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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
THAMIRIS YUMI INOUE
CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CONTENDO
DIHIDROCHALCONA ISOLADA DE Piper aduncum:
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL
IN VITRO
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
THAMIRIS YUMI INOUE
CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CONTENDO
DIHIDROCHALCONA ISOLADA DE Piper aduncum:
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL
IN VITRO
Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dra. Ruth Meri Lucinda-Silva Co-orientadora Prof. Dra. Angela Malheiros
Itajaí (SC)
Julho de 2015
CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CONTENDO
DIHIDROCHALCONA ISOLADA DE Piper aduncum: DESENVOLVIMENTO
E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VITRO
Thamiris Yumi Inoue Julho de 2015
Orientadora: Ruth Meri Lucinda Silva, Dra. Co-Orientadora: Angela Malheiros, Dra. Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de páginas: 154 O melanoma é um tipo de câncer de pele que tem grande incidência no Sul do Brasil e atinge caucasianos de pele clara, expostos a radiação UV. Os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) de segunda geração. Estes sistemas têm por vantagem biocompatibilidade, baixa imunogenicidade, controle na liberação de fármacos hidrofílicos e lipofílicos, versatilidade, estabilidade física e baixo custo de produção. Estudos recentes comprovaram a atividade antitumoral in vitro de uma dihidrochalcona isolada de Piper aduncum. O presente estudo teve por objetivo desenvolver CLN contendo o fitocomposto 2,6-dihidroxi-4-metoxi-dihidrochalcona (DHC) e avaliar a influência dos sistemas sobre a atividade antitumoral em células de melanoma murino in vitro. A DHC foi isolada das folhas de P. aduncum e caracterizada por métodos espectroscópicos e físico-químicos e a pureza determinada por DSC, CLAE e CG/MS. A metodologia para quantificação da DHC por CLAE foi desenvolvida e validada. No desenvolvimento dos CLN foram usados os lipídios dibehenato de glicerila (DBG) e monoestearato de glicerila (MEG); os óleos miristato de isopropila (MIP), triglicérides de ácido cáprico e caprílico (TAC) e monocaprilato de propilenoglicol (MCP) e os tensoativos polissorbato 80 (P80) e óleo de rícino etoxilado (ORE). Os sistemas foram caracterizados quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta, morfologia por MET, comportamento térmico, absorção no IV, eficiência de encapsulação e perfil de liberação in vitro. A atividade antitumoral foi avaliada em células de fibroblastos e de melanoma murino, comparando a atividade do CLN-DHC com o extrato de P. aduncum e o fitocomposto. A metodologia analítica desenvolvida mostrou-se adequada para análise quantitativa da DHC por CLAE, com um tempo de análise de 15 min. O método mostrou-se linear, específico, preciso, exato e robusto. A DHC foi isolada do extrato concentrado de folhas de P. aduncum, com um rendimento de 9,54% e grau de pureza >99%. A partir dos estudos de pré-formulação e desenvolvimento, CLN compostos pelo lipídio DBG, MIP como óleo e ORE como tensoativo foram selecionados para incorporação da DHC na proporção 1:20. Os CLN apresentaram tamanho médio entre 8 a 25 nm, PDI inferior a 0,4, sem aglomeração visual, cor azul translúcido e estabilidade em 30 dias de análise para a
formulação escolhida. Os CLN apresentaram formato esférico e homogêneo. O perfil de liberação da DHC incorporada nos CLN apresentou uma velocidade de dissolução maior do que o fármaco livre. A liberação foi gradativa, com a liberação de mais de 60% do fármaco em 48 h contra 35% do fármaco livre. Os estudos de citotoxicidade em
células normais (fibroblastos L929) e tumorais (melanoma murino B16F10) mostraram que o extrato de P. aduncum, o fitocomposto, os CLN com e sem DHC apresentaram baixo potencial de inibição de crescimento celular para linhagens de fibroblastos. Em células tumorais a inibição do crescimento celular foi potencializada pela incorporação da DHC nos CLN apresentando um potencial citotóxico em uma dose cerca de 1000 vezes inferior ao fitocomposto em solução. Os CLN contendo DHC foram desenvolvidos com sucesso e os métodos empregados permitiram caracterizar os sistemas e conhecer seu potencial em modelos de atividade antitumoral.
Palavras-Chave: Dihidrochalcona. Piper aduncum. Melanoma. Carreadores lipídicos nanoestruturados
NANOSTRUCTURED LIPID CARRIERS CONTAINING
DIHYDROCHALCONE ISOLATED FROM Piper Aduncum: EVALUATION
OF DEVELOPMENT AND IN VITRO ANTITUMORAL ACTIVITY
Thamiris Yumi Inoue July 2015
Supervisor: Ruth Meri Lucinda Silva, PhD. Co-Supervisor: Angela Malheiros, PhD. Concentration Area: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances. Pages number: 154 Melanoma is a skin cancer with very high incidence in the South of Brazil, given that the inhabitants are predominantly light-skinned Caucasians, who are exposed to UV radiation. Nanostructured lipid carriers (CLN) are second-generation solid lipid nanoparticles (NLS). These systems have advantages such as: biocompatibility, low immunogenicity, control of hydrophilic and lipophilic drug release, versatility, physical stability, and low production cost. Recent studies have proven in vitro citotoxicity activity of dihydrochalcone isolated from Piper aduncum. The purpose of the present study is to develop a CLN containing the phytocompound 2’,6’-dihydroxy-4’-metoxydihydrochalcone (DHC) and to evaluate the influence of this system on in vitro cytotoxicity activity using murine melanoma cells (B16F10). DHC was isolated from P. aduncum leaves and characterized by spectroscopic methods. Physical-chemical and purity was determined by DSC, HPLC and GC/MS. The HPLC method for DHC quantification was developed and validated. In the CLN development studies, glyceril dibehenate (DBG) and glyceryl monostearate (MEG) as solid lipids; isopropyl myristate (MIP), caprylic capric triglyceride (TAC) and propylene glycol monocaprilate (MCP) as oils; and polissorbate 80 (P80) and castor oil polyethoxylated-40H (ORE) as surfactants. The systems were characterized by size particle, polydispersity index (PDI), zeta potential, morphology by TEM, thermal behavior, IR absorption, encapsulation efficiency, and in vitro release profile. Antitumor activity was evaluated in murine melanoma cells and murine fibroblast cells, comparing CLN-DHC activity against P. aduncum ethanolic extract and DHC alone. The analytical methodology developed was adequate for DHC quantitative analysis by HPLC with a 15-min time analysis. The method was linear, selective, precise, exact and robust. DHC was isolated from the ethanolic extract of P. aduncum leaves with a yield of 9.54% and purity rate of >99%. CLN containing DBG lipid, MIP as oil, and ORE as tensoactive was chosen as main formulation to incorporate DHC at a ratio of 1:20 (DHC:lipid). The CLN had an average particle size of between 8 and 25 nm, PDI lower than 0.4, no visual agglomeration, a blue translucid color, and stability over 30 days of analysis for the chosen formulation. TEM analysis showed spherical, homogenous CLN. The release profile of the DHC incorporated in the CLN showed a faster dissolution rate than the free drug. The release was gradual, with the release of more than 60% of the drug in 48 h, compared with 35% for the free drug. Cytotoxicty studies on non-tumoral cells (murine fibroblasts L929) presented low potential inhibition on the cellular growth rate for P. aduncum ethanolic extracts, DHC, blank CLN and CLN-DHC for L929 lineage cells. Growth rate inhibition in the tumoral cells (B16F10) was potentialized by incorporating DHC on CLN, presenting a cytotoxic activity over 1000 times in comparison to DHC alone. DHC loaded CLN were successfully developed, and the methods employed enabled us to characterize systems and determine their potential cytotoxic activity on murine melanoma cells. Keywords: Dihydrochalcone. Piper aduncum. Melanoma. Nanostructured lipid carriers.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Classificação de Breslow da espessura do tumor (em milímetros) pelo sistema TNM. ........................................................................................... 28
Figura 2 – Classificação do melanoma de acordo com o estágio. ............................ 29 Figura 3 – Linha do tempo para o conhecimento, diagnóstico e tratamento do
melanoma. ................................................................................................ 34 Figura 4 – Ilustração das nanopartículas lipídicas sólidas. NLS: nanopartículas
de primeira geração. CLN: nanopartículas de segunda geração. ............ 37 Figura 5 – Esquema teórico de possíveis estruturas dos CLN sem ativo. 1 –
matriz mista sólido-líquido; 2 – núcleo oleoso revestido por lipídio sólido; 3 - núcleo oleoso revestido por lipídio sólido seguido de uma camada de lipídio líquido na superfície. ................................................... 38
Figura 6 – Estrutura química do behenato de glicerila. ............................................ 41 Figura 7 - Estrutura química do ácido esteárico. ...................................................... 42 Figura 8 - Estrutura química do monoestearato de glicerila. .................................... 42 Figura 9 - Estrutura química do miristato de isopropila ............................................ 43
Figura 10 - Estrutura química de triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico. .............. 43 Figura 11 - Estrutura química do monocaprilato de propilenoglicol. ......................... 44
Figura 12 – Efeito oclusivo (retenção de água na pele) de sistemas nanoparticulados (primeira ilustração) e sistemas microparticulados (segunda ilustração). ................................................................................ 48
Figura 13 – Partes aéreas da planta adulta de Piper aduncum. ............................... 49
Figura 14 – Núcleo fundamental das chalconas. ...................................................... 52
Figura 15 - Núcleo fundamental das di-hidrochalconas. ........................................... 53
Figura 16 – Estrutura química da 2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona. .............. 53
Figura 17 - Tubo de centrifugação contendo ultrafiltro 10.000 MWCO. .................... 72 Figura 18 – Adaptação da cuba de dissolução. Aparato modificado para conter
30 mL de meio de dissolução. Amostra ficará retida dentro do saco de diálise na haste do dissolutor. .................................................................. 73
Figura 19 - (a) Cromatograma de DHC usando Método A com TR de 21,55 min; (b) Cromatograma de DHC usando Método B com TR de 18,86 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método C com TR de 19,20 min; (d) Cromatograma de DHC usando o Método D com TR de 16,59 min; (e) Cromatograma de DHC usando o Método E com TR de 13,20 min; (f) Cromatograma de DHC usando o Método F com TR de 10,90 min. .... 78
Figura 20 - (a) Cromatograma de DHC usando o Método G com TR de 22,66 min; (b) Cromatograma de DHC usando o Método H com TR de 20,16 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método I com TR de 14,41 min. ........................................................................................................... 79
Figura 21 - (a) Cromatograma de DHC usando o Método J (Metanol 80%) com TR de 8,35 min; (b) Cromatograma de DHC usando o Método L (Metanol 75%) com TR de 5,18 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método M (Metanol 70%) com TR de 8,04 min. ....................... 80
Figura 22 – Espectro de ultravioleta da DHC no UV. ............................................... 81 Figura 23 - Curva analítica da DHC, em 285 nm, usando método L, modo
isocrático, por CLAE. ................................................................................ 82 Figura 24 - Distribuição dos resíduos da curva de regressão................................... 82 Figura 25 - Cromatogramas da análise de especificidade da metodologia
analítica por CLAE para quantificação da DHC. ....................................... 83
Figura 26 - Cromatografia em camada delgada do padrão e frações contendo DHC de extratos de P. aduncum. (a) CCD das frações com maior concentração do composto e (b) DHC pura representada como mancha laranja. ....................................................................................... 87
Figura 27 - Fluxograma da extração da DHC por cromatografia líquida a partir de extratos das folhas de P. aduncum, usando como fase móvel Hexano:acetato de etila. .......................................................................... 88
Figura 28 - Análise do perfil térmico da DCH por DSC e TG em rampa de aquecimento de 1 ºC/min, em atmosfera de nitrogênio. .......................... 89
Figura 29 - Espectro de RMN 1H (acetona d6, 300 MHz) da DHC. .......................... 91 Figura 30 - Espectro de RMN 1H ampliado (acetona d6, 300 MHz) da DHC. ........... 91
Figura 31 - Espectro de RMN 13C (acetona d6, 75,5 MHz) da DHC......................... 92 Figura 32 - Cromatograma por CG/MS da DHC dissolvida em DMSO. ................... 93
Figura 33 - Análise por espectrometria de massas da DHC por CG/MS. ................ 93 Figura 34 - Fragmentações da DHC por CG/MS dissolvida em DMSO. .................. 94 Figura 35 - Espectro no infravermelho da DHC, em pastilha de KBr. ...................... 95 Figura 36 - Análise da pureza da DHC por DSC. ..................................................... 96
Figura 37 - Análise da pureza da DHC por CLAE. ................................................... 96 Figura 38 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) DBG, (c) DHC
dissolvida em DBG e (d) mistura física de DHC: DBG em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ........................................ 98
Figura 39 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MEG, (c) DHC dissolvida em MEG e (d) mistura física de DHC: MEG em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ........................................ 99
Figura 40 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) AE, (c) DHC dissolvida em AE e (d) mistura física de DHC: AE em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 100
Figura 41 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MCG, (c) DHC dissolvida em MCG e (d) mistura física de DHC: MCG em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 102
Figura 42 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MIP, (c) DHC dissolvida em MIP e (d) mistura física de DHC: MIP em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 103
Figura 43 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) TAC, (c) DHC dissolvida em TAC e (d) mistura física de DHC: TAC em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 104
Figura 44 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) P80, (c) DHC dissolvido em P80 e (d) mistura física de DHC: P80 em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 105
Figura 45 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) ORE, (c) DHC dissolvida em ORE e (d) mistura física de DHC:ORE em rampa de aquecimento de 10K/min em atmosfera de N2. ...................................... 105
Figura 46 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo MEG e ORE em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN em geladeira. ............................................................................................... 108
Figura 47 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo MEG e P80 em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos
CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta das CLN em geladeira ................................................................................................. 109
Figura 48 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG e ORE em temperatura ambiente e (c) distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN em geladeira. ........................................................................... 111
Figura 49 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG e P80 em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN mantidos em geladeira ........................................................................................... 113
Figura 50 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG, ORE e LESS em temperatura ambiente durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN .......................... 114
Figura 51 – (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG, ORE com variações no método em temperatura ambiente durante 14 dias, diluição da amostra 1:50 em água ultrapura............................................................. 116
Figura 52 – (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DGB, ORE com variações no método em temperatura ambiente durante 30 dias sem diluição ........... 117
Figura 53 - Carreador lipídico nanoestruturado branco (A) e carreador lipídico nanoestruturado contendo DHC (B). ...................................................... 118
Figura 54 - (a) Distribuição de tamanho de partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo DHC durante um período de 30 dias em geladeira. (b) Potencial zeta das partículas ...................................... 119
Figura 55 - Distribuição detamanho de partículas e potencial zeta do CLN-DHC .. 119
Figura 56 – Fotonanografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) dos (a) CLN brancos, (b) CLN-DHC e (c) CLN-DHC liofilizado .............. 121
Figura 57 - Espectro no IV do (a) Dibehenato de glicerila, (b) miristato de isopropila e (c) óleo de ricino etoxilado .................................................. 123
Figura 58 - Espectros no infravermelho do (a) CLN branco; (b) CLN-DHC e (c) CLN-DHC liofilizado. ............................................................................... 124
Figura 59 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado sem crioprotetores. ................................................ 126
Figura 60 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado com manitol como crioprotetor............................... 127
Figura 61 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado com sacarose como crioprotetor. ........................... 127
Figura 62 – Análise térmica por DSC e TG das CLN brancas em rampa de aquecimento de 10k/min em atmosfera de N2. ....................................... 128
Figura 63 – Análise térmica por DSC e TG de CLN-DHC em rampa de aquecimento de 10k/min em atmosfera de N2. ....................................... 129
Figura 64 - Perfil de dissolução de CLN-DHC e DHC em etanol 30% a 75 rpm em 32 ºC durante 48h. ........................................................................... 130
Figura 65 - Crescimento celular de linhagens celulares de fibroblasto L-929 em extrato etanólico das folhas de P. aduncum, em 2’, 6’-dimetóxi-4’-dihidrochalcona (DHC), em CLN brancas e em CLN contendo DHC. .... 132
Figura 66 - Crescimento celular de linhagens celulares de melanoma murino B16F10 em extrato etanólico das folhas de P. aduncum, em 2’,6’-dimetóxi-4’-dihidrochalcona (DHC), em CLN brancas e em CLN contendo DHC ....................................................................................... 133
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resultados da análise de estabilidade da solução de DHC por CLAE ... 81 Tabela 2 - Resultados da análise de precisão da metodologia analítica para
quantificação de DHC nos CLN por CLAE. ............................................ 84 Tabela 3 - Resultados da análise de exatidão e recuperação da DHC na
presença de carreadores lipídicos nanoestruturados por CLAE ............ 85
Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método para quantificação de DHC de acordo com modificações no pH da água acidificada; fluxo da fase móvel e temperatura de forno ........................ 86
Tabela 5 - Dados de RMN de 1H (300 MHz, Acetona D6) e RMN de 13C (75,5 MHz, Acetona D6) e dados da literatura para a 2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona. ........................................................................... 90
Tabela 6 – Resultados de solubilidade da DHC nos diferentes excipientes dos CLN. ....................................................................................................... 97
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Sistema TNM (tumor|linfonodos|metástase) para classificação do melanoma............................................................................................... 27
Quadro 2 - Linha terapêutica para melanoma grau III, IV e recorrentes. .................. 33 Quadro 3 – Lipídios e tensoativos comumente usados na produção de
nanopartículas lipídicas sólidas. ............................................................. 41
Quadro 4 – Métodos de preparo das nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN). ...................................... 45
Quadro 5 - Condições cromatográficas para análise da DHC em extrato de P. aduncum por CLAE. ............................................................................... 57
Quadro 6 - Preparo das amostras para ensaio de exatidão do método. .................. 61 Quadro 7 - Excipientes usados no ensaio de solubilidade da DHC. ......................... 66 Quadro 8 – Quantidades de excipientes – lipídio - adicionados no ensaio de
solubilidade da DHC (1 mg). .................................................................. 66
Quadro 9 – Quantidades de excipientes – óleos e tensoativos - adicionados no ensaio de solubilidade da DHC (1 mg). .................................................. 67
Quadro 10 – Composição das formulações usadas no desenvolvimento das NLS e CLN. .................................................................................................... 69
Quadro 11 – Condições de temperatura e velocidade de agitação usadas na otimização do método de preparação dos CLN1. ................................... 70
Quadro 12 – Condições experimentais usadas no ensaio de eficiência de encapsulação das CLN-DHC. ................................................................ 72
LISTA DE ABREVIATURAS
AE – Ácido esteárico
ATR – Técnica de refletância total atenuada
B16F10 – Células de melanoma murino
CG/MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectometria de massas
CLAE/HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
CL50 - Concentração letal média
CLN – Carreador lipídico nanoestruturado
CLN-DHC – 2’,6’- dihidróxi-4’-metóxidihidrochalcona incorporada ao carreador lipídico
nanoestruturado
DBG – Dibehenato de glicerila
DHC - 2,6-dihidroxi-4-metoxi-dihidrochalcona
DO – Difração óptica
DRS/DRIFTS – Espectroscopia com reflectância difusa
DSC – Calorimetria diferencial exploratória
ELD – Espalhamento de luz dinâmica
FDA – Food and Drugs Administration
FTIR/IV – Infravermelho com transformada de Fourier
L929 – Células de fibroblasto murino
LD – Limite de detecção
LESS – Lauril éter sulfosuccinato de sódio
LQ – Limite de quantificação
MCP – Monocaprilato de propilenoglicol
MEG – Monoestearato de glicerila
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MIP – Miristato de isopropila
MWCO – Molecular weight cut-off
NLS – Nanopartículas lipídicas sólidas
ORE – Óleo de rícino polietoxilado
P80 – Polissorbato 80
PDI – Indice de polidispersão
PPG – Propilenoglicol
PZ/ZP – Potencial zeta
RF – Fator de retenção
RMN – Ressonância magnética nuclear
TAC – Triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico
TNM – Classificação tumor, nódulos e metástase
TG – Análise termogravimétrica
TRAIL – Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand
usCLN – Carreadores lipídicos nanoestruturados ultra small
UV - Ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 21
2 OBJETIVOS ...................................................................................... 23
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 23
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 23
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................. 25
3.1 Melanoma ........................................................................................................... 25
3.2 Nanopartículas lipídicas sólidas ...................................................................... 36
3.3 Piper aduncum L. .............................................................................................. 49
3.4 Dihidrochalconas .............................................................................................. 52
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 55
4.1 Materiais ............................................................................................................. 55
4.2 Desenvolvimento e validação da metodologia analítica por CLAE .............. 56
4.3 Isolamento e Caracterização da DHC .............................................................. 63
4.4 Estudos de Pré-Formulação ............................................................................. 65
4.5 Desenvolvimento dos CLN ............................................................................... 68
4.6 Preparação e caracterização das CLN contendo DHC (CLN-DHC) ............... 70
4.7 Estudo de secagem dos CLN contendo DHC ................................................. 72
4.8 Análise de liberação in vitro dos CLN contendo DHC ................................... 73
4.9 Avaliação da atividade antitumoral dos CLN contendo DHC em modelos
farmacológicos de melanoma murino in vitro ...................................................... 74
4.10 Avaliação biológica dos resultados e análise estatística ............................ 75
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 77
5.1 Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE .............. 77
5.2 Isolamento da DHC ........................................................................................... 87
5.3 Caracterização da DHC .................................................................................... 89
5.4 Estudos de pré-formulação dos CLN .............................................................. 96
5.5 Desenvolvimento das CLN ............................................................................. 106
5.6 Desenvolvimento dos CLN-DHC.................................................................... 117
5.7 Avaliação da atividade antitumoral dos CLN contendo DHC em modelos
farmacológicos de melanoma murino in vitro ................................................... 130
7 CONCLUSÕES ............................................................................... 135
REFERÊNCIAS .................................................................................. 137
APÊNDICE A - MÉTODOS TESTADOS NO DESENVOLVIMENTO DA
METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DHMDHC POR CLAE.............. 145
APÊNDICE B – ANÁLISE DE TAMANHO DE PARTÍCULA, INDICE DE
POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA POR ESPALHAMENTO DE
LUZ DINÂMICA – DADOS ORIGINAIS .............................................. 149
21
1 INTRODUÇÃO
O número de produtos baseados em novos sistemas carreadores de
fármacos tem aumentado significativamente nos últimos anos. O desenvolvimento
de novos sistemas emulsionados para carrear ativos que consigam penetrar a
barreira da pele e garantir o aumento da eficácia dos produtos de aplicação por via
tópica é uma constante para a indústria farmacêutica. Sistemas nanoestruturados,
como lipossomas, nanoemulsões, nanopartículas lipídicas e nanopartículas
poliméricas, são utilizados como carreadores para a liberação de ativos na pele, com
o objetivo de modificar os perfis de liberação, permeação e oclusão da pele
(STRÖHER; ARMIJO; RAFFIN, 2010).
As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) são partículas coloidais na escala
nanométrica (50 a 1000 nm), produzidas a partir da emulsão das fases oleosa e
aquosa. Apresentam forma sólida em temperaturas até 40 ºC. Limitações
encontradas nas NLS relacionadas à expulsão do ativo após a cristalização e re-
organização da matriz lipídica, levaram ao desenvolvimento das matrizes lipídicas
contendo óleo, denominadas de carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN),
sendo consideradas NLS de segunda geração (PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER,
2009).
Os CLN apresentam vantagens como, o tamanho de partícula na escala
nanométrica após processo de encapsulação do fármaco, serem obtidos por
componentes biocompatíveis e biodegradáveis, sem necessidade de solventes
orgânicos durante a produção e um custo reduzido em comparação a outros
sistemas nanométricos. A versatilidade destes sistemas na liberação de fármacos
torna-os atraente para uso como carreadores de ativos citotóxicos antitumorais. O
polimorfismo e os rearranjos cristalinos são vistos como alvos de estudo para
alcançar maior estabilidade na liberação do fármaco (VAGHASIYA; KUMAR;
SAWANT, 2013, YADAV; KHATAK; SARA, 2013).
As plantas medicinais têm se mostrado uma fonte importante de novos ativos
no tratamento de tumores. Fitoderivados vem sendo empregados na terapia de
neoplasias com eficácia e tolerabilidade (MANTLE; LENNARD; PICKERING, 2000;
NEWMANN, CRAGG; 2012). O Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
(NIQFAR) do Curso de Farmácia e do Programa de Pós-graduação em Ciências
22
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) tem estudado diversas
plantas medicinais nativas e exóticas e verificado a atividade biológica frente a
diferentes modelos patológicos. Dentre as espécies estudadas com alto potencial
antitumoral encontra-se a Piper aduncum.
A P. aduncum é uma planta que pode ser considerada invasora, devido a
ocorrência espontânea, encontrada em Santa Catarina. Estudos anteriores
demonstraram o potencial da atividade antitumoral do extrato bruto das folhas e do
composto 2,6-dihidroxi-4-metoxi-dihidrochalcona (DHC), um marcador fitoquímico da
planta, em células tumorais de leucemia, cérvico-uterino e de melanoma (TOMIO,
2011).
Diante da significativa contribuição dos derivados de plantas medicinais no
descobrimento de novos fármacos para o tratamento de neoplasias, o potencial
antitumoral da DHC e as relevâncias dos sistemas nanométricos na potencialização
da permeação cutânea e aumento de eficácia, no presente estudo foram
desenvolvidos carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) contendo a substância
isolada DHC (CLN-DHC) e avaliada a influência do sistema nanométrico sobre a
atividade antitumoral em células de melanoma murino in vitro.
23
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) contendo o
fitocomposto 2,6-dihidroxi-4-metoxi-dihidrochalcona (DHC) e avaliar a influência
sobre a atividade antitumoral em células de melanoma murino in vitro.
2.2 Objetivos Específicos
Desenvolver e validar metodologia por CLAE para quantificação da DHC pura
e incorporada nos CLN;
Isolar, caracterizar e determinar o grau de pureza da DHC a partir do extrato
das folhas de Piper aducum;
Realizar estudo de pré-formulação e desenvolvimento de CLN sem DHC;
Obter e caracterizar CLN contendo o fitocomposto DHC;
Determinar o perfil de liberação da DHC incorporada nos CLN;
Avaliar a atividade citotóxica dos CLN contendo DHC em células de
melanoma murino (B16F10) in vitro.
24
25
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Melanoma
A pele é um órgão composto por várias células, estruturas com funções
específicas para cada. A função principal da pele é a proteção do corpo. A pele pode
ser dividida em: epiderme (camada exterior), derme (camada interior) e hipoderme.
A epiderme é composta por várias células, entre elas, os melanócitos. Os
melanócitos são células produtoras depigmentos de melanina na exposição à luz
ultravioleta. A melanina exerce proteção contra os raios nocivos de ultravioleta,
reduzindo danos que possam lesionar o DNA. A quantidade de pigmentação de
melanina varia de acordo como fatores hereditários em relação ao tipo, quantidade e
distribuição corporal; fatores fenotípicos como: exposição aos raios ultravioleta e
fatores endócrinos do indivíduo (BERTOLOTTO, 2013; POLAND, et al., 2013). O
cancer de pele é dividido em dois grupos: cancer de pele não melanocítico e cancer
de pele melanocítico.
O cancer de pele não melanocítico ou não melanoma, como o carcinoma
basocelular e o carcinoma epidermoide, é mais incidente em populações de pele
clara com estimativa de 65 novos casos para cada 100 mil homens e 71 novos
casos para cada 100 mil mulheres em 2014, de acordo com Instituto Nacional de
Câncer (INCA) (2014), representando 25% de todos os tumores malignos
registrados no Brasil. São de crescimento lento, possui crescimento somente no
local de desenvolvimento, apresenta baixa ocorrência de metástase em relação ao
cancer de pele melanocítico, assim, representando baixa letalidade
(VASCONCELOS; SANCHES, 2012).
O cancer de pele melanocítico ou melanoma cutâneo acomete as células
melanocíticas e tem predominância principalmente em adultos de pele clara de
origem caucasiana exposta a alta intensidade de radiação UV sem a devida
proteção da pele. Para este, um maior risco inclui história pessoal ou familiar,
enquanto os não melanomas estão relacionados com a exposição excessiva ao sol.
Ao contrário de outros tumores, o melanoma apresenta 55% dos pacientes com
idade inferior a 65 anos (BERTOLOTTO, 2013; DE VITA Jr.; HELLLMANN;
ROSENBERG, 2005; KEE; MCARTHUR, 2014; POLAND et al., 2013;
VASCONCELOS; SANCHES, 2012).
