com as doenças infecciosas, em conseqüência da baixa de sua imunidade
(ALFORD & RICHARDS, 1997; 1999). Por essa série de razões, suas populações
estão declinando em diversos pontos do planeta (Figura 2), o que pode levar a um
grave desequilíbrio da natureza com conseqüências desastrosas para o homem.
Segundo a Lista Vermelha que divulga as espécies ameaçadas no planeta,
elaborada pela União Internacional para a Conservação da Natureza (UICN), 21%
do total das espécies ameaçadas pertence à classe dos anfíbios (UICN, 2002).
24
Devido à sensibilidade dos anfíbios frente a esses fatores responsáveis
pelo seu declínio, eles são conhecidos como excelentes bio-indicadores da
qualidade dos ambientes tendo grande importância em avaliações ecológicas,
chegando a ser mais sensível que os sistemas comuns de monitoramento
(BRANDÃO, 2002).
Figura 2- Distribuição Global de Anfíbios Fonte: UICN 2003, Amphibia Web, Hero J.M. & L. Shoo, 2003. Capítulo 7 – Amphibian Conservation, Smithsonian Press.
Outro aspecto, tão importante quanto o ecológico, é o químico-biológico.
Espécies pertencentes, principalmente a ordem Anura, produzem, armazenam e
secretam substâncias que podem trazer benefícios diretos ao homem. Isso os
coloca na lista da pesquisa sistemática para obtenção de novas substâncias, com
finalidade terapêutica de origem natural, juntamente com as plantas,
microorganismos, répteis, aracnídeos, entre outros.
Uma análise na lista dos 20 produtos farmacêuticos mais vendidos nos tigs
anos revela que vários têm origem natural: Captopril e derivados - um
Figura 2- Densidade de Espécies de Anfíbio por País- Mapa elaborado por Tiwari, Gross, Vredenbur e Van der Meijden (AMPHIBIANWEB, 2003).
Outro aspecto, tão importante quanto o ecológico, é o químico-biológico.
Espécies pertencentes, principalmente a ordem Anura, produzem, armazenam e
secretam substâncias que podem trazer benefícios diretos ao homem. Isso os
coloca na lista da pesquisa sistemática para obtenção de novas substâncias, com
finalidade terapêutica de origem natural, juntamente com as plantas,
microorganismos, répteis, aracnídeos, entre outros.
25
Uma análise na lista dos 20 produtos farmacêuticos mais vendidos nos
últimos anos revela que vários têm origem natural: Captopril e derivados - um
inibidor da enzima conversora de angiotensina, utilizado no tratamento de
hipertensão arterial, teve como protótipo, um polipeptídeo isolado do veneno de
serpente brasileira Bothrops jararaca, comercializado por multinacionais
farmacêuticas, rendendo de 3-5 bilhões de dólares anuais; CECLOR®,
cefalosporina produzida pela Ely Lilly, com vendas anuais da ordem de US$ 837
milhões; MEVACOR® , inibidor da HMG CoA, produto da Merck, com vendas
anuais da ordem de US$ 760 milhões; AUGMENTIN®, antibiótico produzido pela
Smith Kline Beecham, com vendas anuais da ordem de US$ 710 milhões;
ROCEFIN®, cefalosporina, produto da Roche, com vendas anuais da ordem de
US$ 665 milhões (PALMA et al, 2001).
É difícil estimar o número total de produtos terapêuticos que utilizam
formulações originárias de produtos naturais das mais diversas origens.
Entretanto, acredita-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica
moderna tenham sido desenvolvidos a partir deles, sendo 25% de plantas, 13% de
microorganismos e somente 3% de origem animal (CALIXTO, 2000).
Acredita-se no potencial dos animais como uma importante fonte de
substâncias biologicamente ativas. Eles sintetizam, assim como as plantas,
substâncias de uma diversidade estrutural impressionante, conseqüentemente
com propriedades farmacológicas diversas. Além disso, no reino animal o número
de espécies é impressionante. Foram identificadas 1.131.000 espécies das
8.800.000 estimadas do reino animal, contra 270.000 identificadas das 350.000
26
estimadas do vegetal (MENDONÇA-HAGLER, 2001). As oportunidades para
identificação de produtos com possível utilização econômica aumentam com a
diversidade de espécies. Os animais que produzem toxinas (zootoxina) como os
anfíbios, répteis, aracnídeos, insetos, entre outros são os mais visados nessa
busca por novos fármacos. É nas regiões temperadas e equatoriais que se verifica
uma maior incidência de animais produtores de zootoxinas.
Nos anfíbios essas toxinas são produzidas e armazenadas pelas glândulas
granulares localizadas na derme, também chamadas glândulas serosas ou de
veneno, podendo ser encontradas ao longo de todo corpo ou concentrado em
algumas áreas. Nas espécies de anfíbios anuros é comum um outro tipo de
glândulas, as parotóidas que têm a propriedade de estocar grande quantidade de
secreção (PRATES, 2000).
Nas últimas décadas, estudos mostraram que algumas substâncias
presentes nas secreções dessas espécies possuem extraordinários efeitos
farmacológicos, como: irritantes locais, cardiotoxina, miotoxina e neurotoxinas,
agentes colinomiméticos, simpatomiméticos, alucinogênicos, agentes citotóxicos e
inibidores do crescimento de microrganismos (SEBBEN et al, 1993). Alguns
exemplos clássicos são: a epibatidina, isolada da pele de um anuro da América do
Sul, Epipedobates tricolor. Esta substância administrada por via intraperitoneal,
em ratos, apresentou atividade analgésica 200 vezes superior àquela da morfina,
usada como padrão (DALY et al, 1978); as megaininas, isoladas de Xenopus sp
possuem um amplo espectro de ação antimicrobiana. Em doses micromolares,
interrompem o crescimento e/ou induzem a lise osmótica de diversos tipos de
bactérias gram-positiva e gram-negativa e de protozoários (ZASLOFF, 1987). As
27
dermaseptinas, isoladas de espécies do gênero Phyllomedusa, apresentam amplo
espectro de atividade antimicrobiana e cicatrizante (DALY et al, 1992; PRATES,
1999). Alguns exemplos de compostos com atividades farmacológicas
comprovadas de anfíbios são mostrados na Tabela 1.
Das 5.952 espécies de anfíbios conhecidas poucas foram estudadas,
principalmente sobre os aspectos químicos e farmacológicos de suas secreções
cutâneas. Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático das secreções de
três espécies Hylidae do gênero Osteocephalus: O. taurinus, O. oophagus e O.
langsdorffii, sendo os dois primeiros endêmicos na Floresta Amazônica e o último
na Mata Atlântica. Não há registro na literatura de estudos sobre as secreções de
espécies desse gênero.
Da pele de anfíbios já foram isoladas diversas substâncias, a maioria de
baixa massa molecular como as aminas biogênicas, alcalóides, esteróides e
pequenos peptídeos, além de polipeptídeos, proteínas e glicoproteínas de peso
molecular mais elevado (SCHWARTZ, 1993). Além da pele, essas substâncias,
têm sido detectadas no fígado, ovário, trato gastrointestinal, musculatura e em
ovos e larvas de diversas espécies (TAKEDA, 1995; LUTZ, 1971). Muitas dessas
substâncias ainda não foram avaliadas quanto a suas atividades biológicas.
28
Tabela 1- Exemplos de compostos com atividades farmacológicas de anfíbios (McClean et al, 2002)
Composto Gênero Atividade DL* (mg/kg rato)
Bases Nitrogenadas Batracotoxina Samandarina
Phyllobates Salamandra Pseudophryne
Cardio/neurotóxica Ativante do SNC Convulsionante
0,002 0,3
Tetrodotoxina Composto A Composto B
Taricha Dendrobates Dendrobates
Neurotóxica Ativante de músculo e nervo
0,008 2,5 1,5
Indolalquilamina Serotonina Deidrobufotenina O-Metilbufotenina
Bufo Leptodactylus Bufo Bufo
Vasoconstritor Convulsionante Alucinógeno
300
6 75
Fenólico e catecolaminas Norepinefrina Candicina Leptodactila
Bufo Leptodactylus Leptodactylus
Agente hipertensivo Agente colinérgico Agente colinérgico
5
>10 10
Imidazolalquilamina Histamina Espinaceamina Carnosina
Leptodactylus Leptodactylus Eleutherodactylus
Irritante local
13,000
Bufogeninas e Bufotoxinas Bufotalina Bufotoxina
Bufo Bufo
Cardiotóxica Cardiotóxica
0,4
Cininas Bradicinina Fisalaemina
Rana Phyllomedusa
Irritante local Agente hipotensivo
Outras Cininas Ascaphus Phyllomedusa
Proteínas Hemolisina
Trituris
Agente hemolítico
0,002
*Para efeito de comparação a dose letal (DL) mínima do curare e estricnina é 0,5 mg/kg de rato; do cianeto de sódio é 10 mg/kg.
29
1.1. AMINAS BIOGÊNICAS
Aminas biogênicas são moléculas com baixo peso molecular encontradas
tanto em plantas, numa ampla variedade de famílias (BALANDRIN et al., 1978;
SMITH, 1977), quanto em animais (CEI et al., 1972; ERSPAMER, 1994; SMEETS
& GONZALES, 2000). São biologicamente ativas, geralmente, atuam como
agentes psicoativos ou vasoativos (GONZALEZ-FERNANDEZ et al., 2003;
McCLEAN, 2002).
Estes compostos são normalmente formados pela descarboxilação
enzimáticas de seus precursores aminoácidos. Dependendo desses aminoácidos,
estão divididos em: indolalquilaminas, imidazolalquilaminas e
hidroxifenilalquilaminas.
1.1.1. INDOLALQUILAMINAS
As indolalquilaminas têm como características a presença de um sistema
indólico derivado do aminoácido triptofano (01), seu precursor. O processo de
biossíntese dos derivados indólicos passa por uma série de reações enzimáticas
do tipo: descarboxilação, hidroxilação, O e N-metilação, entre outras, a partir do
triptofano (Figura 3). Alguns autores as classificam como alcalóides indólicos
(McCLEAN, 2002; ZHALOLOV et al., 2000; KAMANO et al., 1999).
Muitas aminas biogênicas indólicas (Figura 4) atuam como agonistas ou
antagonistas parciais nos receptores α-adrenérgico, serotoninérgico, colinérgico e
dopaminérgico (SIMÕES et al., 2003). A bufotenina (06), dimetiltriptamina (07),
psilocibina(08) e derivados do harmano, harmina (10) e harmalina (13), possuem
30
uma marcante atividade alucinógena. A psilocibina é o princípio ativo do
cogumelo Psilocybe mexicana, que já era usado pelos Astecas. Harmina (10) e
harmalina (13) são as substâncias ativas de Banisteriopsis como B. caapi e B.
inebrians, espécies usadas em rituais pelos índios na Amazônia. Os extratos de
Psychotrias viridis contêm a N, N-dimetiltriptamina (07) como seu principal
princípio ativo. Todos esses compostos interagem especificamente com os
receptores para serotonina (03), o neurotransmissor endógeno do cérebro
(SIMÕES et al., 2003).
Devido à variedade, abundância e distribuição das indolalquilaminas, elas
são, sem dúvida, as aminas biogênicas mais importantes de pele de anfíbio. São
encontradas na maioria dos gêneros de anfíbios (UDENFRIEND et al., 1952),
inclusive em representantes da ordem Apoda (FERRONI et al., 1992). Espécies do
gênero Bufo provêem uma representação espetacular de indolalquilaminas. Não
há nenhum tecido animal ou vegetal conhecido que apresente uma variedade e
quantidade de indolalquilaminas e de seus precursores como a pele de sapo (CEI
et al., 1972).
1.1.1.1. BUFOTENINA
A bufotenina (06) foi uma das primeiras indolalquilaminas a ser identificada
(Figura 03). Recebeu esse nome por ter sido identificada a partir da secreção da
pele de Bufo bufo (B. vulgaris) por Phisalix e Bertrand (1902). Até a sua completa
elucidação estrutural houve várias etapas. Handovsky (1920) primeiro caracterizou
como sendo derivado pirrólico, depois Jensen e Chen (1929; 1930a; 1930b)
identificaram a presença de um sistema indólico e finalmente Wieland et al. (1934)
31
confirmou ser um derivado 5-hidroxi-indólico como a serotonina (03), mais
precisamente 5-Hidroxi-N,N-dimetiltriptamina ou N,N-dimetilserotonina.
NNH2
COOH
H
NNH2
COOH
H
HO R
NNH2
H
R
NN(CH3)2
H
NN(CH3)2
COOH
H
MeO
I
II
III
IV
Triptofano (01)
5-hidroxitriptofano (02) R= OH = 5-hidroxitriptamina (03)R= H = triptamina (04)
5- metoxibufotenina (05) R= OH = bufotenina (06)R= H = dimetil-triptamina (DMT) (07)
Figura 3 - Biossíntese das Indolalquilaminas de pele de anfíbios. I- Triptofano hidroxilase; II- aminoácido descarboxilase; III- N-metiltransferase; IV- O-metil-5-hidroxiindoltransferase (ERSPARMER, 1994).
A bufotenina (06) é amplamente encontrada no reino vegetal,
principalmente em plantas da família Leguminosae. Nas sementes de
Anadenanthera peregrina seu teor pode chegar até 7,4% e em A. colubrina até
12,4% (OTT, 2001; SMITH, 1977). Ocorre em vertebrados, principalmente
mamíferos (FORSSTRÖM et al., 2001) e em anfíbios, especialmente do gênero de
Bufo (Bufonoidae) (CEI et al., 1972).
32
Essa substância possui propriedades psicotrópicas potentes, e
normalmente é associada a desordens mentais temporárias e doenças como
esquizofrenia e comportamentos psicóticos, provavelmente devido a suas
características fisiológicas semelhantes ao da dietilamida do ácido lisérgico LSD
(RÄISÄNEN & KÄRKKÄINEN 1979; TAKEDA et al., 1995). Uma revisão da ação
neurofarmacológica da bufotenina compara sua ação alucinógena com a de outros
alucinógenos conhecidos como LSD, psilocina e 5-metoxi-dimetiltriptamina e
mostra que eles atuam nos receptores serotoninérgicos 5-HT2A e 5-HT2C
(McBRIDE, 2000). A Tabela 2 mostra a ação da bufotenina por diferentes vias de
administração (OTT, 2001).
Tabela 2– Avaliação da ação farmacológica da bufotenina (OTT, 2001)
Via Dosagem(mg) Efeitos Referências
Intravenosa 1-16 Alucinógeno FABING & HAWKINS, 1956
Intravenosa 2.5-20 não-psicoativo THMER & MERLIS, 1959
Intravenosa 6,4-11,1 alucinógeno BONHOUR & MELGAR, 1967
Intravenosa 2-8 psicotomimetico MCLEOD & SITARAM, 1985
Intramuscular 10-12,5 alucinógeno TURNER & MERLIS, 1959
Nasal <14,3 não-psicoativo TURNER & MERLIS, 1959
Nasal 6-10 não-psicoativo TURNER & MERLIS, 1985
Nasal 40-100 psicoativo OTT, 2001
Sublingual 50 psicoativo OTT, 2001
Oral 100 psicoativo OTT, 2001
Inalado 2-8 psicoativo OTT, 2001
Intraretal 50 psicoativo OTT, 2001
33
Figura 4- Estruturas de indolalquilaminas bioativas (ERSPARMER, 1994).
34
1.1.2. IMIDAZOLALQUILAMINAS
As imidazolalquilaminas têm como precursor o aminoácido histidina (20),
que após descarboxilação enzimática dá origem à histamina (21), o protótipo de
quase todas as imidazolalquilaminas (Figura 5).
As imidazolalquilaminas e derivados, como a histamina (21), constituem o
principal arsenal químico da “rã-pimenta”, como são popularmente conhecidos os
Leptodactylus (PIRES JÚNIOR, 2002).
NHN NH2
COOH
NHCOCH3
COOH
NHN NHCH3
COOH
NHNNH2NHN
Histidina
N-Acetilhistidina N-MetilhistidinaHistamina
N
NHHN
HOOCNHN NHCH3 NHN NHCOCH3
N-AcetilhistaminaN-Metilhistamina Espinacina
N(CH3)2NHN N
NHHN
N,N-Dimetilhistamina Espinaceamina
N
NHH3CN
6-Metilespinaceamina
I
IIIII
IVIIIII
I I IV
IV
(20)
(21)(22) (23)
(24) (25) (26)
(27) (28)
(29)
Figura 5- Biossíntese das imidazolalquilaminas de pele de anfíbios. I- ácido aromático descarboxilase; II- N-metil transferase; III- N-acetil transferase; IV- Ciclização enzimática (ERSPARMER, 1994).
35
1.1.3. HIDROXIFENILALQUILAMINAS
As hidroxifenilalquilaminas têm como precursor o aminoácido fenilalanina
(30) (Figura 6), e dependendo do grau de oxidação estão divididas em mono e
diidroxifenilaquilaminas.
A tiramina (4-hidroxifeniletilamina) (35), um intermediário da biossíntese das
monoidroxifenilaminas, é um componente encontrado normalmente, em
quantidade variável, em vários tecidos de animal e de planta, e também pode
estar presente em alguns alimentos. Foi identificado em extratos da pele de
Leptodactylus pentadactylus, e provavelmente está presente em baixas
concentrações na pele de vários outros sapos. Além da tiramina, foi identificado a
candicina (39), um sal de amônio quaternário conhecido por muitos anos como um
componente comum de alguns Cactaceae argentino (ERSPAMER, 1994).
Um outro intermediário da biossíntese das monoidroxifenilaminas, a m-
tiramina (3-hidroxifeniletilamina) (34), não foi identificado em pele de anfíbio. Mas
a leptodactilina (38), uma substância derivada desse intermediário é comum na
pele de espécies da subfamília Leptodactylinae e de vários outros Leptodactylus.
Foi o primeiro derivado m-tiramina encontrado na natureza. A leptodactylina
apresentou potente ação nicotínica e curarínica (ERSPAMER & GLASSER, 1960).
Uma outra substância pertencente a esta classe, a candicina (39), possui o
mesmo espectro de atividade da leptodactylina, sendo levemente mais potente
(ERSPAMER, 1994).
As catecolaminas como são conhecidas as diidroxifenilaminas, são
compostos que contêm um núcleo catecol (anel benzênico com dois grupos
36
hidroxilas adjacentes) e uma cadeia lateral contendo amina. Do ponto de vista
farmacológico, as catecolaminas mais importantes são: noradrenalina (40),
adrenalina (41), dopamina (36) e isoprenalina (derivado sintético da noradrenalina)
(RANG at al, 2000). Como citado, seu aminoácido precursor é a fenilalanina (30)
que sofre hidroxilação, primeiro passo para síntese de várias catecolaminas
(Figura 06).
A presença da catecolamina, epinefrina, como um componente significante
da secreção de glândulas parótidas de Bufo marinus foi identificada por Abel e
Macht há 80 anos (DEULOFEU & RUVEDA, 1971). Este resultado foi logo
confirmado em trabalhos posteriores mostrando que na pele de Bufo marinus é
encontrado de 6-11% de epinefrina, na de B. arenarum e B. regularis 5% e B.
mauretanicus 1%. Esta amina também está presente em B. paracnemis, B.
crucifer e B. formosus, e em quantidades mínimas em B. bufo (DEULOFEU &
RUVEDA, 1971).
Marki e colaboradores (1961) isolaram além da epinefrina, a norapinefrina,
dopamina (36) e epinina (N-metildopamina)(37), constituintes comuns nas
glândulas parótidas de B. marinus.
37
I I I
HO
HO
NHCH3
OH
A d renalina (41)
NH2
OH
HO
HO
Norad renalina
IV
(40)
N(CH3)3OCand ic ina (39)
O
L ep tod ac t i l ina
N(CH3)3
(38 )
Ep in ina (37)
NHCH3HO
HO
Dop am ina(36)
IV
V
HO
HO
NH2HONH2
p -T iram inaIV
(35)
HO
IV
NH2
m -T iram ina (34)
Dop a (33)
COOH
NH2HO
HO
p -t irosina
II
I I I(32)
COOH
NH2HO
IIIm -t irosina (31)
COOH
NH2
HO
COOH
NH2
Fen ilalan inaIb
Ia
(30)
Figura 6- Biossíntese e estruturas das hidroxifenilalquiaminas de pele de anfíbios. Ia- 4-Hidroxilase fenilalanina; Ib- 3-Hidroxilase fenilalanina; II- 3-Hidroxilase tirosina; III- ácido aromático descarboxilase; IV- N-metiltransferase; V- b-Hidroxilase fenilalana (Ersparmer, 1994).
38
1.2. ALCALÓIDES
Os alcalóides (termo derivado da palavra árabe alquali = cinza) foram umas
das primeiras descobertas do homem que há 4000 anos já fazia uso dessas
substâncias presentes em chás, poções, cataplasmas e venenos. Eles constituem
uma classe de metabólitos com grande diversidade estrutural, farmacológica e de
vias biossintéticas incomparáveis com qualquer outro grupo de produtos naturais.
Por conta dessas características fica difícil uma definição precisa para essa classe
de substâncias. Na literatura corrente existem várias, mas a de Pelletier (1983) é a
mais citada que os define como substância orgânica, de origem natural, cíclica,
contendo um nitrogênio em estado de oxidação negativo e cuja distribuição é
limitada entre os organismos vivos. Representam cerca de 20% das substâncias
naturais descritas (SIMÕES et al., 2003).
Sua grande variedade estrutural permitiu que os alcalóides fossem divididos
em várias classes de acordo com o seu precursor biogenético. Na Tabela 3 e
Figura 7 são dados alguns exemplos.
As principais fontes de alcalóides no passado foram às plantas superiores
(angiospermas). Porém, nos últimos anos observa-se um crescente aumento na
identificação de alcalóides em animais, principalmente anfíbios, insetos,
organismos marinhos, microorganismos, e nas plantas inferiores. Os primeiros
alcalóides de fonte animal foram as samandarinas, identificadas em salamandras
européias (DALY et al., 2002).
O mérito na identificação, isolamento, elucidação estrutural e atividade
farmacológica desses alcalóides de anfíbios, em grande parte, pertence a Daly &
39
Witkop e seus colaboradores. Seus trabalhos e artigos de revisão (DALY e
WITKOP, 1971; DALY, 1982; WITKOP & GOSSINGER, 1983; DALY e SPANDE,
1986; DALY et al. 1987; DALY et al., 1992; DALY, 1998; SPANDE et al., 1992a,
1992b) são a base para qualquer trabalho referente a alcalóides de anfíbios.
Esses alcalóides já foram identificados além de nas salamandras, em tritões
(gêneros Triturus e Taricha) (MOSHER et al., 1964) e em representantes de sapos
e rãs das famílias Ranidae (gênero Mantella), Myobatrachidae (gênero
Pseudophryne), Bufonidae (gêneros Melanophryniscus e Atelopus) (DALY et al.,
1984, 1987, 1990, 1992; GARRAFFO et al., 1993a; GARRAFFO et al., 1993b),
Brachycephalidae (SEBBEN et al., 1986; PIRES JURNIOR, 2002), e
principalmente na família Dendrobatidae onde ocorre o maior número de
compostos alcaloídicos (DALY et al., 1978, 1987, 1992). Inicialmente, esses
alcalóides eram conhecidos como “alcalóides dendrobatides” por terem sido,
primeiramente, isolados de espécies da família Dendrobatidae (DALY et al., 1987).
A presença destes alcalóides provavelmente está relacionada com a dieta
desses anfíbios. Esta hipótese é reforçada por estudos onde foi observado que os
animais perderam sua toxicidade com a manutenção de adultos em cativeiro.
Além disso, indivíduos gerados por reprodução em cativeiro também não se
apresentaram tóxicos (DALY et al., 1994b, 1997; DALY, 1998). Formigas,
besouros e centopéias parece ser a fonte de certos alcalóides das classes
decaidroquinolina, izidina, coccinelina, e espiropirrolizidina presentes em anfíbios.
Mas, a origem dos alcalóides pertencentes as principais classes como as
pumiliotoxina, allopumiliotoxina e homopumiliotoxina, continuava um mistério, até
que o trabalho de Dally e colaboradores (2002) mostrou que provavelmente eles
40
também são originários da dieta desses animais e não de fatores genéticos como
se imaginava.
Tabela 3- Diferentes classes de alcalóides de acordo com o precursor biogenético (SIMÕES et al., 2003)
Precursor Classe Exemplo (Figura07) Origem
Pirrolidínicos Estaquidrina (42) Medicago sativa Tropânicos Atropina (43) Atropa belladonna Pirrolizidínicos Retronescina (44) Senecio spp.
L-ornitina
Fenantroindolizidínicos Tiloforina (45) Tylophora
Piperidínicos Lobelanina (46) Lobelia inflata Quinolizidínicos Lupinina (47) Lupinus luteus
L-lisina
Indolizidínicos Castanospermina(48) Castanospermum Ac. Nicotínico Piridínicos Nicotina (49) Nicotiana spp. Policetídeos Piperidínicos Coniina (50) Conium Lactamas policetídicas Citocalasina B (51) Helmintosporium
Monoterpênicos Valerianina (52) Valeriana Sesquiterpênicos Dendrobina (53) Dendrobium Diterpênicos Atisina (54) Aconitum spp.
Isopreno
Triterpênicos Solasodina (55) Solanum spp.
Quinolínicos Dictamina (56) Dictamnus albus Ac. Antranílico Quinazolínicos Peganina (57) Peganum harmala
Indóis simples Psilocina (58) Psilocybe β-carbolinas Harmina (59) Peganum harmala Indol-monoterpênicos Reserpinina (60) Rauvolfia spp. Quinolínicos Quinina (61) Cinchona spp. Pirroloindólicos Fisostigmina (62) Physostigma
L-triptofano
Ergolinas Ac. lisérgico (63) Claviceps L-fenilalanina Feniletilaminas (-)-efedrina (64) Ephedra spp.
Feniletilaminas Mescaline (65) L. williamsii tetraidroisoquinolínicos Lofocerina (66) Lophophora spp. Benzilisoquinolínicos Papaverina (67) Papaver Aporfínicos Boldina (68) Peumus boldus Morfinanos Morfina (69) Papaver
L-tirosina
Betalaínas Betanidina (70) Beta vulgaris L-histidina Imidazólicos Pilocarpina (71) Pilocarpus spp. Purinas Xantinas Cafeína (72) Coffea arabica Var.aminoácidos Ciclopeptídicos Treviasina (73) Trewia nudiflora
41
N
N
OHH
N O
O
NH
H
O
HO
H
OHO
N
(53)
ON
H
HHH
(52)
N
O(51)
NOO
O
OH
HO
H
H
(50)N
H
H
(49)N
NH
(48)
N
OHOHH
OH
HO
(47)(46)N
OHH
N
O O
(45)
N
H
OO
OO
(44)
N
HO H OH
(43)
OH
OH
N
O(42)
N COOH
(57)(56)
(55)(54)
(61)N
NO
HO H
H
H
(60)
N N
O
H
OO
H
H
O
(59)
N NH3COH
(58)
N
N
OH
H
Figura 7- Exemplos das diferentes classes de alcalóides de acordo com o precursor biogenético (SIMÕES et al., 2003).
42
O
O
N
H
N NH(62) N
NHOOC
H
H(63)
OH
NCH3
(64)
NH2
H3CO
H3CO
OCH3(65)
N
H3CO
HOCH3
(66)
N
H3CO
H3CO
H3CO
H3CO(67)
N
OHH3CO
H3CO
HO
(68)
N
HO
O
HO
H HCH3
(69)
HO
HO N
N
OH
O
OH
OO
OH H(70)
N
N O O
(71)
N
N N
N
O
O(72)
ON
O
OHOCH3
OH3CO
ClO
O
O
H3CO
O
N
N
H(73)
Figura 7- Exemplos das diferentes classes de alcalóides de acordo com o precursor biogenético (SIMÕES et al., 2003) (cont.).
A concentração desses alcalóides na secreção cutânea pode variar
qualitativamente e quantitativamente, inclusive entre diferentes populações de
uma mesma espécie (EDWARDS et al., 1988). Nos anfíbios, a presença de
alcalóides tóxicos, via de regra, é acompanhada por coloração aposemática,
embora ocorram exceções (PIRES JUNIOR et al., 2002).
