LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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CONTROLE GENÉTICO E EPIGENÉTICO DA EXPRESSÃO NUCLEOLAR

Mestranda: Maria Cecília Perantoni FuchsOrientador: Dr. Mateus Mondin

Sumário• Nucléolo

– Função– Estrutura– Divisão celular

• rDNA 45S– Transcrição

• Controle genético• Controle epigenético

– Metilação de citosinas– Modificações de histonas

• Dominância nucleolar• Considerações finais

Nucléolo

(Lodish et al. 2003)

O QUE É ?

Função

+18 S

+ 25 S + 5 S

5.8 S

Estrutura X FunçãoF: Centro fibrilarD:Componente fibrilar densoG: Componente granularI: Interstício nucleolar

(Olson et al. 2000)

• Linha de produção

• Vantagem

Nucléolo X Divisão celular

• Dissociação– Maquinaria de transcrição– Dispersão componentes nucleolares

• Nucleologênese– Transcrição– Corpos pré-nucleolares (PNB)

•Dinâmica da reconstituição nucleolar no final da mitose.

•Fibrilarina-GFP transferidas para células HeLa monitoradas por microscópio de fluorescência.

(Olson e Dundr 2006)

Cromossomo

Proteínas nucleolares

PNB

(Matthews e Olson 2006)

• Dinâmica das proteínas nucleolares durante a reconstituição nucleolar

• Pré-rRNA

rDNA 45S

• Altamente conservado

• Variação nos IGSs

• Transcrito primário = Pré- rRNA → processamento → rRNAs

(Pikaard, 1999)

Transcrição rDNA 45S X

Nucléolo

Inr

(Russell e Zomerdijk 2005)

UBFFatores de

transcrição (TBP)

RNA pol I

PIC

Controles genéticos e

epigenéticos

Controle genético

• Ajuste do número de genes ativos.

• Taxa transcricional dos genes ativos.

Controle epigenético

• Epigenética: fenômeno no qual ocorrem mudanças na expressão gênica por modificações covalentes nos nucleotídeos e histonas.

• Não há alteração na estrutura das seqüências de DNA.

• Principais modificações: metilação na citosina e metilação e acetilação de histonas.

Modificação de histonas• Nucleossomo• Domínio N-terminal livre

(Lodish et al., 2004)

• Metilação e acetilação - histonas H3 e H4

Metilação

• H3: K4, 9, 27, 36, 79 e R17.• H4:K20, 59 e R3.

• Enzimas com atividade histona metiltransferase (HMTase)

• Silenciamento ou ativação gênica

(Peterson e Laniel, 2004)

(Shilatifard, 2006)

(Peterson e Laniel, 2004)

Acetilação

• H3: K4, 9, 14, 18, 23 e 27.• H4: K5, 8, 12 e 16.

• Enzimas: atividade histona acetiltransferase(HAT) e histona desacetilase (HDAC)

• Ativação gênica

(Peterson e Laniel, 2004)

HDAC

HAT

Metilação de citosinas• Metiltransferases

• Contextos siméricos: CpG e CpNpG• Contexto não-simétrico: CpHpH (H = C, A, T)

• 5-aza-2-deoxicitosina

• Afeta expressão gênica por dois meios:

• Impede os fatores de transcrição de se ligarem às suas seqüências específicas.

(Attwood et al., 2002)

• Podem interagir com proteínas que causam modificações em histonas, compactando a cromatina.

(adaptado de Grafi et al., 2007)

(Preuss e Pikaard, 2007)

Dominância Nucleolar• Fenômeno no qual a

expressão nucleolar de uma RON é suprimida, ou reduzida, pela presença de outra RON

• A transcrição do rDNA 45S de um cromossomo éanulada ou parcialmente prejudicada pela transcrição do rDNA 45S de outro cromossomo.(Pikaard, 1999)

• Competição entre os promotores e enhancersacessíveis aos fatores de transcrição em concentração limitada.

• A RON que possuísse um maior número de promotores ou enhancers livres, ou ainda uma maior afinidade do enhancer em se ligar ao fator de transcrição, seria dominante sobre a outra RON.

• Modificações epigenéticas – remodelamento da cromatina.

• Trigo

• Cromossomos 1B, 6B e 5D com contrição secundária

• Isolamento do DNA genômico → digestão com enzimas de restrição – TaqI e HpaII →eletroforese → southern blot.

• TaqI: Sítios em diversos locais do rDNA 45S, mas não dentro dos IGSs.

• HpaII: Cliva sítios CCGG não metilados.

• Clivagem de HpaIIpreferencialmente nos fragmentos maiores

• Proporção de fragmentos grandes/pequenos diminuiu após tratamento com TaqI + HpaII.

• Fragmentos maiores preferencialmente não-metilados.

• 3.1kb – 1B → constrição secundária maior → maioratividade gênica no rDNA 45S

• 2.8 e 2.6kb – 6B• 1.6kb – 5D

• Metilação não é ao acaso → sítios CCGG de uma repetição de 135pb situado ‘upstream’ ao sítio de início da transcrição → conservada

• Variação do comprimento do IGS → número das seqüências de 135pb

• Fatores de transcrição

• Competição

• Dominância nucleolar: modelo baseado no seqüestro diferencial de proteínas regulatórias (fatores de transcrição) em concentrações limitadas.

• Variação no número e seqüência das regiões de 135pb.

• Arabidopsis thaliana• A. suecica = A. thaliana + A. arenosa

• A. thaliana

• Verificação das metilaçõesnos promotores: – Bissulfito (citosina → uracila)→ sequênciamento

• Relação com estado da cromatina– ChIP-chop-PCR

• Anticorpos: H3dimetilK9, H3trimetilK4 e RNApol I.

• McrBC (citosinas metiladas)

→ PCR

• Promotores hipometilados: H3trimetilK4 e RNApol I.• Promotores hipermetilados: H3dimetilK9.

Atividade gênica

Silenciamento gênico

• A. suecica = A. thaliana + A. arenosa• Dominância nucleolar: A. arenosa

• Tratamentos:– 5’aza-2’desoxicitidina

• Metilação do DNA

– Tricostatina• Histona desacetilase

(HDAC)

• Reativação RON de A. thaliana• Aumento expressão de A. arenosa

↓• Mesmo mecanismo de controle da

dosagem gênica

• Relação: Modificação de histonas

X dominância nucleolar

• ChIP dot-blot

• Imunocitoquímica + FISHA. thaliana

A. arenosa

• Metilação de citosinas nos promotores → controle na dosagem de genes de rRNA ativos e dominância nucleolar → associação com H3dimetilK9.

• Não metilação - H3trimetilK4

• Controle da dosagem gênica e dominância nucleolar – mesmos mecanismos

• Dominância nucleolar – silenciamento gênico em larga escala

Considerações finais• A epigenética aparece como um mecanismo

importante na controle da dosagem dos genes de rRNA.

• O entendimento da dominância nucleolar éimportante para a compreensão de como o remodelamento da cromatina está envolvida na expressão geral dos genes.

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