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PESQUISA DA INTERAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO

EGFR E DA COX-2 NOS TUMORES DE MAMA DA

CADELA

MARIA JOÃO GONÇALVES GUIMARÃES

Dissertação de Mestrado em Oncologia

2012

PESQUISA DA INTERAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DO EGFR E

DA COX-2 NOS TUMORES DE MAMA DA CADELA

Maria João Gonçalves Guimarães

Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em

Oncologia submetida ao Instituto de Ciências

Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto.

Orientador – Profª Doutora Felisbina Queiroga

Categoria – Professora Auxiliar com Agregação

Afiliação – Departamento Ciências Veterinárias –

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Co-orientador – Prof. Doutor Carlos Lopes

Categoria – Professor Catedrático Jubilado

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas Abel

Salazar da Universidade do Porto

Co-orientador – Profª Doutora Isabel Pires

Categoria – Professora Auxiliar

Afiliação – Departamento de Ciências Veterinárias –

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

i

Dedicatória

Dedico este trabalho às pessoas que mais amo nesta Vida e que tenho a graça, o

prazer e a enorme felicidade de ter ao meu lado:

Ao Rui, meu marido, meu companheiro, meu melhor amigo, pelo amor e amizade que

me dedica, pela compreensão e paciência que lhe exijo, pela dignidade e integridade que

lhes são marcantes, pela inteligência e cultura que transmite… por ser como é… pois não

o queria diferente.

Aos meus Pais, pela compreensão e auxílio que sempre me deram, por me amarem

incondicionalmente mesmo quando tenho mau feitio, pelo exemplo de Vida que são e

sempre foram para mim. Tenho orgulho em ser vossa filha.

Ao meu filho ou filha, pois ainda não sei se será menino ou menina, mas que me

acompanhou nestas últimas semanas de redação da tese, fazendo a sua parte: não me

dando muitos enjoos e fazendo-me esboçar um sorriso sempre que lembrava que uma

vida crescia dentro de mim. Já é para mim o motivo de maior orgulho e felicidade… deu

sentido à expressão amor incondicional.

Aos meus animais de quatro patas, Mel, Pompeu e Mia que, apesar de não serem

pessoas, enchem o meu coração e a minha casa. Pela amizade e momentos de

felicidade que me proporcionam.

ii

Agradecimentos

Ao longo da realização deste trabalho muitas foram as pessoas que contribuíram com

a sua sabedoria, compreensão, disponibilidade, amizade e paciência. A todas deixo aqui

um obrigado, profundamente sentido e sincero:

À Professora Doutora Felisbina Luísa Queiroga, por ter aceite a árdua tarefa de me

orientar e guiar nesta importante etapa da minha vida. Agradeço a sabedoria, o tempo e a

simpatia investidos. Agradeço a energia e motivação transmitidas e que me fizeram ter

maior interesse e garra pela investigação científica e pela vida em geral.

Ao Professor Doutor Carlos Lopes, por me ter orientado na realização desta tese, pela

gentileza que o carateriza e pelos sábios conselhos e conhecimentos que me facultou.

À Professora Doutora Isabel Pires, minha co-orientadora, pela mestria, amizade,

simpatia e humildade com que sempre me auxiliou. A sua boa disposição, disponibilidade

e carinho em cada gesto, marcaram muito o desenrolar deste trabalho.

À Drª Maria Isabel Carvalho, minha querida colega neste trabalho, por toda a entrega,

boa disposição, disponibilidade, incentivo, conhecimentos, inteligência e experiência

transmitidos. Foi fundamental para a realização deste trabalho… e foi um prazer trabalhar

com ela.

Às Senhoras Lígia Lourenço, Ana e Glória por toda a ajuda dada no trabalho de

laboratório e pela gentileza demonstrada.

À minha companheira de sempre, Ana Paula, amiga de todas as horas, pelo exemplo

de pessoa que é, pela inteligência, persistência, garra e emoção com que defronta a

Vida… é um modelo para mim.

Aos meus colegas de trabalho, por toda a compreensão, preocupação e

disponibilidade demonstradas durante todo o período de realização deste mestrado.

À minha família, por ser a melhor do Mundo, por me fazer sentir a felicidade plena

quando estamos juntos, pela amizade e amor que nos une a todos.

À minha prima Vanda, por ser uma verdadeira irmã, por estar sempre presente, pela

amizade e pela imprescindível ajuda na realização deste trabalho. Sem ti ia ser mais

difícil levar este barco a bom porto.

iii

Resumo

A neoplasia mamária assume-se como a entidade tumoral que mais frequentemente

assola os canídeos do género feminino. Apesar dos reconhecidos progressos médico-

científicos, urge a necessidade de descoberta de modalidades terapêuticas mais

direccionadas e, consequentemente, mais eficazes.

Assim, a pesquisa de marcadores moleculares com potencial como alvo terapêutico

assume um crescente interesse no seio da comunidade científica. Nesse sentido, à

semelhança do descrito em vários tumores humanos e dada a escassez de informação

em tumores mamários de cadela, os objetivos do nosso trabalho consistiram na

determinação da interacção entre as expressões de Cox-2 e EGFR em 43 tumores

mamários malignos de cadela, pelo método da imunohistoquímica, e a sua associação

com características clínico-patológicas.

Os nossos resultados vieram demonstrar a já conhecida associação entre a expressão

de Cox-2 com características de malignidade tumoral, revelando também uma

associação estatisticamente significativa entre a expressão de EGFR e a metastização

nos linfonodos. Foi estabelecida uma correlação positiva e estatisticamente significativa

entre as expressões de Cox-2 e de EGFR. Constatou-se também que tumores com

elevadas expressões de Cox-2 e EGFR apresentavam correlação com características de

malignidade tumoral, nomeadamente grau nuclear (p=0,049), grau histológico de

malignidade (p=0,031) e metastização nos linfonodos (p=0,025).

Os resultados alcançados pelo nosso estudo abrem perspetivas para uma possível

utilização de inibidores seletivos de Cox-2 e de EGFR, no contexto dos tumores de mama

de cadelas.

Palavras-chave: tumores de mama, EGFR, COX-2, imunohistoquímica, alvo terapêutico.

iv

Abstract

The mammary tumor is assumed as the oncological entity that most often plagues

female dog. Despite the recognized scientific medical progress, there is an urgent need

for discovery of therapeutic modalities more targeted and therefore more effective.

Thus, the research of molecular markers with potential as a therapeutic target assumes

a growing interest within the scientific community. Accordingly, as described in a number

of human tumors and given the lack of information on canine mammary tumors, the

objectives of our work consisted in determining the interaction between the expressions of

Cox-2 and EGFR, in 43 malignant mammary tumors of bitch by the method of

immunohistochemistry, and its association with clinicopathological characteristics.

Our results showed the already known association between the expression of Cox-2

with characteristics of malignancy, revealing also a statistically significant association

between EGFR expression and presence of metastasis in lymph node. We established a

positive and statistically significant correlation between the expression of Cox-2 and

EGFR. It was also found that tumors with high expression of Cox-2 and EGFR were

correlated with characteristics of malignancy, such nuclear grade (p=0,049), histologic

grade of malignancy (=0,031) and metastasis in lymph nodes (p=0,025).

The results achieved by our study open perspectives for a possible use of selective

inhibitors of COX-2 and EGFR, in the context of mammary tumors in female dogs.

Keywords: mammary tumors, EGFR, COX-2, immunohistochemistry, therapeutic target.

v

Índice Geral

INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 1

1.1- Anatomia da glândula mamária .......................................................................... 2

1.2- Etiopatogenia ...................................................................................................... 3

1.3- Etiologia Hormonal ............................................................................................. 5

1.3.1- Receptores de estrogénio ........................................................................................................ 5

1.3.2- Receptores de progesterona.................................................................................................... 6

1.3.3- Hormona do crescimento (GH) e factor I de crescimento tipo insulina (IGF-I) ....................... 6

1.3.4- Prolactina ................................................................................................................................. 7

1.4- Factores de prognóstico clínicos e histopatológicos ........................................... 7

1.5- Marcadores Moleculares..................................................................................... 9

1.5.1- Cox-2 ...................................................................................................................................... 10

1.5.2- EGFR ....................................................................................................................................... 12

1.5.3- Cox-2 e EGFR .......................................................................................................................... 14

1.6- Breve abordagem de modalidades de tratamento .............................................15

OBJECTIVOS DO TRABALHO EXPERIMENTAL ................................................................................... 18

MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................................... 19

3.1- Descrição do material utilizado e sua proveniência ...............................................19

3.2- Métodos ................................................................................................................19

3.2.1- Avaliação clínico-patológica ................................................................................................... 19

3.2.2- Avaliação histopatológica ...................................................................................................... 19

3.2.3- Avaliação imunohistoquímica ............................................................................................... 21

3.2.3.1- Procedimento ...................................................................................................................... 22

3.2.3.2 - Métodos de avaliação e quantificação da imunorreactividade ......................................... 23

3.2.4 - Análise estatística .................................................................................................................. 25

RESULTADOS .................................................................................................................................... 26

4.1- Análise descritiva da amostra em estudo ..............................................................26

4.1.1. Variáveis clínico-patológicas .................................................................................................. 26

4.1.2- Imunoexpressão da Cox-2 e do EGFR nos tumores mamários caninos ................................. 28

4.1.3- Associação da Cox-2 e do EGFR com as variáveis clínico-patológicas ................................... 37

4.1.4- Relação entre a expressão de Cox-2 e de EGFR (associação e correlação) ........................... 39

4.1.5- Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e EGFR com as variáveis clínico-patológicas 40

vi

DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 43

CONCLUSÃO ..................................................................................................................................... 51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 52

vii

Índice de Figuras

Figura 1: Anatomia das glândulas mamárias.……………………………….…………………2

Figura 2: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma tubulopapilar, com localização

predominantemente membranar……………………………………………...........................28

Figura 3: Pormenor da imagem anterior…………………………………………………........29

Figura 4: Imunorreactividade para EGFR em carcinoma tubulopapilar……………………29

Figura 5: Pormenor da imagem anterior………………………………………………….……30

Figura 6: Imunorreactividade para Cox-2, em carcinoma sólido……………………………32

Figura 7: Imunorreactividade para Cox-2,em carcinoma sólido com invasão

vascular…………………………………………………………………………………………...33

Figura 8: Imunorreactividade para a Cox-2 nas células tumorais, que se dispõem em

estruturas tubulares……………………………………………………………………………...33

Figura 9: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma sólido……………………………34

Figura 10: Imunorreactividade para EGFR, em carcinoma sólido com invasão

vascular……………………………………………………………………………………………35

Figura 11: Imunorreactividade para EGFR, de forma difusa e intensa, em carcinoma

tubulopapilar………………………………………………………………………………….…..35

Figura 12: Imunorreactividade para EGFR em carcinoma tubulopapilar………….…….…36

viii

Índice de Quadros

Quadro 1: Atribuição do índice mitótico, segundo o número de mitoses, contado num campo de grande ampliação (400x) com diâmetro de 0,53mm……………………….……20

Quadro 2: Critérios de avaliação do grau histológico de malignidade, segundo Goldshmidt

et al (2011)……………………………………………………………………………………..…21

Quadro 3: Avaliação da imunorreactividade da Cox-2 e do EGFR………………………...24

Quadro 4: Síntese das características da amostra em estudo e respetivas frequências

absolutase relativas…………………………………………………………………………...…27

……………………………………………………………………………………………………..28

Quadro 5: Avaliação da imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos tumores mamários …..31

Quadro 6: Associação entre imunoexpressão de Cox-2 e de EGFR e as variáveis clínico-

patológicas pelo teste de x2………………………………………………………………..……37

Quadro 7: Associação da expressão de Cox-2 com a expressão de EGFR em TMC

malignos…………………………………………………………………………………………..39

Quadro 8: Correlação entre Cox-2-EGFR ………………………………………………….…40

Quadro 9: Relação entre os grupos Cox-2/EGFR e as variáveis clínico-

patológicas…………………………………………………………….………………………….41

Lista de Abreviaturas e Siglas

ix

% - Percentagem

ºC - Graus Celsius

μm - Microlitro

μm - Micrómetro

ANOVA - Análise de variância

cm - Centímetros

DAB - Tetra-hidrocloreto de 3,3’-Diaminobenzidina

dm3 - Decímetro cúbico

EGF - Epidermal growth factor (fator de crescimento da epiderme).

EGFR - Epidermal growth factor receptor (receptor do fator de crescimento epidérmico)

5-FU - 5-Fluorocil

GH - Growth hormone (Hormona do crescimento)

GD - Grau de diferenciação tubular

GHM - Grau histológico de malignidade

GN - Grau nuclear

g - Gramas

HE - Hematoxilina-eosina

HER2/neu - Human Epidermal growth factor Receptor 2

HRP - Sistema de detecção Ultravision de volume Anti-Polivalente

HVUTAD - Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

IGF-I - Insuline-like growth factor-I (Fator I de crescimento tipo insulina)

IgG - Imunoglobulina G

IL - Interleucina

IM - Índice Mitótico

IP- Índice de Proliferação

MAPK - Mitogen-activated protein kinase (proteina cinase activada por mitogéneos)

min - Minutos

mL- Mililitro

MMP - Metaloproteinase de matriz

mRNA - Ácido ribonucleico mensageiro

n - Número de amostras

NSCLC - Non-small cell lung cancer

OMS - Organização Mundial de Saúde

OVH - Ovariohisterectomia

p – Nível de significância estatística

x

PBS - Tampão fosfato salino

PCNA - Proliferating cell nuclear antigen (antigénio nuclear de células em proliferação)

PCR - Polymerase chain reaction

PG - Prostaglandinas

PRL- Prolactina

PGE2 - Prostaglandina E2

PGH2 - Prostaglandina H2

r – Coeficiente de correlação

® - Marca registada

RE - Recetores de Estrogénio

RP - Recetores de Progesterona

seg.- Segundo

SPSS - Statistical Pachage for the Social Sciences

SRD - Sem Raça Determinada

TGFβ - Factor de crescimento tumoral beta

T - Tamanho tumoral

TMC - Tumores mamários caninos

TNF-α - Factor de necrose tumoral alfa

TX - Tromboxanos

UTAD - Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

VEGF - Vascular endothelial growth factor (factor de crescimento do endotélio vascular)

x - Vezes

χ2 - Teste de Qui-quadrado

W - Watts

1

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO

A incidência de neoplasias nos pequenos animais tem vindo a crescer nos últimos

anos graças a um aumento da esperança média de vida, à semelhança do que ocorre

nos seres humanos (Thuróczy et al., 2007).