A classificação estabelecida por Daly et al. (2002) dos alcalóides
detectados em pele de anfíbios inclui 22 classes estruturais diferentes com,
aproximadamente, 500 combinações. Para facilitar a nomenclatura desses
alcalóides foi sugerido (DALY et al., 1978) um sistema de código que estabeleceu
que eles fossem designados por suas respectivas massas moleculares nominais
43
em negrito, e caso tivessem a mesma massa, uma ou mais letras seriam
acrescentadas para diferenciá-los.
Dentre as classes dos alcalóides de anfíbios destacam-se: Batracotoxinas,
Indolizidinas, Pumiliotoxinas (Pumiliotoxinas A e B, Allopumiliotoxinas,
Deoxipumiliotoxina e Homopumiliotoxinas), Decaidroquinolina, Epibatidina,
Tetradotoxina, Histrionicotoxina e Gephyrotoxina que serão descritas a seguir.
1.2.1. BATRACOTOXINAS (BTXS)
Os índios Noanamá e Emberá da região da Colômbia Ocidental usam, até
hoje, secreções de pele de espécies do gênero Phyllobates (P. bicolor,
P.aurotaenia e P. terribilis) para envenenar seus dardos de caça desde os tempos
pré-colombianos. Estudos preliminares mostraram a alta toxicidade dessas
secreções o que despertou o interesse científico. O químico J. Aronhson, no final
do século XIX, descobriu a natureza química do princípio ativo desses venenos
como sendo um alcalóide lipossolúvel. Mas, somente na década de 1960 sua
estrutura química foi elucidada por F. Märki e B. Witkop, o que se tornou um ponto
de partida nas pesquisas sobre alcalóides em peles de espécies da família
neotropical Dendrobatidae, que compreende cerca de 200 espécies distribuídas
em nove gêneros: Phyllobates, Dendrobates, Epipedobates, Allobates,
Aromabates, Colostethus, Crytophyllobates, Mannophryne e Minyobates.
Esses alcalóides esteroidais foram os primeiros isolados de anfíbios e
receberam o nome de batracotoxina, do greco batrachos. Na Figura 8 são
mostrados as estruturas básicas (I e II) e alguns exemplos das batracotoxinas.
A batracotoxina (BTX, C31H42N206) (75), encontrada somente no gênero
Phyllobates, com destaque para P. terribilis (Tabela 4), é considerada como a
44
mais potente toxina de baixo peso molecular não-proteíca (DALY et al., 1965;
MYERS et al., 1978). Uma análise da toxicidade das batracotoxinas é mostrada na
Tabela 5. A batracotoxina (75) apresenta uma alta afinidade ao sítio 2, causando a
abertura de canais de Na+ voltagem dependentes de nervos e músculos. A
conseqüência é um grande influxo de sódio que causa uma irreversível
despolarização das membranas dos nervos e músculos, e danos ultraestruturais
na célula (ALBUQUERQUE et al., 1971).
Tabela 4– Distribuição de batracotoxinas em espécies de Phyllobates (mg/indivíduo) (MYERS et al. 1976)
Tabela 5– Toxicidade da Batracotoxina e vários análogos naturais e sintéticos (PELLETIER, 1986)
Composto DL50 µg/kg* Batracotoxina 2 Homobatracotoxina 3 Batracotoxinina A 1000 Batracotoxinina A 20-(2,5-dimetilpirrol-3-carboxilato) 2,5 Batracotoxinina A 20-(4,5-dimetilpirrol-3-carboxilato) 260 Batracotoxinina A 20-(2,4,5-trimetilpirrol-3-carboxilato) 1 Batracotoxinina A20-(2,5-dimetil-5-etilpirrol-3-carboxilato) 8 Batracotoxinina A20-(2,5-dimetil-5-acetilpirrol-3-carboxilato) 280 Batracotoxinina A 20-(N,2,4,5,-tetrametilpirrol-3-carboxilato) >1000 Batracotoxinina A 20-(N-metilantranilato) 2 Diidrobatracotoxina 15
*Toxicidade determinada por injeções subcutânea em 20g de rato.
Espécie Batracotoxina (75)
Homo-batracotoxina (77)
Batracotoxina A (74)
P. terribilis 500 300 200 P. aurotaenia 20 10 50 P. bicolor 24 12 60 P. vittatus 0,2 0,2 2 P. lugubris 0,2 0,1 0,5
45
Figura 8–Estruturas básicas (I e II) e alguns exemplos das batracotoxinas isoladas de pele de anfíbios. 1.2.2. INDOLIZIDINAS
As indolizidinas pertencem a uma classe de alcalóides bicíclicos saturados
com nitrogênio terciário que ocorrem em diferentes espécies de anuros,
comumente elas são dissubstituídas por grupos alquil nas posições 3,5 ou 5,8. Na
Figura 9 são apresentados alguns exemplos de indolizidinas isoladas de anfíbios.
As indolizidinas 3,5-dissubstituídas não são exclusivas dos anuros, elas são
constituintes comuns do veneno de formigas dos gêneros Monomorium e
Solenopis (JONES at al, 1982; 1984). As 5,8-dissubstituídas são mais
representadas em anfíbios estando presentes em várias espécies de
Dendrobates, Epidobates e Minyobates, sendo os principais componentes de seus
HO
HO
OO
H3CN
H3CN
HO
CH3
HO
O O
O
N
O CH3
H3CH
Batracotoxina
ORH
O
N
O CH3
HH5C2
O
HO
CH3
HO
O
H3CN
Homobatracotoxina
O
N
O CH3
H3CH
O
HO
CH3
HO
O
OH
H3CN
Hidroxibatracotoxina
H3CN
HO
CH3
HO
O
OH
O
O
N
O CH3
HH5C2
4-hidroxihomobatracotoxina
OHCH3
Batracotoxina A
H3CN
HO
CH3
HO
O O
1
34
7
11
20 20
11
74
1
ORHH3C
N
HO
HO
OO
OH( I ) ( I I )
3
(74) (75) (76)
(77) (78)
46
extratos. São também encontradas em rãs do gênero Mantella e em bufonídeos
do gênero Melanophryniscus (ERSPAMER, 1994).
A indolizidina 223A (6,8-dietil-5-propilindolizidina) (90), foi o primeiro
exemplo de uma trialquilindolizidina natural. Esse alcalóide foi isolado como
principal componente do extrato da pele do Dendrobates pumilio Shmidt
(Dendrobatidae). Outros três homólogos de 223A foram detectados como
componentes minoritários ou traços em outras populações de D. pumilio, o 237L
(5-butil-6,8-dietilindolizidina) (91), 267J (6-etil-8-(2-hidroxietil)-5-pentilindolizidina)
(92) e 251M (6,8-dietil-5-pentilindolizidina) (93). Não há registro na literatura de
indolizidinas 5,6,8-trissubstituídas terem sido detectadas de outra fonte natural
(GARRAFO, 1993b).
As indolizidinas são encontradas em dendrobatídeos dos gêneros
Dendrobates e Phyllobates, estando ausentes em Epipedobates e Minyobates,
além de serem encontradas em rãs do gênero Mantella e em bufonídeos do
gênero Melanophryniscus (DALY & SPANDE, 1986).
Dados sobre toxicidade das indolizidinas ainda são limitados. Os estudos
realizados até o momento mostraram que as indolizidinas agem como
bloqueadores não-competitivos de receptores nicotínicos na junção neuromuscular
(DALY et al., 1987).
47
Figura 9- Exemplos das indolizidinas isoladas de anfíbios.
1.2.3. PUMILIOTOXINA (PTXs)
Estudos em Dendrobates pumilio realizados a partir da década de 60
levaram a identificação de três alcalóides: pumiliotoxinas A (94), B (95) e C (96).
As pumiliotoxinas A e B apresentaram alta toxicidade e semelhanças estruturais,
enquanto que a pumiliotoxina C mostrou ser relativamente atóxica e
N NN
N N N
N
N
N NNNN
C7H14OH(sec)
N
C9H16OH(sec)
223AB 249A 275C
203A 217B 219F
241F
243B
243D 253B 279D
12
356
78
5
8
N N N
HO
223A 237L 267J
56
8
N
251M
(79) (80) (81)
(82) (83) (84) (85)
(86) (87) (88) (89)
(90) (91) (92) (93)
48
estruturalmente diferente das demais, levando a identificação de uma nova classe:
as decaidroquinolinas (PELLETIER, 1986).
As pumiliotoxina-A (94) e B (95), depois das batracotoxinas, foram os
primeiros alcalóides isolados de peles de dendrobatídeos. Hoje, além de espécies
dos gêneros Dendrobates, Minyobates, Epipedobates, recentemente identificada
em E. flavopictus (MORTARI et al., 2004), e Phyllobates (Dendrobatidae) já foram
identificados em espécies de Mantella (Ranidae), de Pseudophryne
(Myobatrachidae), e de Melanophryniscus (Bufonidae) (ERSPAMER, 1994).
Além das pumiliotoxina A (PTX-A) e B (PTX-B) que possuem como
característica estrutural um sistema de anel (Z)-6-alquilideno-8-hidroxi-8-
metilindolizidina com mais de 20 substâncias descritas (KIBAYASHI & AOYAGI,
2002), fazem parte da grande classe das pumiliotoxinas as sub-classes
allopumiliotoxinas (AlloPTX), deoxipumiliotoxina (DeoxiPTX) e homopumiliotoxinas
(HomoPTX).
PTX-B (95) difere da PTX-A (94) por um adicional grupo hidroxila na
posição C-16; as alloPTX difere das pumiliotoxinas por um adicional grupo
hidroxila na posição C-7 no sistema indolizidina; as DeoxiPTX são destituídas de
um grupo hidroxi na posição C-8 em relação as PTX-A; e o que difere as
homoPTX das demais é a presença de um sistema quinolizidina (Figura 10)
(ERSPAMER, 1994; ARMSTRONG et al., 2004).
Estes alcalóides mostraram ter efeitos moduladores em canais de sódio
voltagem-dependentes, mostrando, em alguns casos, potente ação cardiotônica e
atividade miotônica. As atividades cardíacas mostradas pelas pumiliotoxinas e os
efeitos das mudanças na funcionalidade da cadeia lateral indicam a importância
49
da cadeia lateral no mecanismo de ação nos diferentes análogos das
pumiliotoxinas (GARDNER et al., 2002).
A PTX-B (95), a única pumiliotoxina submetida a um estudo farmacológico
mais completo, inicialmente potencializa e prolonga contrações do músculo
esquelético de anfíbios, de aves e de mamíferos, seu efeito é reversível e dose-
dependente. Albuquerque e colaboradores (1971; 1981) relacionaram sua
toxicidade com alterações em eventos dependentes de Ca+2 em nervos e
músculos, tais como: mobilização e/ou condutância de cálcio para sítios
intracelulares, bloqueio do retorno de cálcio para sítios extracelulares através da
ATPase dependente de cálcio e facilitação de liberação de cálcio dos retículos
sarcoplasmáticos. No entanto, Daly e colaboradores (1992), contrariando os
estudos anteriores, reinterpretaram o efeito primário da Pumiliotoxina-B, discutindo
sua ação em canais de sódio voltagem-dependentes de nervos e músculos, com
um possível efeito adicional na mobilização de cálcio, atuando também nas
sinapses com liberação dos neurotransmissores. A partir deste momento nenhum
trabalho conclusivo foi realizado para esclarecer o mecanismo de ação da
Pumiliotoxina-B (PIRES JUNIOR, 2002).
50
Figura 10- Estruturas de Pumiliotoxina (94) = Pumiliotoxina A; (95) = Pumiliotoxina B; (96) = Allotoxina; (97) = Deoxipumiliotoxina; (98) = Homopumiliotoxina (ERSPAMER, 1994; ARMSTRONG, 2004). 1.2.4. DECAIDROQUINOLINA (DHQ)
Isolada de Dendrobates pumilio, a cis-decaidroquinolina 195A (99) que
inicialmente foi denominada pumiliotoxina C, foi o primeiro representante da classe
das 2,5-dissubstituídas decaidroquinolinas. As decaidroquinolinas (Figura 11)
representam uma das principais classes de alcalóides de anfíbios (DALY, 1994).
Elas têm sido detectadas em extratos de pele de anuros dos gêneros
Dendrobates, Epipedobates e Phyllobates (Dendrobatidae), Mantella (Ranidae) e
Melanophryniscus (Bufonidae) (DALY et al., 1984; 1992; DALY & SPANDE, 1986;
GARRAFO et al., 1993a).
51
Freqüentemente elas ocorrem juntamente com as histrionitoxinas onde foi
observado que as decaidroquinolinas no C-2 apresentam estereoquímica 2S,
enquanto que nas histrionitoxinas é 2R (PELLETIER, 1986).
As decaidroquinolinas apresentam uma relativa baixa toxicidade. Doses de
3-4 mg/kg (s.c.) em ratos apresentaram somente dificuldades de locomoção, e a
dose letal mínima calculada foi de 12-16 mg/kg.
A atividade farmacológica e sítio de ação das decaidroquinolinas não estão
totalmente esclarecidos, no entanto parece estar relacionada com o bloqueio não
competitivo de receptores nicotínicos, de canais de sódio e potássio voltagem-
dependentes (DALY et al., 1978).
Figura 11- Estruturas de cis-decaidroquinolinas: pumiliotoxina C (99); 6-hidroxi análogo pumiliotoxina 211A (100); trans-decaidroquinolinas: 219A (101); (D) 243A (102); (E) 269AB (103) (DALY et al., 1987).
52
1.2.5. EPIBATIDINAS
Epibatidina (104) é um alcalóide com a unidade 7-azabiciclo[2.2.1]heptano,
substituído na posição 2 por um anel 6-cloropiridínico (Figura 12) isolado do
dendrobatídeo equatoriano Epidobates tricolor e identificado em quantidade traço
em E. pictus (DALY et al., 1980). Este alcalóide é considerado um potente
analgésico (SPANDE et al., 1992b) chegando a ser 200 vezes mais potente que a
morfina (BRADLEY, 1993). Experimentos, in vitro, indicam que este poderoso
analgésico, não opióide, de estrutura similar à nicotina (105), atua como agonista
de receptores neuronais nicotinérgicos da acetilcolina. Infelizmente, seu emprego
terapêutico não foi possível devido aos importantes efeitos periféricos que
causava.
Utilizando a epibatidina (104) como protótipo natural, pesquisadores dos
laboratórios Abbott desenharam várias substâncias (ABT-85380 (106), ABT-85543
(107), (ABT-594 (108), e ABT-089 (109)) que após vários testes, algumas
apresentaram potentes propriedades analgésicas suplantando a atividade
analgésica da morfina, com expressiva seletividade funcional (BARREIRO &
FRAGA, 2001).
Além dos efeitos analgésicos, epibatidina (104) induz um decréscimo na
atividade locomotora e provavelmente atua também sobre receptores nicotínicos
(KELLAR, 1995).
53
Figura 12- Estrutura da epibatidina e análogos sintéticos (BARREIRO & FRAGA, 2001). 1.2.6. TETRODOTOXINAS (TTX)
A Tetrodotoxina (110) é a mais potente das toxinas de baixa massa
molecular (319,3 Da.) responsável pela mais violenta forma de biointoxicação
marinha (HO et al., 1994). Foi descoberta por Tahara (1910) em peixes teleósteos
da ordem Tetrodontiformes, uma classe de peixes que possuem 4 dentes
proeminentes (tetra= 4; odontos= dentes) conhecidos popularmente como
baiacus, “puffer fish” ou “Fugu”. Mas, só foi obtida na forma cristalina 40 anos
depois de isolada (YOKOO, 1950), e sua estrutura elucidada, simultaneamente,
por um grupo americano (WOODWARD, 1964) e um japonês (TSUDA et al.,
1964). Goto e colaboradores (1965) confirmaram como sendo um alcalóide
N
Cl
HN
Epibatidina
N Cl
ON
H
N
H N
ON
CH3 N
O
N
CH3 N
O
H3C
ABT-85380 ABT-85543
ABT-594 ABT-089
N
NCH3
H
Nicotina(104) (105)
(106) (107)
(108) (109)
54
aminoperidroquinazolínico cuja molécula consiste de um grupo guanidínico
carregado positivamente, um anel pirimidínico e de um sistema de anéis contendo
grupos hidroxila com função estabilizadora, sua massa molecular estimada é de
319,3 dáltons e sua fórmula molecular proposta é: Cll H17 N3 O8 (Figura 13).
A história da toxina TTX (110) e sua relação com a humanidade remontam
aos primeiros escritos. Hieróglifos de várias tumbas da quinta dinastia egípcia
retratam o baiacu Tetraodon stellatus, indicando um possível envolvimento com
sua propriedade tóxica. A lei Mosaica que tornou proibitivo o consumo de peixes
sem nadadeiras e escamas deve-se, em parte, a associação com os peixes
Tetraodontiformes (RITCHIE, 1980).
A TTX é ativa em concentrações nanomolares, podendo ser até 100.000
vezes mais ativa que os anestésicos locais convencionais, como a procaína ou
cocaína (KAO, 1966). Por estas razões, tornou-se uma importante ferramenta para
estudos sobre membranas excitáveis e estrutura de canais iônicos. Seu
mecanismo de ação só foi totalmente elucidado na metade do ano de 1960
quando experimentos com “voltage-clamp” evidenciaram que essa toxina abolia as
correntes geradas pela abertura dos canais de sódio voltagem-dependentes
(RITCHIE, 1980), levando, então, à paralisia de tecidos com membranas
excitáveis como músculos e nervos. Seus principais efeitos sistêmicos são
caracterizados por um bloqueio neuromuscular, hipotensão e depressão
respiratória (PIRES JUNIOR, 2002).
Desde sua caracterização química, a TTX teve sua ocorrência registrada
em diversos animais, tanto vertebrados quanto invertebrados (SHEUMACK et al.,
1978; NARITA et al., 1981; YASUMOTO et al., 1981; NOGUCHI et al., 1981; 1982;
55
NOGUCHI & HASHIMOTO, 1983; NOGUCHI et al., 1984; YASUMOTO et al.,
1986; MYAZAWA et al., 1987; ARAKAWA et al., 1994; TSAI et al., 1995; FREITAS
et al., 1996; HWANG et al., 1994; TSAI et al., 1997; LIN et al, 1998.).
Os primeiros indícios de ocorrência de TTX entre os anfíbios foram
apontados por Twitti e Johnson (1934), que descreveram nos tecidos e ovos de
uma salamandra norte americana Taricha torosa, uma toxina com ação
paralisante denominada de tarichatoxina. Mosher e colaboradores (1964)
demonstraram que a tarichatoxina, na verdade, é a tetrodotoxina, fazendo assim a
primeira detecção deste composto em vertebrados terrestres. A ocorrência de TTX
e de outros derivados foi posteriormente registrada em órgãos e tecidos de outras
espécies de urodelos das famílias Salamandridae (Cyonops, Notophthalmus,
Paramesotriton, Taricha e Triturus) e Ambystomatidae (Ambystoma) (PIRES
JUNIOR., 2002).
Tetrodotoxina e derivados têm sido identificados de diversas espécies de
bufonídeos do gênero Atelopus, endêmicos na América Central. De Atelopus
chiriquiensis foi isolado, além da TTX, a chiriquitoxina (CHTX) (121) de massa 393
Da (KIM et al. 1995; PAVELKA et al., 1977), sendo tão letal em ratos quanto a
TTX (YOTSU et al., 1990). Da pele de Atelopus zeteki obteve-se a atelopidtoxina,
um cardiotóxico (FUHRMAN et al., 1969; RANNEY et al., 1970) que mais tarde
verificou-se tratar de duas toxinas distintas, renomeadas de zetekitoxinas (ZTX)
AB e C (BROWN et al., 1977). Na Tabela 6, são dados alguns exemplos de TTX e
derivados identificados em anuros.
56
Tabela 6- Exemplos de TTX e derivados identificados em anuros
Espécie Substância Referência
Atelopus chiriquiensis Brachycephalus ephippium Atelopus zeteki
CHTX (122) e TTX ephippiotoxina (ETX) ; ZTX
PAVELKA et al., 1977 SEBBEN et al., 1986 DALY et al., 1987
Coloestethus inguinalis Atelopus ignescens Atelopus spurrelli
TTX (110) TTX TTX
DALY et al., 1994a DALY et al.,1994a DALY et al., 1994a
Atelopus ssp TTX MEBS et al., 1995 Polypedates sp TTX e derivados TANU et al., 2001 Brachycephalus ephippium TTX PIRES JUNIOR., 2002 Brachycephalus nodoterga TTX PIRES JUNIOR., 2002 Brachycephalus pernix TTX PIRES JUNIOR., 2002
A ocorrência de TTX em diversos grupos de vertebrados e invertebrados
sugere que sua origem seja exógena (MATSUI et al., 1981) e, de alguma maneira,
relacionada com a cadeia alimentar.
57
Figura 13- Tetrodotoxina e derivados isolados de fonte naturais, com exceção de VII (SHOJI et al. 2001). 110 = TTX; 111= 4-epiTTX; 112 = 6-epiTTX; 113= 11-deoxiTTX; 114= 11-norTTX-6(S)-ol; 115= 11-norTTX-6(R)-ol; 116= 11-norTTX-6,6-diol; 117= 4,9-anidroTTX; 118= 6-epi-4, 9-anidroTTX; 119= 5-deoxiTTX; 120= 5,6,11-trideoxiTTX.
NN
HO R4
R3
OH
OO
H2NHO R1
H
H
H
H
NN
HO R2
R1
OH
OO
H2NH O
H
H
2R
OHNN
HO R3
R2
OH2N
HO HO
R1
H
R 3
R 2R 1302
OHC H2OH
C H2OHOH
302
R 1 R 2
304HH OH
C H3
C H2OHH 272
OH
H
H
NN
HO
OH
OH
OO
H2NHO H
COOH
OH
NH2
( C HT X) 393
110 =111 =112 =113 =114 =115 =116 =
118 =119 =
120 =121 =
122 =
R1 R2 R3 R4 MH+(m/z)H OH OH CH2OH 320OH H OH CH2OH 320H OH CH20H OH 320H OH OH CH3 304H OH OH H 290H OH H OH 290H OH OH OH 306
58
1.2.7. HISTRIONICOTOXINAS (HTX)
As histrionicotoxinas foram inicialmente isoladas de Dendrobates
histrionicus (DALY & WITKOP, 1971), e mais tarde de outras espécies de
Dendrobates, Epidobates e Phyllobates (DALY et al., 1992).
Nesta classe já foram identificados 16 alcalóides que têm como
característica comum um sistema 1-azaspiro-[5,5] undecan-8-ol (Figura 14)
(ERSPAMER, 1994).
Estes alcalóides apresentam baixa toxicidade sistêmica afetando
fracamente órgãos vitais (sistema cardiovascular, motor e SNC) em mamíferos. A
HTX (122) atua em canais de sódio e potássio voltagem-dependentes de nervos e
músculos, reduzindo a condutância e bloqueando o receptor nicotínico da junção
neuromuscular (MALEQUE et al., 1984).
R’ R’’ (122) cis–CH2CH=CHC≡CH cis–CH=CHC≡CH 283A (123) cis–CH2CH=CHCH=CH2 cis–CH=CHC≡CH 285E (124) cis–CH2CH=CHC≡CH cis–CH=CHCH=CH2 285B (125) cis–CH2CH=CHCH=CH2 cis–CH=CHCH=CH2 287B (126) -CH2CH2CH=C=CH2 cis–CH=CHC≡CH 285A (127) -CH2CH2CH=C=CH2 cis–CH=CHCH=CH2 287A (128) -CH2CH2CH2C≡CH cis–CH=CHC≡CH 285C
Figura 14- Estruturas de algumas histrionitoxinas: (122) histrionitoxina; (123) diidrohistrionitoxina; (124) neodiidrohistrionitoxina; (125) tetraidrohistrionitoxina; (126) isodiidrohistrionitoxina; (127) isotetrahidrohistrionitoxina; (128) allodiidrohistrionitoxina (DALY et al., 1987).
NH
H R'OH
R''
2
7 8
59
1.2.8. GEPHYROTOXINAS
A gephyrotoxina (129), principal alcalóide de Dendrobates histrionicus, foi
inicialmente descrita em 1974 como uma histrionicotoxinas denominada de HTX-D
(TOKUYAMA et al., 1974), mas Daly e colaboradores (1977) após sua completa
elucidação estrutural a identificaram como sendo um alcalóide tricíclico com um
sistema peridrobenzoindolizidina (dodecaidropirrol [1,2-a] quinolina). Somente dois
alcalóides tricíclicos foram identificados em extratos de pele de Dendrobatídeos, a
gephyrotoxina (129) e a diidrogephyrotoxina (130) (Figura 15) (DALY et al., 1987).
Estes alcalóides são relativamente atóxicos. A dose de 10 mg/kg produziu
somente uma mínima redução da motilidade espontânea em ratos. A
gephyrotoxina parece ser uma antagonista muscarínico, e um bloqueador não
competitivo dos receptores nicotínicos de músculos e células feocromocitoma
(ERSPAMER, 1994).
Figura 15- Estruturas da Gephyrotoxina (129) e diidroGephyrotoxina (130) (DALY et al., 1987).
60
1.3. ESTERÓIDES
Esteróides são compostos que contém um núcleo básico
ciclopentanoperidrofenantreno (Figura 16). É uma classe de compostos naturais
com ampla distribuição na natureza. A diversidade de suas atividades biológicas
compreende o desenvolvimento e o controle do sistema reprodutor, ecdise de
insetos e indução da produção sexual em fungos aquáticos. Além disso, possui
vasta gama de aplicações terapêuticas: funcionam como cardiotônicos,
anticoncepcionais orais, antiinflamatórios, precursores de vitamina D e agentes
anabolizantes (ROBBERS et al., 1997).
Os esteróides que apresentam atividades cardiotônicas são conhecidos
como glicosídeos cardioativos ou cardíacos. Embora os termos glicosídeos
cardioativos e glicosídeos digitálicos sejam, em geral, utilizados como sinônimos,
o termo glicosídeos cardioativos é muito mais abrangente; e o termo glicosídeos
digitálicos deve ser reservado para agentes derivados das espécies do gênero
Digitalis (SIMÕES et al., 2003).
Um grupo de esteróides que apresenta grande especificidade pelo
miocárdio é o das geninas ou agliconas esteroidais. Todas as geninas têm em
comum o esqueleto tetracíclico característicos dos esteróides. O encadeamento
dos ciclos A/B, é do tipo cis, raramente trans, B/C e C/D são trans e cis,
respectivamente, sendo esse último caráter conformacional, específico dos
cardioativos. Todas as geninas apresentam duas hidroxilas, uma secundária em
C-3β e uma terciária em C-14β; um hidrogênio ou uma hidroxila em C-5 e uma
metila em C-13. O último elemento que completa a estrutura básica das geninas
61
cardiotônicas é a presença de um ciclo lactônico α,β insaturado na posição C-17β
acima do plano da molécula (DEWICK, 2002; SIMÕES et al. 2003).
Figura 16- Estruturas básicas dos esteróides
O tamanho do anel lactônico permite distinguir dois tipos de genina:
cardenolídeos e bufadienolídeos (Figura 17). Os cardenolídeos são abundantes
em vegetais, mas já foram identificados em espécies de Bufo japoneses
(SHIMADA et al., 1977). Os bufadienolídeos (lactona com 6 membros) são menos
abundantes entre os vegetais, mas são comumente encontrados no reino animal.
O O
O OEstrano Androstano Prenano
Colano Colestano Cardenolido
Ergostano Estigmastano Bufanolido
123
45
678
91 0
111 2
1 31 4 1 5
1 61 7
A B
C D
62
Recebem este nome por terem sido encontrados, originalmente, em espécies do
gênero Bufo.
Os bufadienolídeos, uma família com mais de 250 substâncias obtidas de
fonte animal e vegetal, apresentam uma variedade de atividades biológicas, como:
cardiotônico, estimulante da pressão sangüínea, respiração e antineoplásico (YE,
et al. 2002). Também apresentam atividade inseticida (SUPRATMAN et al, 2001).
A bufalina, um dos principais bufadienolídeos, apresenta forte efeito
citotóxico e uma potente atividade de indução na diferenciação sobre linhagem de
células de leucemia mielóide (K562,U937, ML1, HL60). Um outro exemplo é a
cinobufagina-1, o principal constituinte ativo do veneno dos anuros, chega
representar de 4-6% do peso seco do animal e tem como característica estrutural
um anel de epóxido (14β ,15 β) (YE et al, 2002).
