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aprenDenDo com as interaes Da natureza: microrganismos simBiontes como fontes De proDutos naturais Bioativos

Raphael Conti Denise O. Guimares Mnica T. Pupo

em geral, os microrganismos, especialmente fungos e bactrias, so lembrados como causadores de doenas. Esta associao natural, e, infelizmente, mesmo em uma poca de tantos avanos cientficos e tecnolgicos, algumas infeces microbianas podem comprometer a vida de pacientes, principalmente aqueles que apresentam o sistema imunolgico debilitado. Diversos microrganismos tambm causam doenas em alimentos, plantas e animais, levando a prejuzos significativos no agronegcio.

Esses processos patolgicos e de deteriorao frequentemente esto relacionados a fatores de virulncia microbianos, que podem incluir substncias qumicas conhecidas como micotoxinas. Porm, microrganismos tambm so profcuos produtores de substncias qumicas com grande aplicao na indstria farmacutica, pois so usadas como frmacos ou como estruturasmodelo para o planejamento e desenvolvimento de frmacos. Diversos antibiticos, anticancergenos, imunossupressores e agentes redutores do colesterol sanguneo, entre outros, tm suas origens em produtos naturais microbianos. Os microrganismos apresentam, portanto, uma surpreendente capacidade de produzir substncias qumicas com elevada potncia biolgica (1).

Todas essas substncias qumicas, com efeitos txicos, teraputicos, ou mesmo sem efeito biolgico conhecido, so denominadas produtos naturais. Mas, qual a razo da aprecivel capacidade biossinttica dos microrganismos? Diferentemente dos metablitos primrios, os produtos naturais so produzidos por razes fisiolgicas especficas, sociais ou predatrias, estando, portanto, relacionados com a ecologia dos organismos produtores (2). Microrganismos esto em todos os lugares: solo, ar, gua, pedras, na superfcie ou no interior de outros seres vivos (plantas, animais, humanos), ambientes com condies extremas de temperatura, pH, oxigenao, entre outros. Esses microscpicos seres vivos no apresentam defesas fsicas e no se locomovem, portanto precisaram desenvolver estratgias adaptativas que permitissem sua sobrevivncia no ambiente.

Em um ecossistema os organismos esto constantemente interagindo entre si; tais relaes podem ser intraespecficas ou interespecficas. Em funo dos tipos de dependncia que os organismos mantm entre si, e se h prejuzo ou benefcio para os organismos envolvidos, essas relaes ainda so subdivididas em harmnicas e desarmnicas. Nas relaes harmnicas no existe prejuzo para ne

nhuma das espcies envolvidas e, pelo menos uma delas, beneficiada; j nas desarmnicas, ocorre prejuzo de uma das espcies e benefcio da outra. A simbiose uma relao interespecfica, harmnica e estvel, em geral de longa durao, frequentemente encontrada nas comunidades terrestres e aquticas, com papel fundamental no surgimento das principais formas de vida na Terra e na gerao de diversidade biolgica (3).

Os microrganismos surgiram e se diversificaram previamente aos macrorganismos multicelulares. Estes organismos maiores e mais complexos forneceram novos potenciais habitats ricos em nutrientes e que ainda propiciam proteo para os microrganismos. Assim, muitos microrganismos se tornaram dependentes de seus hospedeiros para a sobrevivncia. Por outro lado, os compostos bioativos produzidos pelos microrganismos podem ser usados como agentes de defesa pelos hospedeiros. Como resultado, plantas, animais e humanos tm se envolvido em complexas interaes com microrganismos durante sua evoluo (3).

muito provvel que os produtos naturais sejam resultados das interaes entre organismos entre si e destes com o ambiente, e que desempenhem funes precisas e definidas nessas associaes simbiticas, representando uma das vantagens adaptativas e evolutivas para os organismos produtores. Como consequncia dessa funo ecolgica, os produtos naturais microbianos constituem fontes promissoras para a bioprospeco de novas molculas com potencial aplicao na medicina (frmacos), agricultura (agroqumicos) e nos estudos de processos biolgicos (biologia qumica). De fato, a investigao de microrganismos que vivem em associaes simbiticas com outros organismos (ex.: plantas, insetos, organismos marinhos, nematoides), e mesmo em associao com outros microrganismos, vem sendo cada vez mais explorada na qumica de produtos naturais como uma alternativa para a busca de molculas com atividade biolgica. Alguns exemplos de interaes simbiontes so destacados a seguir.

microrgaNismos eNdofticos De acordo com a sanidade do hospedeiro vegetal, o material coletado para anlise e a tcnica de isolamento empregada, os microrganismos em relao simbitica com as plantas so classificados em endofticos, epifticos, rizosfricos, entre outros (4). Os endofticos, em geral fungos e bactrias, vivem intra e/ou extracelularmente pelo menos em um perodo de seu ciclo de vida, sem causar doenas aparentes ao hospedeiro (5).