A recente sequenciação do genoma canino e a evidência da sua similitude com o

genoma humano, deu ênfase ao cão como um atractivo modelo alternativo para a

investigação do cancro (Lindblad-Toh et al, 2005, Joy et al., 2006). Para isso também

contribuiu o facto de os cães terem um tamanho corporal considerável, uma variabilidade

genética semelhante aos humanos e desenvolverem tumores espontâneos num contexto

de um sistema imunitário natural. Além disso, ao contrário dos animais de laboratório,

estas espécies partilham o mesmo ambiente e estão expostas aos mesmos

carcinogénios, desenvolvendo contudo tumores em menor período de tempo, fruto da sua

menor longevidade comparativamente com as pessoas (Owen et al., 1979; Alenza et al.,

2000; Lee et al., 2004; Uva et al., 2009; Tahmm et al., 2010; Singer et al., 2012).

O desenvolvimento de tumores espontâneos em canídeos e humanos é, portanto, um

fenómeno altamente incidente, partilhando imensas características: aparência histológica,

genética tumoral, alvos moleculares, comportamento biológico, resposta à terapia

convencional (Kumaraguruparan et al., 2006; Paoloni et al., 2008; Uva et al., 2009).

A neoplasia mamária assume-se como o segundo tumor mais frequente em cães,

embora seja o mais frequente em canídeos do género feminino (Stratmann et al.,2008;

Andrade et al., 2010). Considerando ambos os géneros, os tumores mais frequentes são

os de pele (Solano-Gallego, 2010; Sangha, et al., 2011). Os tumores da glândula

mamária raramente ocorrem em cães machos, sendo a sua incidência inferior a 1%, e

parecem estar associados a alterações hormonais, tais como as que ocorrem nos

tumores das células de Sertoli, onde se verifica a secreção de estrogénios (Misdorp,

2002; Rutteman et al.,2001; Henson, 2003). Assim, os tumores mamários constituem a

lesão neoplásica mais comum nas fêmeas da espécie canina, sendo a proporção de

tumores malignos de aproximadamente 41 a 53% (Andrade et al., 2010). Apresentam

uma distribuição multicêntrica e um único animal pode apresentar mais do que um tipo de

neoplasia (Allen et al., 1986). Os tumores mamários em cadelas têm uma incidência três

vezes superior aos tumores da mama nas mulheres (Misdorp, 2002, Cassali et al., 2007)

Dissertação de Mestrado em Oncologia ICBAS

2

1.1- Anatomia da glândula mamária

Normalmente os canídeos têm cinco pares de glândulas mamárias, observando-se

distinta separação na linha média entre as cadeias mamárias direita e esquerda. As

glândulas mamárias estendem-se desde a parte ventral do tórax até à região inguinal

(Evans,1979; Peleteiro, 1994; Tyler, 2002; Ettinger et al.,2010).

A irrigação sanguínea das glândulas mamárias em canídeos provém dos ramos

esternais das artérias torácica interna, intercostal e torácica lateral, da artéria epigástrica

superficial cranial e das artérias epigástrica superficial caudal, epigástrica profunda

cranial, abdominal segmentada, labial, e ilíaca circunflexa profunda. A drenagem venosa

das glândulas é semelhante à irrigação arterial, embora pequenas veias podem cruzar a

linha média entre as glândulas mamárias direita e esquerda. Também os vasos linfáticos

podem cruzar a linha média e assim penetrar nas paredes abdominal e torácica. O

linfonodo axilar recebe a drenagem linfática das glândulas torácicas (cranial e caudal),

enquanto o linfonodo inguinal superficial recebe a drenagem das glândulas abdominais

(craniais e caudais). Os vasos linfáticos da terceira glândula mamária normalmente

drenam através do linfonodo axilar, mas podem fazê-lo por caudalmente (Evans,1979;

Slatter, 1998).

A drenagem pode fazer-se para a veia jugular comum ou formar conexões com os

troncos traqueais e ducto torácico. A mama torácica cranial drena somente para o

linfonodo axilar, através de um canal linfático isolado (Getty, 1986; Sautet et al., 1992;

Rahal et al.,1995). A mama torácica caudal pode drenar apenas para o linfonodo axilar

Figura 1: Anatomia das glândulas mamárias

A - Drenagem linfática das glândulas mamárias: 1 – linfonodos axilares 2 – linfonodo inguinal superficial B - Principal irrigação sanguínea das glândulas mamárias: 3 – ramos esternais da artéria torácica interna 4 – artéria torácica lateral 5 – artéria epigástrica superficial cranial 6 - artéria epigástrica superficial caudal 7 – artéria pudenda externa Fonte: SLATTER (1998)


3

(Rahal et al., 1995) ou para o axilar e/ou inguinal (Sautet et al., 1992). A mama abdominal

cranial pode drenar para o linfonodo axilar, inguinal ou ambos (Sautet et al., 1992; Rahal

et al., 1995). A mama abdominal caudal drena apenas para o linfonodo inguinal (Rahal et

al., 1995) ou para o axilar e/ou inguinal (Sautet et al., 1992). A mama inguinal drena

apenas para o linfonodo inguinal (Sautet et al., 1992; Rahal et al., 1995). São evidentes

conexões linfáticas plexiformes entre as mamas torácica caudal e as abdominais, o que

justifica a drenagem da mama torácica caudal para o linfonodo inguinal e da mama

abdominal caudal para o linfonodo axilar (Sautet et al., 1992). As duas mamas torácicas e

a abdominal cranial podem drenar ainda para os linfonodos esternais craniais. Dada a

sua inacessibilidade no contexto cirúrgico, o conhecimento relativo aos linfonodos

esternais craniais é ainda escasso (Sautet et al., 1992). Não se verificam comunicações

linfáticas entre as cadeias mamárias direita e esquerda (Sautet et al., 1992, Rahal et al.,

1995).

Uma grande percentagem de tumores (aproximadamente 75%) ocorre nas glândulas

mamárias inguinais, provavelmente, por terem um maior volume de tecido glandular

(Lana et al., 2007).

1.2- Etiopatogenia

A incidência de neoplasias mamárias aumentou na última década, fenómeno

explicado, entre outras razões, pelo aumento da esperança média de vida dos animais

domésticos (Thuróczy et al., 2007), o que reflete um aumento da eficácia no diagnóstico,

nos tratamentos, bem como uma preocupação crescente dos proprietários pelos seus

animais de companhia (Queiroga et al., 2011).

Segundo Lana et al. (2007), a idade do animal e a probabilidade de desenvolvimento

de tumores mamários variam numa razão directa, sendo que a idade média de

manifestação tumoral, nas cadelas, está entre os 10 e os 11 anos, sendo rara em idades

inferiores a 4 anos.

A predisposição racial não é evidente, embora se tenha verificado uma maior

apresentação destas neoplasias em várias raças Spaniel e, em alguns estudos, também

no Caniche e Dachshund (Rutteman et al., 2001). Outros autores apontam para uma

maior incidência no Caniche, Spaniel inglês, Setter inglês, Pointer, Cocker Spaniel, Fox

Terrier e Terrier de Boston (Cohen et al., 1974; Mitchell et al., 1974; Rutteman et al.,

2001). Curiosamente, os animais das raças Boxer e Beagle são referidos como aqueles

que apresentam menor risco de desenvolverem tumores de mama (Queiroga & Lopes,

2002). O que é evidente é que a incidência de tumores mamários é variável consoante a


4

localização geográfica, influenciando a população em causa, em cada estudo (Egenvall et

al., 2005).

Em cães, vários estudos sugerem um maior risco de desenvolvimento de tumores

mamários associado à obesidade, principalmente juvenil (Pérez-Alenza et al., 1998;

Lana et al., 2009; Cleary et al., 2010). Assim, um animal com condição corporal 2,

considerado magro, entre os 9 e os 12 meses de idade, pode ver diminuído o risco de

desenvolvimento deste tipo de tumores na idade adulta (Sonnenschein et al., 1991;

Queiroga & Lopes, 2002). O papel da obesidade no desenvolvimento destas neoplasias

parece resultar das acções levadas a cabo pelos estrogénios, leptina e adiponectina

(Cleary et al., 2010). Graças à actividade da aromatase presente no tecido adiposo, que

promove a conversão dos androgénios em estroma, este tecido assume-se como uma

importante fonte de estrogénio, nomeadamente o 17β-estradiol. Assim sendo, um

aumento do tecido adiposo pode ter como consequência uma maior exposição das

glândulas mamárias ao estrogénio (Simpson & Zhao, 1996). Descobertas recentes em

Medicina Humana vêm atribuir um papel de relevo à adiponectina e leptina, substâncias

adipocitoquinas produzidas no tecido adiposo e cujas concentrações se alteram mediante

o peso corporal, influenciando o desenvolvimento e progressão destas neoplasias (Rose

et al., 2004; Barb et al., 2006; Hou et al., 2007). Desta feita, quando o peso e o índice de

massa corporais aumentam, os níveis séricos de leptina aumentam e de adiponectina

diminuem (Schindler et al.,2006; Behre et al., 2007). De esclarecer que a leptina inibe a

apoptose e estimula a proliferação celular (Artwohl et al.,2002; Fujita et al., 2002),

enquanto a adiponectina reduz a proliferação celular e promove a apoptose, actuando de

forma inversa à primeira (Dieudonne et al., 2006; Arditi et al., 2007).

A dieta caseira, com proporções elevadas de carnes vermelhas, está associada a um

maior risco de desenvolvimento de tumores mamários, bem como displasias (Pérez-

Alenza et al., 1998). Estudos epidemiológicos em humanos demonstram que uma dieta

rica em gordura e uma condição corporal obesa aumentam o risco de tumores mamários

(Lana et al., 2009). As mulheres que tenham mutações nos genes BRCA1 ou BRCA2,

que percam peso entre os 18 e os 30 anos, têm uma redução de 34% no risco de

desenvolvimento de cancro da mama (Kotsopoulos et al., 2005).

Contrariamente ao que acontece na mulher, na cadela não se consegue estabelecer

nenhuma relação entre a gravidez em idades mais prematuras e a diminuição do risco de

desenvolvimento tumoral (Rutteman et al., 2001). Também não se descortinou nenhuma

associação entre as irregularidades do ciclo éstrico e o aparecimento de neoplasias e não

há consenso, entre os diferentes autores, no que diz respeito ao efeito da lactação no

desenvolvimento destes tumores (Hellmén et al.,1993; Misdorp, 2002).


5

1.3- Etiologia Hormonal

Considera-se que a etiologia dos tumores mamários da cadela (TMC) é multifactorial,

envolvendo agentes exógenos e agentes endógenos. Destes últimos destacam-se, pela

evidência dos resultados obtidos, o papel das hormonas na tumorigénese (Pérez-Alenza

et al., 2000).

A etiologia hormonal está bem definida nos tumores de mama canina, tendo em conta

que fêmeas inteiras têm um risco 4 vezes superior de desenvolverem tumores,

comparativamente com fêmeas ovariohisterectomizadas antes dos dois anos de idade,

para além do facto dos cães machos raramente serem acometidos por esta neoplasia. A

ovariohisterectomia (OVH) realizada antes do primeiro estro reduz o risco de

desenvolvimento da neoplasia mamária para 0,5%; este risco aumenta significativamente

nas fêmeas esterilizadas após o primeiro ciclo éstrico (8,0%) e o segundo (26%). A

protecção conferida pela OVH desaparece após os dois anos e meio de idade, quando

nenhum efeito é obtido (Schneider, 1970; Fonseca & Daleck, 2000; Egenvall et al., 2005;

Munson e Moresco, 2007).

Os avanços da imunohistoquímica vieram dar ênfase a isto mesmo, na medida em que

permitiram identificar e caracterizar receptores de estrogénio (RE) e de progesterona

(RP) em lesões mamárias benignas e malignas. (Rutteman et al., 1988; Soremno, 2003;

Martin de las Mulas et al., 2004)

1.3.1- Recetores de estrogénio

Segundo Sorenmo (2003), a maioria dos TMC, benignos e malignos, apresenta RE,

existindo uma relação inversa entre a expressão destes receptores e o grau de

diferenciação histológica, à semelhança do que ocorre em seres humanos.

Tumores epiteliais benignos e carcinomas bem diferenciados apresentam

frequentemente positividade para RE, enquanto tumores pouco diferenciados ou

anaplásicos tendem a ser negativos para este recetor hormonal (Soremno, 2003; De las

Mulas et al., 2005).

Estão descritas duas isoformas de RE: REα e REβ. Uma reduzida expressão de REα

nos tumores de mama de cadela parece estar relacionada com um pior prognóstico, em

tumores de grande tamanho e com ulceração. Por sua vez, tumores positivos a REβ são

mais frequentemente benignos do que malignos. A elevada expressão de REβ em

tumores malignos com baixo grau de malignidade sugere que este parâmetro pode ser

um factor de bom prognóstico (De las Mulas et al., 2005; Saji et al., 2005).


6

1.3.2- Recetores de progesterona

A progesterona participa activamente no desenvolvimento da mama, promovendo a

expansão das unidades terminais ductais lobulares, quer durante a puberdade quer na

gestação (Anderson, 2002).