Cada vez mais esses bufadienolídeos estão sendo sintetizados e/ou
modificados em laboratórios. Trabalhos usando técnicas de biotransformação em
cultura de célula em suspensão estão se tornando uma eficiente ferramenta na
modificação estrutural dos bufadienolídeos sintéticos ou naturais (YE et al, 2002;
2003).
Os bufadienolídeos, também conhecidos como bufogeninas, e seus
derivados com substituintes no C-3 (suberil-argininas, suberil-histidina e suberil-
glutamina), sendo que nos anfíbios esses compostos são basicamente formados
pela conjugação de bufogeninas com suberil-argininas (Figura 18) (SLOTTA &
NEISSER, 1937), estão abundantemente presentes em combinações variadas em
glândulas dérmicas, especialmente em glândulas parotóidas, em espécies dos
gêneros Atelopus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus e principalmente no
63
gênero Bufo, onde foram identificados em mais de 30 espécies (ERSPAMER,
1994).
Figura 17- Estruturas básicas dos cardenolídeos e bufadienolídeos.
Bufogeninas e bufotoxinas atuam de maneira similar aos extratos de
Digitalis. Em concentrações que naturalmente ocorrem no veneno são
cardiotóxicas para muitos mamíferos, apresentando propriedades
cardioaceleradoras, aumentando a força do batimento cardíaco e diminuindo sua
freqüência. As bufogeninas são inibidoras da enzima Na+/K+-ATPase e
provavelmente estão envolvidas na homeostase de eletrólitos e água, aumentando
a pressão arterial (PIRES JUNIOR, 2002).
Essas substâncias são as principais responsáveis pelos envenenamentos
causados em animais domésticos como cães e gatos, podendo levá-los à morte
por parada cardíaca e convulsões violentas. No caso do homem, o contato do
veneno com os olhos pode causar irritação intensa e persistente (SEBBEN et al.,
1993).
OH
OO
O
O
OH
Cardenolídeos Bufadienolídeos
64
Figura 18- Estruturas das bufogeninas e seus derivados (131) bufotalina; (132) bufalina; (133) telocinobufagina; (134) gamabufotalina; (135) arenobufagina; (136) bufotalidina; (137) resibufogenina; (138) marinobufagina; (139) cinobufagina; (140) cinobufotalina; (141) bufotalinina; (142) bufotoxina (bufotalina 3-O-suberilargenina); (143) cardenobufotoxina (sarmentogenina-3-O-suberilargenina) (ERSPAMER, 1994; DALY et al, 2004).
CO2 NH2
R2
R1
RR3
OHHO
OO
H
H
X
R1
RR3
HO
OO
H
H O
R R1 R2 R3 X (131) CH3 H H O Ac H2
(132) CH3 H H H H2
(133) CH3 O H H H H2(134) CH3 H O H H H2(135) CH3 H H H H2
(136) C HO O H H H H2
R R1 R3
(137) CH3 H H(138) CH3 O H H(139) C H 3 H H(140) CH3 O H OAc(141) CHO OH H
R2
H
OAc
OH
O
H
H
Z
(CH2)6CONHCH(CH2)3NHCNH2O
(142)Z= R2 = HO
O
O
O(143)Z = R2 = OH
(131)
65
Esteróides não cardiotônicos como ergosterol, colesterol e o sitosterol
também são encontrados em sapos (Figura 19) (CHEN et al., 1932; ZELNIK et al.,
1964).
Figura 19- Esteróides não cardiotônicos isolados de anfíbios (CHEN et al., 1932; ZELNIK et al., 1964).
HOErgosterol
HOSitosterol
HOColesterol
66
1.4. PROTEÍNAS E PEPTÍDEOS DE ANFÍBIOS
Existem três tipos de polímeros que são essenciais aos processos vitais
das células: os polissacarídeos, os ácidos nucléicos e as proteínas. As proteínas
são encontradas em todas as células vivas, constituindo-se em cerca de ¾ do
peso seco dos tecidos animais. Elas possuem várias funções: estrutural, catalítica,
reguladora e imunológica.
Nos seres humanos estima-se que existam cerca de 5 milhões de
diferentes proteínas. Outras espécies de animais superiores têm também um
número elevado de diferentes proteínas (ALLINGER et al, 1976).
Proteínas são amidas resultantes da reação entre os grupos amina e
carboxila dos α-aminoácidos. O grupo amida, ⎯NHCO⎯, nestes compostos,
designa-se freqüentemente por ligação peptídica. Dependendo do número de
resíduos de α-aminoácidos, esses compostos recebem a designação de
peptídeos. Rang et al. (2000) coloca a linha divisória entre peptídeo e proteína de
50 resíduos de α-aminoácidos. Os mediadores peptídeos e protéicos variam de 3
a 200 aminoácidos (Figura 20).
Os peptídeos foram, até pouco tempo, negligenciados pela farmacologia
que se baseava, essencialmente, em moléculas de sinalização de baixo peso
molecular. Ficou claro, sobretudo nos últimos 20 anos, que os peptídeos são, pelo
menos, tão importantes quanto as moléculas de sinalização, e possivelmente até
com algumas propriedades farmacológicas mais significativas. Contudo, a
manipulação farmacológica da sinalização peptídica ainda continua defasada
(RANG et al., 2000).
67
Em 1955, Vicent du Vigneaud passou para a história e ganhou o Prêmio
Nobel de Química ao determinar a estrutura e o processo de síntese da ocitocina,
o primeiro mediador peptídico a ser caracterizado e o primeiro a ser sintetizado
comercialmente para uso médico. Existem muitos outros mediadores, como, por
exemplo, a substância P, a bradicinina e a angiotensina, que foram identificadas
como peptídeos na década de 1930, mas suas estruturas permaneceram
desconhecidas durante muitos anos. Todos são peptídeos pequenos com média
de 11 resíduos, mas as determinações de suas estruturas e sínteses exigiram
muito trabalho; a estrutura da bradicinina só se tornou conhecida depois de 1960,
ao passo que a da substância P foi publicada em 1970 (RANG et al., 2000).
Em compensação, o uso de métodos mais modernos, atualmente rotineiros,
permitiu que a endotelina, um peptídeo muito maior que os anteriormente citados,
fosse totalmente caracterizado, sintetizado, tendo seu gene clonado em cerca de
um ano, sendo a informação completa publicada num único trabalho (RANG et al.,
2000).
Muitas dessas substâncias, encontradas basicamente em mamíferos,
passaram a ser isoladas de outros animais, principalmente anfíbios.
Da secreção cutânea de uma única espécie, Bombina variegata, foram
isolados peptídeos com atividades antimicrobianas e hemolíticas, além de
proteínas de alta massa molecular, com potente atividade hemolítica, citotóxica e
antibiótica (CSORDAS & MICHL, 1969; CROCE et al., 1973; BALBONI et al.,
1992).
68
Figura 20- Proteínas e Peptídeos Bioativas (Fonte: RANG et al., 2000).
69
1.4.1. PEPTÍDEOS DE ANFÍBIOS
A identificação e estudo de peptídeos de pele de anfíbio contribuíram muito
ao progresso explosivo do conhecimento no campo de peptídeos ativos em
mamífero (ERSPAMER, 1994). Isso é resultado de trabalhos pioneiros como os de
Erspamer, 1981; Spindel & Krane, 1986; 1988 e Bevins & Zasloff, 1990,
mostrando que muitos desses peptídeos isolados de anfíbios apresentam
análogos peptídeos encontrados tanto no cérebro quanto no trato gastrointestinal
de mamíferos.
Como conseqüência de repetidas descobertas que confirmam a
correspondência estrutural entre peptídeos de peles de anfíbios e neuropeptídeos
ou hormônios de mamíferos, é que peptídeo de secreções de peles de anfíbios
constituiu-se em um importante modelo para descoberta de novos hormônios
presentes em mamíferos que não podiam ser estudados devido às baixíssimas
concentrações fisiológicas. A vantagem de se trabalhar com anfíbios é que a
quantidade de material disponível nas espécies até o momento estudadas, chega
a ser cem mil vezes maiores que a encontrada em tecidos de mamíferos
(BATISTA, 1999).
As glândulas granulares da pele de um grande número de espécies de
anfíbios sintetizam e secretam uma enorme variedade de peptídeos
biologicamente ativos (ERSPAMER & MELCHIORRI, 1973; 1980; BEVINS &
ZASLOFF, 1990).
Peptídeos de cerca de 500 espécies diferentes de anfíbios foram estudados
durante as últimas décadas (BEVINS & ZASLOFF, 1990). Tais estudos
demonstraram que peptídeos provenientes da secreção cutânea de anfíbios
70
apresentam um elevado grau de diversidade química e de atividade biológica. A
abundância destes peptídeos varia de espécie para espécie, sendo que, em
determinados gêneros como Xenopus e Phyllomedusa já foram determinados
mais de quarenta peptídeos com as mais diversas atividades biológicas
(BATISTA, 1999).
Esses peptídeos apresentaram, através de bio-ensaios, in vitro e in vivo
amplo espectro de atividades, das quais se destacam: atividades hemolíticas,
bactericidas, anti-fúngica e hormonal. Alguns trabalhos estão destacando a
enorme atividade antimicrobiana presente nas secreções de peles de anfíbios,
especialmente contra fungos patogênicos, bactérias gram-positivas e gram-
negativas (MOR et al., 1991; BOMAN, 1991; BATISTA, 1999; PRATES, 1999), a
qual apresenta um grande potencial terapêutico e farmacológico.
1.4.2. PEPTÍDEOS FARMACOLOGICAMENTE ATIVOS
Erspamer (1994) agrupou esses peptídeos extraídos de secreção cutânea
de anfíbios levando com base em sua estrutura química, afinidades por certos
receptores e atividades biológicas. Os grupos principais: Taquicinina, Bradicinina,
Ceruleína, Bombesina, Sauvagina, Opióides (Dermorfina, Deltorfinas), Tireotropina
(TRH), Xenopsina, Triptofilina, Angiotensina, Adenoregulina e Peptídeos
Antimicrobianos (Magaininas, Bombininas, Dermaseptinas, Brevininas, Caerinas,
Esculentinas, Dicetopiperazinas). Nos anos seguintes novas classes de peptídeos
antimicrobianos foram surgindo como as temporinas (SIMMACO et al., 1996) e
mais recentemente as Phylloseptinas (LEITE et al., 2005).
De uma forma geral, observa-se que peptídeos com atividades
farmacológicas iguais ou equivalentes podem ser encontrados em muitas espécies
71
diferentes de anfíbios, mas não necessariamente em todas. Suas seqüências de
aminoácidos, apesar de não apresentarem óbvia homologia, possuem
substituições altamente conservativas mesmo com relação a seus análogos
provenientes de mamíferos (BATISTA, 1999).
1.4.2.1. TAQUICININAS
Um dos primeiros peptídeos isolados pertence à família das Taquicininas
(ação rápida). Von Euler e Gaddum, em 1931, descreveram o isolamento de uma
substância no extrato alcoólico do cérebro e do intestino de eqüinos, com
propriedades de reduzir a pressão sanguínea e de estimular a região do duodeno
em coelhos. Como essa substância não tinha similaridade com nenhuma outra
com a mesma propriedade, foi nomeada como substância P (SP) (ERSPAMER,
1994). A substância P só foi identificada muito tempo depois por Chang et al.
(1971).
Um outro representante dessa família é a eledoisina, um peptídeo isolado,
em 1947, de glândulas salivares posteriores do octópode mediterrâneo Eledone
moschata. Foi observado que esse peptídeo, identificado por Erspamer e
colaboradores em 1964, reduzia a pressão sanguínea em coelhos e cães,
estimulava preparações isoladas de musculatura lisa intestinal e causava
abundante salivação em cães e ratos (ERSPAMER, 1994). Mais recentemente,
foram identificadas duas taquicininas de mamíferos que ocorrem em menor
abundância, a neurocinina A (NKA) e a neurocinina B (NKB) (HOLZER-PETSCHE
et al., 1987).
72
Em vertebrados essas taquicininas SP, NKA e NKB, são reconhecidas por
agirem como neurotransmissores/neuromoduladores mediando a geração,
transmissão e modulação da informação nociceptiva dos neurônios primários
sensórias. Os receptores dessas taquicininas são referidos como NK1, NK2 e
NK3, respectivamente (YANG et al., 2003). Desvignes et al. (2003) revelaram
através de dados farmacológicos e clínicos que os receptores NK1 e NK2, estão
associados às substâncias antidepressivas.
Extratos da pele de anuro da América do Sul, Leptodactilideos,
Physalaemus biligonigerus (fuscumaculatus), apresentou um espectro de atividade
biológica bastante semelhante ao da eledoisina, desse extrato foi isolado a
substância fisalemina, um undecapeptídeo de estrutura muito similar a da
eledoisina (ERSPAMER et al., 1964). Na Tabela 7, é mostrada a similaridade dos
peptídeos isolados de mamíferos e de anfíbios.
A partir dessa data vários peptídeos com estruturas similares surgiram e a
família foi subdividida em Taquicininas aromáticas e Taquicininas alifáticas. As
Taquicininas aromáticas têm como protótipo a fisalemina e as Taquicininas
alifáticas têm como protótipo a kassinina. Na Tabela 8 e Tabela 9 estão alguns
exemplos desses peptídeos.
As Taquicininas apresentam várias ações farmacológicas potentes no
sistema nervoso central e periférico, neste último ocorrem os melhores resultados.
A fisalemina, comparada a bombesina e a ceruleína, apresentou melhor resposta
eletrofisiológica. Isso confirma que peles de anfíbios possuem substâncias
altamente polares que inibe Na+, K+-ATPase (STIFFLER, 1999).
73
Tabela 7- Taquicininas de diferentes origens (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Origem
Substância P
Neurocinina A
Neurocinina B
Arg-ProLys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2
Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2
Mamíferos
Fisalemina
Eledoisina
pGlu-Ala-Asp-Pro-Asn-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
pGlu -Pro- Ser-Lys-Asp-Ala- Phe-Ile- Gly-Leu-Met-NH2 Anfíbios
Tabela 8- Taquicininas aromáticas isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Tabela 9- Taquicininas alifáticas isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies
Kassinina Asp-Val-Pro-Lys-Ser-Asp-Gln-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Kassina senegalensis
Kassinina II Asp-Glu-Pro-Lys-Pro-Asp-Gln-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Hylambates maculata
Phyllomedusina pGlu-Asn-Pro-Asn-Arg-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2 Phyllomedusa bicolor
PG-K I pGlu-Pro-His-Pro-Asp-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 Pseudophryne guntheri
PG-K II pGlu-Pro-Asn-Pro-Asp-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 P. guntheri
PG-K III pGlu-Pro-His-Pro-Asn-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 P. guntheri
Peptídeo Estrutura Espécies
Fisalemina pGlu-Ala-Asp-Pro-Asn-Lys-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2 Pysalaemus biligonigerus
Uperoleina pGlu-Pro-Asp-Pro-Asn-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2 Uperoleia rugosa
Fisalemina pGlu-Ala--Asp-Pro-Lys-Thr-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2 Uperoleia rugosa
Hilambatina Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-Asp-Arg-Phe-Tyr-Gly-Met-Met-NH2 Hylambates maculata
Ranamarga-rina
Asp-Asp-Ala-Ser-Asp-Arg-Ala-Lys-Lys-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH2 Rana margaratae
PG-SP I pGlu-Pro-Asn-Pro-Asp-Glu-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 Pseudophryne guntheri
Pg-SP II pGlu-Pro-Asn-Pro-Asn-Glu-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 P. guntheri
74
1.4.2.2. BRADICININAS
A bradicinina e calidinas (metionil-lisil-bradicininas) são peptídeos de
mamíferos originários da clivagem dos precursores (cininogênios) presentes na
fração plasmática da globulina. A degradação desses peptídeos ocorre
rapidamente nos tecidos pelas cininases e no plasma pelas carboxipeptidases.
A bradicinina, um dos peptídeos mais importantes desse grupo, é um
nonapeptídeo e foi seqüenciado e sintetizado em 1960. Conhecida primeiramente
por suas inúmeras atividades como: hipotensiva em cães, estimuladora do sistema
digestivo em cobaias e gatos, e do útero de ratas (PRATES, 1999).
Após ter sido isolada de mamíferos, a bradicinina foi isolada e identificada
de extrato da pele de uma perereca européia Rana temporaria por Anastasi et al.
(1965). Em seguida, várias bradicininas foram isoladas de anfíbios (Tabela 10) e
avaliadas farmacologicamente, o que mostrou que essas substâncias são capazes
de ativar os receptores B-1 e B-2 da bradicinina e modular a síntese de DNA, além
de inativar fosfolipase e proteína-quinase C em culturas de células mensageiras
(ERSPAMER, 1994).
Tabela 10- Exemplos de Bradicininas isoladas de anfíbios ERSPAMER,1994
Peptídeo Estrutura Espécies Bradicinina Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Rana temporaria
Filocinina Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-Ile-Tyr(HSO3) Phyllomedusa sauvagei
Bradicinina II Val-Pro-Pro-Gly-Phe-Thr-Pro-Phe-Arg-OH Rana nigromaculata
Ranacinina-O Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-Gly-Lys-His-OH Bombina orientalis
Bradicinina III Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Heleophryne purcelli
Ranacinina-R Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Phe-Arg-Ile-Ala-Pro-Glu-Ile-Val-OH Rana rugosa
75
1.4.2.3. CERULEÍNAS
Ceruleína, o protótipo da família das Ceruleínas, é um decapeptídeo
isolado, por Anastasi et al. (1968), do extrato da pele do hilídeo australiano Hyla
caerulea. Mais tarde foi isolado da pele de um anuro africano Xenopus laevis, e de
um sul-americano Leptodactylus labyrinthicus (ANASTASI et al.,1969; 1970). Na
Tabela 11 são mostradas outras Ceruleínas isoladas de anfíbios.
A ceruleína possui atividade farmacológica e estrutural química muito
semelhante à gastrina e a colecistoquinina (CCK), peptídeos presentes em
mamíferos (ZETLER,1985). Essas duas substâncias são hormônios peptídeos
responsáveis por diversas ações no organismo, como: estimulante da secreção de
insulina, do fluxo sanguíneo, da motilidade gástrica e como agente ansiolítico no
caso da CCK (RANG et al., 2000).
Tabela 11- Exemplos de Ceruleínas isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994
Peptídeo Estrutura Espécies
Ceruleína pGlu-Gln-Asp-Tyr(HSO3)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
Litoria caerulea
CCK 8: Asp-Tyr(HSO3)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 Mamífero
Hexagastrina Tyr(HSO3)-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 Mamífero
Ceruleína [Asn2,Leu5]
pGlu-Asn-Asp-Tyr(HSO3)-Leu-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
Bombina orientalis
Ceruleína [Leu3](3-10)
Asp-Tyr(HSO3)-Leu-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 Heleophryne purcelli
Ceruleína [Glu(Ome)2]
pGlu-Glu(Ome)-Asp-Tyr(HSO3)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
Rana rugosa
Filoceruleína pGlu-Glu-Tyr(HSO3)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
Phyllomedusa sauvagei
76
1.4.2.4. BOMBESINAS
Os três primeiros peptídeos desta família foram descritos por Anastasi et al.
(1971; 1972) que isolou e seqüenciou a bombesina (BN) e a alitesina, extraídos de
pele de Bombina bombina e de Alytes obstetricans, respectivamente, e o terceiro
por Nakajima et al. (1972), a ranatensina de Rana pipiens.
A partir de então, várias bombesinas foram isoladas e seqüenciadas de
extrato da pele de alguns hilídeos, ranídeos e miobatraquídeos: litorina e litorina
[Glu(OMe)2] de Litoria aurea; litorina [Glu(OEt)2] de Uperoleia rugosa; ranatensina
R de Rana rugosa; rodei-litorina de Phyllomedusa rohdei; PG-litorina de
Pseudophryne güntheri; entre outras (ERSPAMER, 1994). O mais recente
membro, um peptídeo rico em prolina chamado PR-bombesina, foi isolado de um
anuro chinês Bombina maxima (LAI et al., 2002).
Esses peptídeos, além da pele, foram isolados de outras partes dos
anfíbios, bombesina de cérebro de Rana ridibunda e litorina do cérebro e ovos de
Xenopus laevis (ERSPAMER, 1994).
Os primeiros representantes desta família descritos de mamíferos foram a
gastrina (GRP), isolada de estômago de porco (McDONALD et al., 1979) e a
neuromedina B, isolada da medula espinhal de porco (MINAMINO et al., 1983).
Nos últimos anos, esses peptídeos também foram purificados e
caracterizados em vários vertebrados: pássaros, peixes, trutas e jacarés. Estão
amplamente distribuídos no trato gastrointestinal e sistema nervoso central dessas
espécies (TSUSHIMA et al., 2003).
Estes peptídeos funcionam como neurotransmissores/neuromoduladores
produzindo múltiplos efeitos, como: hipotermia, anorexia, liberação de hormônios,
77
estimulação da musculatura lisa, antidiurético, hipertensivo e resposta mitogênica
em células cancerígenas da próstata (XIAO et al., 2003; TSUSHIMA et al., 2003).
Há evidência que as bombesinas atuam como fatores de crescimento em
progressão de cânceres de pulmão, pâncreas, próstata, ovário e seio, assim
como, as glioblastomas. Isso levou ao desenvolvimento do antagonista BN/GRP
como a bombesina (RC- 3095), um potente agente antitumor (ROESLER et al.,
2003).
Erspamer (1994), usando como base à estrutura dos tetrapeptídeos C-
terminais, os espectros de atividades farmacológicas e a seletividade de ligação
nos subtipos de receptores, dividiu essa família em três subfamílias: 1a sub-
família, Bombesina com C-terminal tertrapeptídeo Gly-His-Leu-Met-NH2, tento
como protótipo a bombesina; 2a sub-família, Litorina-Ranatensina com C-terminal
tetrapeptídeo Gly-His-Phe-Met-NH2, tendo como protótipo a litorina e a
ranatensina; e 3a sub-família, Filolitorina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-Ser-
Phe(Leu)-Met-NH2, tendo como protótipo a filolitorina (Tabela 12, 13 e 14).
78
Tabela 12- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Bombesina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-His-Leu-Met-NH2 isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies Bombesina pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
B. bombina
Alitesina pGlu-Gly-Arg-Leu-Gly-Thr-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
A. obstetricans
Bombesina [pGlu1] (6-14)
pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 Rana sp
Tabela 13- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Litorina-Ranatensina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-His-Phe-Met-NH2 isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies Litorina pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 Litoria aurea
Litorina [Glu(OMe)2]
pGlu-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 Litoria aurea
Litorina [Glu(OEt)2]
pGlu-Glu(OEt)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 Uperoleia rugosa
Ranatensina
pGlu-Val-Pro-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 Rana pipiens
Ranatensina-C
pGlu-Thr-Pro-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 Rana catesbeiana
PG-Litorina pGlu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 P. guntheri
Tabela 14- Exemplos de Bombesinas, da sub-família Filolitorina com C-terminal tetrapeptídeo Gly-Ser-Phe(Leu)-Met-NH2 isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies Filolitorina pGlu-Leu-Trp-Ala-Val-Gly-Ser-Phe-Met-NH2 Phyllomedusa
sauvagei Fililitorina [Leu]8
pGlu-Leu-Trp-Ala-Val-Gly-Ser-Leu-Met-NH2
Fililitorina [Thr3.Leu8]
pGlu-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-Ser-Leu-Met-NH2
79
1.4.2.5. SAUVAGEÍNAS
A Sauvagina foi, primeiramente, isolado da pele do hilídeo Sul Americano
Phyllomedusa sauvagei. Ele também ocorre em grande quantidade (>100 µg/g de
tecido seco) em extratos da pele de P. burmeisteri, P.palliata, P. edentula, P.
bicolor e em baixas quantidades (5-10µg/g) de P. rohdei, P. hypochondrialis e
Agalychnis helenae. As parotóides e outras glândulas da pele de P. burmeisteri e
P. bicolor possuem dez vezes mais sauvagina que as porções não glandulares da
pele. De acordo com estudos imunohistoquímicos, a sauvagina está presente na
pele de P. trinitatus, mas não em P. azurea (ERSPAMER, 1994).
A sauvagina é um polipeptídeo que possui uma cadeia com 40 resíduos de
aminoácidos (4600 D), estando particularmente bem representados os resíduos de
glutamil-, leucil-, e isoleucil. Na Tabela 15 estão mostradas as seqüências da
sauvagina e de alguns análogos.
Foram isolados alguns homólogos da sauvagina em tecidos de vertebrados,
como: a urotensina I de dois peixes teleósteos, Catostomus commersoni
(LEDERIS et al., 1982) e o Cyprinus carpio (ICHIKAWA et al., 1982); o hormônio
liberador de corticotropina (CRH), com 41 resíduos de aminoácidos, extraído do
hipotálamo de mamífero (VALE et al., 1981); a urocortina, um neuropeptídeo de
mamífero (VAUGHAN et al., 1995); a urocortina II (REYES et al., 2001) e a
urocortina III (LEWIS et al., 2001).
Esses peptídeos apresentam um amplo espectro de atividades entre elas:
taquicardia, glicemia, termoregulação, hipotensão (queda da pressão sanguínea),
liberador do hormônio adrenocorticotrófico e da β-endorfina, reguladora do
80
hormônio α-melanotrófico (α-MSH) responsável pelo processo de adaptação da
coloração na pele de anuros, e acelerador da metamorfose, através do CRH que
estimula a liberação do hormônio tiroidiano de algumas espécies, como: Rana
catesbeiana, Scaphiopus hammondii e Bufo arenarum (ERSPAMER, 1994;
DENVER, 1999; POHL, et al., 2001; COMELISSE, et al., 2002; HAUGER et al.,
2003).
Tabela 15- Exemplos de Sauvaginas (ERSPAMER, 1994)
Peptídeos Estrutura Sauvagina PEGPPISIDLSLELLRKMIEIEKQELELQQAANNRLLLDTI
CRH SQEPPISLDLTFHLLRQVLEMTKADQLAQAHSNRKLLDIA
Urotensina NDDPPISIDLTFHLLRNMIEMARIENEREQAGLNRKYLDEV
1.4.2.6. PEPTÍDEOS OPIÓIDES
Os peptídeos opióides, definidos como peptídeos que exercem efeitos
farmacológicos semelhantes aos dos opiáceos, são codificados por três genes
distintos, cujos produtos são, respectivamente, a pré-pró-opiomelanocortina
(POMC), a pré-pró-encefalina e a pré-pró-dinorfina (RANG, 2000).
No cérebro, esses peptídeos encontram-se amplamente distribuídos, mas
também são encontrados em muitas células não-reuronais, incluindo glândulas
endócrinas e exócrinas e células do sistema imune, bem como em áreas cerebrais
distintas daquelas envolvidas na nocicepção (RANG, 2000).
81
Existem três tipos de receptores de opióides, denominados µ, δ e κ, que
medeiam os principais efeitos farmacológicos dos opiáceos que são: analgesia
(supramedular, medular e periférica), depressão respiratória, constricção da
pupila, redução da motilidade, euforia, disforia, sedação e dependência física.
Os peptídeos opióides analgésicos da pele de anfíbios superam em
potência e seletividade todos os ligantes naturais conhecidos para receptores µ e
δ-opiáceos, possuindo correspondentes no sistema nervoso central e periférico de
mamíferos, onde podem atuar como neurotransmissores e neuromoduladores
(ERSPAMER, 1994).
Levando em conta a seletividade desses peptídeos para receptores µ e δ,
Esrpamer (1994) dividiu-os em duas subfamílias: as dermofinas (µ-seletiva) e as
delorfinas (δ-seletivas). Nas tabelas 16 e 17 são dados alguns exemplos de
peptídeos opióides pertencentes às duas subfamílias.
Os peptídeos opióides da pele de anfíbios são restritos aos hilídeos sul-
americanos pertencentes a uma subfamília altamente especializada denominada
Phyllomedusinae. Em todas as espécies investigadas pertencentes a esta
subfamília foram isolados esses peptídeos (ERSPAMER, 1994).
A deltorfina, um heptapeptídeo extraído de anuros sulamericanos do gênero
Phyllomedusa possui o efeito 1000X da morfina quando administrado na mesma
concentração. Enquanto estes analgésicos podem funcionar como parte da
estratégia de defesa contra potenciais predadores, induzindo efeitos soporíferos; é
possível que eles também atuem no mecanismo do alívio de dor quando um
anfíbio é atacado por um predador (PIRES JUNIOR, 2002).