A interao entre planta e endofticos dependente de um equilbrio antagnico, pois microrganismos considerados como endofticos podem ser fitopatgenos em seu estado latente (4). Verdadeiros endofticos esto diretamente associados com a sanidade de seu hospedeiro, proporcionandolhe benefcios atravs da produo, induo ou inibio de metablitos primrios e/ou secundrios, com funes em controle biolgico (fitohormnios, herbicidas, antimicrobianos), regulao de estresse abitico, biorremediadores e vetores gnicos (4;5). Porm, as relaes bioqumicas entre endfitos e suas plantas hospedeiras ainda no esto totalmente esclarecidas.

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Acreditase que os metablitos secundrios bioativos produzidos por esses microrganismos possam estar diretamente associados com a planta hospedeira atravs da recombinao gnica entre as espcies durante a fase evolutiva. De fato, alguns dados da literatura tm mostrado a habilidade dos fungos endofticos de produzir in vitro metablitos secundrios idnticos aos da planta hospedeira (Figu ra 2) (5). O mais marcante exemplo foi o isolamento do antitumoral taxol (1) do fungo endoftico Taxomyces andreanae, associado a Taxus brevifolia (6). Mais recentemente, os produtos naturais vegetais anticancergenos vincristina (2), camptotecina (3), podofilotoxina (4) e hipericina (5), foram tambm isolados de fungos endofticos associados aos respectivos hospedeiros vegetais (5), evidenciando uma possvel transferncia gentica de genes biossintticos. Nesse contexto, fica evidente a importncia da etnobotnica nos estudos de bioprospeco por microrganismos endofticos. Novos produtos naturais bioativos tm sido frequentemente descritos na literatura, demonstrando a relevncia desses microrganismos em programas de bioprospeco (5).

microrgaNismos e orgaNismos mariNHos Os mares e oceanos juntos cobrem aproximadamente 70% da superfcie de nosso planeta e servem de abrigo para 34 dos 36 filos j descritos, alguns exclusivamente de ambiente marinho, e representados por aproximadamente 300 mil espcies, distribudas entre a fauna e flora (7, 8), constituindo o maior reservatrio de biodiversidade da Terra. Os

diversos fatores abiticos presentes nesses ecossistemas, como a presso, salinidade, temperatura, pH, e biticos, como a competio por espao, predao, incrustao da superfcie e reproduo, se refletem tanto na variabilidade gentica, quanto nas rotas metablicas desses seres vivos para que possam adaptarse ao habitat em que vivem.

Produtos bioativos marinhos so obtidos principalmente de invertebrados, macroalgas e microrganismos (9). Os microrganimos so geralmente isolados da gua do mar, de sedimentos, algas, peixes e principalmente de invertebrados marinhos como esponjas, moluscos, tunicados, cnidrios e crustceos (10). Alguns produtos naturais isolados de invertebrados marinhos mostram grande semelhana estrutural com produtos naturais bacterianos, sugerindo que os microrganismos esto, no mnimo, envolvidos na sua biossntese ou so, de fato, a verdadeira fonte desses metablitos (11, 12, 13). Esta hiptese simbitica tem atrado a ateno dos pesquisadores, afinal a produo em maior escala de eventuais produtos por fermentao microbiana mais factvel e de menor impacto ambiental que o isolamento de produtos naturais dos invertebrados marinhos (11).

Em alguns casos h evidncias para essa hiptese, mas a complexidade das associaes entre os organismos marinhos dificulta a definio da origem biossinttica de muitos produtos naturais. Esponjas, por exemplo, constituem um microambiente que pode abrigar uma ampla diversidade microbiana, incluindo fungos, arqueobactrias, bactrias heterotrficas, algas, cianobactrias,

figura 1. representao do processo de isolamento de endfitos. a) vegetal em seu habitat natural (lychnophora ericoides); b) razes separadas do vegetal coletado; c) microrganismos endofticos se desenvolvendo a partir de fragmentos vegetais em meio de cultura; d) microrganismos endofticos isolados em culturas puras; e) microrganismos endofticos preservados em laboratrio

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Fotos: Raphael Conti

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criptofceas, dinofl agelados e diatomceas (14;15). Estes sim-biontes podem estar localizados intra e/ou extracelularmente na esponja hospedeira. Especula-se que funes como aquisio de nutrientes, regulao metablica, mecanismos de defesa e fi xao de nitrognio podem ser atribudas s interaes entre esponjas e microrganismos (12;16). Novos produtos naturais bioativos pro-duzidos por microrganismos marinhos tm sido frequentemente relatados na literatura (17).