Nos canídeos, o tecido mamário normal, lesões hiperplásicas e lesões benignas é

comum expressarem RE e RP. No geral, na presença de tumores benignos o mais

comum é encontrar-se positividade para ambos os recetores: REα+/RP+, enquanto que

em tumores malignos, é mais frequente o seguinte status: REα-/RP+. (Chang et al., 2009)

À medida que a doença progride com subsequente metastização, os tumores malignos

tendem a perder a sua dependência hormonal, pelo são frequentemente negativos para

os RE e os RP. À semelhança do verificado nas mulheres, um perfil RE-/RP- encontra-se

associado a um pior prognóstico (Knight et al., 1977; Rutteman et al., 1988; De las Mulas,

2005).

1.3.3- Hormona do crescimento (GH) e factor I de crescimento tipo insulina (IGF-I)

A GH é uma hormona que actua de forma autócrina e parácrina na glândula mamária,

funcionando como um factor de crescimento local, contribuindo para a proliferação e

diferenciação desta glândula na fase lútea do ciclo éstrico e no contexto de uma

gestação. Um aumento da multiplicação celular por atuação desta hormona pode ser

responsável por uma maior susceptibilidade mamária à transformação neoplásica

(Leeuwen et al., 2000; Kleinberg et al., 2009). Na espécie canina, foi observado que a

produção local de GH pela glândula mamária é induzida pela estimulação com

progesterona. Lantinga-van Leeuwen et al. (2000), pelo método da imunohistoquímica,

demonstrou existir uma co-localização de RP e GH nas amostras tecidulares de glândula

mamária normal, indicando que a existência de RP pode ser uma condição prévia para a

expressão do gene que codifica para a GH. Esse mesmo estudo confirmou que os RP

podem estimular a expressão de GH de forma indirecta, fazendo com que o promotor do

gene GH se torne disponível para a ligação com outros factores de transcrição, e de

forma directa, activando este promotor. Para além disso, denotaram a ausência de

marcação para RP em alguns tumores GH positivos, uma vez que, em estados mais

avançados de doença neoplásica, a expressão do gene que codifica para estes

receptores tende a perder-se.

O IGF-I parece estar envolvido no desenvolvimento normal da glândula mamária,

servindo de mediador das acções da hormona de crescimento (Laban et al., 2003). O


7

IGF-1 induzido pela GH é necessário para permitir a acção dos estrogénios e da

progesterona na glândula mamária.

O eixo GH/IGF-1 parece desempenhar um papel distinto nos TMC, bem como um

papel prognóstico neste tipo de neoplasia. Este último dado é baseado na constatação

que níveis séricos de GH e IGF-1, bem como a sua concentração nos tecidos malignos,

avaliados num período pré-cirúrgico, estão relacionados com uma redução da

sobrevivência pós-cirúrgica. Os níveis séricos de IGF-1, em cadelas com tumores

malignos, eram substancialmente mais elevados do que em cadelas sem neoplasia

(Queiroga et al., 2010).

1.3.4- Prolactina

Nos canídeos, as hormonas esteróides e a prolactina atuam como factores de

crescimento local nos tumores mamários malignos, estimulando a proliferação celular. É

provável que esta hormona seja, em parte, produzida localmente pelas células que

sofreram transformação neoplásica, actuando de forma autócrina e parácrina nesta

glândula (Queiroga et al., 2005).

1.4- Factores de prognóstico clínicos e histopatológicos

No contexto dos TMC estão descritos diversos factores reconhecidos pelo seu valor

prognóstico, nomeadamente: tamanho tumoral, metastização nos linfonodos regionais,

metastização à distância, crescimento rápido e recente, presença de ulceração, grau

histológico de malignidade, grau de diferenciação nuclear, índice mitótico e grau de

invasão.

O tamanho tumoral é considerado um factor prognóstico independente nos TMC.

Assim, tumores inferiores a 3 cm estão significativamente correlacionados com um

melhor prognóstico, comparativamente com tumores maiores que 3 cm (Pena et al.,

1998; Misdorp, 2002; Soremno, 2003). Ferreira et al. (2009) demonstrou que a dimensão

é importante na avaliação do comportamento biológico tumoral, tendo sido estabelecida

uma associação entre o grau de diferenciação e a dimensão das massas tumorais.

No que diz respeito à metastização nos linfonodos regionais, quando ocorrem

metástases a este nível há uma significativa queda na expectativa de sobrevida

relativamente aos animais sem metastização regional (Misdorp, 2002; Soremno, 2003;

Karayannopoulou et al.,2005).


8

Quanto à presença de metástases à distância, tal situação torna pior o prognóstico,

em relação às cadelas que apresentam disseminação apenas nos linfonodos regionais.

Também o facto de o tumor ter tido um aparecimento recente e se caracterizar por um

crescimento rápido, reflectindo um elevado índice mitótico, está associado a um

prognóstico desfavorável (Pérez-Alenza et al., 1997; Pena et al., 1998; Soremno, 2003).

Um tumor que apresente ulceração na sua superfície é indicador de um pior

prognóstico, na medida em que esta característica está comprovadamente relacionada

com uma maior malignidade tumoral, bem como com uma menor sobrevivência

(Queiroga e Lopes, 2002).

Segundo Misdorp & Hart (1976), o tipo histológico de um tumor assume-se uma

variável independente como factor prognóstico na sobrevida. Contudo, a maior

dificuldade em definir a sua importância em termos prognósticos prende-se com a

existência de uma variedade de sistemas de gradação. Destacam-se entre os mais

utilizados Misdorp et al. (1999) e Gilbertson et al. (1983) ambos baseados na combinação

entre características celulares e nucleares. Num estudo levado a cabo por

Karayannopoulou et al. (2005), cadelas que apresentavam tumores classificados como

grau III apresentavam um risco de morte 21 vezes maior em relação às cadelas com

tumores classificados como grau I ou II. Os carcinomas grau III apresentam aumento do

risco de morte de sete vezes, em relação aos carcinomas grau II. Considerando apenas o

tipo histológico, outros estudos revelaram a existência de um aumento de malignidade

desde os carcinomas complexos até aos carcinomas simples, assumindo-se os sarcomas

como os mais malignos (Parodi et al., 1983; Hellmén et al.,1993; Misdorp et al., 1999,

WHO; Misdorp, 2002; Pérez-Alenza et al., 2000).

Tendo em conta o grau de diferenciação nuclear como indicador de prognóstico,

Lana et al., 2009 demonstrou que o risco de recorrência tumoral ou metastização em

menos de 2 anos, após a mastectomia, foi de 90% em cadelas com tumores pouco

diferenciados, 68% para moderadamente diferenciados e de 24% em tumores bem

diferenciados (Lana et al., 2009).

No que diz respeito ao grau de invasão de um tumor, quanto maior for o grau de

invasão de um tumor, menor é o tempo de sobrevida dos animais acometidos, logo pior é

o prognóstico (Misdorp & Hart, 1976; Pérez-Alenza et al., 1997; Pena et al., 1998).


9

1.5- Marcadores Moleculares

Apesar de no contexto dos TMC já ter sido identificada uma panóplia de factores de

natureza clínica e patológica com evidente valor prognóstico, é evidente que a

interpretação do comportamento tumoral ainda parece longe do completo entendimento.

Com a busca incessante da compreensão deste fenómeno, altamente incidente e

dramaticamente complexo, diariamente a comunidade científica se debruça sobre a

temática na tentativa de descortinar como os processos tumorais se desenrolam a nível

molecular. A identificação de marcadores moleculares tem permitido a identificação de

novos alvos terapêuticos.

Actualmente, no contexto dos TMC, estão identificados alguns marcadores

moleculares, de natureza diversa e interesse sustentado, dos quais destacamos: Ki67 e

PCNA, p53, p63, HER-2/neu, genes BRCA, Cox-2 e EGFR.

O Ki67 e o PCNA assumem-se como marcadores de proliferação e estão

correlacionados com o grau histológico tumoral, o grau nuclear, a presença de

metástases, a morte pela neoplasia e o menor tempo livre de doença, após a cirurgia

(Peña et al.,1998; Kadthur et al., 2011).

A imunoexpressão da proteína p53 nuclear, resultante da mutação do gene p53,

apresenta nos TMC um valor prognóstico, correlacionado com menor tempo de sobrevida

e aumento de recorrência tumoral (Veldhoen et al., 1999; Lee et al., 2004; Lana et al;

2009).

Nos tecidos mamários de canídeos, o p63 assume-se como um potencial marcador

celular mioepitelial, revelando-se útil na distinção de células basais ou mioepiteliais

relativamente aos miofibroblastos do estroma. A sobre-expressão do p63 sugere a

possibilidade da existência de uma relação estreita entre células mioepiteliais e

estaminais (Gama et al., 2003).

Vários estudos demostraram que a amplificação do gene HER-2, bem como a sobre-

expressão da proteína HER-2 podem estar presentes em TMC (Ahern et al., 1996; de Las

Mulas, 2003). Foi ainda constatada uma relação significativa entre a sobre-expressão da

proteína HER-2 e o maior grau histológico e maior número de mitoses nas células

tumorais. Gama et al., 2008ª, obtiveram resultados revelando um prognóstico favorável

num grupo de tumores mamários caninos com sobre-expressão da proteína HER-2 e,

como tal, consideraram que o significado prognóstico desta característica fenotípica ainda

permanece controverso na literatura.

No que concerne aos genes BRCA1, BRCA2 e RAD51, nos TMC a escassez de

estudos a este nível está bem patente. Contudo, constatou-se que a existência de


10

metastização ao nível dos gânglios linfáticos, no caso de adenocarcinomas, está

associada a uma sobre-expressão do mRNA Rad51. O gene BRCA2, por sua vez, está

expresso apenas em cerca de 50% dos casos. A expressão do Rad51 parece estar

relacionada com tumores fenotipicamente mais agressivos (Klopfleisch & Gruber, 2009).

Um estudo revelou que a proteína BRCA1 apresenta uma diminuição significativa da sua

expressão nuclear nos tumores mamários benignos e na maioria dos malignos e, em

contrapartida, uma sobre-expressão ao nível citoplasmático. Tal evidência foi maior nos

tumores que possuíam níveis elevados de Ki-67 e que eram negativos para RE-α. A

perda da expressão da proteína BRCA1 e a sua peculiar distribuição celular parecem

reflectir uma relação com características de malignidade (Nieto et al., 2003).

Como o nosso estudo incide no estudo da expressão da Cox-2 e do EGFR, estes

marcadores serão alvo de uma abordagem mais exaustiva.

1.5.1- Cox-2

A Cox-2 é um membro da família das enzimas ciclooxigenase que catalizam a

conversão do ácido araquidónico em percursores das prostaglandinas (PG) e em

tromboxanos (TX), essenciais na manutenção da homeostasia celular (Smith et al., 2000

No estado patológico, as PG e os TX promovem a inflamação. Em células

inflamatórias, como macrófagos e sinoviócitos, tem sido detectada a expressão de COX-2

e, consequentemente, o aumento das concentrações de PG e TX como parte da cascata

inflamatória. Determinadas condições celulares, tais como hipóxia, citoquinas (IL-1, IL-6),

TNF-1, oncogenes (ras e src) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF),

despoletam um aumento da expressão da COX-2. Ao nível celular, uma elevada

actividade da Cox-2 ajuda a promover a invasão tumoral que é mediada através do

aumento da actividade das MMP-2 e MMP-9. Além disso, a Cox-2 promove a expressão

da proteína anti-apoptótica bcl-2, inibindo assim a senescência celular (Taketo, 1998;

Tamura et al., 2001; Smith et al., 2000; Heller et al., 2005; Lavalle et al., 2009).

Em seres humanos, vários estudos reportam elevados níveis de Cox-2 em cerca de 40

a 50% dos carcinomas de mama invasivos. Esta sobre-expressão aparece

particularmente em carcinomas ductais in situ, lesões consideradas percursoras dos

tumores de mama invasivos. A sua expressão também se encontra relacionada com a

sobre-expressão do HER-2 (Vadlamudi et al., 1999, Half et al., 2002; Subbaramaiah et

al., 2002). A expressão de Cox-2, nos tumores de mama humanos, parece estar


11

correlacionada com um menor tempo de sobrevida livre de doença e pior prognóstico

(Hwang et al., 1998; Costa et al., 2002; Arun et al., 2004).

Um estudo protagonizado por Doré et al. (2003) demonstrou que a Cox-2 se

encontrava expressa em 24% de adenomas e em 56% dos adenocarcinomas, com uma

intensidade de reacção maior nos adenocarcinomas do que nos adenomas. Outros

estudos obtiveram resultados inferiores (42%), similares (56%) e superiores (62-100%)

no respeitante à percentagem de tumores malignos com positividade para Cox-2

(Mohammed et al., 2004; Heller et al., 2005; Millanta et al., 2006; Queiroga et al., 2007;

Dias Pereira et al., 2009; Lavalle et al., 2009; Além disso, outros trabalhos revelaram que

a glândula mamária normal não expressa Cox-2, ou expressa-a mas em níveis muito

reduzidos (Doré et al., 2003; Mohammed et al., 2004; Queiroga et al., 2007). Contudo,

numa investigação recente concluiu-se que, na glândula mamária normal, a Cox-2 tem

uma localização membranar apical, enquanto que nas células tumorais a sua distribuição

é citoplasmática (Dias Pereira et al., 2009).

Tipos específicos de carcinomas mamários caninos estão associados à expressão de

níveis elevados de Cox-2, incluindo carcinomas anaplásicos, tubulopapilares,

inflamatórios e de células escamosas, bem como carcinosarcomas (Heller et al., 2005;

Queiroga et al., 2005b; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009). Os locais de

metastização também estão identificados como locais de elevada intensidade na

expressão de Cox-2, semelhante ou superior ao observado nos tumores primários (Dias

Pereira et al., 2009). Tal como reportado para humanos, também foi possível estabelecer

uma relação entre a Cox-2 e a sobre-expressão de HER-2/neu no contexto dos TMC

(Millanta et al., 2006)

Millanta et al. (2006), levaram a cabo um estudo cujos resultados revelaram que 100%

dos carcinomas mamários caninos expressavam Cox-2, dos quais 79% com uma

expressão elevada. Além disso, concluíram que a Cox-2 estava relacionada com um pior

prognóstico.