82
Os peptídeos opióides de anuros foram os primeiros peptídeos, de origem
animal, a possuir resíduos D-aminoácidos, uma descoberta que causou ceticismo
e perplexidade. Desde então, outros dois peptídeos que contêm resíduos D-
aminoácidos foram isolados de um molusco africano, Achatina fulica
(ERSPAMER, 1994).
Tabela 16- Exemplos de Dermorfinas (µ-seletiva) isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies Dermorfina Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 P. sauvagei
Dermorfina [Hyp6] Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2
P. rohdei
Dermorfina [Lys-OH7] Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Lys-OH
P. bicolor
Dermorfina [Trp1,Asn-OH7] Tyr-D-Ala-Phe-Trp-Tyr-Pro-Asn-OH
P. bicolor
Dermorfina (1-5)[Trp1,Asn5-OH] Tyr-D-Ala-Phe-Trp-Asn-OH P. bicolor
Tabela 17- Exemplos de Deltorfinas (δ-seletivas) isoladas de anfíbios (ERSPAMER, 1994)
Peptídeo Estrutura Espécies met-Deltorfina Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp-NH2 P. bicolor
Ala-Deltorfina I Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Gly-NH2
P. bicolor
Ala-Deltorfina II Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Glyo- NH2
P. bicolor
leu-Deltorfina Tyr-D-Leu-Phe-Ala-Asp-Val-Ala-Ser-Thr-Ile-Gly-Asp-Phe-Phe-His-Ser-Ile-NH2
P. bicolor
83
1.4.2.7. HORMÔNIO LIBERADOR DE TIREOTROPINA (TRH)
O TRH do hipotálamo induz a liberação da tireotropina (hormônio
tireoestimulante-TSH) da adeno-hipófise. O TSH é considerado o principal
hormônio pituitário responsável pela liberação do hormônio tireóide (TH), que é
conhecido como um hormônio chave no processo de metamorfose dos anfíbios.
Níveis de TSH são elevados no auge da metamorfose dos anfíbios (OKADA et al.,
2003).
Um tripeptídeo hipotalâmico, pGlu-His-Pro-NH2, foi isolado dos extratos de
pele de Bombina orientalis, em quantidades acima de 40 µg/g de tecido fresco, de
Rana ridibunda e de Rana pipiens, em quantidade duas vezes mais que no
hipotálamo. Secreções de TRH de pele são estimuladas por norapinefrina
(ERSPAMER, 1994).
1.4.2.8. XENOPSINA
O primeiro membro dessa família foi a xenopsina (XT), um octapeptídeo
isolado de Xenopus laevis por Araki et al. (1973). No mesmo ano, Carraway e
Leemann isolaram a neurotensina (NT), um tridecapeptídeo isolado de cérebro de
mamíferos, com similaridade estrutural a da xenopsina, principalmente nas
posições dos seus aminoácidos C-terminais. Estudos sobre suas atividades
biológicas mostraram que ambos aumentam a permeabilidade vascular, inibem a
secreção do ácido gástrico, estimulam a secreção pancreática exócrina e
aumentam a contratilidade isolada da região fúndica do estômago de ratos e da
porção ileal do intestino de porcos (FEURLE, 1998).
84
Seguidas investigações mostraram a presença de peptídeos relacionados a
xenopsina e neurotensina nos tecidos da pele e gastrointestinal de vários anfíbios
(CARRAWAY et al., 1982; FLUCHER et al.,1988; SHAW et al., 1992).
Um outro importante peptídeo relacionado a xenopsina é a xenina, um
peptídeo com 25 resíduos de aminoácidos isolado e identificado por Feurle et al.
(1992) em extrato da mucosa gástrica, da região duodenal e jejunal do homem. A
similaridade estrutural nestes peptídeos está na porção C-terminal, que segundo
alguns trabalhos citados por Silvestre et al. (2003) é o fragmento essencialmente
responsável pelas inúmeras atividades biológicas atribuídas a xenina. Na Tabela
18 são dados algumas estruturas de membros da família
Xenopsina/Neurotensina/Xenina.
Tabela 18- Exemplos de alguns membros da família Xenopsina/Neurotensina/Xenina (FEURLE, 1998)
Peptídeo Estrutura Xenopsina pGlu-Gly-Lys-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH
Neurotensina pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH
Xenina Met-Leu-Thr-Lys-Phe-Glu-Thr-Lys-Ser-Ala-Arg-Val-Lys-Gly-Leu-Ser-Phe-His- Pro-Lys-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH
Neuromedina Lys-Ile-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH
Cinetensina Ile-Ala-Arg-Arg-His-Pro-Tyr-Phe-Leu-OH
85
1.4.2.9. TRIPTOFILINAS
Montecucchi et al. (1984) trabalhando com extrato metanólico da pele de
Phyllomedusa rohdei, observaram que algumas frações provenientes de uma
coluna de alumina, usando etanol como eluente (50, 70 e 95%), deram positivo
para o reagente Erlich’s, indicando a presença do aminoácido triptofano. As
substâncias presentes nestas frações foram chamadas coletivamente de
Triptofilinas (TPHs).
As Triptofilinas são peptídeos heterogêneos com atividades biológicas
indefinidas. Dependendo do número de resíduos de aminoácidos, as Triptofilinas,
são classificados em: Triptofilinas tetrapeptídicas (TPH-4), Triptofilinas
pentapeptídicas (TPH-5), Triptofilinas heptapeptídicas TPH-7 e Triptofilinas
decatripeptídicas (TPH-13). Alguns exemplos desses peptídeos estão na Tabela
19 (ERSPAMER, 1994).
Uma das características comum nestas substâncias é a presença de
resíduos de prolina em todas as substâncias descritas, com exceção da <Glu-Ala-
Trp-Met. Em particular, TPH-4 e TPH-5 possuem resíduo de prolina ligado ao
triptofano (MONTECUCCHI, 1985).
Além de Phyllomedusa rohdei, esses peptídeos foram isolados de P.
sauvagei e P. bicolor. Esses peptídeos representam o primeiro exemplo de
peptídeos de anuros identificados simplesmente por reação de cor em
cromatografia de camada delgada (ERSPAMER, 1994).
A atividade farmacológica e os correspondentes em tecidos de mamíferos
desses peptídeos, ainda, não foram estabelecidos, embora bioensaios tenham
revelado um aumento da síntese protéica no fígado de ratos (PRATES, 1999).
86
Tabela 19- Exemplos de Triptofilinas isoladas de anfíbios (ERSPAMER et al., 1985).
Subfamília Estrutura
TPH-4 p-Glu-Pro-Trp-Met-NH2
p-Glu-Pro-Trp-Val-NH2
Phe-Pro-Trp-Leu-NH2
p-Glu-Pro-Trp-Met-OH
p-Glu-Ala-Trp-Met-OH
Phe-Pro-Pro-Trp-OH TPH-5 Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH2
Phe-Pro-Pro-Trp-Val-NH2
Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-NH2
Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OH
TPH-7 Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Met-OH TPH-13 p-Glu-Glu-Lys-Pro-Trp-Pro-Pro-Pro-Ile-Tyr-Pro-Met-OH
1.4.2.10. ANGIOTENSINAS
O principal representante dessa família é a angiotensina II (ANG II), um
produto biológico do sistema renina-angiotensina (RAS) que está envolvido na
regulação da pressão sanguínea e no balanço de sal e água de muitos
vertebrados (SLIVKOFF & WARBURTON, 2003).
A angiotensina II é um vasoconstritor extremamente potente, cuja potência
é cerca de 40 vezes maior do que a da adrenalina na elevação da pressão arterial.
Seus efeitos periféricos assemelham-se aos dos agonistas dos receptores α1,
visto que afeta principalmente os fluxos sangüíneos cutâneo, esplâncnicos e
renais, com menos efeito sobre o fluxo sangüíneo para o cérebro e o músculo
esquelético (RANG, 2000).
Os componentes do sistema RAS também estão presentes em anfíbios.
Atividade renina é encontrada no plasma e rins em várias espécies de anuros,
incluindo Rana catesbeiana, Rana esculenta e Bufo bufo (SANDBERG & JI, 2001).
87
O extrato da pele de Crinia georgiana forneceu a crinia-angiotensina II, um
tripeptídeo (Ala-Pro-Gly) ligado ao resíduo de ácido aspártico da angiotensina
convencional. Esse peptídeo mostrou espectro de atividade similar ao da
angiotensina de mamíferos, estimulando a musculatura lisa vascular e
extravascular e da vesícula biliar de ratos e coelhos (ERSPAMER, 1994).
Em mamíferos, a ANG II é formada durante um estresse hipotensivo e
hiperosmótico, induzido pela hemorragia e/ou desidratação (figura 21)
(SANDBERG & JI, 2001). Estudos recentes em anfíbios relacionam a ANG II a
regulação da permeabilidade da pele e a concentração de sal nos tecidos,
determinando o gradiente osmótico de pressão (VIBORG & ROSENKILDE, 2001;
REA et al., 2002).
Figura 21- Formação das Angiotensinas I – IV a partir da extremidade N-terminal da proteína precursora, o angiotensinogênio (Fonte: RANG et al., 2000).
88
1.4.2.11. ADENOREGULINA
Este peptídeo foi isolado primeiramente da secreção da pele de
Phyllomedusa bicolor e, possivelmente, inclui D-aminoácido em sua cadeia
polipeptídica. O espectro de ação da adenoregulina baseia-se na sua capacidade
de se ligar aos receptores A1 de adenosina nas membranas do cérebro de ratos,
agindo como estimulante central. Além dos efeitos farmacológicos, a
adenoregulina mostrou ser potentemente ativa na inibição do crescimento de
bactérias, fungos e protozoários (PRATES, 1999).
A adenoregulina exibe grande semelhança estrutural com a dermaseptina
isolada da pele de Phyllomedusa sauvagii (Tabela 20). Ambos os peptídeos são
altamente básicos e hidrofóbicos, duas características observadas em vários
peptídeos antimicrobianos isolados de pele de anfíbios (AMICHE et al.,1993).
Tabela 20- Estrutura da adenoregulina e da dermaseptina
Peptídeo Origem Seqüência Adenoregulina Phyllomedusa
bicolor GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVS30EAV
Dermaseptina Phyllomedusa sauvagii
ALWKTM•••LKKLGTMALH•AGKAALGAAADTIS30QGTQ
89
1.4.2.12. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS (AMPS)
As glândulas localizadas na pele dos anfíbios são ricas fontes de peptídeos
antimicrobianos, que são potencialmente ativos contra um largo espectro de
microorganismos e não apresentam toxicidade em células normais de mamíferos
(FEDER et al., 2001).
Esses peptídeos são usados por estes animais como parte de seu sistema
de defesa contra microorganismos patogênicos (BOMAN, 1991; ZASLOFF, 1992;
PIERRE, 2000). Rollins-Smith et al. (2002) mostraram, pela primeira vez com mais
evidência, que esses peptídeos operam como primeira linha de defesa contra os
microorganismos associados com o declínio global dos anfíbios.
O primeiro peptídeo de pele de anfíbio que apresentou atividades
antimicrobianas, além da hemolítica, foi a bombinina. Este peptídeo foi isolado, há
mais de 30 anos, de Bombina variegata (CSORDAS & MICHL, 1969). A partir
desta data, mais de cinqüenta peptídeos antimicrobianos de anfíbios já foram
isolados, tendo como principal característica à natureza catiônica e a capacidade
de permeabilizar membranas de microorganismo (PRATES, 1999).
Baseados em características como seqüência e estrutura tridimensional,
esses peptídeos de anfíbios foram agrupados em três grandes grupos: os
peptídeos em hélice anfipática, como as magaininas e peptideos análogos
isolados de Xenopus laevis, as bombininas de Bombina orientalis e B. variegata, e
as dermaseptinas de espécies da subfamília Phyllomedusinae (Phyllomedusa
sauvagei, P. bicolor, P. oreades, entre outras); os peptídeos que possuem dois
resíduos de cisteínas na parte C-terminal, os quais formam uma ponte dissulfeto,
como as brevininas 1 e 2, as gaegurinas, ranalexinas, esculentinas 1 e 2 isolados
90
de várias espécies da família Ranidae; e os peptídeos de 10 a 13 resíduos
conhecidos como pequenos peptídeos isolados de anfíbios, como as temporinas,
isolados de Rana temporaria, R. catesbeiana, R. clamitans, R. pipiens e R.
iuteiventris (AMICHE et al., 1999; LAI et al., 2002). Na Tabela 21 são dados alguns
exemplos de Peptídeos Antimicrobianos.
Além das atividades antimicrobianas, alguns desses peptídeos apresentam
outras atividades farmacológicas, o que reforça, ainda mais, sua utilização como
potentes agentes terapêuticos. As Magaininas, que são reconhecidas como um
potente antimicrobial, apresentou significativa atividade anti-tumoral (BAKER et al.,
1993; CRUCIANE et al., 1991; OHSAKI et al., 1991). Alguns derivados sintéticos
das magaininas possuem atividades antiviral contra herpes tipo I (GENCO et al.,
2003) e magaininas A e C mostraram atividade espermicida (LAI et al., 2002). Os
peptídeos polifemusina e taquifesina têm atividade anti-HIV (MALOY & KARI,
1995). A dermaseptina DS 01, isolada de Phyllomedusa oreades, apresentou
atividade anti-trypanosoma cruzi (BRAND et al., 2002). Algumas bombininas
possuem atividade hemolítica (MIELE et al., 1998). As Phylloseptinas, conhecidas
por serem bactericidas, apresentaram atividades anti-protozoário (LEITE, 2005).
A cada ano vários novos AMPs são identificados a partir de espécies de
anuros. Alguns desses novos peptídeos apresentam pouca ou nenhuma
homologia com os já existentes, conseqüentemente novas famílias estão surgindo
como as Tigerininas, Pseudinas, Maximinas, Japonicinas, Nigrocinas, Distinctinas
(RINALDI, 2002) e Phylloseptinas (LEITE, 2005). Na Tabela 22 são mostradas as
estruturas de alguns novos peptídeos isolados de espécies de anuros.
91
Tabela 21- Exemplos de alguns Peptídeos Antimicrobianos isolados de anfíbios (AMICHE et al., 1999; LEITE, 2005)
Peptídeos Estruturas Dermaseptina B Dermaseptina B1 AMWKDVLKKIGTVALH-----AGKAALGAVADTISQ NH2 Dermaseptina B3 ALWKNMLKGIGK----------LAGQAALGAVKTLVGA NH2 Dermaseptina B4 ALWKDILKNVGK---------AAGKAVLNTVTDMVNQ NH2 Brevininas-1 Brevininas-1 FLPVLAGIAAKVVPALFCKITKKC Brevininas-1E FLPLLAGLAANFLPKIFCKITKKC Brevininas-1EA FLPAIFRMAAKVVPTIICKITKKC Brevininas-2 Brevinina-2 G-LLDSLKGFAATAGKGVLQSLLSTASCKLAKTC Brevininas-2E G-IMDTLKNLAKTAGKGALQSLLNKASCKLSGQC Brevininas-2EA G-ILDTLKLNAISAAKGAAQGLVNKASCKLSGQC Esculentina-1 Esculentina-1 GIFSKLGRKKIKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTGIDIAGCKIKGEC Esculentina-1ª GIFSKLAGKKIKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTGIDIAGCKIKGEC Esculentina-1B GIFSKLAGKKLKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTGIDIAGCKIKGEC Esculentina-2 Esculentina-2ª GILSLVKGVAKLAGKGLAKEGGKFGLELIACKIAKQC Esculentina-2B GIFSLVKGAAKLAGKGLAKEGGKFGLELIACKIAKQC Gaegurina-4 GILDTLKQFAKGVGKDLVKGAAQGVLSTVSCKLAKTC Temporina Temporina FLPLIGRVLSGILNH2 Temporina LLPIVGNLLKSLL NH2 Phylloseptinas PS-1 FLSLIPHAINAVSAIAKHN NH2 PS-2 FLSLIPHAINAVSTLVHHF NH2 PS-3 FLSLIPHAINAVSALANHG NH2
Tabela 22- Principais características dos recentes Peptídeos Antimicrobianos descritos (RINALDI, 2002)
Peptídeo Estrutura Espécies Japonicina- 1 FFPIGVFC1KIFKTC2 (S-S, anel peptapeptídeo) Rana japonica Japonicina- 2 FGLPMLSILPKALC1ILLKRKC2 (S-S, anel octapeptídeo) Temporina- 1 ILPLVGNLLNDLL-Am (α -helice) Nigrocina1 GLLDSIKGMAISAGKGALQNLLKVASC1KLDKTC2
(S-S,anel peptapeptídeo) R. nigromaculata
Nigrocina 2 GLLSKVLGVGKKVLC1GVSGLC2 (S-S,anel peptapeptídeo) Brevinina-20a*
GLFNVFKGALKTAGKHVAGSLLNQLKC1KVSGGC2
(S-S, anel heptapeptídeo) R. ornativentris
Temporina- 10d*
FLPLLASLFSGLF-Am (α -helice) P. guntheri
Tigerinina 1* FC1TMIPIPRC2Y-Am (S-S,anel nonapeptapeptídeo) R. tigerina Pseudina- 2* GLNALKKVFQGIHEAIKLINNHVQ (α -helice) Pseudis paradoxa Maximina 1* GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-Am (α -helice) Bobina maxima XT-1* GFLGPLLKLAAKGVAKVIPHLIPSRQQ (α -helice) Xenopus tropicalis Distintina ENREVPPGFTALIKTLRKC1KII (CADEIA 1)
NLVSGLIEARKYLEQLHRKLKNC2KV(CADEIA 2) (S-S, heterodímero) Phyllomedusa
distincta *Somente o membro representativo da multi-isoforma é mostrado. ‘Am’ indica uma amida C terminal; os números subscritos indicam os aminoácidos da ponte dissulfeto.
92
1.5. ANUROS HYLIDAE
Os anuros, principais representantes da classe dos anfíbios, são
cosmopolitas, não ocorrendo, entretanto, nas latitudes extremas norte, Antártica e
a maioria das ilhas oceânicas. Eles estão divididos em 29 famílias, sendo a
família Hylidae uma das mais representativas, possuindo 05 subfamílias (Hylinae,
Phyllomedusinae, Hemiphractinae, Pelodryadinae e Pseudinae) com 42 gêneros e
cerca de 550 espécies (AMNH, 2003).
Essas espécies estão distribuídas na América do Sul e do Norte, Índia
Ocidental, Eurásia Temperada, extremo norte da África e no arquipélago japonês.
É na subfamília Hylinae que se concentra grande parte desses gêneros, 26 no
total, com destaque para os gêneros Hyla, Scinax e Osteocephalus, com cerca de
335, 84 e 17 espécies, respectivamente (AMNH, 2003).
1.5.1. GÊNERO OSTEOCEPHALUS
O gênero Osteocephalus, após ser revisado e reorganizado por Trueb e
Duellman (1971), possuía somente 05 espécies. Nos anos seguintes, várias novas
espécies foram sendo descritas e/ou transferidas para este gênero (DUELLMAN,
1974; HENLE, 1981; MARTINS & CARDOSO, 1987; DUELLMAN & HOOGMOED,
1992; JUNGFER & SCHIESARI, 1995; DUELLMAN & MENDELSON, 1995;
GORZULA & SEÑARIS, 1996; RON & PRAMUK, 1999; JUNGFER et al., 2000;
SMITH & NOONAN, 2001; JUNGFER & HÖDL, 2002). Atualmente possui cerca de
17 espécies (AMNH 2003).
Entre as espécies de Osteocephalus nenhuma foi estudada do ponto vista
químico/farmacológico.
93
As espécies do gênero Osteocephalus têm hábitos noturnos e arbóreos,
habitam quase exclusivamente as florestas primárias, sendo um importante
constituinte da fauna das florestas tropicais intactas, e são de tamanhos que
variam do médio ao grande porte (JUNGFER et al., 2000). Eles estão amplamente
distribuídos ao longo da Bacia Amazônica, Guianas e partes da Floresta Atlântica
da América do Sul (Figura 22).
Figura 22- Distribuição Geográfica das Espécies do Gênero Osteocephalus.
94
1.5.1.1. OSTEOCEPHALUS TAURINUS
Classe: Amphibia Sub-família: Hylinae Ordem: Anura Gênero: Osteocephalus Família: Hylidae Espécie: Osteocephalus taurinus
O Osteocephalus taurinus (Figura 23), descrito por Steindachnerde (1862),
foi uma das espécies que deu origem ao gênero (TRUEB & DUELLMAN, 1971).
Tem cor marrom, como quase todos os Osteocephalus, e é a mais distribuída
entre as espécies; é encontrado no Equador, Brasil, Bolívia, Peru, Colômbia,
Venezuela e Guianas. O dimorfismo sexual é bem evidente nessa espécie. O
tamanho do macho é de 66-85 mm enquanto o das fêmeas é de 76-103 mm. A
pele da fêmea é mais lisa (RODRÍGUEZ & DUELLMAN, 1994).
Foto de Morley Read
Figura 23- Osteocephalus taurinus
95
1.5.1.2. OSTEOCEPHALUS OOPHAGUS
Classe: Amphibia Sub-família: Hylinae Ordem: Anura Gênero: Osteocephalus Família: Hylidae Espécie: Osteocephalus oophagus
O Osteocephalus oophagus (Figura 24) foi descrito por Jungfer e Schiesari
(1995), é de tamanho médio, cerca de 47 mm para os machos e 63 mm para as
fêmeas, de cor marrom com manchas escuras. É endêmico no estado do
Amazonas / Brasil, mas também é encontrado nas Guianas e Venezuela (AMNH,
2003).
Foto de Christian Marty
Figura 24- Osteocephalus oophagus
96
1.5.1.3. OSTEOCEPHALUS LANGSDORFFII
Classe: Amphibia Sub-família: Hylinae Ordem: Anura Gênero: Osteocephalus Família: Hylidae Espécie: Osteocephalus langsdorffii
Primeiramente, descrito como Hyla langsdorffii por Dumeril e Bibron (1841),
foi depois classificada no gênero Osteocephalus por Duellman (1974). São
pererecas de porte muito grande, especialmente as fêmeas que podem
ultrapassar 100 mm de comprimento, do focinho ao ânus. Com colorido
esverdeado, exibem no corpo desenhos variados de cor marrom, dando-lhe um
aspecto de casca de árvore com liquens (IZECKSOHN & CARVALHO-E-SILVA,
2001). Diferente das outras espécies de Osteocephalus, o O. langsdorffii (Figura
25) habita a Floresta Atlântica sendo encontrado nos estados do Rio de Janeiro,
Espírito Santos e Bahia, e no nordeste da Argentina (AMNH, 2003).
Foto de Rodrigo Morales
Figura 25- Osteocephalus langsdorffii
97
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL
O Brasil é detentor de uma megadiversidade, mas somente uma pequena
parcela de sua riqueza animal, vegetal e de microorganismos foi, até nos dias
atuais, objeto de pesquisa. Está realidade não é diferente com os anfíbios, com
cerca de 600 espécies, apenas uma minoria destas espécies foi, até então,
estudada.
O presente trabalho tem como objetivo estudar as secreções cutâneas de
três espécies de anfíbios (Osteocephalus taurinus, Osteocephalus oophagus e
Osteocephalus langsdorffii) oriundos da Amazônia e da Mata Atlântica brasileira.
2.2. ESPECÍFICOS
• Comparar a composição molecular das secreções cutâneas das espécies
de Osteocephalus taurinus, Osteocephalus oophagus e Osteocephalus
langsdorffii;
• Isolar, purificar e identificar os constituintes da secreção cutânea de
Osteocephalus taurinus;
• Avaliar as atividades biológicas dos constituintes da secreção cutânea de
Osteocephalus taurinus.
98
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. COLETA DO MATERIAL
Os espécimes, de ambos os sexos, de Osteocephalus taurinus e
Osteocephalus oophagus foram coletados no Campus da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) (coordenadas geográficas: 03º 02’ 45” S, 59º 28’ 52” W), e na
Reserva Ducke (RD), pertencente ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
(INPA), localizados na periferia da cidade de Manaus/AM (Tabela 23). Os
espécimes foram identificados pelo Prof. MSc. Marcelo Gordo do Departamento
de Ecologia da UFAM.
Os espécimes, de ambos os sexos, de Osteocephalus langsdorffii foram
coletados na Reserva Santa Lúcia (RSL) (19º 59’ 23” S, 40º 36’ 42” W), na cidade
de Santa Teresa/ES (Tabela 23), e identificadas pelo Prof. Dr. José P. Pombal Jr.
do Museu Nacional do Rio de Janeiro (MN/UFRJ).
As coletas foram realizadas sob a licença do Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e Recursos Renováveis (IBAMA) para captura e transporte de anfíbios
N° 0637/91A.C.
Tabela 23- Número de individuos e local de coleta das três espécies de Osteocephalus
N° de individuos Espécies Local de coleta Código
09 Osteocephalus taurinus RD/UFAM EXTTA
04 Osteocephalus oophagus UFAM EXTOO
02 Osteocephalus langsdorffii RSL EXTLA
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) AM; Reserva Ducke (RD) AM; Reserva Santa Lúcia (RSL) ES.
99
3.2. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
Os espécimes foram cuidadosamente lavados em água corrente,
numerados, medidos e identificados quanto ao sexo, tamanho e local de coleta. As
suas secreções cutâneas foram obtidas por estimulação elétrica.
3.2.1. ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA
Os espécimes, depois de lavados, foram submetidos à estimulação elétrica
com aproximadamente 8 volts, os eletrodos foram colocados em contato
diretamente sobre a superfície dorsal (Figura 26) por um tempo de 5 – 8 segundos
por 3 – 5 vezes com intervalo de 2 – 4 segundos, produzindo contração muscular
involuntária, resultando na compressão das glândulas granulares, expelindo uma
secreção levemente esbranquiçada. As secreções cutâneas obtidas de
Osteocephalus taurinus (EXTTA), O. oophagus (EXTOO) e O. langsdorffii
(EXTLA), foram filtradas, congeladas, liofilizadas (Centrivap Concentrator
LABCONCO) e armazenadas a -80 °C.
Figura 26- Obtenção das secreções EXTTA, EXTOO e EXTLA, por estimulação elétrica.
100
No intuito de analisar as possíveis diferenças entre as secreções de
diferentes indivíduos levando em consideração ao tamanho, sexo e local de
coleta, as secreções dos espécimes de Osteocephalus taurinus foram analisadas
individualmente (Tabela 24). Após as análises químicas comparativas todas as
amostras foram agrupadas numa mesma amostra (EXTTA).
Tabela 24- Extratos obtidos por estimulação elétrica de Osteocephalus taurinus- EXTTA
3.3. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DOS CONSTITUINTES
Para isolamento e purificação dos constituintes foram seguidas as
metodologias de Prates, 1999 e Batista, 1999.
Os extratos secos EXTTA, EXTOO e EXTLA foram divididos em alíquotas
de 2,0 mg e dissolvidos em 200 µL de água Milli Q contendo TFA 0,1% (v/v).
Essas alíquotas foram submetidas à Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) (SHIMADZU, Classe LC10 AD-VP). A coluna utilizada foi de fase reversa,
semipreparativa 218TP C18, 5 µ (10 X 250mm) da Vydac, que foi previamente
equilibrada em solução de H2O/TFA 0,1%. Foi utilizado um fluxo de 2,5 mL/min e
as frações foram coletadas manualmente sob um gradiente linear de acetonitrila (0
N° Sexo Tamanho(cm) Local de coleta
Extrato código
01 M 6,8 RD 1-EXTTA 02 M 7,5 RD 2-EXTTA 03 M 7,6 RD 3-EXTTA 04 F 9,3 UFAM 4-EXTTA 05 M 6,5 UFAM 5-EXTTA 06 F 9,3 UFAM 6-EXTTA 07 F 9,0 UFAM 7-EXTTA 08 F 9,5 UFAM 8-EXTTA 09 M 8,9 UFAM 9-EXTTA
101
a 65% em 55 min.) contendo TFA 0,1%. O experimento foi monitorado
simultaneamente a 216 e 280 nm.