QUANDO A FUNO DO PRODUTO NATURAL NA RELAO SIMBI-TICA DESVENDADA A grande maioria dos trabalhos envolvendo microrganismos simbiontes, como aqueles associados a plantas e organismos marinhos, tem sido direcionada seguindo as estratgias experimentais tradicionais da qumica de produtos naturais, isto , envolvendo o isolamento da linhagem microbiana de seu habitat, o cultivo em laboratrio e a triagem dos extratos obtidos em dife-rentes ensaios biolgicos para o isolamento e identifi cao dos pro-dutos naturais bioativos. Esta abordagem permite a identifi cao de produtos naturais ativos, objeto da bioprospeco, porm no fornece respostas para a difcil questo que envolve as razes pelas quais os produtos naturais so biossintetizados. Trabalhos mais recentes tm sido direcionados para se determinar a funo real desses produtos naturais para o microrganismo produtor. Exemplos elegantes da determinao da funo ecolgica de produtos natu-rais microbianos incluem estudos realizados com microrganismos associados a insetos. Outros trabalhos envolvendo interaes entre nematoides e microrganismos e entre microrganismos, tambm tm determinado a funo dos produtos naturais envolvidos na relao simbitica.

MICRORGANISMOS E INSETOS Insetos, um dos fi los de animais mais abundantes e complexos, abrigam um surpreendente nmero de microrganismos simbiontes. As formigas se destacam, representando um exemplo fascinante de interao simbitica com microrganis-mos. Formigas Apterostigma dentigerum coevoluram em um mutu-alismo de cerca de 50 milhes de anos com o fungo basidiomiceto Leucoagaricus sp., que cultivado em jardins como fonte de alimento para as formigas. Porm, fungos fi lamentosos parasitas do gnero Escovopsis podem comprometer a viabilidade dos ninhos de formigas, devido ao efeito txico frente Leucoagaricus sp. Como forma de

proteo, as formigas desenvolveram estruturas especializadas em seu corpo para carregar actinobactrias, predominantemente dos gneros Pseudonocardia e Streptomyces, responsveis pela produo de antimicrobianos que controlam a infeco por Escovopsis sp., protegendo a fonte de alimento. Das culturas laboratoriais de Pseu-donocardia spp. foi obtido o depsipeptdeo cclico dentigerumicina (6), responsvel pela inibio do fungo parasita Escovopsis sp. e de outros fungos patognicos, mas sem toxicidade ao fungo usado para alimentao das formigas (18). Formigas cortadeiras Acromyrmex echinatior tambm estabelecem relao simbitica com o fungo Leucoagaricus gongylophorus e com actinobactrias dos gneros Pseu-donocardia e Streptomyces. Antimicinas A1-A4 (7-10), valinomicina (11) e actinomicinas D e X2 (12-13) (Figura 3) foram identifi cadas de espcies Streptomyces em associao com as formigas cortadeiras e possuem atividade antibitica relacionada com a proteo das for-migas contra patgenos (19). Outra espcie de formiga cortadeira, Acromyrmex octospinosus, tambm possui relao simbitica com fungos do gnero Leucoagaricus, e com actinobactrias do gnero Streptomyces. Diversas espcies Streptomyces spp. produziram o anti-bitico macroldeo, candicinina D (14) (Figura 3), que, juntamente com outros antibiticos produzidos por essas actinobactrias, deve auxiliar no combate aos fungos patognicos que possam causar morte de Leucoagaricus sp. (20).

Vespas tambm estabelecem relaes simbinticas com micror-ganismos. Streptomyces sp., isolado da vespa Sceliphron caementa-rium, produz o polieno macrocclico escelifolactama (15) (Figura 3), substncia com atividade antifngica frente a Candida albicans resistente anfotericina B (21). Outros metablitos, pertencentes a diferentes classes qumicas, tambm foram identifi cados a partir da simbiose entre Streptomyces sp. e as espcies de vespas Sceliphron caementarium e Chalybion californicum (22). Vespas Philanthus spp. cultivam bactrias simbiontes especfi cas Streptomyces spp. que so incorporadas no casulo para proteo contra patgenos. A identi-fi cao de substncias antibiticas produzidas por essas actinobac-trias, como estreptoclorina (16), piericidina A1 (17), piericidina B1 (18), glucopiericidina A (19) piericidina A5 (20), piericidina C1 (21), 9-demetil-piericidina A1 (22), piericidina B5 (23) e pie-ricidina IT-143-B (24) (Figura 4), indica que essa relao favorece a garantia de sobrevivncia das vespas atravs da proteo das larvas no casulo contra agentes patognicos (23).

Figura 2. Produtos naturais vegetais anticancergenos tambm isolados de fungos endofticos

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Outro estudo demonstrou que uma espcie de Streptomyces sp., simbionte do besouro Dendroctonus frontalis, responsvel pela pro-duo da micangimicina (25) (Figura 3), que possui ao antago-nista de crescimento frente ao fungo Ophiostoma minus, o qual um competidor natural do fungo Entomocorticium sp., este ltimo por sua vez possui importante funo protetora durante o desenvolvi-mento de larvas do besouro Dendroctonus frontalis (24, 25).

