23/11/2017

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Princípios Básicos deGenética Molecular

Profª Ana Claudia17/11/2017

Fluxo da informação genética

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Estrutura do Material Genético

Replicação do DNA

Transcrição

Tradução

Regulação da Expressão Gênica

Fosfato

Base purina oupirimidina

Fosfato

Base purina oupirimidina

Nucleotídeos

Ribose

Desoxirribose

Ribonucleotídeo

Desoxirribonucleotídeo

RNA

DNA

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Nucleotídeos BasesNitrogenadas

Purinas

Pirimidinas

RNADNA

NucleotídeosDesoxirribonucleotídeos

Ribonucleotídeos

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Ligaçãofosfodiéster

Cadeia de Nucleotídeos

Polaridade oposta dadupla fita

Pontes de HidrogênioA = T C G

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Estrutura de dupla hélice doDNA

Watson e Crick – modelo dadupla hélice

Pares de bases empilhadas

Pares de basesempilhadas

Sulco menor

Sulco maior

Esqueletoaçúcar-fosfato

HidrogênioOxigênioCarbono e nitrogênioem pares de basesCarbono

Fósforo

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O Genoma compreende todo o materialgenético que um organismo possui

Estrutura de Genomas

Procariotos: tipicamente um único cromossomocircular

Eucariotos: conjunto de cromossomos nuclearesgenoma mitocondrialgenoma do cloroplato (em plantas)

Genomas Virais

Características de alguns genomas virais

Tamanho: mil pares de bases

DNA (dupla fita ou simples fita) ou RNA

Número de genes: 3 a >190

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Genomas Procarióticos

O cromossomo bacteriano tem alguns milhões depares de bases

Algumas bactérias apresentam pequenas moléculasindependentes de DNA Plasmídeos

Sequências codificadoras correspondem a maior partedo genoma

Genoma de Escherichia coli 4.639 kilobases

Genoma de Mycobacterium genitalium 580 kilobases

Genoma de Bradyrhizobium japonicum 9.105 kilobases

Genomas Bacterianos

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Genoma de Escherichia coli estirpe K12 MG16554.639.675 pb

4.149 genes – cerca de 80% do genoma

Genes/kbp = 0,894

Sequências codificadoras correspondem a maiorparte do genoma

Genomas Bacterianos

Genomas BacterianosPLASMÍDEOS:

Estrutura não essencial – pode

conferir vantagens seletivas. Ex.:

resistência a agentes antimicrobianos

Importantes ferramentas em Engenharia Genética

No variável em uma mesma bactéria

Tamanho variável (~1 a 200 kb)

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Genomas Eucarióticos

Species Common name Genome size(base pairs)

Predictednumber of

genesPlasmodium falciparum malaria protozoan 22,820,308 5,317Saccharomyces cerevisae baker’s yeast 12,057,909 6,268Caenorhabditis elegans roundworm 100,291,841 20,516Apis mellifera honeybee 197,657,892 29,832Drosophila melanogaster fruit fly 131,000,899 13,792Arabidopsis thaliana mouse ear cress 116,566,763 25,706Canis familiaris dog 2,359,826,366 18,201Homo sapiens human 2,851,330,913 22,287Mus musculus mouse 2,932,368,526 25,396Pan troglodytes chimpanzee 2,733,948,177 22,524

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~22.000 genes

~1-2%

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- A maioria é diplóide (alguns poliplóides)

- Cromatina: DNA, proteínas e RNA

EucromatinaCromatina ativa, pouco condensada: regiões do genomasuscetíveis à transcrição

HeterocromatinaCromatina altamente condensada ao longo de todo ociclo celular

-Proteínas: Histonas (básicas) muito conservadasH1, H2a, H2b, H3, H4

não-Histonas (ácidas) composição variada

Genomas Eucarióticos

Nucleossomo (1º nível de compactação)

DNA ligador: 8 a 114 pbNúcleo dehistonas

Octâmero de histonas

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DNA ligador

Octâmero de histonas

Fibra de nucleossomo(aproximadamente10 nm de diâmetro)

Fibra de cromatina(aproximadamente30 nm de diâmetro)

Fibra de cromatina (2º nível de compactação)

Representação esquemática do DNA cromossômicopreso a um arcabouço (scaffold) nuclear.

Cada dobra representa mais uma compactação.

Cromossomo metafásico (3º nível de compactação)

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Fibra de 10 nm

Fibra de 30 nm

Uma alça(≈ 75.000 pb)

Uma roseta(6 alças)

Uma espira(30 rosetas)

Duas cromátides(10 espiras cada)

DNA

Arcabouço formado porproteínas cromossômicasNão-histonas

Condensação das fibras de cromatina no cromossomo metafásico

Centrômeros e Telômeros

Centrômero

telômeros

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Centrômeros Separação de cromossomos homólogos (anáfase I dameiose)

Separação de cromátides (anáfase II da meiose e anáfaseda mitose)

Regiões ligadas pelas fibras do fuso

Cinetocoros irmãos

Cromátides

Microtúbulos do fuso

Centrômero

externa

média

interna

CamadasdoCinetocoro

Centrômeros

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Telômeros

Impedem a degradação das pontas dos cromossomos porDNAses

Evitam a fusão das pontas de um cromossomo com outro

Facilitam a replicação das pontas do DNA

Composição:

- Sequências curtas de nucleotídeos repetidas:

