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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
VIVIANE ALVES DE OLIVEIRA MAIA
Natal/RN
2014
IMUNOEXPRESSÃO DO EGFR E DA
PODOPLANINA EM CISTOS RADICULARES E
DENTÍGEROS
Viviane Alves de Oliveira Maia
IMUNOEXPRESSÃO DO EGFR E DA PODOPLANINA EM CISTOS
RADICULARES E DENTÍGEROS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Patologia Oral da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
como parte dos requisitos para obtenção do
título de mestre em Patologia Oral.
Orientador: Profº Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel.
Co-orientadora: Profª. Drª Roseana de Almeida Freitas.
Natal/RN
2014
Anexo
“Um dia você entende que o tempo não é inimigo.
E que ele é o nosso maior mestre.
Que tudo vem na hora que deve vir.
Que não adianta espernear nem se esconder da vida.
Que a fuga não é a melhor saída.
E que no fim das contas a gente sempre acaba agradecendo tudo que passou.
Porque o tempo (ah, o tempo!) está sempre ao nosso lado,
para nos mostrar o que realmente vale a pena.”
(Autor desconhecido)
Dedicatória
DEDICATÓRIA
Com muito amor e carinho dedico este trabalho...
Ao meu marido, amor, cúmplice, companheiro e confidente Marcus Fábio
Maia, pela ajuda, compreensão e apoio em todos os momentos.
Aos meus pais Marlene e Elismar que me ensinaram e me apoiaram em
todas as etapas na busca do conhecimento e, que nos últimos anos, mesmo de longe,
mas totalmente presentes, me inspiram, me abençoam, me incentivam e me
impulsionam na busca e realização dos meus sonhos. Pelo amor constante e
incondicional.
Aos meus irmãos Vagner e Vanessa, que fazem com que minha família seja
completa e realizada, pelo amor entre nós, e por festejarem comigo cada conquista.
Agradecimentos
Aos meus amigos de mestrado Thâmara, Andréia, Luciana, Tais, Tiago,
Maria Luiza, Luiz Eduardo e Marcelo pelo companheirismo, ajuda e
prestabilidade. Por serem verdadeiros amigos, dando apoio nas horas ruins,
comemorando as horas felizes e fornecendo incentivo, enfim, fazendo o fardo do dia-a-
dia ficar mais leve. Por serem confidentes e por formarem a família que eu tanto
precisava aqui em Natal. Vocês me completaram e, com certeza, cada um de modo
especial, será sempre lembrado e merecem meu muito obrigada.
Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel,
e à minha coorientadora Prof. Dra. Roseana de Almeida Freitas, pela dedicação,
compreensão, companheirismo, amizade e doação. A Bruno, por saber me entender,
respeitar minhas opiniões, compartilhar seus conhecimentos de forma aberta, pela
extrema prestabilidade, e por aceitar encarar comigo esse desafio, que com certeza nos
serviu de grande aprendizado. A Roseana, por aceitar ser o apoio essencial, que com
carinho e de forma especial me acolheu como filha, me ouvindo, ajudando na
orientação e nos completando com seu imenso conhecimento e solicitude.
À Melka, em especial, por ser sempre solícita, por me ajudar com sua
extrema organização, seus caderninhos e sua gentileza.
Às doutorandas, Denise, Aninha, Bárbara, Clarissa, Natália, Roseane,
Keila, Cintia e Emeline por fornecerem ajuda e compartilharem seus conhecimento
sempre que solicitadas. Por fazerem parte do nosso dia-a-dia compartilhando e
vivenciando cada aflição, dúvida, alegrias, comemorações e conquistas.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente e, sobretudo, a Deus, por me conceder força para realizar meus
sonhos, e por abençoar e guiar todos os meus passos. A ELE toda honra e toda glória
por toda essa bênção.
Toda conquista só é alcançada com a ajuda de pessoas especiais, verdadeiros
anjos que se fazem presentes em nossa vida, não só nos concedendo apoio essencial,
mas por comemorarem e se orgulharem de cada vitória. Aos meus anjos, merecidos
agradecimentos sejam prestados:
A Marcus Fábio Maia, por ser meu companheiro, incentivador e
impulsionador para essa realização, que com certeza também é dele. Pela doação,
ajuda e compreensão nos momentos de ausência e muito trabalho. Por toda a
batalha vencida juntos, o que tornou meus momentos e minha vida mais felizes, leves
e completamente realizadas.
Aos meus pais Elismar e Marlene por me educarem e incentivarem para o
estudo. Por compreenderem minha ausência e mesmo assim me concederem amor
pleno, que me impulsiona na realização dos meus sonhos. Pela educação, dedicação e
compromisso que os fazem exemplos para minha vida, e a quem eu tenho imenso
orgulho e dedico cada realização, que só é conseguida com a ajuda incondicional
prestada por eles.
Aos meus irmãos Vagner e Vanessa por torcerem pela minha felicidade e por
fazerem minha família ser linda como é.
