Ferramentas da Gentica Molecular Humana

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Ferramentas da Gentica Molecular Humana(uma viso rpida do conjunto de tcnicas da gentica molecular aplicadas ao estudo do genoma e das doenas genticas) Este captulo seguir essencialmente o assunto abordado no captulo 4 do livro Gentica Mdica (Thompson e Thompson). Em muitos pontos, entretanto, o assunto ser abordado de forma muito mais aprofundada, adicionado para isto informaes de outros livros e de artigos cientficos, ou remetendo o leitor a uma uma mais aulas do website BiolMol. Um dos principais objetivos da gentica mdica compreender a base molecular das doenas genticas. Uma vez que se compreenda o mecanismo molecular da doena, deve ser possvel desenvolver um sistema diagnstico aperfeioado, voltado ao DNA ou a RNA, e ainda intervir para a cura da doena. Aps o enorme avano do conhecimento representado pelo Projeto Genoma Humano, passou a ser outro objetivo importante da gentica mdica a compreenso do pano-de-fundo gentico que determina a susceptibilidade/ resistncia a doenas, a tolerncia a medicamentos e muitos outros parmetros indiretamente relacionados doena, mas que esto na base da diversidade dos seres humanos e na sobrevivncia da espcie. O avano concreto na compreenso dos mecanismos moleculares que explicam os fenmenos descritos acima foi possvel graas introduo de um grande nmero de tcnicas novas no estudo da gentica. Neste captulo falaremos de vrias delas, com maior ou menor profundidade de acordo com suas aplicaes mais imediatas na gentica mdica, procurando ao mesmo tempo evitar um detalhamento excessivo, que no contribuiria diretamente compreenso das aplicaes das tcnicas na gentica mdica, razo principal do captulo. Em muitos casos o leitor ser encaminhado para a webpage Biolmol, onde a maior parte das tcnicas est discutida em detalhe (particularmente aquelas ligadas tecnologia do DNA recombinante, PCR e ao sequenciamento de DNA. Sumrio I. A linguagem da tecnologia do DNA recombinante II. Clonagem gnica 1.Primeiros passos 2. Restrio e Modificao: a ferramenta escondida na bactria 3. Ainda um pouco sobre as enzimas de restrio 4. Vetores (falta) 5. Construo de Bibliotecas 6. Biblioteca genmica: todo o genoma em pedaos... 7. Clonagem e expresso: o problema dos introns

8. Como fazer um DNA eucarioto sem introns? 9. Biblioteca de cDNA e caractersticas de um vetor de expresso para Escherichia coli. 10. Seleo (triagem ou screening) de clones pela expresso da protena recombinante. 11. Que genes esto representados numa biblioteca de cDNA? 12. Protenas recombinantes: as quimeras so desejveis? III. PCR: uma tcnica de mltiplas aplicaes IV. Sequenciamento de DNA ******************************************************************* I. A linguagem da tecnologia do DNA recombinante Como em toda rea de conhecimento espefica, a linguagem da gentica molecular parece impermevel ao leigo, numa primeira leitura. Entretanto, o significado de cada termo corriqueiramente usado pro geneticistas moleculares no complexo, mas reflete o peso da tcnica na fenomenologia estudada. Para que o leitor no se perca com um linguajar pouco familiar, vamos inicialmente definir certos termos de uso corrente na rea. Estas definies podem ser encontradas em muitos livros e fontes na internet; aqui elas provm da experincia dos responsveis pela pgina. Glossrio da Gentica Molecular (tender a se ampliar at o final das aulas sobre este tema) Biblioteca: Conjunto de clones (aqui Northern blot: Transferncia de RNAs

compreendidos como um hospedeiro albergando mltiplas cpias idnticas de um determinado vetor recombinante, ou ainda o prprio vetor, quando armazenado sem o hospedeiro, como no caso de bacterifagos) gerados a partir de uma fonte de informao gentica (DNA ou mRNA). As bibliotecas feitas a partir de DNA do organismo so ditas genmicas e aquelas feitas a partir de mRNA so ditas de cDNA (e representam apenas os genes expressos do tecido empregado para extrair o mRNA)

bandeados por eletroforese para uma membrana adequada, em geral de nylon. O processo pode ser feito por campo eltrico (os RNAs so negativos e migram para o plo positivo) ou arraste hidrodinmico. As membranas de Northern blot podem ser hibridizadas com sondas de DNA ou RNA. O nome northern uma aluso ao nome Southern, do inventor da transferncia anloga de DNA.

Clone: Nome empregado em vrias acepes

distintas. Pode significar uma molcula de DNA recombinante contendo um gene ou sequncia de DNA de interesse. A palavra empregada para designar tambm o hospedeiro carreando o clone (no vetor) ou ainda qualquer organismo obtido por propagao vegetativa de outro (esta acepo est foram do contexto da gentica molecular)

Oligonucleotdeo: Um filamento curto de cido

nuclico, em geral fita simples, que pode variar desde poucas bases at algumas dezenas. Em geral so sintticos. So chamados abreviadamente de oligos (p. ex., oligodT, oligos para sequenciamento, etc.)

cDNA: Rigorosamente, DNA complementar. O

PCR: Sigla de polymerase chain reaction, ou

nome empregado para designar a fita simples de DNA obtida pela transcrio reversa (geralmente parcial) de um mRNA, a partir de sua extremidade 3' (cauda poli A). A designao estendida para o DNA fita dupla obtida pela sntese de uma segunda fita de DNA complementar primeira por alguma DNA polimerase.

reao em cadeia da polimerase. Reao de extenso de DNA que emprega dois primers que hibridizam prximos um ao outro na fita de DNA molde (ou alvo), e permitem a produo de milhes de cpias do fragmento de DNA situado entre os dois primers

dNTPs/ ddNTPs: Desoxinucleotdeos

trifosfatados/ didesoxinucleotdeos trifosfatados. Precursores da sntese de DNA, so empregados para a extenso de fitas simples in vitro pela ao de uma DNA polimerase, a partir de primers e DNA moldes adicionados ao sistema. Os dideoxinucleotdeos, quando adicionados a uma cadeia crescente, interrompem a extenso da fita, pois no oferecem a hidroxila na posio 3', indispensvel para a ligao fosfodister com o nucleotdeo seguinte. Podem ser dATP. dGTP. dTTP ou dCTP, ou seus anlogos dideoxi.

Primers: iniciadores da sntese de DNA, so

pequenos oligonucleotdeos sintticos fita simples (de DNA). O primer vai hibridizar (ou parear) com uma fita do DNA alvo dupla fita. Para o PCR emprega-se em geral dois primers. Para o sequenciamento de DNA sempre um primer empregado de cada vez. Tanto para PCR como para sequenciamento os primers costumam ter entre 10 e 25 bases.

Enzima de restrio: Enzimas que reconhecemstios especficos no DNA fita dupla (em geral palndromos) e cortam a dupla fita, formando extremidades abruptas (cegas) ou desencontradas (ou coesivas). Os stios reconhecidos por estas enzimas so designados stios de restrio e os fragmentos de DNA gerados pela digesto de um DNA com estas enzimas so conhecidos como fragmentos de restrio.

Sonda: Uma molcula de DNA ou RNA marcada

com fsforo radioativo u conjugada com algum tipo de marcao que possa ser identificada posteriormente por um ensaio bioqumico (florescena, biotina, digozigenina, etc.). A molcula pode ser fita simples ou fita dupla. As sondas devem ser produzidas em milhares de cpias e por isto em geral so segmentos clonados em plasmdeo ou produtos de PCR. Entretanto, em alguns casos, todos os fragmentos de um determinado genoma podem ser marcados e usados como sondas para hibridizar com outro genoma.

Hibridizao: O pareamento de duas molculas

de DNA fita simples atravs da complementariedade de bases, seguindo a regra de Chargaff (A-T, G-C). Aplica-se a mesma designao para o pareamento RNA-DNA ou RNA-RNA.

Southern blot: Transferncia de DNAs

bandeados por eletroforese para uma membrana adequada, em geral de nylon. O processo pode ser feito por campo eltrico (os DNAs so negativos e migram para o plo positivo) ou arraste hidrodinmico. As membranas de Southern blot podem ser hibridizadas com sondas de DNA ou RNA. O nome uma homenagem ao inventor da transferncia.

Hospedeiro: O organismo usado para isolar e

propagar uma molcula de DNA clonada (em geral num vetor qualquer). Para clones inseridos em plasmdeos, em geral emprega-se a Escherichia coli como hospedeiro. Da mesma forma se bacterifagos so usados. Clulas de mamferos, de leveduras e de insetos so tambm muito empregadas.

Vetor: Qualquer unidade autoreplicativa de DNA(fita dupla ou simples) que possa servir para carregar um inserto de DNA exgeno de um hospedeiro para outro (da mesma espcie ou de espcies distintas, quando o vetor ganha o nome de vetor de transferncia ou shuttle vector). Exemplos: plasmdeos (bacterianos ou eucriotos),

bacterifagos, vrus, cosmdeos, fagemdeos, BACs (cromossomos artificiais de bactrias) e YACs (cromossomos artificiais de leveduras).

Insero/ Inserto: Ato de inserir um DNA

doador num DNA receptor/ Diz-se inserto ao DNA inserido (em geral num vetor, mas algumas vezes diretamente no genoma da clula transformada ou transfectada)

Western blot: Transferncia de protenas

bandeadas por eletroforese para uma membrana adequada, em geral de nitrocelulose. O processo s pode ser feito por campo eltrico (os RNAs so negativos e migram para o plo positivo). As membranas de western blot podem ser hibridizadas com sondas de anticorpos. O nome western, como o nome northern tambm, uma aluso ao nome Southern, do inventor da transferncia anloga de DNA. O western blot frequentemente chamado imunoblot.

Ligao: A unio de dois segmentos de DNA fitasimples pela ao da ligase. A enzima reconstitui a ligao fosfodister 3'5' entre dois nucleotdeos adjacentes.

II. Clonagem gnica Criar seres novos tm sido, por bilhes de anos, o privilgio da Natureza, atravs do processo contnuo de mutao e seleo natural e por outros mecanismos de alterao do DNA que agora comeam a ser compreendidos. Mas a humanidade sempre "criou" seus prprios seres, geralmente extraordinrios. Os gregos eram particularmente imaginativos, e a mitologia clssica cheia de monstros como a Quimera, o co Crbero, o Minotauro, a Medusa e um sem-nmero de outros hbridos. Como se ver mais adiante, a palavra quimera foi tomada de emprstimo na mitologia para designar as construes artificiais de molculas (em geral DNA). Inicialmente a imaginao do homem atribua a algum deus a gerao dos seres monstruosos ou, ao contrrio, extraordinariamente belos. A idia de que estes seres podiam ser fabricados por um ser humano s veio muito depois, mas em vrias partes do mundo os homens criaram "protocolos" para a gerao de vida a partir de material "morto", desde simples insetos at o prprio ser humano. A partir do meio do sculo XVIII a cincia comeou a mostrar a verdadeira face da criao e a esclarecer a origem das ossadas que eram em parte o combustvel para a imaginao dos homens naquele tempo: a vida s podia ser criada a partir da vida e os ossos imensos ou estranhos achados em toda a parte eram de seres extintos, mas que tinham sido produto da Natureza, como todos os demais. Ainda assim, alguns seres exticos mais "queridos" da humanidade permaneceram por todo o sculo XVIII e boa parte do sculo XIX e alguns passaram