Num outro estudo, protagonizado por Queiroga et al. (2005), os níveis de Cox-2 foram

avaliados por “enzyme immunoassay” e vieram revelar uma associação entre níveis

elevados de Cox-2 e pior prognóstico.

Em dois estudos mais recentes foi também encontrada uma associação

estatisticamente significativa entre expressões elevadas de Cox-2 e angiogénese,

desenvolvimento de metástases à distância, pior prognóstico e menor sobrevida (Lavalle

et al., 2009; Queiroga et al., 2010).

Inibidores seletivos de Cox-2 mostraram reduzir significativamente tumores mamários

de ratinhos induzidos por carcinogénios e ter um papel na quimioprevenção (Arun et al.,

2004). Em Medicina Humana, um estudo indicou que a utilização de aspirina pode reduzir


12

o risco de cancro da mama em cerca de 20% (Kudher et al., 2001). Vários trabalhos

apontam para que o uso de inibidores seletivos de Cox-2, em combinação com a

quimioterapia convencional, possa resultar em melhores resultados clínicos, com

menores efeitos nefastos (Chow et al., 2003; Toi et al., 2003).

Em Medicina Veterinária, à semelhança dos humanos, a Cox-2 é alvo de incessante

interesse no sentido de se avaliar o seu papel como factor prognóstico, bem como

potencial alvo terapêutico. Num estudo desenvolvido por Souza et al. (2009), em que 12

cães com carcinoma inflamatório foram tratados com piroxicam, demonstrou-se uma

melhoria do seu estado clínico comparativamente com animais tratados com

doxorrubicina.

Urge a necessidade de desenvolvimento de mais estudos que testem a verdadeira

utilidade de inibidores selectivos de Cox-2, em TMC.

1.5.2- EGFR

A família HER inclui quatro receptores tirosina-quinase: EGF-R ou erbB1, HER-2/neu

ou erbB2, HER-3 ou erbB3 e HER-4 ou erbB4 (Hynes & Lane, 2005; Park et al., 2007;

Sassen et al., 2008).

O receptor EGFR é, portanto, um membro da família HER, sendo constituído por um

domínio extracelular, ao qual se encontra ligado o EGF ou o TGF-α, e pelos domínios

transmembranário e intracelular (Sueoka et al., 2007; Yin et al., 2010).

Ao nível do domínio extra-celular, quando os dois ligandos activam o EGFR (EGF e

TGF-α), tal ligação resulta na homo ou heterodimerização do receptor, seguida da

autofosforilação do domínio da tirosina quinase. Os resíduos fosforilados funcionam como

locais de ligação para o recrutamento de transdutores de sinal e activadores de

substratos intracelulares. As vias Ras-Raf mitogénio-activada proteína quinase, fosfatidil

inositol 3 quinase e Akt constituem as maiores vias de sinalização do EGFR (Alroy et al.,

1997; Muthuswamy et al., 1999;). O domínio intracelular encontra-se associado à acção

desempenhada pela tirosina-quinase (Carpenter & Cohen, 1979).

O EGFR foi o primeiro receptor transmembranário tirosina-quinase a estar

directamente ligado às neoplasias da espécie humana (Hynes & Lane, 2005),

participando nos processos de proliferação e crescimento celulares, angiogénese e

metastização e, por isso, encontra-se envolvido na sobrevivência e crescimento tumorais

(Shien et al., 2005). Existem vários estudos sobre a expressão do EGFR em tumores de

mama humanos, com resultados algo contraditórios. A sobre-expressão de EGFR foi

identificada em cerca de 16 a 36% de tumores de mama contudo, estudos sistemáticos


13

avaliando a amplificação génica, expressões do mRNA e de proteínas, nos mesmos

casos, são escassas (Harris et al.,1989; Walker et al, 1999; Tsutsui et al.,2002). Outros

estudos mais recentes revelam que a amplificação do gene EGFR é um evento pouco

frequente no cancro da mama, ocorrendo em cerca de 6 % dos tumores segundo Rohit B

et al., 2005, ou em 0,8 a 14% dos casos segundo outros autores (Al Kuraya K et al.,

2004; Ro J et al., 1988). Apesar de pouco frequente, existirá uma minoria de pacientes

que poderão usufruir de uma terapêutica dirigida ao EGFR, com todas as vantagens que

esta acarreta. Assim, os inibidores da tirosina-quinase assumem-se altamente

promissores como terapia alvo de tumores com expressão de EGFR. Agentes como o

Gefitinib (ZD1839) e Erlotinib são exemplo deste tipo de inibidores, que actuam no

domínio da tirosina-quinase bloqueando as vias de transdução de sinal que promovem o

crescimento das células tumorais (Wakeling et al., 2002).

Em TMC, estudos de avaliação da expressão do EGFR são ainda escassos. Num

estudo imunohistoquímico realizado por Gama et al. (2009), foi avaliada a expressão do

EGFR em 136 tumores mamários caninos (46 benignos e 90 malignos). Nos tecidos

tumorais, a sobre-expressão do EGFR foi detectada em 9 lesões benignas (19,6%) e 38

malignas (42,2%), com a positividade do EGFR significativamente correlacionada com a

malignidade. Além da idade do animal e do tamanho tumoral, não foram comprovadas

associações significativas com outros parâmetros clínico-patológicos. Além disso, neste

mesmo estudo, verificou-se a existência de EGFR ao nível das células mioepiteliais de

tecido mamário normal, hiperplásico e neoplásico benigno. As células epiteliais luminais

apresentavam-se negativas para a presença deste marcador. Desta feita, a marcação

imunohistoquímica deste receptor parece ter uma aplicabilidade diagnóstica na

identificação de células mioepiteliais da glândula mamária (Gama et al., 2003; Gama et

al., 2004).

Num estudo recente realizado por Singer et al., 2012, os autores compararam a

homologia funcional biológica e a estrutura molecular do EGFR e HER-2 associados aos

tumores humanos e caninos, bem como a possibilidade de poderem servir como alvos

para os anticorpos anti-EGFR (cetuximab) e anti-HER-2 (trastuzumab). Pela análise

imunohistoquímica dos TMC, detectaram sobre-expressão do EGFR em 3/10 pacientes e

do HER-2 em 4/10. Constataram 91% de homologia nos aminoácidos do EGFR e 92% do

HER-2, entre as moléculas canina e humana. Além disso, o epitopo do cetuximab apenas

difere em 4 aminoácidos: Lys443 é substituída pela Arg, Ser468 pela Asn, Gly471 pela

Asp e a Asn473 pela Lys, nos canídeos. O local de ligação do trastuzumab é idêntico em

humanos e caninos, diferindo apenas num aminoácido: Pro557 pela Ser. Desta feita,

estes resultados indiciam uma franca homologia entre os antigénios Erb-1 e 2 associados

aos tumores, de canídeos e humanos. O facto dos homólogos caninos expressarem


14

semelhantes epitopos para o cetuximab e trastuzumab poderá promover a imunoterapia

baseada em anticorpos em cães. Mais do que isso, a constatação de tal homologia

poderá abrir portas para estratégias comparativas de desenvolvimento de alvos

terapêuticos.

De referir também que, num outro estudo recente levado a cabo por da Costa A et al.

(2011), os autores tentaram identificar por PCR alguns marcadores moleculares no

sangue periférico de canídeos, com o intuito de detectar células tumorais. Entre os

marcadores testados estava o EGFR que se revelou, conjuntamente com os demais

estudados (CK19, ERBB2, CLDN7 e ELF3), um candidato útil a marcador tumoral nos

TMC, bem como um possível factor de prognóstico para comportamentos metastáticos.

1.5.3- Cox-2 e EGFR

Em Medicina Veterinária, que seja do nosso conhecimento, não existem trabalhos

desenvolvidos no sentido de avaliarem simultaneamente as expressões de Cox-2 e

EGFR, no contexto dos TMC. Em Medicina Humana, já existem diversos estudos que se

debruçaram sobre a temática.

EGFR e Cox-2 são moléculas alvo que demonstraram importância em vários tipos de

tumor, com estudos anteriores a relacionar as suas expressões com pior prognóstico e

redução da sobrevivência, embora com conclusões não consistentes entre os diferentes

estudos (Dannenberg et al., 2005; Brown et al., 2005; Soo et al., 2005; Che et al., 2005;

Chua et al., 2004; Putti et al., 2002; Tan et al., 2005). As moléculas Cox-2 e EGFR

demonstraram partilhar funções em várias etapas da carcinogénese, mediando

processos carcinogénicos pleiotrópicos, incluíndo sobrevivência celular, proliferação,

angiogénese e invasão. (Dannenberg et al., 2005).

Vários estudos in vitro revelaram uma ligação entre a activação do EGFR e

subsequente sobre-regulação da Cox-2. A activação do EGFR pode induzir a expressão

da Cox-2 pela via ras/raf MAPK (McKay et al., 2007), bem como a Cox-2 pode induzir a

expressão do EGFR dado que as PG podem activar a sinalização do EGFR, estimulando

assim a proliferação celular. Estudos anteriores descortinaram que as PGE2 derivadas da

Cox-2 podem transactivar o EGFR no cancro colorectal (Pai et al., 2002; Buchanan et al.,

2003) e no colangiocarcinoma (Han et al., 2005). Por outro lado, a activação do EGFR

conduz a um aumento da expressão de Cox-2 e da produção de PGE2 no carcinoma de

células escamosas e nas células de cancro do cólon. Foi demonstrado que a inibição da

tirosina-quinase do EGFR, no carcinoma de células escamosas, reduz a expressão de

Cox-2 (Matsuura et al., 1999).


15

A lacuna de informação respeitante à relação da expressão de EGFR e de Cox-2 nos

tumores de mama de cadela, aliado ao conhecimento prévio existente sobre cada um

deles resumidamente descrita nos parágrafos anteriores, serve como base de interesse à

realização desta tese, mais propriamente ao trabalho prático que, mais à frente, será

descrito e apresentado. Anseia-se humildemente que os resultados obtidos se revelem

verdadeiramente úteis na compreensão do teatro tumoral e, principalmente, no

descortinar de novos factores de prognóstico e possíveis alvos terapêuticos, com vista ao

benefício conjunto e partilhado das espécies em causa.

1.6- Breve abordagem de modalidades de tratamento

A Cirurgia assume-se como a abordagem de eleição para o tratamento de tumores

mamários em canídeos, muito embora seja de considerar a sua não realização na

presença de metástases à distância ou na presença de um tipo de tumor designado

“carcinoma inflamatório” (Pérez-Alenza et al.,2001; Lana et al.,2009). O tipo de cirurgia a

realizar é avaliado caso a caso, estando directamente relacionado com o tamanho

tumoral, número de tumores, localização na glândula mamária (que se relaciona com a

drenagem linfática), estado geral do paciente e experiência do cirurgião (Hedlund, 2008).

Das várias técnicas disponíveis – nodulectomia, mastectomia simples, mastectomia

regional, mastectomia unilateral e mastectomia bilateral – o objectivo major consistirá em

atingir a cura, mas também permitir a realização do exame histológico, melhorar a

qualidade de vida do animal acometido pela doença e fazer face ou impedir a progressão

neoplásica. Na escolha entre uma cirurgia mais ou menos invasiva, pesam factores como

a diminuição do risco efectivo de recidivas, para a primeira opção, mas uma menor

morbilidade e custo económico para a segunda. De frisar, que o desenvolvimento de

metástases à distância não parece ser directamente influenciado por abordagens

cirúrgicas mais agressivas (Lana et al., 2009).

No que diz respeito à Quimioterapia, a sua utilização como modalidade terapêutica

pode ainda considerar-se diminuta no contexto dos TMC, facto que advém do menor

número de estudos existentes, de resultados menos satisfatórios, do elevado custo

associado e da evidência de grande heterogeneidade nestes tumores e que dificulta a

caracterização da quimiossensibilidade dos diferentes tipos histológicos,

comparativamente com os seres humanos (Pérez-Alenza, 2001; Lana et al. 2007, Lana et

al., 2009). Ainda assim, os principais quimioterápicos utilizados em neoplasias mamárias

são a Ciclofosfamida, a Doxorrubicina e o 5-Fluouracil (5-FU). Para além destes existem

outros, menos utilizados, como a Vincristina que pode ser associada à Doxorrubicina e à


16

Ciclofosfamida; Mitoxantrona, em substituição da Doxorrubicina devido à

cardiotoxicidade; Metotrexato, associado à Ciclofosfamida e ao 5-Fluouracil (Cirillo,

2008). Foram também realizados ensaios com outros fármacos de utilidade em medicina

humana, nomeadamente o Paclitaxel e a Gemcitabina, mas sem produção de resultados

satisfatórios (Cirillo, 2008; Marconato et al., 2008).

A Desmopressina é um derivado sintético da hormona anti-diurética, com propriedades

hemostáticas. A administração desta substância numa solução salina, 30 minutos antes e

24 horas após a remoção cirúrgica dos tumores, diminui a recorrência local e minimiza a

disseminação e sobrevivência de células tumorais residuais, prolongando o período livre

de doença e o período de sobrevivência (Hermo et al., 2008). Mais estudos serão

necessários para melhor compreender o mecanismo de acção e comprovação de

resultados deste fármaco.

Os inibidores da Cox-2 têm sido indicados por alguns autores no tratamento de

carcinomas inflamatórios de mama (Souza et al., 2009). Serão cruciais mais estudos para

averiguar o seu papel nos TMC.

No que concerne à Radioterapia, da escassez de estudos realizados resultaram

efeitos pouco atractivos e que têm condenado à utopia esta modalidade terapêutica nos

TMC (Lana et al., 2009).

A Hormonoterapia, embora não praticada na verdadeira ascensão da palavra, é uma

prática ancestral no tratamento dos TMC, como oportunamente já foi explicado, e em que

se destacou o papel protector da OVH, em idades precoces, no desenvolvimento deste

tipo de tumores (Fonseca & Daleck, 2000).