Aos queridos funcionários Gracinha, Lurdinha, Sandrinha, Hévil, Ricardo e
Idel pela solicitude, prestabilidade e carinho com que nos ajudam, o que os tornam
especiais e essenciais nesta conquista.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte: Profa. Dra. Éricka Janine
Dantas da Silveira, Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Prof. Dra. Lélia
Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Prof. Dr. Antônio de
Lisboa Lopes Costa, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, Prof. Dra. Márcia
Cristina da Costa Miguel, Profa. Dra. Ana Myriam Costa de Mederiros pela
dedicação, disponibilidade e amor à Patologia Oral.
À minha ex-professora Tânia Regina Grão Velloso por ter dispertado em
mim o interesse pela Patologia Oral.
Aos amigos de perto e de longe que torceram, torcem e se alegram com cada
vitória. Em especial Raquel e Hilton por me incentivarem, serem amigos,
fornecerem apoio e sempre terem uma palavra de alegria e força. Por me concederem
a honra de ser madrinha do lindo e especial Luiz Fernando.
Ao apoio e incentivo financeiro fornecidos pela CAPES, que me permitiram
cursar o mestrado e realizar esta pesquisa.
Resumo
RESUMO
Os cistos radiculares (CRs) e dentígeros (CDs), apesar de possuírem etiologias diferentes, formam uma cavidade patológica revestida por epitélio, a qual cresce em função do acúmulo de líquido em seu interior, à medida que o osso ao redor é reabsorvido e o epitélio vai sendo induzido a proliferar. A proliferação epitelial, que tem sido apontada como um dos processos determinantes no crescimento das lesões císticas odontogênicas, é influenciada por fatores de crescimento como o EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e a podoplanina (PDPN), muitos dos quais podem ter sua produção estimulada principalmente durante processos inflamatórios. O objetivo desta pesquisa foi avaliar e comparar a expressão imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em 30 casos de CRs e 30 casos de CDs, de forma semiquantitativa, em microscopia de luz, associando-a com o grau de inflamação, localização celular da imunocoloração e com as camadas epiteliais imunomarcadas. Os dados foram avaliados estatisticamente por meio de testes do Qui-quadrado e Exato de Fisher, considerando-se um nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que houve elevada imunorreatividade das duas proteínas nas lesões estudadas, sendo observada apenas diferença estatística significativa na imunoexpressão da PDPN (p=0,033), que se mostrou mais elevada nos CRs. Os demais parâmetros analisados não demonstraram diferenças significativas relevantes. Conclui-se que, como o EGFR e a PDPN apresentaram elevada imunoexpressão nas lesões císticas analisadas, essas proteínas participam da patogênese dessas lesões através da estimulação epitelial, apesar de apresentarem etiologias diferentes. Além disso, pode-se inferir que a maior imunomarcação da PDPN em CRs do que em CDs não se mostrou indicador de distinção entre as duas lesões, com relação às suas etiologias, uma vez que nestes últimos essa proteína também apresentou expressão considerável, independente da intensidade do infiltrado inflamatório.
Palavras-chave: Cistos odontogênicos. Cisto dentígero. Cisto radicular. EGFR. Podoplanina. Imunoistoquímica.
Abstract
ABSTRACT
The radicular cysts (RCs) and dentigerous (DCs), despite having different etiologies, form a pathological cavity lined by epithelium, which grows due to the buildup of fluid inside, as the surrounding bone is reabsorbed and the epithelium will being induced to proliferate. The epithelial proliferation, which has been identified as one of the key processes in the growth of odontogenic cystic lesions, is influenced by growth factors such as EGFR (epidermal growth receptor factor) and podoplanin (PDPN), many of which may have its production stimulated mainly during inflammatory processes. The objective of this research was to evaluate and compare the immunohistochemical expression of EGFR and PDPN in 30 cases of RCs and 30 cases of DCs, semiquantitatively, in light microscopy, associating it with the degree of inflammation, cellular localization of immunostaining and with the immunostained epithelial layers. Data were statistically analyzed by Chi-square test and Fisher exact test, considering a significance level of 5 %. The results showed high immunoreactivity of both proteins in the lesions studied, only statistically significant difference was observed in immunostaining of PDPN (p=0.033), which proved higher in RCs. The other analyzed parameters showed no relevant significant differences. We conclude that, as EGFR and PDPN showed high immunoreactivity in cystic lesions analyzed, these proteins participate the pathogenesis of these lesions through the epithelial stimulation process, despite having different etiologies. Furthermore, it can infer that the higher immunostaining of PDNP in RCs that DCs showed no distinction indicator between the two lesions, regarding their etiologies, once this protein also showed a considerable expression in DCs, independent of the intensity of the inflammatory infiltrate.
Keywords: Odontogenic Cysts. Dentigerous cyst. Radicular cyst. EGFR. Podoplanin. Immunohistochemistry.
Lista de Ilustrações
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Ilustração da análise do infiltrado inflamatório em CRs e CDs,
segundo metodologia adaptada do estudo de Tsai et al.
(2004)............................................................................................ 57
Figura 2: Características morfológicas dos CRs e CDs............................... 75
Figura 3: Imunoexpressão do EGFR em CRs.............................................. 76
Figura 4: Imunoexpressão do EGFR em CDs.............................................. 77
Figura 5: Imunoexpressão da PDPN em CRs.............................................. 78
Figura 6: Imunoexpressão da PDPN em CDs.............................................. 79
Quadro 1: Classificação das variáveis dependentes. Natal-RN, 2014........... 55
Quadro 2: Classificação das variáveis independentes. Natal-RN, 2014........ 55
Quadro 3:
Especificações dos anticorpos primários utilizados na pesquisa.