"vivos" pelo sculo XX at hoje! O unicrnio "viveu" feliz por todo o sculo XVIII, as serpentes marinhas monstruosas alcanaram a metade do sculo XX e os duendes e fadas esto muito bem de sade, "vivendo" entre ns, civilizados. Os lobisomens e vampiros andam mais desacreditados, mas sempre se deve esperar um retorno triunfal, s custas do cinema ou de um livro, lanados por bons marqueteiros... Entretanto, a criao de hbridos de verdade muito mais difcil do que insinua o cinema ou pensam as pessoas, porque a maior parte das espcies tm algum tipo de restrio para o cruzamento com uma espcie diversa. Na melhor das hipteses o hbrido costuma ser estril. Esta a regra entre animais. Os hbridos entre vertebrados, por exemplo, so raros, e quando ocorrem, em geral so estreis. o caso da mula e do burro, hbridos de cavalos e jumentos. Entre plantas, contudo, a obteno de hbridos muito mais fcil e uma enorme frao das plantas que hoje cultivamos produto de cruzamento entre duas ou mais espcies. Uma abordagem mais simples produo de novas formas de vida (ao menos em teoria) a clonagem de genes de um organismo e a transfeco destes para outro organismo. A vantagem desta abordagem que se pode selecionar da espcie doadora apenas as marcas que interessam, evitando a introduo de genes indesejados. Adicionalmente, ela permite (tambm em teoria...) total controle sobre a construo final, contornando as recombinaes que a Natureza produz durante a reproduo sexuada (entre indivduos da mesma espcie ou no). Clonar genes parece simples a princpio, mas as ferramentas para cortar DNA e "emendar" os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta forma conserva o pedao "emendado" nele, chamado inserto) no eram conhecidas at o meio da dcada de 70. 1.Primeiros passos As primeiras tentativas de clonagem de genes foram feitas no fim da dcada de 70 com um vrus que infecta clulas de primatas (inclusive seres humanos): o SV40 (simian virus 40). Este vrus capaz de entrar na clula do mamfero e em alguns casos integrar-se ao DNA cromossmico, em qualquer lugar do genoma. Ao sair, ocorre muitas vezes uma exciso anmala, e o vrus deixa no genoma da clula hospedeira uma parte de si, levando, ao contrrio, um pequeno segmento do genoma da clula do primata. Ao invadir uma nova clula, o segmento transportado insere-se num outro ponto do DNA da clula hospedeira, totalmente diverso do que estava antes. Este procedimento embaralha o genoma e pode, ao acaso, produzir uma construo interessante, mas muito grosseiro para permitir um avano concreto no campo da clonagem. Adicionalmente, o SV40, assim como o fago , do qual falaremos em outra aula, e vrios outros vrus, tm uma limitao sria quanto ao tamanho de inserto que

podem carregar, pois devem ser encapsulados para sair de uma clula e invadir a outra, e o volume do capsdeo no comporta muito mais DNA do que o que normal no vrus. Desta forma, vetores virais empacotados em capsdeos devem ser previamente engenheirados de forma a que se retire um certo nmero de genes dispensveis in vitro, fazendo espao para mais bases do inserto. Como no havia uma forma simples e precisa de cortar DNA numa sequncia ou posio especficas, produzindo segmentos de extremidades conhecidas, era impossvel unir de forma eficiente um segmento de DNA de doador com as extremidades de um vetor (viral ou plasmidial, como veremos mais adiante). A falta desta tesoura molecular restringiu durante anos o avano da nascente "engenharia gentica", nome que a mdia deu ao que se chama nos meios acadmicos de tecnologia do DNA recombinante. Alm disso, o fato de todos os primeiros vetores de clonagem terem sido vrus que infectam o homem fez da engenharia gentica uma tecnologia de alto risco. As legislaes foram, compreensivelmente, durssimas no princpio, com uma opinio pblica inteiramente desfavorvel, como ocorre hoje com a questo da clonagem de mamferos. O cuidado era, contudo, muito importante. Apesar de todo cuidado, e um pouco antes das tentativas de se fazer engenharia gentica de forma sistemtica e abrangente, o SV40 acabou sendo o protagonista de uma infeco acidental de milhes de pessoas, atravs da vacina de poliomielite, nas dcadas de 50 e 60. A infeco pelo SV40 no provocou, at onde se pode saber, qualquer problema de sade nos indivduos infectados, apesar de potencialmente ser possvel a ao direta do vrus no organismo ou atravs de sua recombinao in vivo com o S2, um vrus humano. A legislao evolui bastante medida em que a engenharia gentica tornava-se mais segura. Paralelamente, a cincia da Biossegurana emergiu da unio entre conceitos de biologia e de direito, resultando num corpo de normas e diretrizes bastante coerente, que se atualiza continuamente atravs de workshops, congressos e outros encontros tcnicos entre especialistas do mundo todo (para detalhamento consulte o site da CTNBio - Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana) 2. Restrio e Modificao: a ferramenta escondida na bactria Os bacterifagos, partculas virais que invadem e destroem bactrias, tiveram um papel central no desenvolvimento da Biologia Molecular. J na dcada de 40 uma srie de experimentos mostrou como funcionavam os genes de vrios destes vrus. Uma gerao depois experimentos com fagos levaram a uma descoberta fundamental as enzimas de restrio. Estas "tesouras" moleculares, que a bactria emprega para se defender dos bacterifagos, poderiam ser aproveitadas para a pesquisa. Elas de fato forneceram a ferramenta h muito desejada pelos bilogos moleculares para estudar

e manipular o DNA e fundamentaram o caminho para o desenvolvimento da engenharia gentica. A descoberta das enzimas de restrio aconteceu ao longo de mais de duas dcadas e demonstrou que as bactrias desenvolveram, durante a evoluo, um eficiente mecanismo de defesa contra vrus a DNA. Fagos que se desenvolvem bem numa certa linhagem de bactria, frequentemente produzem uma prognie pequena quando infectam pela primeira vez uma outra linhagem da mesma bactria, mas os poucos fagos sobreviventes prosperam. O fenmeno, conhecido como restrio controlada pelo hospedeiro, foi descrito pela primeira vez no incio da dcada de 50. Werner Arber, um microbiologista suo, encontrou uma explicao molecular para o fenmeno. Ele sugeriu que as bactrias controlam os fagos com um sistema de reaes geneticamente controladas que ele designou restrio - modificao. A seguir analisaremos as observaes de Arber. Quando os bacterifagos entram numa bactria da linhagem A, so em sua maioria mortos no interior da bactria, que corta (cliva) o DNA em um ou mais pontos. Os poucos fagos que se replicam no interior da bactria, contudo, parecem "aprender" a evitar o ataque da bactria e, numa segunda infeco, j produzem um grande nmero de partculas virais novas. Quando estes fagos procuram infectar uma bactria da mesma espcie, porm de uma outra linhagem (digamos, B), inicialmente produz uma prognie pequena e apenas na segunda infeco na mesma linhagem bacteriana que se adapta e produz um grande nmero de partculas virais novas. Se transportado a um tubo de ensaio com a bactria A original, o fenmeno se repete, como se o fago tivesse "desaprendido" a infectar a bactria do tipo A. A situao est mostrada na figura abaixo.

Figura 1: A restrio controlada pela hospedeira: Fagos que se desenvolvem bem numa certa linhagemde bactria, frequentemente produzem uma prognie pequena quando infectam pela primeira vez uma outra linhagem da mesma bactria, mas os poucos fagos sobreviventes prosperam.

Como poderia ser este "aprendizado"? Afinal, quando um fago entra na bactria, apenas o seu DNA subsiste e se replica, ficando o capsdeo do lado externo da hospedeira. Ento, todo o processo de adaptao teria que estar ligado ao DNA. Vejamos a hiptese de Arber (mostrada de forma esquemtica na figura a seguir):

Inicialmente temos que admitir que a bactria possui um sistema de proteo de seu DNA contra a sua prpria enzima de restrio (a "tesoura" molecular), que consiste na modificao, em geral por metilao, de duas bases numa certa sequncia fita-dupla. Na figura abaixo a bactria da linhagem A protege desta forma as sequncias marcadas em amarelo (por exemplo 5-GAATTC-3), enquanto a da linhagem B protege outras sequncias, marcadas em azul (por exemplo, 5-GGCC-3). Esta proteo levada a cabo pela enzima de modificao. Em seguida vamos admitir que a enzima de restrio que a bactria produz cliva (corta) o DNA fita dupla exatamente na mesma sequncia que a sua prpria enzima de modificao protege. Agora imaginemos um fago sem qualquer modificao em seu DNA fita dupla infectando a bactria A. Seu DNA ser clivado (restrito ou cortado) exatamente na sequncia amarela (e at em mais de uma, se houver). Entretanto, uns poucos fagos sero replicados antes de serem clivados e imediatamente modificados pela enzima de modificao da bactria, que metila as sequncias amarelas independentemente de sua origem, bacteriana ou viral. Alternativamente, podero sobreviver porque foram metilados antes mesmo de replicarem.

Aqui cabe uma pergunta: como a bactria "decide" se uma sequncia deve ser modificada ou restrita? As enzimas de restrio (E.R.) esto dispersas no citosol bacteriano, mas as de modificao em geral tm uma proximidade com o aparato de replicao do DNA. Por isso, um DNA invasor mais provavelmente restrito antes de ser modificado. Ao contrrio, o DNA bacteriano recm sintetizado (uma fita nova, j que a outra, velha, j est modificada) ser provavelmente modificado na fita nova antes de ser restrito. Alm disso, uma hemi-metilao tambm confere um razovel grau de proteo contra o ataque de enzimas de restrio, o que faz com que o DNA bacteriano seja essencialmente imune ao da enzima de restrio da prpria bactria. De forma equivalente, o DNA viral, que no tem nenhuma metilao, muito mais sensvel ao corte pela E.R..

Os poucos fagos sobreviventes tero suas duas fitas modificadas exatamente na sequncia reconhecida pela E.R da bactria hospedeira. Consequentemente, quando entram na prxima bactria da mesma linhagem, seus DNAs esto imunes ao ataque da E.R. bacteriana. Todos os fagos da prognie, igualmente modificados, sobrevivem da por diante nesta linhagem de hospedeira.

Quando, na segunda parte da figura, os fagos provenientes de A penetram na hospedeira da linhagem B, eles esto todos modificados na sequncia amarela. Mas a hospedeira agora corta o fago na sequncia azul (digamos, 5-GGCC-3), de forma que a proteo na sequ~encia GAATTC de nada adianta. Quase todos os fagos tero seu DNA clivado, mas os poucos sobreviventes tero o DNA metilado na posio correta, pela enzima de modificao da bactria da linhagem B. A modificao na sequncia amarela vai se diluindo na populao, pois a replicao semi-conservativa e a prognie viral muito grande (mais de 200 fagos por fago infectante). Apos a segunda infeco na bactria do tipo B todos os fagos estaro agora modificados e protegidos na sequncia azul, e tero "desaprendido" a sobreviver na bactria do tipo A. O processo recomea quando o fago tenta infectar uma bactria da linhagem A outra vez.

Esta explicao molecular foi fundamental para espantar o espectro de lamarckismo que obviamente ronda um experimento desta natureza.

Figura 2: Interpretao molecular do fenmeno da restrio pela hospedeira, de acordo com WernerArber. As crculos vermelhos e verdes representam as modificaes.

Era notvel a especificidade destas reaes e os bioqumicos ficaram bastante esperanosos de que as enzimas de restrio pudessem ser empregadas para estudar e clivar o DNA, se pudessem ser purificadas. Enquanto Arber trabalhava com E. coli, outros pesquisadores experimentavam com outras bactrias, encontrando resultados similares. As esperanas, entretanto, enfraqueceram quando a primeira das enzimas purificada parecia cortar in vitro o DNA de forma aleatria, e no numa sequncia de bases especfica (conhecida como stio de restrio). As esperanas ressurgiram na dcada de 70, atravs de uma srie de trabalhos balizadores de Hamilton Smith, um bilogo molecular que trabalhava na Johns Hopkins University School of Medicine. Ele purificou a primeira enzima stioespecfica, a enzima Hind II, da bactria Haemophilus influenzae. Esta descoberta crucial foi obra do acaso (com tantas outras): incubando bactrias e fagos juntos, Smith observou que o DNA do fago degradava aos poucos. Ele e seus colaboradores conseguiram purificar a enzima responsvel pela degradao e posteriormente identificaram a sequncia de seis pares de bases que ela reconhece e cliva, sempre na mesma posio, sempre da mesma forma! Logo muitas outras enzimas foram descobertas e agora h mais de 3000 j descritas. Cada enzima cliva o DNA num stio especfico e com estas enzimas foi possvel manipular o DNA como nunca antes. Um dos trabalhos mais festejados, que vieram na cola das descobertas de Arber e Smith, foi o de Daniel Nathans com SV40, que pela primeira vez empregou estas enzimas para mapear fisicamente o DNA. Seus experimento levaram em 1972 primeira tentativa bem sucedida de clonagem de DNA, conseguida por Paul Berg. Pelas suas descobertas, Hamilton Smith recebeu o Prmio Nobel em Fisiologia ou Medicna em 1978, dividindo a premiao, merecidamente, com Arber e Nathan. As palestras dos trs laureados, Arber, Nathans e Smith, com uma descrio de seus trabalhos, esto tambm disponveis no site de downloads, no formato pdf. 3. Ainda um pouco sobre as enzimas de restrio Como vimos acima, cada bactria possui em geral uma enzima que reconhece uma sequncia de DNA curta, com 4 a 12 pares de bases. Nas diferentes bactrias estes stios tm em sua maioria uma caracterstica comum: a de terem a mesma sequncia de bases quando lidas nas duas fitas complementares. As sequncias abaixo, reconhecidas pela enzimas de restrio EcoR1 (obtida da Escherichia coli) e HindIII (obtida de Hemophilus influenzae) exemplificam o que chamamos de stio de restrio. Observe a sequncia e veja sua simetria. Sequncias de DNA fita dupla com estas caractersticas so chamadas palndromos.