(TTAGGG altamente conservada em vertebrados)

- Região unifilamentar rica em G

Estrutura do Material Genético

Replicação do DNA

Transcrição

Tradução

Regulação da Expressão Gênica

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Replicação Semiconservativa

Pontes dehidrogênio

Ligaçõescovalentes

Início dadeselicoidização

Novosfilamentos

duplos

Replicação Semi-descontínua

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Síntese do DNA pelas DNA polimerases

Molde

Primer ou iniciador

Fidelidade da replicação

Em E. coli:

1 erro a cada 109 ou 1010 nucleotídeos adicionados

cromossomo ~ 4,6 x 106 pb 1 erro a cada 1.000a 10.000 replicações

atividade exonuclease 3’5’ das DNA polimerases

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Fidelidade da replicação

Atividade revisora exonuclease 3’5’

1

2

3

4

REPLICAÇÃO EM

PROCARIOTOS

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DNA polimerases em E. coli

DNA polimerase I = Replicação e reparo

DNA polimerase II = Reparo

DNA polimerase III = REPLICAÇÃO

DNA polimerase IV = Reparo

DNA polimerase V = Reparo

Replicação de DNA em E. coli

Iniciação Alongamento Terminação

Replissomo:

DNA Polimerase III DNA Polimerase I DNA ligase Primase ou Iniciase DNA girase (topoisomerase II) Proteína DnaB (helicase) SSB (Proteína de ligação ao DNA simples fita)

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Iniciação

DnaADnaBDnaC

Alongamento

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Alongamento

3’

5’

DNA Polimerase

Fita Contínua

Fita Descontínua

Primer de RNA noínicio de umfragmento de

Okazaki

Terminação

Forquilha sentidohorário

Forquilha sentidoanti-horário

Cromossomos catenados

Cromossomos separados

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REPLICAÇÃO EM

EUCARIOTOS

Aspectos característicos de eucariotos

Várias forquilhas de replicação em um únicosegmento de DNA

Humanos e outros mamíferos:≈ 10.000 origens de replicação a intervalos de

30.000 a 300.000 pb

Em Saccharomyces cerevisiae:≈ 400 distribuídas pelo genoma

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DNA polimerases

alfa

delta

épsilongama

beta

zeta

etaiota

kapa

θ (teta), λ (lambda), φ (phi), σ (sigma), and μ (mi).

DNA polimerases nucleares

Pol - atividade de DNA primase

Pol - atividade de replicação – fita contínua- atividade de reparo

Pol - atividade de replicação – fita descontínua

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Modelo de replissomo eucariótico

DNA polymerase

Estrutura do Material Genético

Replicação do DNA

Transcrição

Tradução

Regulação da Expressão Gênica

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EucariotosProcariotos

Dogma Central

Direção da transcrição

O processo de transcrição

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O processo de transcrição

Topoisomerases

O processo de transcrição

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Transcrição em Procariotos

RNA Polimerase

Core ou núcleo da RNA polimerase

+

Subunidade sigma

1 erro a cada 10.000 a 100.000 nc

Core + sigma = HOLOENZIMA

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A transcrição inicia nos PROMOTORES

Iniciação Ligação ao DNA

Formação do ComplexoFechado

Formação do ComplexoAberto

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Iniciação

Início da síntese de RNA

Liberação do fator sigma

Alongamento

Sítio de desenovelamentoSítio de reenovelamento Região da héliceDNA/RNA

Cadeia crescente de RNA

Sítio de chegada deribonucleosídeos trifosfato

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Terminação

Terminadores do tipoRho () Dependente

Proteína Rho ()

Terminação

Cadeia de RNAdobrada

Terminadores intrínsecos

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Terminação

Terminadoresintrínsecos

Transcrição em Eucariotos

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RNA Polimerases

RNA Polimerase I RNA Polimerase II RNA Polimerase III

Enzima ProdutosRNA polimerase IRNA polimerase IIRNA polimerase III

rRNAs 18S, 5,8S e 28SmRNAs e snRNAstRNAs, 5S rRNA e snRNAs

Promotores

Promotores da RNA Pol II: elementos conservados curtos

Exemplo: gene da timidina quinase de camundongo

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Iniciação

Complexofechado

Complexoaberto

Iniciação e alongamento

Início da síntese de RNA

Alongamento

HE

F

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Terminação

Processamento de RNA

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Processamento do mRNA eucariótico

Adição do capacete 5’

7-metil-guanosina Complexo de ligação de CAP

A extremidade 5’permanece ligada a RNApol II

Protege o mRNA dadegradação por ribonucleases

Participa da ligação domRNA ao ribossomo parainiciar a tradução

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Adição da cauda Poli (A) no terminal 3’

Filamento de 80 a 250 resíduos A

Serve como sítio de ligaçãopara proteínas específicas

A cauda e as proteínasassociadas protegem o mRNA dadegradação enzimática

Após a clivagem do mRNA, apoliadenilato polimeraseadiciona adeninas naextremidade 3’

Processamento de íntrons

Ribonucleossomos ou Spliceossomos: formadospor ribonucleoproteínas complexos RNA-proteínas

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Mecanismo de processamento acoplado à transcrição

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2

3

4

Processamento de mRNA eucariótico

Gene da ovoalbumina

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Processamento alternativo

Hormônio Calcitonina CGRP (peptídeo relacionado aogene da calcitonina)