Natal-RN, 2014.............................................................................. 58
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório quanto ao tipo de
cisto. Natal-RN, 2014............................................................................... 63
Tabela 2: Distribuição dos escores de imunomarcação para EGFR e PDPN
quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014.................................................. 64
Tabela 3: Distribuição da localização celular da imunomarcação para EGFR e
PDPN quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014....................................... 65
Tabela 4: Distribuição das camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e
PDPN quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014....................................... 65
Tabela 5: Distribuição dos escores de imunomarcação com relação à
intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da
imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e
PDPN nos casos de CRs. Natal-RN, 2014.............................................. 66
Tabela 6: Distribuição dos escores de imunomarcação com relação à
intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da
imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e
PDPN nos casos de CDs. Natal-RN, 2014.............................................. 67
Tabela 7: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação à
localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos
de CRs. Natal-RN, 2014.......................................................................... 68
Tabela 8: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação à
localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos
de CDs. Natal-RN, 2014.......................................................................... 68
Tabela 9: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação às
camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de
CRs. Natal-RN, 2014............................................................................... 69
Tabela 10: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação às
camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de
CDs. Natal-RN, 2014............................................................................... 69
Tabela 11: Distribuição da localização celular da imunomarcação com relação às
camadas epiteliais imunomarcadas nos casos de CRs. Natal-RN,
2014......................................................................................................... 71
Tabela 12: Distribuição da localização celular da imunomarcação com relação às
camadas epiteliais imunomarcadas nos casos de CDs. Natal-RN,
2014......................................................................................................... 71
Tabela 13: Teste Exato de Fisher entre escores de imunomarcação do EGFR e
da PDPN quanto aos tipos de cistos analisados. Natal-RN, 2014.......... 72
Tabela 14: Associação da imunomarcação para EGFR e PDPN quanto à
intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da
imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas, de acordo com
o Teste de Qui-quadrado/Exato de Fisher para os casos de CRs.
Natal-RN, 2014........................................................................................ 73
Tabela 15: Associação da imunomarcação para EGFR e PDPN quanto à
intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da
imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas, de acordo com
o Teste Exato de Fisher para os casos de CDs. Natal-RN, 2014............ 74
Lista de Abreviaturas e Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AKT: Proteína cinase B.
BEH: Bainha epitelial de Hertwig.
CD: Cisto dentígero.
CD-105: Glicoproteína transmembranar expressa sobre as
células endoteliais vasculares ativadas.
CEA: Antígeno carcinoembriogênico.
CEO: Carcinoma epidermóide oral.
c-erbB-1: Primeiro membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de EGFR e HER-1.
c-erbB-2: Segundo membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de HER-2.
c-erbB-3: Terceiro membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de HER-3.
c-erbB-4: Quarto membro da família erbB/HER dos receptores de
tirosona cinase. Sinônimo de HER-4.
CNS: Conselho Nacional de Saúde.
CONEP: Comissão Nacional de Ética em Pesquisa.
COO: Cisto odontogênico ortoceratinizado.
CR: Cisto radicular.
D2-40: Clone monoclonal do anticorpo anti-podoplanina.
DVL: Densidade de vasos linfáticos.
E-11: Glicoproteína do tipo mucina expressa em células
endoteliais linfáticas.
EGF: Do inglês epidermal growth factor, traduzido como fator
de crescimento epidérmico. É um fator de crescimento
que estimula o crescimento celular, proliferação e
diferenciação por se ligar ao seu receptor EGFR.
EGFR: Do inglês epidermal growth factor receptor, traduzido
como receptor do fator de crescimento epidérmico.
erbB: Familia de receptores de tirosina cinase a qual pertence
o receptor do fator de crescimento epidérmico. Sinônimo
de Família HER.
EROE: Epitélio reduzido do órgão do esmalte.
FGF: Do inglês fibroblast growth factor, traduzido como fator
de crescimento de fibroblastos.
FP: Folículo pericoronário.
GP: Granuloma periapical.
GP38: Glicoproteína do tipo mucina expressa em células
fibroblásticas reticulares de órgãos linfóides e células
epiteliais tímicas.
HE: Hematoxilina/Eosina.
HER: Familia de receptores de tirosina cinase a qual pertence
o EGFR. Sinônimo de família erbB.
HER-1: Primeiro membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de EGFR e c-erbB-1.
HER-2: Segundo membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de c-erbB-2.
HER-3: Terceiro membro da família erbB/HER dos receptores
de tirosona cinase. Sinônimo de c-erbB-3.
HER-4: Quarto membro da família erbB/HER dos receptores de
tirosona cinase. Sinônimo de c-erbB-4.
ICAM-1: Do inglês Intercellular adhesion molecule 1, traduzido
como molécula de adesão intercelular 1.
MDV: Microdensidade vascular.