Figura 3: As setas indicam a ponte fosfodiester clivada pelas enzimas EcoRI e HindIII. A linha indicao eixo de simetria do palndromo

Quando uma enzima de restrio digere o DNA, ela produz um corte em cada fita, podendo resultar em extremidades colantes ou adesivas, como as geradas pelas enzimas acima, ou extremidades cegas, isto , sem bases despareadas. Cada vez que elas encontram um stio de restrio que lhes prprio, clivam o stio.

Figura 4: Ao da enzima de restrio EcoR1, com gerao de extremidades colantes(ou adesivas) eunio de fragmentos de DNA de origens distintas

Os stios de restrio ocorrem ao acaso no DNA e tanto mais freqentes so quanto mais curtos. A probabilidade de se ter uma seqncia qualquer definida de seis bases (1/4)6, isto 1: 4096. Uma enzima que reconhea um stio de restrio de 12 bases cortar o DNA com uma freqncia muito baixa. Aps a digesto de um DNA longo por uma enzima de restrio muitos fragmentos so gerados, tanto menores quanto maior for o stio de restrio. Para finalizar: qual a vantagem para um fago ter um stio de restrio alvo de uma determinada enzima? Nenhuma, evidentemente, mas como os stios ocorrem ao acaso, provvel que um fago possa ser restrito por vrias de suas potenciais hospedeiras. Por outro lado, qual a vantagem para uma bactria em ter uma enzima de restrio que reconhece stios com 10 pb? No ser muito raro encontrar um stio destes num fago? Provavelmente estas bactrias tem uma gama bastante restrita de fagos que lhes so infectivos e por isso no precisam estar prontas para clivar stios frequentes, mas apenas aqueles que existem nos seus fagos invasores. Como a Natureza estabelece este balano uma questo de estudos ainda.

4. Vetores (falta) Finalmente podemos discutir as bases da clonagem de DNA. Para exemplificar o procedimento empregaremos um plasmdeo como vetor de clonagem e cortaremos o plasmdeo e o DNA a ser clonado com uma enzima de restrio que forma extremidades coesivas. preciso ter em mente contudo, que existem vrios outros vetores de clonagem (dos quais discutiremos, em outro captulo, o fago lambda e suas variantes comerciais) e diferentes formas de fragmentar e clonar o DNA (com enzimas de restrio que deixam extremidades cegas, com ou sem posterior encaudeamento, com nebulizao, com prensa francesa, etc.). Em atualizaes futuras cada uma destas tcnicas ser discutida. Por enquanto, recomendamos a visita do site portugus sobre vetores, para uma viso geral sobre os vrios vetores de clonagem. A consulta aos livros-texto da disciplina se impe, evidentemente. 5. Construo de Bibliotecas O que uma biblioteca? o conjunto de clones (aqui compreendidos como hospedeiros albergando mltiplas cpias idnticas de um determinado vetor recombinante, ou ainda o prprio vetor, quando armazenado sem o hospedeiro, como no caso de bacterifagos) gerados a partir de uma fonte de informao gentica (DNA ou mRNA). As bibliotecas feitas a partir de DNA do organismo so ditas genmicas e aquelas feitas

a partir de mRNA so ditas de cDNA (e representam apenas os genes expressos do tecido empregado para extrair o mRNA) Clonando DNA num plasmdeo O processo se inicia pela extrao do DNA das clulas doadoras e do plasmdeo (neste exemplo, um plasmdeo pequeno, de aprox. 2,5 kpb, da bactria E. coli). A extrao de DNA no um processo complexo: resumidamente, as clulas so lisadas com um detergente, os restos celulares e boa parte das protenas precipitadas por centrifugao em presena de uma concentrao elevada de sal (em geral acetato de potssio) e o sobrenadante, transferido para outro tubo, misturado com isopropanol. O DNA no solvel neste lcool, mesmo diludo com gua, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a 13.000 rpm por alguns minutos e o precipitado ressuspenso m gua ou num tampo adequado. O DNA que se obtm desta forma no muito limpo, mas serve para uma boa parte das aplicaes corriqueiras de laboratrio. Atualmente kits comerciais permitem a extrao rpida de DNA de praticamente qualquer tipo de clula, em quantidades e grau de pureza que satisfaam ao mais exigente pesquisador. A extrao do plasmdeo semelhante descrita acima, mas preciso usar um estratagema para separar o plasmdeo do DNA bacteriano. O DNA plasmidial muito menor que os fragmentos de DNA cromossmico bacteriano. O truque ento consiste em adicionar soluo de lise uma certa quantidade de lcali. O pH alto desnatura o DNA. Logo em seguida adiciona-se cido actico gracial e acetato de potssio: o cido neutraliza o lcali e os DNAs tendem a renaturar. Porm, a presena de sal provoca a precipitao de todas as molculas que no forem muito solveis em gua. O DNA desnaturado pouco solvel em gua e precipita. o caso dos fragmentos grandes de DNA cromossmico, que no conseguem se renaturar e precipitam (por centrifugao), junto com as protenas da bactria e restos celulares. O DNA plasmidial, ao contrrio, renatura-se rapidamente e torna-se muito solvel em gua, no podendo ser precipitado. Assim, recolhendo o sobrenadante, teremos essencialmente DNA plasmidial, com uma contaminao pequena de DNA cromossmico bacteriano. Uma vez com os dois DNAs disponveis (doador e plasmidial), resta cort-los com a enzima de restrio escolhida e misturar os dois DNAs. A tendncia ser parear as extremidades coesivas, formando construes hbridas, ou quimeras. A adio de ligase completa a cadeia fosfodister em cada uma das fitas de DNA. Este passo est representado na parte superior da figura abaixo.

Figura 5: Esquema para a obteno de plasmdeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima derestrio que cria extremidades coesivas. Para maiores detalhes veja o texto abaixo.

Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir desta mistura. O produto 1 o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmdeo (vermelho). Mas, lamentavelmente, outras construes tambm aparecem: o produto 2 o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmdeo vazio, fechado sem inserto. Ele perfeitamente funcional e no pode ser descartado do processo. O produto 3 a circularizao de vrios fragmentos de DNA do doador, numa ordem qualquer. Este

"lixo" no problemtico, porque no contm uma origem de replicao bacteriana. um DNA que ser perdido ao longo do tempo. O produto 4 a unio de dois (ou mais) plasmdeos e no se replica to rpido quando o plasmdeo vazio ou carregado com apenas um inserto, de forma que acaba desaparecendo ao longo do tempo. O ltimo "lixo" o plasmdeo carregado com vrios insertos catenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande. uma construo instvel, tambm, e tende a desaparecer. Assim, excetuando o plasmdeo vazio, todos as outras quimeras "lixo", uma vez na bactria, tendem a desaparecer e no so um problema para o experimentador. Uma vez ligado o inserto com o plasmdeo (e produzidos os vrios possveis lixos, tambm), preciso introduzir estas construes na bactria hospedeira. Isto feito pela entrada passiva de DNA atravs da membrana de bactrias previamente tratadas com uma soluo de cloreto de clcio, ou ativamente, atravs de choques eltricos, num processo chamado eletroporao. A eficincia de transformao (entrada de DNA na bactria) bastante baixa (10-3 a 10-8), mas os transformantes tero o plasmdeo dentro deles, o que lhes deve conferir propriedades novas, que permitam uma seleo positiva. De fato, os plasmdeos tm uma gene que confere bactria a resistncia a um certo antibitico (suponhamos, ampicilina), de forma que basta adicionar ampicilina ao meio e eliminaremos rapidamente todas as bactrias que no tiverem plasmdeo (vazio ou carregado). E como se ver livre do "lixo" representado pelas bactrias que tm o plasmdeo vazio? No possvel, pois o plasmdeo vazio confere a mesma resistncia ao antibitico que o plasmdeo carregado. Entretanto, possvel averiguar ao menos se, no conjunto de plasmdeos formados, a maior parte est carregada (com inserto) ou, ao contrrio, vazia. Para tal os plasmdeos de clonagem tm uma segunda marca de resistncia a antibiticos (em geral, tetraclina), que perdida quando o plasmdeo aberto e o inserto clonado. Significa dizer que o stio de clonagem interno ao gene para a resistncia tetraciclina. Significa tambm dizer que as bactrias que tm plasmdeos vazios so resistentes a ampicilina e tetraciclina, enquanto as que tm plasmdeos com inserto s mostram resistncia a ampicilina. O procedimento baseia-se na obteno de uma rplica de uma placa de Petri contendo colnias crescidas em presena de ampicilina, que ento carimbada sobre uma nova placa de Petri contendo tetraciclina. As colnias que crescerem tambm em tetracilcina no interessam, mas podem ser contadas. A figura abaixo mostra esquematicamente o procedimento, desenvolvido para outros fins, h quase 50 anos, por Joshua Lederberg, que tambm recebeu o Prmio Nobel pelos seus estudos (Joshua Lederberg, George Beadle e Edward Tatum receberam o prmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1958. Lederberg provou a existncia da recombinao gentica em bactrias e contribuiu de forma importante para o conhecimento da organizao gnica de microrganismos.

Beadle e Tatum mostraram que os genes agem regulando eventos qumicos definidos. As Palestras Nobel dos trs pesquisadores esto disponveis no site de downloads). Voc pode ver uma animao da clonagem em plasmdeos neste site ( um arquivo muito grande e exige que voc tenha o QuickTime movie player instalado): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/data/mcb/pictures/ch7/ch7anim2.mov

Figura 6. O processo conhecido como rplica, na qual um carimbo de veludo estril, facilmente

improvisado sobre um cilindro de madeira, serve para transferir um pouco de bactrias de cada colnia de uma placa para outra. Aps 24 horas o crescimento na nova placa avaliado. Neste caso a primeira placa contm meio de cultura adicionado de ampicilina, enquanto na segunda o meio contm tetraciclina. Da figura pode-se concluir que a maior parte das bactrias da amostra sensvel tetraciclina e alberga, portanto, plasmdeos recombinantes (quimricos, ou com inserto).

6. Biblioteca genmica: todo o genoma em pedaos... O conjunto de bactrias albergando plasmdeos quimricos ou recombinantes construdos a partir de DNA genmico chamado biblioteca genmica. Em princpio, se cortamos um genoma de um organismo qualquer em pedaos com uma enzima e construmos uma biblioteca suficientemente grande (isto , com muitos clones, ou bactrias, diferentes uns dos outros), teremos uma probabilidade alta de termos qualquer fragmento de DNA desejado em algum dos clones. Esta meta, contudo, no to simples de ser alcanada. As enzimas de restrio s cortam nos seus stios especficos e as regies ricas em repeties muitas vezes no tm nenhum stio de restrio. Como o DNA dos eucariotos superiores muito rico em regies repetidas, o que ocorre que uma parte relativamente grande do genoma no pode ser clonada desta forma.

O recurso para obter fragmentos de tamanho razovel (1 a 4 kpb) ao longo de todo o genoma a fragmentao do DNA por nebulizao ou por outro mtodo mecnico qualquer e a clonagem dos fragmentos em um vetor aberto com uma enzima que produz extremidades cegas. Desta forma pode-se obter mais facilmente uma biblioteca genmica que represente efetivamente todo o genoma. 7. Clonagem e expresso: o problema dos introns Um dos principais objetivos da clonagem a expresso do segmento clonado. Em geral entendemos por expresso do gene a protena que ele codifica. Assim, se clonarmos um gene qualquer de um mamfero, desejamos em geral que ele possa ser expresso num outro organismo, digamos, uma bactria, de forma que possamos obter grandes quantidades da protena do mamfero a partir de uma cultura bacteriana. o que imaginamos quando ouvimos falar na produo de insulina humana por bactrias. Entretanto, expressar genes eucariotos em bactrias no uma tarefa to fcil quanto a princpio possa parecer. Neste e nos prximos sub-itens vamos discutir as razes pelas quais um gene eucarioto em geral no pode ser expresso num procarioto se clonado diretamente num plasmdeo ou fago. Vamos discutir que estratgia pode ser adotada para contornar esta limitao. Vamos tambm discutir como deve ser o desenho de um plasmdeo (ou outro vetor) de expresso para permitir a produo de protena a partir do gene clonado. E veremos como deve ser a hospedeira para que o produto final seja de interesse para o pesquisador. Por fim, vamos discutir como so as protenas recombinantes, ou quimeras, e como podemos nos beneficiar destas construes proticas artificiais. Como mostrado na aula 2, comum nos eucariotos que o quadro aberto de leitura ou ORF (a regio do gene que vai deste o primeiro ATG a ser traduzido at o cdon de terminao) seja interrompido por um ou mais trechos de DNA que no sero posteriormente traduzidos, pois sero retirados do conjunto, no nvel do RNA, no processo de maturao do RNA mensageiro. Este mecanismo de retirada de segmentos de DNA no codificantes, chamados ntrons, conhecido como splicing. A figura abaixo mostra uma estrutura hipottica, genrica, de um gene eucarioto, e a gerao de um mRNA eucarioto por splicing e adio de cauda poli-A, acompanhadas de modificao da extremidade 5(capping). Adicionalmente, mostramos como seria a organizao de um mRNA com introns, produzido a partir do mesmo segmento gnico, por um procarioto (por exemplo, a bactria hospedeira de um plasmdeo recombinante).