26
Os melanomas cutâneos são menos frequentes. Estimativas da Organização
Mundial da Saúde (OMS) apontam para 27 milhões de casos incidentes, 17 milhões
de mortes e 75 milhões de pessoas portadoras da patologia do melanoma no ano de
2030 (DE VITA Jr.; HELLLMANN; ROSENBERG, 2005; OMS, 2012). Espera-se
cerca de 7 novos casos para cada 100 mil homens e 6 novos casos para cada 100
mil mulheres e representando 4% das neoplasias malignas registradas e com maior
incidência na região sul do Brasil e sendo sua letalidade mais elevada
(VASCONCELOS; SANCHES, 2012; INCA, 2014). O melanoma cutâneo é a forma
de cancer de pele mais perigosa. Casos de incidência de melanoma são
estatisticamente, menos de 5% no mundo, mas melanomas são responsáveis por
cerca de 80% de mortes acometidas de todos os canceres de pele devido à sua
capacidade de extender a lesão, invadindo para camadas mais profundas da pele
como a derme até atingir os vasos sanguíneos, aumentando os riscos de disseminar
para outros órgãos e nódulos linfáticos (metástase) e diminuindo o prognóstico de
vida do paciente. O melanoma metastático, após a metástase para outros órgãos, é
difícil de ser removido cirurgicamente devido à invasão tecidual e a resistência a
tratamentos disponíveis (BERTOLOTTO, 2013).
3.1.1 Classificação do estágio do melanoma
O estágio do melanoma é determinado após uma análise histológica do sítio
investigado, inicialmente na pele. O melanoma é classificado pela espessura vertical
da lesão em milímetros, denominada Classificação de Breslow e pelo nível de
invasão da lesão.
A classificação de Breslow, foi criada por Alexander Breslow em 1970. É
definida como a altura vertical total do melanoma, desde a camada superior
(epiderme) até a camada mais profunda da pele. O prognóstico do paciente está
relacionada à diminuição da taxa de sobrevivência e maior for a invasão pela
classificação de Breslow. A unidade usada é milímetro.
O comitê americano de câncer, American Joint Committe on Cancer (AJCC,
2002) elaborou um sistema de classificação de melanoma denominado TNM, sigla
proveniente do inglês Tumor, Nodes, Metastasis que significa tumor, linfonodos e
metástase. O sistema TNM apresenta três classificações primárias de avaliação do
grau e intensidade de cada parâmetro (Quadro 1): a análise baseada na espessura
27
do tumor e seu grau de invasão na pele (epiderme, derme e tecido adiposo) (Figura
1), espalhamento do melanoma para linfonodos e grau de metástase.
Quadro 1 – Sistema TNM (tumor|linfonodos|metástase) para classificação do melanoma.
Classificação TNM
T = TUMOR. Baseado na espessura do tumor (Classificação de Breslow).
Tis = células de melanoma na superfície da epiderme
T1 = melanoma com espessura vertical < 1 mm
T2 = melanoma com espessura vertical de 1 a 2 mm
T3 = melanoma com espessura vertical de 2 a 4 mm
T4 = melanoma com espessura vertical > 4 mm
N = LINFONODOS. Células do sistema imune. Geralmente, são as primeiras
células em que o melanoma se espalha na metástase.
N0 = não há células de melanoma nos linfonodos
N1 = há células de melanoma em 1 linfonodo
N2 = há células de melanoma em 2 a 3 linfonodos
N3 = há células de melanoma em mais de 4 linfonodos
M = METÁSTASE. Espalhamento do melanoma na pele para outros órgãos.
M0 = não houve metástase
M1 = metástase
o M1a = metástase de células de melanoma para outras partes do
corpo ou linfonodos
o M1b = metástase de células de melanoma para pulmão
o M1c = metástase de células de melanoma para outros órgãos e/ou
aumento de lactato desidrogenase no fígado
Fonte: AJCC, 2002.
28
Figura 1 – Classificação de Breslow da espessura do tumor (em milímetros) pelo sistema TNM.
Fonte: Cancer Research UK (2014).
Após a avaliação pelo sistema TNM, o melanoma é classificado em estágios
0, I, II, III e IV, conforme descrito abaixo.
Estágio 0 - melanoma in situ. Localiza-se somente na epiderme, sem invasão
para a derme.
Estágio I = Pode apresentar até 2,0 mm de espessura vertical. Pode
apresentar ulcerações.
Estágio II = Pode apresentar até 4,0 mm de espessura vertical. Pode
apresentar ulcerações. Não apresenta metástase para linfonodos e outros
órgãos.
Estágio III = Pode apresentar espessura vertical variada. Pode apresentar
ulcerações. Metástase para linfonodos próximos da região com melanoma
pele.
Estágio IV = Melanoma apresenta metástase para linfonodos próximos e
distantes, tecido subcutâneo e órgãos como pulmão, fígado, cérebro.
Na sétima edição da classificação TNM do melanoma, de acordo com o
American Joint Committe on Cancer (BALCH et al., 2009), foram inseridos novos
critérios como a taxa mitótica por mm2 para classificação T1 e detecção
imunoquímica de metástases ganglionares. Na Figura 2 são ilustrados os diferentes
estágios e classificação do melanoma segundo o AJCC (NCI, 2014).
Uma das características dos cânceres é a capacidade de proliferar através
dos nódulos do sistema linfático e assim se espalhar para outros órgãos,
constituindo cânceres secundários (metástase) (BERTOLOTTO, 2013; CAI et al.,
2011). A gravidade do melanoma está no estágio final da doença, quando se
29
manifesta em outros órgãos e desse momento fica a dificuldade em tratar o tumor,
resultando em alta mortalidade do melanoma metastático (POLAND et al., 2013).
Figura 2 – Classificação do melanoma de acordo com o estágio.
Fonte: NCI, 2014
30
Certas mutações gênicas conferem aumento de risco de desenvolvimento de
melanomas, como mutações dos reguladores celulares cíclicos como a ciclina
quinase-dependente N2A (CDKN2A) e a ciclina quinase-dependente 4 (CDK4).
Recentemente, estudos relacionados à mutação do fator de transcrição associada a
microftalmia (MITF), gene envolvido na produção de melanócitos, mostrou aumento
de risco significativo no aparecimento de melanomas (BERTOLOTTO, 2013).
As células de melanoma tem a capacidade de reduzir o acúmulo de fármaco
intracelular ao aumentar os níveis das bombas de efluxo, como os transportadores
ABC. Os transportadores ABC são uma das maiores famílias de proteínas,
possuindo uma porção na parte interna da célula e outra na parte externa (proteína
transmembrana). Os transportadores ABC em células saudáveis possuem função de
transporte de nutrientes, como sais biliares, colesterol e ions. Em células
cancerígenas, os transportadores ABC estão envolvidos na resistência a tratamentos
quimioterápicos pela expulsão das moléculas de fármacos quimioterápicos do meio
intracelular, transportando-as para fora da célula. Devido à expulsão constante de
fármacos pelos transportadores, ocorre uma diminuição da concentração no meio
intracelular e não permitindo que o fármaco atinja concentração mínima para ser
citotóxico para as células cancerígenas. Esse fenômeno aumenta a chance de
desenvolvimento de resistência ao tratamento quimioterápico.
A expressão do transportador ABC5 está elevada em melanomas malignos,
sugerindo a resistência do melanoma maligno a tratamentos terapêuticos como da
doxorrubicina. As células de iniciação de melanomas são capazes de inibir ou não
expressar o antígeno de melanoma reconhecido por células T-1 (MART-1) ou ainda,
inibir a atividade do complexo de histocompatibilidade tipo 1 (MHC-1) em liberar
peptídeos antigênicos para os linfócitos. Em outras palavras, as células de iniciação
de melanomas conseguem ficar “invisíveis” para os anticorpos (BERTOLOTTO,
2013).
Nas últimas décadas, as neoplasias têm se convertido em um evidente
problema de saúde pública. Estas são classificadas como doenças crônicas
degenerativas e caracterizadas como alteração no controle da proliferação,
diferenciação e morte celular, com multiplicação desordenada das células (WHO,
2008).
31
3.1.2 Fatores de risco
Os fatores de risco envolvidos no desenvolvimento de melanomas podem ser
divididos em: fatores de risco constitucionais ou hereditários e fatores de risco
ambientais ou adquiridos (MILLER; MIHM, 2006).
A constituição de cada indivíduo varia de acordo com seu genoma e de suas
características hereditárias. Os indivíduos de descendência caucasiana apresentam
menores ou nenhuma quantidade de eumelanina, portanto, possuem proteção
inferior aos raios ultravioletas do sol em relação à indivíduos que naturalmente
possuem pele mais escura (BERTOLOTTO, 2013).
Hábitos individuais podem influenciar no tempo de exposição do individuo aos
raios UV. O excesso de exposição ao sol durante a infância e a adolescência aliada
às quantidades de queimaduras ao sol por ano iniciam a transformação de
melanócitos benignos a melanócitos de fenótipo maligno. Os riscos de desenvolver o
melanoma podem dobrar se o individuo tiver mais que cinco queimaduras solares
por ano (BERTOLOTTO, 2013).
Os raios ultravioletas (UV) são divididos e classificados em: raio ultravioleta A
(UVA), raio ultravioleta B (UVB) e raio ultravioleta C (UVC) (KANAVY;
GERSTENBLITH, 2011). A principal diferença entre eles está no comprimento de
onda de absorção. Os raios UVC, UVB e UVA são absorvidos no comprimento de
onda de 100 a 280 nm, 280 a 320 nm e 320 a 400 nm, respectivamente.
Entre os três raios, o UVC é considerado o mais perigoso e letal capaz de
ultrapassar as barreiras da pele e lesionar o DNA. No entanto, esse raio é filtrado
pela camada de ozônio e não atinge a camada terrestre. Então, dos raios que
atingem a camada terrestre, estão os raios UVA (atinge 95%) e os raios UVB (atinge
5%). Ambos os raios são lesivos embora o raio UVB seja considerado mais
cancerígeno devido sua capacidade de formar fotoprodutos como: dímeros de
ciclobutano pirimidina (CPD) e 6-pirimidina 4-pirimidona, enquanto a UVA induz
estresse oxidativo. As lesões provocadas pela exposição aos raios ultravioletas
induzem alterações gênicas na fita do DNA, ao causar uma mutação da transição de
citosina (C) para timina (T) (BERTOLOTTO, 2013; KANAVY; GERSTENBLITH,
2011).
32
3.1.3 Linha terapêutica
As estratégias terapêuticas para o tratamento de melanoma se iniciaram no
final da década de 50. No entanto, os avanços nos estudos só aconteceram
recentemente nas últimas décadas (Figura 3) (ASCO, 2014).
Na década de 70, foram iniciados os estudos relacionando a exposição ao sol
com pacientes que desenvolveram melanoma. Na década de 80, as cirúrgias para
remoção de pele para melanomas nos estágios iniciais foram aceitas como forma de
tratamento. Na década de 90, foram aprovadas as imunoterapias com interferon alfa
2b e interleucinas-2 para tratamento de melanomas. No ínicio do século, grupos de
pesquisas iniciaram o mapeamento genético de melanoma para identificar o
mecanismo e causas/alterações genéticas para o aparecimento do tumor (ASCO,
2014).
Nos últimos anos, houve uma grande melhora na sobrevida dos pacientes
com melanoma, principalmente devido à detecção precoce do tumor. Para a
estimativa de aproximadamente 6000 novos casos em 2012 foram registradas, 1507
mortes em 2010 (842 homens e 665 mulheres) (INCA, 2014). Quanto ao tratamento
dos melanomas, a cirurgia é o tratamento mais indicado, podendo incluir a
radioterapia e a quimioterapia.
O Quadro 02 mostra a linha terapêutica disponível, de acordo com a NCI e
outros autores para tratamento de melomas em estágio avançado de grau III, IV e
recorrentes. Para o grau I e II, a remoção cirúgica é indicada (AJCC, 2002;
GOLDMANN; AUSIELLO, 2005; AMERICAN CANCER SOCIETY, 2015).
Na quimioterapia existem obstáculos comumente presenciados, como: a
limitada seletividade, alta toxicidade, e a resistência ao fármaco, que podem ser
contornados utilizando as NLS. Estes sistemas são relatados como grande
promessa para a quimioterapia do sistema linfático em metástase (FORREST et al.,
2011).
O tratamento do melanoma se torna difícil após a metástase, devido que a
excisão cirúrgica do tecido epitelial não ser suficiente para a remoção, sendo
necessária a entrada de quimioterapia e radioterapia. Dentre os fármacos usados na
quimioterapia dos melanomas estão os medicamentos de origem sintética e os de
origem natural. Dentre os fármacos antineoplásicos empregados na prática clínica
ou em fase de desenvolvimento, 60 a 70% são obtidos direta ou indiretamente de
33
produtos naturais (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2015; MANTLE; LENNARD;
PICKERING, 2000; NEWMAN; CRAGG, 2012).
Um dos medicamentos quimioterápicos mais usados é a dacarbazina,
fármaco derivado de triazeno. É usada como tratamento clássico para melanoma em
metástase por mais de 30 anos. A atividade antitumoral do fármaco está relacionada
com a alquilação e reações cross-link com DNA durante as fases do ciclo celular,
causando apoptose celular. No entanto, cerca de 5 a 15% dos pacientes atingem a
resposta terapêutica (KEE; MCARTHUR, 2014; NCI, 2014).
Quadro 2 - Linha terapêutica para melanoma grau III, IV e recorrentes.
Linha terapêutica Referência
1) Imunoterapia
a) Inibidores
Anti-CTLA-4 → Ipilimumab
Anti-PD1 e PD-L1
b) Interleucina-2 (IL-2)
c) Duo imunomodulação
Anti-CTLA-4 + Anti-PD1
BERTOLOTTO, 2013; NCI, 2014
2) Inibidores de sinais transducionais
a) BRAF
Vemurafenib, Dabrafenib
b) Inibidores MEK
Trametinib
c) Terapia combinacional com inibidores de
sinais de transdução
Dabrafenib + Trametinib
Sorafenib
d) Inibidores KIT
CARVAJAL et al., 2011; KEE;
MCARTHUR, 2014;
MAVROPOULOS; WANG, 2014;
NCI, 2014
3) Quimioterapia
Dacarbazina
Nitrossureias
Carmustina
Iomustina
Semustina
Cisplatina
3.1) Fitoderivados
Vincristina, Vimblastina, Vindesina
Placlitaxel, Docetaxel
GOLDMANN; AUSIELLO, 2005;
MANTLE; LENNARD; PICKERING,
2000; NCI, 2014
4) Terapia paliativa local NCI, 2014
34
Figura 3 – Linha do tempo para o conhecimento, diagnóstico e tratamento do melanoma.
Fonte: American Society of Clinical Oncology, 2014.
1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010
1957 Identificação do
interferon
1961 Introduzida a
técnica de perfusão de órgãos isolados
1970 Estudos relacionam
exposição ao sol com risco de desenvolver melanoma
1978 Síndrome genética
associada com melanoma aos 50 anos
1980-1990 Cirurgias retirando
cerca de 2 cm de pele são viáveis
1987 Primeiro uso de
imunoterapia personalizada
1992 Introduzida biópsia de linfonodos sentinelas
1996 Interferon alfa 2b disponível para
melanomas recorrentes
1998 Segundo fármaco para imunoterapia aprovado
(Interleucina-2)
2001 Atualização da classificação do
melanoma para auxiliar nos prognósticos e tratamentos
2002 Melanoma pode ter
mutações em genes diferentes
2009 Inicio do mapeamento genético pela Cancer Genome Atlas Project
2010 Ipilimumab aumenta
expectativa de vida de melanoma avançado
2011 Vemurafenib aprovado.
Reduz tumor com mutações BRAF
35
A imunoterapia é uma das linhas alternativas visadas para o tratamento de
melanomas, os fármacos dessa linha utilizam o sistema imune para combater o
turmor (ASCO, 2014). Em 1998, o Food and Drugs Administration (FDA), órgão
americano de fiscalização nos Estados Unidos, aprovou o uso de interleucina-2 (IL-
2) para o tratamento de melanomas em estágio avançado para o Estados Unidos. O
interferon alfa (IFNα) foi utilizado após cirurgias de remoção do tumor isoladamente
e em combinações com outros agentes terapêuticos. No entanto, os resultados de
ensaios clínicos não obtiveram a resposta clínica desejada. Mas apesar disso, a
imunoterapia continua sendo um dos campos a serem explorados (BERTOLOTTO,
2013).
Uma nova classe de imunoterapia é ipilimumab, aprovado pelo FDA em 2011,
para tratamento de melanoma irressecável ou metastático e em casos em que a
remoção cirúrgica não for possível. Ipilimumab é um anticorpo monoclonal humano
IgG1, atuando no bloqueio do antígeno linfócito-T citotóxico (CTLA-4) e auxilia o
sistema imune a reconhecer, alvejar e atacar células tumorais como bloquear a
atividade de ativação, proliferação e funções efetoras (FDA, 2014; MAVROPOULOS;
WANG, 2014; NCI, 2014). Há comercialmente, o medicamento Allovectin-7®
contendo plasmídeos HLA-B7 e microglobulinas β2 no carreador lipossomal para
tratamento específico de melanoma (IRACHE et al., 2011).
Outro alvo de estudos está na terapia-alvo em genes, como: a mutação em
BRAF, um gene da classe dos oncogenes (responsável pela produção da proteína
B-raf), envolvido na regulação do crescimento e divisão celular (proliferação), a
diferenciação celular, a migração celular e a apoptose. A mutação no gene BRAF
aumenta o potencial de transformar células normais em células cancerígenas (GHR,
2014); a sinalização e ativação da proteína RAS que irá fosforilar proteínas quinase
e ativar processos de divisão celular, principalmente na mitose, meiose e
diferenciação celular (KEE; MCARTHUR, 2014). E a ativação do receptor tirosina
quinase transmembrana tipo III (KIT), KIT é responsável pela ativação de
sinalizações celulares, mediando crescimento celular, proliferação, invasão,
metástase e inibição da apoptose (CARVAJAL et al., 2011).
As plantas medicinais tem se mostrado uma fonte importante de novos ativos
no tratamento destas patologias. Cerca de 60% dos tratamentos antitumorais
provem de fontes naturais (NEWMAN; CRAGG, 2012). Fitoderivados de espécies
como Taxus baccata (fármacos paclitaxel e docetaxel), Podophyllum peltatum
36
(fármaco etoposídeo), Camptotheca acuminata (fármaco camptotecina) e Vinca
rosea (fármacos vimblastina e vinorelbina) empregados na terapia de neoplasias
como leucemias, linfomas, câncer da mama, pulmão, testículos, melanomas e entre
outros com eficácia e tolerabilidade (MANTLE; LENNARD; PICKERING, 2000;
NEWMAN; CRAGG, 2012). Estudos realizados na Universidade do Vale do Itajaí
(UNIVALI), no Núcleo de Investigação Químico-Farmacêutica (NIQFAR) e pelo
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF) pesquisaram
diversas plantas nativas e exóticas de Santa Catarina, seus constituintes e
atividades biológicas.
3.2 Nanopartículas lipídicas sólidas
As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) ou solid lipid nanoparticle são
partículas na escala nanométrica que foram descritas pela primeira vez no ínicio da
década de 1990 e possuem diâmetro entre 50 a 1000 nm (Figura 04). As NLS são a
primeira geração de nanopartículas lipídicas sólidas. As NLS foram desenvolvidas
após os sistemas lipossomais devido à baixa estabilidade desses sistemas. As
nanopartículas são sistemas lipídicos particulados, apresenta estabilidade durante
meses e são promissores candidatos à carreadores de fármacos, sendo muito
estudado nos últimos anos. São compostas de lipídios sólidos, tensoativos e veículo.
São compostas de 0,1% a 30% de lipídios sólidos e estabilizados com 0,1 a 0,5% de
tensoativos. O lipídio sólido é usado para compor a matriz lipídica e estabilizado por
tensoativos, causando a formação de um sistema particulado, estruturado,
organizado e “perfeito”. Os lipídios sólidos das NLS apresentam mesmo formato e
rearranjo formando um encaixe em cada unidade de lipídio, como ilustrado em
branco na Figura 4. Ao longo do tempo, os lipídios sólidos podem passar pelo
processo de polimorfismo com rearranjo do núcleo lipídico do estado amorfo para
um estado cristalino. O rearranjo para forma cristalina causa a expulsão de ativos
(ilustrado em pretoo na Figura 4) do núcleo lipídico e consequente baixo teor de
encapsulação. O tensoativo é usado na formulação para auxiliar na formação da
partícula formada e principalmente, na estabilização da partícula pela estabilização
estérica (pelo afastamento entre partículas devido às longas cadeias hidrofóbicas)
ou estabilização eletrônica (repulsão devido às cargas de superfície) (CAI et al.,
37
2011; FENG; MUMPER, 2013; PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER, 2009; SHARMA
et al., 2011; VAGHASIYA; KUMAR; SAWANT, 2013).
A segunda geração de nanopartículas sólidas é chamada de carreadores
lipídicos nanoestruturados (CLN) ou nanostructured lipid carrier (Figura 04) e são
compostas por lipídios sólidos, tensoativos e veículos, com acréscimo de lipídios
líquidos (óleos) e não-compatíveis com os lipídios sólidos da formulação, para o
desenvolvimento de um sistema estruturado desorganizado e “imperfeito”. Essa
geração foi desenvolvida para corrigir as desvantagens da expulsão do ativo dentro
do núcleo lipídico das NLS (1ª geração de nanopartículas lipídicas sólidas) após a
cristalização e re-organização do sistema. A imperfeição gerada pela adição de
óleos não-compatíveis com lipídios sólidos na formulação permite a introdução de
ativos com alta taxa de eficiência de encapsulação devido à falta de organização
espacial lipídica e estado amorfo dos lipídios dentro das nanopartículas que permite
que maior quantidade de moléculas de fármaco se acomode dentro da partícula
(PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER, 2009). Para a incorporação de ativos dentro da
matriz lipídicas, certos fatores são essenciais para a determinação da capacidade de
incorporar o fármaco, como: a solubilidade do fármaco no lipídio; a miscibilidade do
fármaco com o lipídio; a estrutura química e física da matriz lipídica e o estado
polimórfico do material (estado amorfo ou cristalino) (MULLER; MADER; GOHLA,
2000).
Figura 4 – Ilustração das nanopartículas lipídicas sólidas. NLS: nanopartículas de primeira geração. CLN: nanopartículas de segunda geração.
Fonte: Adaptado de PARDEIKE; HOMMOSS; MULLER, 2009.
Keck e colaboradores (2014) descreveram as possíveis formas de
estruturação dos CLN. Conforme apresentado na Figura 5, as matrizes lipídicas
sólidas contendo óleo podem ser formadas por uma matriz em que o óleo está
NLS CLN
38
disperso aleatoriamente no lipídio sólido (Figura 5.1); ou que o óleo esteja formando
um núcleo líquido revestido por uma camada de lipídio sólido (Figura 5.2). Ambas
estruturas de CLN resultam em sistemas com tamanho superior a 100 nm.
Uma nova subdivisão para as nanopartículas de segunda geração (CLN) são
os carreadores lipídicos nanoestruturados ultra-small (usCLN). Os usCLN foram
assim denominados por apresentar tamanho de partícula inferior a 100 nm - as
nanopartículas de 1ª e 2ª geração apresentam tamanho de partícula superior a 100
nm -, possuírem uma proporção maior de óleo e, possivelmente, uma estrutura
composta por um núcleo oleoso incorporado no lipídio sólido e uma camada externa
fluída de óleo, resultando em uma estrutura mais flexível, que os autores
denominaram de flip-flop core-shell (KECK et al., 2014)
Figura 5 – Esquema teórico de possíveis estruturas dos CLN sem ativo. 1 – matriz mista sólido-líquido; 2 – núcleo oleoso revestido por lipídio sólido; 3 - núcleo oleoso revestido por lipídio sólido seguido de uma camada de lipídio líquido na superfície.
(1) (2) (3)
Fonte: Adaptado de Keck et al. (2014).
3.2.1 Características físico-químicas das nanopartículas lipídicas sólidas
As NLS apresentam características de fácil preparação, baixo custo de
produção, aumento da estabilidade de ativos, biocompatibilidade,
biodegradabilidade, baixa imunogenicidade, versatilidade, controle de liberação de
fármacos lipofílicos. As NLS permanecem em estado sólido a temperatura ambiente,
sem biotoxicidade, possibilidade de produção em larga escala e esterilização e
produção sem solventes orgânicos (CAI et al., 2011; FENG; MUMPER, 2013; GAO
et al., 2013; MEHNERT; MÄDER, 2012).
Lipídio sólido
Óleo
39
A capacidade de incorporação de fármacos no sistema de NLS é
representada pela porcentagem do mesmo na fase lipídica. Os fatores
determinantes para a incorporação do fármaco são: (a) solubilidade do ativo na fase
oleosa; (b) miscibilidade; (c) estrutura física e química da matriz lipídica e (d) estado
polimórfico do material lipídico (MULLER; MADER; GOHLA, 2000).
O ativo deve apresentar alta solubilidade na matriz lipídica (lipofilicidade), pois
alguns métodos de preparo de nanopartículas lipídicas utilizam temperaturas
elevadas para fundir o lipídio sólido e aumentar a solubilidade do ativo. E após
finalizar a formulação, quando houver o resfriamento do sistema e solidificação das
partículas lipídicas, a solubilidade do ativo pode diminuir com a redução de
temperatura e/ou no sistema sólido-lipídico pronto e diminuir a eficiência de
encapsulação do ativo dentro da nanopartícula (MULLER; MADER; GOHLA, 2000).
A hidrofilicidade e baixa solubilidade de ativos pelo sistema nanopartículado lipídico
não seria atrativo para tratamentos tópicos devido à dificuldade de penetrar a pele
(BOSE et al., 2013).
Algumas moléculas do ativo podem ficar na superfície das NLS que resultam
em um perfil de liberação bifásico, dividido em uma liberação imediata (burst
release) do ativo na camada superficial das CLN e de uma liberação prolongada do
ativo de dentro da matriz lipídica (BOSE et al., 2013).
A estrutura da matriz lipídica é essencial para determinação da localização do
ativo, se este será incorporado ou expelido do sistema. Os ativos lipofílicos terão
maior afinidade pelo núcleo lipídico ficando incorporados internamente.
Inversamente, ativos hidrofílicos podem ficar mais retidos na camada superficial
externa das nanopartículas lipídicas sólidas (MULLER; MADER; GOHLA, 2000).
Os parâmetros físicos de caracterização dos SLN e CLN sugeridos para
serem analisados são: tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta
e grau de cristalinidade (YADAV; KHATAK; SARA, 2013).
3.2.2 Composição das nanopartículas lipídicas sólidas
O sistema nanoparticulado apresenta os seguintes componentes: (a) lipídio
sólido ou mistura de sólido e líquido para ser carreador, (b) água para fase de
dispersão das CLN e (c) tensoativos primários e em alguns casos tensoativos
secundários. Como formadores de matriz lipídica carreadora são empregados os
40
ácidos graxos, esteroides, ceras, acilgliceróis, esteroides e misturas de triglicérides.
Os tensoativos auxiliam na estabilização do lipídio dentro do sistema ao reduzir a
tensão superficial e facilitar a partição das partículas. Os tensoativos empregados
relatados são: os lipídios de membrana biológica como lecitina, sais biliares como
taurocolato de sódio, tensoativos não-iônicos como os copolímeros de óxido de
etileno/óxido de propileno, ésteres de sorbitol, ácidos graxos etoxilados e as
misturas de tensoativos (CAI et al., 2011; MEHNERT; MÄDER, 2012; MULLER;
MADER; GOHLA, 2000; SHARMA et al., 2011). Os tensoativos são formados por
partes hidrofílicas/polar e por parte lipofílica/apolar. A parte polar é denominada
“cabeça”, e possui características hidrofílicas e/ou iônicas enquanto a parte apolar é
denominada “cauda”, devido a longa cadeia de hidrocarbonetos (8 a 22 átomos de
carbono) com afinidade pela lipofilicidade. Os tensoativos podem ser divididos em:
tensoativos catiônicos, aniônicos, não-iônicos e anfóteros (MYERS, 2006).
Os tensoativos não-iônicos não possuem cargas iônicas. Sua solubilidade em
água está relacionada com a interação entre os grupos polares do tensoativo e o
composto. Os exemplos desse grupo são os polioxietilenos e os polióis. São mais
empregados em formulações, devido suas características de estabilidade,
compatibilidade, menor toxicidade em comparação aos tensoativos aniônicos,
anfóteros e catiônicos. Além de possuir menor irritação cutânea e manter o pH perto
do fisiológico (MYERS, 2006; KUMAR; RAJESHWARRAO, 2011).
Um resumo das matérias-primas usadas nas formulações dos CLN está
descrito no Quadro 03.
Os excipientes usados na preparação de CLN devem possuir status de
geralmente reconhecidos como seguros (GRAS, do inglês generally regarded as
safe pela organização regulatória americana FDA), pois haverá menor risco de
toxicidade aguda e crônica (VAGHASIYA; KUMAR; SAWANT, 2013; FDA, 2014).
Os lipídios sólidos são componentes primários que constituirão a matriz
lipídica. Seu uso é essencial na formulação para a formação de nanopartículas
lipídicas.