MMP(s): Do inglês matrix metalloproteinasis, traduzido como
metaloproteinase(s) de matriz.
MMP-13: Do inglês matrix metalloproteinasis 13, traduzido como
metaloproteinase(s) de matriz 13.
MMP-9: Do inglês matrix metalloproteinasis 9, traduzido como
metaloproteinase(s) de matriz 9.
OE: Órgão do esmalte.
OTS-8 Glicoproteína do tipo mucina, expressa quando induzida
por molécula de osteoblastos após tratamento do éster
de forbol e Aggrus, um fator de agregação plaquetária.
p63: Grupo de aproximadamente seis proteínas que são
produzidas em um único gene, devido à utilização de
dois promotores e splicings alternativos. Membro da
família da ptoteína p53.
PA2.26: Glicoproteína do tipo mucina, que é regulada
positivamente nos queratinócitos da pele após lesão.
PCNA: Do inglês proliferating cell nuclear antigen, traduzida
como antígeno nuclear de proliferação celular.
PDGF: Do inglês platelet-derived growth factor, traduzido como
fator de crescimento derivado de plaquetas.
PDPN: Podoplanina.
Ras: Transdutor de sinal extracelular, responsável pela
transmissão de informações da membrana celular para
o núcleo.
Ras-Raf: Tipo de via de sinalização celular MAPK.
RE: Retículo estrelado.
REM: Restos epiteliais de Malassez.
RhoA GTPase: Membro da família GTPases Rho envolvida na
sinalização da proteína G.
T1a/rTI40: Marcador molecular de células epiteliais alveolares do
tipo I.
T1α-2: Antígeno expresso sobre a superfície apical das células
alveolares pulmonares do tipo I.
TGF-α: Do inglês transforming growth factor alpha, traduzido
como fator de crescimento transformante alfa.
TGF-β: Do inglês transforming growth factor beta, traduzido
como fator de crescimento transformante beta.
TOA: Tumor odontogênico adenomatóide.
TOC: Tumor odontogênico calcificante.
TOEC: Tumor odontogênico epitelial calcificante.
Tris-HCL: Do inglês Tris (hydroxymethyl) aminomethane
hydrochloride. Reagente essencial na formulação de
tampões para estabilização e eletroforese de moléculas
biológicas.
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 27
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................ 30
2.1 CISTO RADICULAR ......................................................................... 30
2.2 CISTO DENTÍGERO ........................................................................ 36
2.3 EGFR ................................................................................................ 39
2.4 PODOPLANINA ................................................................................ 45
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................. 53
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 55
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ............................................................ 55
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO .................................................. 55
4.2.1 Variáveis .......................................................................................... 55
4.3 POPULAÇÃO ................................................................................... 56
4.4 AMOSTRA ........................................................................................ 56
4.4.1 Critérios de seleção da amostra ................................................... 56
4.4.1.1 Critérios de inclusão da amostra ...................................................... 56
4.4.1.2 Critérios de exclusão da amostra ..................................................... 56
4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO .............................................................. 57
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO ...................................................... 58
4.7 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA ...................................................... 60
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................. 60
5 RESULTADOS ................................................................................. 63
5.1 RESULTADOS DO ESTUDO MORFOLÓGICO ............................... 63
5.2 RESULTADOS DO ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO ...................... 63
5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................... 72
6 DISCUSSÃO .................................................................................... 81
CONCLUSÕES ................................................................................ 92
REFERÊNCIAS ............................................................................... 94
APÊNDICES ..................................................................................... 101
ANEXO ............................................................................................. 104
25
Introdução
27
1 INTRODUÇÃO
Os cistos são cavidades patológicas revestidas por epitélio contendo em seu
interior um material líquido ou semi-líquido. São classificados em cistos
odontogênicos e não odontogênicos, sendo os odontogênicos aqueles em que os
remanescentes epiteliais da odontogênese dão origem à lesão. Os cistos
odontogênicos podem ainda ser subclassificados, de acordo com a etiologia, em
cistos de desenvolvimento e cistos inflamatórios. Os cistos de desenvolvimento
apresentam estímulo indutor desconhecido e os inflamatórios, como o próprio nome
sugere, são resultantes de um estímulo inflamatório (MORAES et al., 2013).
O cisto radicular (CR) é um cisto odontogênico inflamatório que surge a partir
de um granuloma periapical (GP) preexistente, por indução dos restos epiteliais de
Malassez (REM) (MARTINS NETO; DANESI; UNFER, 2004; SCHULZ et al., 2009).
O cisto dentígero (CD) é um cisto odontogênico de desenvolvimento que está
aderido à região cervical (junção amelo-cementária) de um dente não-erupcionado,
envolvendo sua coroa (NEVILLE et al., 2009). Ele surge pelo acúmulo de líquido
entre o epitélio reduzido do órgão do esmalte (EROE) e a coroa de um dente incluso
(XU et al., 2011), através da proliferação de remanescentes do órgão do esmalte
(OE) ou do EROE (epitélio reduzido do órgão do esmalte) (REGEZI; SCIUBBA;
JORDAN, 2008).