Figura 7: Aps a produo do transcrito primrio, os spliceossomos aproximam o fim e o incio de

exons adjacentes e formal um lao com o intron, preparando o conjunto para a retirada da regio intrnica (1). O RNA gerado aps o splicing dos introns (2) ainda no um mRNA maduro, pois ter ainda retirada uma poro 3 aps o sinal de poliadenilao, dever receber uma cauda poli-A e a modificao da extremidade 5(cap 7-metil-guanosina) (3). Um procarioto no capaz de realizar o splicing e o sistema de traduo considerar como mRNA vlido o RNA transcrito primrio (4), desde que os ribossomos possam se ligar ao RBS da sequncia (nos sistemas de clonagem com expresso veremos que o RBS faz parte do vetor).

fcil, aps a anlise da figura acima, entender que um procarioto no ser capaz de produzir uma protena igual quela produzida pelo eucarioto, se iniciar o processo com genes contendo introns. Na verdade, mesmo um outro eucarioto poder no faz-lo se o sistema de splicing no compreender os sinais de splicing (sequncias de bases) contidos no incio e no fim dos introns. Por isso, a estratgia para se clonar e expressar genes eucariotos tem que ser distinta da apresentada na aula 5.

8. Como fazer um DNA eucarioto sem introns? Precisamos necessariamente partir de genes cujos introns j foram retirados (salvo algumas excees, quando os genes no contiverem introns, como o caso de muitos protozorios, por exemplo). Portanto, precisamos partir de RNAs mensageiros (que no contm introns) e seguir um caminho inverso, inicialmente, produzindo DNA,

para depois, ento, clonar este DNA no vetor e permitir que seja traduzido de volta num mRNA sem introns. H vrios procedimentos para se produzir um DNA fita dupla a partir de um mRNA. Este DNA chamado cDNA, pois a primeira etapa de sua construo envolve a produo de um DNA complementar (da o C...), como ser visto na prxima figura. Neste captulo vamos discutir um mtodo que permite criar um DNA fita dupla com extremidades coesivas diferentes nas pontas 5e 3, de tal forma que, na hora de se clonar o segmento no vetor, a clonagem ser uni-direcional, isto , o inserto entrar apenas num sentido. O processo se inicia pela extrao do mRNA. Este processo , do ponto de vista bioqumico, semelhante ao processo de extrao de DNA, porm o RNA muito lbil, sujeito ao das RNAses do prprio organismo e de praticamente qualquer fluido biolgico, inclusive a gua no autoclavada. Tomadas as devidas precaues (e empregando kits comerciais, de preferncia) pode-se obter uma boa quantidade de RNA praticamente a partir de qualquer clula eucariota. Mas o que queremos mRNA, e no RNA total (uma mistura de RNA heterogneo nucelar, RNA transportador, RNA ribossomal e pequenos RNAs do ncleo, alm de mRNA). Por isso, empregamos uma segunda etapa de purificao, onde o mRNA separado por cromatografia de afinidade dos demais RNAs. Geralmente se usa um kit, no qual uma pequena seringa cheia de gel de sepharose ligada a oligonucleotdeos poli-T serve de sistema de captura dos mRNAs (pela extremidade poli-A, que vai parear com os poli-T do gel). Aps lavar com tampo tudo o que no ficou aderido, desloca-se o mRNA da coluna com uma soluo de alta fora inica e, pronto! Temos em trs ou quatro gotas de tampo mRNA suficiente para obter uma biblioteca de cDNA. Em seguida vamos discutir o processo de produo do DNA fita dupla a partir de mRNA. O processo, que todo conduzido em tubo de ensaio, se inicia pela produo de um DNA complementar fita simples, a partir do mRNA. Como a transcriptase reversa necessita de um primer para iniciar sua tarefa, empregamos oligonucleotdeo poli-T. No caso mostrado na figura, detalhe (1), o oligo dT prolongado, no sentido 5, por um conjunto de bases que contm o stio de restrio para uma enzima A (neste caso, a enzima XhoI, cujo stio de restrio 5- CTCGAG - 3). Esta a forma de adicionarmos ao nosso futuro DNA um stio de restrio conhecido bem na extremidade 3. Uma vez pareado, o primer vai permitir a sntese da primeira fita de DNA, que ser estendida com a ajuda da transcriptase reversa e com dNTPs (desoxirribonucleotdeos tri-fosfato), como na sntese de DNA normal (etapa (2)). Para proteger a fita de DNA contra a ao de enzimas de restrio (que sero empregadas mais adiante), o sistema de reao tem, no lugar de desoxicitosina-

trifosfato, um precursor metilado, a 5-metil-citosina-trifosfato, que vai impedir a ao das duas enzimas de restrio sobre o DNA recm sintetizado, numa etapa posterior que j iremos comentar. A transcriptase reversa tende a parar seu processo de sntese de DNA complementar antes de chegar ao incio do mRNA (estamos produzindo o cDNA de "trs para frente"). Esta parada ocasionada, em parte, por uma atividade RNsica residual da enzima, que pode degradar o RNA que ela mesma est prestes a copiar como DNA. Nos kits modernos a transcriptase reversa recombinante empregada tem uma atividade RNsica muito pequena, mas ainda assim se observa uma parada da produo do cDNA antes da extremidade do mRNA, por razes ainda no completamente compreendidas, e que acaba gerando um cDNA mais curto que o mRNA original. Mais adiante discutiremos a importncia da perda de informao gentica nesta regio 5 do cDNA. Para a sntese da segunda fita de DNA a maior parte dos kits comerciais usa um artifcio, denominado nick translation (traduo por cortes), que uma denominao muito mal encontrada pelos seus inventores para o processo de replicao de DNA descrito a seguir. Inicialmente, com o uso da atividade endonuclesica de uma enzima adequada, inserimos pequenos cortes na cadeia de fosfatos do RNA (os chamados nicks). Estes cortes criam automaticamente extremidades 3-OH, que serviro de apoio para que a DNA polimerase (em geral o chamado fragmento Klenow da DNApol I bacteriana, que polimerisa mas no faz reviso da sntese). Estes nicks esto mostrados na etapa (3). A partir deles a DNApol I (ou o fragmento Klenow) sintetiza pequenos trechos de DNA, apoiando-se nas extremidades 3-OH criadas pelos nicks. Ao trmino desta etapa a DNA pol produz uma srie de fragmentos e reconstitui, em fita dupla, o stio Xho I na extremidade 3 do DNA (detalhe (5)).

Figura 8: Sntese de cDNA para clonagem uni-direcional em vetor de expresso. Cada etapa estdiscutida no texto. Os crculos vermelhos representam as bases metiladas. A seta na etapa 4 aponta para um nick ou corte.

Em seguida os fragmentos so ligados entre si pela ao da ligase (etapa (6)) e eventuais salincias (overhangs) da fita so retirados pela ao de uma exonuclease adicionada ao tubo. Esta ao chamada de trimming (segundo detalhe (6)). A prxima etapa a adio de adaptadores, que so pequenos fragmentos de DNA fita dupla contendo um stio de restrio para uma segunda enzima (no exemplo, o stio GAATTC,

da enzima EcoRI). Estes adaptadores so colados durante algumas horas pela incubao do DNA 'trimado" na presena de ligase. O resultado o que est mostrado na etapa (7). A adio de vrios adaptadores em cada extremidade minimizada por um artifcio bioqumico, que envolve a desfosforilao de uma das extremidades 5 dos adaptadores. O penltimo passo o corte do fragmento de DNA fita dupla com as duas enzimas de restrio para as quais adicionamos stios (neste caso, Xho I e Eco RI), mostrado na etapa (8). As duas enzimas cortam o DNA formando extremidades coesivas, isto , deixando bases despareadas, numa salincia (overhang) 5. As duas enzimas no podem cortar o DNA recm sintetizado em algum stio de restrio interno, pois ele est protegido pela adio das bases metiladas na primeira etapa de sntese. Os adaptadores e o stio XhoI, contudo, no tm esta proteo e podem ser clivados. Os fragmentos de DNA gerados por estes cortes so eliminados de nosso tubo por uma reao de filtrao ou de precipitao e o DNA fita dupla, pronto para ser clonado unidirecionalmente, fica disponvel finalmente (etapa (9)).

9. Biblioteca de cDNA e caractersticas de um vetor de expresso para Escherichia coli. A clonagem dos insertos de cDNA em plasmdeo e a transformao de bactrias com estes plasmdeos gera uma biblioteca de cDNA. Assim, da mesma forma que definimos para biblioteca genmica, a biblioteca de cDNA o conjunto de bactrias, cada qual transportando mltiplas cpias de um plasmdeo carreando um inserto representando um cDNA qualquer obtido do material biolgico doador de mRNA. Se o plasmdeo tiver certas caractersticas bsicas que permitam a expresso do inserto clonado, ser produzida uma protena recombinante. Como deve ser este plasmdeo? Inicialmente, devemos ter em mente que os cDNAs gerados pelo sistema descrito acima nem sempre contm toda a ORF (o quadro aberto de leitura) do gene. O esquema abaixo mostra as vrias possibilidades, fruto do fato de que a transcriptase reversa encerra aleatoriamente seu trabalho de sntese da primeira fita .

Figura 10: Vrios cDNAs de tamanhos diferentes so produzidos a partir do mesmo mRNA. A razo

desta variao o abandono da sntese da primeira fita pela enzima transcriptase reversa em diferentes momentos da sntese, provavelmente devido clivagem do RNA mensageiro adiante dela pela ao remanescente de RNAseH que existe naturalmente nesta enzima. O mRNA original (1) em geral mais longo do que qualquer um dos cDNAs gerados pela ao da trascriptase reversa. O mais curto (4) no contm sequer um trecho da ORF. UTR = "untranslated region" ou regio no traduzida.

Como as ORFs costumam ser muito mais longas do que as UTRs (veja propores no alto da figura 5.10), a maior pare dos cDNAs gerados cai no caso descrito em 3, isto , contm uma parte da ORF e a regio 3 no traduzida (3UTR).

Se clonarmos unidirecionalmente o cDNA com a estrutura mostrada em (3), Figura 5.10 num vetor de expresso, teremos que disponibilizar no vetor um promotor esquerda (5) do fragmento clonado. Deveremos tambm adicionar um operador ao sistema para que a hospedeira no corra o risco de se intoxicar e morrer com uma quantidade grande de protena recombinante (que, por no ser normalmente um produto da hospedeira, perturba seu metabolismo, sobretudo quando est em grandes quantidades, o que geralmente o caso de protenas recombinantes). Alm disso, pelo fato de que a ORF clonada em geral incompleta e no contm o ATG inicial, precisamos tambm acrescentar um ATG (e um RBS antes dele) para garantir a sntese de protena a partir do mensageiro. A figura abaixo mostra esquematicamente

estas propriedades do plasmdeo e a conseqente protena recombinante gerada pela clonagem.

Figura 11 Esquema representativo de um vetor de expresso que emprega parte do operon lac (muitomodificado) para garantir a expresso controlado dos insertos clonados no stio mltiplo de restrio (MRS). Veja o texto abaixo para detalhes. A cabea do cavalo a parte aminoterminal da protena (NH2) e cauda da tartaruga a extremidade carboxi-terminal (COOH).