As frações obtidas, após serem liofilizadas, foram dissolvidas em 100 µL de
água Milli Q/TFA 0,1% (v/v) e cromatografadas em sistema CLAE usando-se
coluna de fase reversa, analítica Vydac 218TP 54, C18, 5 (4,6 × 250mm). A coluna
foi previamente equilibrada na mesma solução de TFA 0,1% (v/v) descrita
anteriormente. Foi utilizado um fluxo de 1,0 mL/min e os constituintes isolados
foram coletados manualmente sob diferentes gradientes de acetonitrila / TFA 0,1%
(v/v). O experimento foi monitorado a 216 e 280 nm.
3.4. ESPECTROMETRIA DE MASSAS
3.4.1. ESPECTROMETRIA DE MASSAS SISTEMA MALDI-TOF
As secreções das três espécies (EXTTA, EXTOO e EXTLA), foram
submetidas à espectrometria de massas usando um sistema MALDI-TOF, Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight, modelo Voyager-DE-STR
Biospectrometer (Applied Biosystems, MA, USA). As frações oriundas da
cromatografia analítica foram, também, submetidas à mesma técnica para avaliar
o grau de pureza. Os íons moleculares foram formados usando-se pulsos de laser
(fótons) na faixa do ultravioleta (laser de nitrogênio, λ = 337 nm). Os sinais de
ionização foram monitorados usando-se osciloscópio digital (Tectrnix TDS 540).
Alíquotas de 3 µL das amostras foram misturadas com 9 µL de uma solução
saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (α-ciano) ou ácido diidroxibenzóico
(DHB) saturada em acetonitrila e TFA a 3% (5:1 v/v). A mistura foi agitada
vigorosamente por cerca de um minuto em agitador Vortex Genie 2 (Scientific
102
Industries Inc., Bohemia, USA). 1 µL das amostras foi aplicado sobre a placa de
amostra do sistema MALDI em quadruplicada, e deixada em repouso à
temperatura e pressão ambiente para cristalização. O equipamento foi operado
nos modos refletor e linear.
Para a obtenção dos dados, as amostras foram bombardeadas com pulsos
de laser, principalmente nas áreas onde foi detectada a maior geração de sinais.
O processamento dos dados foi realizado usando-se programa GRAMS 386,
fornecido pelo fabricante.
Após análise, as frações de interesse foram submetidas a várias técnicas
de identificação, síntese química, testes biológicos e avaliação quanto às
interações com metais.
Os processos realizados para cada espécie estão explícitos na figura 28.
3.4.2. ESPECTROMETRIA DE MASSA SISTEMA “ELECTROSPRAY IONIZATION” (ESI)
Os experimentos foram realizados num espectrofotômetro Quattro II
equipado um sistema de ionização Electrospray Z-spray (ESI/MS) da Micromass.
Os parâmetros adotados para as análises de EM e EM/EM foram:
temperatura de desolvatação de 150 oC, temperatura do bloco de 90 oC, voltagem
do cone de 10 eV e 20 eV e voltagem do capilar de 4,20 kV. O Nitrogênio foi
utilizado como o gás inerte de solvatação e nebulização. Para as fragmentações a
voltagem de colisão foi ajustada para 33,0 V. O espectrômetro de massa foi
operado por um sistema operacional de MassLynx TM.
103
3.4.3. ESPECTROMETRIA DE MASSA SISTEMA “QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT” (Q-TOF)
Os experimentos foram realizados no equipamento Q-TOF ULTIMA API
(waters/Micromass – Manchester, UK), modo W e ESi+, com probe NanoFlow e
fluxo de 2,0 µL por minuto. A voltagem aplicada no capilar foi de 2 a 2,5 KV.
3.4.4. SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS POR PSD
Os fragmentos protéicos seqüenciados por Post Sourse Decay (PSD)
tiveram sua seqüência determinada de acordo com a notação estabelecida por
Roepstorff e Fohlman em 1984 e modificada por Johnson e colaboradores em
1987 (Figura 27).
104
Figura 27- Fragmento de íons observados em espectro de EM/EM. Fonte http://matrixscience.com.
3.5. ESPECTROMETRIA DE IV, UV E RMN 1H E 13C
Os espectros no Infravermelho (IV) foram realizados em um equipamento
modelo Nicolet-Magna-IR 760 com transformada de Fourier (FT) usando pastilhas
de KCl. Os dados de Ultravioleta (UV) foram obtidos diretamente do cromatógrafo
(CLAE-FR, Waters modelo 510 pump com detector fotodiodo UV modelo 996),
usando uma coluna C18 semi-preparativa (µ-Bondapark C18, Waters).
105
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C foram
obtidos em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz. Além das técnicas
convencionais (RMN-1D), foram realizados experimentos de RMN-2D como:
COSY e HSQC.
3.6. SEQUENCIAMENTO DOS PEPTÍDEOS
A seqüência completa de aminoácidos dos peptídeos purificados foi
determinada usando o seqüenciador automatizado pelo método de degradação de
Edman em sequenciador de peptídeos PPSQ-23 (SHIMADZU Co., Kioto, Japão).
No sequenciamento pelo método de Edman (N-terminal), o peptídeo é
fragmentado em tantas etapas quantos forem os seus resíduos de aminoácidos, e
esses são identificados um a um de acordo com seus tempos de retenção em
coluna de fase reversa (anexo 01).
3.6 DETERMINAÇÃO DAS LIGAÇÕES DISSULFETO
A existência de pontes dissulfeto, em um peptídeo ou proteína, é um fator
crítico no seu seqüenciamento e clivagem enzimática. As pontes dissulfeto
existentes em uma cadeia polipeptídica podem ser quantificadas por
espectrometria de massa, através da diferença de massa após reação simples de
redução das mesmas (FINDLAY & GEISON apud SANTOS, 2003). Nas reações
de redução (anexo 02), o material protéico foi solubilizado em solução de
bicarbonato de amônio 0,1 molL-1 (pH 8,0) e a ele adicionou-se solução recém
preparada de DTT 1,0 mol.L-1, resultando em uma concentração final de 10
106
mmol.L-1 em bicarbonato de amônia 0,1 mol.L-1 (pH 8,0). O material foi incubado
por 15 minutos a 37 °C, e depois sua massa foi analisada por MALDI-TOF/MS.
3.7. ALQUILAÇÃO DAS CISTEÍNAS
A alquilação das cisteínas foi realizada segundo modificação do método de
Findlay e Geison, 1989 (apud SANTOS, 2003). O material protéico foi solubilizado
em solução de cloridrato de guanidina 6,0 mol.L-1 e em bicarbonato de amônio 0,1
mol.L-1 (pH 8,0), e deixado reagir com DTT (concentração final de 10 mmol.L-1 )
por 30 min. a 37 °C. Após este período, adicionou-se solução de iodoacetamida
com concentração final igual a 50 vezes a concentração de cisteína da solução, e
deixou-se o material reagiu por 15 min. a 37 °C, na ausência de luz (anexo 03). A
dessalinização e a purificação do material foram feitas por cromatografia de fase
reversa.
3.8. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR)
Os estudos de interação molecular foram feitos em equipamento BIACORE
3000 (BIACORE Co) usando-se chip sensor de dextran carboximetilado com β–
tripsina imobilizada. A tripsina imobilizada foi adquirida da Sigma Co., e purificada
por RP-HPLC. O chip (modelo CM5) depois de hidratado foi ativado pela
passagem de EDC 0,1 mol.L-1 e NHS 0,025 mol L-1 a um fluxo de 5µ L/min durante
7 minutos. A β–tripsina foi imobilizada ao chip sensor ligando-se covalentemente
aos ésteres formados durante a etapa de ativação (anexo 04). Os ésteres
restantes foram bloqueados por cloreto de etanolamina (pH 8,0). Uma célula de
referência foi preparada da mesma forma, mas sem a utilização da β–tripsina,
107
para correções em virtude da mudança no índice de refração, ocasionadas pelo
tampão utilizado e ligações inespecíficas. O tampão utilizado foi Hepes 10 mmol L-1
pH 8,0; NaCl 150 mmol.L-1; EDTA 3 mmol.L-1 e surfactante P20 0,005%. A solução
de regeneração usada foi de cloridrato de glicina pH 2,0. Os dados obtidos foram
analisados pelo programa BIAevaluation, que acompanha o equipamento, e
comparados com modelos teóricos.
3.9. SÍNTESE QUÍMICA
Atualmente, são três os métodos de síntese de peptídeo: síntese química,
síntese enzimática e síntese via DNA recombinante. Neste trabalho usamos o
método de síntese química em fase sólida (SPFS), utilizando estratégia Fmoc, 9-
fluorenilmetoxilcarbonila, de fluxo contínuo em um sintetizador de peptídeo PSSM
8 Shimadzu. O produto foi desprotegido usando TFA e purificado por CLAE
(coluna Econosil C-18, 10µ, 22,5X250 mm) com um sistema de dois solventes (A)
TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACT/H2O (1:900:100), fluxo de 5 mL/min e com
gradiente de 10–60% do solvente B por 45 min.. A cromatografia analítica foi
realizada usando um CLAE binário da Shimadzu com um detector uv-vis SPD-
10AV acoplado a uma coluna C18 Ultrasphere (5µ, 4,6/150 mm) eluida com um
sistema de solvente (A) H3PO4/H2O, 1:1000 e (B) ACN/H2O/H3PO4, 900:100:1 em
um fluxo médio de 1 mL/min, e gradiente de 10-80% de B em 20 min. A
confirmação da pureza e peso molecular do peptídeo sintético foram realizadas
por sistema de espectrometria de massa MALDI-TOF (TofSpec-E, Micromass).
108
3.10. INTERAÇÕES COM METAIS
A avaliação dos sítios ligantes do peptídeo/metal foi realizada em
espectrômetro de massa Q-TOF ULTIMA API (waters/Micromass – Manchester,
UK), usando cloretos de metal alcalino (Li, Na, K e Cs), de alcalino terroso (Ca) e
de transição (Cr, Fe, Co, Ni, Cu e Cd), todos numa concentração de 10 mM. As
amostras foram dissolvidas numa solução água/metanol 1:1.
3.11. TESTES ANTIMICROBIANOS
Os testes de atividades antibacteriana e antifúngica foram realizados no
laboratório SABIN de análises clínicas de Brasília.
3.11.1. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
As cepas bacterianas de Escherichia coli (ATCC 25922) e Staphylococcus
aureus (ATCC 25923) pertencentes à coleção da American Type Culture
Collection – ATCC (The Global Bioresource Center™) foram doadas pelo
Laboratório SABIN de Análises Clínicas Ltda.
Foram realizados testes de susceptibilidades com cepas bacterianas
causadoras de mastite em humanos e gados, comparando a atividade bactericida
e/ou bacteriostática dos peptídeos antimicrobianos de anfíbios com antibióticos
convencionais de última geração utilizados pela clínica brasileira.
As bactérias foram armazenadas a 4°C em meio de cultura Ágar sangue.
As cepas bacterianas foram repicadas semanalmente para garantir que sempre
estejam na fase log de crescimento no momento do ensaio. Para o ensaio as
109
bactérias foram transferidas para um meio de cultura líquido Mueller-Hinton
(National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS) e quantificadas
utilizando transmitância na escala de Mac-Farland.
Os experimentos foram realizados em microplacas de 96 poços estéreis,
utilizando diluição seriada em triplicata, onde as placas foram mantidas em estufa
a 37°C, e monitorados após a incubação em leitor de micro-placa BIORAD 3550
reader num comprimento de onda 595 a 650 nm de acordo com as
recomendações do NCCLS, segundo Bulet et al. (1991). A partir da absorbância
relativa comparada foram calculados os MICs (concentração mínima de inibição)
para cada peptídeo testado comparando com os antibióticos comercias.
3.11.2. ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
Os testes de sensibilidade aos peptídeos antimicrobianos de fungos
leveduriformes foram realizados no Laboratório SABIN de Análises Clínicas Ltda.
Três isolados clínicos de leveduras de importância médica e veterinária foram
utilizados para os testes (Candida albicans e Candida tropicalis). A atividade
antifúngica in vitro foi realizada em um ensaio de microplaca pelo método de
diluição seriada em meio BHI (Brain-Heart Infusion) recomendado pelo protocolo
da National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1995). A
sensibilidade das leveduras aos peptídeos antimicrobianos foi comparada a vários
antifúngicos de uso convencional pela clínica médica, como o fluconazol e o
cetoconazol. Determinou-se, também, o MIC (Concentração Mínima Inibitória),
que é a concentração do peptídeo que inibe o crescimento total dos
microorganismos, e a MFC (Concentração Fungicida Mínima), definida como a
110
concentração do peptídeo que causa morte total nas leveduras para todos os
antifúngicos convencionais utilizados.
Figura 28- Fluxograma dos processos realizados nos extratos EXTTA, EXTOO e EXTLA.
111
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os extratos 1-9 EXTTA (Tabela 24), antes de serem reunidos, foram
analisados por CLAE, usando-se as mesmas condições, na tentativa de observar
as possíveis diferenças entre suas secreções. O resultado mostrou que, apesar
dos indivíduos serem de diferentes localidades, sexos e tamanhos, apresentaram
um perfil cromatográfico muito semelhante entre si, indicando que esses fatores
não alteram a constituição de suas secreções. Desta forma, os extratos EXTOO e
EXTLA não tiveram o mesmo tratamento inicial que o EXTTA.
EXTTA, EXTOO e EXTLA foram submetidos à espectrometria de massas
sistema MALDI-TOF (Figuras 29, 30, 31). Os espectros apresentaram
semelhança, principalmente os EXTTA e EXTOO, entre as massas de seus
constituintes. Os espectros de EXTTA e de EXTOO mostraram que seus
constituintes principais estão nas faixas de 1000 a 2000 Da, de 3000-3500 Da e
de 6000-6800 Da. Fato confirmado mais tarde com a identificação dos
constituintes com 1705, 3225 e 6670 Da de EXTTA. O espectro de EXTLA
mostrou que seus constituintes principais estão na faixa de 1500-4000 Da, e os
constituintes minoritários estão na faixa de 6600-7400 Da.
Os três extratos totais EXTTA, EXTOO e EXTLA foram cromatografados em
CLAE-FR (Figuras 32, 33, 34). Seus cromatogramas apresentaram semelhança, e
um pico chamou atenção por possuir aproximado tempo de retenção e
intensidades em todos os extratos (Figura 35). Esse pico foi codificado como OTA
06, OOP 06 e OLA 06, respectivamente.
Figura 29- Espectro de massas do extrato total de O. taurinus (EXTTA) obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em propanona. Modo linear .
113
Figura 30- Espectro de massas do extrato total de O. oophagus (EXTOO) obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em propanona. Modo linear.
114
Figura 31- Espectro de massas do extrato total de O. langsdorffii (EXTLA) obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em propanona. Modo linear e detecção de íons positivos.
Na cromatografia do extrato EXTTA, além de OTA 06, foram selecionadas
outras frações (Tabela 25) para serem caracterizadas.
Tabela 25- Frações da Cromatografia (CLAE-FR) do Extrato EXTTA
TR (min) Código ACN %
20,8 OTA 06 18
37,5 OTA 08 36
38,3 OTA 09 37
46,5 OTA 15 40
57,8 OTA 18 54
116
Figura 32– Cromatograma do extrato total da secreção da pele de O. taurinus (EXTTA). CLAE-FR (Shimadzu Co). Coluna semi-preparativa C18 (218TP1010, Grace Vydac). Gradiente linear de acetonitrila/TFA (0,1%) em 60 min. Monitorado simultaneamente em 216(---) e 280 nm (----).
117
M i n u t e s
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
Abs
0 , 0
0 , 5
1 , 0
1 , 5
2 , 0
2 , 5
Perc
ent
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 33 – Cromatograma do extrato total da secreção da pele de O. oophagus (EXTOO). CLAE-FR (Shimadzu Co). Coluna semi-preparativa C18 (218TP1010, Grace Vydac). Gradiente linear de acetonitrila/TFA (0,1%) em 60 min. Monitorado simultaneamente em 216(---) e 280 nm (----).
Minutes0 10 20 30 40 50 60
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0,8
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cent
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80
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20,9
54
Figura 34– Cromatograma do extrato total da secreção da pele de O. langsdorffii (EXTLA). CLAE-FR (Shimadzu Co). Coluna semi-preparativa C18 (218TP1010, Grace Vydac). Gradiente linear de acetonitrila/TFA (0,1%) em 60 min. Monitorado simultaneamente em 216(---) e 280 nm (----).
118
Figura 35- Cromatogramas dos extratos EXTTA (Ota 06), EXTOO (Oop 06) e EXTLA (Ola 06).
119
4.1. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA FRAÇÃO OTA 06, OOP 06 E OLA 06
A fração ota 06, um sólido marrom claro não cristalino, oriunda de várias
cromatografias semi-preparativas do extrato EXTTA, foi cromatografada em
sistema analítico, para melhorar seu grau de pureza (Figura 36), e posterior
identificação.
A fração ota 06 foi submetida à espectrometria de massas, sistema MALDI-
TOF, onde foram usadas várias matrizes, mas não foi possível obter seu espectro.
O que levou a uma leve indicação que ota 06 fosse uma molécula de peso
molecular baixo
Figura 36- Cromatorama da fração ota 06 obtido em CLAE-FR Shimadzu LC10 AD-VP). Coluna analítica e pré-coluna Vydac C18, gradiente linear ACN/TFA 0,1%. Monitorado simultaneamente em 216(---) e 280 nm (----).
120
O espectro na região do infravermelho de ota 06 (Figura 37) apresentou
bandas de absorção em 3400, 3300 e 2980 cm-1, indicando a presença de OH, NH
indólico, e metileno, respectivamente. A forte absorção em 1622 cm-1 demonstra a
natureza aromática da substância. Seu espectro de ultravioleta (Figura 38)
apresenta absorção em 287,5 e 277,0 nm sugerindo a presença de um sistema
indólico não substituído na posição C-2 (KAWANISHI et al., 1985).
O espectro de RMN 1H (Figura 39) apresenta um simpleto (6H) em δ 2,85
indicando a presença do grupo N(CH3)2, e dois tripletos (4H) de hidrogênios
metilênicos entre δ 3,00-3,30, próprio do grupo Ar-CH2-CH2-N (Figura 40) -
característico de hidrogênios em cadeia lateral de N,N-dimetiltriptamina
(YAMASATO et al., 1972). Estão presentes sinais correspondendo a quatro
hidrogênios na região de aromático (Figura 41): o hidrogênio H-2 aparece como
um simpleto em δ 7,16; o hidrogênio H-4 surge como um simpleto em δ 6,90; o
hidrogenio H-6 como um duplo-dupleto (dd) em δ 6,76, e finalmente o hidrogênio
H-7 é observado como um dupleto (d) em δ 7.29. Os três hidrogenios H-4, H-6 e
H-7 são característicos de um sistema ABC de anel de seis membros, típico de
anel benzênico substituído (ZHALOLOV et al., 2000).
O espectro de correlação de 1H-1H confirma os acoplamentos dos
hidrogênios nas regiões alifática e aromática, discutidos nos parágrafos anteriores
(Figura 42). A figura 43 mostra o experimento COSY expandido na região
aromática para melhor visualização dos acoplamentos: H-2 (δ 7,16); H-4 (δ 6,95),
H-6 (δ 6,76) e H-7 (δ 7.29).
121
Figura 37- Espectro de IV da fração ota 06.
Figura 38- Espectro de UV da fração ota 06
122
Figura 39- Espectro de RMN de 1H de ota 06 obtido em espectrômetro Bruker Avane DRX 400 MHz CD3OD.
123
Figura 40- Expansão do espectro de RMN de 1H de ota 06 obtido em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz.
Figura 41- Expansão do espectro de RMN de 1H de ota 06 obtido em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz.
124
Figura 42- Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H -COSY de ota 06 obtido em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz.
Figura 43- Expansão do espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H, 1H –COSY.
125
Interpretação do experimento HSQC da fração ota 06 (Figuras 44, 45)
possibilitou correlacionar os sinais de carbono aos seus respectivos sinais de
hidrogênio. Dados mostrados na Tabela 26.
Figura 44- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC de Ota 06 obtido em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz.
126
Figura 45- Expansão do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H, 13C- HSQC de Ota 06 obtido em um espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz.
Tabela 26- Deslocamento químico em δ de RMN de 1H e 13C da fração 0ta 06
RMN de 1H RMN de 13C Parte alifática
8 3,02 (t, 2H) 22,50 9 3,20 (t, 2H) 40,50
N(CH3)2 2,85 (s, 6H) 44,00 Parte
2 7,10(s, 1H) 125,80 4 6,90 (d,1H) 102,97 6 6,76 (dd, 1H) 112,01 7 7,29 (d, 1H) 113,40
127
Os espectros de ESI/MS e ESI/MS/MS da amostra ota 06 (Figura 46)
revelaram um pico predominante com íon molecular [M+H]+ 205 e os picos m/z
160, 159, 146, 145, 132, 131, 117, 91 e 58. Os dois picos em m/z 146 e 160
aparentam ser de um grupo hidroxi-indol com um e dois grupos CH2,
respectivamente, ligados na posição β do sistema indólico (Figura 47) (GHOSAL &
MUKRERJEE, 1966). O pico base m/z 58 corresponde a perda do grupo CH2-
N(CH3)2+ de [M+H]+ e o íon 131 origina-se da perda de CH2-CH2-N(CH3)2
acompanhada por migração de um hidrogênio. Os íons 117, 91 e 77 são formados
pela clivagem do sistema indólico (ZHALOLOV et al., 2000).
128
Figura 46- Espectros de ESI-MS e ESI-MS/MS da amostra ota 06, análise do íon 205 [M+H+] com diferentes energia de colisão A, B (10 eV), C (20 eV).
129
Figura 47- Fragmentação da cadeia lateral da bufotenina (GHOSAL & MUKRERJEE, 1966).
Assim, os dados espectrais de RMN 1H, RMN de 13C, Massas, IV e UV
comparados com os da literatura (GHOSAL & MUKHERJEE, 1966; ZHALOLOV et
al., 2000; SOMEI et al, 2000; FORSSTROM et al, 2001; McCLEAN et al, 2002;
REVIAL et al, 2002), confirmam a estrutura da bufotenina para a fração ota 06.
As frações oop 06 e ola 06 apresentaram semelhantes tempos de retenção
e intensidades quando comparadas a fração ota 06, levando a uma forte indicação
de ser tratar do mesmo composto. Essas observações foram confirmadas pelas
análises dos espectros de ESI/EM/EM das referidas frações, apresentando o
mesmo pico molecular e semelhante padrão de fragmentação (Figuras 48 e 49).
HO
NN(CH3)2
H
a
b aHO
NH
CH2
+H2C N(CH3)2
146
58b
N
CH2
H
HO +
160
HO
NH159
Bufotenina
130
Figura 48- Espectros de ESI-MS/MS da amostra oop 06, íon 205 [M+H+] com diferentes energia de colisão A (O eV), B (10 eV) e C (20 eV).
131
Figura 49- Espectros de ESI-MS/MS da amostra ola 06, íon 205 [M+H+] com diferentes energia de colisão A (O eV), B (10 eV) e C (20 eV).
132
A bufotenina (5-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina ou N,N-dimetilserotonina) foi
uma das primeiras indolalquilaminas a ser identificada. Possui propriedades
psicotrópicas potente, e normalmente é associada a desordens mentais
temporárias e doenças como esquizofrenia e comportamentos psicóticos,
provavelmente devido as suas características fisiológicas semelhantes ao da
dietilamida do ácido lisérgico LSD (RÄISÄNEN & KÄRKKÄINEN 1979; TAKEDA et
al., 1995).
Ocorre amplamente no reino vegetal, com predominância nas plantas da
família Leguminosae (SMITH, 1977), e nos vertebrados, principalmente mamíferos
(FORSSTRÖM, 2001) e anfíbios, especialmente do gênero de Bufo (Bufonoidae)
(CEI et al., 1972).
Muitos trabalhos, entre eles os de Roseghini e colaboradores (1986; 1989)
e Erspamer (1994), mostraram que a bufotenina não está restrita somente ao
gênero Bufo (recebeu esse nome por ter sido primeiramente identificada a partir
da secreção da pele de Bufo bufo). Está amplamente distribuída em espécies dos
mais variados gêneros, como: Xenopus, Rana, Leptodactylus, Litoria, Scaphiopus.
Neste trabalho identificamos a bufotenina em três espécies do gênero
osteocephalus, fato que até então, não havia sido descrito na literatura.
Das espécies estudadas duas são endêmicos na Amazônia, O. taurinus e
oophagus, e a terceira endêmica na Mata Atlântica (Figura 22), fato que chamou
bastante atenção. Existem vários trabalhos indicando que algumas classes de
metabólitos de anfíbios estão relacionadas com sua dieta e habitat, e as espécies
em questão pertencem a regiões bem diferentes o que mostra à necessidade de
estudos mais detalhados tanto por químicos, como por biologos e ecólogos.
133
Roseghini e colaboradores (1986) realizando um screening para detectar
substâncias bioativas em mais de 150 espécies de anfíbios, entre elas o
Osteocephalus taurinus, usando cromatografia de placa com reveladores
específicos, só detectaram a serotonina e a leptodactilina. Acreditamos que
provavelmente, esse resultado, foi devido à variação natural desses metabólitos
em relação ao sexo, região, dieta, e entre populações da mesma espécie.
134
4.2. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA FRAÇÃO OTA 08
O material referente à fração ota 08 foi cromatografado em CLAE-FR
analítica (Figura 50) até que sua pureza fosse constatada por MALDI-TOF/MS. A
massa molecular de ota 08 intacta foi determinada por MALDI-TOF/MS como
sendo 6668.09 Da (Figura 51).
Figura 50- Cromatograma de ota 08 obtido em CLAE-FR Shimadzu LC10 AD-VP). Coluna analítica e pré-coluna Vydac C18, gradiente linear ACN/TFA 0,1%. Monitorado simultaneamente a 216 (---) e 280 (---) nm.
135
Figura 51- Espectro de massas MALDI-TOF da fração ota 08 obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em propanona. Modo linear e detecção de íons positivos.
Experimentos com MALDI-TOF/MS usando DTT revelaram a presença de
pontes de dissulfeto. Este dado pode ser estimado pelo ganho de massa da
molécula devido à entrada de hidrogênio por ocasião da redução das pontes. A
porção N-terminal de ota 08 foi seqüenciada por degradação de Edman, e assim
obteve-se 35 dos 56 possíveis aminoácidos da seqüência completa (Tabela 27).
Em seguida, o ota 08 foi reduzido com DTT e alquilado com iodoacetamida. O
material foi então dessalinizado por meio de diálise e depois purificado por CLAE-
FR. O espectro de massa de ota 08 alquilado mostra a entrada de quatro grupos
acetamida na sua seqüência (6668,09 → 6905,07) (Figura 52), confirmando a
existência de quatro resíduos de cisteína.
136
Figura 52- Espectro de massa MALDI-TOF da fração ota 08 alquilada com iodoacetaminada.
O material alquilado foi em seguida clivado enzimaticamente com tripsina e
seus fragmentos resultantes foram separados e purificados por cromatografia de
fase reversa. Os fragmentos foram analisados por espectrometria de massa
sistema MALDI-TOF/MS (Figura 53) e suas massas comparadas às massas da
previsão de clivagem obtida no programa CUTTER de clivagem teórica, o que
levou à confirmação de alguns fragmentos da seqüência obtida por degradação de
Edman (Tabela 27 ).
Tabela 27- Fragmentos confirmados da Fração ota 08
Seqüência do Ota 08 Massa Teórica
Massa Exp.
EQDPKCLLSRNLGKGKSSLTRYYYDKSASICKPFKYQGNCFRFKRMQYMFRDCVAF 6715,29
CLLSR 648,35 648,51
CLLSRNLGK 1060,59 1060,5
SSLTR 563,32 563,63
YYYDK 751,33 751,49
SASICKPFK 1038,55 1037,5
137
A seqüência completa não foi obtida por falta de material. Os experimentos
realizados através ressonância plasmônica de superfície (SPR) indicam que ota
08 é um inibidor de tripsina com similaridade com inibidores de tripsina-acrosina
de várias fontes animais.
Figura 53- Espectro de fragmento tríptico de ota 08 obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em ACN 50% + TFA 0,3% em solução aquosa. Modo linear íons positivos.
138
4.2.1. ESTUDOS DE INTERAÇÃO BIOMOLECULAR
Estudos preliminares por ressonância plasmônica de superfície (SPR)
mostraram interação de ota 08 com β-tripsina (Figura 54).