Apesar de os cistos odontogênicos serem considerados as lesões destrutivas
mais comuns do esqueleto facial, os mecanismos responsáveis pelo seu
crescimento ainda não são completamente esclarecidos. Acredita-se que a formação
destes está relacionada com a proliferação de restos epiteliais, que são ativados
pela liberação de citocinas e/ou fatores de crescimento, produzidos principalmente
durante processos inflamatórios (ISAAC et al., 2010; MORAES et al., 2011), sendo
seu crescimento acompanhado pela liberação de fatores de reabsorção do osso e
aumento da osmolaridade do fluido cístico (TAMGADGE et al., 2011; LIMA et al.,
2013). No processo de proliferação epitelial e crescimento cístico merece destaque o
receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e, mais recentemente,
especula-se que a podoplanina (PDPN) também possa estar envolvida.
O EGFR é uma glicoproteína transmembranar cuja ligação ao fator de
crescimento transformante alfa (TGF-α) e ao fator de crescimento epidérmico (EGF)
28
conduz a ativação de vias de transdução de sinal que estão envolvidos na regulação
e diferenciação da proliferação celular epitelial (LIN et al., 2007; OLIVEIRA et al.,
2011). A PDPN é uma glicoproteína transmembranar do tipo mucina que, embora
tenha sido considerada como um imunomarcador específico para células endoteliais
linfáticas, sua expressão também tem sido demonstrada em várias células normais,
bem como em células neoplásicas (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Especula-
se que essas duas proteínas possam estar relacionadas com lesões císticas e
neoplásicas odontogênicas, através da estimulação epitelial (LIN et.al., 2007;
ZUSTIN; SCHEUER; FRIEDRICH, 2010; OLIVEIRA et al., 2011).
Apesar de etiologias diferentes, CRs e CDs podem exibir uma faixa estreita
ou extensa de inflamação primária ou secundária, respectivamente, e é possível que
variações vistas na cápsula fibrosa destes cistos, com relação ao infiltrado
inflamatório, possam refletir diferenças na atividade de crescimento destas lesões
(MORAES et al., 2011).
Assim, estudos que auxiliem na compreensão do envolvimento do EGFR e da
PDPN no processo de crescimento e expansão das lesões císticas odontogênicas
tornam-se necessários, sobretudo em CRs e CDs, que são as mais prevalentes e
que, apesar disso, apresentam reduzido número de trabalhos publicados nesse
sentido. A técnica de imunoistoquímica tem sido muito utilizada, analisando não
somente a quantidade de células que expressam essas proteínas, mas também o
padrão da imunoexpressão, ou seja, através da análise da localização celular da
imunocoloração e das camadas epiteliais imunomarcadas. Vale pesquisar ainda se o
processo é dependente ou não da intensidade do infiltrado inflamatório.
Diante disso, o objetivo desta pesquisa foi avaliar e comparar a expressão
imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em CRs e CDs, assim como associar essa
imunoexpressão com o grau da inflamação, localização celular da imunomarcação e
camadas epitelias imunomarcadas. Pretendeu-se que os resultados contribuíssem
para o melhor entendimento da participação dessas proteínas na patogênese das
lesões císticas analisadas.
25
Revisão de Literatura
30
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CISTO RADICULAR
Cistos odontogênicos são as lesões com destruição óssea mais comuns da
região maxilofacial (SANTOS et al., 2011; MORAES et al., 2011), sendo que os CRs
constituem a maior parte destes (LATOO et al., 2009; SELVAMANI et al, 2012). O
CR também tem sido designado como cisto periodontal apical, apical ou periapical
(TOMMASI, 2002). É um cisto odontogênico inflamatório que tem como etiologia
principal a cárie dentária (SANTOS et al., 2006; REGEZI; SCIUBBA; JORDAN,
2008).
Segundo Brave et al. (2011), esses cistos podem ocorrer na região periapical
de todos os dentes, em qualquer idade, mas raramente é visto associado com a
dentição decídua. Ocorrem mais comumente entre a terceira e a quinta décadas de
vida, com maior prevalência em homens do que em mulheres, e maior frequência na
região anterior da maxila. Taylor et al. (2002) relataram que, em geral, são
assintomáticos nas etapas iniciais, a menos que sejam infectados secundariamente
ou alcancem um tamanho significativo. Gibson et al. (2002) descreveram ainda que,
nestas situações, podem ocorrer tumefação, sensibilidade, mobilidade e/ou
deslocamento dental.
Quando a cárie atinge porções mais profundas do dente ocorre um ataque
bacteriano massivo e uma resposta inflamatória intensa, estando a polpa com suas
funções vitais ameaçadas. O processo inflamatório causa elevação da pressão nos
canais radiculares que juntamente com o acúmulo de mediadores, pode causar dano
vascular, aumento da inflamação e necrose tecidual (GARCÍA et al., 2007; NEVILLE
et al., 2009).