O tratamento hormonal exógeno está indicado em tumores que exibam receptores de

estrogénio, progesterona ou prolactina (VSSO, 2008a). Em Medicina Humana, o recurso

à manipulação hormonal é prática corrente, nomeadamente pela utilização do Citrato de

Tamoxifeno que é um inibidor selectivo dos receptores de estrogénio ao nível da glândula

mamária (Tavares et al., 2010).

Nos canídeos, devido ao elevado risco de desenvolvimento de piómetras, aconselha-

se que a administração de Tamoxifeno se restrinja a cadelas esterilizadas. Além disso,

visto não haver diferença entre a dose mais alta e a mais baixa, a nível de demais efeitos

secundários, deve optar-se pela administração da dose mais alta deste fármaco,

aumentando assim as hipóteses de sucesso terapêutico (Tavares et al., 2010).

Uma substância promissora como modalidade terapêutica é a Goserilina, um análogo

das hormonas hipofisárias e hipotalâmicas, com capacidade para reduzir os níveis

circulantes de estradiol e progesterona. Revelou a capacidade de diminuir a actividade

tumoral em 53% dos canídeos com patologia mamária, desde que na presença de RE

(VSSO, 2008a).


17

Como modalidade terapêutica de vanguarda no combate aos TMC surge a

Imunoterapia. Interessantes estudos têm produzido resultados não menos interessantes

neste contexto, dos quais destaco, entre outros, um ensaio com utilização de um vírus

vacinal oncolítico (GLV-1h68) no tratamento de tumores mamários caninos, vírus este

que infectou e destruiu com sucesso linhas celulares de adenoma mamário canino in

vitro, inibiu a proliferação tumoral, diminuiu o tamanho da neoplasia e replicou-se em

xenotransplante (Gentschev et al.,2009).

Num outro estudo, avaliou-se a administração conjunta do factor de necrose tumoral-α

(TNF) associado a polietilenoglicol (PEG). Apesar de ser necessário estabelecer uma

dose muito restrita de TNF-α, devido à elevada toxicidade verificada, a administração

conjunta com PEG melhora a bioactividade e aumenta a semi-vida (Thamm et al., 2010).

Como tal, os resultados deste estudo justificam a avaliação clínica da utilização destas

substâncias em tumores da espécie humana (Thamm et al., 2010). A aplicação de uma

vacina autóloga de fusão de células dendríticas-células tumorais mamárias, em cães,

também foi avaliada por um grupo de investigadores (Bird et al., 2011). A sua

administração em gânglios poplíteos de canídeos saudáveis conduziu a uma produção

significativa de IgG, imunoglobulinas estas que revelaram reconhecer antigénios de

células tumorais em cultura (Bird et al, 2011). Não se registaram quaisquer efeitos

secundários.

Dada a complexidade envolta no desenvolvimento de um processo tumoral, as

modalidades terapêuticas disponíveis terão de ser alvo de constante actualização e

tendencialmente dever-se-ão preconizar tratamentos combinados e personalizados.

18

CAPÍTULO 2

OBJECTIVOS DO TRABALHO EXPERIMENTAL

Avaliar a expressão de Cox-2 e EGFR em 43 tumores mamários malignos de

cadela, utilizando uma abordagem cega na selecção dos casos no que concerne

à sua classificação histológica, bem como demais dados do historial clínico.

Relacionar as expressões de Cox-2 e EGFR, individualmente, com as

características clínico-patológicas dos animais abrangidos pela amostragem.

Averiguar a associação existente entre os dois parâmetros analisados: Cox-2 e

EGFR e interpretar em termos clínico-patológicos quais os reflexos de tal

associação.


19

CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1- Descrição do material utilizado e sua proveniência

Na realização deste trabalho foram incluídas 43 amostras de tumores malignos de

mama de cadela, processadas no Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), provindos do Hospital Veterinário

do UTAD e de diversas clínicas privadas.

3.2- Métodos

3.2.1- Avaliação clínico-patológica

Em todos os casos, procedeu-se à recolha de informação respeitante à identificação

dos animais incluídos na amostra, nomeadamente: idade, sexo, raça, tamanho da lesão,

presença de ulceração, presença de necrose, invasão dos linfonodos regionais,

metástases para órgãos distantes.

No que concerne ao tamanho tumoral, considerou-se o parâmetro T como diâmetro

máximo do tumor primário, tendo sido agrupados em T1- menor que 3 cm; T2-

compreendido entre 3 e 5 cm; T3- superior a 5 cm.

No parâmetro invasão dos linfonodos regionais, considerou-se N0 para a ausência de

metástases e N1 para a presença de metástases ganglionares, com confirmação

histológica.

3.2.2- Avaliação histopatológica

Todo o material recolhido foi fixado em formol a 10%, incluído em parafina sintética

Histoplast ®- Shandon ®, seguindo a metodologia habitual. Após inclusão, foram

realizados cortes de cada um dos tumores com 3 µm de espessura num micrótomo

automático Leica® RM 2255. Em seguida, os cortes foram colocados em lâminas e

efectuou-se secagem na estufa, à temperatura de 37º. Após secagem, foram

desparafinados em xilol, hidratados por passagem consecutiva em álcoois de


20

concentrações decrescentes, procedendo-se à coloração convencional com hematoxilina-

eosina (H-E) para posterior diagnóstico histopatológico.

O diagnóstico histopatológico foi realizado em conformidade com os critérios da OMS

(Misdorp, 1999), por dois patologistas independentes e segundo os mesmos critérios,

num microscópio Olympus® BH-2.

Os critérios que foram avaliados constam de: tipo histológico, comportamento tumoral,

e entre tumores malignos: invasão metastática dos linfonodos, grau de pleomorfismo

nuclear, grau de diferenciação tubular e índice mitótico (IM).

O índice mitótico foi avaliado de acordo com a metodologia descrita por (Elston and

Ellis, 1991) para classificação do grau histológico. Efectuaram-se contagens de mitoses

em dez campos de grande ampliação (400x), num microscópio Nikon Optiphot-2®, nas

áreas mais proliferativas, designadas de hot spots. Sempre que era observada grande

variação no número de mitoses em áreas diferentes, eram contados dez campos de

grande ampliação em cada uma delas, de modo a apurar a contagem mais correcta. De

acordo com a área do campo, definida pelo fabricante do microscópio, atribuiu-se o

respectivo índice 1, 2 ou 3 à contagem de mitoses conforme indicado no método de

Elston e Ellis (Elston and Ellis, 1998).

Quadro 1: Atribuição do índice mitótico, segundo o número de mitoses, contado num campo de

grande ampliação (400x) com diâmetro de 0,53mm.

Número de mitoses Índice mitótico

≤ 7 1

8-16 2

≥17 3

Na avaliação do grau histológico de malignidade, foram tidos em conta os parâmetros

relativos a três aspectos: formação tubular, pleomorfismo nuclear, índice mitótico e

hipercromasia, segundo as mais recentes recomendações (Goldschmidt et al., 2011).

(Quadro 2)


21

Quadro 2: Critérios de avaliação do grau histológico de malignidade, segundo Goldshmidt et al.,

(2011).

Pontos Formação tubular Pleomorfismo nuclear Índice Mitótico e Hipercromasia

1

Formação de túbulos em mais de 75% da preparação, bem

diferenciados

Núcleos uniformes, de pequeno tamanho. Nucléolos

ocasionais. Ligeiro pleomorfismo e coloração.

0-9 mitoses/ 10 CGA Ocasionais núcleos

hipercromáticos/CGA

2

Moderada formação de túbulos, em 10-75% da

preparação, com áreas de crescimento tumoral sólido

Moderado pleomorfismo nuclear, núcleos

hipercromáticos e presença de nucléolos, alguns dos

quais proeminentes

10-19 mitoses/ 10 CGA 2-3 núcleos hipercromáticos

/CGA

3 Formação de túbulos

mínima ou inexistente (< 10% da preparação)

Marcado pleomorfismo nuclear, frequentemente com

um ou mais nucléolos proeminentes.

Marcada hipercromasia.

20 mitoses/ 10 CGA 2-3 núcleos hipercromáticos/

CGA

Pontuação total Grau histológico de malignidade 3-5 6-7 8-9

I – Baixo Grau, tumor bem diferenciado II – Grau intermédio, moderadamente diferenciado

III – Alto Grau, fracamente diferenciado

3.2.3- Avaliação imunohistoquímica

Para a análise imunohistoquímica foram utilizadas amostras preservadas em formol a

10%, incluídas em parafina. No micrótomo foram realizados cortes seriados de cada um

dos tumores com 3 µm de espessura, que foram colocados em lâminas revestidas com

solução de Silane (3-Aminopropyltriethoxysilane, Sigma ®), de acordo com a metodologia

convencional. Antes de estarem preparados para a realização da técnica de

imunohistoquímica, os cortes permaneceram por 48 horas na estufa a 37ºC, para

secagem e melhor aderência às lâminas.

A expressão das proteínas em estudo foi avaliada pelo método indirecto da

esterptavidina biotina-peroxidase, utilizando a solução de 3,3-diaminobenzidina

tetrahidrocloreto (DAB) como agente cromogéneo.

No apuramento da técnica foram inicialmente efectuados estudos preliminares, para

adequar concentrações dos anticorpos primários, método de recuperação antigénica e

diferentes tempos de incubação, de forma a optimizar os resultados.

Neste estudo, a mácula densa de rim de cão jovem foi utilizada como controlo positivo.

Para controlo positivo do anticorpo EGFR foi utilizada a epiderme. Nos cortes usados

como controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por tampão fosfato salino

(PBS) com pH=7,4. Todas as incubações foram realizadas em câmara húmida horizontal,

Bio Optica ®.


22

3.2.3.1- Procedimento

A expressão imunohistoquímica dos anticorpos foi obtida pelo método indirecto com

uso de um complexo estreptavidina-biotina peroxidase, utilizando o kit Ultravision

Detection System, Labvision Corporation®, Fremont, CA, USA, para a Cox-2, e o kit

Novolink Polymer Detection Sistem, Novocastra®, Newcastle, UK, para o EGFR.

Os cortes foram desparafinados em xilol durante 30 minutos e hidratados com uma

série de álcoois de concentração decrescente (100%, 90%, 80% e 70%) para obter nos

tecidos uma fase aquosa miscível com reagentes a aplicar nos passos seguintes.

Como método de recuperação antigénica, procedeu-se do seguinte modo:

- Cox-2: 20 minutos no microondas, na potência de 750 Watts, com as lâminas imersas

em solução de extran a 0,05%. Por precaução, para manter as lâminas cobertas de

solução de modo a evitar a dessecação dos tecidos, foi adicionada mais solução de

extran a intervalos de 3 minutos.

- EGFR: digestão enzimática com uma solução de 0,4% de pepsina em HCL 0,01N

(pH=2), durante 30 minutos a 37ºC.

Após recuperação antigénica foram deixados a arrefecer, à temperatura ambiente, por

cerca de 30 minutos.

A inibição das peroxidases endógenas foi conseguida com peróxido de hidrogénio a

3%, durante 30 minutos, sendo o seu excesso removido com PBS, numa lavagem

durante 5 minutos. O objectivo deste passo é evitar que haja uma reacção inespecífica do

agente cromogéneo, DAB, com outras peroxidases além daquelas presentes no

complexo estreptavidina-biotina peroxidase.

No que diz respeito à Cox-2, os cortes foram então incubados à temperatura ambiente

durante 10 minutos com Ultra V Block ® para reduzir a reacção inespecífica do anticorpo

primário com a avidina e biotina endógenas dos tecidos. Em seguida, procedeu-se à

incubação com o anticorpo monoclonal anti-Cox-2 (Clone 33, Transduction

Laboratories®, Lexington, KY, USA), na diluição de 1:40 em PBS com pH=7,4, por um

período de 24 horas, no frigorífico a 4ºC, permanecendo em câmara húmida horizontal,

Bio Optica®.

No caso do EGFR, os cortes foram incubados durante 5 minutos à temperatura

ambiente com Protein Block®, seguindo-se 2 lavagens de 5 minutos com PBS.

Posteriormente as lâminas foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti- EGFR

(clone 31G7, Invitrogen®, Paisley,UK), na diluição de 1:100 em PBS com pH=7,4,

durante 45 minutos à temperatura ambiente, permanecendo as lâminas em câmara

húmida horizontal Bio Optica®.


23

Após o referido período de incubação, os anticorpos primários foram removidos com

três lavagens em tampão PBS e os cortes foram incubados da seguinte forma:

- Cox-2: 10 minutos com Biotinylated Goat Polivalent ® à temperatura ambiente,

seguidos de duas lavagens com PBS e nova incubação de 10 minutos com Streptavidin

Peroxidase®, igualmente à temperatura ambiente, à qual se seguiu nova lavagem por 5

minutos em tampão PBS.

- EGFR: 30 minutos à temperatura ambiente com o Post Primary Block®, seguido de 2

lavagens com tampão PBS e nova incubação por um período de 30 minutos com

Novolink Polymer®. Seguiram-se 2 novas lavagens com tampão PBS.

A revelação das lâminas foi efectuada com uma incubação de pelo menos 5 minutos

em solução de tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) SIGMA® diluído em

PBS, à qual se adicionou 0,8 µl de H2O2 (a 30%) por cada mililitro (ml) de solução. O

tempo de reacção foi controlado por visualização ao microscópio óptico, de forma a evitar

que surgisse uma coloração de fundo que poderia prejudicar a avaliação da

imunorreactividade. No final deste tempo procedeu-se à lavagem em água corrente

morna por dez minutos.

Posteriormente, para a realização do contraste nuclear ou contra-coloração, as

lâminas foram imersas numa solução de Hematoxilina de Gill, durante 1 minuto. A

Hematoxilina é um corante nuclear básico que confere aos núcleos das células uma

tonalidade azul, permitindo assim evidenciar a tonalidade castanha da marcação

imunohistoquímica. Finalmente, as lâminas foram desidratadas, com passagens por

álcoois de concentração crescente, por 5 minutos cada (95%,100%), diafanizadas em

xilol e montadas, utilizando a resina sintética Entellan (Merck®).