Figura 54- Sensograma de interação de ota 08 com tripsina obtido em BIACORE 3000; chip de dextran com tripsina imobilizada. Tampão: hepes 10 mmol/L pH 8,0; NaCl 150 mmol/L; EDTA 3 mmol/L e surfactante P20 0,005%. Solução de regeneração: 10 mmol/L cloridrato de glicina, pH 2,0. fluxo de 20 µL. min-1.
A espectroscopia de SPR é uma técnica em que a molécula interagente, o
ligante, está imobilizada em uma matriz sólida e a outra molécula, o analito, está
em solução em concentração sub-nM. A interação entre elas é monitorada em
tempo real.
139
A resposta por SPR é relativa a mudanças no índice de refração na
superfície do biosensor, causadas por alteração na concentração, como por
exemplo, quando uma das moléculas presentes em solução se liga ao ligante
imobilizado, como aconteceu com ota 08.
O sinal SPR é expresso em unidades de ressonância (RU), plotados
contra o tempo em um sensograma. 1000 RU equivalem a uma mudança na
concentração do ligante de aproximadamente 1ng.mm-2 para a maioria das
biomoléculas (STEMBERG, 1991).
O sensograma da fração ota 08 (Figura 54) mostra uma substancial
interação com o ligante tripsina (RU – 20500 a 21500) indicando ser ota 08 um
inibidor de tripsina. A falta de material suficiente para testes impediu a
determinação das constantes de associação e dissociação.
Recentemente, inibidores de protease têm sido acrescidos na
diversificada lista de classes de substâncias de pele de anfíbios. O primeiro, em
1996, foi o inibidor de tripsina de pele de Bombina (BSTI) isolado de Bombina
bombina; possui 60 residuos de aminoácido, sendo 10 cisteínas e mostrou
atividade inibidora contra tripsina e trombina. Em 2000, Colon e Kin descreveram
um inibidor de protease encontrado na pele de espécimes de Dyscophus guineti
da família Microhylidae. Em 2002, mais três foram isolados, dois a partir de
secreção cutânea de Rana areolata e um de Bombina maxima. Em 2003, quatro
novos inibidores foram isolados de Phyllomedusa tarsius e dois de Bombina
variegata. Finalmente, em 2004, mais três, PSTI, PSKP-1 e PSKP-2 foram
isolados de Phyllomedusa sauvagii (SANTOS, 2003; TIMBAO, 2003; GEBHARD,
2004).
140
Um crescente interesse de inibidores de protease tem-se estabelecido,
pelo fato de que tais substâncias são de grande importância no controle de
proteólise. Eles são encontrados em numerosos fluidos biológicos e tecidos de
animais e plantas. Nos animais, por exemplo, eles controlam eventos associados
à coagulação sanguínea, à migração celular, ao transporte hormonal, à supressão
de tumores, à conversão de pró-hormônios, à fibrinólise e a reações inflamatórias.
Os inibidores de proteases serínicas teriam a função de facilitar a internalização e
a degradação de enzimas proteolíticas indesejadas (SANTOS, 2003).
Inibidores de protease são farmacologicamente importantes no controle
do HIV/AIDS, porque previne o processamento de proteínas virais e
consequentemente a formação de partículas virais "maduras". Os inibidores de
protease não levam a cura ou eliminam o vírus, mas atrasam a progressão da
doença e diminuem as taxas de morte por AIDS (SANTOS, 2003 apud MILLER et
al., 2000).
Os inibidores de protease estão também relacionados com o controle de
metástase em câncer de mama. A mobilidade de células cancerosas, para regiões
distantes do tumor, é propiciada graças a ação de serinoproteases extracelulares.
Acredita-se que devido a presença de inibidores endógenos de proteases a
migração dessas células é controlada. Entretanto, várias células cancerosas são
capazes de suprimir esses inibidores de forma ainda não conhecida (SANTOS,
2003 apud KIDD et al., 2001).
141
4.3. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE OTA 09.
O material referente à fração ota 09 foi cromatografado em CLAE-FR
analítica (Figura 55) até que sua pureza fosse constatada por MALDI-TOF/MS. A
massa molecular de ota 09 intacta foi determinada por MALDI-TOF/MS como
sendo 1706 Da (Figura 56).
Figura 55- Cromatograma de ota 09 obtido em CLAE-FR Shimadzu LC10 AD-VP). Coluna analítica e pré-coluna Vydac C18, gradiente linear ACN/TFA 0,1%. Monitorado simultaneamente a 216 (---) e 280 (---) nm.
142
Figura 56- Espectro de massas MALDI-TOF/MS da fração ota 09 obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico. Modo linear e detecção de íons positivos.
Após confirmação de seu grau de pureza a fração ota 09 teve seu N-
terminal e sua seqüência completa obtida por degradação de Edman (PPSQ-23
SHIMADZU Co.) e espectrometria de massa (Micromass Q-TOF 2) (Figura 57). O
ponto isoelétrico e a massa monoisotópica teórica do peptídeo ota 09 foram
calculados, via Internet, pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools” e resultaram
em 3,67 e 1706 Da, respectivamente (Tabela 29). A análise da seqüência nos
bancos de dados disponíveis não revelou nenhuma similaridade significante.
143
Figura 57- Espectro de fragmentação EM/EM do íon 1706,48 (m/z) obtido espectrômetro Micromass Q-Tof 2 – íons b designados usando Micromass sequenciamento software.
Tabela 28 - Íons a, b, y e z do Espectro de Fragmentação EM/EM de ota 09
Íon Asp Ser Val Ala Ser Ser Ala Ala Gln Glu Leu Ser Gly Val Leu Ala Ser Asn
a. 88,04 175,07 274,14 345,18 432,21 519,24 590,28 661,32 789,37 918,42 1031,50 1118,53 1175,55 1274,62 1387,71 1458,74 1545,78 1659,82
b. 116,03 203,07 302,14 373,17 460,02 547,24 618,27 689,31 817,37 946,41 1059,50 1146,53 1203,55 1302,62 1415,70 1486,74 1573,77 1687,81
y. 1705,82 1590,80 1503,77 1404,70 1333,66 1246,63 1159,60 1088,56 1017,52 889,46 760,42 647,34 560,30 503,28 404,21 291,13 220,09 133,06
z. 1688,79 1573,77 1486,74 1387,67 1316,63 1229,60 1142,57 1071,53 1000,49 872,43 743,39 630,31 543,27 486,25 387,18 274,10 203,06 116,03
Tabela 29- Estrutura primária do peptídeo ota 09 obtida por degradação de Edman em seqüenciador automático PPSQ23 (Shimadzu) e espectrometria de massa (Micromass Q-TOF 2). Ponto Isoelétrico (pI) teórico e massa molecular calculados, via Internet, pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools”.
A previsão da estrutura secundária de peptídeo ota 09, nos programas
pertencentes ao site “Expasy Tools”, revelou tendência a formar α-hélice como
mostra a Tabela 30.
Tabela 30- Predição de estrutura secundária do peptídeo ota 09 obtidos pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools”.
Programa Predição de Estrutura Secundária SOPMA hhhhhhhhhhhhhhhhht HNN cchhhhhhhhhhhheccc nnPredict Nnnnnhhhhhheneennn GOR IV Ccccccchhhhheeeeec
h= hélice; t= torção beta; c= curva randômica; e= porção estentida.
4.3.1. SÍNTESE QUÍMICA DE OTA 09
A fração ota 09, após seqüenciada, foi sintetizada pelo método de síntese
química em fase sólida (SPFS). A figura 58 mostra o espectro EM/EM do
peptídeo sintético.
Seqüência DSVASSAAQELSGVLASN pI 3,67 Peso Molecular 1706,48 Da
Figura 58 – Espectro EM/EM do peptídeo sintético ota 09 (sintetizado pelo método de síntese química em fase sóloda (SPFS)
4.3.2. PEPTÍDEO OTA 09 C0M METAL
A análise do espectro de massa de ota 09 (Figura 57; Tabela 31) está
indicando tratar-se de um peptídeo que se liga facilmente a metal, isso nos impeliu
a realizar vários experimentos para confirmar tal observação.
Tabela 31- Análise dos íons do espectro de massas MALDI-TOF/MS da fração ota 09 obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: acido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico. Modo linear e detecção de íons positivos.
Íon (m/z) Indicação 1706.4818 [M+H]+
1728.4906 [M+Na]+
1744.4500 [M+Na+K]+
1750.4968 [M+2Na]+
1766.4000 [M+2Na+K]+
1772.3850 [M+3Na]+
1788.4300 [M+3Na+K]+
1794.4761 [M+4Na]+
Os experimentos realizados com os metais alcalinos mostraram uma forte
interação com o peptídeo ota 09. Os espectros de massa com suas respectivas
fragmentações (Figuras 59 a 59.13) confirmam a forte interação do peptídeo com
esses metais. Analisando as séries B e Y (Tabela 28) podemos propor que o metal
está ligado a partir do íon B4, embora fracamente, mas confirmado pelo íon Y15,
até B17 (Figura 60).
Além dos metais alcalinos foram realizados experimentos com metal
alcalino terroso (Cálcio) e metais de transição (Ferro, Cobalto, Níquel, Cobre e
Cádmio) (Figuras 61 e 62).
147
Figura 59- Espetros de massas de ota 09 (M), M+Li, M+Na e M+K.
148
Figura 59.1- Espectros de massas de ota 09 (M) e M + Cs
149
Figura 59.2- Íons B2 e Y2 dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K
150
Figura 59.3- Íons B3, Y3, Y3+Li, Y3+Na e Y3+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K. A partir do íon Y3 começa a ligação com os metais.
151
Figura 59.4- Íons B4 (B4+K?), Y4, Y4+Li, Y4+Na e Y4+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
152
Figura 59.5- Íons B5, B5+Li, B5+Na e B5+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
153
Figura 59.6- Íons B6, B6+Li, B6+Na e B6+K, Y5, Y5+Li, Y5+Na, Y5+K, Y6, Y6+Li, Y6+Na, Y6+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
154
Figura 59.7- Íons B6, B6+Li, B6+Na e B6+K, Y6, Y6+Li, Y6+Na, Y6+K e B7-H2O dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
155
Figura 59.8- Íons Y7, Y7+Li, Y7+Na, Y7+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
156
Figura 59.9- Íons B7, B7+Li, B7+Na, B7+K, B7-H2O, B8, B8+Li, B8+Na, B8+K, Y7, Y7+Li, Y7+Na e Y7+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
157
Figura 59.10- Íons B9, B9+Li, B9+Na, B9+K9, Y8, Y8+Li, Y8+Na e Y8+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
158
Figura 59.11- Íons B10, B10+Li, B10+Na, B10+K, B11, B11+Li, B11+Na, B11+K, Y10, Y10+Li, Y10+Na, Y10+K, Y11, Y11+Li, Y11+Na e Y11+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
159
Figura 59.12- Íons B12, B12+Li, B12+Na, B12+K, B13, B13+Li, B13+Na, B13+K, Y12, Y12+Li, Y12+Na, Y12+K, Y13, Y13+Li, Y13+Na e Y13+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
160
Figura 59.13- Íons B14, B14+Li, B14+Na, B14+K, B15, B15+Li, B15+Na, B15+K, Y14, Y14+Li, Y14+Na, Y14+K, Y15+Li, Y15+Na e Y15+K dos Espectros de Fragmentação EM/EM de M, M+Li, M+Na e M+K.
Figura 60- Peptídeo + Metal
Figura 61- Espectros de massas de ota 09, Ota 09 + Ca, Ota 09 + Fe e Ota 09 + Co
Figura 62- Espectros de massas de ota 09, Ota 09 + Cd, Ota 09 + Cu e Ota 09 + Ni
4.3.3. TESTES ANTIMICROBIANOS
O peptídeo ota 09 foi testado contra duas cepas bacterianas patogênicas da
espécie humana: Escherichia coli (gram-negativa) e Staphylococcus aureus
(gram-positivo), todas do tipo ATCC. Foi obtida a concentração mínima necessária
para a inibição do crescimento bacteriano denominado de CIM.
Os testes foram realizados por meio de um ensaio de diluição seriada,
partindo-se da concentração de 1,5 µM (2 µg/mL) a 195,2 µM (256 µg/mL) de ota
09. Como referências, foram testados também antibióticos de uso comercial como
a Amoxacilina e o Imipenem. Os resultados estão sendo mostrados na Tabela 32.
Tabela 32- Atividade antimicrobiana do peptídeo ota 09
BACTÉRIAS MIC* (µM) OTA9 Amoxacilina Imipenem S. aureus** ATCC 25923 74,8 NDA**** 102,1 E. coli*** ATCC 25922 37,4 28,0 26,5
*CIM – concentração inibitória mínima;** Staphylococcus aureus;*** Escherichia coli; **** NDA - não detectada atividade.
O peptídeo ota 09 apresentou ação antibacteriana significativa em relação
ao Staphylococcus aureus quando comparado ao Imipenem, pertencente aos
carbapenêmicos (subclasse dos betalactâmicos). Quanto a Escherichia coli o
peptídeo apresentou atividade antibacteriana em concentrações discretamente
superiores ao das drogas comparadas.
O Staphylococcus aureus devido sua virulência pode comprometer o
organismo em infecções sistêmicas, ocasionando septicemia, endocardite, choque
tóxico e outras complicações (ZAVADINACK et al., 2002). É o microorganismo mais
freqüentemente isolado de infecções comunitárias, e 54% das mães com crianças
164
menores de um mês têm cultura positiva para o S. aureus na presença de mastite.
Acima de 92% dos pacientes com estafilocóccia apresentam resistência às
penicilinas (GIUGLIANI, 2004).
A Escherichia coli é o patógeno mais comum causador da infecção urinária
(IU), sendo responsável por, aproximadamente, 85% dos casos. Dados
epidemiológicos evidenciam, entre as mulheres sexualmente ativas, uma elevada
incidência de IU, pelo menos duas durante o menacme (LENZ, 2000).
O peptídeo ota 09 também foi testado contra o crescimento de fungos
leveduriformes patogênicos humanos, Candida albicans e Candida tropicalis,
ambos do tipo ATCC. Foram determinadas a concentração de inibição mínima
(CIM) e a concentração mínima fungicida (CMF) para o peptídeo e para os
antifúngicos Cetoconazol e Fluconazol. O Fluconazol por ser uma droga
reconhecidamente de ação fungistática não apresenta CMF.
Os testes foram realizados por meio de um ensaio de diluição seriada,
partindo-se da concentração de 1,5 µM (2 µg/mL) a 195,2 µM (256 µg/mL) de ota
09. Como referências, foram testados também antifúngicos de uso comercial como
o Cetoconazol e o Fluconazol. Os resultados estão sendo mostrados na Tabela
33.
Tabela 33- Atividade antifúngica do peptídeo ota 09
FUNGOS CIM* / CFM** (µM) OTA9 Fluconazol Cetoconazol Candida albicans 74,8 / 74,8 230,0 / *** 5,0 / 35,7 Candida tropicalis 37,4 / 37,4 8,5 / *** 9,7 / 75,0
*CIM – concentração inibitória mínima; ** CFM – concentração fungicida mínima; *** Fluconazol não apresenta ação fungistática.
165
Os resultados mostraram que o peptídeo ota 09 apresentou ação
antifúngica significativa em relação a Candida albicans quando comparado ao
Fluconazol, e discreta ao Cetoconazol. Quanto a Candida tropicalis o peptídeo
apresentou atividade antifúngica, entretanto em concentração superior as das
drogas comparadas.
A cândida é um fungo que, sob determinadas condições, multiplicando-se
por esporulação, torna-se patogênico. A maioria das mulheres (75%) tem pelo
menos um episódio de candidíase sintomática uma vez na vida (MORSE, 1999),
dessas 40 a 50% apresentam recorrência e 5% desencadeiam um quadro de
vulvovaginite crônica recorrente. A Candida albicans causa 90% dessas
infecções, e em 15 a 20% dos casos outras espécies estão envolvidas, como a
Candida tropicalis, C. glabrata, C. rugosa, produzindo idênticas manifestações
clínicas (LIMA et al., 2003).
Em relação ao tratamento das infecções fúngicas, as décadas de 60 e 70
foram consideradas como a era da Anfotericina B; a década de 80 a era dos
diazólicos (Cetoconazol, Miconazol) e a de 90, a era dos triazólicos (Itraconazol,
Fluconazol). Drogas como o Fluconazol e o Cetoconazol possuem eficácia no
tratamento da candidíase, entretanto, apresentam toxicidade sistêmica e
resistência a múltiplas cepas (ODDS, 2004).
Atualmente, há linhagens de estafilococos e de candidas resistentes a
vários tipos de antimicrobianos. Na década de 40, doenças como as provocadas
por estafilococos tinham sido transferidas da categoria "extremamente perigosas"
166
para a de "infecções secundárias facilmente controladas". Em 1946, apenas 5%
das bactérias estafilococos eram resistentes à penicilina; em 1948 esse número
havia subido para 18%; em 1950 era de 40% e em 1982 de 90% (LIMA et al.,
2003).
Por isso, inúmeros estudos vêem sendo desenvolvidos em busca de drogas
eficazes, de menor toxicidade, menor potencial de resistência antimicrobiana e
pequeno número de efeitos colaterais para tratamento das infecções bacterianas e
fúngicas. Isto se deve a magnitude destas infecções, pois segundo a OMS vírus,
bactérias e parasitas são, de longe, a principal causa da mortalidade humana. Na
década de 90, as doenças infecciosas responderam por um terço de todas as
mortes ocorridas no mundo.
Os peptídeos, oriundos da pele de anfíbios, têm sido alvos destes estudos
por serem potencialmente ativos contra um largo espectro de microorganismos e
não apresentarem toxicidade em célula normal de mamíferos (FEDER et al., 2001).
O primeiro peptídeo de pele de anfíbio, que apresentou atividades
antimicrobianas, além da hemolítica, foi a bombinina. Foi isolada, há mais de 30
anos, de Bombina variegata (CSORDAS & MICHL, 1969). A partir desta data mais
de cinqüenta peptídeos antimicrobianos de anfíbios já foram isolados, tendo como
principal característica à natureza catiônica e a capacidade de permeabilizar
membranas de microorganismo causando perturbações múltiplas e irreversíveis
(PRATES, 1999; 2003). Além das atividades antimicrobianas, alguns desses
167
peptídeos apresentam outras atividades farmacológicas, o que reforça, ainda
mais, sua utilização como potentes agentes terapêuticos.
As propriedades farmacológicas do peptídeo ota 09, sem dúvida, precisa de
maiores investigações, mas o resultado mostrado já o coloca como um agente
terapêutico promissor.
168
4.4. ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE OTA 18
O material referente à fração 18 foi cromatografado em CLAE-FR analítica
(Figura 63) até que sua pureza fosse constatada por MALDI-TOF/MS. A massa
molecular do ota 18 intacto foi determinada por MALDI-TOF/MS como sendo
3226,63 Da (Figura 64)
Após confirmação de seu grau de pureza, a fração ota 18 teve sua
seqüência completa obtida por degradação de Edman (Tabela 34).
Figura 63- Cromatorama de ota 18 obtido em CLAE-FR Shimadzu LC10 AD-VP). Coluna analítica e pré-coluna Vydac C18, gradiente linear ACN+TFA 0,1%. Monitorado simultaneamente a 216 (---) e 280 nm (---).
169
Figura 64- Espectro de massa MALDI-TOF da fração ota 18 obtido em espectrômetro Voyager-DE STR (Applied Biosytems). Matriz: ácido trans-4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico em propanona. Modo linear e detecção de íons positivos. Laser de Nitrogênio 337.
O ponto isoelétrico (pI) e a massa monoisotópica teórica do peptídeo ota 18
foram calculados, via Internet, pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools” e
resultaram em 5,84 e 3226,63 Da, respectivamente (Tabela 34). A análise da
seqüência nos bancos de dados disponíveis não revelou nenhuma similaridade
significante.
170
Tabela 34- Estrutura primária do peptídeo ota 18 obtida por degradação de Edman em seqüenciador automático PPSQ23 (Shimadzu). Ponto Isoelétrico teórico e massa molecular calculados, via Internet, pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools”
A previsão da estrutura secundária de peptídeo ota 18, nos programas
pertencentes ao site “Expasy Tools”, revelou tendência a formar α-hélice como
mostra a Tabela 35.
Tabela 35- Predição de estrutura secundária do peptídeo ota 18 obtidos pelo pacote de ferramentas “Expasy Tools”
Programa Predição de Estrutura Secundária SOPMA eecccccchhhhhhheccctheeeeccttcc HNN cccccccchhhhhhhhccccheeehhccccc GOR IV ccccccccchhhhhhhhcceeeeeeeeeeec nnPredict nnnnnnnnnnhhhhhhnnnnnnheeennnnn
h= hélice; t= torção beta; c= curva randômica; e= porção estentida.
O peptídeo ota 18, devido sua pequena quantidade de material, não passou
por testes biológicos. Porém temos conhecimento da diversificada atividade
farmacológica dos peptídeos isolados de anfíbios, que acreditamos ser devido sua
função de proteção nesses animais, principalmente no controle de
Seqüência IALDTSIPTT MAQRTLALPQ AVTFQQVGGT P pI 5.84 Peso Molecular 3226,71 Da
171
microorganismos. Vários peptídeos isolados de anfíbios já confirmaram possuir
uma excelente atividade antimicrobiana.
A maior parte dos peptídeos antibióticos parece partilhar um mecanismo de
ação comum, a permeabilização da membrana, mas a grande variedade de
mecanismos defensivos desenvolvidos pelos organismos multicelulares, na
imunidade não específica, levanta questões relativas ao papel preciso dos
peptídeos antibióticos no combate às infecções.
172
5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
Os Estudos para busca de novos fármacos ou substâncias que sirvam de
modelos para síntese de fármacos já são uma necessidade imediata. Cada vez
mais os microrganismos estão ficando resistentes aos medicamentos em uso,
levando as comunidades médica e científica a ficarem em alerta.
A pele dos anfíbios, por possuir um arsenal de substâncias das mais
variadas estruturas e atividades biológicas, tornou-se um dos principais alvos
desses estudos. Nas últimas décadas, pesquisas mostraram que algumas
substâncias presentes nas secreções de pele de anfíbios possuem extraordinários
efeitos farmacológicos, algumas já em uso e outras em avançados testes ou
servindo de modelo para fármacos.
As substâncias isoladas e identificadas neste trabalho confirmam a
diversidade de classes de substâncias em anfíbios. Foi isolada e identificada a
bufotenina, uma amina biogênica, nas três espécies estudadas, O. taurinus e O.
oophagus da Amazônia Brasileira e O. langsdorffii da Mata Atlântica; dois
peptídeos (OTA 09 e OTA 18) e uma pequena proteína (OTA 08) isolados e
seqüenciados de O. taurinus.
A bufotenina foi identificada nas três espécies, confirmando não só a idéia
que diferentes famílias de anfíbios possuem sistema de defesa comum, mas
também um alto padrão de conservação de substâncias bioativas, em espécies
com significante dispersão geográfica (Mata Atlântica e Amazônia).
173
Um outro fator importante foi a semelhança do perfil cromatográfico entre as
três espécies, mostrando que a quimiossistemática é uma forte ferramenta para
contribuição na classificação das espécies.
O peptídeo OTA 09, isolado de O. taurinus, mostrou considerável atividade
antimicrobiana, destacando sua atividade bactericida. Apresentou esta atividade
em concentrações menores ao antibiótico comercial Imipenem® (utilizado em
infecções graves e multiresistentes), um carbapenêmico da subclasse dos
betalactâmicos. Alguns trabalhos mostraram que os peptídeos quando
sintetizados em fase sólida mantiveram sua atividade, o que demonstra a
viabilidade de se utilizar os análogos sintéticos dos peptídeos descobertos.
O peptídeo OTA 09 também apresentou forte interação com metais (Lítio,
Sódio, Potássio, Césio, Cálcio, Ferro, Cobalto, Níquel, Cobre e Cádmio). Alguns
trabalhos têm demonstrado que a presença do metal é de fundamental
importância para a atividade de alguns complexos, já que o ligante sem a
presença do metal fica completamente inativo.
O OTA 08, um possível inibidor de serinoprotease, foi seqüenciado
parcialmente. Os inibidores de serinoproteases são de grande interesse na
indústria farmacêutica, devido à sua ação como moduladores, executando tarefas
estratégicas em diversos sistemas fisiológicos. A pele de anfíbios está se
mostrando um excelente fornecedor dessas substâncias.
O peptídeo OTA 18, também isolado de Osteocephalus taurinus, não foi
submetido à avaliação farmacológica.
174
Como perspectivas já existe uma proposta, a curto prazo, de estudar as
outras espécies do gênero já que não existem dados na literatura, e verificar se
essas espécies conservam o mesmo perfil químico. Com isso poderemos
contribuir para a classificação dessas espécies.
Em relação ao OTA 08 existe um grande interesse para seqüência-lo
completamente.
O OTA 09 passará por novos testes antimicrobianos, mas desta vez usando
o complexo OTA 09 + Metal, onde será avaliado se o potencial de atividade
aumenta ou diminui com a presença do metal.
Os peptídeos isolados de anfíbios apresentam um amplo espectro de
atividades, das quais se destacam: atividade hemolítica, bactericida, antifúngica e
hormonal. Desta forma temos o interesse da síntese, ou até mesmo de coletar
novos indivíduos para obtenção de OTA 18 para uma avaliação farmacológica.
O estudo químico e farmacológico das espécies de Osteocephalus deverá
ser continuado, objetivando principalmente para o conhecimento da nossa
biodiversidade.
175
6. Referências Bibliográficas
ALBUQUERQUE, E.X.; DALY, J.W.; WITKOP, B. Batrachotoxin: Chemistry and Pharmacology. Science, 172: 995-1002, 1971. ALBUQUERQUE, E. X.; WARNICH, J.E.; MALEQUE, M.A.; KAUFFMAN, F.C.; TAMBURINI, R.; NIMIT, Y.; DALY, J. W. The pharmacology of pumiliotoxin-B. 1. Interaction with calcium sites in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Molecular Pharmacolgy, 19:411-424, 1981. ALFORD, R.; RICHARDS, S.J. Lack of evidence for epidemic disease as an agent in the catastrophic decline of Australian rain forest frogs. Conservation Biology, 11:1026-1029, 1997. ALFORD, R.; RICHARDS, S.J. Global amphibian declines: A problem in applied ecology. Annual Review of Ecology and Systematics, 30:133-165, 1999. ALLINGER, N.L.; CAVA, M.P.; JONGH, D.C.; JOHNSON, C.R.; LEBEL, N.A.; STEVENS, C.L. Organic Chemistry. Worth Publishers, Inc. New York, NY/USA. 1976. AMICHE, M.; DUCANCEL, F.; LAJEUNESSE, E.; BOULAIN, J.; MÉNEZ, A.; NICOLAS, P. Molecular cloning of A cDNA encoding the precursor of adenoregulin from frog skim. Biochemical and Biophysical Research Communications, 191:983-990, 1993. AMICHE, M.; SEON, A.A.; PIERRE, T.N.; NICOLAS, P. The dermaseptin precursors: a protein family with a common preproregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS Letters (Federation of European Biochemical Societies), 456:352-356, 1999. AMNH Amphibian Species of the World V2.21 Database - The American Museum of Natural History. http://research.amnh.org/cgi-bin/herpetology/amphibia_tree?Search. Acessado 25/09/03. 2003. AMPHIBIAWEB Information on amphibian biology and conservation. [web application]. 2003. Berkeley, California: AmphibiaWeb. Available: http://amphibiaweb.org/. Acessado 25/09/03. 2003. ANASTASI, A.; ERSPAMER, V.; BERTRACCINI, G. Occurence of bradykinin in the skin of Rana temporaria. Comparative Biochemistry Physiology, 14:43-52, 1965.