No processo de necrose pulpar, bactérias, seus subprodutos e mediadores da
inflamação se acumulam no sistema de canais radiculares e podem se difundir além
do forame apical, produzindo lesões nos tecidos periodontais. Desta forma, mesmo
em estágios iniciais de inflamação da polpa dentária, como em resposta a uma
exposição por cárie, alterações no tecido periapical podem ser observadas como
perda da lâmina dura, desenvolvimento de uma pequena área radiotransparente
associada a um infiltrado inflamatório e aumento do número de osteoclastos. Porém,
31
lesões maiores somente ocorrem se a polpa necrosada sofrer uma invasão de
microrganismos pela câmara pulpar e ocorrer uma grande multiplicação bacteriana
(BERGENHOLTZ; BINDSLEV; REIT, 2006).
A lesão periapical representa uma resposta imune local à infecção da polpa, e
pode ser considerada uma segunda linha de defesa, que tem a finalidade de manter
a infecção dentro dos limites do sistema de canais radiculares. O processo
inflamatório periapical ocorre da mesma forma que na inflamação pulpar, com
exceção de que a destruição do osso periapical também acontece (STASHENKO;
TELES; D'SOUZA, 1998; SANTOS et al., 2011).
Dependendo dos microrganismos envolvidos e da integridade dos
mecanismos de defesa do indivíduo, este processo pode ser agudo (abscesso) ou
crônico (GP ou CR). O processo inflamatório pode se propagar para os tecidos
periapicais, onde ocorrerá uma intensa proliferação microbiana de alta
patogenicidade que, associada com uma resistência orgânica baixa, caracteriza os
quadros agudos, ou pode se apresentar sob a forma de GP ou CR, fruto de
multiplicação e proliferação microbiana de pequena intensidade, caracterizando os
processos crônicos. (AZAMBUJA; BERCINI; ALANO, 2006; GARCÍA et al., 2007).
Após a fase aguda, o processo entra em equilíbrio com a resposta do
hospedeiro, com início de um contínuo combate às bactérias invasoras e tentativas
do hospedeiro em reorganizar e reparar os tecidos danificados. Devido à constante
liberação de produtos bacterianos o reparo pode não ocorrer, iniciando um estágio
crônico da inflamação chamado de GP (BERGENHOLTZ; BINDSLEV; REIT, 2006).
O GP é uma massa de tecido de granulação localizada ao redor do ápice
radicular, formado em resposta a estímulos de baixa intensidade provenientes do
canal radicular e é considerada a periapicopatia mais comum. Após a necrose
pulpar, as toxinas se difundem ao periápice, seguindo uma resposta inflamatória
com proliferação de tecido fibroblástico e vascular, acompanhado de infiltrado
inflamatório. Há o espessamento do ligamento periodontal e o início da reabsorção
óssea com destruição da lâmina dura. Radiograficamente apresenta-se como uma
lesão radiolúcida arredondada, unilocular, sendo parecida com CR e, portanto,
torna-se difícil diferenciá-las (AZAMBUJA; BERCINI; ALANO, 2006).
Com o passar do tempo, um GP pode se transformar em um CR (SCHULZ et
al., 2009), sendo este definido como um cisto odontogênico inflamatório que está
32
aderido ao periápice de um dente com necrose pulpar (GIL; DOMINGUES, 2007).
Os dentes associados são sempre não vitais e podem mostrar descoloração, porém,
geralmente não apresentam reabsorção radicular (BRAVE et al., 2011). Diferente do
granuloma, o cisto formará uma cavidade patológica revestida por epitélio, com
exsudato inflamatório líquido ou semi-sólido em seu interior, além de produtos
necróticos (AZAMBUJA; BERCINI; ALANO, 2006).
Este epitélio que delimita a lesão cística será comumente originado pela
proliferação dos REM presentes no ligamento periodontal, que são estimulados por
citocinas e fatores de crescimento liberados durante o processo inflamatório
(BERGENHOLTZ; BINDSLEV; REIT, 2006; LIN; HUANG; ROSENBERG, 2007;
LATOO et al., 2009). Estes restos epiteliais proliferam a fim de separar o estímulo
inflamatório (polpa necrótica) do osso circundante (REGEZI; SCIUBBA; JORDAN,
2008). Segundo NEVILLE et al. (2009) podem também serem consideradas fontes
epiteliais viáveis para o desenvolvimento dos CRs: o epitélio crevicular, o
revestimento sinusal e o revestimento epitelial dos trajetos fistulosos.
A bainha epitelial de Hertwig (BEH), que é formada pela fusão dos epitélios
interno e externo do OE, tem a finalidade de estimular e guiar o desenvolvimento da
dentina radicular durante a odontogênese e, após cumprir sua função, é reabsorvida
parcialmente ficando seus remanescentes, também conhecidos como REM,
localizados ao longo do ligamento periodontal (LIN et al., 2007; GIL; DOMINGUES,
2007). Com a formação dos GPs, os REM podem ser englobados, sendo estes
encontrados em aproximadamente metade dos casos. (BERGENHOLTZ;
BINDSLEV; REIT, 2006).
O processo de desenvolvimento dos cistos pode ser dividido em três fases:
iniciação, formação e expansão. Na fase de iniciação, os restos celulares epiteliais
odontogênicos proliferam devido à inflamação resultante dos restos necróticos e
antígenos bacterianos derivados da polpa necrosada, estabelecendo uma
verdadeira rede epitelial no interior do granuloma apical. Na de formação, o epitélio
odontogênico proliferativo reveste a cavidade patológica do cisto. A de expansão
compreende a fase de crescimento cístico, em torno de 5 mm de diâmetro por ano,
tendendo à expandir progressivamente e crescer consideravelmente se não tratados
(GARCÍA et al., 2007; LATOO et al., 2009; SHEAR; SPEIGHT, 2011).