O behenato de glicerila ou 1,2,3-Propanetriol docosanoato, comercialmente
denominado Compritol® ATO 888 (Figura 6), como insumo farmacêutico é uma
mistura de dibehenoglicerol com mono e triacilglicerol. É um ácido graxo com 22
hidrocarbonetos na cadeia e é usado como agente de viscosidade em formulações
cosméticas (ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006). Na revisão de Rostami e
41
colaboradores (2014), a combinação deste lipídio com doxorrubicina aumentou a
atividade antitumoral em células tumorais na quimioterapia. Portanto, é um lipídio
relevante para ser estudado no desenvolvimento de CLN.
Figura 6 – Estrutura química do behenato de glicerila.
Fonte: ChemBlink (2015).
Quadro 3– Lipídios e tensoativos comumente usados na produção de nanopartículas lipídicas sólidas.
Lipídios Tensoativos/Excipientes
Triacilglicerol/Óleos - Ácido oleico - Miristato de isopropila (*) - Pentadecano - Propilenoglicol monocaprilato/ Capryol
® 90 (*)
- Tricaprino - Triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico/Polymol
® (*)
- Trilaurino - Trimistino - Trioleino - Tripalmitino - Tristerarino Acilglicerol - Behenato de glicerila/Compritol
® ATO 888 (*)
- Monoestearato de glicerila (*) - Palmitoestearato de glicerila Ácidos graxos - Ácido behenico - Ácido decanóico - Ácido esteárico (*) - Ácido palmítico Ceras - Palmitato de cetila
Fosfolipídeos - Lecitina de soja - Lecitina de ovo - Fosfatidilcolina Copolímeros de óxido de etileno/óxido de propileno - Poloxamer 182 - Poloxamer 188 - Poloxamer 407 - Poloxamer 908 Óleo de ricino polietoxilado/Alkest® CSO 400H - Polissorbato 20/Tween
® 20
- Polissorbato 60/Tween® 60
- Polissorbato 80/Tween® 80 (*)
Polímeros álcool polieter alquilaril - Tyloxapol Sais biliares - Colato de sódio - Glicocolato de sódio - Taurocolato de sódio - Taurodeoxicolato de sódio Outros - Propilenoglicol
Complexos cíclicos Álcool
- Ciclodextrina - Para-acil-calix-arenos
- Etanol - Butanol
Fonte: Sharma et al., 2011; Yang et al., 2014. (*) Excipientes usados no desenvolvimento de CLN nesse trabalho.
42
O ácido esteárico ou ácido octadecanoico (Figura 7), segundo a Farmacopeia
Brasileira (BRASIL, 2010) e o Handbook de excipientes (ROWE; SHESKEY; OWEN,
2006), trata-se de uma mistura de ácido esteárico (cadeia de 18 carbonos) e ácido
palmítico (cadeia de 16 carbonos), devendo conter não menos que 40% de ácido
esteárico. O ácido esteárico é usado em formulações como emulsionante e também
pode ser usado como carreador de sistemas de liberação sustentada de fármacos
(ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006).
Figura 7 - Estrutura química do ácido esteárico.
Fonte: Rowe; Sheskey; Owen (2006).
O monoestearato de glicerila (Figura 8), que consiste em uma mistura de
monoglicerídeos e diglicerídeos após uma reação de glicerina com triglicérides
animal ou vegetal, é usado em formulações cosméticas como emulsionante e
estabilizante (ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006). O ácido esteárico e seu derivado
monoestearato de glicerila, já foram citados em bibliografias como componentes da
matriz lipídica e formadores de nanopartículas (LUO et al., 2006; GARDOUH et al.,
2013; KOTIKALAPUDI et al., 2012; SOOD et al., 2013).
Figura 8 - Estrutura química do monoestearato de glicerila.
Fonte: Rowe; Sheskey; Owen (2006).
Os óleos são estruturas lipídicas no estado líquido em temperatura ambiente.
São essenciais na preparação dos CLN devido à capacidade de formação de uma
matriz lipídica imperfeita e capaz de incorporar uma maior concentração de ativo e
43
consequente eficiência de encapsulação. Os óleos comumente usados são
monocaprilato de propilenoglicol, miristato de isopropila e triglicerídeos de ácido
cáprico-caprílico (SHARMA et al., 2011; YANG et al., 2014).
O miristato de isopropila ou 1-metiletil tetradecanoato (Figura 9) é um óleo de
ésteres de 2-propanol e de ácido mirístico. É usado em formulações cosméticas
como emoliente não-gorduroso para ser aplicado na pele. Pode ser aplicado como
um potenciador de penetração transdérmico e usado em conjunto com ultrassom e
iontoforese (ROWE; SHESKEY; OWEN, 2006).
Figura 9 - Estrutura química do miristato de isopropila
Fonte: Rowe; Sheskey; Owen (2006).
Os triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico (Figura 10) são ácidos graxos de
cadeia média (C10: ácido cáprico; C8: ácido caprílico) e usados como emulsionantes
em formulações cosméticas (BACH; BABAYAN, 1982).
Figura 10 - Estrutura química de triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico.
R1, R
2 e R
3
n = 6-8
Fonte: Rowe; Sheskey; Owen (2006).
44
O monocaprilato de propilenoglicol, comercialmente chamado de Capryol® 90,
(Figura 11) é um óleo insolúvel em água para sistemas auto-emulsionantes, também
é usado em formulações tópicas como tensoativo água/óleo e solubilizante
(GATTEFOSSE, 2014).
Figura 11 - Estrutura química do monocaprilato de propilenoglicol.
Fonte: Chemicalland (2015).
3.2.3 Tecnologia de obtenção das nanopartículas lipídicas
As NLS e os CLN podem ser obtidos por diferentes técnicas de produção
como homogeneização em alta pressão, ultrasonicação, evaporação de solvente,
fluido supercrítico, microemulsão, dupla emulsificação, emulsificação-difusão,
precipitação, dispersão de filme, injeção de solvente e membrana contratora. No
Quadro 4 está descrita resumidamente cada uma destas técnicas.
45
Quadro 4 – Métodos de preparo das nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN). Continua
Técnica de preparo Características
Homogeneização em alta pressão
(HPH)
Quente
Frio
É uma técnica pressurizada, em torno de 100 a 2000 bar através de uma abertura estreita.
É necessário passo preparatório de incorporação de ativo antes de usar HPH.
Ultrassonicação
Sondas
Banho-maria
Técnica que precisa de auxílio de sondas de sonicação para imersão na solução.
É realizada para reduzir tamanho de partículas ao tamanho desejado.
Necessidade de padronizar tempo e freqüência da sonda.
Pode liberar resíduos da própria sonda.
Evaporação de solvente
Materiais lipofílicos são dissolvidos em solventes orgânicos e depois emulsificados em fase
aquosa.
O solvente será evaporado no final do processo de produção das nanopartículas.
Fluido supercrítico
Usa menos solvente no processo de preparo.
As nanopartículas são preparadas usando rápidas expansões de soluções de dióxido de
carbono supercríticas.
Microemulsão
É baseado na técnica de diluição de microemulsão. Obtidas por componentes lipídicos,
tensoativos, co-tensoativos e água. Após a emulsificação, a microemulsão é dispersa em água
fria (2-3 ºC) sob agitação.
Dupla emulsificação
Dupla microemulsões (A/O/A) são preparadas em dois passos.
Primeiro passo é a adição de solução aquosa contendo ativo na mistura de lipídios e
tensoativos em uma temperatura acima do ponto de fusão do lipídio.
Na segunda etapa, a microemulsão preparada anteriormente é adicionada em meio aquoso.
Emulsificação-difusão de solventes
Método envolve preparação de uma emulsão O/A. A fase interna é composta por solvente
orgânico hidromiscível.
A adição de água provoca a difusão do solvente orgânico na fase externa.
Solvente pode ser eliminado por evaporação ou por ultrafiltração.
46
Quadro 4 – Métodos de preparo das nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN). Conclusão
Técnica de preparo Descrição
Precipitação
Necessidade de uso de solventes.
São usados lipídios de glicerídeos e dissolvidos em solventes orgânicos, como o clorofórmio.
Em seguida, a solução vai ser emulsificada em fase aquosa.
O próximo passo é a evaporação do solvente orgânico que precipitará o lipídio e ocasionará a
formação de nanopartículas.
Dispersão de filme-ultrassom
Tanto o lipídio quanto o fármaco são colocados em soluções orgânicos e passarão pelos
processos de decompressão, rotação e evaporação dos solventes orgânicos para formação de
um filme lipídico. Em seguida, é adicionada uma solução aquosa e usado sondas de ultrassom
para a formação de nanopartículas.
Injeção de solvente
A técnica se baseia na precipitação do lipídio a partir de uma solução de lipídio dissolvido em
solventes miscíveis com água ou uma mistura de solventes.
A mistura de solvente-lipídio é adicionada a uma fase aquosa sob agitação através de uma
seringa de injeção.
Membrana contratora
O princípio da técnica se baseia na utilização da fase lipídica ser pressurizada contra poros de
membrana em temperatura acima do ponto de fusão do lipídio e portanto, formando pequenas
gotículas. As nanopartículas lipídicas são formadas ao resfriar para a temperatura ambiente.
Fonte: BANGALE et al. (2012); SHARMA et al. (2011); SOUTO, E. B.; SEVERINO, P.; SANTANA, M. H. A. (2012); YADAV; KHATAK; SARA (2013).
47
3.2.4 Propriedades biofarmacêuticas dos CLN
As NLS e os CLN possuem vantagens em relação a emulsões convencionais,
como redução do tamanho da partícula, pequena distribuição de tamanho (menor
grau de polidispersão), melhorando o aspecto visual e capacidade de retenção das
nanopartículas no estrato córneo, evitando que as nanopartículas atinjam o sistema
circulatório, evitando absorção sistêmica, e os efeitos adversos sistêmicos
consequentes. As nanopartículas possuem propriedades de proteção de ativos
contra degradação química hidrolítica, devido à barreira de proteção do ativo dentro
do núcleo lipídico, não há extravasamento do conteúdo do ativo de dentro das
nanopartículas devido à matriz sólida e estável em temperatura ambiente e durante
armazenamento (SHARMA et al., 2011; WISSING; MULLER, 2002; YADAV;
KHATAK; SARA, 2013). As NLS foram introduzidas como uma alternativa para
solucionar os problemas dos sistemas lipossomais, devido aos carreadores coloidais
serem sensíveis a mudanças de temperatura e pH. Essas dificuldades trouxeram
dificuldades no preparo e na administração destes sistemas lipossomais (SHARMA
et al., 2011).
As nanopartículas também têm sido estudadas como sistema de liberação de
fármacos para vários alvos, como o sistema linfático (CAI et al., 2011), tratamentos
oncológicos (CHO et al., 2008; FENG; MUMPER, 2013; MARTINS et al., 2013;
PARBOOSING et al., 2012), anti-inflamatórios (KHURANA; BEDI; JAIN, 2013),
antioxidante (PANDITA et al., 2014) e antibiótico e antiparasitários (GREMIAO et al.,
2014). Além disso, a nanotecnologia possibilita que o fármaco administrado ao
organismo seja capaz de atingir o alvo específico ao penetrar as barreiras
fisiológicas e eliminar seletivamente as células alteradas sem afetar as células
normais (CHO et al., 2008).
Os sistemas lipídicos sólidos tem a propriedade de formar filmes oclusivos ao
serem aplicados na pele. A oclusão ocorre devido ao tamanho das partículas do
sistema (Figura 12). Nas formulações microparticuladas ocorre maior perda de água
transepidermal no extrato córneo devido ao espaçamento entre as partículas,
enquanto nas formulações nanoparticuladas, esse espaçamento é reduzido e
promove maior oclusão e menor perda da água transepidermal, garantindo a
hidratação da pele e a retenção de ativos (SOUTO; MULLER, 2008).
48
Além da capacidade de formação de filmes sobre a pele, as nanopartículas
lipídicas protegem componentes ativos lábeis devido a encapsulação e a retenção
dentro da matriz lipídica sem sofrer intereferência externa (como sol e luz) e modular
a liberação de fármacos na epiderme (MULLER; MADER; GOHLA, 2000; SOUTO;
MULLER, 2008).
Figura 12 – Efeito oclusivo (retenção de água na pele) de sistemas nanoparticulados (primeira ilustração) e sistemas microparticulados (segunda ilustração).
Fonte: Adaptada de Souto e Muller (2008).
Para a atividade antitumoral, a aplicação das nanopartículas lipídicas
apresenta vantagens como: melhora na liberação de fármacos hidrofóbicos e lábeis
ao reduzir sua exposição ao meio biológico ou aquoso; aprimoramento da
farmacocinética, aumentando o tempo de meia vida do fármaco circulante ao
protegê-lo do meio; aumento do tempo de retenção e permeabilidade e melhora na
distribuição de fármacos; possibilidade de aderir ligantes na superfície da NLS para
tratamento de alvos específicos e aumentar a seletividade (FENG; MUMPER, 2013).
Para o tratamento antitumoral sistêmico, é necessário que o fármaco esteja
na circulação sanguínea por um tempo razoável para atingir as células tumorais,
sem ser eliminado. A resistência e a eliminação do fármaco são obstáculos no
tratamento antitumoral, como a que ocorre pela Glicoproteína-P. A glicoproteína tem
a capacidade de eliminar o fármaco pelo sistema de efluxo e consequentemente
reduzir a biodisponibilidade e a efetividade do tratamento antitumoral. O efluxo pela
Glicoproteína-P pode ser evitado utilizando ligantes de superfície para que o sistema
seja internalizado por receptores mediados por endocitose (CHO et al., 2008).
49
Estudos contendo NLS como sistema de liberação de fármacos mostram a
viabilidade de vetorização do fármaco até as células tumorais, aumentando a
eficiência do mesmo e demonstrando o potencial promissor das NLS no tratamento
de câncer (GAO et al., 2013).
3.3 Piper aduncum L.
A família Piperaceae é uma das mais antigas famílias das Angiospermas. As
plantas desse conjunto podem ser encontradas nas regiões tropicais e subtropicais.
Atualmente, o gênero mais estudado dessa família é o gênero Piper, que conta com
mais de 2000 espécies identificadas e 600 constituintes químicos de diferentes
classes de bioativos, como alcaloides, amidas, propenilfenois, chalconas, entre
outros (FAZOLIN et al., 2006; WANKE et al., 2007).
A Piper aduncum L. é um arbusto ou arvoretas de 3-8 m (GAIA et al., 2004).
De acordo com Fazolin et al. (2006, p. 13), “as folhas apresentam pecíolo de 0,3 a
0,8 cm de comprimento, lâmina elíptica, apresentam base assimétrica, arredondada-
cordada, ápice agudo ou acuminado, escabrosas, ásperas ao tato em ambas as
faces”.
A espécie P. aduncum (Figura 13) é conhecida popularmente como aperta-
ruão, jaborandi-do-mato, falso-jaborandi, erva do jatoti, pimenta-de-fruto-ganchoso e
pimenta-de-macaco.
Figura 13 – Partes aéreas da planta adulta de Piper aduncum.
Fonte: O autor.
50
A distribuição da P. aduncum pode ser considerada variada, sendo
encontrada ao nível do mar ou em altitudes elevadas, localizada na Ámerica Central,
Antilhas, Ámerica do Sul e em diversas regiões do Brasil. É considerada uma planta
invasora devido a sua ocorrência espontânea, principalmente em áreas modificadas
pelo homem (FAZOLIN et al., 2006). Esta espécie é popularmente utilizada no
tratamento de inflamações e dores de estômago. O seu óleo essencial tem
apresentado ação analgésica e anti-inflamatória (FAZOLIN et al., 2006; GAIA et al.,
2004; OLIVEIRA et al., 2013).
Pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR)
do curso de Farmácia e do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
da UNIVALI tem estudado diversas plantas da flora catarinense, sendo uma delas, a
P. aducum. Estudos fitoquímicos com essa espécie descrevem a presença de
derivados de ácidos benzoicos, di-hidrochalconas e cromanas com atividades
antibacterianas e citotóxicas (ANDRADE; BLODORN, 2010, TOMIO, 2011).
Muller (2011) estudou a atividade antibacteriana e antifúngica de substâncias
isoladas taboganato de metila, cromanona, metóxi-taboganato de metila e 2’,6’-
dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona (DHC) e dos extratos da P. aduncum contra as
cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans em teste
autobiográfico. No teste autobiográfico, o extrato de P. aduncum apresentou uma
boa atividade contra S. aureus e C. albicans, no entanto essa atividade não foi
observada para as substâncias isoladas, indicando que talvez haja um sinergismo
dos componentes para haver a atividade antibacteriana ou haver um componente
ainda não isolado. Os mesmos resultados foram observados para a análise de
bactérias gram-negativas e para as bactérias gram-positivas (Streptococcus
pyogenes, S. epidermides, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus e S.
saprophyticus). O teste de atividade antifungica realizado por Muller (2011) avaliou a
atividade contra as cepas de fungos leveduriformes de C.albicans, C. krusei, C.
parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, usando novamente, o extrato e 4
substâncias isoladas. Com exceção da C. krusei, o extrato de P. aduncum foi a única
amostra a ter atividade (concentração inibitória e fungicida mínima de 125 µg/mL)
contra os fungos leveduriformes.
Os extratos etanólicos dos galhos e folhas e compostos isolados, como a di
DHC, ácido tabogânico e taboganato de metila, foram avaliados em modelos
51
experimentais para avaliar o potencial antitumoral (TOMIO, 2011). Os extratos
etanólicos apresentaram excelente atividade em células de melanoma murino
(B16F10), leucemia linfoide aguda B (NALM-6), câncer cervical (HELA) e leucemia
mieloide crônica (K562).
Leoni (2012), Santos (2013) e Lobato (2014) estudaram a relação da
proporção de fitocompostos ativos de extratos hidroalcoólicos das folhas de P.
aduncum com as estações do ano.
Leoni (2012) avaliou quantitativamente os fitoconstituintes da P. aduncum de
extratos coletados em diferentes sazonalidades do ano por CLAE. Foi obtido maior
rendimento no final de inverno e primavera e maior rendimento de extratos em folhas
do que galhos. O perfil cromatográfico foi semelhante, com a única diferença na
intensidade do sinal. A DHC foi encontrada em todas as quatro coletas do estudo.
Santos (2013) analisou os derivados de ácidos benzoicos e cromanomas nas
partes aéreas de P. aduncum por CLAE em diferentes épocas de coleta. Foi
avaliado que há a presença da cromanona ácida, cromanona e ácido-p-
metóxitabogânico em todas as partes da planta. No entanto, foi visualizado a
alteração de concentração por estação, sendo que a cromanona ácido foi mais
encontrada nos extratos de galhos na estação de primavera. Enquanto que ácido p-
metoxitabogânico e cromanona tiveram maiores concentrações nas folhas de verão.
Lobato (2014) analisou qualitativamente os extratos da P. aduncum, e
verificou que há a presença da DHC nas folhas e galhos em todas as estações do
ano, com maior concentração para as folhas. O perfil cromatográfico de extratos de
folhas e galhos só apresenta alteração na intensidade dos sinais cromatográficos.
Tais resultados são semelhantes aos obtidos por Leoni (2012). Entre as estações do
ano, as melhores épocas de coleta para a substância, são inverno e primavera.
Souza e Reinert (2014) avaliaram a atividade antifúngica a partir de estudo de
otimização de extratos secos por spray-drying e extratos moles das folhas de P.
aduncum. Os extratos de P. aduncum apresentaram potente atividade para cepas de
Trichophyton mentagrophytes, Cryptococcus neoformans, Microsporum gypseum, T.
rubrum, atividade moderada para Epidermophyton floccosum e fraca para M. canis,
de acordo com a classificação de Holetz e colaboradores (2002).
52
3.4 Dihidrochalconas
As chalconas são um grupo de enonas aromáticas (1,3-diaril-2-propen-1-
onas) que pertencem a família dos flavonoides. Estas são precursoras das flanonas
e podem ser responsáveis pela coloração amarela nas plantas. São encontradas de
forma natural em plantas e são de fácil obtenção na síntese orgânica (SIMÕES et
al., 2010). Na figura 14 está apresentada a estrutura fundamental das chalconas.
Figura 14 – Núcleo fundamental das chalconas.
O
A B
3
5
6'
4'2'
Fonte: SIMÕES et al. (2010).
Devido a grande variedade de substituintes possíveis nos aneis aromáticos A
e B, os derivados de chalcona podem apresentar diversas atividades biológicas,
incluindo atividades analgésica, antibacteriana, antifúngica, antioxidante,
antiprotozoário, gastroprotetora, antitumoral e anti-inflamatória. Dentre essas
atividades, a atividade antitumoral tem atraído atenção devido a sua capacidade de
bloquear a ativação de NF-κB, induzir apoptose, inibir proliferação, invasão,
metástase e angiogênese (SIMÕES et al., 2010; YADAV, 2011).
As di-hidrochalconas (Figura 15) diferem das chalconas pela redução dos
carbonos α,β insaturados presentes na estrutura da chalcona. Na estrutura química
das di-hidrochalconas não há a presença de centro simétrico, sendo que é possível
haver substituintes hidroxilas, metilas, açúcares e alquilas nos anéis A e B, como por
exemplo, é possível alterar o sabor das di-hidrochalconas para doce ou amargo
através da inserção de açúcar nos anéis (SIMÕES et al., 2010).
53
Figura 15 - Núcleo fundamental das di-hidrochalconas.
A B
3
5
6'
4'2'
O
Fonte: SIMÕES et al. (2010).
A 2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona (DHC) (Figura 16) é uma substância
extraída das folhas de Piper aduncum (TOMIO, 2011). Estudos com esta
dihidrochalcona demonstraram atividade antitumoral (SZLISZKA, 2010; TOMIO,
2011), antifúngica (LAGO et al., 2007; MULLER, 2011; SOUZA; REINERT, 2014),
antibacteriana (MULLER, 2011; PISSINATE, 2006) e antileishmania (HERMOSO et
al., 2003; LAGO et al., 2007).
Figura 16 – Estrutura química da 2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona.
A B
OOH
OHOCH3
Fonte: TOMIO, 2011.
Zhang e colaboradores (2013) realizaram uma revisão de chalconas e seus
derivados e relataram a atividade farmacológica desta classe frente a diferentes
patologias, incluindo a antitumoral. As chalconas são tidas como potencial fonte de
novos ativos farmacêuticos (GUTIERREZ; RAMIREZ; SAUCEDA, 2015).
Szliskza e colaboradores (2010) estudaram a atividade citotóxica e atividade
de apoptose de chalconas e dihidrochalconas, como a DHC, em atividade apoptótica
mediada por TRAIL em células tumorais de próstata. TRAIL ou tumor necrosis
factor-related apoptosis-inducing ligand é um agente “antitumoral” endógeno,
expressado por células do sistema imunológico (Linfócitos T, células natural killers,
54
células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos) para induzir a apoptose
seletiva de células tumorais sem apresentar atividade contra tecidos saudáveis e,
atuando portanto, no monitoramento e mecanismos de defesa do organismo. Os
autores observaram um aumento de porcentagem de morte celular para a molécula
DHC em 66,27 a 87,09% em sinergia com TRAIL no estudo de citotoxicidade de
células tumorais de próstata. A atividade foi confirmada com ensaios de anexina V-
FTIC em microscópio de fluorescência. Os autores sugerem que a atividade
citotóxica aliada a TRAIL possa estar relacionada com a presença das hidroxilas no
anel A.
Nos estudos realizados por Tomio (2011), a DHC demonstrou atividade
citotóxica nas linhagens celulares de HELA (células de câncer cérvico-uterino),
B16F10 (células de melanoma murino), K562 (células leucêmicas) e NALM-6 (célula
pré-B precursora de leucemia).
Em estudos de citotoxicidade de fitocompostos isolados e extratos de P.
aduncum realizados por Tomio (2011), a DHC foi a substância que apresentou
menor concentração de Cl50 em células de melanoma murino B16F10, com Cl50 de
44,81 ± 17,57 µg/mL em comparação a Cl50 ≥ 300 µg/mL de outros compostos
isolados (3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-hidroxibenzoato de metila, 3-(1’-oxo-3’-metil-
2’-butenil)-4-metoxibenzoato de metila, ácido 3-(1’-oxo-3’-metil-2’-butenil)-4-
hidroxibenzeno e éster metílico do ácido 2,2-dimetil-6-carboxicroman-4-ona) da P.
aduncum. Os extratos etanólicos das partes aéreas da P. aduncum apresentaram
CI50 de 24,91 ± 19,16 µg/mL, indicando um possível sinergismo entre os
componentes das partes aéreas.
55
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Equipamentos
Agitador mecânico Fisatom® 713D
Banho de ultrassom - Ultronique® – Ecosonics
Calorímetro Netzsch® STA449F3 Jupiter
Camara de fluxo laminar - Veco®, modelo VLDS-12
Centrífuga – Hermle®, mod. Z323
Centrífuga refrigerada – Sonyo, mod. Harrier 18180
Coluna cromatográfica de fase reversa C18 Phenomenex® Luna com
especificações de 250 x 4,6 mm x 5 µm.
Cromatógrafo gasoso acoplado a espectrometria de massas - Shimadzu® QP-
2010S, com biblioteca NIST08.
Cromatógrafo líquido de alta eficiência acoplado a espectrometria de
ultravioleta Shimadzu, Prominence LC-20AT, com bomba (LC-10ADvp),
acoplado a detector de arranjo de diodos (DAD SPD-M10Avp), auto-injetor
(SIL-10AF), comunicador (SCL-10Avp), forno de coluna (CTO-10Avp)
(Shimadzu), software Class VP (VPS MU)
Espectrofotomêtro de microplacas – Asxys Expert Plus®, Microplate Reader
G020 150.
Estufa para cultivo celular com atmosfera de 5% de CO2 – Ultra-Safe®, mod.
HF 212 UV
Infravermelho IRPrestige-21 Shimadzu® acoplado ao Diffuse Reflectance
Attachment (DRS-8000) e ao Attenuated Total Reflectance (ATR) com prisma
de ZnSe.
Liofilizador - Terroni®, mod. LD1500
Microscópio eletrônico de transmissão – Jeol®, modelo JEM-1200 EX II
Microscópio óptico - Leica®, modelo CME
Microscópio de luz invertida com fluorescência - Olympus®, mod. CKX41
Ressonância Magnética Nuclear - Bruker® 300
56
Zetasizer Malvern® Nano-ZS
4.1.2 Reagentes
Acetato de etila - Synth®
Acetonitrila grau HPLC – J.T. Baker®
Ácido esteárico – All Chemistry do Brasil Ltda®
Ácido fosfórico R - Fluka®
Álcool etílico absoluto P.A. – Vetec ®
Dibehenato de glicerila (Gliceryl Dibehenate (and) tribehenin (and) glyceryl
behenate) - Compritol® ATO 888 - Gattefossé®
Dimetilsulfóxido - Synth®
Hexano - Synth®
Meio de cultura DMEM (Dubelco’s Eagle Medium Modified) - Sigma®
Metanol grau HPLC – J.T. Baker ®
Miristato de Isopropila - Synth®
Monocaprilato de propilenoglicol (Capryol® 90) - Gattefossé®
Monoestearato de Glicerila – All Chemistry do Brasil Ltda®
MTT – Sigma®
Oleo de rícino hidrogenado etoxilado (Alkest® R400H) - Oxiteno®
Placa de CCD - Merck®
Polissorbato (Tween 80®) - Neon®
Propilenoglicol – Via Farma
Sílica-gel 0,063-0,200 mesh – Merck®
Soro bovino fetal - Sigma®
Triglicerídeos do ácido cáprico caprílico (Polymol®) - KLK®
4.2 Desenvolvimento e validação da metodologia analítica por CLAE
Para o desenvolvimento da metodologia de quantificação da DHC por CLAE
foi usada como ponto de partida a metodologia descrita por Santos (2013) e Lobato
(2014) para análise da DHC por CLAE usando método gradiente (Quadro 5), fluxo
de 0,8 mL/min, temperatura de 35 ºC, volume de injeção de 20 µL e detecção em
57
285 nm. As análises foram realizadas em uma coluna cromatográfica de fase
reversa C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), Phenomenex® Luna.
Quadro 5 - Condições cromatográficas para análise da DHC em extrato de P. aduncum por CLAE.
Tempo (min) Metanol (%) Acetonitrilia (%) Água* (%)
0,01 50 10 40
2 50 10 40
15 70 10 20
25 80 10 10
30 80 10 10
40 85 10 5
55 85 10 5
60 85 10 5
65 50 10 40
Fonte: Santos (2013) e Lobato (2014); * acidificada em pH 3,50 com ácido fosfórico.
Para análise da DHC pura buscou-se otimizar a metodologia analítica a fim
de reduzir o tempo de análise. Para tanto, usando a mesma coluna (coluna de fase
reversa C18 Phenomenex® Luna), foram testados diferentes métodos com alteração
da temperatura, do fluxo, do tempo e composição do sistema gradiente e também no
modo isocrático. Foram testados 12 métodos (B ao M), conforme descritos abaixo e
detalhados no Apêndice A.