3.2.3.2 - Métodos de avaliação e quantificação da imunorreactividade

A imunorreactividade foi avaliada por dois observadores independentes, sem

conhecimento prévio do respectivo diagnóstico. A positividade foi indicada pela presença

de distinta marcação castanha citoplasmática ou membranar. Foi utilizado o mesmo

método de quantificação de imunorreactividade para a Cox-2 e para o EGFR.

Na avaliação das expressões dos marcadores foram considerados dois parâmetros

distintos, sendo eles a percentagem de células imunorreactivas (Extensão) e a

Intensidade da Marcação (Intensidade). Uma gradação semi-quantitativa foi realizada na

percentagem de células imunorreactivas, enquanto na intensidade de marcação foi

efectuada uma avaliação subjectiva.


24

Quadro 3: Avaliação da imunorreactividade da Cox-2 e do EGFR.

Extensão Intensidade

Extensão 1

1-10% de células imunorreactivas

Zero (0)

Intensidade negativa

Extensão 2


Um (+)

Intensidade fraca

Extensão 3


Dois (++)

Intensidade moderada

Extensão 4

> 80% de células imunorreactivas

Três (+++)

Intensidade forte

Tendo em consideração o exposto no quadro anterior, e avaliados todos os casos

quanto às características em causa, procedeu-se subsequentemente ao cálculo de um

score que resultou do somatório das duas variáveis (adaptado de Ceccarelli et al., 2005).

Desta feita, pela soma dos valores de extensão (1,2,3 ou 4) com os de intensidade (0,1,2

ou 3), obtivemos valores que classificámos:

1 - 2 - negativo

3 - 5 - baixo

6 - 7 - alto

Relativamente ao EGFR, a localização da marcação foi alvo de análise, tendo sido

possível distinguir em todas as amostras marcação com localização citoplasmática,

membranar ou mista.


25

3.2.4 - Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao sistema SPSS®

(Statistical Package for the Social Sciences, Chicago, IL, EUA), versão 19.0. Os valores

obtidos foram considerados significativos para um valor de p <0,05.

Os resultados foram expressos em frequências absolutas e relativas. Para as diversas

variáveis incluídas foi efectuada uma análise estatística descritiva, com o cálculo da

média, desvio padrão, erro padrão, mediana, máximo, mínimo e frequências relativas.

O teste de correlação de Spearman’s foi efectuado, de modo a verificar a presença de

associação entre valores de Cox-2 e de EGFR.

26

CAPÍTULO 4 RESULTADOS

4.1- Análise descritiva da amostra em estudo

4.1.1. Variáveis clínico-patológicas

Os tumores em estudo pertenciam a animais com idades compreendidas entre os 6 e

os 16 anos, sendo a média de idades 10,6 ± 2,6.

As características epidemiológicas e clínico-patológicas relevantes, na caracterização

da amostra de tumores, encontram-se sumariadas no quadro 4.

Dos 43 tumores mamários em estudo, a maioria (23) foi classificada como carcinoma

tubulopapilar (53,5%), 11 como carcinoma complexo (25,6%), 4 representam carcinomas

sólidos (9,3%), 3 carcinomas anaplásicos (7%) e os carcinossarcomas estão

representados em apenas 2 tumores (4,7%).

Entre outras características, de frisar que a maioria dos tumores não apresenta

ulceração (90,7%), nem metastização nos linfonodos regionais (86,0%).


27

Quadro 4: Síntese das características da amostra em estudo e respectivas frequências absolutas

e relativas.

Variáveis N %

Raça(n=43)

SRD 30 69,8

Caniche 2 4,7

Cão d´Água 1 2,3

Cocker 2 4,7

Doberman 1 2,3

Epagneul 1 2,3

Labrador 2 4,7

Lhasa Apso 1 2,3

Pincher 1 2,3

Scotish Terrier 1 2,3

Sharpei

1 2,3

Tamanho (n=43) T1 (<3cm) T2 (3-5cm) T3 (>5cm)

17 39,5

15 34,9

11 25,6

Ulceração (n=43) Presente Ausente

4 9,3

39 90,7

Diagnóstico histológico (n=43) Carcinoma tubulopapilar Carcinoma complexo Carcinoma anaplásico Carcinoma sólido Carcinossarcoma

23 53,5

11 25,2

3 7,0

4 9,3

2 4,7

Necrose (n=43) Presente Ausente

11 25,6

32 74,4

Índice mitótico (n=43) 1 (≤ 7) 2 (8-16) 3 (≥17)

22 51,2

12 27,9

9 20,9

Grau nuclear (n=43) 2 3

21 48,8

22 51,2

Grau de diferenciação (n=43) 1 2 3

9 20,9

17 39,5

17 39,5

Grau histológico de malignidade (n=43) I II III

17 39,5

13 30,2

13 30,2


28

4.1.2- Imunoexpressão da Cox-2 e do EGFR nos tumores mamários caninos

A imunorreactividade para a Cox-2 foi observada no citoplasma, membrana nuclear e

membrana citoplasmática, de forma difusa e homogénea.

A imunorreactividade para o EGFR foi observada na membrana citoplasmática e no

citoplasma das células neoplásicas, de forma difusa (Figuras 2 e 3). A marcação não foi

homogénea em toda a preparação histológica, pelo que foi avaliada a marcação

predominante. Numa mesma área observou-se, em alguns tumores, marcação evidente

em células basais, enquanto noutros, em células luminais (Figuras 3 e 4).

Figura 2 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma tubulopapilar, com localização

predominantemente membranar. Estalão = 60 μm.

Invasão de linfonodos regionais (n=43) N0 N1

37 86

6 14


29

Figura 3 - Imunorreactividade para o EGFR com localização predominantemente membranar

(pormenor da imagem anterior). Estalão = 30 μm.

Figura 4 - Imunorreactividade para o EGFR em carcinoma tubulopapilar. De notar a intensa

marcação nas células luminais. Estalão=60 μm.


30

Figura 5 - Pormenor da imagem anterior. Estalão=30 μm.


31

No quadro 5 observamos a imunorreactividade para a Cox-2 e para o EGFR nas

diferentes amostras estudadas.

Quadro 5: Avaliação da imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos tumores mamários caninos.

Amostra Diagnóstico Cox-2 EGFR

Extensão Intensidade Extensão Intensidade

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

c.complexo c.tubpap c.solido

c.tubpap c.complexo c.complexo

c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap

carcinossarcoma c.tubpap c.tubpap

c.complexo c.complexo

c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.tubpap

c.complexo c.tubpap c.tubpap

c.complexo c.tubpap c.solido c.anapl c.anapl c.anapl

c.complexo c.complexo c.complexo c.complexo

carcinossarcoma c.tubpap c.tubpap c.tubpap c.solido c.solido

c.tubpap

3 2 4 4 3 3 2 3 2 4 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 3 2 3 2 3 2 3 4 4 2 3 3 1 4 4 4 4 4 4 2 3 2

2 2 2 3 2 2 3 2 1 1 1 3 3 3 2 2 2 1 1 3 3 3 2 2 1 2 3 3 3 3 3 3 2 2 2 1 3 2 1 3 3 2 2

3 2 4 4 2 4 2 3 2 2 2 2 2 3 3 4 4 2 3 3 4 4 4 3 2 4 3 4 4 4 2 3 3 1 4 4 4 4 4 4 2 4 2

2 3 2 3 3 3 3 2 2 3 2 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 3 2 3


32

Assim, neste estudo não obtivemos qualquer amostra cuja imunorreactividade, quer

para a Cox-2 quer para o EGFR, fosse considerada negativa (score 1-2). Por

conseguinte, todas as amostras tiveram imunorreactividade positiva, incluíndo-se nos

scores 3-5, considerado de baixa imunorreactividade, ou 6-7, considerado de alta

imunorreactividade.

Tendo por base os resultados evidenciados no quadro 5, e no que concerne à Cox-2,

pela avaliação da extensão da marcação das lâminas em estudo denotou-se que a

maioria das amostras manifestou extensões 2 (37,2%) e 3 (34,9%). Apenas 2,3% (1) dos

casos apresentaram extensão 1, enquanto 25,6% (11) das amostras revelaram extensão

máxima. Quanto à intensidade da marcação, observou-se que o maior número de

amostras se incluía nas intensidades 2 (41,9%) e 3 (39,5%), tendo sido a intensidade 1

verificada em apenas 8 casos (18,6%). (Figuras 6, 7 e 8)

Figura 6- Imunorreactividade para a Cox-2, em carcinoma sólido. Estalão = 60 μm.


33

Figura 7- Imunorreactividade para a Cox-2, em carcinoma sólido com invasão vascular. Estalão =

30 μm.

Figura 8- Imunorreactividade para a Cox-2 nas células tumorais, que se dispôem em estruturas

tubulares. Estalão = 60 μm.


34

Na avaliação da extensão da marcação do EGFR, sobressai o facto do maior número

de casos apresentar extensão 4 (19 amostras / 44,2%). Em contrapartida apenas 1 caso

se caracterizou por extensão 1 (2,3%). As restantes amostras distribuíram-se nas

extensões 2 (13 amostras / 32,2%) e 3 (10 amostras / 23,3%). A intensidade da

marcação para este receptor caracterizou-se por uma forte predominância de casos com

intensidade 3 (31 amostras / 72,1%). Somente 12 amostras (27,9%) manifestaram

intensidade 2. Não houve quaisquer amostras com intensidade 1.

As figuras seguintes (9-12) ilustram a imunorreactividade para o EGFR em diferentes

casos.

Figura 9 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma sólido. De notar as imagens

sugestivas de invasão vascular. Estalão = 120 μm


35

Figura 10 - Imunorreactividade para o EGFR, em carcinoma sólido com invasão vascular.

Estalão=60 μm.

Figura 11 - Imunorreactividade para o EGFR, de forma difusa e intensa, em carcinoma

tubulopapilar. Estalão=300 μm.


36

Figura 12 - Imunorreactividade para o EGFR em carcinoma tubulopapilar. Estalão = 120 μm.


37

4.1.3- Associação da Cox-2 e do EGFR com as variáveis clínico-patológicas

Após termos determinado as expressões de Cox-2 e EGFR nas várias amostras em

estudo, procedemos à avaliação da sua possível relação com os diferentes parâmetros

clínico-patológicos. As associações obtidas estão patentes no quadro 6.

Quadro 6: Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e de EGFR e as variáveis clínico-

patológicas pelo teste de χ2.

Variáveis Cox-2

P EGFR

p Alta Baixa Alta Baixa

Tamanho (n=43) 1 (<3cm) 2 (3-5cm) 3 (>5cm)

0,033

0,191 2 15 10 7

3 12 7 8

6 5 9 2


0,267

0,479 2 2 3 1

9 30 23 16

Tipo histológico (n=43) Carcinoma sólido

Carcinoma tubulo-papilar

Carcinoma complexo

Carcinossarcoma

Carcinoma Anaplásico

0,179

0,732

2 2 3 1

5 18 13 10

1 10 6 5

1 1 2 0

2 1 2 1


0,091

0,276 5 6 8 3

6 26 18 14

Índice mitótico (n=43) 1 2 3

0,040

0,331 2 20 11 11

5 7 9 3

4 5 6 3


0,021

0,085 2 19 10 11

9 13 16 6


0,140

0,424 2 7 4 5

2 15 10 7

7 10 12 5


0,020

0,103 2 15 7 10

2 11 9 4

7 6 10 3

Invasão dos linfonodos (n=43) Presente Ausente

0,029

0,038 4 2 6 0

7 30 20 17


38

Como podemos constatar pela análise do quadro anterior, a Cox-2 apresentou

associação estatisticamente significativa com o tamanho tumoral (p=0,033), índice

mitótico (p=0,040), grau nuclear (p=0,021), grau histológico de malignidade (p=0,020) e

com a metastização nos linfonodos (p=0,029).

Neste estudo foi evidente um aumento do número de casos com alta expressão de

Cox-2 à medida que o tamanho tumoral aumentou. Tendo em conta o índice mitótico

(IM), constatou-se que os tumores com IM=1 têm maioritariamente baixa expressão de

Cox-2, com registo de apenas 2 casos com alta expressão. Pelo contrário nos tumores

com IM=3 (n=9), contabilizaram-se 4 com alta expressão de Cox-2 e 5 com baixa

expressão desta molécula. Denotou-se uma tendência para um aumento da

imunorreactividade para a Cox-2 à medida que o IM aumentou embora, em todos os

grupos, o número de tumores com baixa imunorreactividade foi superior aos de elevada

imunoreactividade.

No que diz respeito ao grau nuclear (GN), nos tumores com GN= 2 (n=22), existe

claramente um maior número de amostras com baixa expressão de Cox-2 (n=20 casos),

observando-se apenas 2 casos com elevada imunorreactividade. Nos tumores com GN=3

(n=22), existe um aumento substancial de casos com elevada imunoexpressão de Cox-2

(n=9), embora ainda existam 13 tumores com baixa expressão.

Finalmente, a existência de associação estatisticamente significativa entre a

expressão de Cox-2 e o grau histológico de malignidade (GHM) vem demonstrar, à luz

dos nossos resultados, que a maioria dos tumores com GHM=III tem altas expressões de

Cox-2 (n=7), sendo que 6 tumores apresentaram baixa imunorreactividade. Nos tumores

com GHM I e II, a maioria apresenta imunoexpressão de Cox-2 baixa contudo, denota-se

uma tendência para uma diminuição dos casos com baixa imunorreactividade, à medida

que o grau de malignidade aumenta.

Nos casos em que se verifica metastização nos linfonodos, a maioria dos tumores

revela alta imunorreactividade para a Cox-2 (4 em 6 casos). Em contrapartida, nas

amostras em que não existe metastização, a baixa expressão de Cox-2 é claramente

mais frequente (n=30) do que a alta expressão (n=7).