O exemplo dado na figura bem prximo realidade, isto , assemelha-se a plasmdeos comerciais que so frequentemente usados nos laboratrios de pesquisa e desenvolvimento. Vamos analisar detalhadamente cada parte da figura. Observe que o local onde a clonagem ser feita chamado MRS ou stio mltiplo de restrio, por conter vrios stios de restrio muito prximos e nicos em todo o plasmdeo. A vantagem deste arranjo sobre aquele que emprega uma nica

enzima que o experimentador tem muito mais liberdade de escolher a enzima de restrio que ir empregar para contar o DNA doador. Alm disso, ele pode cortar o vetor com duas enzimas e obter extremidades diferentes esqueda (5) e direita (3), o que permitir a clonagem unidirecional dos fragmentos gerados com a tcnica descrita na figura 5.8. A clonagem ser feita, neste exemplo, dentro do gene lacZ. Consequentemente, se a bactria hospedeira for lacZ-, ela se tornar lac+ quando receber o plasmdeo vazio (sem inserto) e permanecer lac- se receber um plasmdeo recombinante (carregando um inserto). Mediante o uso de um indutor do sistema (no caso, um anlogo de latose, o IPTG ou isopropil-tio-galactosdeo) e um indicador da atividade da b-galactosidase (a X-gal), possvel visualizar como colnias azuladas aquelas formadas por bactrias com plasmdeos vazios e como colnias transparentes aquelas formadas por bactrias com plasmdeos recombinantes. a chamada "seleo por cor". Aps o gene lacZ indispensvel um sinal de terminao da traduo, que terminar a sntese do mRNA. Ele est indicado como uma pequena caixa preta, marcada com um t. O mRNA, por sua vez, termina num grampo, seguido de um poli-U, representado por uma pequena elipse rosa cortada por 3 Us. A sntese de mRNA iniciada no promotor e est sob controle do operador. Assim, a bactria s ir expressar a protena recombinante se houver indutor no meio, evitando que ela morra intoxicada com a protena recombinante que est fazendo. Embora o promotor lac seja fraco na Natureza, o que se emprega para clonagem um promotor mutante forte. Como no podemos ter certeza de que o primeiro ATG da ORF original do gene obtido do organismo doador est disponvel (o que implicaria dizer que a transcriptase reversa teria copiado toda a regio 3no-traduzida mais toda a ORF antes de parar), convm contar com a presena de um ATG no plasmdeo, que justamente o ATG do gene lacZ. indispensvel tambm ter um RBS procarioto antes deste ATG, como indicado pelas caixas azuis na figura, para fazer do RNA transcrito um verdadeiro mRNA. Na figura acima o inserto clonado contm parte da ORF do organismo doador e a extremidade 3 no traduzida (3 UTR). Quando se d a clonagem, o gene lacZ fica interrompido. A primeira parte do gene servir para codificar os primeiros aminocidos da protena recombinante (representados pela cabea de cavalo ao final do esquema). A segunda metade nunca ser expressa porque os ribossomos terminaro a sntese num cdon de terminao muito anterior ao incio do trecho restante do lacZ. No caso especfico do exemplo da figura, o inserto contm parte da ORF

(presumivelmente no mesmo quadro de leitura do lacZ, 1a. parte) e portanto h no fim desta ORF um cdon de terminao do gene do organismo doador. Se o quadro de leitura estiver errado ou se apenas a extremidade 3 UTR for clonada, existe uma pequena chance de que os ribossomos alcancem a 2a. parte do lacZ, mas provavelmente fora do quadro de leitura (2 chances em 3). De uma forma geral, podemos afirmar que a segunda parte do lacZ nunca traduzida. A partir do ATG aps o RBS plasmidial, forma-se ento uma ORF que termina em geral no cdon de terminao (stop) do gene doador. necessariamente uma ORF recombinante, que dar consequentemente origem a uma protena recombinante, ou quimrica. A protena sempre muito menor do que o mRNA sintetizado a partir do promotor lac do plasmdeo. A "cabea" beta-galactosidase da protena recombinante (ou quimrica) no enzimaticamente ativa. Esgotada a discusso da figura, podemos ainda discutir outras caractersticas do plasmdeo de clonagem e expresso. Como o exemplo de plasmdeo discutido na construo de bibliotecas genmicas , este tambm deve conferir bactria uma marca seletiva. Em geral, esta marca a resistncia a um antibitico. Os plasmdeos comerciais em geral empregam a marca de resistncia ampicilina. Por fim, o plasmdeo deve ter uma origem de replicao autnoma e relaxada, que permita a gerao de um grande nmero de cpias por bactria. Muitos plasmdeos apresentam outras caractersticas interessantes, mais ou menos comuns a todos. Uma delas a existncia de sequncias de bases antes e depois do inserto que permitiro a hibridizao de primers para o sequenciamento do inserto. No captulo seguinte falaremos em maiores detalhes sobre esta estratgia. Como saber se a biblioteca de cDNA que construmos tem qualidade, isto , tm a maior parte dos clones cheia com insertos? No exemplo dado na figura acima temos um poderoso recurso, a seleo por cor. De fato, basta plaquear no meio indicador (contendo IPTG e X-gal) a bactria e poderemos em poucas horas avaliar se a porcentagem de colnias brancas muito maior que a de colnias azuis. Uma biblioteca razovel deve ter ao menos 90% de colnias brancas. Outro aspecto importante a representatividade de nossa biblioteca. Assim que a construmos, podemos calcular quantos clones (uma bactria carregando um grande nmero de cpias do mesmo plasmdeo recombinante) independentes geramos no volume total de nosso ensaio. Se a maior parte dos clones estiver com inserto, podemos assumir que a biblioteca ser representativa se tiver ao menos 500.000 clones. Mas porque um nmero to grande, se no h nenhum organismo que expresse um nmero to grande de genes? De fato, 100.000 genes quase o limite para o nmero de genes de um organismo complexo como o homem. Entretanto, devemos nos

lembrar que os genes muito expressos geraro muitos cDNAs e, conseqentemente, muitos clones, enquanto que os genes pouco expressos podero gerar apenas um clone na mistura total. Por isso, necessrio sempre um nmero de clones independentes muito maior do que o total esperado de genes expressos no material empregado para a construo da biblioteca de cDNA. 10. Seleo (triagem ou screening) de clones pela expresso da protena recombinante. Se desejarmos encontrar em nossa biblioteca de cDNA um clone qualquer, geralmente o que fazemos procurar pelo clone que est expressando a protena que queremos. Mesmo considerando que a protena quimrica, ela ter ao menos uma poro (final) da protena de interesse. Para uma triagem voltada protena, geralmente empregamos como sondas anticorpos, obtidos pela imunizao de camundongos ou coelhos com uma protena de mesma funo, purificada de outro organismo, ou mesmo recombinante, mas de outra origem. Como os anticorpos produzidos so policlonais e dirigidos contra mltiplos epitopos ao longo da protena, muito provvel que reconheam a parte da protena recombinante que teve origem no inserto (o corpo de tartaruga da figura acima), mesmo que os anticorpos tenham sido feitos contra uma protena semelhante de outro organismo. Para que os anticorpos possam encontrar as protenas recombinantes, essencial que as bactrias sejam rompidas e o contedo protico fixado num substrato adequado. De forma semelhante ao que fazemos na triagem de bibliotecas genmicas, uma membrana circular (desta vez de nitrocelulose, que adere protenas; no caso das bibliotecas genmicas a membrana de nylon, que adere o DNA) colocada sobre uma placa de Petri quando as colnia de uma pequena alquota da biblioteca ainda esto pequenas. Deixa-se que as colnias cresam algumas horas em contato com a membrana, que ento retirada. A placa (master) deve ser mantida na geladeira. As bactrias so lisadas, o contedo bacteriano sondado pelos anticorpos, que se ligaro s manchas proticas onde h a protena recombinante que eles reconhecem. O excesso de anticorpos lavado com tampo e os anticorpos fixados so revelados pelo uso de um conjugado adequado (anticorpo anti-anticorpo, ligado enzima peroxidase, por exemplo) e de um substrato que possa ser visualizado facilmente (no caso da peroxidase, pode ser empregada a tetrametilbenzidina como substrato cromognico e o perxido de hidrognio como doador de oxignio reativo). As manchas reativas indicaro na placa de Petri master a posio das colnias de interesse. evidente que tambm podemos empregar, como fizemos para a triagem de bibliotecas genmicas, sondas de DNA, mas os clones encontrados no necessariamente estaro expressando os insertos na forma de protenas

recombinantes, porque os insertos podem estar fora do quadro de leitura inicial do lacZ. H muitos detalhes tcnicos na triagem que no discutimos, porm a base do processo est adequadamente esclarecida. 11. Que genes esto representados numa biblioteca de cDNA? Ao contrrio de uma biblioteca genmica, que contm em princpio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contm apenas os genes expressos pelas clulas empregadas na extrao de mRNA, e ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das clulas no laboratrio. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com clulas do meristema apical de uma planta ter muitos genes diferentes de uma outra biblioteca feita a partir de estame. Mas tambm ter muitos outros iguais, pois h genes que so expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.

12. Protenas recombinantes: as quimeras so desejveis? Ao examinarmos a protena recombinante esquematicamente representada na figura 11 poderamos nos perguntar: para que serve uma protena hbrida, parte betagalactosidase bacteriana e parte protena de meu organismo de estudo? No seria mais sensato ter apenas a parte no bacteriana para ensaiar? Mesmo uma protena quimrica pode ter aplicao imediata. Apenas como exemplo discutimos duas aplicaes rotineiras: como antgeno diagnstico e como vacina. Se desejamos empregar uma protena recombinante para diagnstico (suponhamos, uma protena que se inicia com a beta-gal e termina com uma frao carboxi-terminal da tubulina de Leishmania), podemos fix-la aos micropoos de uma placa de ELISA. Em seguida, o soro dos pacientes pode ser previamente misturado com uma soluo contendo extrato de Escherichia coli, de forma a imunoadsorver na fase lquida todos os eventuais anticorpos do paciente contra protena bacteriana, em geral, e contra a beta-galactosidase em particular. Por fim, basta pipetar o soro imunoadsorvido sobre os micropoos. Os anticorpos livres contra atubulina de Leishmania (presentes no soro dos pacientes com leishmaniose) vo aderir parte recombinante da tubulina e ficaro presos ao plstico. O excesso de anticorpos lavado e a presena dos anticorpos fixados tubulina detectada como descrito acima para a triagem de colnias. Poder-se-a argumentar que os anticorpos humanos so produzidos contra a tubulina completa, e no reconheceriam apenas parte dela.

Entretanto, com dito acima, a produo de anticorpos numa imunizao e numa infeco , em geral, policlonal, e dirigida contra muitos epitopos, que podem estar na parte amino (no presente na nossa protena recombinante) ou na parte carboxiterminal (representada pelo corpo de tartaruga da figura 11). Esta abordagem especialmente interessante quando o antgeno (uma protena ou uma mistura de componentes do organismo infectante) difcil de conseguir. o caso da filariose bancroftiana, pois o nico hospedeiro do parasita Wuchereria bancrofti o ser humano. No tico e vivel obter grandes quantidades de microfilrias de um paciente para diagnosticar os demais! A produo de uma biblioteca de cDNA tambm depende de microfilrias ou vermes adultos de um paciente, mas evento nico e uma vez construda a biblioteca no ser mais necessrio voltar a obter parasitas do paciente. No caso de desejarmos fazer uma vacina, a abordagem semelhante: basta inocularmos a protena recombinante no mamfero que desejamos imunizar, com ou sem adjuvantes. preciso apenas ter ateno para a imunogenicidade da parte plasmidial da protena recombinante. A beta-galactosidase pouco imunognica e pode ser empregada, mas outras construes usam polipeptdeos mais imunognicos, que devem ser empregados com cautela. Se, por qualquer razo, no podemos de forma alguma usar uma protena quimrica, podemos lanar mo de vetores que tm imediatamente antes do stio de restrio empregado na clonagem uma sequncia de bases que codifica um pequeno peptdeo reconhecido e cortado por uma enzima adequada. Na figura 11 como se a cabea de cavalo estivesse ligada ao corpo da tartaruga por uma pequena haste de peptdeo, que pode ser cortada por uma enzima. Podemos ento capturar as protenas recombinantes da lise bacteriana por uma coluna de cromatografia de afinidade com anticorpos dirigidos contra a parte plasmidial da protena recombinante (a cabea de cavalo). Uma vez lavada a coluna para retirar o material no fixado, adiciona-se a ela um pequeno volume de tampo contendo a enzima que corta a unio entre a cabea e o corpo, e recolhe-se no efluente da coluna apenas a parte que interessa (protena do organismo doador) da protena quimrica.

III. PCR - Uma tcnica de mil e uma utilidades Esta aula bastante longa. Por isso optamos por construir internamente links para seus diversos temas, tabelados abaixo. Basta clicar sobre o tema de interesse.