A. Reprodutibilidade do Método desenvolvido por Lobato (2014).
B. Método A Lobato (2014) com alteração da temperatura do forno de 35 ºC para
40 ºC e fluxo mantido em 0,8 mL/min.
C. Redução do tempo de corrida do método B de 65 para 35 min, com
manutenção do fluxo (0,8 mL/min) e temperatura (35 °C).
D. Método C com fluxo de 1 mL/min.
E. Aumento do valor fixo de Acetonitrila de 10 para 20% e redução do tempo de
corrida de 35 para 20 min, com fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
F. Método E com fluxo de 1 mL/min.
G. Método de Metanol fixo a 5% em fluxo de 0,8 mL/min.
H. Método G com fluxo de 1 mL/min.
58
I. Redução do tempo de corrida do método C de 35 para 15 min com fluxo de
0,8 mL/min.
J. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada com ácido fosfórico pH
3,50 (80:10:10), fluxo de 0,8 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida
de 15 min.
K. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada com ácido fosfórico pH
3,5 (80:10:10), fluxo de 1,0 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida
de 15 min.
L. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada com ácido fosfórico pH
3,5 (75:10:15), fluxo de 1,0 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida
de 15 min.
M. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada com ácido fosfórico pH
3,5 (70:10:20), fluxo de 0,8 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida
de 15 min.
O método L foi selecionado para quantificação da DHC e submetido à
validação. O método L apresentou menor tempo de corrida e detecção da DHC
(aprox. 5 minutos) com pico simétrico.
4.2.1 Preparo da Fase Móvel
A água ultrapura de grau analítico I foi acidificada com ácido fosfórico R até
atingir pH 3,50 e filtrada em filtro de membrana de celulose regenerada de 0,45 μm.
Os solventes acetonitrila e o metanol de grau HPLC e a água acidificada
foram degaseificados com gás hélio.
4.2.2 Preparo da solução padrão da dihidrochalcona DHC
Foi pesado 1 mg da DHC e transferido para balão volumétrico de 10 mL. Foi
acrescentado 5 mL de metanol e sonicado em banho de ultrassom durante 30 min.
Foi completado volume com metanol e homogeneizado (100 μg/mL). A solução
referência foi diuída 1:10 em metanol (10 μg/mL), filtrada usando filtro de 0,45 µm e
injetada no cromatógrafo em triplicata.
59
4.2.3 Preparo e análise da solução amostra de CLN-DHC A solução amostra de CLN-DHC na concentração de 0,35 mg/mL foi
preparada a partir da concentração teórica de DHC na dispersão de CLN, ou seja,
50,0 mg de DHC em 140 mL de água.
A dispersão de CLN-DHC foi homogeneizada em agitador magnético durante
10 minutos para posterior retirada da amostra.
Uma alíquota de 1 mL da solução amostra foi transferida para balão
volumétrico de 10 mL, adicionado 5 mL de metanol e mantido em banho de
ultrassom por 30 min. Em seguida, o volume foi completado com metanol e
homogeneizado, resultando na concentração de 35 µg/mL de DHC. A solução foi
diluída com metanol para obtenção da solução amostra a 10 µg/mL.
A solução foi filtrada usando filtro de 0,45 µm e injetada no cromatógrafo em
triplicata.
4.2.4 Adequabilidade do sistema
Foram injetados 20 µL da solução padrão de DHC 10 µg/mL em 6 replicatas,
registrada e integradas as áreas referentes ao pico da DHC entre 4 a 7 min.
4.2.5 Análise de estabilidade da solução de DHC
A estabilidade da solução de DHC foi analisada por CLAE. Soluções-teste de
DHC, descritas no item 4.2.2, a 10 µg/mL foram preparadas em metanol e etanol. A
justificativa da escolha do metanol se deve ao seu uso como fase móvel no CLAE e
a DHC possuir maior solubilidade e o etanol por ser um co-solvente usado nos
estudos de dissolução.
A solução-teste de DHC foi mantida em temperatura ambiente e quantificada
tempos de 0, 12, 24 e 48 h por CLAE, usando o método isocrático descrito no item
4.2.
60
4.2.6 Validação do método
4.2.6.1 Linearidade e faixa de variação
O estudo referente ao parâmetro de linearidade foi baseado no preparo de
soluções padrão de concentração conhecida, dentro de um dado intervalo,
possibilitando assim a avaliação da relação entre a concentração e a resposta
gerada pelo sistema.
De acordo com a RE nº 899, de 29 de maio de 2003 (BRASIL, 2003), o
intervalo a ser utilizado para determinações quantitativas do analito em matérias-
primas ou em formas farmacêuticas é de 80% a 120% da concentração teórica
fixada pelo método.
A solução padrão de DHC a 100 μg/mL foi preparada conforme item 4.2.2.
Para obtenção da curva analítica de DHC foram transferidos volumes crescentes
desta solução para balão volumétrico de 10 mL (em triplicata). O volume foi
completado com metanol. As concentrações teóricas foram 2,5; 5,0; 10; 20; 30
µg/mL.
As amostras foram filtradas em filtro de membrana de 0,45 m e injetadas no
cromatógrafo em duplicata. Foi calculada a equação da reta por regressão linear, o
coeficiente de determinação (r2) e foram plotados os resíduos das curvas.
4.2.6.2 Limite de Quantificação (LQ) e de detecção (LD)
Os limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) do método analítico
foram calculados a partir dos resultados da curva analítica da DHC usando as
equações 1 e 2, respectivamente (BRASIL, 2003; ICH, 1996).
(1)
(2)
Onde: = desvio padrão do coeficiente linear da curva analítica.
a = coeficiente angular da curva analítica.
61
O valor do coeficiente angular (a) médio das curvas analíticas foi obtido
através das equações da reta (y = ax + b) e o foi obtido através do cálculo do
desvio padrão do coeficiente linear das curvas analíticas, empregando o programa
Excel®.
4.2.6.3 Exatidão
Para determinação da exatidão do método foi realizada a adição de solução
de DHC em diferentes concentrações: 8 µg/mL (nível baixo), 10 µg/mL (nível médio)
e 12 µg/mL (nível alto) na dispersão de CLN em meio aquoso. As soluções foram
preparadas conforme descrito no Quadro 6.
Quadro 6- Preparo das amostras para ensaio de exatidão do método.
Balão Dispersão de
CLN (µL)1 Solução DHC (µL)
Metanol (µL)
Concentração teórica DHC (µg/mL)
1 200 - 800 0
2 200 80 720 8
3 200 100 700 10
4 200 120 680 12
5 - 100 900 10
1CLN sem DHC.
As amostras foram filtradas em membrana de 0,45 µm e realizadas as
injeções em triplicata. O cálculo do % de recuperação foi feito através da equação 3.
(3)
O critério de aceitação para o ensaio de recuperação neste nível de
concentração pode ser de 80-110% (HUBER, 1999).
4.2.6.4 Especificidade
A especificidade ou seletividade do método foi inferida pela análise da
resolução do pico da DHC do ensaio de exatidão e também pela análise da
influência dos excipientes ou das CLN inertes adicionado às amostras no ensaio de
62
exatidão (Quadro 6).
Foi comparada a área do analito presente no balão 3 (após descontar a
respectiva área média presente no balão 1) com a área deste analito presente no
balão 5, que contém somente o padrão, na mesma concentração (Quadro 6),
representado na equação 4.
[(
) ] (4)
4.2.6.5 Precisão
A precisão do método foi determinada em dois níveis: repetibilidade, que
expressa a precisão intra-dia e, precisão intermediária, que representa a precisão
inter-dias com repetidos preparos da solução-amostra (sextuplicata) e por dois
analistas diferentes.
a) Repetibilidade
A repetibilidade foi avaliada através de 6 determinações na concentração alvo
de 10 µg/mL. O ensaio foi repetido no mesmo dia, pelo mesmo analista.
As soluções amostras foram preparadas conforme descrito no item 4.2.2,
preparando 6 replicatas de solução amostra.
O DPR da área do pico correspondente da DHC foi calculado para avaliar a
variação intra-dia. O critério de aceitação é DPR ≤ 5 % (BRASIL, 2003).
b) Precisão intermediária
A precisão intermediária foi avaliada através de 6 determinações, na
concentração alvo (10 µg/mL). O ensaio descrito para a repetibilidade foi repetido
em dois dias diferentes e por analistas diferentes.
O DPR das áreas correspondente a DHC foi calculado nos 2 dias, para avaliar
a variação inter-dia. O critério de aceitação é DPR ≤ 5 % (BRASIL, 2003).
4.2.6.6 Robustez
Para o teste da robustez da metodologia analítica de quantificação da DHC,
foram preparadas soluções de 10 µg/mL e analisados os perfis cromatográficos
obtidos com a alteração dos parâmetros de temperatura (34, 35 e 36 oC), fluxo (0,9,
63
1,0 e 1,1 mL/min) e pH da fase móvel (3,40, 3,50 e 3,60). As amostras foram
preparadas em triplicatas e injetadas em triplicata.
O método analítico é considerado robusto se o DPR entre as áreas das
replicatas de injeção da solução referência e amostra for menor que 2,0%, a
resolução para o pico da DHC na solução referência e amostra for ≥ 1,0 e o teor da
DHC nas amostras analisadas em cada condição apresentar um DPR ≤ 5,0%.
4.3 Isolamento e Caracterização da DHC
O isolamento da DHC foi realizado a partir das folhas da espécie P. aduncum,
devido a maior quantidade presente do fitocomposto nas folhas detectado em
estudos prévios (LEONI, 2012; LOBATO, 2014).
A pastilha preparada para o isolamento da DHC foi composta frações
enriquecidas provenientes de separação do extrato bruto etanólico das folhas por
cromatografia líquida.
A coluna de separação (cromatografia em coluna) de 6 cm de diâmetro foi
preparada usando sílica-gel (0,063-0,200 mesh) como fase estacionária adsorvente
e soluções de hexano:acetato de etila (Hex:AcEt) como fase móvel em
concentrações crescentes de polaridade. A pastilha do extrato foi preparada
utilizando sílica-gel (0,063-0,200 mesh) e adicionada na parte superior da coluna
cromatográfica. As frações das amostras foram coletadas em frascos de vidro
identificados e previamente higienizados e limpos com álcool 70%. Os solventes das
amostras coletadas foram evaporados em capela de exaustão a temperatura
ambiente.
O isolamento da DHC foi acompanhado por cromatografia de camada
delgada (CCD) em cromatoplacas de sílica-gel com dimensões de 4 x 5 cm. As
frações foram colocadas em formas de ‘spots’ nas placas e eluídas em fase móvel
Hex:AcEt (7:3), em cuba de vidro. Para detecção das substâncias foi empregado da
câmara de luz ultravioleta em comprimentos de onda de 254 e 366 nm, seguido de
revelação com pulverização de solução de anisaldeído sulfúrico e aquecimento. O Rf
das amostras foi calculado usando a equação 5.
(5)
64
O composto isolado foi caracterizado quanto aos aspectos de solubilidade,
ponto de fusão, comportamento térmico por Calorimetria Diferencial Exploratória
(DSC) e Análise Termogravimétrica (TG) e pureza por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) e Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN1H) e de
carbono (RMN13C).
4.3.1 Solubilidade
A solubilidade da DHC foi analisada pela adição de 10 mg em um tubo de
ensaio e adicionado uma quantidade de solvente e agitado manualmente até
dissolução das partículas. Foi adicionado mais solvente se necessário para dissolver
a DHC (BRASIL, 2010).
Os volumes foram de 0,010, 0,030, 0,100, 1,0, 10 e 15 mL para avaliar a
solubilidade da DHC. Os solventes analisados foram: água ultrapura, acetonitrila,
acetona, hexano, metanol e acetato de etila. A escolha dos solventes para essa
análise se deve por serem solventes envolvidos no processo de extração,
purificação e análise por CLAE.
4.3.2 Comportamento térmico
O comportamento térmico da DHC foi determinado por DSC e TG. O ponto de
fusão das amostras foi determinado pelo pico endotérmico no DSC. A perda da
massa e a massa residual foram analisadas pela interpretação da curva de TG.
Uma pequena quantidade de amostra (5 a 10 mg) foi colocada em cadinho de
alumina e submetida a rampa de aquecimento de 20 a 500 °C, em uma taxa de
aquecimento de 1 °C/min em atmosfera de nitrogênio.
4.3.3 Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN de 1H e 13C da DHC foram obtidos em espectroscópio
Bruker 300 a 300 MHz e 75,5 MHz, respectivamente.
Cerca de 10 mg de amostra foi adicionado ao um tubo de RMN contendo 0,5
mL de acetona deuterada. As análises foram realizadas no laboratório de
Ressonância Magnética Nuclear, do curso de Farmácia, UNIVALI, campus Itajaí.
65
4.3.4 Espectro de Massas
A análise por espectrometria de massas da DHC foi realizada no
cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas (Shimadzu QP-2010S com
biblioteca NIST08). A amostra foi dissolvida em dimetilsufóxido (DMSO) e injetada
diretamente no probe do equipamento. A análise foi realizada no laboratório de
Instrumentação Analítica, do curso de Farmácia, UNIVALI, campus Itajaí.
4.3.5 Espectroscopia no Infravermelho
A análise no infravermelho (IV) foi realizada no equipamento IR Prestige-21
DRS-8000 da marca Shimadzu. A análise da DHC foi realizada no laboratório de
Síntese Orgânica, do curso de Farmácia, UNIVALI, campus Itajaí.
Para a análise da DHC foi usada a técnica de espectroscopia de IV médio
com transformada de Fourier (FTIR) com reflectância difusa (DRS ou DRIFTS). Uma
pequena quantidade de amostra foi misturada em brometo de potássio (KBr),
homogeneizado com pistilo para posterior formação de uma pastilha. A mistura de
pós foi transferida para suporte metálico e submetida à análise. Os resultados foram
ajustados usando a equação de Kubelka-Munk.
4.3.6 Análise de pureza
A análise de pureza da DHC foi realizada por calorimetria exploratória
diferencial com auxílio da equação de Van’t Hoff e informações do ponto de fusão e
peso molecular da DHC. A pureza foi calculada com auxílio do software Proteus
Analysis®.
A pureza da DHC foi confirmada pela análise do perfil da solução a 10 µg/mL
por CLAE, usando metodologia descrita no item 4.2 e por CG acoplado à
espectroscopia de massa (CG-EM).
4.4 Estudos de Pré-Formulação
Para estudos de pré-formulação foram realizados ensaios de solubilidade da
DHC nos excipientes e avaliada a presença de incompatibilidade fármaco:excipiente.
66
4.4.1 Ensaios de Solubilidade da DHC nos Excipientes
No estudo de solubilidade da DHC nos excipientes na etapa de pré-
formulação foram estudados 03 lipídios, 03 óleos e 03 tensoativos, conforme
apresentado no Quadro 7.
Quadro 7 - Excipientes usados no ensaio de solubilidade da DHC.
Excipientes
Lipídios
Ácido esteárico AET
Dibehenato de glicerila DBG
Monoestearato de glicerila MEG
Óleos
Monocaprilato de propilenoglicol MCP
Miristato de isopropila MIP
Triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico TAC
Tensoativos
Propilenoglicol PPG
Polissorbato 80 P80
Óleo de rícino hidrogenado etoxilado 40 ORE
4.4.1.1 Solubilidade DHC em lipídios
Foi pesado 1,0 mg de DHC em um béquer e adicionado 1,0 mg de lipídio. O
béquer foi aquecido em banho-maria até ± 5 ºC acima do ponto de fusão do lipídio e
verificada a dissolução da DHC. Quando necessário para dissolução da DHC, foi
adicionado mais lipídio em quantidades descritas no Quadro 8, até dissolução da
DHC.
Quadro 8 – Quantidades de excipientes – lipídio - adicionados no ensaio de solubilidade da DHC (1 mg).
Quantidade Adicionada (mg) Quantidade Total (mg)
+ 1,0 1,0
+ 4,0 5,0
+ 5,0 10,0
+ 40,0 50,0
+ 50,0 100,0
+ 50,0* 150,0
*50,0 mg foi adicionado sucessivamente até a dissolução entre excipiente e DHC.
67
4.4.1.2 Solubilidade DHC em óleos e tensoativos
Foi pesado 1,0 mg de DHC em béquer e adicionado 10 mg de óleo ou de
tensoativo. O béquer foi colocado em banho de ultrassom por 15 min e verificada a
dissolução. Se necessário, foi adicionado mais excipiente, conforme Quadro 9.
Quadro 9 – Quantidades de excipientes – óleos e tensoativos - adicionados no ensaio de solubilidade da DHC (1 mg).
Quantidade Adicionada (mg) Quantidade Total (mg)
+ 10,0 10,0
+ 40,0 50,0
+ 50,0 100,0
+ 50,0* 150,0
*50,0 mg foi adicionado sucessivamente até a dissolução entre excipiente e DHC.
4.4.2 Ensaios de compatibilidade de DHC com os Excipientes
A compatibilidade de DHC com os lipídios, óleos e tensoativos foi analisada
em DSC e TG e análise no IV usando mistura física DHC:excipiente 1:20 e os
produtos da análise de solubilidade da DHC nos excipientes, conforme item 4.4.1. A
escolha da proporção 1:20 (DHC:excipiente) invés do convencional 1:1
(ativo:excipiente) foi escolhida devido a limitação de DHC disponível e por ser uma
concentração suficiente para análises biológicas.
Para as análises calorimétricas de DSC e TG, cerca de 5 a 10 mg foram
pesados em cadinhos de alumina e analisados usando rampa de aquecimento de 20
a 500 ºC, a 10 ºC/min em atmosfera de nitrogênio (50 mL/min).
O espectro de absorção no IV dos excipientes sólidos (dibehenato de glicerila,
monoestearato de glicerila e ácido esteárico) foi determinado usando a técnica de
DRS, conforme descrito no item 4.3.5. Os excipientes líquidos (óleos e tensoativos)
foram analisados usando a técnica de refletância total atenuada (ATR) com prisma
de selênio de zinco (ZnSe). Uma pequena quantidade de amostra foi colocada no
suporte com auxílio de pipeta de Pasteur e depois o suporte foi inserido no
equipamento.
68
4.5 Desenvolvimento dos CLN
No desenvolvimento dos CLN sem ativo foram empregados como lipídios o
monoestearato de glicerila (MEG) e o dibehenato de glicerila (DBG); como
tensoativos o óleo de ricino hidrogenado polietoxilado (ORE), polissorbato 80 (P80)
e Lauril éter sulfusuccinato de sódio (LESS) e como óleos, o triglicérides de ácido
cáprico e caprílico (TAC), o monocaprilato de propilenoglicol (MCP) e o miristato de
isopropila (MIP).
Foram preparadas formulações contendo: (a) lipídios e tensoativos, (b)
lipídios, óleo e tensoativos e (c) lipídios sem tensoativos (somente para
monoestearato de glicerila devido sua propriedade tensoativa). As formulações
testadas estão descritas no Quadro 10.
Os CLN foram obtidos pelo método de microemulsificação com inversão de
fases seguida de resfriamento, usando metodologia adaptada de Silva, Silva e
Lucinda-Silva (2013). No béquer da fase oleosa foi adicionado lipídio, tensoativo e
óleo e no béquer da fase aquosa somente a água (40 mL). Em temperatura de 90
°C, a fase aquosa foi gotejada sobre a fase oleosa, em agitador mecânico a 1500
rpm. A amostra foi mantida em agitação a 1500 rpm até chegar a temperatura
ambiente. A microemulsão obtida foi gotejada em 100 mL de água resfriada (3 °C),
sob agitação a 2500 rpm, para obtenção dos CLN.
A fim de verificar a influência da temperatura e da velocidade de agitação no
tamanho de partícula e índice de polidispersão, a formulação DBG-O-MIP (Quadro
10) foi preparada usando diferentes temperaturas e velocidades de agitação durante
as fases de microemulsificação e resfriamento, conforme apresentado no Quadro 11.
A fim de verificar a estabilidade dos CLN, os lotes preparados foram
acondionados em frascos de vidro âmbar e armazenados durante 14 dias em
temperatura ambiente e em geladeira. Os parâmetros de tamanho, PDI e potencial
zeta foram determinados a cada 24 h até o sétimo dia e no final do estudo (14 dias).
69
Quadro 10 – Composição das formulações usadas no desenvolvimento das NLS e CLN.
Formulação Lipídio (g) Tensoativos (g) Óleos (g)
MEG DBG ORE P80 LESS MCP TAC MIP
MEG 1,0 - - - - - - -
MEG-O 1,0 - 4,0 - - - - -
MEG-P 1,0 - - 4,0 - - - -
MEG-O-MCP 0,9 - 4,0 - - 0,1 - -
MEG-P-MCP 0,9 - - 4,0 - 0,1 - -
MEG-O-TAC 0,9 - 4,0 - - - 0,1 -
MEG-P-TAC 0,9 - - 4,0 - - 0,1 -
MEG-O-MIP 0,9 - 4,0 - - - - 0,1
MEG-P-MIP 0,9 - - 4,0 - - - 0,1
DBG-O - 1,0 4,0 - - - - -
DBG-P - 1,0 - 4,0 - - - -
DBG-O-MCP - 0,9 4,0 - - 0,1 - -
DBG-P-MCP - 0,9 - 4,0 - 0,1 - -
DBG-O-TAC - 0,9 4,0 - - - 0,1 -
DBG-P-TAC - 0,9 - 4,0 - - 0,1
DBG-O-MIP - 0,9 4,0 - - - - 0,1
DBG-P-MIP - 0,9 - 4,0 - - - 0,1
DBG-OL-MIP1 - 0,9 3,65 - 0,35 - - 0,1
DBG-OL-MIP2 - 0,9 3,25 - 0,75 - - 0,1
DBG-OL-MIP3 - 0,9 2,90 - 1,10 - - 0,1
MEG = monoesterato de glicerila; DBG = Dibehenato de glicerila; ORE = óleo de rícino etoxilado; P80 = polissorbato 80; MCP = monocaprilato de propilenoglicol; TAC = triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico; MIP = miristato de isopropila; LESS = lauril éter sulfusuccinato de sódio.
A partir da formulação escolhida DBG-O-MIP, foram desenvolvidas
formulações com diferentes condições de processo de preparo. Foi realizado
variação na temperatura do processo de emulsificação do lipídio de 90 ºC para 80,
75 e 70 ºC, considerando que apesar de 90 ºC ser a temperatura proposta por Silva,
Silva e Lucinda-Silva (2013), a temperatura de 90 ºC poderia provocar degradação
do ativo DHC e avaliado a influência da temperatura no tamanho de partícula, índice
de polidispersão e potencial zeta. E também foram realizadas variações na
velocidade de agitação do agitador mecânico, para estudar a influência da energia
cinética no processo de estabilização de partículas. A energia cinética pode
ocasionar o aumento de partículas devido a colisões frequentes entre as partículas.
A redução da velocidade de agitação é uma proposta de estudo para avaliar se a
energia cinética possui influência nos parâmetros das nanopartículas lipídicas. A
velocidade de agitação foi alterada de 2500 rpm para 1500 rpm no processo de
resfriamento das nanopartículas lipídicas e 800 rpm no processo de emulsificação
70
para 1500 rpm. O motivo do aumento da velocidade para 1500 rpm invés da redução
de velocidade no processo de emulsificação é devido a melhor aparência (aspecto
mais translúcido) em relação a formulações preparadas com velocidade de 800 rpm.
As formulações propostas foram desenvolvidas de acordo com Quadro 11.
Quadro 11 – Condições de temperatura e velocidade de agitação usadas na otimização do método de preparação dos CLN
1.
Formulação Temperatura (ºC) Agitação (rpm)2
DBG-O-MIP1 90 800/1500
DBG-O-MIP2 80 800/1500
DBG-O-MIP3 75 800/1500
DBG-O-MIP4 70 800/1500
DBG-O-MIP5 80 1500/2500
DBG-O-MIP6 80 1500/1500
1Formulação DBG-O-MIP (DBG 0,9 g; ORE 4 g e MIP 0,1 g).
2Velocidade de agitação nas etapas de microemulsificação/resfriamento
Os CLN foram caracterizados quanto ao tamanho de partícula, índice de
polidispersidade (PDI) e potencial zeta (ζ) por espalhamento de luz dinâmica
(ZetaSizer®).
4.6 Preparação e caracterização das CLN contendo DHC (CLN-DHC)
A DHC foi incorporada nos CLN na proporção de 1:20 em relação ao lipídio,
resultando na dispersão de CLN na concentração de 0,35 mg/mL. A DHC foi
incorporada na formulação de CLN selecionada na etapa de desenvolvimento,
composta por 0,9 g de Compritol, 0,1 g miristato de isopropila e 4 g de óleo de rícino
polietoxilado (DBG-O-MIP). Os CLN foram preparados conforme metodologia
descrita no item 4.5 com velocidade de agitação de 1500 rpm nas etapas de
nanoemulsificação e resfriamento. A DHC foi adicionada na fase oleosa na etapa de
nanoemulsificação após aquecimento da fase oleosa.
Os CLN contendo DHC (CLN-DHC) foram caracterizados pelos métodos
descritos abaixo.
71
4.6.1 Análise de tamanho
A distribuição de tamanho dos CLN foi determinada em equipamento de
difração de luz laser (Zetasizer Malvern). Para análise, a amostra foi previamente
diluída em água ultrapura na proporção 1:50 (V/V). Foram analisados os parâmetros
de distribuição de tamanho, tamanho médio e índice de polidispersidade.
4.6.2 Análise de potencial zeta
O potencial elétrico de superfície ou potencial zeta foi determinado em
analisador de carga de superfície a partir da velocidade de migração das partículas
em um meio eletroforético com auxílio de difração de luz laser em equipamento
Zetasizer (Malvern®). Para análise, a amostra foi previamente diluída em água
ultrapura na proporção 1:50 (V/V).
4.6.3 Análise morfológica
O aspecto morfológico e a estrutura dos CLN foram analisados por
microscopia eletrônica de transmissão (MET). A dispersão de CLN foi depositada
(cerca de 1 gota) sobre uma grade de cobre de 400 mesh coberta com filme
FormVar/Carbono, e deixado em repouso por 1 h para permitir a secagem. Sobre a
grade com os CLN foi adicionado 1 gota de contraste negativo à base de acetato de
uranila a 2% e deixado em contato por 10 min. O excesso de contraste foi retirado
com papel filtro e a grade foi analisada diretamente no MET a temperatura ambiente
e 80 kV. A análise foi feita no Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade
Federal do Paraná (UFPR) em parceria com a Profa. Joana Silveira.
4.6.4 Determinação da eficiência de encapsulação da DHC
A eficiência de encapsulação foi realizada usando ultrafiltração/centrifugação
em tubos Amicon® (Merck Millipore, 10.000 MWCO) (Figura 17). Da dispersão
aquosa de CLN-DHC, 4 mL foram pipetados dentro do reservatório do tubo e
centrifugados em diferentes velocidades de centrifugação e intervalos de tempo,
72
conforme apresentado no Quadro 12. As condições de centrifugação foram usadas
de acordo com fabricante.
Quadro 12 – Condições experimentais usadas no ensaio de eficiência de encapsulação das CLN-DHC.
Velocidade de
centrifugação (g)
Velocidade de
centrifugação (rpm) Tempo (min)
2000 4339 10
1000 3068 10
500 2170 10
1000 3068 20
A velocidade de centrifugação a 500 g, durante 10 min, não foi eficiente para
filtração de um volume mínimo necessário para quantificação da DHC.
O filtrado obtido foi quantificado por CLAE usando a metodologia descrita no
item 4.2 e a eficiência de encapsulação foi calculada usando a equação 5.
Figura 17 - Tubo de centrifugação contendo ultrafiltro 10.000 MWCO.
(5)
QT = quantidade total de DHC na amostra
QUC = massa de DHC quantificada no filtrado.
4.7 Estudo de secagem dos CLN contendo DHC
A liofilização das CLN e CLN-DHC foi realizada com e sem crioprotetores. Os
crioprotetores usados foram manitol e sacarose na concentração de 10%. Os
crioprotetores foram adicionados à dispersão de CLN, homogeneizados e, após
congelamento, as amostras foram liofilizadas.
73
Para avaliar a influência da secagem no tamanho das CLN, após a
liofilização, as amostras secas foram redispersas em água na proporção teórica
inicial. Para os CLN liofilizados sem crioprotetores, foi pesado cerca de 5 mg de
material liofilizado em tubo de ensaio e adicionado 10 mL de água ultrapura. Em
seguida, o tubo foi levado ao vortex automático por 2 min e homogeneizado em
banho de ultrassom por 30 min.
Para redispersão dos CLN liofilizados com crioprotetores, foi pesado cerca de
75 mg de material liofilizado em tubo de ensaio e adicionado 10 mL de água
ultrapura. O tubo foi levado para mistura em vortex por 2 min e homogeneizado em
banho de ultrassom por 30 min.