MICRORGANISMOS E NEMATOIDES Outros metablitos secundrios com atividade biolgica e possvel aplicao industrial tambm po-dem ser exemplifi cados a partir de microrganismos encontrados em associao com nematoides. Bactrias pertencentes ao gnero Pho-torhabdus e Xenorhabdus vivem em associao complexa de simbiose com nematoides hospedeiros, parasitam larvas de insetos no solo e ainda enfrentam competidores microbianos. Atravs da relao de simbiose entre bactrias Photorhabdus e Xenohabdus com nematoides Heterorhabditis e Steinernema, respectivamente, possvel a garantia de infeco de uma ampla variedade de larvas de insetos no ambien-te, e essa caracterstica utilizada no auxlio como controle biolgico natural na agricultura. Quando um nematoide invade um inseto, ele regurgita a bactria, esta por sua vez produz toxinas, proteases e

esterases que auxiliam no combate e morte do inseto. Alm disso, as bactrias produzem molculas que auxiliaro no desenvolvimento de jovens nematoides at a fase adulta, contra a resposta imune inata dos insetos e como antibiticos contra competidores microbianos naturais. Essas funes biolgicas mltiplas podem ser atribudas aos compostos produzidos, estilbenos (26) e isocianetos vinlicos, como a rabduscina (27) (Figura 3) (26).

MICRORGANISMOS E MICRORGANISMOS Outro tipo de associao que tem levado caracterizao funcional de produtos naturais estudo de simbiose entre dois microrganismos. A substncia rizoxina (28) (Figura 3), com propriedades anticncer, produzida pela bactria Burkholderia rhizoxinica, encontrada em associao simbitica com o fungo Rhizopus microsporus. Nessa relao ambos benefi ciam da ao fi topatognica da rizoxina contra o arroz que, durante estgio de morte, serve como alimento para a bactria e para o fungo. Alm disso, a bactria ganha proteo dentro das clulas fngicas com condies favorveis de metabolismo citoslico e o fungo necessita da bactria para garantir sua esporulao, enquanto garante sua resistncia toxi-cidade da rizoxina via mutaes genticas em genes da tubulina, alvo de mecanismo geral para ao dessa toxina (26).

Figura 3. Produtos naturais microbianos envolvidos na simbiose de actinobactrias com formigas (6-14), vespas (15-24), e besouro (25), e na simbiose de bactrias com nematoides (26-27) e fungo (28)

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coNcluses clara a relevncia da incluso de microrganismos em programas de bioprospeco. Ateno especial deve ser dirigida aos microrganismos simbiontes, que produzem diversos produtos naturais ainda desconhecidos e envolvidos em funes ecolgicas, sendo, portanto, candidatos promissores para a descoberta de molculas com aplicaes teraputicas e/ou agroqumicas. provvel que muitos dos microrganismos em comunidades naturais sejam obrigatoriamente dependentes de outras espcies de organismos (3), o que explicaria a razo pela qual o cultivo em laboratrio de cerca de 99% dos microrganismos seja difcil ou impossvel. Neste sentido, a metagenmica e as tcnicas modernas de biologia molecular despontam como alternativas para acessar o genoma dessa microbiota e, consequentemente, o amplo arsenal qumico que ainda permanece escondido na biodiversidade microbiana. Porm, o sucesso de projetos na rea depende de trabalho integrado entre qumicos, bilogos e farmacuticos, com conhecimentos nas reas de qumica orgnica, qumica analtica, qumica medicinal, farmacologia, microbiologia, biologia molecular, ecologia, entomologia, botnica, meio ambiente, entre outros. No Brasil, o nmero de grupos de pesquisa que se dedica ao estudo de produtos naturais microbianos vem aumentando significativamente. Com trabalho integrado entre as diversas expertises podese vislumbrar um futuro promissor que possibilitar a descrio das funes de produtos naturais microbianos na mediao de interaes simbinticas e, concomitantemente, a descoberta de novas molculas teis para o planejamento de frmacos e agroqumicos.

Raphael Conti doutorando em cincias pelo Programa de PsGraduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo (FCFRPUSP), Ribeiro Preto, SP. Email: raphael.conti@gmail.com.

Denise O. Guimares doutora em cincias pelo Programa de PsGraduao em Cincias Farmacuticas FCFRPUSP e professora adjunta do curso de farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Maca, RJ . Email: denise@macae.ufrj.br.

Mnica T. Pupo doutora em cincias pelo Programa de PsGraduao em Qumica do DQUFSCar, professora associada da FCFRPUSP e bolsista do CNPq, Ribeiro Preto, SP . Email: mtpupo@fcfrp.usp.br.

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