33
São conhecidas duas teorias para a fase de formação cística, sendo ambas
possíveis e, às vezes, independentes. Uma propõe que o epitélio prolifera e recobre
a superfície exposta do tecido conjuntivo de um abscesso ou a cavidade pode
ocorrer em função da fragmentação do tecido conjuntivo pela atividade enzimática
proteolítica. A outra, e mais provável, sugere que uma cavidade cística se forma
dentro de uma massa epitelial proliferativa em um GP pela degeneração e morte das
células centrais. A morte das células centrais não ocorre pela falta de suprimento
sanguíneo, mas sim através de reações imunológicas, sendo que as colagenases do
tipo metaloproteinases de matriz (MMPs), que são produzidas por células epiteliais,
fibroblastos e plasmócitos, podem estar envolvidas na degradação da matriz. A
MMP-13 pode ter um papel importante na patogênese dos cistos, facilitando a
proliferação das células epiteliais e a invasão do tecido de granulação (LIN et al.,
2007; LATOO et al., 2009; SHEAR; SPEIGHT, 2011).
Na fase de expansão, ocorre um aumento da pressão hidrostática ou
osmótica no interior da lesão e o cisto cresce e se expande por pressão (LATOO et
al., 2009). Assim, à medida que o cisto se expande, a pressão osmótica passa a ter
um papel menor e a proliferação celular se torna mais importante. A proliferação
celular continua, desde que exista um estímulo inflamatório. Quando o estímulo
para, a proliferação epitelial cessa. Assim, um aumento posterior de material líquido
ou semilíquido no interior da cavidade cística provavelmente leva à atrofia do
revestimento epitelial. O crescimento do cisto pode também ser acompanhado pela
reabsorção óssea e degradação dos tecidos conjuntivos adjacentes (SHEAR;
SPEIGHT, 2011).
Radiograficamente, aparecem como radiotransparências apicais regulares,
circunscritas por uma linha radiopaca bem definida, com perda da lâmina dura na
região, podendo, às vezes, ocorrer reabsorção radicular. Para estabelecer o
diagnóstico definitivo é necessário, além de dos testes de vitalidade pulpar, realizar
a biópsia excisional, que pode ser precedida de punção aspirativa (RIBEIRO JR et
al., 2004).
Macroscopicamente, podem apresentar geralmente entre 1-1,5 cm de
diâmetro, atingindo até 3 cm. As paredes podem ser delgadas ou terem até 5 mm de
espessura. A superfície interna pode ser uniforme ou corrugada e apresentarem
cristais de colesterol swe projetando para a cavidade. O fluido geralmente é marrom,
34
proveniente de componentes do sangue como a hemossiderina, e quando os cristais
de colesterol estão presentes dão uma coloração amarelada ou palha brilhante ao
fluido (SHEAR; SPEIGHT, 2011; BRAVE et al., 2011).
Microscopicamente, esses cistos exibem uma cavidade patológica revestida
total ou parcialmente por epitélio pavimentoso estratificado não ceratinizado,
apresentando, com certa frequência, espongiose, exocitose e/ou hiperplasia
(GARCÍA et al., 2007; NEVILLE et al., 2009; SANTOS et al., 2011). A natureza do
revestimento epitelial depende da fase de desenvolvimento do cisto e da intensidade
da inflamação. A espessura deste revestimento varia de 1 a 50 camadas celulares,
porém a maioria apresenta de 6 a 20 camadas de células. Nos cistos iniciais, o
revestimento epitelial pode ser proliferativo e exibir projeções arciformes, com um
processo inflamatório intenso associado, composto predominantemente de
neutrófilos. Porém, à medida que o cisto se expande, o revestimento epitelial se
torna regular com certo grau de diferenciação. Mudanças metaplásicas, na forma de
células mucosas ou ciliadas, são vistas com frequência no revestimento epitelial
(GARCÍA et al., 2007; SHEAR; SPEIGHT, 2011; BRAVE et al., 2011; SANTOS et al.,
2011).
Ocasionalmente, o revestimento epitelial apresenta calcificações lineares ou
em forma de arco, conhecidas como corpúsculo de Rushton, assim como cristais de
colesterol (GARCÍA et al., 2007; NEVILLE et al., 2009; SHEAR; SPEIGHT, 2011;
SANTOS et al., 2011). O lúmem cístico é constituído por material amorfo eosinofílico
com alto teor protéico, grande número de cristais de colesterol e células epiteliais
descamadas. Colônias bacterianas podem fazer parte do conteúdo cístico ou
apenas serem detectadas na superfície apical do dente afetado (LEONARDO,
1998).