No que concerne à expressão de EGFR, evidenciou-se a existência de associação

estatisticamente significativa entre a expressão desta molécula e um parâmetro de

natureza clínico-patológica: metastização dos linfonodos (p=0,038)

Ficou patente pela análise do quadro 6, que todos os tumores em que se verificou

metastização ao nível dos linfonodos revelaram alta imunorreactividade ao EGFR (6

casos ). Na ausência de metastização, a maioria dos tumores revelou elevada expressão

de EGFR (20 de 37 casos).


39

As demais variáveis clínico-patológicas que figuram no quadro 6, não revelaram

associações estatisticamente significativas com a Cox-2 ou com o EGFR (p˃0,05).

4.1.4- Relação entre a expressão de Cox-2 e de EGFR (associação e correlação)

Pela evidência de partilha de funções nas diversas etapas da carcinogénese por parte

da enzima Cox-2 e do receptor EGFR, foi realizado o teste de Spearman˃s de modo a

verificar a existência de uma correlação entre os marcadores em estudo. Ambas as

variáveis foram utilizadas de modo categorizado, segundo os valores de cut-off usados

previamente. A correlação obtida é positiva e significativa (r=0,474, p=0,001) para os

tumores incluídos neste estudo. (Quadros 7 e 8)

Quadro 7: Associação da expressão de COX-2 com a expressão de EGFR em TMC malignos.

Pela análise do quadro anterior pode-se constatar que, dos tumores que constituem a

amostra deste estudo, 39,5% (n=17) revelam baixa imunorreactividade para os

marcadores em análise. Contudo, um número significativo de tumores (n=15),

representando 34,9% dos casos, apresenta elevada imunoexpressão de EGFR e

reduzida expressão de Cox-2. Além disso, 11 tumores apresentam simultaneamente alta

imunorreactividade para Cox-2 e EGFR (25,6% da amostra). De realçar que nenhum

tumor apresenta elevada expressão de Cox-2 e reduzida expressão de EGFR.

A associação entre a Cox-2 e o EGFR é estatisticamente significativa (p=0,001).

Expressão COX-2 n

%

Expressão EGFR n % Total P

Baixa Alta

Baixa 39,5% 34,9% 74,4%

0,001 Alta 0,0% 25,6% 25,6%

Total 39,5% 60,5% 100%


40

Quadro 8: Correlação entre Cox-2 e EGFR

No quadro 8 está patente que a correlação obtida entre os marcadores em estudo é

positiva e significativa (r=0,474, p=0,001).

4.1.5- Associação entre a imunoexpressão de Cox-2 e EGFR com as variáveis clínico-patológicas

Os tumores mamários incluídos neste estudo foram distribuídos por 3 grupos: o grupo

com baixa expressão de Cox-2 ou EGFR foi denominado grupo A; o grupo com elevada

imunorreatividade à Cox-2 e baixa ao EGFR, ou alta expressão de EGFR e baixa de Cox-

2, forma o grupo B; o grupo com elevada imunorreatividade a ambos foi designado grupo

C (adaptado de Ceccarelli et al., 2005). De frisar, que todos os tumores da amostra

revelaram imunorreatividade para os marcadores em análise. No quadro 9 estão

expressas as relações encontradas entre cada um dos grupos e as variáveis clínico-

patológicas analisadas.

EGFR

Cox-2 n= 43

r=0,474 p=0,001


41

Quadro 9: Relação entre os grupos Cox-2/EGFR e as variáveis clínico-patológicas.

Variáveis

baixoCOX-2/baixo EGFR

baixoCOX-2/altoEGFR

altoCOX-

2/altoEGFR p

n n n

Tamanho (n=43) 1 (<3cm)

2 (3-5cm)

3 (>5cm)

0,083

7 8 2

8 4 3

2 3 6


0,500 1 1 2

16 14 9

Tipo histológico (n=43) Carcinoma sólido Carcinoma tubulo-papilar Carcinoma complexo Carcinossarcoma Carcinoma anaplásico

0,479

1 1 2

10 8 5

5 5 1

0 1 1

1 0 2


0,213 3 3 5

14 12 6

Índice mitótico (n=43) 1 2 3

0,147 11 9 2

3 4 5

3 2 4


0,049 11 8 2

6 7 9


0,263 5 2 2

7 8 2

5 5 7


0,031 10 5 2

4 7 2

3 3 7

Metastização dos linfonodos (n=43) Presente Ausente

0,025 0 2 4

17 13 7

Pela observação do quadro 9, podemos constatar que foi possível determinar

associações estatisticamente significativas entre os grupos Cox-2/EGFR e as seguintes

variáveis clínico-patológicas: grau nuclear (p=0,049), grau histológico de malignidade

(p=0,031) e metastização dos linfonodos (p=0,025).

No que concerne ao grau nuclear (GN), observando o quadro 9 podemos constatar

nos tumores identificados como tendo GN=3, 6 de 22 casos revelaram baixa


42

imunorreatividade para os dois marcadores, 7 de 22 casos, apresentaram

imunoexpressão alta para o EGFR e baixa para a Cox-2 e 9 de 22 casos, caracterizaram-

se por uma imunoexpressão alta para ambos os marcadores.

No que respeita ao grau histológico de malignidade (GHM), constatou-se que a

maioria dos tumores com GHM=I apresentou baixa imunoexpressão quer de Cox-2, quer

de EGFR (10 de 17 casos). A maioria dos tumores com GHM=2 revelou alta

imunorreatividade para o EGFR e baixa para a Cox-2 (7 de 13 casos). Nos tumores de

GHM=3, denotou-se que a maioria dos casos apresentou alta imunorreatividade para

Cox-2 e EGFR, com o registo de 7 de 13 casos.

No que diz respeito ao parâmetro metastização nos linfonodos, dos 6 casos com

linfonodos metastizados, 4 apresentam em simultâneo elevada imunoreatividade para a

Cox-2 e para o EGFR. Os outros 2 casos pertencem ao grupo com baixa

imunoreatividade para a Cox-2 e elevada para o EGFR. Dos tumores com ausência de

metastização nos linfonodos (n=37), 17 apresentaram baixa imunorreatividade à Cox-2 e

ao EGFR, 13 demonstraram baixa immunoreatividade para a Cox-2 e elevada para o

EGFR e 7 elevada imunoreatividade aos dois marcadores.

43

CAPÍTULO 5 DISCUSSÃO

Os tumores mamários assumem-se como a entidade tumoral mais frequente em

canídeos do género feminino (Sorenmo, 2003).

Apesar de, nas últimas décadas, uma imensidão de trabalhos científicos terem incidido

no complexo fenómeno oncológico na tentativa de descortinar qual a etiologia, factores

de risco, processos moleculares, contributo genético, factores de prognóstico e

modalidades de tratamento, será correcto afirmar que muitos mistérios continuam por

desvendar. Reconhecem-se várias batalhas ganhas nesta luta contra o Cancro, fruto de

novas modalidades de diagnóstico e tratamento, mas a guerra ainda pende para o lado

inimigo, com inúmeras mortes registadas todos os anos, não só na espécie humana mas

também na canina.

A pesquisa de marcadores moleculares com potencial como alvo terapêutico é, desta

feita, de importância fulcral para a comunidade científica, cujo objectivo é atingir a doença

no seu cerne, com a maior especificidade possível e o menor número de efeitos nefastos.

Reconhece-se, porém, que este tipo de modalidade terapêutica poderá ter mais utilidade

associada à terapia convencional, e não como tratamento isolado.

Em Medicina Humana, vários são já os trabalhos desenvolvidos tendo como base a

pesquisa dos marcadores Cox-2 e EGFR, quer isoladamente, quer associados, não só

em tumores de mama, mas em vários outros tipo de tumor: adenocarcinoma pulmonar,

carcinoma pulmonar de não pequenas células, cancro colo-rectal, carcinoma

nasofaríngeo, adenocarcinoma esofágico, entre outros (Bhargava et al., 2005; Ceccarelli

et al., 2005; Li et al., 2006; Van Dyke et al., 2008; Huang et al., 2010; Li et al., 2011)

Em Medicina Veterinária existem alguns estudos que avaliaram a expressão de Cox-2

nos diferentes tumores caninos, embora para o EGFR tal número é notoriamente mais

escasso (Doré et al., 2003; Mohammed et al., 2004; Heller et al., 2005; Millanta et al.,

2006; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009; Gama et al. 2009; Lavalle et

al.,2009). Que seja do nosso conhecimento, não existe actualmente nenhum trabalho

científico em tumores de mama de cadela que tenha avaliado a expressão de Cox-2 e de

EGFR, simultaneamente e no mesmo grupo de tumores, nem, consequentemente, a

correlação entre estas duas moléculas. Tal facto serviu de mote para o desenvolvimento

deste trabalho, cujos objectivos recaem na avaliação da expressão destas moléculas em

43 tumores mamários de cadela, pelo método da imunohistoquímica, na relação desta


44

expressão com características clínico-patológicas e na relação da Cox-2 e do EGFR

entre si. A análise da expressão das moléculas em causa com a sobrevida foi um

parâmetro não analisado, resultante do facto dos casos serem recentes e não ter

decorrido tempo suficiente para o efeito.

Segundo o nosso trabalho, pela avaliação da expressão da Cox-2 nos tumores

mamários incluídos na nossa amostra, foi possível estabelecer associações

estatisticamente significativas entre esta molécula e diversas características clínico-

patológicas. Assim, os nossos resultados demonstraram que a expressão de Cox-2 tinha

associação estatisticamente significativa com o tamanho tumoral (p=0,033), índice

mitótico (n=0,040), grau nuclear (0,021), grau histológico de malignidade (p=0,020) e

metastização nos linfonodos (p=0,029). As associações constatadas traduzem uma

relação entre a expressão de Cox-2 e fenótipos tumorais mais agressivos, tal como

relatado em estudos anteriores (Doré et al., 2003; Heller et al., 2005; Queiroga et al.,

2007; Dias Pereira et al., 2009; Queiroga et al., 2010).

À semelhança dos resultados obtidos no nosso trabalho, Queiroga et al. (2005),

analisando a expressão de Cox-2 em 129 tumores mamários de cadela por “enzyme-

immunoassay” (ElA) concluiu que, nos tumores malignos não inflamatórios, a detecção

de Cox-2 era maior nos tumores de maior tamanho e de tipo histológico mais agressivo.

Num trabalho desenvolvido pela mesma autora, em 2010, em 27 TMC de carácter

maligno, em que 100% revelaram imunorreactividade para a Cox-2, concluiu-se que a

expressão de Cox-2 apresentava associação estatisticamente significativa com a

metastização nos linfonodos regionais (p=0,038), associação também evidente no nosso

estudo. Num estudo recente, concluiu-se que a expressão de Cox-2 estava presente em

76,2% dos tumores malignos analisados e evidenciava associação estatisticamente

significativa com o tipo histológico (p=0,034), crescimento infiltrativo (p=0,010), grau

nuclear (P=0,049) e índice mitótico (p=0,006) (Queiroga et al., 2011). Como se pode

constatar, existe uma similitude entre estes resultados e os do nosso trabalho,

relativamente ao índice mitótico e ao grau nuclear.

Os nossos resultados não evidenciaram uma associação estatisticamente significativa

entre a expressão de Cox-2 e o tipo histológico, ao contrário do demonstrado no estudo

anterior e noutros de Medicina Veterinária (Heller et al., 2005) e Humana (Ristimaki et al.,

2002). De referir que esta discrepância de resultados poderá resultar do facto da nossa

amostra se caracterizar por um reduzido número de tumores em cada tipo histológico e,

portanto, não haver suficiente representatividade. Para além disso, diferenças na técnica

da imunohistoquímica, na avaliação da imunorreactividade e nos anticorpos utilizados

poderão contribuir para as discrepâncias verificadas nalguns estudos.


45

Assim sendo, podemos depreender que as conclusões da nossa investigação

traduzem uma relação entre a expressão de Cox-2 nos TMC e diversos parâmetros

clínicos de malignidade e agressividade tumoral. Estes resultados estão em consonância

com diversos estudos anteriores, no contexto dos tumores de mama (Doré et al., 2003;

Heller et al., 2005; Millanta et al., 2006a; Queiroga et al., 2007; Dias Pereira et al., 2009),

bem como em outros tipos de tumor de canídeos, nomeadamente, mastocitomas (Justina

et al., 2011) e melanomas (Pires et al., 2010).

No que diz respeito ao EGFR, os nossos trabalhos vieram revelar que a expressão

deste receptor apresentava associação estatisticamente significativa com um parâmetro

clínico: metastização nos linfonodos (p=0,038).

Seis tumores revelaram metastização ao nível dos linfonodos regionais e todos

expressaram EGFR (100%).

Num estudo desenvolvido por Gama et al., 2009, em que procedeu à análise de 136

TMC por imunohistoquímica, constatou-se que a expressão de EGFR apresentava

associação estatisticamente significativa com a malignidade tumoral, a idade do animal e

o tamanho tumoral. Assim, segundo esse trabalho, a expressão de EGFR era superior

nos animais com idade superior a 9 anos, nos tumores malignos e nos tumores de maior

tamanho. Não se obtiveram associações significativas com os demais parâmetros clínico-

patológicos, nem com a sobrevivência, embora se denote uma tendência para menores

períodos livres de doença e de sobrevivência global nos tumores com expressão de

EGFR. Apesar dos nossos resultados apenas revelarem uma associação

estatisticamente significativa entre a expressão do EGFR e a invasão dos linfonodos, tal

traduz uma relação entre a expressão do marcador em causa e a malignidade tumoral, tal

como verificado no estudo de Gama et al. (2009), denotando-se simultaneamente um

possível papel do EGFR na progressão tumoral.

Rutteman et al., (1994) realizaram um estudo no sentido de avaliarem a expressão de

EGFR em tecidos mamários normais, tumores benignos, tumores malignos e metástases,

concluíndo que a expressão de EGFR não diferia muito entre estes tecidos. Segundo os

seus resultados, na glândula mamária de canídeos, a expressão de EGFR não se

relacionava com a agressividade biológica do comportamento tumoral. Resultados

semelhantes foram alcançados por Nerurkar et al. (1987) e Donnayet al. (1996). A

disparidade verificada entre os resultados apresentados por estes autores e os obtidos no

nosso trabalho e de Gama et al. (2009), poderá estar relacionada com o contexto

temporal em que se desenvolveram e, consequentemente, pela adopção de diferentes

técnicas. Tal facto impossibilita, a nosso ver, o exercício de comparações legítimas.