176
ANASTASI, A.; ERSPAMER, V.; ENDEAN,R. Isolation and amino acid sequence of caerulein, the active peptide in the skin of Hyla caerulea. Archives Biochemistry and Biophysics, 125:57-68, 1968. ANASTASI, A.; BERTACCINI, G.; CEI, J.M.; DE CARO, G.; ERSPAMER, V.; IMPICCIATORE, M. Structure and pharmacological actions of phyllocaerulein, a caerulein-like nonapeptide: its occurrence in extracts of the skin of Phyllomedusa sauvagei and related Phyllomedusa species. Britsh Journal Pharmacology 37:198-206, 1969. ANASTASI, A.; BERTACCINI, G.; CEI,J.M.; DE CARO,G.; ERSPAMER, V.; IMPICCIATORE, M. Presence of caerulein in extracts of the skin Leptodactylus labyrinthicus and Xenopus laevis. Britsh Journal Pharmacology 38:221-228, 1970. ANASTASI, A.; ERSPAMER, V.; BUCCI, M. Isolation and structure of bombesin and alytesin, 2 analogous active peptides from the skin of the European amphibian Bombina and Alytes. Experientia, 27: 166-167, 1971. ANASTASI, A.; ERSPAMER, V.; BUCCI, M. Isolation and amino acid sequence of alytesin and bombesin, two analogous active tetradecapeptides from the skin of European discoglossid frogs. Archives of Biochemistry and Biophysics, 148: 443-446, 1972. ARAKAWA, O.; NOGUCHI, T.; SHIDA, Y.; ONOUE, Y. Occurence of 11-oxotetrodotoxin and 11-nortetrodotoxin-6(R)-ol in a xanthid Crab Atergatis floridus collected at Kojima, Ishigaki Island. Fisheries Science, 60: 769-771, 1994. ARAKI, K.; TACHIBANA, S.; UCHIYAMA, M.; NAKAJIMA, T.; YASUHARA, T. Isolation and structure of a new active peptide xenopsin on rat stomach strip and some some biogenic in the skin of Xenopus laevis. Chemical Pharmaceutical Bulletin, 23:3132-3140, 1973. ARMSTRONG, P.; FEUTREN, S.; McALONAN, C.; O’MAHONY, G.; STEVENSON, J. Synthesis of the putative structures of homopumiliotoxins 235C and 233F. Tetrahedron, 45: 1627-1630, 2004. BAKER, M.A.; MALOY, W.L.; ZASLOFF, M.; JACOB, L.S. Anticancer of magainina 2 and analogue peptides. Cancer Research, 53:3052-3057, 1993. BALANDRIN, M.F.; KINGHORN, S.J.; SMOLENSKI AND DOBBERSTEIN, H. Reversed-phase high-pressure liquid chromatography of some tryptamine derivates. Journal of Chromatography, 157: 365-370, 1978.
177
BALBONI, F.; BERNABEI, P.A.; BARBERIO, C.; SANNA, A; ROSSI FERRINI, P.; DELFINO, G. Cytotoxic effects of the cutaneous venom of Bombina variegata on the growth of the HL 60 cell line. Cell Biology Internatonal Reports, 16: 329, 1992. BARREIRO, E.J.; FRAGA, C.A.M. Química Medicinal: As Bases Moleculares da Ação dos Fármacos. Porto Alegre, Artmed Editora, 243 p, 2001. BATISTA, C.V.F. Peptídeos antimicrobianos do anfíbio brasileiro Phyllomedusa distincta. Universiade de Brasília- Biologia Molecular. Tese,77p., 1999. BEATTIE, R.C.; TYLER-JONES, R.; BAXTER, M.J. The effects of pH, aluminium concentration and temperature on the embryonic development of the European common frog, Rana temporaria. Journal Zoology, London 228:557-70, 1992. BEVINS, C.L.; ZASLOFF, M. Peptides from frog skin. Annual Review Biochemical, 59: 295-414, 1990. BOMAN, H.G. Antibacterial peptides: Key components needed in immunity. Cell, 65: 205-207, 1991. BONHOUR, A.; FISCHER, E.; MELGAR, M.C. Estudios psicofarmacologicos con bufotenina. Revista de Psiquiatria y Psicologia Medica, 8: 123-143, 1967. BRADLEY, D. Frog venom cocktail yields a one-handed painkiller. Science, 261:1117, 1993. BRAND, G.D.; LEITE, J.R.S.A.; SILVA, L.P.; ALBUQUERQUE, S.; PRATES, M.V.; AZEVEDO, R.B.; CARREGARO, V.; SILVA, J.S.; SÁ, V.C.L.; BRANDÃO, R.A.; BLOCH JUNIOR, C. Dermaseptins from Phyllomedusa oreades and Phyllomedusa distincta. The Journal of Biological Chemistry, 277:49332-49340, 2002. BRANDÃO, R.A. Rapid ecological assessment of the herpetofauna in Pedras Negras and Curralinho extractive reserves, Costa Marques, RO. Brasil Florestal, 74: 61-73, 2002. BROOMHALL, S.D.; OSBORNE, W.; CUNNINGHAM, R.B. Comparative effects of ambient ultraviolet-B radiation on two sympatric species of Australian Frogs. Conservation Biology, 14:420-427, 2000.
178
BROWN, G.B.; KIM, Y.H.; KUNTZEL, H.; MOSHER, H.S.; FUHRMAN, G.J.; FUHRMAN, F.A. Chemistry and pharmacology of skin toxins from the frog Atelopus zeteki (Ateloptoxin: zetekitoxin). Toxicon, 15(2):115-128, 1977. BULET, P.; COCIANCICH, S.; DIMARCQ, J.L. Insect immunity. Isolation from a coleopteram insect of a novel inducible antibacterial peptide and of new members of the insect defensin family. Journal of Biological Chemistry, 236:24520-24524, 1991. CALIXTO, J.B. A diversidade biológica na mira da indústria farmacêutica. Ciência Hoje, 28: 36-43, 2000. CÂMARA, I.G. Megabiodiversidade Brasil. Editora sextante Artes (GMT Editores Ltda). 206 p., 2001. CAPOBIANCO, J.P.R.; VERÍSSIMO, A.; MOREIRA, A.; SAWYER, D.; SANTOS, I.; PINTO, L.P. Biodiversidade na Amazônia Brasileira. Câmara Brasileira do Livro, SP, Brasil. 540p., 2001. CARRAWAY, R.; LEEMANN, S. The isolation of a new hypotensive peptide neurotensin from bovine hypothalami. Journal of Biological Chemistry, 248:6854-6861, 1973. CARRAWAY, R.; RUANE, S.E.; FEURLE, G.E.; TAYLOR, S. Amphibian neurotensina (NT) is not xenopsin (XP): Dual presence of NT-like and XP-like peptides in various amphibia. Endocrinology, 110:1094-1101, 1982. CEI, J.M.; ERSPAMER, V.; ROSEGHINI, M. Biogenic Amines. In Evolution in the genus Bufo. Ed. W.F. Blair, University of Texas Press, Austin and London, 233-243, 1972. CHANG, M.M.; LEEMAN, S.E.; NIALL, H.D. Amino acid sequence of substance P. Nature, 232: 86-87, 1971. CHEN, K.K.; JENSEN, H.; CHEN, A.L. The physiological action of the principles isolated from the secretion of Bufo arenarum. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutcs, Vol. XLIX: 1-13, 1932. CHEN, T.; TANG, L.; SHAW, C. Identification of three novel Phyllomedusa sauvagei dermaseptins (sVI – sVIII) by cloning from a skin secretion-derived cDNA library. Reguletory peptides, 116:139-146, 2003. COMELISSE, L.N.; DEUMENS, R.; COENEN, J.J.; ROUBOS, E.W.; GIELEN, C.C.A.M.; YPEY, D.L. JENKS, B.G.; SCHEENEN, W.J.J.M. Sauvagine Regulates
179
Ca2+ Oscillations and Electrical Membrane Activity of Melanotrope Cells of Xenopus laevis. Journal of Neuroendocrinology 14: 778-787, 2002. CROCE, G.; GIGLIOLI, N.; BOLOGNANI, L. Antimicrobial activity in the skin secretion of Bombina variegata pachypus. Toxicon, 11: 99-100, 1973. CRUCIANI, R.A.; BARKER, J.L.; ZASLOFF, M.; CHEN, H.C. Antibiotic magainins exert cytolytic activity against transformed cell lines through channel formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3792-3796, 1991. CSORDAS, A.; MICHL, H. Primary struture of two oligopeptides of the toxin of Bombina variegata. Toxicon 7: 103-108, 1969. DALY, J.W.; WITKOP, B.; BOMMER, P.; BIEMANN, K. Batrachotoxin. The active principle of the Colombian Arrow poison frog, Phyllobates bicolor. Journal of the American Chemícal Society, 87: 124-126,1965. DALY, J.W.; MYERS, C.W. Toxicity of Panamanian poison frogs (Dendrobates): some biological and chemical aspects. Science, 156: 970-973, 1967. DALY, J.W.; WITKOP, B. Chemistry and pharmacology of frog venoms. In Venomous Animals and their venoms. Vol. 2, pags. 497-519. Academic Press, New York, 1971. DALY, J.W.; WITKOP, B.; TOKUYAMA, T.; NISHIKAWA, T.; KARLE, I.L. Gephyrotoxins, histrionicotoxin and pumiliotoxins from the Neotropical frog Dendrobates histrionicus. Helvetica Chimica Acta 60:1128, 1977. DALY, J.W.; BROWN, G.B.; MENSAH-BWUMAH, M.; MYERS, C.W. Classification of skin alkaloids from neotropical poison-dart frogs (Dendrobatidae). Toxicon 16: 189-194, 1978. DALY, J.W.; MYERS, C.W.; WARNICK, J.E.; ALBUQUERQUE, E.X. Levels of Batrachotoxin and lack of sensitivity to its action in poison-dart frogs (Phyllobates). Science, 208:1383-1385, 1980. DALY, J.W. Alkaloids of neotropical poison frogs (Dendrobatidae). In: Progress in the chemistry of organic natural products. Ed by W. Herz. H. Grisebach and G. W. Kirby. Springer Verlag, Wien. 41: 206-340, 1982. DALY, J.W.; HIGUET, R.J.; MYERS, C.W. Occurence of skin alkaloids in non-dendrobatidae frogs from Brazil (Bufonidae), Australia (Myobatrachidae) and Madagascar (Mantellinae). Toxicon 22:905- 919, 1984.
180
DALY, J.W.; SPANDE, T.F. Amphibian alkaloids: chemistry, pharmacology and biology. ln: S.W. Pelletier. Alkaloids. Chemical and Biological. 4: 1986. DALY, J.W.; MYERS, C.W.; WHITTAKER, N. Further classification of skin alkaloids from neotropical poison frogs (Dendrobatidae), with a general survey of toxic noxious substances in the amphibia. Toxicon 25:1023-1095, 1987. DALY, J.W., GARRAFFO, H.M.; PANNELL, L.K. Alkaloids from australian frogs (myobatrachidae) Pseudophrynamines and pumiliotoxins. Journal Natural Product. 53:407-421, 1990. DALY, J.W.; SECUNDA, S.I.; GARRAFFO, H.M., SPANDE, T.F. Variability in alkaloid profiles in neotropical poison frogs (Dendrobatidae) - Genetic versus envoronmental determinants. Toxicon 30:887-898,1992. DALY, J.W.; GUSOVSKY, F.; MYERS, C.W.; YOTSU-YAMASHITA, M.; YASUMOTO, T. First occurrence of tetrodotoxin in a dendrobatid frog (Colostethus inguinalis), with further reports for the bufonid genus Atelopus. Toxicon, 32:279-285, 1994a. DALY, J.W., GARRAFFO, H.M., SPANDE, T.F., JARAMILLO, C.; RAND, A.S. Dietary source for skin alkaloids of poison frogs (Dendrobatidae). Journal Chemical Ecology 20:943-955,1994b. DALY, J.W.; GARRAFFO, H.M.; HALL, G.S.E.; COVER JUNIOR, J.F. Absence of skin alkaloids in captive-raised madagascan mantelline frogs (Mantella) and sequestration of dietary alkaloids. Toxicon 35:1131- 1135,1997. DALY, J.W. Thirty years of discovering arthropod alkaloids in amphibian skin. Journal Natural Product, 61:162-172, 1998. DALY, J.W.; KANEKO, T.; WILHAM, J.; GARRAFFO, H.M.; SPANDE, T.F.; ESPINOZA, A.; DONNELLY, M.A. Bioactive alkaloids of frog skin: combinatorial bioprospecting reveals that pumiliotoxins have an arthropod source. Proceeding of the National Academy Sciences, USA 99: 13996-11097, 2002. DALY, J.W.; NOIMAI, N.; KONGKATHIP, B.; KONGKATHIP, N.; WILHAM, J.M.; GARRAFFO, H.M.; KANEKO, T.; SPANDE, T.F.; NIMIT, N.; NABHITABHATA, J.; CHAN-ARD, T. Biologically active substances from amphibians: preliminary studies on anurans from twenty-one genera of Thailand. Toxicon, 44: 805-815 2004.
181
DENVER, R.J. Evolution of the Corticotropin-releasing Hormone Signalling System and Its Role in Stress-induced Phenotypic Plasticity. Annals of the New York Academy of Sciences, 897:46-53, 1999. DESVIGNES, C.; ROUQUIER, L.; SOUILHAC, J.; MONS, G.; RODIER, D.; SOUBRIÉ, P.; STEINBERG, R. Control by tachykinin NK2 receptors of CRF1 receptor-mediated activation of hippocampal acetylcholine release in the rat and guinea-pig. Neuropeptides, 37:89-97, 2003. DEULOFEU, V.; RUVEDA, E.A. The basic constituents of toad venoms. In: Venomous Animals and Theirs Venoms. Vol. 2, ed. By W. Buchler and E. E. Buckley. Academic Press. New York, 1971. DEWICK, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. John Wiley & Sons Ltd, 2nd ed. New York, NY/USA. 2002. DUELLMAN, W.E. A reassessment of the taxonomic status of some Neotropical hylid frogs. Occasional Papers of Museum of Natural History. University of Kansas, 27: 1-27, 1974. DUELLMAN, W.E.; TRUEB, L. Biology of Amphibians. New York: McGraw-Hill Book Company Publ. 228 p., 1986. DUELLMAN, W.E.; HOOGMOED, M.S. Some hylid frogs from the Guiana highlands, northeastern South America: new species, distributional records, and a generic reallocation. Occasional Papers of Museum of Natural History University of Kansas, 147: 1-21, 1992. DUELLMAN, W.E.; MENDELSON, J.R. Amphibians and reptiles from northern Departamento Loreto, Peru: Taxonomy and biogeography. University of Kansas Science, Bulletin, 55: 329-376, 1995. DUMERIL, A.M.C.; BIBRON, G. Erpétologie générale ou historie naturelle compléte des reptiles. Vol. 08. Paris, France, 1841. EDWARDS, M.W.; DALY, J.W.; MYERS, C.W. Alkaloids from Panamaian poison frog, Dendrobates speciosus: identification of pumiliotoxin-A and allopumiliotoxin class alkaloids, 3,5-disubstituted indolizidines, 5-substituted 8-methilindolizidines and A 2-methil-6-nonyl- 4-hydroxypiperidine. 1988. ERSPAMER, V.; GLASSER, A. The pharmacological actions of (m-hydroxiyphenylethyl) trimethylammonium (leptodactyline). British Journal Pharmacology, 15:14-22, 1960.
182
ERSPAMER, V.; ANASTASI, A.; CEI, J.M. Structure and pharmacological actions of physalaemin, the main active polypeptide of the skin of Physalaemis fuscumaculatus. Experientia, 20: 489-490, 1964. ERSPAMER, V.; MELCHIORRI, P. Active polypeptides of amphibian skin and their synthetic analogues. Pure and applied Chemistry, 35: 463-494, 1973. ERSPAMER, V.; MELCHIORRI, P. Active polypeptides: from amphibian skin to gastrointestinal tract and brain of mammals. Trends Pharmacology Sciences, 1: 391-395, 1980. ERSPAMER, V. The tachykinin peptides famyly. Trends Neuroscience. 4: 267-269, 1981. ERSPAMER, V.; MELCHIORRI, P.; ERSPAMER, G.F.; MONTECUCCHI, P.C.; CASTIGLIONE, R. Phyllomedusa skin: A huge factory and store-house of a variety of active peptides. Peptides, 6: 7-12, 1985. ERSPAMER, V. Bioactive secretions of the amphibian integument. In: Heatwole, H., Barthalmus GT, editors. Amphibian Biology. The Integument, Vol. 1. Chipping Norton, Australia: Ed Surray Beatty & Sous, pp.178-350, 1994. FABING, H.D.; HAWKINS, J.R. Intravenous bufotenine injection in the human being. Science 123: 886-887, 1956. FEDER, R.; NEHUSHTAI, R.; MOR, A. Affinity driven molecular transfer from erythrocyte membrane to target cells. Peptides, 22: 1683-1690, 2001. FERRONI, E.; SCHWARTZ, C.A.; SEBBEN, A.; MENDES, E.G. Ocorrência de serotonina (5-hidrotriptamina e bufotenina (N,N-dimetil-5-hidroxitriptamina) em extrato de pele de Siphonops annulatus (Caeciliidae, Gymonophiona). Resumo do XIX Congresso Brasileiro de Zoologia, p. 120, Soc. Brás. Zool. Belém, 1992. FEURLE, G.E. Xenin – A review. Peptides, 19:609-615, 1998. FEURLE, G.E.; HAMSCHER, G.; KUSIEK, R.; MEYER, H.E.; METZGER, J.W. Identification of xenin, a xenopsin-related peptide, in the human gastric mucosa and its effect on exocrine pancreatic secretion. Journal Biological Chemistry, 267:22305-22309, 1992. FORSSTRÖM, T.; TUOMINEN, J.; KARKÄINEN, J. Determination ofpotentially hallucinogenic N-dimethylated indoleamines in human urine by HPLC/ESI-MS-MS. Scancinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 61: 547-556, 2001.
183
FLUCHER, B.E.; LENGLACHNER-BACHINGER, C.; FEURLE, G.E. Immunocytochemical evidence for the colocalization of neurotensin/xenopsin- and gastrin/caerulein-immunoreative substances in Xenopus laevis gastrointestinal tract. General and Comparative Endocrinology, 72:54-62, 1988. FREITAS, J.C.; OGATA, T.; VEIT, C.H.; KODAMA, M. Occurence of tetrodotoxin and paralytic shellfish toxins in Phallusia nigra (Tunicata, ascidiacea) from the brazilian coast. Journal Venomous Animals and Toxins, 2: 28-38, 1996. FUHRMAN, F.A.; FUHRMAN, G.J.; MOSHER, H.S. Toxin from skin of frog of the genus Atelopus: differention from dendrobatid toxins. Science, 165: 1376-1377, 1969. GARDINER, J.M.; GILES, P.E.; MARTIN, M.L.M. An approach towards C12 oxo analogues of the side chain of pumiliotoxin B/allopumiliotoxin 339A and B. Tetrahedron Letters 43: 5415-5418, 2002. GARRAFFO, H.M.; SPANDE, T.F.; DALY, J.W.; BALDESSARI, A.; GROS, E.G. Alkaloids from bufonid toads (Melanophryniscus): decahydroquinolines, pumiliotoxins and homopumiliotoxins, indolizidines, pyrrolizidines, and quinolizidines. Journal of Natural Products 56:357-373, 1993a. GARRAFFO, H.M.; DALY, J.W.; SPANDE, T.F.; ANDRIAMAHARAVO, N.R.; ANDRIANTSIFERANA, M. Alkaloids in madagascan frogs (Mantella): pumiliotoxins, indolizidines, quinolizidines and pyrrolizidines. Journal of Natural Products 56:1016-1038, 1993b. GENCO, C.A.; MALOY, W.L.; KARI, U.P.; MOTLEY, M. Antimicrobial activity of magainin analogues against anaerobic oral pathogens. International Journal of Antimicrobial Agents, 21:75-78, 2003. GHOSAL, S.; MUKRERJEE, B. Indole-3-alkylamine bases of Desmodium pulchellum. 31, 2284-2288, 1966. GILLILLAND, C.D.; SUMMER, C.L.; GILLILLAND, M.G.; KANNAN, K.; VILLENEUVE, D.L.; COADY, K.K.;MUZZALL, P.; MEHNE, C.; GIESY, J.P. Organochlorine insecticides, polychlorinated biphenyls, and metals in water, sediment, and green frogs from southwestern Michigan. Chemosphere, 44:327-339, 2001. GIUGLIANI,E.R.J. Common problems during lactation and their management. Journal Pediatrics, 80: 147-154, 2004.
184
GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, C.; SANTOS, E.M.; JAIME, I. ; ROVIRA, J. Influence of starter cultures and sugar concentrations on biogenic amine contents in chorizo dry sausage. Food Microbiology 20:275-284, 2003. GORZULA, S.; SEÑARIS, C. Una nueva especie de Osteocephalus (Anura: Hylidae) de la Gran Subana. Venezuela. Acta Biologica Venezuela. 16: 19-22, 1996. GOTO, T.; KISHI, Y.; TAKAHASHI, S.;HIRATA, Y. Tetrodotoxin. Tetrahedron, 21: 2059-2088, 1965. HANDOVSKV. H. Ein alkaloid im gifte from Bufo vulgaris. Archiv fur Experimentelle Pathologie Pharmakalogie, 86: 138-158, 1920. HAUGER, R.L.; GRIGORIADIS, D.E.; DALLMAN, M.F.; PLOTSKY, P.M.; VALE, W.W.; DAUTZENBERG, F.M. Current Status of the nomenclature for receptors for Corticotropin-Releasing Fator and their ligands. International Union of Pharmacology. XXXVI, 55: 21-26, 2003. HAYES, T.B.; COLLINS, A.; LEE, M.; MENDOZA, M.; NORIEGA, N.; STUART, A. and VONK, A. Hermaphroditic, demasculinized frog after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant doses. PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), 99:5476-5480, 2002. HECNAR, S.J.; M’CLOSKEY, R.T. Regional dynamics and the status of amphibians. Ecology, 77: 2091-97, 1996. HENLE, K. Hyla elkejungingerae, ein neuer Hylidae aus dem peruanischen regenwald (Amphibia: Salientia: Hylidae). Amphibiaa-Reptilia, 2: 123-132, 1981. HOLZER-PETSCHE, U.; LEMBECK, F.; SEITZ, H. Contractile effects of substance P and neurokinin A on rat stomach in vivo and in vitro. British Journal of Pharmacology, 90:273–279, 1987. HO, B.; YEO, D.S.A.; DING, J.L. A tetrodotoxin neutralizizing system in the haemolymph of the horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Toxicon, 32: 755-762, 1994. HWANG, D.F.; CHENG, C.A.; CHEN, H.C.; JENG, S.S.; NOGUCHI, T.; OHWADA, K.; HASHIMOTO, K. Microflora and tetrodotoxin producing bacteria in the lined moon shell Natica lineata. Fisheries Science, 60: 567-571, 1994. ICHIKAWA, T.; MCMASTER, D; LEDERIS, K.; KOBAYASHI,H. Isolation and amino acids sequence of urotensin, a vasoativeand ACTH-releasing
185
neuropeptide, from the carp (Cyprinus carpio) urophysis. Peptides 3: 859-867, 1982. IZECKSOHN, E.; CARVALHO-E-SILVA, S.P. Anfíbios do município do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro: Editora UFRJ, 148p., 2001. JENSEN, H.; CHEN. K.K. A chemical study of Ch’an su, the dried venom of the Chinese toad, with special reference to isolation of epinephrine. Journal of Biological Chemistry, 82: 397-401, 1929. JENSEN, H.; CHEN. K.K. Chemical syudies on toad poisons. II. Ch’an su, the dried venom of the Chinese toad. Journal of Biological Chemistry 87: 741-753, 1930a. JENSEN, H.; CHEN. K.K. Chemical syudies on toad poisons. III. The secretion of the tropical toad. Bufo marinus. Journal of Biological Chemistry 87: 755-759, 1930b. JOHNSON, R.S.; MARTIN, S.A.; BIEMANN, K.; STULTS, J.T.; WATSON, J.T. Novel fragmentation process of peptides by collision-induced decomposition in a tandem mass spectrometer: differentiation of leucina and isoleucina. Analytical Chemistry, 59: 2621-2625, 1987. JONES, T.H.; BLUM, M.S.; FALES, H.M. Ant venom alkaloids from Solenopsis and Monomorium species: Recent developments. Tetrahedron 38: 1949, 1982. JONES, T.H.; HIGHET, R.J., BLUM, M.S.; FALES, H.M. (5Z, 9Z)-3-Alkil-5-methylindolizidines from Solenopsis (Diplorhoptrum) species. Journal of Chemical Ecology, 10:1233, 1984. JUNGFER, K.H.; SCHIESARI, L.C. Description of a central Amazonian and Guianan tree frog, genus Osteocephalus (Anura, Hylidae), with oophagus tadpoles. ALYTES, International Journal of Batrachology, 13: 1-13, 1995. JUNGFER, K.H.; RON, S.; SEIPP, R.; ALMENDÁRIZ, A. Two new species of hylid frogs, genus Osteocephalus, from Amazonian Ecuador. Amphibia-Reptilia, 21:327-340, 2000. JUNGFER, K.H.; HÖDL, W. A new species of Osteocephalus from Ecuador and a redescription of O. leprieurii (Duméril & Bibron, 1841) (Anura: Hylidae). Amphibia-Reptilia, 23:21-46, 2002. KAMANO, Y.; MORITA, H.; TAKANO, R.; KOTAKE, A.; NOGAWA, T.; HASHIMA, H.; TAKEYA, K.; ITOKAWA, H.; PETTIT, G.R. Bufobutanoic acid and
186
bufopyramide, two new indole alkaloids from the Chinese traditional drug Ch’an Su. Heterocycles, 50: 499-503, 1999. KAO, C.Y. Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomena. Pharmacology Reviews, 18: 997-1049, 1966. KAWANISH, K.; UHARA, Y.; HASHIMOTO, Y. Alkaloids from the hallucinogenic plant Virola sebifera. Phytochemistry, 24: 1373-1375, 1985. KELLAR, K.J. Epibatidine: its pharmacological actions and utility for studying neuronal nicotinic receptors. Neurotransmissions XI: 1-5, 1995. KIBAYASHI, C.; AOYAGI, S. A convergent total síntesis of pumiliotoxins A and B via palladium-catalyzed cross-coupling reaction of homoallylic organozinc compounds with vinyl iodides. Journal of Organometallic Chemistry 653: 229-233, 2002. KIM, Y.H.; MOSHER, H.S.; FUHRMAN, F.A. Occurrence of tetrodotoxin in atelopid frogs of Costa Rita. Science, 189: 151, 1995. LAI, R.; LIU, H.; LEE, W.H.; ZHANG, Y. Anovel proline rich bombesin-related peptide (PR-bombesina) from toad Bombina maxima. Peptides, 23: 437-442, 2002. LAMAR, W.W. The World’s Most Spetacular Reptiles and amphibians. Tampa: World Publications Inc. 208 p., 1997. LEDERIS, K.; LETTER, A.; MCMASTER, D.; MOORE, G.; SCHLESINGER, D. Complete amino acid sequence of urotensin, a hypotensive and corticotropin-releasing neuropeptide from Catostomus. Science 218: 162-164, 1982. LEITE, J.R.S.A.; SILVA, L.P.; RODRIGUES, M.I.; PRATES, M.V.; BRAND, G.D.; LACAVA, B.M.; AZEVEDO, R.B.; BOCCA, A.Z.; ALBUQUERQUE, S.; BLOCH JUNIOR, C. Phylloseptins: a novel class of anti-bacterial anti-protozoan peptides from the Phyllomedusa genus. Peptides 26, 565-573, 2005. LEWIS,K.;LI,C.; PERRIN,M.H.; BLOUNT,A.; KUNITAKE,K.; DONALDSON,C.; VAUGHAN,J.; REYES, T.M.; GULYAS,J.; FISHER,W.; BILEZIKJIAN,L.; RIVIER,J.; SAWCHENKO,P.E.; VALE,W.W., Identification of urocortin III, an additional member of the corticotropin-releasing factor (CRF) family with high affinity for the CRF2 receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 98:7570-7575, 2001.