As dispersões obtidas foram analisadas por espalhamento de luz dinâmica
(ELD) para avaliação do tamanho, PDI e potencial zeta. Esses resultados foram
comparados com os dados de CLN antes da liofilização.
4.8 Análise de liberação in vitro dos CLN contendo DHC
Para o estudo de liberação in vitro dos CLN contendo DHC foram usadas
membranas de acetato de celulose, e como meio solução hidroalcoólica a 30%
(V/V). As membranas de acetato de celulose ficaram imersas em meio de dissolução
durante 12h antes do uso.
Figura 18 – Adaptação da cuba de dissolução. Aparato modificado para conter 30 mL de meio de dissolução. Amostra ficará retida dentro do saco de diálise na haste
do dissolutor.
74
A amostra de dispersão de CLN-DHC (1 mL) foi transferida para aparato de
cesta modificado para conter 1 mL de amostra e o sistema foi imerso em meio de
liberação (30 mL) usando aparato modificado para conter 30 mL de meio (Figura 18).
O ensaio de dissolução foi realizado usando agitação de 50 rpm a 32 ºC. Em
intervalo de tempo pré-estabelecido 30, 60, 120, 240, 480, 1440 e 2880 min, a
amostra (1 mL) foi coletada e quantificada por CLAE após filtração em filtro de 0,45
µm. Foi realizada reposição do volume com o mesmo meio de dissolução.
4.9 Avaliação da atividade antitumoral dos CLN contendo DHC em modelos
farmacológicos de melanoma murino in vitro
Os ensaios de atividade biológica dos sistemas in vitro foram realizados em
parceria com os professores Dr. José Roberto Santin e Dra. Isabel D. Machado do
Laboratório de Farmacologia in vitro do PPGCF (UNIVALI), empregando células de
melanoma murino B16F10 e células de fibroblasto murino L-929.
A citotoxicidade do DHC incorporada nos CLN foi avaliada usando os
métodos de viabilidade celular por MTT (MOSMANN, 1983).
4.9.1 Cultivo celular
Fibroblastos murino linhagem NCTC clone 929 (L CELL, L-929) e células de
melanoma murino B16F10 foram cultivadas em garrafas mantidas em meio de
cultura DMEM (Dubelco’s Eagle Medium Modified), suplementado com 10% de soro
bovino fetal (Sigma®). Os experimentos foram realizados em condições assépticas e
em câmara de fluxo laminar, a fim de evitar contaminações das células. O cultivo
celular foi mantido em estufa a 37 oC em atmosfera de 5% de CO2.
4.9.2 Ensaio de MTT
As culturas celulares de L929 e B16F10, mantidas em estufa a 37 °C com 5%
de CO2, foram plaqueadas (50.000 células/poço) em microplacas de 96 poços (TTP)
e mantidas a 37 °C com 5% de CO2. Após 2 h, as amostras testes foram
adicionadas sendo: solução de extrato mole de P. aduncum em DMSO a 10% (0,1,
1,0, 10 e 100 μg/mL), solução de DHC em DMSO a 10% (0,1, 1,0, 10 e 100 μg/mL),
dispersão aquosa de CLN brancos e contendo DHC (0,01, 0,1, 1,0 e 10 μg/mL).
75
Como controle positivo e negativo de citotoxicidade foram empregados DMCO a
10% e meio DMEM, respectivamente. O crescimento celular foi revelado pelo ensaio
de redução do MTT (Sigma Inc.). Neste ensaio, o MTT sofre redução pela atividade
da succinato desidrogenase mitocondrial das células vivas e é convertido em sal
formazan, formando cristais de coloração azulada que, após dissolução com DMSO,
permite a quantificação da coloração formada em espectrofotômetro (MOSMANN,
1983). Após 21 h de incubação a 37 °C com 5% CO2, foi adicionado 10 μL de MTT
(5 mg/mL) e a placa mantida mais 3 h em estufa a 37 °C e com 5% CO2. Ao término
desse período, o sobrenadante foi retirado, e para a dissolução dos cristais formados
pela redução do MTT foi adicionado 100 μL de DMSO. A densidade óptica (DO) de
cada poço foi determinada em espectrofotômetro de microplacas em 570 nm
(BABICH; BORENFREUND, 1992; DENIZOT; LANG, 1986).
Os resultados em DO obtidos em quatro experimentos independentes
realizados em quadruplicata foram analisados após eliminação do background de
proliferação das células de cada experimento, empregando como indicador a
percentagem de proliferação, de acordo com Florão et al. (2007), conforme equação
6.
(6)
A intensidade de cor formada é proporcional à atividade enzimática
mitocondrial e indica a viabilidade celular. Assim, a percentagem de crescimento
obtida corresponde ao número de células presentes no cultivo celular e indica o
efeito induzido pelo composto adicionado ao cultivo celular (ESTEVES-SOUZA et al.,
2002; MANOSROI; SARAPHANCHOTIWITTHAYA; MANOSROI, 2005; RISCO et al.,
2003; SUNILA; KUTTAN, 2004; XU et al., 1999).
4.10 Avaliação biológica dos resultados e análise estatística
Os resultados da avaliação biológica foram apresentados como a média ±
erro padrão da média e o desvio padrão relativo (DPR%) para cada grupo de
experimentos. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida
76
pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnett, quando
apropriado. Valores de p<0,05 foram considerados indicativos de significância.
77
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE
Trabalhos realizados por pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI (LOBATO;
2014; SANTOS, 2013) desenvolveram e validaram um método por CLAE para
quantificação dos extratos etanólicos das folhas de P. aduncum, usando a
dihidrochalcona DHC como marcador, por ser este um composto majoritário no
extrato.
No presente estudo, por envolver somente a análise da DHC isolada, buscou-
se diminuir o tempo de análise por meio de modificações no método citado acima.
As diferentes condições de análise testadas estão apresentadas no Apêndice A.
A partir dos testes de reprodutibilidade do método desenvolvido por Lobato
(2014), nomeado como método A (Figura 19a), foi testado um método B (Figura
19b), com mudanças na temperatura do forno de 35 ºC para 40 ºC e mantendo o
fluxo de 0,8 mL/min. Com o método B, foi obtido redução no tempo de retenção da
DHC de 21,55 min para 18,86 min.
Como o método B reduziu o tempo de retenção da DHC sem influenciar na
área da amostra, foi reduzido o tempo total de corrida de 65 para 35 min a 35 °C,
usando fluxo de 0,8 mL/min (Método C, Figura 19c) e 1,0 mL/min (Método D, Figura
19d). As análises com fluxo 0,8 e 1,0 mL/min apresentaram tempos de retenção da
DHC de 19,20 e 16,59 min, respectivamente.
Alterações na concentração de acetonitrila, em 20 min de corrida com fluxo de
0,8 mL/min (Método E, Figura 19e) e 1,0 mL/min (Método F, Figura 19f) reduziu o
tempo de corrida para 13,20 e 10,90 min, respectivamente.
Também foram testadas alterações na concentração de metanol, em 25 min
de corrida com fluxo de 0,8 mL/min (Método G, Figura 20a) e 1,0 mL/min (Método H,
Figura 20b). Foi obtido tempo de retenção de 22,66 e 20,16 min da DHC com os
métodos G e H, respectivamente.
78
Figura 19 - (a) Cromatograma de DHC usando Método A com TR de 21,55 min; (b) Cromatograma de DHC usando Método B com TR de 18,86 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método C com TR de 19,20 min; (d) Cromatograma de DHC usando o Método D com TR de 16,59 min; (e) Cromatograma de DHC usando o Método E com TR de 13,20 min; (f) Cromatograma de DHC usando o Método F com TR de 10,90 min.
(a) Método A
(b) Método B
(c) Método C
(d) Método D
(e) Método E
(f) Método F
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
mA
U
0
200
400
600
800
mA
U
0
200
400
600
800
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
mA
U
0
200
400
600
800
mA
U
0
200
400
600
800
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
mA
U
0
200
400
600
800
1000
mA
U
0
200
400
600
800
1000
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
1000
mA
U
0
200
400
600
800
1000
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
1000
mA
U
0
200
400
600
800
1000
79
Figura 20 - (a) Cromatograma de DHC usando o Método G com TR de 22,66 min; (b) Cromatograma de DHC usando o Método H com TR de 20,16 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método I com TR de 14,41 min.
(a) Método G
(b) Método H
(c) Método I
No método I foi testada uma adaptação do método C com a redução do
tempo de corrida de 35 para 15 min e o fluxo de 0,8 mL/min, devido esse fluxo
apresentar maior área de amostra (método I – Figura 20c). A DHC apresentou um
tempo de retenção de 14,41 min, muito próximo do fim da análise de 15 min.
Também foram testados 3 métodos em modo isocrático, com tempo de
corrida de 15 min e temperatura de 35 °C: Método J - Metanol:ACN:água acidificada
pH (80:10:10) com fluxo de 0,8 mL/min; Método K - Metanol:ACN:água acidificada
pH (80:10:10) com fluxo de 1,0 mL/min; Método L - Metanol:ACN:água acidificada
pH (75:10:15) com fluxo de 0,8 mL/min; Método M - Metanol:ACN:água acidificada
pH (70:10:20) com fluxo de 0,8 mL/min. A DHC apresentou tempo de retenção de
Minutes
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
Minutes
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
1000
mA
U
0
200
400
600
800
1000
80
8,35 min para MeOH 80% (Figura 21a), de 5,18 min para MeOH 75% (Figura 21b) e
de 8,04 min para MeOH 70% (Figura 21c).
De todos os métodos e variáveis analisadas, o método L com MeOH 75%
apresentou um pico simétrico, tempo de retenção significativamente reduzido - 5 min
para a DHC e tempo total de corrida de 15 min, quando comparado com o método A
que apresentou tempo de retenção de 21,55 min para a DHC, tendo 65 min de
corrida. O método L foi escolhido para continuar os estudos de validação da
metodologia para quantificação da DHC por CLAE.
Figura 21 - (a) Cromatograma de DHC usando o Método J (Metanol 80%) com TR de 8,35 min; (b) Cromatograma de DHC usando o Método L (Metanol 75%) com TR de 5,18 min; (c) Cromatograma de DHC usando o Método M (Metanol 70%) com TR de 8,04 min. (a) Método J
(b) Método L
(c) Método M
O espectro de ultravioleta da DHC obtido nas análises por CLAE está
apresentado na Figura 22. No espectro no UV foram observados 3 máximos de
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mA
U
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
mA
U
0
20
40
60
80
100
120
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
mA
U
0
200
400
600
800
81
absorção em 201, 230 e 285 nm. As análises foram realizadas em 285 nm, pois
comprimentos de onda na região de 200 nm são menos específicos por ser uma
região na qual os solventes também absorvem.
Figura 22 – Espectro de ultravioleta da DHC no UV.
5.1.1 Adequabilidade
Para a análise de adequabilidade, foram injetados seis replicatas da solução
de DHC a 10 µg/mL. Foi calculado o DPR da área de DHC e do tempo de retenção.
Para os valores de área de DHC foi obtido um DPR de 0,09% e para o tempo de
retenção, o DPR foi de 0,27% e fator de Tailing para simetria de pico de 1,2.
5.1.2 Estabilidade da solução de DHC
A estabilidade da solução de DHC em metanol foi analisada durante 48 h em
temperatura ambiente. Conforme apresentado na Tabela 1, a solução se manteve
estável durante 48 h. O valor de DPR para área o tempo de retenção e a
concentração de DHC foi inferior a 5%.
Tabela 1 – Resultados da análise de estabilidade da solução de DHC por CLAE
Tempo
(h)
Área
(DPR%)
Tempo de retenção
(min) (DPR%)
DHC
(µg/mL) (DPR%)
0 995727 (0,39) 4,95 (0,20) 9,80 (0,40)
12 990256 (0,11) 5,01 (0,08) 9,75 (0,11)
24 1018874 (0,29) 5,062 (0,18) 10,04 (0,30)
48 1044482 (0,55) 5,02 (0,33) 10,30 (0,56)
Média (DPR%) 1012335 (2,45) 5,01 (0,88) 9,97 (2,52)
82
5.1.3 Linearidade do método
A linearidade do método analítico para quantificação da DHC incorporado nos
CLN foi analisada pela obtenção da curva analítica da DHC usando concentrações
entre 1 e 30 µg/mL. Conforme apresentado na Figura 23, o método é linear de 1 a
30 µg/mL, com R2 de 0,9999. A curva foi obtida em triplicata e o valor de CV foi
inferior a 5% para todas as concentrações estudadas.
Figura 23 - Curva analítica da DHC, em 285 nm, usando método L, modo isocrático, por CLAE.
Para a obtenção de uma curva analítica com bom ajuste é necessário que
tenha uma distribuição de resíduos uniforme, sem amostras atípicas e
homocedástico. Como observado na Figura 24, a metodologia analítica apresentou
uma distribuição de resíduos uniforme na faixa de concentração de 1 a 30 µg/mL.
Figura 24 - Distribuição dos resíduos da curva de regressão.
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 5 10 15 20 25 30 35
UA
Concentração (ug/mL)
-20000
-15000
-10000
-5000
0
5000
10000
15000
20000
0 1000000 2000000 3000000 4000000
83
5.1.3 Especificidade
A especificidade do método analítico foi realizada ao analisar a presença de
picos nos cromatogramas de solventes usados no método: Metanol (MeOH),
Acetonitrila (ACN), água ultrapura e água ultrapura acidificada pH 3,5,
nanopartículas brancas, nanopartículas contendo DHC e somente DHC (Quadro 6).
Conforme apresentado na Figura 25, os cromatogramas demonstram que não
há presença de picos adicionais de solventes e excipientes das nanopartículas
brancas no tempo de retenção do padrão DHC, assim não interferindo na análise.
Figura 25 - Cromatogramas da análise de especificidade da metodologia analítica por CLAE para quantificação da DHC.
Solvente: Metanol
Solvente: Água ultrapura
Solvente: Água acidificada pH 3,5
Solvente: Acetonitrila
CLN branca
DHC
CLN-DHC
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
-3
-2
-1
0
1
2
3
mA
U
-3
-2
-1
0
1
2
31: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE METANOL
2015MAI30 ESPECIFICIDADE METANOL-Rep1
AreaRetention Time
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
-4
-2
0
2
4
6
mA
U
-4
-2
0
2
4
6
1: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE AGUA ULTRAPURA
2015MAI30 ESPECIFICIDADE AGUA ULTRAPURA-Rep1
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
-2
0
2
4
6
mA
U
-2
0
2
4
6
1: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE AGUA ACIDIFICADA AC FOSF
2015MAI30 ESPECIFICIDADE AGUA ACIDIFICADA AC FOSF-Rep1
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
-2
-1
0
1
2
mA
U
-2
-1
0
1
2
1: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE ACETONITRILA
2015MAI30 ESPECIFICIDADE ACETONITRILA-Rep1
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
-2
0
2
4
6
8
mA
U
-2
0
2
4
6
81: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE NANO BRANCA
2015MAI30 ESPECIFICIDADE NANO BRANCA-Rep1
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
200
400
600
800
1000
mA
U
0
200
400
600
800
1000
74
74
94
7
5.0
90
1: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE MYG
2015MAI30 ESPECIFICIDADE MYG-Rep1
AreaRetention Time
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
500
1000
1500
2000
2500
mA
U
0
500
1000
1500
2000
2500
15
50
19
55
5.10
8
1: 285 nm, 8 nm
2015MAI30 ESPECIFICIDADE NANOMYG
2015MAI30 ESPECIFICIDADE NANOMYG-Rep1
AreaRetention Time
84
5.1.4 Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ)
O LD é um teste analítico que indica a menor concentração do analito que
pode ser detectada no equipamento (RIBEIRO et al., 2008). O LD obtido para o
método foi de 0,74 µg/mL.
O LQ é um teste analítico que avalia a menor concentração que pode ser
quantificada pelo equipamento e manter os padrões de precisão e exatidão do
método (RIBEIRO et al., 2008). O LQ obtido para o método foi de 2,45 µg/mL.
5.1.5 Precisão intra-dia e inter-dia
Os resultados da análise de precisão da metodologia estão apresentados na
Tabela 2. O método desenvolvido demonstrou precisão inter- e intracorrida com DPR
inferior a 2% (BRASIL, 2003).
Tabela 2 - Resultados da análise de precisão da metodologia analítica para quantificação de DHC nos CLN por CLAE.
Repetibilidade
DHC
µg/mL
Dia 1 Dia 2
Area s DPR % Area s DPR %
10 723504 1041,97 0,14 724404 865,21 0,12
10 723077 137,20 0,02 735541 911,31 0,12
10 728103 577,79 0,08 719892 1041,10 0,14
10 719201 2291,45 0,32 736385 1301,34 0,18
10 711428 2038,55 0,29 718075 1596,75 0,22
10 729817 2016,14 0,28 733280 1055,11 0,14
Média 722522 6366, 37 0,88 727930 7717,83 1,06
Precisão intermediária
Média 725226 7492,56 1,03
5.1.6 Exatidão
A exatidão do método foi avaliada em 3 níveis de concentração (alto, médio,
baixo) com adição de solução de DHC na dispersão de CLN. Também foram
analisadas amostras de dispersão de CLN sem adição de DHC da solução de DHC
(sem CLN). Os resultados da análise de exatidão estão representados na Tabela 3.
85
A recuperação foi de 94,63%, 96,40% e 91,42% para os níveis baixo, médio-alvo e
alto, respectivamente. Não houve detecção de picos de DHC entre 4 e 7 min para a
análise da CLN branca sem adição DHC. A recuperação da solução de DHC a 10
µg/mL foi de 98,20%. Para a dispersão de CLN-DHC (concentração teórica de DHC
igual a 0,035%), baseado nos critérios estabelecidos por Huber (2001), a
recuperação média esperada deve ficar entre 90-107%. Para todas as análises o
valor de DPR foi inferior a 5% e com recuperação média dentro da faixa esperada,
mostrando que o método apresenta boa recuperação e exatidão (HUBER, 2001).
Tabela 3 - Resultados da análise de exatidão e recuperação da DHC na presença de carreadores lipídicos nanoestruturados por CLAE
Concentração teórica de
DHC (µg/mL) DHC
(µg/mL) Recuperação (%) DPR (%)
- - - -
8 7,57 94,63 0,08
10 9,64 96,40 0,04
12 10,97 91,42 0,25
10 9,82 98,20 0,09
5.1.8 Robustez
A solução de DHC preparada a 10 µg/mL foi testada frente a variáveis no pH
da água ultrapura acidificada (solvente da eluição), no fluxo de corrida e na
temperatura de forno para ser analisado a robustez do método analítico
desenvolvido. Os resultados da análise de robustez da corrida cromatográfica estão
representados na Tabela 4.
Nos perfis cromatográficos das corridas da DHC com a mudança do pH da
água ultrapura acidificada, não houve mudanças significativas no tempo de retenção
da amostra e apresentou um DPR < 5%.
Nas corridas com mudança no fluxo do solvente, pode ser observada uma
mudança no tempo de retenção. Há uma tendência de diminuição no tempo de
retenção com o aumento do fluxo da fase móvel. Essa variável também influenciou
na área resultante, com diminuição da área nos maiores fluxos. A influência do fluxo
da fase móvel já observada anteriormente no desenvolvimento do métodos (Figura
18). O DPR% para mudança de fluxo foi superior a 2,0% e o teor de DHC nas
86
amostras nessa condição apresentou um DPR ≥ 5,0%, significando que o método
não é robusto para a mudança de fluxo da fase móvel.
Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método para quantificação de DHC de acordo com modificações no pH da água acidificada; fluxo da fase móvel e temperatura de forno
Parâmetros
Tempo de
retenção
(DPR%)
Área (DPR%) DHC
µg/mL (DPR%)
pH água
acidificada
3,40 5,28 (0,13) 2168709 (1,50) 9,68 (1,58)
3,50 5,28 (0,17) 1946541 (1,69) 8,59 (1,79)
3,60 5,33 (0,17) 2003819 (2,92) 8,85 (3,08)
DPR% 0,58 5,65 0,76
Fcal/Fcrit 21,94 11,64 11,64
Fluxo (mL/min)
0,9 5,94 (0,40) 2024698 (3,60) 8,95 (3,80)
1,0 5,32 (0,36) 1800422 (2,02) 7,91 (2,15)
1,1 4,90 (0,34) 1650582 (4,83) 7,21 (5,15)
DPR% 9,66 10,31 10,92
Fcal/Fcrit 1082,63 13,31 13,31
Temperatura de
forno (ºC)
34 5,34 (0,25) 1841917 (0,57) 8,10 (0,61)
35 5,31 (0,43) 1801643 (5,73) 7,91 (6,07)
36 5,27 (0,26) 1878573 (4,45) 8,27 (4,70)
DPR% 0,65 2,09 2,81
Fcal/Fcrit 6,48 0,41 0,41
Para a análise de mudança de temperatura do forno, onde está presente a
coluna cromatográfica, não foram observadas mudanças significativas no tempo de
retenção da amostra. O DPR das áreas foi inferior a 2,0%. O teor de DHC nessa
condição apresentou DRP ≤ 5,0%. Com base nesses dados, pode-se afirmar que o
método é robusto frente a mudanças de pH da água ultrapura acidificada e a
mudanças de temperatura do forno.
Analisando estatisticamente as condições do ensaio, o F calculado foi
superior ao F crítico (Fcalculado > Fcrítico), significando que pelo menos uma média das
condições é diferente, mas sem influenciar na robustez da fase móvel e temperatura
de forno.
87
5.2 Isolamento da DHC
O isolamento da DHC foi realizado inicialmente a partir de 7,549 g de
extratos de P. aduncum. A eluição ocorreu com os solventes Hexano:Acetato de etila
(9:1 até 5:5). O isolamento dos compostos foi acompanhado por cromatografia em
camada delgada (CCD) sendo a fase móvel 7:3, a polaridade ideal para identificar a
DHC no terço intermediário da cromatoplaca.
O perfil químico por CCD das frações com maior concentração do composto
é apresentado na Figura 26a. A DHC pura está representada como mancha
alaranjada (Figura 26b) na placa de CCD (Rf 0,54), após processo de purificação da
fração com hexano:acetato de etila.
O fitocomposto foi isolado após a segunda coluna de separação e lavagens
com hexano e acetato de etila. A Figura 27 apresenta o fluxograma do isolamento e
o rendimento obtido em cada etapa.
Figura 26 - Cromatografia em camada delgada do padrão e frações contendo DHC de extratos de P. aduncum. (a) CCD das frações com maior concentração do composto e (b) DHC pura representada como mancha laranja.
Nota: Fase móvel 70:30 Hexano:Acetato de Etila após revelação com solução de anisaldeido sulfúrico a quente. (a) Amostra referência de DHC e frações coletadas contendo DHC; (b) Visualização da placa de CCD da DHC isolada (+) e a água mãe da lavagem do processo de isolamento (-).
Na primeira coluna PA-1, a DHC foi extraída junto com outros compostos nas
frações de 71-92 (Hex:Ac 75:25); 93-116 (Hex:Ac 70:30); 117-152 (Hex:Ac 65:35) e
153-161 (Hex:Ac 60:40). O rendimento dessas frações impuras foi de 4,2852 g.
DH 86 87 88 + -
(a) (b)
88
A segunda coluna PA-2 foi realizada a partir da junção das frações eluídas da
coluna PA-1 que continham a DHC impura. Para a purificação da DHC foi necessário
sucessivas lavagens com Hexano:Acetato de Etila 8:2. O rendimento final de DHC
foi de 0,7202 g representanto 9,54% do extrato inicial.
Figura 27 - Fluxograma da extração da DHC por cromatografia líquida a partir de extratos das folhas de P. aduncum, usando como fase móvel Hexano:acetato de etila.
Extrato das folhas de Piper aduncum
1ª Coluna cromatográfica
Fase móvel 75-25 Frações 71-80
Fase móvel 70-30 Frações 81-111
Fase móvel 65-35 Frações 112-151
Fase móvel 60-40 Frações 152-161
611,5 mg 2186,0 mg 1309,9 mg 117,8 mg
2ª Coluna cromatográfica
Fase móvel 85-15 Frações 42-51
Fase móvel 80-20 Frações 52-74
Fase móvel 75-25 Frações 75-82
552,4 mg
Frações 75-82 (Água-mãe)
167,8 mg
89
5.3 Caracterização da DHC
5.3.1 Solubilidade
A solubilidade da DHC foi determinada nos solventes usados nos métodos
analíticos. Segundo os critérios da Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), a DHC é
praticamente insolúvel ou insolúvel em água e hexano, ligeiramente solúvel em
acetato de etila, acetonitrila e metanol e solúvel em acetona.
5.3.2 Análise térmica
O perfil térmico da DHC foi analisado por calorimetria exploratória diferencial
(DSC) e análise termogravimétrica (TG) (Figura 28). A DHC apresentou início da
fusão em 166,4 ºC e ponto de fusão em 170,1 ºC, caracterizado pelo evento
endotérmico no perfil por DSC.
.
Figura 28 - Análise do perfil térmico da DCH por DSC e TG em rampa de aquecimento de 1 ºC/min, em atmosfera de nitrogênio.
A perda de massa da DHC é caracterizada pela análise por TG (Figura 28).
Foi observada uma perda de massa gradual com início em 241,1 °C, com ponto
médio de 264,2 °C e final da curva em 285,4 °C com 71,79% de perda de massa. Na
temperatura de 450 °C a massa residual foi de 16,10%. A análise calorimétrica
mostrou que o composto possui um evento de fusão bem definido e, que mesmo
após fusão, o composto permanece estável, sofrendo degradação térmica somente
acima de 240 °C.
DSC
TG
90
5.3.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Para fins de caracterização e auxílio na identificação da estrutura da DHC
foram realizadas análises de RMN de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13 (RMN 13C).
Analisando o RMN de 1H (Figura 29 e 30), observa-se dois tripletos nas regiões de δ
3,40 e δ 2,97, atribuídos aos metilenos α e β adjacentes a carbonila; um multipleto
entre δ 7,17-7,27, característico dos hidrogênios aromáticos do anel A (tetra
substituído).
O sinal em δ 3,78 com integral para 3H é referente ao hidrogênio do grupo
metóxi (-OCH3). O sinal de δ 11,88 refere-se a um grupo hidroxila (-OH). O simpleto
em δ 5,99 com integral para 2H refere-se a um grupo aromático monossubstituído
com grupamento alquila como observado no anel B (Figura 16). Os dois hidrogênios
apresentam o mesmo deslocamento químico devido à simetria. Na tabela 5 estão
apresentados os dados de RMN obtidos para a DHC, assim como os dados que
constam na literatura para esta dihidrochalcona.
Tabela 5 - Dados de RMN de 1H (300 MHz, Acetona D6) e RMN de
13C (75,5 MHz, Acetona D6) e
dados da literatura para a 2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona.
2’,6’-dihidroxi-4’-metóxidihidrochalcona (DHC) Dados da literatura1 Nº Carbono δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)
1 - 142,93 - 141,5
2/6 - 129,39 - 128,3
3/5 5,99 (2H; s) 129,26 5,93 (2H; s) 128,5
4 - 126,74 - 125,9
α 3,40 (2H; m) 46,56 3,39 (2H; m) 45,5
β 2,97 (2H; m) 31,38 3,02 (2H; m) 30,5
C=O - 205,65 - 204,5
1’ - 105,76 - 104,7
2’/6’ 7,27 (2H; m) 165,26 7,19 (2H; m) 165,5
3’/5’ 7,26 (2H; m) 94,45 7,31 (2H; m) 94,3
4’ 7,17 (1H; m) 167,00 7,19 (1H; m) 165,5
OCH3 3,78 (3H; s) 55,90 3,79 (3H. s) 55,4
OH 11,88 - - - 1Fonte: Hermoso et al. (2003).
91
Figura 29 - Espectro de RMN 1H
(acetona d6, 300 MHz) da DHC.
Figura 30 - Espectro de RMN 1H
ampliado (acetona d6, 300 MHz) da DHC.
92
No espectro de RMN 13C (Figura 31), são encontrados sinais em δ 31,38 e δ
46,56, referentes aos carbonos metilenos Cα e Cβ. Em δ 55,90 encontra-se o sinal
do carbono do grupo metóxi (OCH3). Em δ 94,45, δ 105,76, δ 126,74, δ 165,26 e δ
167,00 estão os sinais dos carbonos do anel aromático A (C3’/5’; C1’; C2’/6’ e C4’,
respectivamente). Em δ 126,74, δ 129,26, δ 129,39 e δ 142,93, estão ossinais dos
carbonos de anel aromático B monossubstituído (C4, C3/5, C2/6 e C1) e em δ
205,65 encontra-se o sinal do carbono da cetonas (-C=O). Os deslocamentos de
RMN 13C estão apresentados na tabela 5. Os sinais obtidos no RMN 1H e 13C estão
de acordo com estudos realizados por Hermoso e colaboradores (2003).
Figura 31 - Espectro de RMN 13
C (acetona d6, 75,5 MHz) da DHC.