A escassez de estudos de expressão de EGFR em TMC é deveras notória, o que

impossibilita uma confrontação de resultados mais produtiva. De referir que a expressão


46

de EGFR tem sido alvo de estudo noutros tumores caninos, nomeadamente em tumores

nasais (Shiomitsu et al., 2009), gliomas (Higgins et al., 2010) e osteossarcomas

(Selvarajah et al., 2012), entre outros, e relacionada com a malignidade tumoral, tal como

verificado nos TMC. Tais constatações despoletam um interesse cada vez maior para a

utilização de terapia dirigida.

Em Medicina Humana, no contexto do cancro da mama, o EGFR é um marcador

molecular cujo valor prognóstico tem sido alvo de inúmeros estudos, cujos resultados

permanecem bastante controversos (Fox et al., 1994; Toi et al., 1994; Pirinen et al.,1995;

Reis-Filho et al., 2006a, b). Assim, enquanto alguns trabalhos concluem que a expressão

positiva de EGFR está relacionada com menor tempo livre de doença e menor

sobrevivência (Tsutsui et al., 2002), outros há que não denotam qualquer correlação

(Ciardiello et al., 2003).

Como anteriormente referido, não existem à data, segundo o nosso conhecimento,

quaisquer estudos realizados em TMC que avaliem a expressão de Cox-2 e EGFR, bem

como a sua correlação. Segundo os nossos resultados, dos 43 tumores de mama

malignos analisados, 25,6% apresentaram simultaneamente altas expressões de Cox-2 e

EGFR. Além disso, 34,9% revelaram alta imunorreatividade para o EGFR e baixa para a

Cox-2, sobressaindo o facto de não existir qualquer tumor com alta expressão de Cox-2

sem alta expressão de EGFR. Apenas 17 casos (39,5%) demonstraram baixa

imunorreactividade para os dois marcadores em análise.

As expressões de Cox-2 e EGFR apresentaram correlação positiva (r=0,474) e

estatisticamente significativa (p=0,001), entre si.

Na relação da imunoexpressão dos grupos Cox-2/EGFR com as variáveis clínico-

patológicas foi possível estabelecer associações estatisticamente significativas entre

estes grupos e o grau nuclear (p=0,049), o grau histológico de malignidade (p=0,031) e a

metastização nos linfonodos (p=0,025).

Assim, em linhas gerais, denotou-se que os tumores com alta imunoexpressão de

Cox-2 e EGFR eram tumores com características de maior agressividade. A maioria dos

tumores com GN=3, GHM=3 e com invasão dos linfonodos regionais revelaram alta

imunorreactividade para ambos os marcadores.

Face ao exposto, o nosso trabalho vem constatar uma correlação entre as expressões

COX-2 e EGFR nos TMC, além de ter demonstrado a existência de associações

estatisticamente significativas com determinadas características clínico-patológicas

relacionadas com fenótipos tumorais mais agressivos. Estes resultados entram em

acordo com o verificado individualmente para cada marcador analisado, como

anteriormente discutido.


47

O EGFR encontra-se frequentemente sobre-expresso no cancro colo-rectal humano,

cuja aberrante expressão promove a proliferação e a resistência à apoptose e,

consequentemente, a transformação, progressão e metastização (Radinsky et al., 1995;

Tong et al., 1998; Robert set al., 2002). Tais fatos são concordantes com os nossos

resultados, dado que se verificou uma associação estatisticamente significativa entre o

EGFR e a invasão dos linfonodos regionais, sobressaindo o papel deste marcador na

progressão tumoral. A Cox-2 também se encontra anormalmente expressa na maioria

destes tumores e encontra-se envolvida na tumorigénese promovendo também a

proliferação celular e a inibição da apoptose, além da angiogénese (Kutchera et al., 1996;

Gupta et al., 2001; Pai et al., 2003). As acções desenvolvidas pela Cox-2 nas várias

etapas da carcinogénese, anteriormente explícitas, conduzem a fenótipos tumorais mais

agressivos, sendo esta conclusão semelhante às formuladas no decorrer no nosso

estudo.

Num estudo levado a cabo por Ceccarelli et al. (2005) avaliou-se por IHQ as

expressões de EGFR, Cox-2 e marcadores proliferação, numa série de 205 tumores

colorectais e as suas associações com parâmetros clínico-patológicos. Os seus

resultados não evidenciaram associações estatisticamente significativas entre EGFR e

Cox-2 com a idade, localização tumoral ou estadio. A expressão de EGFR apresentou

relação directa com o Ki-67 e as ciclinas D1 e E, o que confirmou ser um dos factores

envolvidos na proliferação, como anteriormente já referido (Knauer et al., 1984, Li net al.,

2001) dando ainda mais solidez aos resultados por nós alcançados relativamente ao

EGFR nos TMC. Por outro lado, os casos com elevada expressão de Cox-2

demonstraram uma clara promoção da proliferação do EGFR, o mesmo não se

verificando nos de baixa expressão, tal como constatado pelo nosso estudo cuja

correlação entre estas duas moléculas se revelou positiva e significativa, além de que

não se registaram quaisquer casos de alta expressão de Cox-2 com baixa expressão de

EGFR. Ceccarelli et al. (2005) concluíram que as duas proteínas são alvos

farmacológicos de enorme interesse no contexto do Cancro Colo-rectal, quer para

terapia, quer para quimioprevenção. O grupo de casos com elevada expressão de Cox-2

parece ser o candidato ideal para uma terapia combinada anti-Cox-2/EGFR. Uma vez

que, na nossa amostra, 25,6% dos tumores revelaram elevada imunorreactividade para

os dois marcadores, fará todo o sentido, futuramente, o desenvolvimento de estudos

sobre a utilização de modalidades terapêuticas combinadas anti-Cox-2/EGFR nos TMC.

Li et al. (2006) analisaram e compararam pacientes com tecido esofágico normal,

esofagite de Barret e adenocarcinoma esofágico, revelando um aumento de expressão

de Cox-2 e EGFR do tecido normal para a esofagite normal, e deste para o

adenocarcinoma. O fato das expressões de Cox-2 e EGFR aumentarem em tecidos


48

tumorais, comparativamente com não cancerígenos, entra em concordância com os

nossos resultados pois, tendo em consideração que só analisámos tumores malignos,

obtivemos imunoexpressões (baixas ou altas) de Cox-2 e EGFR em todos os casos.

Além disso, houve uma clara relação da expressão destes marcadores com

características de maior malignidade tumoral.

Kim et al. (2004), constataram que pacientes padecendo de carcinoma de células

escamosas no cérvix uterino, com imunopositividade para Cox-2 e EGFR, apresentavam

piores resultados de sobrevivência livre de doença aos 5 anos e maior probabilidade de

recorrência loco-regional comparativamente com doentes com +Cox-2/-EGFR, -Cox-

2/+EGFR ou –Cox-2/-EGFR. Os nossos resultados também evidenciaram relações entre

o grupo +Cox-2/+EGFR com o GHM e a metastização nos linfonodos, características de

maior agressividade tumoral. Por analogia é de esperar que os TMC com alta

imunorreactividade a Cox-2 e EGFR tivessem menor sobrevida e maior recorrência loco-

regional.

Van Dyke et al. (2008), num estudo analisando adenocarcinomas de pulmão em

mulheres, demonstrou que tumores com expressão -Cox-2/+EGFR, mas não +Cox-

2/+EGFR, apresentaram-se associados a sobrevivência. Por outro lado, pacientes com

positividade à Cox-2 tendiam a ter pior prognóstico do que pacientes sem expressão do

marcador. Estes resultados vêm uma vez mais reforçar as nossas conclusões, dado que

também verificámos que os grupos +Cox-2/+EGFR apresentavam relações com

características de maior agressividade tumoral, do que nos restantes grupos, pelo que se

esperaria que, nestes últimos, a sobrevivência fosse menor. Também constatámos que

tumores com elevada imunorreatividade para Cox-2 estavam associados a características

clínico-patológicas de maior agressividade, consequentemente, pior prognóstico. No

entanto serão necessários estudos de seguimento clinico, a fim de clarificar os presentes

resultados.

Num estudo recente desenvolvido por Fenge et al. (2011), foi avaliada a expressão de

EGFR e Cox-2 em tumores pulmonares de não pequenas células (NSCLC), com o intuito

de relacionar tais expressões com características clínico-patológicas e estabelecer os

seus valores prognósticos. A imunoexpressão de EGFR demonstrou associação

estatisticamente significativa com o parâmetro metastização nos linfonodos (p=0,040), em

concordância com os nossos resultados, e sobrevivência (p=0,038), sendo que elevadas

expressões de EGFR se relacionaram com menor período de sobrevivência. Além disso,

demonstraram que a expressão de EGFR está associada a uma maior resistência dos

tumores à radioterapia e menor efectividade da técnica. Relativamente à Cox-2, esta

apresentou-se relacionada com a malignidade tumoral, à semelhança do nosso estudo,

mas não evidenciou correlação com a sobrevivência. Apesar de se ter constatado sobre-


49

expressão de Cox-2 e EGFR nos NSCLC, as suas expressões não demonstraram

correlação entre si. Segundo os autores esta falta de correlação poderá implicar que a

expressão destas duas proteínas poderá ser controlada por mecanismos independentes.

Num estudo protagonizado por Lanza-Jacoby et al.(2006), os autores demonstraram

os efeitos da combinação do inibidor da tirosina-quinase do EGFR, ZD1839, e o inibidor

da Cox-2, celecoxib, na sobrevivência celular, progressão do ciclo celular e apoptose,

numa linha celular de tumores de mama de ratinhos, NMF11.2. Os resultados deste

trabalho revelaram que a combinação dos dois fármacos conduziu a um efeito supra-

apoptótico adicional em células tumorais com simultânea expressão de HER-2. A

eficácia do tratamento combinado também demonstrou estar associado com uma

considerável inibição do EGFR EGF- activado e do sinal extracelular regulado pela

quinase (via ERK-1/2), comparativamente com os tratamentos preconizados com apenas

um dos agentes. A evidência de que 25,6% dos tumores abrangidos pela nossa amostra

revelaram altas expressões de Cox-2 e EGFR, dá ênfase à possível utilidade destes

fármacos no combate aos TMC.

Por outro lado, num ensaio de fase I em doentes com cancro de pulmão de não

pequenas células, observou-se que a terapia combinada era segura e obtinha respostas

parciais em 33% dos pacientes e conduzia a estabilização em cerca de 24% (Reckamp et

al., 2006). Contudo, noutros ensaios clínicos mais recentes (utilizando um inibidor de

Cox-2 e inibidores do EGFR, gefitinib ou erlotinib, não evidenciaram qualquer benefício

adicional do tratamento combinado em pacientes sem resposta ao tratamento com

platinum ou pacientes naíve à quimioterapia, comparativamente com estudos anteriores

preconizados com o recurso ao gefitinib ou erlotinib sozinhos (O, Byrne et al.,2007;

Gadgeel et al., 2007; Argwala et al., Fidler et al., 2006). Estes resultados entram em

discordância com os verificados em linhas celulares in vitro, havendo autores que

sugiram que o benefício da terapia combinada poderá estar associada a tumores com

mutações de EGFR (Gadgeel et al., 2007). Apesar dos nossos resultados evidenciarem

um número considerável de tumores com expressão simultânea de Cox-2 e EGFR,

estudos específicos com inibidores selectivos destas moléculas são necessários, no

contexto dos TMC, para constatação da sua real efectividade.

Em suma, o nosso trabalho de investigação, que seja do nosso conhecimento,

debruçou-se pela primeira vez, na esfera da Medicina Veterinária, na avaliação conjunta

das imunoexpressões dos marcadores EGFR e COX-2, desta feita em TMC. Os

resultados produzidos evidenciaram relações significativas entre estas expressões e

características de malignidade/agressividade tumoral, à semelhança do relatado em

inúmeros estudos realizados em tumores de Medicina Humana, como anteriormente


50

descrito. Além disso, foi possível estabelecer uma correlação entre a expressão das

proteínas entre si.

51

CAPÍTULO 6

CONCLUSÃO

Em Medicina Humana, apesar da panóplia de estudos incidindo sobre as expressões

de Cox-2 e EGFR, os resultados relacionados com o valor prognóstico e a utilidade da

utilização de terapia combinada dirigida a estas moléculas-alvo, ainda permanece

controverso. Evidente parece ser que cada situação tumoral está envolta de processos

ímpares, de interacções moleculares próprias e passíveis de adaptações temporais,

levando-nos a crer que o valor prognóstico de cada molécula e a utilização de terapia-

dirigida carece de uma minuciosa avaliação individual.

Em Medicina Veterinária urge a necessidade de desenvolvimento de um maior número

de estudos no sentido de se avaliarem as expressões de Cox-2 e EGFR em amostras

maiores de TMC e noutros tipos de tumor, na tentativa de discernir qual o seu papel

prognóstico, bem como a possibilidade de usufruir de terapia combinada.

Os nossos resultados revelaram-se bastante promissores no sentido em que

demostraram a existência de imunoexpressão de Cox-2 e EGFR nos TMC, conseguiram

estabelecer relações entre estes marcadores e características relacionadas com

agressividade tumoral, à semelhança de alguns tumores humanos, e evidenciaram

correlação entre as expressões de Cox-2 e EGFR. Estas constatações abrem portas para

investigações respeitantes à utilização de terapia dirigida, em modalidade isolada ou

combinada, nos tumores mamários de cadela. A utilização destas abordagens

terapêuticas trará esclarecimentos para o entendimento da tumorigénese mamária de

canídeos e, adicionalmente, para os tumores de mama da mulher, tendo em conta que,

actualmente, a cadela se assume como um reconhecido modelo de carcinogénese para

os tumores humanos.

52

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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