187
LIMA, G.R.;GIRÃO, M.J.B.C.; BARACAT, E.C. Ginecologia de Consultório. São Paulo: EPM-Editora de Projetos Médicos, 2003. LIN, S.J.; TSAI, Y.H.; LIN, H.P.; HWANG, D.F. Paralytic toxins in Taiwanese starfish Astropecten scoparius. Toxicon, 36: 573-579, 1998. LUTZ, B. Venomous toads and frogs. In Venomous Animals and their Venoms. Ed. Por Bucherl W. and Buckley, E.E.. Vol. 02, pp. 423-473. Academic Press, Inc., Boston. 1971. McLEOD,W.R. & SITARAM,B.R. Bufotenine reconsidered. Acta Psychiatrica Scandinavica, 72: 447-50, 1985. MALEQUE, M.A.; BROSSI, A.; WITKOP, B.; GODLESKI, S.A.; ALBUQUERQUE, E.X. Interaction of analogs of histrionicotoxin with the acetilcholine receptor ionic channel complex and membrane excitability. Journal Pharmacology Exp. Therap. 229: 72-79, 1984. MALOY, W.I.; KARI, U.P. Structure-activity studies on magainins and other host defense peptides. Biopolymers, 37:105-122, 1995. MARK, F.; ROBERTSON, A.V.; WITKOP, B. Dehydrobufotenine, a novel type of tricyclic serotonin metabolite from Bufo marinus. Journal American Chemical Society, 83: 3341-3342, 1961. MARTINS, M.; CARDOSO, A.J. Novas espécies de hilídeos do estado do Acre (Amphibia: Anura). Revista Brasil de Biologia, 47: 549-558, 1987. MATSUI, T.; HAMADA, S.; KONOSU, S. Difference in accumulation of puffer fish toxin and crystalline tetrodotoxin in tha puffer fish, Fugu rubripes. Bulletin of the Japonese Society of Scientific Fishiries, 47:535-537, 1981. McBRIDE, M.C. Bufotenine: Toward an understanding of possible psychoactive mechanisms. Journal of Psychoactive Drugs, 32: 321-331, 2000. McCLEAN, S.; ROBINSON, R.C.; SHAW, C.; SMYTH, W.F. Characterisation and determination of indole alkaloids in frog-skin secretions by electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry: RCM, 16: 346-354, 2002. McDONALD, T.J.; JORNVALL, H.; NILSSON, G.; VAGNE, M.; GHATEI, M.; BLOOM, S.R.; MUTT, V. Characterization of gastrin-releasing peptide from porcine non-antral gastric tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications, 90: 227-233, 1979.
188
McLEOD, W.R.; SITARAM, B.R. Bufotenine reconsidered. Acta psychiatrica Scandinavica 72: 44750, 1985. MEBS, D.; YOTSU-YAMASHITA, M.; YASUMOTO, T.; LOTTERS, S.; SCHLUTER, A. Further report of the occurrence of tetrodotoxin in Atelopus species (Family: Bufonidae). Toxicon, 33:246-249, 1995. MENDONÇA-HAGLER, L.C.S. Biodiversidade e Biossegurança. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Jan/Fev 18: 16-22, 2001. MIELE, R.; PONTI, D.; BOMAN, H.G.; BARRA, D.; SIMMACO, M. Molecular cloning of a bombinin gene from Bombina orientalis: detection of NF- ĸB and NF- IL6 binding sites in its promoter. FEBS Letters (Federation of European Biochemical Societies), 431:23-28, 1998. MINAMINO, N.; KANGAWA, K.; MATSUO, H. Neuromedin-B: a novel bombesin-like peptide identified in porcine spinal cord. Biochemical and Biophysical Research Communications, 114: 541-548, 1983. MONTECUCCHI, P.C.; GOZZINI, V.; ERSPAMER, V.; MELCHIORRI, P. Primary structure of trytphan-containing peptides from skim extracts of Phyllomedusa rohdei (Tryptophyllins). Int. Journal of Peptide & Protein Research, 23: 276-281, 1984. MONTECUCCHI, P.C. Isolation and primary structure determination of amphibian skin Tryptophyllins. Peptides, 6 : 187-195, 1985. MOR, A; NGUYEN, V.H.; DELFOUR, A.; MIGLIORE-SAMOUR, D.; NICOLAS, P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin. Biochemistry, 30: 8824-8830, 1991. MORSE,A.S.; MORELAND,A.A.; HOLMES,K.K. Candida and Candidiosis. London: Balliere-Tindall, 42-49, 1999. MORTARI, M.R.; SCHWARTZ, E.N.F.; SCHWARTZ, C.A.; PIRES JR, O.R.; SANTOS, M.M.; BLOCH JR, C.; SEBBEN, A. Main alkaloids from the Brasilian dendrobatidae frog Epipedobates flavopictus: pumiliotoxin 251D, histrionicotoxin and decahydroquinolines. Toxicon 43: 303-310, 2004. MOSHER, H.S.; FUHRMAN, F.A.; BUCHWALD, H.D.; FISCHER, H.G. Tarichatoxin-tetrodoxin: a potent neurotoxin. Science, 144: 1100, 1964. MYAZAWA, K.; JEON, J.; NOGUCHI, T.; ITO, K.; HASHIMOTO, K. Distribution of tetrodotoxin in the tissue of flatworm Planocera multitentaculata (Platyhelminthes). Toxicon, 25: 975-980, 1987.
189
MYERS, C.W.; DALY, J.W. Preliminary evaluation of skin toxins and vocalization in taxonomic and evolutionary studies on poison dart frogs (Dentrobatidae). Bulletin of the American Museum of Natural History, 157: 175-262, 1976. MYERS, C.W.; DALY, J.W.; MALKIN, B. A dangerously toxic new frog (Phyllobates) used by Emberá Indians of western Colombia, with discussion of blowgun fabrication and dart poisoning. Bulletin of the American Museum of Natural History, 161: 307-366, 1978. NARITA, H.; NOGUCHI, I.; MARUYAMA, J; UEDA, Y.; HASHIMOTO, K.; WATANABE, I.; HIDA, K. Occurrence of tetrodotoxin in a trumpet shell, “boshubora”, Charonia sauliae. Bulletin Jpn. Society Sciences Fish, 47: 935-941, 1981. NAKAJIMA, T.; TANIMURA, T.; PISANO, J.J. Isolation and structure of a new vasoactive peptide. Feder. Proc., 29: 282, 1972. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. NCCLS approved standard M100-S9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA. 1999. NOGUCHI, T.; MARUYAMA, J.; UEDA, Y.; HASHIMOTO, K.; HARADA, T. Occurrence of tetrodotoxin in japonese ivory shell Babylonia japonica. Bulletin Jap. Society Sciencis Fish, 47: 909-913, 1981. NOGUCHI, T.; NARITA, H.; MARUYAMA, J. Tetrodotoxin in the starfish Astropecten polyacanthus, in association with toxification of a trumpet shell, “boshubora” Charonia sauliae. Bulletin Jap. Society Sciencis Fish, 48: 1173-1177, 1982. NOGUCHI, T.; HASHIMOTO, Y. Isolation of tetrodotoxin from a goby Gobius cringer. Toxicon, 11: 305-307, 1983. NOGUCHI, T.; MARUYAMA, J.; HASHIMOTO, K. Occurrence of tetrodotoxin in the gastropd mollusk tutufa lissostoma (Frog Shell). Toxicon, 22: 219-226, 1984. ODDS,F.C. Candidiosis: resistence drugs. American Journal Obstet. Gynecology, 88: 676-689, 2004.
190
OHSAKI, Y.; GAZDAR, A.F.; CHEN, H.C.; JOHNSON, B.E. Antitumor activity of magainin analogues against human lung cancer cell lines. Cancer Research, 52:3534-3538, 1992. OKADA, R.; YAMAMOTO, K.; KODA, A.; ITO, Y.; HAYASHI, H.; TANAKA, S.; HANAOKA, Y.; KIKUYAMA, S. Development of radioimmunoassay for bullfrog Thyroid-stimulating hormone (TSH): effects of hypothalamic realing hormones on the release of TSH from the the pituitary in vitro. General and Comparative Endocrinology, 2003. OTT, J. Pharmanopo-psychonautics: human intranasal, sublingual, intrrectal, pulmonary and oral pharmacology of bufotenine. Journal of Psychoactive Drugs, 33: 273-281, 2001. PALMA, M.S.; YAMANE, T.; CAMARGO, C.M. Biodiversidade: preservação e bioprospecção. Disponível em: http://www.comciência.br/biodiversidade/bio13.htm. Consultado em 08/2003. 2001. PAVELKA, L.A.; KIM, Y.H.; MOSHER, H.S. Tetrodotoxina and tetrodotoxin-like compounds from the eggs of the Costa Rican frog, Atelopus chiriquiensis. Toxicon, 15: 135, 1977. PELLETIER, S.W. In: Pelletier, S.W., (Ed), The nature and definition of Alkaloids, Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives, vol. 1. Wiley, New York. 1983. PELLETIER, S.W. Alkaloids: Chemical and Biological perspectives. Copyright © by John Wiley & Sons, Inc. 1986. PHISALIX, C.; BERTRAND, G. Sur les principes actifs du venom de crapaud comun (Bufo vulgaris L.). C. R. Soc. Biol. 54: 932-934, 1902. PIRES JUNIOR, O. Ocorrência de tetrodotoxina e derivados em três espécies de Brachycephalus (Amphibia: anura: Brachycephalidae). Tese, Brasília. Biologia Amimal. Universidade de Brasília, 2002. POHL, S.; DARLISON, M.G.; CLARKE, W.G.; LEDERIS, K.; RICHTER, D. Cloning and functional pharmacology of two corticotropin-releasing factor receptors from a teleost fish. European journal of Pharmacology 430: 193-202, 2001. PRATES, M.V. Peptídeos catiônicos de Phyllomedusa tarsius (Amphibia): estrutura e atividade biológica. Universidade de Brasília- Biologia Molecular. Dissertação,75p. 1999.
191
PRATES, M.V.; BLOCH JÚNIOR, C. Peptídeos Antimicrobianos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Nov/Dez 17: 30-36, 2000. PRATES, M.V. Peptídeos bioativos do anuro Hyla punctata. Universidade de Brasília- Biologia Molecular. Tese, 95p. 2003. RAISANEN, M.; KÄRKKÄINEN, J. Mass fragmentographic quantification of urinary N,N-dimethyltryptamine and bufotenine. Journal of Chromatography B: Biomedical Science and Applications, 162: 570-584, 1979. RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M. Pharmacology. Churchill Livingstone, a division of Copyright Harcourt Publisheers Limited, 2000. RANNEY, B.K.; FUHRMAN, G.J.; FUHRMAN, F.A Cardiovascular effects of atelopidtoxin. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeuts, 175: 368-376, 1970. REA, M.S.; BAUBY, H.; BABAR, S.; PARSONS, R.H. Effects of nitric oxide and angiotensin II and their interaction on water uptake in Rana catesbeiana. Comparative Biochemistry and Physiology (CBP), Part A, 131:457-466, 2002. REYES, T.M.; LEWIS, K.; PERRIN, M.H.; KUNITAKE, K.S.; VAUGHAN, J.; ARIAS, C.A.; HOGENESCH, J.B.; GULYAS, J.; RIVIER, J.; VALE, W.W.; SAWCHENKO, P.E. Urocortin II: a member of the corticotropin-releasing factor (CRF) neuropeptide family that is selectively bound by type 2 CRF receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 98: 2843-2848, 2001. RINALDI, A.C. Antimicrobial peptides from amphibian skin: an expanding scenario. Current Opinion in Chemical Biology, 6:799-804, 2002. RITCHIE, J.M. Tetrodotoxin and saxitoxin, and the sodium channels of excitable tissue. Trends in Pharmacological Sciencis, 1: 275-279, 1980. ROBBERS, J.; SPEEDIE, M.K.; TYLER, V. Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology. Williams & Wilkins. Baltimore, MA-USA, 1997. RODRIGUEZ, L.O.; DUELLMAN, W.E. Guide to the frogs of the Iquitos region, Amazonian Peru. Published by Asociación de Ecología y Conservación, Amazon Center for Environmental Education and Research and Natural History Museum, the University of Kansas. Lawrence, Kansas, pp. 80, 1994. ROEPSTORFF, P.; FOHLMAN, J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biological Mass Spectrometry, 11:601, 1984.
192
ROESLER, R.; MELLER, C.A.; KOPSCHINA, M.I.; SOUZA, D.O.; HENRIQUE, J.A.P.; SCHWARSTSMANN, G. Intrahippocampal infusion of the bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 impairs inhibitory avoidance retention. Peptides, 24: 1069-1074, 2003. ROLLINS-SMITH, L.A.; DOERSAM, J.K.; LONGCORE, J.E.; TAYLOR, S.K.; SHAMBLIN, J.C.; CAREY, C.; ZASLOFF, M.A. Antimicrobial peptide defenses against pathogens associated with global amphibian declines. Developmental & Comparative Immunology, 26:63-72, 2002. RON, S.; PRAMUK, J.B. A new species of Osteocephalus (ANURA: HYLIDAE) from Amazonian Ecuador and Peru. Herpetologica, 55(4): 433-446, 1999. ROSEGHINI, M.; ERSPAMER, V.; ERSPAMER, G.F.; CEI, J.M. Indole-imidazole-and phenyl-alkylamines in the skin of one hundred and forty American amphibian species other than Bufonids. Comparative Biochemistry and Physiology (CBP). 85C(1), 139-147, 1986. ROSEGHINI, M.; ERSPAMER, G.F; SEVERINI, C.; SIMMACO, M. Biogenic amines and active peptides in extracts of the skin of thirty-two European amphibian species. Comparative Biochemistry and Physiology (CBP). 94C(2), 455-460, 1989. SANDBERG, K.; JI, H. Comparative analysis of amphibian and mammalian angiotensin receptors. Comparative Biochemistry and Physiology (CBP), Part A, 128:53-75, 2001. SANTOS, N.C.F. Inibidores de serino protease e peptídeos biologicamente ativos de Phyllomedusa tarsius (Amphibia). Tese, Universidade de Brasília/Instituto de química, 97 pp., 2003. SCHWARTZ, C.A. Composição e dosagem de indolalquilaminas da secreção cutânea de Bufo rufus Garman, 1877 (AMPHIBIA, SALIENTIA, BUFONIDAE): Comparação com outros seis bufonídeos brasileiros.– Departamento de Fisiologia Geral do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Tese pp. 81, 1993. SEBBEN, A.; SCHWARTZ, C.A.; VALENTE, D.; MENDES, E.G. A tetrodotoxin-like substance found in the brazilian frog Brachycephalus ephippium. Toxicon, 24: 799-806, 1986. SEBBEN, A.; SCHWARTZ, C.A.; CRUZ, J.S. A defesa química dos anfíbios. Ciência Hoje, 15: 25-33, 1993.
193
SHAW, C.; McKAY, D.M.; HALTON, D.W.; THIM, L.; BUCHANAN, K.D. Isotion and primary structure of an amphibian neurotensin. Regulatory Peptides, 38:23-31, 1992. SHU, Y. Recent natural products based drug development: A pharmaceutical industry perspective (Reviews). Journal Natural Product., 61: 1053-1071, 1998. SHEUMACK, D.F.; HOWDEN, M.E.H.; SPENCER, I.; QUINN, R.J. Malucotoxin: a neurotoxin from the venon glands of the octopus Hapalochlaena maculosa indentified as tetrodoxin. Science, 199: 188-189, 1978. SHIMADA, K.; FUJII, Y.; YAMASHITA, E.; NIIZAKI, Y.; SATO, Y.; NAMBARA, T. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 25:714-730, 1977. SHOJI, Y.; YOTSU-YAMASHITA, M.; MIYAZAWA, T.; YASUMOTO, T. Eletrospray Ionization Mass Spectrometry of tetrodoxin and its analogs: Liquid Chromatography/Mass spectrometry, Tamdem Mass Spectrometry, and Liquid Chromatography/Tamdem Mass Spectrometry. Analytical Biochemical, 290:10-17, 2001. SILVESTRE, R.A.; RODRIGUEZ-GALLARDO, J.; EGIDO, E.M.; HERNÁNDEZ, R.; MARCO, J. Stimulatory effect of xenin-8 on insulin and glucagon secretion in the perfused rat pancreas. Regulatory Peptides, 115:25-29, 2003. SIMMACO, M.; MIGNOGNA, G.; CANOFENI, S.; MIELE, R.; MARGONI, M.L.; BARRA, D. Temporins, antimicrobial peptides from the European red frog Rana temporaria. European Journal Biochemical. 242, 788-792, 1996 SIMÕES, M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L. e PETROVICK, P.R Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5°ed. –Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 1102 p. 2003. SLIVKOFF, M.D.; WARBURTON, S.J. An endocrinological update in toads: disparity between the cardiovascular effects of two angiotensin II analogs. General and Comparative Endocrinology, 132:125-132, 2003. SLOTTA, C.H.; NEISSER, C. Composição do veneno de Bufo marinus. Mem. Instituto Butantan XI: 89-99, 1937. SMEETS, W.J.A.; GONZALEZ, A. Catecholamine systems in the brain of vertebrates: new perspectives through a comparative approach. Brain Research Reviews, 33: 308-379, 2000. SMITH, T.A. Tryptamine and related compounds in plants. Phytochemistry, 16, 171-175, 1977.
194
SMITH, E.N.; NOONAN, B.P. A new species of Osteocephalus (Anura: Hylidae) from Guyana. Revista Biologia Tropical, 49: 347-357, 2001. SPANDE, T.F.; GARRAFFO, H.M.; DALY, J.W. Identification of histrionicotoxins by GC-MS and GC-FTIR: photo and chemical-artefacts and revised 13C NMR assignments. Tetrahedron 48 : 1823-1836, 1992a. SPANDE, T.F.; GARRAFFO, H.M.; EDWARDS, M.W.; YEH, H.J.C.; PANNELL, L.; DALY, J.W. Epibatidine: a novel (chloropyridyazabicycloheptane with potent analgesic activity from Ecuadoran Poison Frog. Journal American Chemical Society. 114:3475-3478, 1992b. SPINDEL, E. Mammmalian bombesin-like peptides. Trends Neurosci. 9:130-133, 1986. SPINDEL, E.R.; KRANE, I.M. Molecular biology of bombensing-like peptides. Comparison of cDNAs encoding human gastrin releasing peptide, human neuromedin B. and amphibian ranatensin. Annals of the New York Academy of Sciences, 547:10-20, 1988. STEINDACHNER, F. Überzwei noch unbeschriebene Batrachier. Archives of Zoological Anatomy and Fisiology, 2: 77-82, 1862. STEMBERG, E.; PERSSON, B.; ROOS, H.; URBANUZKY, C.J. Colloid and Interface Science, 143, 1991. STIFFLER, D.F. Electrophysiological responses of frog skin to the peptides bombesin, caeruelein, and physalaemin. Peptides, 20: 1239-1241, 1999. SUPRATMAN, U.; FUJITA, T.; AKIYAMA, K.; HAYASHI, H. Insecticidal compounds from Kalanchoe daigremontiana X tubiflora. Phytochemistry, 58:311-314, 2001. TAKEDA, N. The metabolism of biogenic amines during embryogenesis and metamorphosis in two anuran species. General Comparative Endocrinology, 106: 361-373, 1997. TAHARA, Y. Uber dastetrodongift. Biochem. Z., 30:255-275. Apud Halstead, 1967. 1910. TAKEDA, N.; IKEDA, R.; OHBA, K.; KONDO, M. Bufotenine reconsidered as a diagnostic of psychiatric disorders. Neuroreport, 6: 2378-2380, 1995.
195
TANU, M.B.; MAHMUD, Y.; TSURUDA, K.; ARAKAWA, O.; NOGUCHI, T. Occurrence of tetrodotoxin in the skin of a rhacophoridid frog Polypedates sp. From Bangladesh. Toxicon, 39:937-941, 2001. TIMBAO, C.; SHAW, C. Identification and molecular cloning of novel trypsin inhibitor analogs from the dermal venon of the Oriental fire-bellied toad (Bombina orientalis) and the European yellow-bellied toad (Bombina variegata). Peptides, 2003. TOKUYAMA, T.; UENOYAMA, K.; BROWN, G.; DALY, J.W.; WITKOP, B. Allenic and acetylenic spiropiperidine alkaloids from the neotropical frog, Dendrobates histrionicus. Helvetica Chimica Acta, 57: 2597, 1974. TRUEB, L.; DUELLMAN, E. A synopsis of neotropical Hylid frogs, genus Osteocephalus. Occasional Papers of Museum of Natural History. The University of Kansas Lawrense, Kansas. N° 01, 29/April1. 1971. TSAI, Y.H.; HWANG, D.F.; CHAI, T.J.; JENG, S.S. Occurrence of tetrodotoxin and paralytic shellfish poison in the Taiwanense Crab Lophozozymus pictor. Toxicon, 33: 1327-1335, 1995. TSAI, Y.H.; HWANG, D.F.; CHAI, T.J.; JENG, S.S. Toxicity and toxic components of two xanthid crabs, Atergatis floridus and Demania reynaudi, in Taiwan. Toxicon, 35: 1327-1335, 1997. TSUDA, K.; ARAKAWA, O.; KAWATSU, K.; YONEKAZU, H.; TAKATANI, T.; NOGUCHI, T. Secretory glands of tetrodotoxin in the skin of the japanese newt Cynops pyrrhogaster. Toxicon, 40: 131-136, 1964. TSUSHIMA, H.; MORI, M.; FUJIWARA, N.; MORIYAMA, A. Pharmacological characteristics of bombesin receptor mediating hypothermia in the central nervous system of rats. Brain Research, 969: 88-94, 2003. TURNER,W.J. & MERLIS,S. Effect of some indolealkylamines on man. Archives of Neurology and Psychiatry, 81:121-129, 1959. TWITTI, V.C.; JOHNSON, H.H. Motor inhibition in Ambstoma produced by Triturus transplants. Science, 80: 78-79, 1934. UNDEFRIEND, S.; CLARK, C.T.; TITUS, E. The presence of 5-hidroxytryptamine in the venom of Bufo marinus. Experientia, Basel, 8: 379-380, 1952. UICN 2002 IUCN Red List of Threatened Species. www.redlist.org. Downloaded on 14 august 2002.
196
VALE, W.; SPIESS, J.; RIVIER, C.; RIVIER, J. Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and β-endorphin. Science, 213:1394-1397, 1981. VAUGHAN, J.; DONALDSON, C.; BITTENCOURT, J.; PERRIN, M.H.; LEWIS, K.; SUTTON, S.; CHAN, R.; TURNBULL, A.V.; LOVEJOY, D.;RIVIER, C.; RIVIER, J.; SAWCHENKO, P.F.; VALLE, W. Urocortin, a mammalian neuropeptide related to fish urotensin I and to corticotropin-releasing factor. Nature 378:287-292, 1995. VIBORG, A.L.; ROSENKILDE, P. Angiotensin II elicits water seeking behavior and the water absorption response in the toad Bufo bufo. Hormones and Behavior, 39:225-231, 2001. VON EULER, U.S.; GADDUM, J.H. An unidentified depressor substance in certain tissue extracts. Journal Physiology (Lond.), 72: 74-87, 1931. WIELAND, H.; KONZ, W.; MITTASCH, H. Die konstitution von bufotenin und bufotenidin, ber krotengiftstoffe. VII. Liebigs Annalen der Chemie, 513: 1-25, 1934. WOODWARD, R.B. The structure of tetrodotoxin. Pure and Applied Chemestry, 9: 49-74, 1964. WITKOP, B.; GOSSINGER, E. Amphibian alkaloids. In: The Alkaloids. Academic Press, New York. Vol. 21: 139-253, 1983. XIAO, D.; QU, X.; WEBER, H.C. Activation of extracellular signal-regulated kinase mediates bombesin-induced mitogenic responses in prostate cancer cells. Cellular Signalling, 15: 945-953, 2003. YAMASATO, Y.; KAWANISHI, K.; KATO, A.; HASHIMOTO, Y. Organic bases from Brazilian Piptadenia species. Phytochemistry, 11:737-739, 1972. YANG, Y.; YAO, K.; LI, Z. Similarities of SP-, NKA- and NKB-induce currents in rat dorsal root ganglion neurons. Brain Research, 991:18-25, 2003. YASUMOTO, T.; OSHIMA, Y.; HOSAKA, M.; MIYAKOSHI, S. Occurence of tetrodotoxin in the ivory Shell Babylonia japonica from Walasa Bay. Bulletin of the Japanese society of Scientific Fisheries, 47: 929-934, 1981. YASUMOTO, T.; NAGAI, H.; YASUMURA, D.; MICHISHITA, T.; ENDO, A.; YOTSU, M.; KOTAKI, Y. Interspecies distribuition and posible origin of tetrodotoxin. Annals New York Academy of science. Pp 44-51, 1986.
197
YE, M.; DAI, J.; GUO, H.; CUI, Y.; GUO, D. Glucosylation of cinobufagin by cultured suspension cells of Catharanthus roseus. Tetrahedron Letters, 43: 8535-8538, 2002. YE, M.; NING, L.; ZHAN, J.; GUO, H.; GUO, D. Biotransformation of cinobufagin by cell suspension cultures of Catharanthus roseus and Platycodon grandiflorum. Journal Molecular Catalysis B: Enzymatic, 22:89-95, 2003. YOTSU, M.; YASUMOTO, T.; KIM, Y.H.; NAOKI, H.; KAO, C.Y. The structure of chiriquitoxin from the Costa Rican frog Atelopus chiriquiensis. Tetrahedron Letters, 31: 3187-3190, 1990. ZALOLOV, I.; KHUZHEV, U.V.; LEVKOVICH, M.G.; ARIPOVA, S.F. Alkaloids of arundo donax. VIII. 3-alkylindole derivatives in A-donax. Chemistry of Natural Compounds, 36: 528-530, 2000. ZASLOFF, M. Magainins, a ciass of antimicrobial peptides from Xenopus skin. Isolation, characterization of 2 active forms and partial cDNA sequence of a precursor. Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 84: 5449- 5453, 1987. ZASLOFF, M. Antibiotic peptides as mediators of innate immunity. Current Opinion in Immunology, 4:3-7, 1992. ZAVADINACK, M.N.; HERREIRO, F.; BANDEIRA, C.O.P.; ITO, Y.; CIORLIN, E.; SIQUEIRA, V.L.D. Staphylococcus aureus: incidência e resistência antimicrobiana em abcessos cutâneos de origem comunitária. Acta Scientiarum, 23: 709-712, 2002. ZELNIK, R.; ZITTI, L.M.; GUIMARÃES, C.V. A chromatography study of the bufadienolides isolated from the venom of the parotoid glands of Bufo paracnemis Lutz. Journal Chromatography, 15: 9-14, 1964. ZETLER, G. Caerulein and analogues: neuropharmacological properties. Peptides, 6: 33-46, 1985. ZHALOLOV, I.; KHUZHAEV, V.U.; LEVKOVICH, M.G.; ARIPOVA, S.F. Alkaloids of Arundo donax. VIII. 3-Alkylindole derivatives in A. donax. Chemistry of Natural Compounds, 36: 528-530, 2000.
198
Anexos
199
Anexo 01 – Degradação de Edman
Fonte: Lehninger, A.L.; Nelson, D.L.; Cox, M.M. Principles of Biochemistry. 3° ed., New York, 1999.
N C S H2NN
NN
OH
O
O
O
OR1
R2
R3
R4
H
H
H
NN
NN
OH
O
O
O
OR1
R2
R3
R4
H
H
H
H
CN
S
H
NN
NN
OH
O
O
O
OR1
R2
R3
R4
H
H
H
CS
H
NH
NN
NN
OH
O
O
OR1
R2
R3
R4
H
H
H
H
C S O
HN
H
NN
NN
OH
O
O
OR1
R2
R3
R4
H
H
H
H
C S O
HN
N
R1
H
C SN
O H2NN
NOH
O
O
O
R2
R3
R4H
H
Fenil isotiocianato
Peptídeo com menos um aminoácido
Ppetídeo
N N
O R1
SH
200
Anexo 02 – Reação de Alquilação das Cisteínas
Fonte: Kyte, J. Chemical reactions; Mechanisms in protein chemistry. Garland Publishing, Inc.; New York, 1995.
NO
O S
HNH2H
H I
O
Fragmento peptídeocontendo cisteína
Iodoacetamida
H NO
O S I
NH2O
HH
NO
O S
ONH2
H H
H
201
Anexo 03 – Reação de Redução das pontes dissulfeto
Fonte: Kyte, J. Chemical reactions; Mechanisms in protein chemistry. Garland Publishing, Inc.; New York, 1995.
S S e S S
S S HS
HS
e
SH S H S
HS
H
Ponte dissulfeto ânion radical dissulfeto
tiolato radical tiol
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