Sinopse da aula Primeiros passos - Introduo ao PCR PCR na investigao de Paternidade PCR na investigao de crimes PCR no diagnstico de enfermidades genticas PCR em tempo real - o sistema Taqman Um pouco de histria Artigos importantes sobre PCR

A. Primeiros passos Ainda na dcada de 60 muitos pesquisadores procuraram obter a sntese de DNA in vitro. evidente que obter DNA em tubo de ensaio o primeiro passo para um universo de experimentos em gentica molecular. O primeiro a conseguir caminhar neste sentido foi Arthur Kornberg, de quem j falamos na aula sobre replicao do DNA. Era natural, j que Kornberg era um profundo conhecedor das DNA polimerases. A sntese de um DNA viral in vitro foi recebida com entusiasmo por todos, inclusive a imprensa leiga, que qualificou o feito como a criao da vida em laboratrio. Esta metfora tem sido usada pela imprensa com insistncia em vrias ocasies, sempre que se trata de manipular o DNA de um ser vivo, e em geral provoca mal estar entre os pesquisadores, o que foi o caso de Arthur Kornberg. Em 1983, Kary Mullis, ento pesquisador empregado na Cetus Corporation, EUA, imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse seu trabalho em trechos pr-determinados do DNA. Com o sistema seria possvel amplificar milhes de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. A idia foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985, numa conferncia. Depois disso a tcnica, conhecida como PCR, ganhou quase instantaneamente uma aceitao mundial e em menos de uma dcada tornou-se o procedimento bsico de todo laboratrio de gentica molecular no mundo. Mas, afinal, o que a PCR? A sigla significa "polymerase chain reaction", que em portugus seria reao em cadeia da polimerase. Ento, a base da tcnica a ao in vitro da DNA polimerase. Para compreendermos como funciona a tcnica, que na verdade bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a sntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de precursores de sntese de DNA,

coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotdeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP). A idia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratrio, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distncia entre os stios de pareamento dos dois primers no podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reao era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, at 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequncia alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cpia recm sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cpias do alvo. claro que a repetio do processo geraria um nmero de cpias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2. Na verdade, a coisa no foi to fcil assim: a DNA pol era termoinstvel (como a maioria das protenas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94 oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extenso. Alm disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos esprios (sem sentido, errneos) no sistema, gerando ao final produtos de PCR inesperados. A soluo foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituda por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta extraordinariamente til na gentica molecular. Que propriedades tm a Taq polimerase que a fazem to til? Ela termoestvel e sua temperatura tima de funcionamento 72 oC. Com isto trs problemas ficaram automaticamente resolvidos: a) no havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo. b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridizao, que podia ser mantida acima de 50 oC, evitando hibridizaes esprias. c) o DNA molde no se renaturava por completo, permitindo uma rpida desnaturao ao se iniciar um novo ciclo. Adicionalmente, a manuteno do tubo fechado evitava contaminao do material do laboratrio e dos estoques de reagentes com os amplicons, nome genrico dado aos produtos de amplificao da PCR. claro que um amplicon gerado com um par de

primers qualquer serve perfeitamente de molde para uma nova reao de PCR com os mesmos primers. A contaminao de reagentes e pipetas com amplicons continua sendo um problema para todos que trabalham com PCR. Os eventos ligados s trs temperaturas que mencionamos, 94 oC, 50 oC e 72 oC, esto esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as fitas simples de DNA alvo esto misturados, mas no podem parear. Quando a temperatura reduzida os primers rapidamente alcanam seus stios de complementariedade, pois so molculas pequenas e, portanto, muito mveis, e porque esto em concentrao muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde tende a renaturar, mas logo a temperatura novamente elevada para 72 oC, que permite a extenso das novas fitas a partir dos primers, sem desparear os primers outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as fitas, inclusive as recm sintetizadas, recomeando o processo.

Figura 12: Eventos relacionados s trs temperaturas bsicas da PCR: Desnaturao a 94 oC,

pareamento dos primers a 50 oC e extenso de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estvel.

O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento varivel, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vrus ou plasmdeo), e outra, de comprimento determinado, que obtida sempre que um DNA previamente copiado empregado como molde em sua sntese. Esta situao est claramente representada na figura abaixo, que mostra os trs primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original no tem comprimento fixo, porque o molde muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o primer hibridizar com o stio de complementariedade e pela tempo de extenso total, temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas esto indicadas com a letra

e sua direita. J as fitas que so produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas previamente copiadas tm fatalmente ser comprimento definido, j que inicia, no primer e terminam ao fim do DNA molde, que exatamente a e extremidade 5do primer j incorporado na fita molde. As fitas de comprimento definido aumentam de nmero exponencialmente, formando aos poucos um imenso nmero d fita duplas de comprimento definido, enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeo da figura a seguir esclarecer o leitor sobre esta questo.

Figura 13: Produo de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Aps hibridizao dos primersa 56 oC, as fitas novas so sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reao.

A visualizao dos produtos de uma reao de PCR costuma ser feita atravs do uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminao UV, "corando" previamente o DNA com brometo de etdio (esta substncia se intercala entre as fitas de DNA e nestas condies absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada). O produto de PCR ser sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro, no gel, ser apenas o comprimento relativo. Esta situao est representada no esquema da figura seguinte.

Figura 14: Visualizao de trs reaes de PCR. Em a e b dois produtos so gerados, a partir de doispares de primers diferentes. Os dois produtos tm comprimentos de 400 e 360 pb. A migrao das bandas na eletroforese de cima para baixo. O fragmento menor migra mais rpido e produz a banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. A coluna c um controle negativo, essencial em qualquer reao de PCR. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA - DNA ladder - de 100 pb). Na transiluminao ou na colorao por prata, evidentemente, todas as bandas tm a mesma cor.

Quando fazemos um PCR, a prtica aconselha a deixar o tubo com os reagentes por 5 a 10 minutos a 94 oC antes de iniciar o ciclo. Em geral 1 minuto a cda temperatura suficiente para as etapas do ciclo, que repetido de 35 a 40 vezes. Por fim, ao terminar a ltima extenso muitas vezes os protocolos experimentais sugerem a manuteno da temperatura de 72 oC por mais 5 a 10 minutos. A opo de esperar 10 minutos antes de comear o ciclo, mantendo o tubo aquecido, garante que todo o DNA alvo esteja desnaturado antes de se iniciar o ciclo. Por outro lado, o perodo final a 72 o C garante que todas as fitas tero o mesmo comprimento pois pode acontecer que, durante o ciclo, algumas fitas copiadas no tenham atingido o fim do molde. A figura a seguir sintetiza o ciclo da PCR.

Figura 15: Ciclo padro de uma PCR. Antes de iniciar o ciclo o tubo com os reagentes mantido a 94C para garantir a desnaturao inicial de todo DNA alvo. Da mesma forma, ao terminar o ciclo, a manuteno do tubo a 72 oC garante que todos as fitas tenham exatamente o mesmo nmero de bases.o

Quando PCRs so realizadas, gerando produtos de diferentes comprimentos, e estes produtos so analisados por transiluminao UV em gel de agarose, o resultado que se obtm pode ser semelhante ao mostrado abaixo. O menor dos produtos migra mais rpido e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser necessrio usar um gel de poliacrilamida.

Figura 16: Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos dePCR com diferentes comprimentos (nmero total de pares de bases) (colunas 2 a 5). Na coluna 1 esto os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido, obtidos

por digesto por enzima de restrio de um DNA conhecido ou sintetizados por mquinas. A coluna 6 um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel apenas a fronteira da eletroforese.

Nos dias de hoje uma PCR feita numa mquina chamada termociclador. simplesmente um bloco aquecido, controlado por um sistema digital, que eleva e abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-placas de 96 poos, etc), de acordo com a programao digitada pelo operador. Mais de duas dcadas foram necessrias para que estas mquinas pudessem atingir um grau de preciso e confiabilidade aceitveis, aliado a um preo razovel. Tambm os reagentes para PCR reduziram de preo consideravelmente na ltima dcada, tornando o mtodo comercialmente atrativo. Uma reao de PCR pode, agora, ser feita por US$ 1,00. Alm do cuidado com a contaminao de amplicons, a PCR exige ateno em vrios outros detalhes. Um deles diz respeito ao pareamento dos primers: a ltima base da extremidade 3 do primer tem que estar corretamente pareada com o DNA alvo, sem o que no ocorrer amplificao. No restante do primer a necessidade de um pareamento exato no existe e, na extremidade 5podemos at mesmo adicionar um segmento fita simples que no vai parear com o DNA alvo. Este ressalto (overhang) no atrapalha em nada a reao e pode adicionar propriedades importantes ao nosso amplicon final. Vejam um exemplo disso na construo da biblioteca de cDNA na aula 6! Outro ponto importante a questo dos erros na sequncia devido tautomeria de bases. A Taq polimerase no faz reviso (proof reading) in vitro. Se, ao copiar pela primeira vez o DNA alvo, ela introduzir uma base errada numa das duas fitas, 25% do produto final estar com sua sequncia diferente nesta base. As consequncias deste erro podem ser trgicas se estamos procurando fazer um diagnstico gentico (veja item correspondente). Para evitar isto todos os testes so feitos em duplicata. A idia que a probabilidade da Taq polimerase "errar" nas duas reaes sempre na primeira extenso muito reduzida e se um resultado conflitante surgir, fica claro que num dos tubos a Taq "errou". Se o "erro" for cometido depois do terceiro ciclo ele j se torna praticamente imperceptvel, pois uma pequena porcentagem das fitas ter erro e no ser possvel detect-lo facilmente. Seria ideal que pudssemos disponibilizar em Downloads um relato de Mullis sobre o PCR a partir da sua apresentao na Academia Nobel. Entretanto, no h na pgina da Academia Sueca que coordena o Nobel (http://www.nobel.se) as palestras de Kary Mullis e Michael Smith. Uma apresentao on-line dos trabalhos dos dois laureados Nobel em Qumica, do ano de 1993 est disponvel: Michael Smith (pelo aperfeioamento da tecnologia da mutao stio-dirigida) e Kary B. Mullis (pela inveno da PCR). http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html

para outro. B. PCR na investigao de Paternidade Uma das aplicaes mais conhecidas da PCR a investigao de paternidade. Tcnicas bioqumicas ou moleculares (voltadas ao DNA) j existiam muito antes da descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnsticos baseados em PCR que a investigao de paternidade alcanou o mercado com mais abrangncia, pela reduo dos custos do exame e democratizao dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties). Para se compreender como funciona a tcnica precisamos recordar um pouco a organizao do genoma humano ( e de muitos outros organismos complexos). Apenas 3% do nosso genoma composto de genes. H, ao contrrio, uma enorme parte dele composta de repeties mais ou menos longas, conforme o caso. No sabemos ainda porque isto ocorre, mas estas repeties podem ser usadas vantajosamente como marcadores moleculares em muitos casos. Como no so genes, no esto sob uma presso seletiva to grande e mostram muito mais variao do que as sequncias de genes propriamente ditas. Dentre as regies repetidas a investigao de paternidade por PCR costuma empregar uma classe de repeties conhecidas como STR - small tandem repeats ou pequenas repeties em tandem. So pequenas regies de DNA com um nmero varivel de repeties de 3 ou 4 nucleotdeos cada, flanqueadas por regies conservadas. Um esquema simplificado de um STR est mostrado na figura abaixo. Como os seres humanos e os demais mamferos so diplides, cada regio de um cromossomo (exceto nos machos o par XY) est presente no outro. Elas no precisam, contudo, ser exatamente iguais. Na representao da figura abaixo chamamos alelos as duas rgies homlogas nos dois cromossomos, por analogia ao que fazemos com genes, embora os STRs no sejam genes. Observe que as regies repetidas esto flanqueadas por regies conservadas que se estendem esquerda (5) e direita (3) das repeties. Para qualquer ser humano estas regies conservadas so as mesmas, mas cada um de ns pode ter um nmero diferente de repeties em cada alelo. Quanto maior o conjunto de diferentes repeties maior ser a informao colhida pela realizao da anlise da regio. Assim, se o nmero de repeties para o caso estudado (cada caso chamado sistema e em geral empregam-se 8 a 16 sistemas, cada um lanando mo de um STR de um cromossoma diferente) varia, digamos, de 3 a 15, haveria 12 possibilidades em cada alelo. Apenas como exerccio, se a probabilidade na natureza fosse a mesma para qualquer uma das repeties (i.e., a frequncia allica fosse a mesma), a probabilidade de um indivduo qualquer ter o arranjo de 4 e 9 repeties mostrado abaixo seria 1/12 x 1/12 = 1/ 144.

Figura 17: Representao esquemtica de um STR e sua amplificao por PCR, atravs de primersdirigidos s regies flanqueadoras conservadas. Os dois produtos gerados tem comprimentos diferentes pois a parte interna da sequncia difere de um alelo para o outro.

Quando o sistema acima analisado em gel de agarose, duas bandas sero visveis se o indivduo for heterozigoto para aquele STR. No caso de investigao de paternidade, o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da me. Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o filho ter um STR (e uma banda) materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a situao onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda est na mesma altura da banda paterna. Portanto, o marido no pode ser excludo de ser o pai. No segundo caso, contudo, a criana tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. Esta situao exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. 2).

Figura 18: Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STRpara investigao de paternidade. A primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos

marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado da amplificao de um sistema para o suposto pai, a me e dois filhos. A banda materna de cada filho est indicada e a banda paterna de um deles est contornada com uma elipse. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho.

