PREPARO DE ANTÍGENOS PARA

IMUNIZAÇÃO DE ANIMAIS

PARA A OBTENÇÃO DE SOROS

PRECIPITANTES E

AGLUTINANTES

Prof. Helio José Montassier

• Objetivos:-

• ESTUDAR AS BASES DO FUNCIONAMENTO SISTEMA IMUNE

• ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS

– Preparar antissoros para serem testados em reações de soro-precipitação, como o teste de imunodifusão dupla em gel de ágar. (Ags solúveis)

– Preparar antissoros para serem testados em reações de soro-aglutinação, como o teste de hemaglutinação. (Ags Partículados)

O Fenômeno Básico na Ativação do Sistema Imune Adaptativo

ESTÍMULOS

SISTEMA IMUNE

RESPOSTAS IMUNES ADAPTATIVAS

-Resps. Imunes Humorais – Acs-Resps Imunes Celulares – Linfs. T efetores

Ags solúveis:-São constituídos por macromoléculas de Proteínas (> parte) ou de Polissacarídeos (< parte). Exs. Principais – Soroalbumina bovina, gamaglobulina bovina, ovoalbumina.

Ags Particulados:-São constituídos por células de procariotos ou eucariotos.Exs. Principais – Eucariotos – Hemácias de Carneiro e de Galinhas; Procariotos – Diferentes tipos de bactéirias.

Principais Tipos de Antígenos Usados em Imunologia

Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags:

•Peso molecular

•Complexidade molecular

•Concentração

•Digestibilidade intra-celular

Influência das doses de Ags nas RI s

Primárias e Secundárias

Adjuvantes

São imunomoduladores, ou seja, substâncias capazes de potenciar, inespecificamente, as respostas imunes contra os antígenos.

Principais Tipos de Adjuvantes:

Minerais – Ex: Al(OH)3, óleo mineral/emulsionante (Adjuvante Incompleto de Freund –AIF)

Orgânicos – Ex: Saponina, óleos vegetais e lecitina de soja

Microrganismos e Produtos derivados de microrganismos – Ex: bactérias (Mycobacterium spp.; Propyonabacterium acnes; bactérias gram negativas - LPS), fungos (Sacharomyces cerevisae - Glucana).

OBS: O Adjuvante Completo de Freund (ACF) é composto de óleo mineral + emulsionante + Mycobacterium spp.

Efeitos principais dos Adjuvantes:-

• Efeito depósito

• Aumentar resposta inflamatória no local da inoculação

• Ativação de células imunocompetentes ou apresentadoras de antígenos

Fases das Respostas Imunes Adaptativas Humorais e Cito-mediadas

PRINCIPAIS VIAS DE ADMINISTRAÇÃO de Ags

Para cada agente imunizante há uma via de administração recomendada, que

deve ser obedecida rigorosamente. Caso isso não seja atendido, podem

resultar em menor proteção imunológica ou maior frequência de eventos

adversos

VIA ORAL - A solução é introduzida na cavidade oral e é utilizada para substâncias que são absorvidas no

trato gastrintestinal.

VIA INTRADÉRMICA - A solução é introduzida na camada superficial da pele e a absorção é mais lenta.

Indicação:; Teste de tuberulina.

VIA SUBCUTÂNEA - Também tem lenta absorção, pois se trata de um tecido menos irrigado geralmente

indicada para vacinas de vírus atenuado.

VIA INTRAMUSCULAR - Utilizada para administração de soluções irritantes com volume máximo de 5 ml em

adultos; em crianças, 0,5 a 1 ml, no deltoide é considerado seguro. Tem rápida absorção porque é uma região

bastante vascularizada.

Perfil de Respostas Imunes em Grupos de Animais Vacinados

Imunização: necessidade de doses de reforço e/ou boosters para

serem geradas RIs de maior intensidade

Figura - Anticorpos

podem ser induzidos por

pequenos grupos

químicos chamados

haptenos apenas quando

estes estão conjugados a

uma proteína carreadora

imunogênica.

I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA E IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS

1. Preparar uma solução de Gama Globulina Bovina (GGB) a 2 mg/ml.

2. Após a dissolução misturar 1ml da solução de GGB com 1ml de adjuvante completo de Freund (ACF) e em um outro conjunto de seringas com 1ml de adjuvante incompleto de Freund (AIF).

3. Misturar a solução de GGB com a de hidróxido de alumínio a 2,5% na proporção de 7 volumes da primeira para 3 volumes da segunda

4. Imunizar a cada 15 dias durante 30 dias grupos de 5 camundongos cada um, sendo cada grupo para um adjuvante diferente. A via de injeção é subcutânea (região cervical), devendo-se inocular 0,1ml por animal.

5. Sangrar os animais 2 semanas após o início e, ao final, 1 semana após a reimunização. Separar os soros, nos 2 casos e fazer a titulação deles por imunodifusão dupla em gel de ágar.

II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE CARNEIRO

1. O sangue é retirado previamente com anticoagulante (solução de Alsever) de um carneiro, conforme o descrito no roteiro anterior.

2. Passar o sangue colhido por um funil com algodão hidrófilo.

3. Recolher o sangue filtrado e centrifugá-lo a baixa rotação por 5 minutos.

4. Dispensar o sobrenadante com pipeta pasteur ou com trompa de vácuo.

5. Colocar cerca de l0ml de salina, homogeneizar e centrifugar novamente, para lavar as hemácias.

6. Repetir os ítens (4) e (5) mais 2 vezes, ou até quando o sobrenadante estiver claro.

7. Preparar a suspensão de hemácias a l0% (v/v) em solução salina. Homogeneizar bem.

8. Injetar 3 grupos de camundongos de 5 camundongos cada, por via subcutânea (0,1ml/animal). Em 5 camundongos injetar hemácias de carneiro com adjuvante completo de Freund, em outros 5 camundongos injetar a mistura de hemácias de carneiro mais adjuvante incompleto de Freund e nos outros 5 camundongos restantes injetar a suspensão de hemácias sem adjuvante.

9. Repetir as imunizações depois de 15 dias, e sangrar 15dias depois da última imunização.