5.3.4 Cromatografia a gás/Espectro de massas
O cromatograma da amostra de DHC por CG/MS e o espectro de massas do
composto são apresentados nas Figuras 32 e 33, respectivamente. No espectro de
massas foi observada a presença de fragmentos de m/z 167 referente a
93
fragmentação do anel A com a carbonila (Ar-C=O+); fragmento de m/z140 referente
ao anel A (Ar-OH, -OH, -OCH3); fragmento de m/z 91 referente ao íon ropilio;
fragmento m/z 237 (M-18) referente à saída de uma hidroxila como água. O íon
molecular da DHC é de 272 m/z. O resumo das fragmentações pode ser observado
na Figura 34.
Figura 32 - Cromatograma por CG/MS da DHC dissolvida em DMSO.
Figura 33 - Análise por espectrometria de massas da DHC por CG/MS.
94
Figura 34 - Fragmentações da DHC por CG/MS dissolvida em DMSO.
140 m/z
167 m/z
H
H
OH
H
O
H
CH3
124 m/z
91 m/z
+
+
65 m/zM+ 272 m/z
77 m/z
M = 256 m/z
O
OCH3
OH
OH
O H
OH O
CH3
OH
O+
O OH
H
H
CH3
DHC
OHOCH3
H
OH
HH
+
+
++.
.
5.3.5 Espectroscopia no Infravermelho
O espectro de absorção no infravermelho (IV) da DHC (Figura 35) apresenta
banda de absorção máxima em 3257,77 cm-1 referente a deformação axial do
grupamento OH. Em 3082,25 cm-1 há banda referente a deformação axial do grupo
Csp2H de aromático. Em 3022,45 cm-1 há a presença de uma banda referente a
deformação axial do grupo Csp3-H de alcano. Em 1645,28 cm-1 é observada a
presença de uma banda de deformação axial C=O de aril cetona. Em 1427,32 cm-1
1440,83 cm-1, 1525,69 cm-1, 1629,85 cm-1 foi observada a presença de m bandas de
deformação axial C=C de aromático. Em 1593,20 cm-1 há a presença de uma banda
de deformação axial de C=C de alceno. Em 1465,90 cm-1 há a presença de uma
banda representativa de deformação angular CH2 de alcano. Em 1301,95 e 1080,14
cm-1 há presença de duas bandas de deformação axial C-O de aril-alquil-eter. Em
615,29 e 750,31 cm-1 há duas bandas de deformação angular C-H de aromático
monossubstituído. Em 700,16 e 812,03 cm-1 há presença de duas bandas de
deformação angular de aromático tetrasubstituido.
95
Figura 35 - Espectro no infravermelho da DHC, em pastilha de KBr.
5.3.6 Análise de pureza
A análise da pureza da DHC foi derminada por DSC, CLAE e espectroscopia
de massas. Conforme observado na Figura 36, na análise das informações de
comportamento de fusão na análise calorimétrica por DSC, usando a equação de
Van’t Hoff e considerando a massa molecular de 272 g/mol, a pureza foi quantificada
em 100%, ou seja, o composto isolado possui pureza maior que 99,99%.
Na análise da pureza da DHC por CLAE, a pureza do composto também pode
ser considerada >99,99%, pois no cromatograma não foram observados picos de
impureza além do próprio pico da DHC, como representado na Figura 37.
A pureza da DHC também foi confirmada por CG/MS. Conforme apresentado
na Figura 32, o cromatograma da solução do composto apresenta um pico simétrico
em 8,23 min, indicando a pureza da amostra.
96
Figura 36 - Análise da pureza da DHC por DSC.
Figura 37 - Análise da pureza da DHC por CLAE.
5.4 Estudos de pré-formulação dos CLN
5.4.1 Solubilidade da DHC nos excipientes
Nos estudos de pré-formulação foi analisada a solubilidade da DHC na
presença de diferentes lipídios sólidos, óleos e tensoativos buscando selecionar os
excipientes e conhecer a quantidade necessária de cada excipiente para obter DHC
dissolvido e incorporado nas nanopartículas lipídicas (NLS e CLN). Conforme
apresentado na Tabela 6, a DHC possui maior solubilidade no P80, seguido dos
óleos e lipídios sólidos. O resultado de solubilidade foi um dos parâmetros para
escolha dos excipientes, porém não o principal. Fatores como compatibilidade,
disponibilidade e custo também foram considerados.
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mA
U
0
25
50
75
100
125
150
mA
U
0
25
50
75
100
125
150
5.1
86
91
66
50
1.2
9
10
0.0
0
3: 285 nm, 8 nm
2014Mar11 MyG 10 ugmL MeOH 75
2014Mar11 MyG 10 ugmL MeOH 75-Rep1
Retention TimeAreaAsymmetryArea Percent
97
Tabela 6 – Resultados de solubilidade da DHC nos diferentes excipientes dos CLN.
Excipientes Solubilidade (m/m)
Lipídios
Ácido esteárico 350
Dibehenato de glicerila 450
Monoestearato de Glicerila 350
Óleos
Monocaprilato de propilenoglicol 200
Miristato de Isopropila 200
Triglicerídeos de Ácido Cáprico-caprílico 300
Tensoativos
Propilenoglicol 350
Polissorbato 80 150
Óleo de ricino polietoxilado hidrogenado 250
5.4.2 Estudos de compatibilidade entre DHC e excipientes
A análise de compatibilidade por comportamento térmico dos excipientes
puros e misturados com DHC foi analisada por DSC/TG. As análises por calorimetria
permitem avaliar possíveis interações entre excipientes e ativo, presença de
degradação do ativo e excipiente, interação ativo-excipiente, analisar se houve
dissolução de DHC na mistura binária, se há presença do DHC no estado cristalino
ou amorfo nas misturas binárias de solubilidade e mistura física.
Neste estudo foram avaliados: (a) DHC separadamente, (b) excipiente, (c)
uma mistura de excipiente:DHC com proporção para a dissolução completa da DHC
e (d) uma mistura física 1:20 (DHC:Excipiente) sem dissolução dos componentes.
Na Figura 38 está apresentado o perfil térmico do dibehenato de glicerila
(DBG) com a DHC dissolvida. O evento endotérmico no perfil por DSC representa o
ponto de fusão do lipídio em 76,9 ºC. O lipídio sofre degradação com perda de
massa em aproximadamente 421,4 ºC, e não apresenta uma massa residual após a
corrida, conforme observado por TG. Isto significa que praticamente toda amostra foi
degradada no final da análise. DBG apresentou uma diferença de temperatura do
ponto de fusão até o início da perda de massa de 403,6 ºC e perda de massa final
em 448 ºC, indicativo de estabilidade do lipídio em relação ao ensaio térmico. No
perfil térmico por DSC foi observado um segundo evento endotérmico, que pode
estar relacionado com a degradação do composto. A massa residual do DBG foi de
3,03%. O perfil térmico de DHC:DBG dos ensaios de solubilidade e a mistura física
de DHC:DBG, que foram misturados sem aquecimento ou dissolução prévio, mostra
98
que apresentaram perfis semelhantes de comportamento térmico, e não há presença
do evento endotérmico do DHC, significando que a fusão do lipídio auxiliou na
dissolução do DHC, mesmo na mistura física.
Figura 38 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) DBG, (c) DHC dissolvida em DBG e (d) mistura física de DHC: DBG em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) DBG
(c) DHC:DBG solubilidade
(d) DHC:DBG mistura física
Na Figura 39 está apresentado o perfil térmico do lipídio monoestearato de
glicerila (MEG) com a DHC dissolvida dos ensaios de solubilidade e a mistura física,
ambas as amostras foram comparadas com o DHC. Na análise térmica do MEG por
DSC e TG, é observado um evento térmico endotérmico em 67,2 ºC, representando
o ponto de fusão do lipídio. Em aproximadamente 393,3 a 467,8 ºC é observado um
evento térmico que pode ser representativo da decomposição do material. Por TG, a
perda da massa do MEG é observada em 405,9 ºC até 443,2 ºC e com massa
residual de 1,11%.
Analisando os termogramas das misturas binárias, são observados eventos
endotérmicos na região de 60 ºC representando o ponto de fusão do MEG. No perfil
térmico por TG, observa-se a perda da massa do lipídio que inicia em 403,7 ºC. A
perda da massa em temperatura superior a 400 ºC demonstram que o lipídio tem
boa estabilidade frente ao calor. No final da análise em 500 ºC houve uma massa
99
residual de 0,81%. Ambos os perfis térmicos de DHC:MEG tanto do produto dos
ensaios de solubilidade como da mistura física apresentaram perfis térmicos
semelhantes com eventos endotérmicos característicos do lipídico, sem traços do
evento endotérmico do DHC. Isso é indício que DHC pode estar dissolvido e
incorporado no lipídio, por isso não apresentou evento térmico, não indicando
necessariamente que houve incompatibilidade.
Figura 39 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MEG, (c) DHC dissolvida em MEG e (d) mistura física de DHC: MEG em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) MEG
(c) DHC: MEG solubilidade
(d) DHC: MEG mistura física
Na Figura 40, são analisadas as análises térmicas do DHC, AE e misturas
binárias dos compostos provenientes de ensaios de solubilidade e análise da
mistura física dos materiais. No termograma do DSC, é observado um evento
térmico endotérmico em 59 ºC, representando o ponto de fusão do lipídio. Em
aproximadamente 266 ºC até 310,2 ºC, há um evento térmico podendo representar o
início da degradação do material. Por análise da linha do TG, há início da perda de
massa em 260,4 ºC, ocorrendo até 302 ºC, com massa residual de 3,76% no final da
corrida.
100
Observando as misturas binárias (c) e (d), há a presença de evento térmico
em 62,9 ºC representando o ponto de fusão do ácido esteárico na mistura com DHC
dissolvida ou mistura física. Foi possível observar um segundo evento endotérmico,
que está relacionado à degradação do material. Também foi observado o
comportamento termogravimétrico do lipídio. O ácido esteárico (AE) teve início de
perda de massa em aproximadamente 288,7 ºC, juntamente com um evento
endotérmico caracterizado pelo DSC, indicando a degradação do AE. AE apresentou
uma massa residual de 1,72% no final da análise. Ambos os perfis térmicos
apresentaram comportamento térmico semelhante com eventos térmicos em
temperaturas aproximadas. Após o ensaio de solubilidade, foram observados
mudança na coloração de branco para alaranjado suave da mistura binária DHC:AE,
indicando incompatibilidade entre os compostos, embora não observadas alterações
no comportamento térmico.
Figura 40 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) AE, (c) DHC dissolvida em AE e (d) mistura física de DHC: AE em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) AE
(c) DHC:AE solubilidade
(d) DHC:AE mistura física
101
Na Figura 41 a 43 estão demonstrados os perfis térmicos das misturas de
DHC dissolvida nos óleos: monocaprilato de glicerila (MCG), miristato de isopropila
(MIP) e triglicérides de ácido cáprico-caprílico (TAC). Como as matérias-primas são
óleos, eles não apresentaram evento térmico de fusão.
Na Figura 41 está apresentado o perfil térmico do MCG e sua mistura binária
com DHC. O MCG apresenta um evento térmico endotérmico em 33,5 até 167,5ºC e
outro evento térmico em 191,4 ºC até 499 ºC. O primeiro evento térmico é
comumente observado em óleos, visto que óleos não apresentam ponto de fusão,
por estar em estado líquido, o evento endotérmico não é representado em forma de
pico. O segundo evento térmico pode estar relacionado a evaporação do material
devido à alta temperatura. Por TG, é observado o início da perda de massa em
197,4 ºC até o final da perda de massa em 223,2 ºC. A massa residual do MCG foi
de 1,0%.
Na mistura binária de MCG onde se observa um evento endotérmico na
região de 79,2 a 200 ºC, caracterizando a perda do material e na região de 237,2 ºC
há a presença de um segundo evento endotérmico logo após a queda endotérmica
da perda de massa do material acima de 200 ºC, possivelmente relacionado à
evaporação do óleo. Não há presença do evento endotérmico na região de 170 ºC
relacionado ao ponto de fusão de DHC, indicando que o fitocomposto pode estar
dissolvido no óleo.
102
Figura 41 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MCG, (c) DHC dissolvida em MCG e (d) mistura física de DHC: MCG em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) MCG
c) DHC:MCG solubilidade
(d) DHC:MCG mistura física
O perfil térmico do MIP e suas misturas binárias com DHC estão
representados na Figura 42. O óleo MIP apresenta um único evento térmico que
inicia em 205,4 ºC e vai até 218,9 ºC, demonstrando o momento que o material inicia
sua evaporação. Na análise termogravimétrica do material, a perda do material inicia
em aproximadamente em 191 ºC e continua até 216 ºC, acompanhando o evento
térmico observado pela análise do DSC. A massa residual do MIP foi de 6,16%. A
análise térmica da mistura binária do óleo apresenta um grande evento endotérmico
em aproximadamente 50 ºC até 200 ºC, característico de óleos. A perda de massa
do MIP inicia-se em aproximadamente 200 ºC e finaliza em 265 ºC.
103
Figura 42 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) MIP, (c) DHC dissolvida em MIP e (d) mistura física de DHC: MIP em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) MIP
(c) DHC:MIP solubilidade
(d) DHC:MIP mistura física
A Figura 43 está representando o perfil térmico do TAC e suas misturas
binárias com DHC. O óleo TAC apresenta evento térmico endotérmico na região de
24,9 ºC até 340,7ºC, esse evento é observado normalmente em óleos. Outros
eventos térmicos observados por DSC são encontrados em 357,8 a 416,6ºC e 416,7
até 499 ºC, representando a perda do material e possivelmente a formação de
produtos de degradação. Na análise térmica por TG, é observado a perda de massa
do óleo em 366,4 ºC até 407,8 ºC, acompanhando a linha de DSC representando a
evaporação do material e perda de massa da amostra. A massa residual do TAC
após a análise de 500 ºC foi de 0,02%.
Na região de 83,6 a 325 ºC há um amplo evento endotérmico, característico
de óleos. Pela análise termogravimétrica do TAC, na região de 260 ºC é observado o
início da perda de massa da matéria-prima, juntamento com um segundo evento
endotérmico representando pelo DSC, com degradação do material até
aproximadamente 402,4 ºC.
104
Figura 43 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) TAC, (c) DHC dissolvida em TAC e (d) mistura física de DHC: TAC em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) TAC
(c) DHC:TAC solubilidade
(d) DHC:TAC mistura física
Como os três materiais analisados são óleos, todos apresentaram um perfil
térmico semelhante, com grandes eventos térmicos e característicos dessa classe
de excipientes. Para todos os óleos não houve a presença de evento endotérmico
característico de fusão que está presente no perfil da DHC na região de 170 ºC,
indicando que o ativo pode ter dissolvido nos óleos durante o ensaio.
A Figura 44 e 45 apresenta o perfil térmico do tensoativo óleo de ricino
etoxilado hidrogenado (ORE) e polissorbato 80 (P80).
O P80 apresentou amplo evento térmico entre 50 ºC e 350 ºC, esse
comportamento foi visualizado em ambos perfis térmicos (DHC:P80 mistura física e
DHC:P80 solubilidade). A perda de massa pela análise termogravimétrica iniciou em
aproximadamente 375 ºC e finalizou em 450 ºC, juntamente com o segundo evento
térmico caracterizado pelo DSC, indicando a degradação do material nessa
temperatura.
105
Figura 44 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) P80, (c) DHC dissolvido em P80 e (d) mistura física de DHC: P80 em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) P80
(c) DHC:P80 solubilidade
(d) DHC:P80 mistura física
Figura 45 - Análise do perfil térmico da (a) DHC isolado, (b) ORE, (c) DHC dissolvida em ORE e (d) mistura física de DHC:ORE em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
(a) DHC
(b) ORE
(c) DHC:ORE solubilidade
(d) DHC:ORE mistura física
A análise térmica do ORE foi feita somente para o produto do ensaio de
solubilidade (DHC:ORE solubilidade). Entre 50 a 150 ºC há um amplo evento
106
endotérmico. O primeiro evento endotérmico está relacionado à perda do material. A
perda da massa do ORE começa inicialmente em 350 ºC, junto com outro evento
térmico caracterizado pelo DSC, seguido de uma grande perda em
aproximadamente 400 ºC e finalizando em aproximadamente 425 ºC, possivelmente
relacionada à degradação do material.
5.5 Desenvolvimento das CLN
Os sistemas lipídicos foram desenvolvidos a partir dos estudos prévios sobre
NLS realizados em nosso laboratório por Silva, Silva e Lucinda-Silva (2013). Foram
desenvolvidas formulações com e sem lipídio líquido, ou seja, do tipo NLS e CLN.
Os sistemas obtidos foram acondicionados em diferentes temperaturas - geladeira e
ambiente – e em frascos de vidro âmbar, a fim de determinar a formulação com
maior estabilidade física e físico-química por meio da determinação do tamanho de
partícula, potencial zeta e índice de polidispersão.
Devido ao ácido esteárico e propilenoglicol apresentarem inadequabilidade
nos testes de solubilidade com a DHC, os dois componentes não foram utilizados
para os testes de desenvolvimento das nanopartículas lipídicas.
Foram desenvolvidas formulações contendo somente MEG e somente DBG
como lipídio principal. As formulações são apresentadas no Quadro 10.
Os CLN desenvolvidos com o lipídio MEG foram avaliadas em: 0 a 7 dias e 14
dias em relação ao tamanho de partícula, índice de polidispersão (PDI) e potencial
zeta (PZ), quando armazenadas em temperatura ambiente e geladeira. Os
resultados são apresentados nas Figuras 46 a 51 e no Apêndice B.
Como o MEG possui propriedade de emulsionante, também foram
pesquisados formulações sem tensoativos para comparação. As formulações
contendo MEG (Figura 46 e 47) apresentaram aspecto de emulsão, com cor branca
e leitosa ao longo do ensaio. Essa mudança de aspecto variou de horas para 2 a 3
dias após o preparo, dependendo da formulação. Na Figura 44a, foi observada uma
tendência para a elevação do PDI e o mesmo comportamento de PZ ao longo dos
14 dias para as formulações. Não houve muita diferença no tamanho de partículas
das formulações armazenadas em geladeira e em temperatura ambiente. O estudo
de acondicionamento em diferentes temperaturas, como temperatura ambiente e
geladeira, foi baseado nos estudos de Freitas e Muller (1999) que estudaram a
107
influência desses fatores mais a incidência de luz em relação à estabilidade das
nanopartículas. O PDI das formulações apresentou resultados aproximadamente ou
igual a 1,0 (indicando sistema heterogêneo e polidisperso com diversos tamanhos
de partículas), indicando que o sistema foi instável tanto para armazenamento em
temperatura ambiente como geladeira. No final do estudo de 14 dias, o aspecto
visual de muitas formulações apresentou grumos e separação de fases. Na análise
microscópica, todas as formulações apresentaram aglomerações de partículas no
final de 14 dias.
108
Figura 46 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo MEG e ORE em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN em geladeira.
(a)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícu
la (
nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice
de
po
lid
isp
ers
ão
(n
m)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
MEG-O
MEG-O-MCP
MEG-O-TAC
MEG-O-MIP
PDI MEG-O
PDI MEG-O-MCP
PDI MEG-O-TAC
PDI MEG-O-MIP
(b)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
MEG-O
MEG-O-MCP
MEG-O-TAC
MEG-O-MIP
(c)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Tam
an
ho
de
pa
rtíc
ula
(nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olidis
pe
rsão
(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
MEG-O
MEG-O-MCP
MEG-O-TAC
MEG-O-MIP
PDI MEG-O
PDI MEG-O-MCP
PDI MEG-O-TAC
PDI MEG-O-MIP
(d)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Pote
ncia
l zeta
(m
V)
-40
-30
-20
-10
0
MEG-O
MEG-O-MCP
MEG-O-TAC
MEG-O-MIP
109
Figura 47 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo MEG e P80 em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta das CLN em geladeira
(a)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Tam
an
ho
de
pa
rtíc
ula
(nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olidis
pe
rsão
(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
MEG-P
MEG-P-MCP
MEG-P-TAC
MEG-P-MIP
PDI MEG-P
PDI MEG-P-MCP
PDI MEG-P-TAC
PDI MEG-P-MIP
(b)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
MEG-P
MEG-P-MCP
MEG-P-TAC
MEG-P-MIP
(c)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Tam
an
ho
de
pa
rtíc
ula
(nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olidis
pe
rsão
(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
MEG-P
MEG-P-MCP
MEG-P-TAC
MEG-P-MIP
PDI MEG-P
PDI MEG-P-MCP
PDI MEG-P-TAC
PDI MEG-P-MIP
(d)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
MEG-P
MEG-P-MCP
MEG-P-TAC
MEG-P-MIP
Formulações contendo o tensoativo P80 apresentaram cristalização no fundo
do recipiente, separação de fases com precipitações de lipídios e cristais e aumento
de tamanho de partículas, tornando-as visíveis a observação direta, aglomeradas e
110
grosseiras, sendo indícios de instabilidade do sistema. A análise por espalhamento
de luz dinâmica pelo ZetaSizer mostrou que as partículas estavam aglomeradas com
PDI de aproximadamente 1 para a maioria das formulações e partículas na escala
micrométrica. Apesar dos altos valores de potencial zeta obtidos pelas formulações
contendo MEG, que é considerado um dos fatores atribuídas a estabilidade para as
nanopartículas (SHARMA et al., 2011), o mesmo não pode ser afirmado para essas
formulações devido a precipitações do sistema. Apesar, de haver relatos na literatura
de formação de NLS contendo MEG como lipídio sólido principal (LUO et al., 2006;
GARDOUH et al., 2013; KOTIKALAPUDI et al., 2012; SOOD et al., 2013), nesse
estudo não foi possível obter um sistema nanométrico estável devido aos resultados
insatisfatórios de tamanho de partícula e PDI. As formulações contendo o lipídio
MEG foram excluídas do estudo de incorporação de DHC.
Os CLN desenvolvidos com o lipídio dibehenato de glicerila (DBG) foram
avaliadas em 0 a 7 dias e 14 dias em relação ao tamanho de partícula, PDI e PZ. As
formulações foram divididas em 2 partes para avaliar a estabilidade em temperatura
ambiente e em geladeira. As formulações contendo DBG estão representadas no
Quadro 10 e 11. Os resultados são apresentados nas Figuras 48 a 49 e no Apêndice
B.
O DBG é um lipídio sem propriedades emulsionantes, por isso não foram
preparadas formulações contendo somente DBG sem tensoativos (ROWE;
SHESKEY; OWEN, 2006).
As formulações contendo DBG apresentaram um aspecto visual superior às
formulações contendo MEG, apresentando uma aparência translúcida, azulada (com
tensoativo ORE) e amarelada (com tensoativo P80).
As formulações contendo ORE mantiveram o aspecto visual após 14 dias. As
formulações contendo esse tensoativo apresentaram valores de PDI semelhante ao
longo do estudo de estabilidade, com uma redução do PDI para os últimos dias em
temperatura ambiente e geladeira. A leve alteração do PDI pode estar relacionada
com um rearranjo da matriz lipídica para uma forma mais estável. Foi observado um
pequeno aumento do tamanho das partículas para DBG-O com e sem óleos ao
longo dos 14 dias, mas com tamanho ainda inferior a 20 nm.
CLN DBG-O, ou seja, contendo somente lipídio e tensoativo, apresentou
maior potencial zeta que as formulações DBG contendo óleos. Esse comportamento
111
pode estar relacionado com a disponibilidade do tensoativo na superfície da
partícula para as nanopartículas sem óleos.
Figura 48 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG e ORE em temperatura ambiente e (c) distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN em geladeira.
(a)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícu
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nm
)
0
20
40
60
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po
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isp
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(P
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0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-O
DBG-O-MCP
DBG-O-TAC
DBG-O-MIP
PDI DBG-O
PDI DBG-O-MCP
PDI DBG-O-TAC
PDI DBG-O-MIP
(b)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Pote
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l zeta
(m
V)
-40
-30
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0
DBG-O
DBG-O-MCP
DBG-O-TAC
DBG-O-MIP
(c)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Tam
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(nm
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0
20
40
60
80
Ind
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(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-O
DBG-O-MCP
DBG-O-TAC
DBG-O-MIP
PDI DBG-O
PDI DBG-O-MCP
PDI DBG-O-TAC
PDI DBG-O-MIP
(d)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Pote
ncia
l zeta
(m
V)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-O
DBG-O-MCP
DBG-O-TAC
DBG-O-MIP
112
As formulações contendo DBG e P80 apresentaram tamanhos inferiores a 20
nm. O PZ das CLN apresentou um valor baixo, próximo de zero e independente de
estarem usando ou não óleos. O baixo PZ das formulações contendo P80 e ORE
pode estar relacionado com o caráter não iônico desses tensoativos, ou seja, não
proporcionam carga de superfície para as partículas e, além disso, possuem longas
cadeias hidrofóbicas que podem estar interferindo na leitura do ZetaSizer, pelo
espalhamento de luz dinâmica na leitura do PZ. As formulações contendo P80
apresentaram uma leve turvação após alguns dias de análises por inspeção visual,
indicando um início de aglomeração das partículas e provável instabilidade.
Analisando comparativamente os tensoativos ORE e P80 a partir dos
resultados citados anteriormente, o ORE foi escolhido para continuar os estudos
devido ao aspecto visual, manutenção da aparência translúcida no período de 14
dias de estudo, maior PZ e PDI entre 0,3 a 0,4.
Para a escolha entre os óleos da formulação, foram comparados o MCP, TAC
e MIP. Para as formulações contendo MCP houve uma leve tendência de aumento
de partícula (Figura 46) em formulações contendo P80. Esses comportamentos
foram observados para as formulações armazenadas em temperatura ambiente e
geladeira. Apesar do tensoativo escolhido para a formulação ser o ORE, o MCP foi
excluído das escolhas devido à possibilidade de haver uma alteração no tamanho
mais precocemente do que com outros óleos estudados.
A escolha do óleo é fundamental para promover a estabilidade contra
agregação de partículas nas CLN. Entre os óleos TAC e MIP, ambos apresentaram
resultados satisfatórios de tamanho de partícula, PDI e PZ, com resultados
próximos. No entanto, o óleo MIP apresentou melhor PDI em comparação ao TAC.
PDI é um indicativo importante de homogeneidade de partículas e atraso no
aparecimento de instabilidades de formulação (SHARMA et al., 2011; YANG et al.,
2014).
113
Figura 49 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG e P80 em temperatura ambiente e (c) em geladeira durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN em temperatura ambiente e (d) potencial zeta dos CLN mantidos em geladeira
(a)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícu
la (
nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice
de
po
lid
isp
ers
ão
(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-P
DBG-P-MCP
DBG-P-TAC
DBG-P-MIP
PDI DBG-P
PDI DBG-P-MCP
PDI DBG-P-TAC
PDI DBG-P-MIP
(b)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-P
DBG-P-MCP
DBG-P-TAC
DBG-P-MIP
(c)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Tam
anho d
e p
art
ícula
(nm
)
0
20
40
60
80
Indic
e d
e p
olidis
pers
ão (
PdI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-P
DBG-P-MCP
DBG-P-TAC
DBG-P-MIP
PDI DBG-P
PDI DBG-P-MCP
PDI DBG-P-TAC
PDI DBG-P-MIP
(d)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-P
DBG-P-MCP
DBG-P-TAC
DBG-P-MIP
114
A estabilidade do sistema nanoparticulado pode ser dividida em estabilidade
estérica e estabilidade eletrônica. Para a estabilidade estérica são usados
tensoativos com longas cadeias, para afastar as nanopartículas entre si. Para a
estabilidade iônica são usados tensoativos aniônicos para alterar a carga da
superfície das nanopartículas e causar uma repulsão entre elas (MEHNERT;
MADER, 2012; YADAV, KHATAK; SARA, 2013). Em vista dessa propriedade, foi
produzido 3 formulações contendo o tensoativo iônico lauril éter sulfosuccinato de
sódio (LESS) em 3 concentrações diferentes. As análises dessas formulações
podem ser observadas no Apêndice B e na Figura 50.
Figura 50 - (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG, ORE e LESS em temperatura ambiente durante 14 dias; (b) Potencial zeta dos CLN
(a)
Dias
Dia 1 Dia 7 Dia 14
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícula
(n
m)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olid
ispe
rsão
(P
dI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-OL-MIP1
DBG-OL-MIP2
DBG-OL-MIP3
PDI DBG-OL-MIP1
PDI DBG-OL-MIP2
PDI DBG-OL-MIP3
(b)
Dias
Dia 1 Dia 7 Dia 14
Pote
ncia
l zeta
(m
V)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-OL-MIP1
DBG-OL-MIP2
DBG-OL-MIP3
A formulação contendo 0,25% de LESS apresentou melhor PDI entre as
formulações. Na análise de 14 dias, a formulação apresentou aspecto translúcido e
azulado. No entanto, em análise visual após o estudo de 14 dias, foram visualizadas
precipitações, indicando instabilidade dos sistemas contendo tensoativos iônicos.