A incluso obrigatria da me em testes de paternidade evita que uma eventual troca de recm-nascido na maternidade possa confundir os resultados. O mesmo processo descrito acima pode ser empregado em qualquer animal que tenha reproduo sexuada. preciso apenas identificar os STRs candidatos e avaliar criteriosamente a distribuio dos alelos na populao em estudo. Para os seres humanos os alelos esto distribudos igualmente em todas as populaes do globo, mas em bovinos, por exemplo, devido ao cruzamento controlado pelo produtor, os STRs esto distribudos de forma muito diferente de uma raa para outra. Ainda assim, a avaliao de pedigree em animais de raa um campo crescente de aplicao desta tecnologia. Apenas como lembrete: os STRs no so os nicos alvos possveis para investigao de paternidade via DNA. Alm disso, a investigao bioqumica e gentica de paternidade j era um mtodo bem estabelecido muito antes da inveno do PCR. Sugerimos que o leitor mais interessado procure informaes na internet para complementar esta questo.

C. PCR na investigao de crimes Outro campo frtil para o uso da PCR a criminalstica. A possibilidade de amplificar um pequeno trecho de DNA milhes de vezes permite, em muitos casos, amplificar de uma pequena amostra biolgica (mancha de sangue, bulbo de cabelo, fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservao, suficiente DNA para uma anlise de STRs como a descrita acima. Um caso clssico a investigao da procedncia de uma mancha de sangue no casaco da vtima (ou resto de pele sob as unhas da vtima). Supondo, para fins deste exemplo, que o material no contivesse restos de clulas da prpria vtima, o procedimento para anlise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo. Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas bandas (aparecer apenas uma se o indivduo for "homozigoto" para aquele STR). Na amostra as duas bandas do suspeito 2 esto claramente visveis. O suspeito um tem apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O teste exclui dois indivduos, mas no prova, como na paternidade, que o outro o "dono" da amostra. A incluso do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de no excluso (como no caso de paternidade) para 99,99999999%. Isto quer dizer que no podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99,99999999%.

Figura 19: Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STR

para investigao criminal. Trs suspeitos esto sendo investigados e uma amostra de sangue est disponvel. A primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificao de um sistema para os possveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra. O padro de duas bandas idntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.

Os casos de estupro, em geral, trazem uma complicao adicional: o material colhido na vtima (por exemplo, esperma do criminoso) est misturado com o DNA da vtima (e com muito DNA contaminante no humano, da flora vaginal). Nestes casos o DNA dos suspeitos sempre misturado com o DNA das vtimas antes da amplificao dos STRs. O resultado feito por comparao do padro de 4 bandas das misturas de DNA, uma a uma, de suspeito + vtima, com o padro obtido da amostra colhida da vtima no corpo de delito. A figura abaixo ilustra este caso.

Figura 20: Representao esquemtica de um gel representando o resultado de um sistema de STR

para investigao criminal. Trs suspeitos esto sendo investigados num caso de estupor e uma amostra de sangue est disponvel. A primeira coluna tem marcadores allicos padro, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificao de um sistema para os possveis criminosos, sempre em mistura com o DNA da vtima.. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra colhida no corpo de delito que, supostamente contendo DNA da vtima e do criminoso. A ltima coluna da direita a amplificao apenas do DNA da vtima. O padro de quatro bandas da amostra idntico ao do suspeito 3 e exclui os demais.

As aplicaes forenses (na justia) da PCR so ilimitadas, mas no h espao aqui para maior detalhamento.

D. PCR no diagnstico de enfermidades genticas e na identificao de portadores sos de alelos mutantes. Doenas genticas podem, algumas vezes, ser difceis de diagnosticar. Adicionalmente, no aconselhamento gentico de casais importante determinar inequivocamente se um indivduo portador de um alelo mutante (portador so). A identificao de mutaes em genes pode ser feita tambm por PCR, em geral com a manipulao posterior do produto de amplificao. A seguir exemplificamos duas destas aplicaes. Numa delas o nucleotdeo mutado faz parte de um stio de restrio (se voc lembrar que so mais de 600 as enzimas de restrio, cada uma com seu prprio stio, no ser muito difcil encontrar uma que corte um stio incluindo o nucleotdeo em estudo). Na outra um

artifcio permite detectar qualquer nucleotdeo mutado, faa ele parte de um stio de restrio ou no. A figura abaixo ilustra o caso em que o stio de restrio para EcoRI, GAATTC, inclui um nucleotdeo que est frequentemente mutado no caso da doena gentica em estudo. No alelo normal o stio de restrio est preservado e no alelo mutante ele foi perdido, pela troca de um par AT por um GC. Se o contrrio tivesse acontecido, a tcnica tambm poderia ser aplicada da mesma forma, apenas com a mudana equivalente na interpretao dos resultados. Quando o trecho de DNA em estudo amplificado por dois primers anelando nas regies acima e abaixo da mutao (em princpio todo o restante do gene conservado), os produtos gnicos tero o mesmo tamanho, sejam provenientes do alelo normal (wt - wild type)ou do mutante. Ento, ser preciso uma interveno nos produtos para que uma distino entre eles possa aparecer. Isto feito pela ao da enzima de restrio escolhida (no caso, a EcoRI). O produto de PCR produzido a partir do alelo normal pode ser clivado pela enzima de restrio, dando origem a duas bandas. O produto originado da amplificao do alelo mutante no tem mais o stio para EcoRI e no pode ser clivado, permanecendo do tamanho original. Assim, num indivduo heterozigoto (portador so de uma mutao recessiva) o sistema produzir trs bandas: a maior, correspondente ao produto de PCR do alelo mutante, que no pde ser clivado pela EcoRI, e duas menores, fruto da clivagem do produto de PCR do alelo normal.

Figura 21: Princpio da identificao de mutaes pontuais atravs da eliminao/criao de stios

de restrio e gerao de fragmentos de digesto com polimorfismo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca estudada. A mutao elimina um stio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto destes fragmentos com a enzima EcoRI gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto.

Na avaliao do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve mostrar uma banda nica apenas para o indivduo afetado (homozigoto mutante, com clnica da doena), j que os produtos de PCR dos dois alelos no podem ser clivados pois perderam o stio de restrio para EcoRI. J o homozigoto normal ter seus os produtos de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas bandas estaro visveis. Apenas no caso j discutido (portador so, heterozigoto wt/m) sero visveis trs bandas. A figura abaixo representa de forma esquemtica o resultado de uma anlise PCR/RFLP.

Figura 22: Resultado da investigao da presena de mutao no stio EcoRI por PCR (PCR/RFLP). Afigura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b), um indivduo afetado e um normal homozigoto. A mutao elimina um stio EcoRI existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto destes fragmentos com a enzima gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto.

Em muitos casos de mutaes pontuais a tcnica de PCR/RFLP no pode ser aplicada, seja porque no h stio de restrio conhecido para o entorno da mutao, seja porque mltiplas mutaes so possveis no gene de interesse, tornando a abordagem acima impraticvel. Uma alternativa o mis-match PCR, ou PCR com pareamento errneo. O princpio desta tcnica, descrito pela primeira vez por Cotton et al., em 1988, e tambm conhecido com CMC - chemical mismatch cleavage - baseia-se na clivagem de DNA em locais com pareamento errneo pela piperidina, e est representada na figura abaixo. Um indivduo heterozigoto tem uma mutao pontual numa regio qualquer do gene. Podemos amplificar esta regio com primers dirigidos a suas extremidades, como fizemos na PCR/RFLP. Em seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar rapidamente para induzir a formao de heteroduplexes (uma fita simples de um alelo e a complementar do outro) alm dos homoduplexes (as dus fitas pareadas de volta, de um mesmo alelo). Nas regio no pareadas ou com pareamento errneo com bases C e T liga-se o produto hidroxilamina ou o tetrxido de smio, respectivamente. Uma vez ligados, estes produtos permitem a clivagem do DNA neste local pela piperidina. Assim, 50% dos produtos de PCR sero cortados por este sistema em todo lugar onde houver uma mutao. Em geral os fragmentos gerados pro

este sistema so pequenos e devem ser visualizados em gel de poliacrilamida. A figura abaixo mostra como funciona este sistema.

Figura 23: Resultado da investigao da presena de mutao em uma base desconhecida pela

tcnica de PCR-mismatch. A figura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o mutante o par GC. A amplificao por PCR do trecho onde a mutao est usa primers que esto a alguma distncia direita e esquerda da provvel mutao. Quando o produto do PCR aquecido os dois tipos de fita (TA e GC) se separam, dando origem a 4 fitas simples. Quando a mistura rapidamente aquecida, as fitas simples se reassociam ao acaso de 4 formas distintas, pois a diferena de uma nica base no impede o pareamento das fitas quase complementares. Aps o uso de um sistema qumico adequado, os pares de base errneos so clivados e as fitas com mismatch geram dois fragmentos no gel, ao contrrio das fitas com pareamento perfeito. O heretozigoto aparece, no gel, com trs bandas (veja figura abaixo).

O resultado do experimento descrito acima est esquematicamente representado na figura seguinte. O portador so, heterozigoto, tem uma mutao na posio descrita na figura anterior. O primeiro afetado tem esta mutao nos dois alelos. J o segundo afetado tem um alelo com a mutao da figura anterior e outro alelo com uma mutao mais a direita, como representado na barra vertical ao lado do gel.

Figura 24: Resultado da investigao da presena de mutao pela tcnica de mismatch PCR. A

figura representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b), dois indivduo afetados e um normal homozigoto. A amplificao dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a clivagem destes fragmentos pela piperidina gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado, enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho distinto. No caso do primeiro afetado (homozigoto) no h mismatch interno porque os dois alelos so idnticos. Nocaso do afetado heterozigoto cada alelo diferente do outro em dois pontos distintos, o que gera trs fragmentos pela piperidina, mais o produto no clivado do homoduplex.

No se deve esquecer, contudo, que a presena de um mismatch no significa diretamente uma mutao, pois h na natureza diferenas individuais entre qualquer ser vivo. Estad diferenas, que no significam doena mas diferenas simples entre indivduos so chamadas SNPs. O teste final para o reconhecimento de presena de uma mutao , de fato, o sequenciamento direto do produto de PCR. Se houver diferena entre os alelos, no lugar correspondente eletroferograma haver duas bases possveis (p.ex. T ou A). (veja aula sobre sequenciamento, a seguir). A consulta num banco de dados pblico de SNPs ser essencial, tambm (ver aula de Introduo Bioinformtica, mais adiante).

E. PCR em tempo real - o sistema Taqman Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems (fundida com a Celera na atual Applera), para detectar o produto do PCR medida em que esta vai sendo sintetizado na reao. O engenhoso sistema baseado no uso de uma sonda, dirigida contra uma regio interna da sequncia que se deseja amplificar, e que tem dois fluorocromos, um em cada extremidade da sonda (um DNA fita simples). Na extremidade 5 h um fluorocromo que s fluoresce se estiver distante fisicamente do fluorocromo na posio 3. Este segundo fluorocromo funciona como capturador de energia (quencher) e no deixa com que a energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suficiente para excitar o primeiro fluorocromo. Estes dois fluorocromos esto representados como R e Q (para quencher). Quando o primer hibridiza na regio 5, a sonda tambm o faz no meio da sequncia. medida em que a Taq polimerase avana sintetizando a fita nova, ela vai degradando a sonda sua frente, liberando o fluorocromo R da sonda e permitindo que absorva energia e emita luz. A energia para a excitao dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra e o equipamento que faz isto chama-se PCR em tempo real (real time PCR) ou Taqman. A figura abaixo esclarece este princpio.

Figura 25: Princpio de funcionamento do Taqman, ou PCR em tempo real. Uma sonda fita simples

com dois florocromos adicionada reao de PCR. O fluorocromo Q atua com atenuador da fluorescncia de R, sendo protanto um quencher. Para isto preciso que esteja prximo a R. A TAq polimerase separa os dois fluorcromos medida em que degrada a sonda quando sintetiza a fita nova. O

fluorocromo R recm liberado da sonda emite ento luz num comprimento de onda caracterstico, diferente de Q. A excitao dos fluorocromos feita com laser que atravesse o tubo de reao.

A medio da radiao feita pelo aparelho, que taa um grfico com a absoro obtida aps cada ciclo de PCR. O ciclo em que o patamar (limite) de negatividade ultrapassado est diretamente relacionado quantidade de DNA molde na mistura. Com isto, a quantificao de DNA molde passou a ser no apenas possvel, mais rpida. O sistema ainda bastante dispendioso mas tender a se tornar mais barato medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um maior nmero de mquinas for disponvel.

Figura 26: Grfico obtido com o Taqman. A seta indica o ciclo em que a reao ultrapassa o limiteda reao negativa. Quanto menor a quantidade de DNA molde no tubo de reao maior o nmero de ciclos necessrios para ultrapassar o limite da negatividade. A reao de PCR no Taqman emprega em geral apenas duas temperaturas (94 oC para desnaturao e 60 oC, para hibridizao e extenso) e o resultado da PCR pode ser dado em menos de 30 minutos.

F. Um pouco de histria (em construo) A reao em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idia de Kary B. Mullis. K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau de bacharel em qumica em 1966 no Instituto de Tecnologia da gergia e o PhD em Bioqumica pela Universidade da Califrnia em Berkeley. Passou ento 7 anos como ps-doutor em Cardiologia Pediatria e Qumica Farmacutica na Escola de Medicina da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um convite para trabalhar como tcncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi l que teve a idia da PCR.

Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La Jolla, California, que ele comeou a imaginar uma maneira simples de determinar uma sequncia de nucleotdeos a partir de um trecho de DNA. Ele ento, como querem para si outros cientistas, tece uma inspirao sbita: a soluo no era apenas para seu problema original, mas tinha um alcance muito maior. Ele imaginou uma forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pr-determinados e, consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma maneira de amplificar exponencialmente uma sequencia de DNA num tubo de ensaio. Mullis ento levou a idia para seus colegas da Cetus e juntos eles a colocaram para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela primeira vez ao pblico numa conferncia em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela comunidade cientfica. A popularidade da tcnica, assim como seu conceito, ganhou crescente popularidade ao longo dos anos seguintes. Em 1989 a revista Science escolheu a molcula usada na PCR, a Taq polimerase, como a primeira "Molcula do Ano". Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratrios pelo mundo afora e referncias ao uso da tcnica j somavam milhares nas revistas cientficas. Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganizao corporativa, vendeu a patente da PCR para a Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00. Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu o prmio Nobel de Qumica em 1995. Esta indicao foi duramente contestada por muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de tcnica e que sua concepo no era suficiente para dar a Mullis o status de nobelista. Mullis argumentou a seu favor que a unio das tcnicas pr-existentes no formato por ele criado fazia toda a diferena. Para uma histria um pouco mais detalhada sobre o desenvolvimento da PCR veja o site http://usitweb.shef.ac.uk/~mba97cmh/history/history.htm

G. Artigos importantes sobre PCR Uma seleo dos mais importantes artigos sobre PCR, tanto durante o desenvolvimento da tcnica quanto para diversas aplicaes, pode ser encontrada na pgina especfica da Universidade de Berkeley: http://sunsite.berkeley.edu/pcr/foundationalPCR.html#anchor1239949 Vale a pena conferir!

IV. Sequenciamento de DNA At meados da dcada de 70 no era nada simples obter uma sequncia de DNA, fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais complicado do que com protenas e o conhecimento sobre os cidos nuclicos avanava de forma lenta. No incio da dcada de 80 uma tcnica relativamente rpida de sequenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de uma cadeia de DNA com diferentes produtos qumicos e a visualizao dos fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcao radiativa das molculas porque a quantidade de material produzida era muito pequena e no podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas dificuldades houve ento um rpido progresso no conhecimento de sequncias de DNA. Poucos anos depois um novo avano tecnolgico foi alcanado pela introduo da tcnica de interrupo da sequncia pela incorporao aleatria de um nucleotdeo modificado (sem a hidroxila na posio 3), que ficou conhecida como tcnica de didesoxi ou dideoxi. Esta tcnica suplantou imediatamente a anterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automticos de DNA, sobre os quais versa este captulo. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento manual, mas muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substncias radiativas. De uma forma geral quando desejamos saber uma sequncia de bases de um fragmento qualquer de DNA, purificamos o fragmento e enviamos para sequenciamento numa empresa prestadora deste servio. Mas, afinal, como produzir um DNA para sequenciamento e do que se trata a tcnica de dideoxi? A primeira parte da pergunta crucial: de fato, se queremos sequenciar um trecho de DNA, temos que ter uma grande quantidade dele no nosso tubo de ensaio. Duas formas corriqueiras de se obter grandes quantidades de uma determinada sequncia de DNA so a clonagem em plasmdeo e a PCR. Se o DNA que queremos sequenciar for o inserto de um plasmdeo, tudo o que precisamos crescer 200 microlitros da bactria com o plasmdeo e, empregando as tcnicas j usuais de extrao de DNA, obter o plasmdeo purificado, que ser empregado na reao de sequenciamento. Se ainda no tivermos o material clonado, podemos empregar a PCR e amplificar o trecho a ser sequenciado, purificando a banda do gel e usando o material assim obtido para iniciar a reao do sequenciamento. Neste caso, precisamos saber apenas as sequncias das extremidades do trecho a ser sequenciado. A segunda parte da pergunta exige uma explicao mais detalhada.

Inicialmente, temos que recordar o que seja um didesoxinucleotdeo trifosfasto, ou ddNTP. O precursor normal da sntese de DNA o dNTP, ou desoxiribonucleotdeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posio 3. a partir desta hidroxila que a fita nascente estendida. Um ddNTP, entretanto, no tem esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a incorporao de outros nucleotdeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado associado radiao ou fluorescncia, a fita interrompida ficar radiativa ou fluorescente e poder ser detectada mais facilmente. Para fins desta aula vamos admitir que cada didesoxibase est marcada com uma florescncia diferente. Portanto, as fitas terminadas em A, T, G ou C vo emitir cores diferentes quando excitadas com luz de um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser). Em seguida temos que entender como a reao de sequenciamento pode comear sempre exatamente da mesma base, a partir do DNA molde que adicionamos reao. Para tal, basta recordarmos que uma nova fita simples s sintetizada se tivermos um DNA molde, uma DNA polimerase, dNTPs (e neste caso, um pouco de ddNTPs fluorescentes) e, finalmente, um primer! neste primer que reside o segredo do incio exato da reao de extenso: o primer sempre pareia exatamente na posio esperada, jamais uma base antes ou uma depois, por exemplo. Por isso, todas as fitas estendidas a partir deste primer iniciam rigorosamente na mesma base, a partir do primer e copiando a fita molde. Por fim, basta recordarmos que as fitas assim produzidas devem ser muito numerosas para poderem ser detectadas. Por isso, temos que comear a reao de sequenciamento com muito mais DNA do que uma reao de PCR. As fitas produzidas podem ser separadas pelo tamanho em eletroforese de poliacrilamida, e a base final da sequncia da fita identificada pela fluorescncia emitida quando a banda eletrofortica correspondente fita cruza o ponto do gel que iluminado por um feixe de laser. Neste sistema de deteco a eletroforese no pra, as bandas passando no fim (em baixo) do gel que so detectadas em movimento. Com isto, podemos identificar com preciso 600 a 700 bases a partir do primer. Na figura abaixo exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a partir de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma sequncia especfica (em vermelho) do plasmdeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto (azul) entre os stios de restrio EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um comprimento muito varivel, tipicamente entre 500 e 3000 pb. No exemplo estamos admitindo que, numa determinada posio na sequncia do inserto, uma parte dele tem uma base A e outra uma base G. o que ocorre se clonarmos um trecho de DNA de um alelo para o qual o doador heterozigoto. Observe tambm que, do lado direito do inserto, h uma sequncia (em verde) na qual pode parear um outro primer, que ser empregado no sequenciamento quando quisermos vir da direita para a esquerda sobre

o inserto. Jamais, contudo, os dois primers so empregados simultaneamente, e por isto a reao de sequenciamento NO UMA PCR!!! Por isso, no temos tanta preocupao com contaminao como nas reao de PCR: podemos fazer mltiplas reaes de sequenciamento, lado a lado, numa placa de 96 micropoos e mesmo reutilizar boa parte do material plstico empregado no preparo do DNA ou na reao de sequenciamento, em si, bastando para isto lavar bem o material. Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos so gerados, porm nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual tamanho terminaro em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os fragmentos representados na parte de cima esto organizados por ordem de tamanho. Observe que: a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminaro na mesma base (exceto no caso do polimorfismo do DNA molde); b) podem existir fitas terminado na mesma base (afinal, s temos 4 opes, A,T,G ou C!), com comprimentos diferentes. No h qualquer restrio para isto. c) h espaos mostrados na sequncia, onde no havia nenhum fragmento gerado do tamanho esperado. Isto s acontece quando a reao gera poucos fragmentos, mas uma reao deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de cada tamanho e muito pouco provvel que existam sequncias no representadas de um comprimento qualquer. d) apenas onde h polimorfismo de base do DNA molde h fragmentos do mesmo tamanho terminando em bases diferentes ( o caso A/G). Examine, por favor, atentamente a figura abaixo antes de continuar a leitura desta aula.

Figura 27: Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do primer, interrompidosquando um didesoxinucleotdeo incorporado na fita. Os didesoxinucleotdeos so marcados com substncias fluorescentes diferentes, conforme a base (A,T,G ou C).

Quando os fragmentos gerados numa reao de sequenciamento so separados por eletroforese, os fragmentos menores vo frente, seguidos dos demais, sendo a distncia entre as bandas aproximadamente igual, pois representa sempre a diferena de uma base a mais ou a menos. A figura 8.2 mostra esquematicamente como esta

separao acontece e como a fluorescncia nas bandas identificada, medida em que elas atravessam um trecho do gel que iluminado por um feixe laser (representado pela barra verde na parte de baixo do gel). Observe que a distncia entre as bandas regular. Um gel pode permitir o sequenciamento de 600-700 bases para cada reao, e podemos correr at 96 reaes por gel. H no mercado tambm sequenciadores de DNA de ltima gerao nos quais o gel foi substitudo por um feixe de capilares, que so automaticamente preenchidos por um polmero, ao invs de gel. Cada reao de sequenciamento separada no seu capilar e a fluorescncia detectada individualmente. o que evita uma eventual confuso entre sequncias causada pelos desalinhamentos das corridas eletroforticas, comum nos gis. H mquinas com feixes de 1 a 384 capilares. As maiores so capazes de produzir mais de 2 mil sequncias em 24 horas. Examine, por favor, atentamente a figura 8.2 abaixo antes de continuar a leitura desta aula.

Figura 28: Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na frente. So

iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando atravessam a janela do feixe. Um gel pode resolver 96 sequncias simultaneamente. Os gis tm sido substitudos por capilares preenchidos de polmero nas mquinas mais modernas. As bandas pretas indicam ausncia de material e so apenas um recurso grfico usado aqui para indicar o espao aumentado entre bandas que aconteceria neste caso. Entretanto, isto no ocorre na reao de sequenciamento finalizada, porque o nmero de fragmentos gerados muito grande e a probabilidade de uma classe de tamanho no ser representada na reao praticamente nula.

A fluorescncia emitida pela passagem de uma banda pela janela de medio registrada por um sistema de microcmaras sensoras, que por sua vez transforma o sinal num grfico, conhecido como eletroferograma. Os picos representam as bandas, e quanto mais altos e agudos mais qualidade tm, isto , maior ser a probabilidade de que a base registrada seja correta. O valor de qualidade medido por um programa chamado Phred, que leva em conta vrios parmetros (espaamento entre bandas, largura e altura do pico, intensidade absoluta do sinal, rudo de fundo, etc). Geralmente emprega-se como padro aceitvel de qualidade o valor Phred 20, que corresponde a aprox. 99% de certeza da base indicada. A figura 8.3 abaixo mostra um eletroferograma obtido no sequenciamento de um inserto de cDNA do parasita Leishmania chagasi. Observe que, neste trecho, a qualidade do sequenciamento muito alta, com espaamento regular dos picos (que indica espaamento regular das bandas) e picos agudos. No h nenhum polimorfismo de bases, nem poderia haver, pois esta sequncia foi obtida a partir de um clone de cDNA.

Figura 29: Eletroferograma parcial de uma sequncia de DNA obtida no sequenciador automtico

ABI3100 Prism, da Applied Biosystems, na Unidade de Genmica do Laboratrio de Gentica Molecular do Departamento de Gentica da UFPE. Observe que os picos so agudos e regularmente separados, o que indica alta qualidade do sequenciamento neste trecho

Esperamos que este texto tenha esclarecido a maior parte das questes bsicas pertinentes ao sequenciamento de DNA. Entretanto, julgamos que uma visita nossa sub-pgina de animaes essencial, pois a animao sobre sequenciamento muito ilustrativa do que foi dito aqui. Em edies futuras desta aula outras questes sero abordadas e discutidas: a) a qualidade da sequncia e o aspecto do eletroferograma b) a identificao de polimorfismos c) a contaminao de primers e de clones d) as limitaes do sequenciamento automtico de DNA

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