As formulações contendo 0,5 a 0,75% de LESS apresentaram partículas na
escala nanométrica, com aumento no PDI e no aspecto visual houve um aumento de
turbidez com o aumento progressivo da LESS. Foi observado um aumento do PZ
com o acréscimo do tensoativo iônico, portanto, observa-se que há um limiar para a
115
quantidade de tensoativo iônico usado para deixar as formulações estáveis (baixo
PDI, impedimento iônico) ou instáveis (PDI elevado, turvação do sistema).
Por fim, foram analisadas diferentes condições de desenvolvimento de CLN,
com diferenças na velocidade de agitação durante a emulsificação (1ª etapa) e o
resfriamento (2ª etapa), e a temperatura durante o processo de emulsificação para a
produção de microemulsão. As análises dessas formulações podem ser observadas
no Apêndice B e na Figura 51.
Foi observada a diminuição do PDI para todas as formulações, após diluição
1:50 (v/v) com água ultrapura. O aspecto visual nos primeiros dias para DGB-O-
MIP1, DGB-O-MIP2 e DGB-O-MIP3 foi conforme com aspecto translúcido e azulado.
É possível observar a influência na temperatura no processo de emulsificação nas
formulações DGB-O-MIP5 (temperatura reduzida de 90 ºC para 75 ºC) e DGB-O-
MIP4 (temperatura reduzida de 90 ºC para 70 ºC). Quanto menor a temperatura
maior foi o tamanho das partículas e PDI. O aspecto visual dessas formulações
(DGB-O-MIP4 e DGB-O-MIP5) foi de turbidez e leitoso, indicando a inclinação da
formação de um sistema nanométrico para micrométrico.
As formulações analisadas apresentaram tamanho na escala nanométrica
abaixo ou aproximadamente 20 nm, conforme apresentado nas Figuras 49a e 49b.
Foram observados nas formulações DGB-O-MIP que estas apresentaram uma
tendência de aumento de PDI no terceiro ao quarto dia com redução para o décimo
quarto dia de análise, com exceção da DGB-O-MIP4 que apresentou PDI elevado
com alta polidispersidade de tamanho de partículas durante toda a análise (0,5-0,6).
A DGB-O-MIP1 e DGB-O-MIP5 apresentaram PDI inicial de aproximadamente 0,3
para o primeiro e último dia de análise. Essa flutuação do PDI durante os dias da
análise podem estar relacionadas ao rearranjo e estruturamento do lipídio e óleo
para uma forma mais estável e cristalina.
Durante o período de estudo, o potencial zeta das formulações oscilou
durante os dias de análise, especialmente DGB-O-MIP1 e DGB-O-MIP4 que
chegaram a apresentar potencial zeta próximo de zero. Em geral, as formulações
mantiveram um valor entre -10 a -20 mV.
Entre as temperaturas testadas na etapa de microemulsificação das
formulações, DGB-O-MIP4 que usou 70 oC para o processo de emulsificação
apresentou os piores resultados em comparação com as demais formulações. Esses
resultados junto com o aspecto visual que DGB-O-MIP3 também apresentou de
116
coloração translúcida para turvo ao longo dias, conclui-se que para o preparo das
CLN a melhor temperatura a ser usada é ≥ 80 ºC.
Figura 51 – (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DBG, ORE com variações no método em temperatura ambiente durante 14 dias, diluição da amostra 1:50 em água ultrapura.
(a)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícu
la (
nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice
de
po
lid
isp
ers
ão
(P
DI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-O-MIP1
DBG-O-MIP2
DBG-O-MIP3
DBG-O-MIP4
DBG-O-MIP5
DBG-O-MIP1 PDI
DBG-O-MIP2 PDI
DBG-O-MIP3 PDI
DBG-O-MIP4 PDI
DBG-O-MIP5 PDI
(b)
Dias
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 14
Pote
ncia
l zeta
(m
V)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-O-MIP1
DBG-O-MIP5
DBG-O-MIP2
DBG-O-MIP3
DBG-O-MIP4
Depois desses ensaios, foi testada mais uma condição de preparo de CLN
mantendo temperatura no processo de emulsificação em 80 oC e a velocidade de
agitação foi aumentada para 1500/1500 rpm (lote DGB-O-MIP6). A formulação foi
avaliada pelos mesmos parâmetros que as formulações anteriores durante um
período de tempo maior, cerca de 30 dias, com análise semanal da formulação
(Figura 50).
Os CLN DGB-O-MIP6 apresentou tamanho em torno de 20 nm e
manuntenção desse tamanho por 30 dias; PDI variou de 0,28 a 0,36 até o término
dos estudos, com PZ entre -10 a -20 mV, como observado para as formulações
anteriores.
Devido a melhores aspectos visuais (cor translúcida, sem turvação, sem
agregados, límpida – Figura 52a) e resultados aceitáveis de distribuição de tamanho,
PDI e PZ durante os 30 dias de estudo, foi escolhido a formulação DGB-O-MIP6
para seguir os estudos de incorporação de DHC.
117
Figura 52 – (a) Distribuição do tamanho das partículas (em nm) e indice de polidispersão dos CLN contendo DGB, ORE com variações no método em temperatura ambiente durante 30 dias sem diluição
(a)
Dias
Dia 1 Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 30
Tam
an
ho
de
pa
rtíc
ula
(nm
)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olidis
pe
rsão
(P
DI)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DBG-O-MIP6
PDI DBG-O-MIP6
(b)
Dias
Dia 1 Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 30
Pote
ncia
l zeta
(m
V)
-40
-30
-20
-10
0
DBG-O-MIP6
5.6 Desenvolvimento dos CLN-DHC
A formulação escolhida para a incorporação do fitocomposto DHC nos CLN
foi a formulação DBG-O-MIP6 contendo DBG e MIP como lipídios, ORE como
tensoativo nas condições de 80 ºC e agitação de 1500 rpm no processo de
microemulsificação e resfriamento.
Foram preparados dois lotes de CLN contendo DHC, a partir da formulação
escolhida. O fitocomposto DHC foi incorporado nas proporções de 1:20 (DHC:lipídio)
e 1:40 (DHC:lipídio), devido a limitação de material. A estabilidade física dos CLN
armazenados em geladeira foi acompanhada por 30 dias. Uma formulação de CLN
branca foi preparada para fazer o acompanhamento e comparação de resultados
dos CLN contendo DHC. O aspecto físico das dispersões aquosas de CLN com e
sem DHC pode ser visualizado na Figura 53. As dispersões de CLN e CLN-DHC
apresentam semelhança quanto ao aspecto homogêneo, translúcido, levemente
azulado, mostrando que a incorporação do DHC não alterou as propriedades físicas
visuais.
118
Figura 53 - Carreador lipídico nanoestruturado branco (A) e carreador lipídico
nanoestruturado contendo DHC (B).
Os CLN brancos apresentaram uma variação de tamanho de 15,75 nm a
23,35 nm, no período de 30 dias de estudo. A formulação CLN-DHC 1:20
apresentou variação de tamanho na faixa de 16,58 a 17,88 nm e a formulação CLN-
DHC 1:40 apresentou tamanho de partícula de 15,36 a 21,79 nm. A formulação 1:20
apresentou menor variação de distribuição de tamanho durante o período de estudo
(Figura 54a).
O PDI dos CLN brancos apresentou uma alteração de 0,198 a 0,422. Para
as CLN-DHC, a formulação 1:20 teve uma alteração que variou de 0,340 a 0,591 e o
PDI para a formulação 1:40 variou de 0,169 a 0,625 (Figura 54a). A variação de PDI
que ocorre entre os dias 1° a 30° é um comportamento esperado dos CLN devido a
energia cinética que promove oscilação das partículas lipídicas provocando colisões
e possível aumento de tamanho ao longo do tempo (FREITAS; MULLER, 1999).
A B
119
Figura 54 - (a) Distribuição de tamanho de partículas (em nm) e índice de polidispersão dos CLN contendo DHC durante um período de 30 dias em geladeira. (b) Potencial zeta das partículas
(a) (b)
Dias
Dia 01 Dia 07 Dia 14 Dia 21 Dia 30
Ta
ma
nh
o d
e p
art
ícula
(n
m)
0
20
40
60
80
Ind
ice d
e p
olid
ispe
rsão
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CLN Branca
CLN-DCH 1:20
CLN-DCH 1:40
PDI CLN Branca
PDI CLN-DCH 1:20
PDI CLN-DCH 1:40
Dias
Dia 01 Dia 07 Dia 14 Dia 21 Dia 30
Po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
-40
-30
-20
-10
0
CLN Branca
CLN:DCH 1:20
CLN-DCH 1:40
O tamanho de partículas do CLN-DHC apresentou adequada distribuição e
leitura da análise (em triplicata) com tamanho médio de partícula de 15,81 nm e PDI
de 0,365 (Figura 55).
O potencial zeta de todas as formulações analisadas teve uma queda
gradual ao longo do estudo. Esses dados demonstram uma diminuição gradativa do
potencial zeta de todas as formulações.
Figura 55 - Distribuição detamanho de partículas e potencial zeta do CLN-DHC (DHC:lipídio 1:20).
120
As propriedades morfológicas dos CLN foram analisadas por MET. Na Figura
56a são observados os CLN brancos. As maiores partículas visualizadas
apresentam tamanho em torno de 40 nm. É possível que o corante usado como
contraste possa ter causado um leve aumento de tamanho de partícula. E também, é
possível visualizar partículas inferiores a 40 nm. Em geral, as partículas apresentam
forma esférica, sem aglomeração e deformações.
Na Figura 56b são observados os CLN-DHC. As nanopartículas presentes na
figura apresentam forma esférica, com adequada resolução, sem deformações e
tamanho em torno de 50 a 70 nm. O aumento do tamanho da partícula observada na
MET, não foi confirmado pela análise pelo método de espalhamento de luz dinâmica
(Zetasizer), conforme apresentado na Figura 55. Está alteração de tamanho por
MET pode estar relacionado com a técnica de preparação da amostra nos suportes
para posterior análise no microscópio.
121
Figura 56 – Fotonanografia por microscopia eletrônica de transmissão (MET) dos (a) CLN brancos, (b) CLN-DHC e (c) CLN-DHC liofilizado
(a)
(b)
(c)
Na Figura 56c também é apresentada a fotonanografia dos CLN-DHC após
liofilização. São obsevadas partículas com bordas não regulares e uma grande
quantidade de partículas no campo de visão. A quantidade de partículas pode estar
122
relacionada à quantidade de amostra adicionada para análise por MET ou escolha
do campo de visão. Não são observados, na imagem contrastada, aumentos de
tamanho significantes dos CLN, significando que estes não sofreram modificações
de tamanho após processo de liofilização.
Para determinação da eficiência de encapsulação, a DHC foi separada do
sistema lipídico por ultrafiltração, sob força centrífuga. A amostra de CLN foi
submetida a diferentes condições de velocidade e tempo de centrifugação e em
todas as condições testadas não foi detectado o composto no método analítico por
CLAE. Portanto a partir dos resultados obtidos a eficiência de encapsulação por ser
consideradas >99%.
Os CLN foram caracterizados por absorção no IV com o objetivo de conhecer
a influência, interação e disposição dos componentes nos sistemas. Para tanto foi
realizada a análise dos componentes individualmente e dos CLN com e sem DHC.
Análises por espectroscopia no IV são rápidas, precisas, não-destrutivas, permitem a
caracterização de excipientes sólidos e líquidos para estudos preliminares e de
controle de qualidade de matérias-primas. Os espectros de absorção no IV permitem
identificar grupos funcionais das estruturas químicas dos excipientes, como também
averiguar a pureza (ZHANG; SU, 2014).
O espectro do DBG (Figura 57a) apresenta uma banda em 1735,93 cm-1
referente a deformação axial referente a carbonila do ácido carboxílico. Em 1467,83
cm-1 encontra-se uma banda de deformação angular referente ao CH2 de alcano. Na
região de 2900 cm-1 há bandas de absorção referente a deformação axila referente
ao carbono Csp3-H.
O óleo MIP e o tensoativo ORE foram caracterizados no IV pelo método de
refletância total atenuada (ATR) com prisma de selênio de zinco (ZnSe). Os
espectros estão apresentados na Figura 55. No espectro do MIP (Figura 57b) são
encontradas as bandas de absorção em 1732,08 cm-1 referente a deformação axial
da carbonila. Em 1465,90 cm-1da banda de deformação angular de CH2 de alcano.
Em 1456,26 cm-1 há a presença da banda de deformação angular assimétrica de
CH3 e em 1373,32 cm-1 a presença da banda de deformação angular simétrica do
CH3. Na região de 1100 cm-1 há a presença da banda de deformação axial do C-O
de éster. Em 2852,72 cm-1 uma banda de deformação axila de Csp3-H de alcano.
123
Figura 57 - Espectro no IV do (a) Dibehenato de glicerila, (b) miristato de isopropila e (c) óleo de ricino etoxilado
(a)
(b)
(c)
600750900105012001350150016501800195024002700300033003600
1/cm
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%T
34
06
.29
29
54
.95
29
18
.30
28
48
.86
17
35
.93 1
46
7.8
3
11
76
.58
11
09
.07
10
55
.06
99
1.4
1 94
1.2
6
87
1.8
2
72
1.3
8
Compritol
600750900105012001350150016501800195021002400270030003300
1/cm
-15
0
15
30
45
60
75
90
%T
29
78
.09
29
53
.02
29
22
.16
28
52
.72
17
32
.08
14
65
.90 1
45
6.2
6
14
19
.61
13
73
.32
13
40
.53
13
01
.95
12
47
.94
11
78
.51
11
45
.72
11
09
.07
96
4.4
1
93
9.3
3
82
3.6
0
72
1.3
8
MIRISTATO DE ISOPROPILA
6008001000120014001600180020002400280032003600
1/cm
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%T
35
00
.80
34
81
.51
29
22
.16
28
56
.58
17
32
.08
14
56
.26
13
48
.24
13
23
.17
12
96
.16
12
49
.87
10
97
.50
10
41
.56
99
5.2
7
94
8.9
8
84
8.6
8
ULTRAMONA R400
124
Figura 58 - Espectros no infravermelho do (a) CLN branco; (b) CLN-DHC e (c) CLN-DHC liofilizado.
(a)
(b)
(c)
40060080010001200140016001800200024002800320036004000
1/cm
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%T
34
95
.01
33
13
.71
29
14
.44
28
50
.79
27
38
.92
19
57
.75
17
34
.01
14
69
.76
13
50
.17
13
00
.02
12
51
.80
11
07
.14 1
04
3.4
9
94
8.9
8
84
8.6
8 71
7.5
2
40060080010001200140016001800200024002800320036004000
1/cm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%T
29
14
.44 2
84
8.8
6
17
34
.01
14
69
.76 14
52
.40
13
50
.17
13
00
.02
12
49
.87
11
78
.51
11
11
.00
10
45
.42
94
7.0
5
84
8.6
8
40060080010001200140016001800200024002800320036004000
1/cm
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%T
34
95
.01
29
16
.37
28
50
.79
17
35
.93
14
71
.69
14
58
.18
13
50
.17
12
98
.09
12
51
.80
11
80
.44
11
07
.14
10
41
.56
95
2.8
4
84
4.8
2
71
7.5
2
125
A estrutura do ORE está representada na Figura 57c. Observa-se em 1732,08
cm-1 uma banda de deformação axial referente a C=O. Em 1097,50 cm-1, é
visualizada uma banda larga de forte intensidade referente adeformação axial da
ligação C-O. Em 2922,16 e 2866,58 cm-1 há duas bandas de deformação axial
referente à Csp3-H de alcano e Csp
2-H de alceno. Em 1041,56 cm-1 há uma banda
referente a alquil-éter. Na região de 3500 cm-1 há a presença de sinal possivelmente
relacionado ao grupo etoxilado do tensoativo.
Os espectros dos CLN estão representados na Figura 58. Foram analisados
os CLN com e sem DHC e os CLN-DHC liofilizados. Todos os espectros apresentam
as mesmas bandas de absorção de IV, só diferenciando na intensidade de
transmitância entre cada uma delas, provavelmente causada pela diferença na
quantidade de amostra usada com KBr no ensaio. As bandas de absorção dos CLN
são semelhantes ao do tensoativo usado, ORE (Figura 57c). Não foi observado
picos referentes à DHC (Figura 35). Essa é uma informação importante para
compreensão da estruturação do sistema, pois é um indicativo que a DHC foi
incorporada no CLN e que o tensoativo polietoxilado está recobrindo a superfície das
nanopartículas.
5.6.1 Estudo de secagem dos CLN
Os CLN são obtidos na forma de dispersão aquosa. Como proposta para
melhor conservação e também análise complementeares nos CLN, a secagem dos
sistemas por liofilização foi estudada.
A secagem foi realizada sem e com a adição de crioprotetores. A sacarose e
o manitol na concentração de 10% foram testados como crioprotetores na secagem
dos CLN com e sem DHC.
O material liofilizado foi redisperso em água a fim de verificar a influência do
processo nas características de tamanho, PDI e potencial zeta.
A formulação contendo CLN-DHC sem crioprotetor teve um tamanho de
partícula médio de 879 nm, PDI de 0,54 e potencial zeta de -18,6 mV, conforme
apresentado na Figura 59. Os sistemas após liofilização apresentaram aumento do
tamanho de partícula e de PDI, demonstrando que houve alteração física durante a
secagem.
126
Figura 59 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado sem crioprotetores.
(a)
(b)
A distribuição de tamanho e potencial zeta dos CLN após liofilização usando o
manitol como crioprotetor são apresetados na Figura 60. O tamanho médio de
partículas foi de 543,1 nm com PDI de 0,23 e potencial zeta de -24,3 mV. Embora a
adição do manitol tenha proporcionado a obtenção de partículas menores e menor
PdI após a liofilização, ainda foi observada uma alteração significativa das
propriedades físicas do sistema se comparado aos resultados antes da secagem.
A distribuição de tamanho de partículas do CLN-DHC contendo sacarose
como crioprotetor, apresentou tamanho de partícula médio de 1013 nm e 223 nm,
PDI de 0,876 e potencial zeta de -21,7 mV, conforme Figura 61. Com a adição da
sacarose como crioprotetor é possível observar a formação de diferentes populações
de tamanho além do aumento de tamanho das partículas.
127
Figura 60 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado com manitol como crioprotetor
Figura 61 - Distribuição de (a) tamanho de partículas e (b) potencial zeta de CLN-DHC liofilizado com sacarose como crioprotetor.
128
As alterações de tamanho observadas na liofilização dos CLN podem estar
relacionadas com a provável estrutura do sistema. Na hipótese do sistema ser do
tipo usCLN contendo uma camada fluida de óleo e tensoativo emulsionados na
superfície, tal estrutura pode ser alterada com o processo de liofilização mesmo na
presença do crioprotetor.
5.6.2 Análise térmica de CLN branca e CLN-DHC
A análise térmica das CLN brancas é observada na Figura 62. A primeira
linha que se mantém constante até 350 ºC representa a análise por TG e a segunda
linha que apresenta um rápido decaimento, representa a análise térmica por DSC.
Analisando a linha do DSC é observado um evento térmico endotérmico em 73,2 ºC,
representando o lipídio DBG na formulação. Após 400 ºC é observado um evento
térmico que pode caracterizar um processo de degradação do material pela
temperatura da análise. A linha do TG acompanha o processo de perda de massa
da amostra analisada em consequência do aumento da temperatura. Em
aproximadamente 392 ºC ocorre o início da degradação do material por TG que
encerra em 428,3 ºC, com uma massa residual de 1,58%.
Figura 62 – Análise térmica por DSC e TG das CLN brancas em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
129
A análise térmica de CLN-DHC é observada na Figura 63. Na imagem, não é
observado o evento térmico endotérmico na região de 170 ºC, representativo do
DHC. Esse fenômeno pode ser interpretado como a incorporação do composto
dentro do sistema matricial lipíco. Na região de 60 a 70 ºC há um pequeno evento
térmico endotérmico, podendo representar o lipídio DBG que compõe o sistema
nanoestruturado. Após 400 ºC é normalmente encontrado produtos de degradação
devido à alta temperatura, o evento térmico representado nessa faixa de
temperatura é similar ao termograma do tensoativo ORE usado na formulação. Após
a análise térmica a 500 ºC, a amostra analisada apresentou início de perda de
massa em 392,1 ºC e término de perda de massa em 428,8 ºC, com uma massa
residual de 3,3% por TG.
Figura 63 – Análise térmica por DSC e TG de CLN-DHC em rampa de aquecimento de 10 °C/min em atmosfera de N2.
5.6.3 Perfil de liberação de CLN-DHC
O perfil de liberação da DHC incorporada nos CLN-DHC foi analisado em
dissolutor, a 32 ºC com velocidade de agitação de 75 rpm em meio hidroetanólico
30% (V/V). A solução hidroetanólica foi empregada devido à baixa solubilidade da
DHC em meio aquoso ou na presença de tensoativos.
130
Conforme perfil de liberação apresentado na Figura 64, inicialmente teve-se a
liberação de 4,22% de DHC isolada e 6,27% de DHC incorporado nos carreadores
lipídicos. Após 1 h de dissolução, houve liberação de 4,5% de DHC para o meio e
12,5% de DHC em CLN. E no final da corrida de 48 h (4880 min), houve a liberação
total de 35,5% de DHC e 62,84%. Esses dados demonstram a importância do
sistema matricial lipídico para a liberação de compostos lipossolúveis de baixa
liberação, ao aumentar a solubilidade e liberação da DHC para o meio estudado.
Figura 64 - Perfil de dissolução de CLN-DHC e DHC em etanol 30% a 75 rpm em 32 ºC durante 48 h.
5.7 Avaliação da atividade antitumoral dos CLN contendo DHC em modelos
farmacológicos de melanoma murino in vitro
Os testes de citotoxicidade celular foram avaliados em duas linhagens
celulares: fibroblastos (L929) e melanoma murino (B16F10). As amostras usadas
para o teste de citotoxicidade celular foram: (a) extrato etanólico de folhas de P.
aduncum, (b) 2’,6’-dimetóxi-4’-dihidrochalcona (DHC), (c) carreadores lipídicos
nanoestruturados brancos e (d) carreadores lipídicos nanoestruturados contendo
DHC.
Para avaliação das células de fibroblasto L929 e células de melanoma murino
B16F10 foram usados como controle negativo meio DMEM (basal) e como controle
positivo de citotoxicidade o solvente DMSO a 10%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
DH
C l
ibera
do
(%
)
Tempo (min)
CLN-DHC
DHC
131
As células L929, fibroblastos, foram testadas como forma de avaliar a
citotoxicidade das amostras em células não tumorais. As células B16F10, melanoma
murinho, foram usadas para avaliar a capacidade de citotoxicidade das amostras
frente células tumorais.
Na Figura 65 está ilustrada a atividade das amostras em células L929. As
concentrações analisadas para o extrato etanólico de P. aduncum e DHC foram de
0,1; 1,0; 10 e 100 µg/mL. Os resultados são analisados em comparação com o
resultado do controle negativo, basal. O basal é interpretado como 100% de
crescimento celular e as análises das amostras são comparadas em relação a esse
valor. A única concentração do extrato de P. aduncum que apresentou resultados
significativos (p<0,01) de citotoxicidade foi 100 µg/mL. A solução de DHC não
apresentou resultados significativos de citotoxicidade nas concentrações analisadas.
Para avaliação citotoxicidade dos CLN brancos e CLN-DHC foram testadas as
concentrações de 0,01; 0,1; 1,0 e 10 µg/mL. A única concentração de CLN sem DHC
que apresentou citotoxicidade foi 10 µg/mL. Esse resultado pode estar relacionado
com a presença de tensoativos na formulação que pode interagir com células e
tecidos (DOKTOROVOVA; SOUTO; SILVA, 2014). A avaliação da citotoxicidade dos
CLN brancos (sem ativo incorporado) é importante como controle para conhecer se
o sistema carreador em si apresenta citotoxicidade e se irá adicionar citotoxicidade
para o sistema (nanopartículas e fármaco) (DOKTOROVOVA; SOUTO; SILVA,
2014).
132
Figura 65 - Crescimento celular de linhagens celulares de fibroblasto L-929 em extrato etanólico das folhas de P. aduncum, em 2’, 6’-dimetóxi-4’-dihidrochalcona (DHC), em CLN brancas e em CLN contendo DHC.
Os CLN contendo DHC não inibiram o crescimento das células L929 de forma
significativa quando comparado ao basal nas concentrações analisadas (0,1 a 10
µg/mL).
Na Figura 66 são apresentados os resultados de citotoxicidade frente a
células de melanoma murino B16F10. O extrato etanólico das folhas de P. aduncum
e o fitocomposto DHC apresentaram significativa inibição do crescimento celular se
comparado ao controle negativo a partir da concentração de 10 e 100 µg/mL,
respectivamente. Os resultados mostram que o composto isolado apresenta menor
potencial citotóxico do que o extrato, estando de acordo com os resultados
anteriores de Tomio (2011). Isso se deve provavelmente ao sinergismo de atividades
dos componentes presentes no extrato que possui outras substâncias com potencial
citotóxico (resultados não publicados).
133
Figura 66 - Crescimento celular de linhagens celulares de melanoma murino B16F10 em extrato etanólico das folhas de P. aduncum, em 2’,6’-dimetóxi-4’-dihidrochalcona (DHC), em CLN brancas e em CLN contendo DHC
Os CLN brancos apresentaram inibição significativa (p<0,01) do crescimento
celular a partir da concentração de 1,0 µg/mL, enquanto os CLN-DHC apresentaram
inibição significativa do crescimento celular a partir da concentração de 0,1 µg/mL
sendo o valor de p<0,001.
Ao comparar a atividade citotóxica da DHC em solução e do CLN-DHC para
as células tumorais (Figura 66), é possível observar a capacidade do sistema
nanoestruturado em potencializar a atividade citotóxica para as células do estudo.
134
135
7 CONCLUSÕES
No presente estudo foram realizados estudos de isolamento e caracterização
do fitocomposto DHC, desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE,
desenvolvendo dos sistemas lipídicos nanoestruturados contendo DHC e avaliação
da citotoxicidade em células de melanoma murino in vitro.
A metodologia analítica desenvolvida mostrou-se adequada para análise
quantitativa da DHC por CLAE, com um tempo de análise de 15 min. O método foi
validado nos parâmetros de linearidade (2,5 a 30 µg/mL), especificidade,
reprodutibilidade inter e intra-dia/corrida, exatidão e robustez, estando adequado em
todos os parâmetros. O método se mostrou robusto para alterações de valores de
pH e temperatura e não robusto para fluxo de fase móvel.
A DHC foi isolada do extrato concentrado de folhas de Piper aduncum, com
um rendimento satisfatório. A estrutura química do fitocomposto foi confirmada por
métodos espectroscópicos e sua solubilidade determinada. Os resultados das
análises por DSC, cromatografia por CLAE e espectroscopia de massas permitem
inferir que o fitocomposto possui pureza maior que 99%.
Estudos de pré-formulação permitiram selecionar os lipídios, os óleos e os
tensoativos para desenvolvimento dos sistemas lipídicos do tipo NLS e CLN. Dos
sistemas obtidos por microemulsificação, os CLN contendo dibehenato de glicerila
(DBG) como lipídio, miristato de isopropila como óleo (MIP) e óleo de rícino etoxilado
(ORE) como tensoativo apresentaram maior estabilidade quanto ao tamanho de
partícula, PDI e potencial zeta, sendo selecionados para incorporação do
fitocomposto DHC.
Os CLN apresentaram tamanho médio entre 8 a 25 nm, PDI inferior a 0,4,
sem aglomeração visual, cor azul translúcido e estabilidade em 30 dias de análise
para a formulação escolhida. As formulações de CLN apresentaram formato esférico
e homogeneidade de tamanho e morfologia.
Por análise de comparação de gráficos obtidos por FTIR, é possível observar
os mesmos picos de absorção do óleo de rícino etoxilado em todos os gráficos de
CLN, CLN-DHC e CLN-DHC liofilizados. Isso demonstra que provavelmente os
sistemas obtidos possuem uma camada externa recoberta por tensoativo, formando
uma interface lipídio/água.
136
O perfil de liberação da DHC incorporada nos CLN apresentou uma
velocidade de dissolução maior do que o fármaco livre. A liberação foi gradativa,
com a liberação de mais de 60% do fármaco em 48 h contra 35% do fármaco livre.
As amostras de extrato de P. aduncum, do fitocomposto, dos CLN com e sem
DHC apresentaram baixo potencial de inibição de crescimento celular para linhagens
de fibroblastos. Em células tumorais a inibição do crescimento celular foi
potencializada pela incorporação da DHC nos CLN apresentanto um potencial
citotóxico em uma dose cerca de 1000 vezes inferior ao fitocomposto em solução.
Os CLN contendo DHC foram desenvolvidos com sucesso e os métodos
empregados permitiram caracterizar os sistemas e conhecer seu potencial em
modelos de atividade antitumoral.
Na continuidade propõem-se o estudo da estruturação dos sistemas,
comportamento de liberação e penetração do fitocomposto na pele e o mecanismo
de citotoxicidade.
137
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144
145
APÊNDICE A - MÉTODOS TESTADOS NO DESENVOLVIMENTO DA
METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DHMDHC POR CLAE
Métodos
A. Reprodutibilidade do Método desenvolvido por Lobato (2014)
B. Método A Lobato (2014) com alteração da temperatura do forno de 35 ºC para
40 ºC e fluxo mantido em 0,8 mL/min.
C. Redução do tempo de corrida do método B de 65 para 35 min, com
manutenção do fluxo (0,8 mL/min) e temperatura (35 °C).
D. Método C com fluxo de 1 mL/min.
E. Aumento do valor fixo de Acetonitrila de 10 para 20% e redução do tempo de
corrida de 35 para 20 min, com fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
F. Método E com fluxo de 1 mL/min.
G. Método de Metanol fixo a 5% em fluxo de 0,8 mL/min.
H. Método G com fluxo de 1 mL/min.
I. Redução do tempo de corrida do método C de 35 para 15 min com fluxo de
0,8 mL/min.
J. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada pH 3,5 (80:10:10), fluxo
de 0,8 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida de 15 min.
K. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada pH 3,5 (80:10:10), fluxo
de 1,0 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida de 15 min.
L. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada pH 3,5 (75:10:15), fluxo
de 1,0 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida de 15 min.
M. Método Isocrático com Metanol:ACN:água acidificada pH 3,5 (70:10:20), fluxo
de 0,8 mL/min e temperatura da 35 °C, tempo de corrida de 15 min.
146
Método A - Reprodutibilidade do Método de desenvolvido por Lobato (2014). Fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
Tempo % MeOH % ACN % Agua Ac
0,01 50 10 40
2,0 50 10 40
15,0 70 10 20
25,0 80 10 10
30,0 80 10 10
40,0 85 10 5
50,0 85 10 5
53,0 50 10 40
65,0 50 10 40
Método C – Método B com alteração do tempo total de análise. Fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
Tempo % MeOH % ACN % Agua Ac
0,01 50 10 40
2,0 50 10 40
10,0 70 10 20
17,0 80 10 10
22,0 85 10 5
25,0 85 10 5
30,0 50 10 40
35,0 50 10 40
Método E - Aumento da quantidade de ACN de 10 para 20% e redução do tempo de corrida de 35 para 20 min. Fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
Tempo % MeOH % ACN % Agua Ac
0,01 50 20 30
2,0 50 20 30
10,0 75 20 5
12,0 75 20 5
15,0 50 20 30
20,0 50 20 30
147
Método G - Metanol fixo a 5% em fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
Tempo % MeOH % ACN % Agua Ac
0,01 5 15 80
2,0 5 15 80
10,0 5 50 45
12,0 5 70 25
15,0 5 70 25
20,0 5 15 80
25,0 5 15 80
Método I – Método C com alteração do tempo total de análise. Fluxo de 0,8 mL/min e temperatura de 35 °C.
Tempo % MeOH % ACN % Agua Ac
0,01 50 10 40
2,0 50 10 40
5,0 80 10 10
8,0 85 10 5
10,0 85 10 5
12,0 50 10 40
15,0 50 10 40
148
149
APÊNDICE B – ANÁLISE DE TAMANHO DE PARTÍCULA, INDICE DE
POLIDISPERSÃO E POTENCIAL ZETA POR ESPALHAMENTO DE
LUZ DINÂMICA – DADOS ORIGINAIS
Quadro 1 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Amostra Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
Sobrena-dante
89,31 ± 27,22 1,0000 -37,1 Dia 2 91,43 ± 26,83 0,4690 -33,3 Dia 3 225,50 ± 13,84 0,6770 -34,5 Dia 4 230,00 ± 2,95 0,7150 -34,2 Dia 5 146,10 ± 75,83 0,6330 -30,8 Dia 6 104,30 ± 64,32 0,5040 -33,7 Dia 7 76,01 ± 17,34 0,5070 -30,9
Dia 14 82,27 ± 2,92 0,4750 -31,4 Dia 1
Sedimento
130,00 ± 85,33 0,7510 -38,9 Dia 2 175,70 ± 20,85 1,0000 -38,7 Dia 3 39,56 ± 16,18 0,8140 -31,8 Dia 4 81,49 ± 71,93 1,0000 -34,2 Dia 5 33,44 ± 27,88 0,3700 -36,8 Dia 6 99,90 ± 69,28 1,0000 -38,6 Dia 7 95,72 ± 37,77 0,8120 -30,6
Dia 14 71,55 ± 34,13 0,9340 -28,0 Dia 1
Geladeira
Sobrena-dante
12,52 ± 1,07 0,6570 -37,1 Dia 2 11,83 ± 3,72 0,4580 -35,6 Dia 3 12,63 ± 2,67 0,5990 -30,3 Dia 4 14,56 ± 1,70 0,4800 -33,5 Dia 5 12,22 ± 0,93 0,7900 -38,7 Dia 6 13,09 ± 1,46 0,5070 -40,5 Dia 7 14,17 ± 2,00 0,5590 -39,9
Dia 14 13,89 ± 1,34 0,5500 -34,4 Dia 1
Sedimento
12,52 ± 1,07 0,2450 -38,9 Dia 2 13,99 ± 1,41 1,0000 -36,8 Dia 3 14,67 ± 0,20 0,9750 -36,0 Dia 4 14,55 ± 1,13 0,7560 -40,4 Dia 5 13,39 ± 0,10 0,8410 -40,7 Dia 6 14,19 ± 0,97 0,8120 -41,3 Dia 7 13,68 ± 4,53 0,6030 -35,3
Dia 14 15,88 ± 0,85 0,8500 -33,4 1Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
150
Quadro 2 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-O, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
12,52 ± 1,07 0,4250 -19,4 Dia 2 11,83 ± 3,72 0,5150 -18,2 Dia 3 12,63 ± 2,67 0,4990 -23,4 Dia 4 14,56 ± 1,71 0,3750 -18,4 Dia 5 12,22 ± 0,93 0,9430 -31,4 Dia 6 13,09 ± 1,46 0,9620 -33,1 Dia 7 14,17 ± 2,00 0,8830 -31,0
Dia 14 13,89 ± 1,35 0,6930 -26,9 Dia 1
Geladeira
12,52 ± 1,07 0,4250 -19,4 Dia 2 13,99 ± 1,41 0,4610 -27,1 Dia 3 14,67 ± 0,20 0,4500 -20,0 Dia 4 14,55 ± 1,13 0,4450 -20,7 Dia 5 13,39 ± 0,10 0,5260 -23,2 Dia 6 14,19 ± 0,98 0,3890 -25,7 Dia 7 13,68 ± 4,53 0,4770 -28,6
Dia 14 15,88 ± 0,85 0,9040 -26,1 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 3 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-P, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
24,61 ± 12,89 0,2500 -18,7 Dia 2 19,44 ± 16,49 0,6530 -24,9 Dia 3 36,78 ± 7,18 0,5500 -27,3 Dia 4 35,32 ± 6,05 1,0000 -30,9 Dia 5 28,44 ± 14,14 0,9210 -29,1 Dia 6 41,60 ± 6,72 1,0000 -30,9 Dia 7 36,13 ± 6,810 1,0000 -35,7
Dia 14 22,86 ± 11,78 0,3020 -15,5 Dia 1
Geladeira
24,61 ± 12,89 0,2500 -18,7 Dia 2 31,27 ± 26,08 0,8830 -21,2 Dia 3 33,96 ± 5,77 0,7890 -22,1 Dia 4 28,00 ± 4,38 0,8910 -30,7 Dia 5 22,40 ± 6,80 0,9470 -33,7 Dia 6 29,75 ± 6,27 0,7840 -30,4 Dia 7 18,23 ± 11,20 0,6790 -29,4
Dia 14 13,27 ± 1,56 0,3510 -17,0 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
151
Quadro 4 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-O-MCP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
13,05 ± 0,07 0,46 -19,2 Dia 2 11,83 ± 3,72 0,51 -32,1 Dia 3 14,44 ± 0,46 0,51 -28,9 Dia 4 12,18 ± 4,84 0,62 -28,8 Dia 5 19,19 ± 12,04 1,00 -30,5 Dia 6 13,52 ± 1,14 0,82 -30,6 Dia 7 13,67 ± 1,56 0,79 -30,8
Dia 14 17,05 ± 8,55 0,85 -26,0 Dia 1
Geladeira
13,05 ± 0,07 0,46 -19,2 Dia 2 13,92 ± 0,26 0,51 -24,4 Dia 3 15,10 ± 0,43 0,52 -25,8 Dia 4 13,45 ± 1,90 0,93 -25,5 Dia 5 13,94 ± 1,14 0,53 -30,9 Dia 6 28,34 ± 42,71 1,00 -30,5 Dia 7 13,56 ± 1,90 0,91 -34,8
Dia 14 14,90 ± 1,23 0,85 -18,8 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 5 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-P-MCP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
12,48 ± 2,22 0,86 -21,4 Dia 2 37,17 ± 25,05 0,43 -20,6 Dia 3 51,03 ± 12,08 0,45 -23,4 Dia 4 60,98 ± 2,62 0,73 -35,9 Dia 5 31,07 ± 9,76 0,68 -27,5 Dia 6 33,89 ± 21,42 0,50 -25,5 Dia 7 48,58 ± 6,90 0,57 -24,9
Dia 14 66,41 ± 5,14 0,57 -19,5 Dia 1
Geladeira
12,48 ± 2,22 0,8600 -21,4 Dia 2 32,83 ± 19,25 0,5330 -27,3 Dia 3 50,20 ± 13,42 0,7180 -24,4 Dia 4 42,52 ± 24,89 0,8690 -26,8 Dia 5 45,09 ± 17,34 0,8110 -28,1 Dia 6 52,56 ± 6,28 0,7210 -26,3 Dia 7 42,88 ± 16,56 0,7240 -26,7
Dia 14 58,60 ± 4,56 0,8510 -24,2 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
152
Quadro 6 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-O-TAC, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
15,19 ± 1,24 0,6510 -21,8 Dia 2 13,84 ± 0,74 0,4920 -17,7 Dia 3 16,55 ± 0,49 0,6310 -19,4 Dia 4 14,58 ± 0,84 0,5740 -31,2 Dia 5 14,13 ± 0,69 0,8850 -31,7 Dia 6 14,43 ± 1,46 0,7730 -34,6 Dia 7 14,96 ± 1,70 0,9980 -34,1
Dia 14 13,14 ± 3,30 0,8800 -29,0 Dia 1
Geladeira
15,19 ± 1,24 0,6510 -21,8 Dia 2 15,67 ± 0,62 0,5660 -23,1 Dia 3 13,62 ± 4,15 0,5520 -20,5 Dia 4 12,65 ± 3,39 0,5120 -19,6 Dia 5 16,72 ± 1,01 0,4470 -23,9 Dia 6 14,71 ± 0,72 0,4590 -27,2 Dia 7 15,98 ± 0,71 0,5570 -23,7
Dia 14 13,36 ± 0,39 0,9020 -31,7 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 7 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-P-TAC, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
55,45 ± 8,66 0,6120 -15,5 Dia 2 23,55 ± 22,28 0,9530 -25,4 Dia 3 50,26 ± 9,90 0,4950 -18,4 Dia 4 12,65 ± 3,39 0,5120 -23,9 Dia 5 11,11 ± 17,81 0,9570 -26,8 Dia 6 48,80 ± 29,08 0,7180 -26,2 Dia 7 53,62 ± 0,77 0,5660 -24,7
Dia 14 65,44 ± 3,12 0,4040 -24,1 Dia 1
Geladeira
55,45 ± 8,66 0,6120 -15,5 Dia 2 41,54 ± 24,37 0,7110 -19,8 Dia 3 36,15 ± 12,79 1,0000 -34,8 Dia 4 13,07 ± 4,22 0,4760 -24,8 Dia 5 32,95 ± 28,05 0,6860 -34,3 Dia 6 37,20 ± 14,09 0,9210 -30,5 Dia 7 37,69 ± 23,33 0,5230 -20,7
Dia 14 41,93 ± 11,57 0,8870 -22,9 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
153
Quadro 8 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-O-MIP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
14,51 ± 1,38 0,5420 -20,0 Dia 2 15,78 ± 0,95 0,5310 -20,8 Dia 3 14,96 ± 0,88 0,5570 -20,9 Dia 4 15,30 ± 1,24 0,6900 -24,6 Dia 5 11,36 ± 1,88 0,9750 -37,5 Dia 6 15,78 ± 0,86 0,9430 -31,4 Dia 7 14,16 ± 2,72 0,8330 -25,7
Dia 14 13,98 ± 1,20 0,8220 -28,9 Dia 1
Geladeira
14,51 ± 1,38 0,5420 -20,0 Dia 2 14,62 ± 0,15 0,5520 -20,8 Dia 3 15,57 ± 1,98 0,5110 -24,4 Dia 4 15,77 ± 1,35 0,4400 -22,6 Dia 5 15,09 ± 1,95 0,5340 -14,3 Dia 6 16,38 ± 1,85 0,3700 -22,3 Dia 7 14,17 ± 1,29 0,4690 -20,1
Dia 14 15,07 ± 0,91 0,7910 -27,7 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 9 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote MEG-P-MIP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
53,56 ± 3,42 0,3440 -18,5 Dia 2 56,03 ± 7,08 0,9480 -30,2 Dia 3 28,87 ± 18,47 0,7900 -29,1 Dia 4 48,50 ± 11,47 0,8310 -21,5 Dia 5 35,19 ± 20,77 0,4850 -21,6 Dia 6 55,44 ± 2,66 0,3930 -24,6 Dia 7 52,25 ± 2,39 0,5280 -21,3
Dia 14 56,89 ± 2,23 0,4780 -22,4 Dia 1
Geladeira
53,56 ± 3,42 0,3440 -18,5 Dia 2 46,05 ± 46,00 0,4790 -26,0 Dia 3 29,62 ± 32,17 1,0000 -33,7 Dia 4 46,18 ± 32,64 1,0000 -38,9 Dia 5 53,97 ± 2,76 0,5090 -21,7 Dia 6 48,74 ± 3,71 0,3740 -25,3 Dia 7 20,45 ± 17,73 0,3940 -22,0
Dia 14 29,83 ± 22,17 0,4650 -22,6 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
154
Quadro 10 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-O, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
8,89 ± 0,42 0,4630 -17,80 Dia 2 8,86 ± 0,03 0,5400 -18,80 Dia 3 8,04 ± 0,10 0,5310 -19,30 Dia 4 8,28 ± 0,40 0,3110 -17,50 Dia 5 9,23 ± 0,03 0,6440 -17,60 Dia 6 7,67 ± 2,61 0,6640 -16,50 Dia 7 10,11 ± 0,66 0,6140 -14,80
Dia 14 15,49 ± 0,21 0,5130 -6,28 Dia 1
Geladeira
8,89 ± 0,42 0,4630 -17,80 Dia 2 9,32 ± 0,47 0,5820 -16,10 Dia 3 9,04 ± 0,42 0,6530 -18,60 Dia 4 9,17 ± 0,38 0,6160 -16,30 Dia 5 8,58 ± 0,61 0,5860 -17,50 Dia 6 9,04 ± 0,26 0,6770 -18,30 Dia 7 8,62 ± 0,23 0,5670 -18,20
Dia 14 8,03 ± 0,92 0,3520 -18,40 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 11 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-P, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
11,03 ± 0,57 0,4850 -6,09 Dia 2 11,09 ± 0,23 0,4450 -6,00 Dia 3 8,35 ± 3,11 0,4750 -5,64 Dia 4 9,88 ± 0,21 0,4860 -7,68 Dia 5 10,82 ± 0,58 0,5230 -8,20 Dia 6 10,23 ± 0,48 0,4690 -7,90 Dia 7 12,04 ± 0,54 0,4720 -6,16
Dia 14 11,31 ± 0,70 0,4790 -6,61 Dia 1
Geladeira
11,03 ± 0,60 0,4850 -6,09 Dia 2 10,87 ± 0,65 0,4810 -5,37 Dia 3 10,51 ± 0,48 0,4710 -4,90 Dia 4 11,03 ± 0,30 0,4620 -5,40 Dia 5 10,84 ± 0,21 0,4780 -5,49 Dia 6 11,64 ± 0,36 0,4350 -5,95 Dia 7 8,89 ± 2,28 0,4310 -6,28
Dia 14 11,19 ± 1,13 0,4700 -5,90 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
155
Quadro 12 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-O-MCP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
8,22 ± 0,39 0,6880 -10,40 Dia 2 8,73 ± 0,23 0,6700 -9,99 Dia 3 8,48 ± 0,01 0,6680 -10,50 Dia 4 8,32 ± 0,28 0,6470 -9,95 Dia 5 9,24 ± 0,53 0,5920 -12,40 Dia 6 10,45 ± 0,32 0,5470 -13,10 Dia 7 11,61 ± 0,29 0,4030 -7,80
Dia 14 14,59 ± 0,26 0,6880 -5,54 Dia 1
Geladeira
8,22 ± 0,40 0,6920 -10,40 Dia 2 9,12 ± 0,20 0,6470 -8,26 Dia 3 8,69 ± 0,11 0,6420 -9,12 Dia 4 9,11 ± 0,44 0,6660 -8,73 Dia 5 8,89 ± 0,40 0,6630 -9,15 Dia 6 8,99 ± 0,38 0,6720 -10,10 Dia 7 9,14 ± 0,22 0,6650 -9,46
Dia 14 9,82 ± 0,10 0,6430 -7,96 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 13 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-P-MCP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
9,11 ± 3,70 0,4990 -8,37 Dia 2 14,71 ± 2,39 0,4670 -7,42 Dia 3 15,76 ± 1,67 0,4800 -7,77 Dia 4 8,99 ± 3,67 0,4790 -10,2 Dia 5 6,53 ± 2,10 0,4890 -6,11 Dia 6 12,84 ± 8,32 0,4870 -4,9 Dia 7 20,06 ± 2,37 0,3170 -4,33
Dia 14 22,73 ± 11,03 0,3160 -3,12 Dia 1
Geladeira
9,11 ± 3,70 0,4990 -8,37 Dia 2 14,27 ± 1,38 0,4760 -8,00 Dia 3 12,39 ± 4,87 0,4740 -7,94 Dia 4 9,55 ± 5,17 0,4910 -7,76 Dia 5 10,10 ± 4,05 0,4780 -7,27 Dia 6 10,41 ± 2,30 0,4900 -7,73 Dia 7 13,37 ± 3,79 0,4800 -7,36
Dia 14 13,55 ± 2,83 0,5000 -7,09 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
156
Quadro 14 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-O-TAC, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
7,95 ± 0,09 0,6020 -11,10 Dia 2 7,90 ± 0,17 0,5520 -11,50 Dia 3 7,67 ± 0,64 0,5720 -11,60 Dia 4 7,37 ± 0,04 0,5720 -10,20 Dia 5 8,07 ± 0,43 0,5690 -11,20 Dia 6 9,00 ± 0,37 0,5260 -8,98 Dia 7 10,07 ± 0,30 0,5680 -8,67
Dia 14 13,87 ± 0,20 0,3630 -5,63 Dia 1
Geladeira
7,96 ± 0,10 0,6020 -11,10 Dia 2 8,35 ± 0,30 0,5430 -9,19 Dia 3 8,47 ± 0,12 0,5360 -9,93 Dia 4 8,91 ± 0,11 0,5310 -11,70 Dia 5 8,55 ± 0,25 0,5500 -9,99 Dia 6 8,64 ± 0,19 0,5480 -9,35 Dia 7 9,19 ± 0,40 0,5240 -8,75
Dia 14 9,82 ± 0,03 0,5020 -8,60 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 15 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-P-TAC, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
9,99 ± 1,08 0,5370 -7,62 Dia 2 9,73 ± 0,64 0,5240 -7,52 Dia 3 9,50 ± 0,19 0,5550 -7,46 Dia 4 9,61 ± 0,05 0,5400 -9,51 Dia 5 10,45 ± 0,41 0,5220 -6,13 Dia 6 10,62 ± 0,36 0,5100 -6,32 Dia 7 11,35 ± 0,15 0,5050 -6,75
Dia 14 11,57 ± 0,55 0,5270 -3,79 Dia 1
Geladeira
9,99 ± 1,08 0,5370 -7,62 Dia 2 9,57 ± 0,63 0,5350 -7,11 Dia 3 10,12 ± 0,27 0,5510 -7,20 Dia 4 10,06 ± 0,12 0,5370 -7,54 Dia 5 9,81 ± 0,84 0,5430 -7,24 Dia 6 9,42 ± 1,24 0,5580 -8,17 Dia 7 10,20 ± 0,22 0,5470 -7,63
Dia 14 9,70 ± 0,38 0,5460 -7,57 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
157
Quadro 16 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-O-MIP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
8,51 ± 0,18 0,5570 -10,00 Dia 2 9,13 ± 0,29 0,5140 -10,10 Dia 3 8,82 ± 0,27 0,4920 -9,51 Dia 4 10,24 ± 0,19 0,4840 -9,89 Dia 5 10,47 ± 0,80 0,5390 -8,60 Dia 6 11,21 ± 0,11 0,3990 -10,50 Dia 7 12,09 ± 0,58 0,3830 -10,80
Dia 14 15,23 ± 0,13 0,3400 -6,25 Dia 1
Geladeira
8,51 ± 0,18 0,5570 -10,00 Dia 2 8,72 ± 0,41 0,5130 -9,51 Dia 3 8,82 ± 0,25 0,5480 -9,31 Dia 4 8,44 ± 0,66 0,5800 -10,10 Dia 5 8,63 ± 0,27 0,5340 -10,40 Dia 6 8,86 ± 0,06 0,5400 -12,50 Dia 7 9,25 ± 0,14 0,5690 -9,55
Dia 14 9,37 ± 0,52 0,5660 -9,97 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. Quadro 17 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para as NLS lote DBG-P-MIP, armazenadas em temperatura ambiente e geladeira por 14 dias.
Dias Armazenamento Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
Temperatura ambiente
10,07 ± 0,47 0,5580 -7,10 Dia 2 9,84 ± 1,08 0,5660 -8,36 Dia 3 8,27 ± 2,58 0,5650 -8,82 Dia 4 10,37 ± 0,37 0,5250 -8,25 Dia 5 10,41 ± 0,44 0,5250 -7,74 Dia 6 11,03 ± 0,25 0,5060 -7,64 Dia 7 10,75 ± 0,93 0,4880 -8,27
Dia 14 11,50 ± 0,58 0,5120 -4,83 Dia 1
Geladeira
10,07 ± 0,47 0,5580 -7,10 Dia 2 10,57 ± 0,61 0,5410 -7,93 Dia 3 9,93 ± 0,84 0,5210 -8,94 Dia 4 10,53 ± 0,61 0,5230 -8,15 Dia 5 9,86 ± 0,37 0,5020 -8,42 Dia 6 10,18 ± 0,61 0,5290 -8,65 Dia 7 10,14 ± 0,44 0,5310 -8,86
Dia 14 9,739 ± 0,73 0,5250 -8,28 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
158
Quadro 18 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para os CLN lotes DBG-OL-MIP1, DBG-OL-MIP2, DBG-OL-MIP3, contendo LESS nas concentrações de 0,25, 0,5 e 0,75%, respectivamente e armazenadas em temperatura ambiente por 14 dias.
Dias Formulação Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1 DBG-OL-MIP1
6,11 ± 0,20 0,3690 -14,70 Dia 7 18,92 ± 0,70 0,1620 -20,70
Dia 14 15,77 ± 0,49 0,1710 -23,20 Dia 1
DBG-OL-MIP2 6,293 ± 0,18 0,6260 -18,20
Dia 7 9,802 ± 0,59 0,4570 -22,80 Dia 14 9,105 ± 3,28 0,5280 -28,60 Dia 1
DBG-OL-MIP3 6,74 ± 0,41 0,5500 -21,60
Dia 7 12,09 ± 0,35 0,4880 -24,90 Dia 14 11,28 ± 0,73 0,4300 -30,00
1Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
Nos dias 7 e 14, as amostras foram diluídas 1:50 em água ultrapura antes da análise.
159
Quadro 19 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para os CLN obtidos com diferentes condições de temperatura e velocidade de agitação a partir da formulação DBG-O-MIP. As amostras foram armazenadas em temperatura ambiente por 14 dias.
Dias Formulação1 Tamanho2
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
DBG-O-MIP1
15,84 ± 1,70 0,3870 -13,90 Dia 2 18,86 ± 0,72 0,5180 -12,70 Dia 3 17,78 ± 0,12 0,5660 -15,30 Dia 4 15,06 ± 0,56 0,5500 -15,30 Dia 5 15,81 ± 0,15 0,4280 -14,40 Dia 6 21,15 ± 0,47 0,4400 -1,84 Dia 7 17,97 ± 0,48 0,3060 -7,63
Dia 14 18,53 ± 1,45 0,4370 -13,80 Dia 1
DBG-O-MIP2
18,00 ± 0,26 0,4680 -14,10 Dia 2 14,68 ± 0,11 0,3380 -14,80 Dia 3 15,66 ± 0,29 0,3200 -8,96 Dia 4 22,07 ± 0,29 0,4800 -14,40 Dia 5 21,02 ± 0,53 0,4860 -16,30 Dia 6 17,22 ± 0,19 0,3880 -12,30 Dia 7 15,55 ± 0,19 0,3440 -15,80
Dia 14 15,67 ± 0,51 0,2990 -13,20 Dia 1
DBG-O-MIP3
16,36 ± 0,53 0,5500 -19,80 Dia 2 16,88 ± 0,33 0,5850 -18,50 Dia 3 18,07 ± 0,53 0,4750 -18,10 Dia 4 22,01 ± 0,55 0,6050 -15,50 Dia 5 18,80 ± 0,94 0,2840 -15,20 Dia 6 20,33 ± 1,37 0,3760 -16,00 Dia 7 19,97 ± 0,51 0,2500 -15,40
Dia 14 20,37 ± 0,391 0,2900 -14,10 Dia 1
DBG-O-MIP4
17,09 ± 0,47 0,7420 -21,70 Dia 2 16,92 ± 0,25 0,6380 -23,00 Dia 3 18,15 ± 0,69 0,5930 -19,30 Dia 4 18,73 ± 0,40 0,5140 -17,60 Dia 5 19,20 ± 0,93 0,5140 -1,02 Dia 6 17,38 ± 1,33 0,5660 -17,70 Dia 7 19,04 ± 0,18 0,5520 -15,90
Dia 14 17,49 ± 0,50 0,6220 -17,70 Dia 1
DBG-O-MIP5
18,37 ± 0,32 0,3540 -12,80 Dia 2 15,42 ± 0,06 0,2950 -18,00 Dia 3 20,61 ± 0,46 0,3990 -14,20 Dia 4 20,46 ± 0,73 0,5540 -14,90 Dia 5 17,01 ± 0,27 0,4180 -10,80 Dia 6 16,33 ± 0,75 0,3140 -8,10 Dia 7 18,46 ± 0,24 0,2660 -7,37
Dia 14 21,63 ± 0,56 0,3290 -16,90
1Condições de temperatura e velocidade de agitação durante emulsificação/resfriamento:
DBG-O-MIP1 - 90 ºC/ 800/1500 rpm; DBG-O-MIP2 - 80 ºC/ 800/1500 rpm; DBG-O-MIP3 - 75 ºC/ 800/1500 rpm; DBG-O-MIP4 - 70 ºC/ 800/1500 rpm; DBG-O-MIP5 - 80 ºC/ 1500/2500 rpm.
2Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão.
As amostras foram diluídas 1:50 em água ultrapura antes da análise.
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Quadro 20 – Resultados da análise de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta para os CLN lote DBG-O-MIP6 com e sem DHC, obtidos com microemulsificação a 80 ºC e velocidade de agitação de emulsificação/resfriamento de 1500/1500 rpm. As amostras foram armazenadas em geladeira por 30 dias.
Dias Formulação Tamanho1
(d.nm) PDI
Potencial zeta (mV)
Dia 1
DBG-O-MIP6 Branca
15,66 ± 4,11 0,28 -20,7
Dia 7 23,36 ± 5,53 0,18 -16,2
Dia 14 20,14 ± 4,90 0,40 --7,76
Dia 21 18,32 ± 5,07 0,38 -18,7
Dia 30 23,33 ± 5,48 0,36 -10,1
Dia 1
DBG-O-MIP6
DHC 1:20
15,81 ± 4,10 0,36 -18,2
Dia 7 16,34 ± 4,22 0,35 -14,9
Dia 14 17,78 ± 4,48 0,57 -13,9
Dia 21 16,41 ± 4,34 0,57 -13,4
Dia 30 15,54 ± 4,02 0,37 -19,4 1
Tamanho expresso em média ± desvio. PDI = índice de polidispersão. As amostras foram diluídas 1:50 em água ultrapura antes da análise.