O tecido conjuntivo da parede do CR é formado por feixes de fibras
colágenas, fibroblastos e pequenos vasos sanguíneos em número variável
(MARTINS NETO; DANESI; UNFER, 2004). Esta cápsula consiste em tecido
conjuntivo fibroso denso, muitas vezes com infiltrado inflamatório contendo linfócitos
variáveis, mesclados com neutrófilos, plasmócitos, histiócitos e, raramente,
mastócitos e eosinófilos. Ocasionalmente, a cápsula apresenta granulomas hialinos
dispersos. Estas estruturas surgem como pequenas poças de material eosinofílico
35
que exibe uma periferia ondulada de colágeno condensada, quase sempre por
linfócitos e células gigantes multinucleadas (NEVILLE et al., 2009).
Henriques et al. (2013) estudaram a frequência de granulomas hialinos e a
natureza dessas estruturas em uma série de 661 casos de cistos odontogênicos
inflamatórios. Destes, 594 eram CR, 49 CRs residuais (CRRs) e 18 cistos
paradentários. Os resultados mostraram que, do total, vinte e dois casos (3,3%)
apresentaram granulomas hialinos. A freqüência relativa dessas estruturas foi maior
entre os CRRs (6,1%), seguido por cistos paradentários (5,6%) e CRs (3,0%). Em 14
casos (63,6%) essses granulomas se mostravam como massas
homogêneas/fibrilares circulares, e em 3 (13,6%), apresentavam-se como estruturas
redondas com material amorfo. Concluíram, então, que uma baixa freqüência de
granulomas hialinos é encontrada em cistos odontogênicos inflamatórios e
sugeriram a hipótese de que estas estruturas surgem a partir da implantação de
material estranho, partículas de alimentos provavelmente de origem vegetal.
Diversas características microscópicas possivelmente representam diferentes
estágios de desenvolvimento dessas estruturas.
Na parede fibrosa dos cistos de formação recente podem ser encontradas
áreas típicas de GP antecedente, e suas variáveis morfológicas. Já nos cistos
maiores e mais persistentes, a parede cística encontra-se fibrosa, densa e
colagenizada com graus variáveis de infiltração leucocitária, predominantemente
mononuclear. Ainda na parede cística, calcificações distróficas e focos eventuais de
exsudato purulento associados com focos de infiltrado neutrofílico são, por vezes,
encontrados (LEONARDO, 1998).
Calcificações distróficas, cristais de colesterol com células gigantes
multinucleadas, hemácias e áreas de pigmentação por hemossiderina estão
presentes, por vezes, no lúmem, na cápsula ou em ambos (NEVILLE et al., 2009).
Remanescentes epiteliais odontogênicos também são encontrados na cápsula.
(SHEAR; SPEIGHT, 2011).
O tratamento indicado para lesões endodônticas, com ou sem envolvimento
do periápice tem sido o tratamento de canais radiculares. Quando apenas este não
consegue restabelecer a integridade dos tecidos periapicais, é necessário a
realização de cirurgias apicais (RIBEIRO JR et al., 2004; AZAMBUJA; BERCINI;
ALANO, 2006; BRAVE et al., 2011). Quando o dente envolvido com a formação do
36
CR é removido sem que o tratamento tenha sido instituído, o cisto permanecerá no
local recebendo a denominação de CRR, que poderá regredir, estabilizar, ou
aumentar de tamanho ao longo dos anos (NONAKA et al., 2008; JAMDADE et al.,
2012), sendo seu diagnóstico estabelecido com a junção das características
radiográficas e histopatológicas (BOFFANO; GALLESIO, 2010).
2.2 CISTO DENTÍGERO
O CD, também chamado de cisto folicular, é um cisto odontogênico de
desenvolvimento, originado através do acúmulo de fluido entre o remanescente do
OE e a coroa dentária subjacente de um dente não irrompido, causando expansão
de seu folículo, permanecendo preso à região cervical (junção cemento-esmalte)
(GIL e DOMINGUES, 2007; SHEAR e SPEIGHT, 2011; DANTAS et al., 2012). É o
segundo tipo mais comum dos cistos odontogênicos e o mais comum entre os cistos
de desenvolvimento dos maxilares (SELVAMANI et al, 2012).
São geralmente presentes na segunda ou terceira décadas de vida (RAVI et
al., 2012), e em indivíduos do sexo masculino (AVELAR et al., 2009). Ocorrem, com
maior frequência, em associação com terceiros molares inferiores e caninos
superiores, pois estes são os dentes que se apresentam mais comumente
impactados (XU et al., 2011; LIMA et al., 2013). Trata-se de uma lesão cística
comum, solitária e assintomática (COSTA et al., 2011), porém, múltiplos cistos
podem ocorrer em associação com síndromes como a Síndrome de Gardner,
Síndrome de Maroteaux-Lamy, Mucopolissacaridose, Síndrome do nevo basocelular
(RAVI et al., 2012). Geralmente, apresentam pequenas dimensões, mas, em alguns
casos, atingem tamanhos consideráveis causando expansão óssea e assimetria
facial. A estimativa de tamanho desta lesão é muito variável, podendo ser
confundida com um folículo pericoronário (FP) (CARVALHO et al., 2011).
A presença deste cisto impede a erupção do dente a ele vinculado, porém
raramente aparecem na dentição decídua. São rotineiramente diagnosticados
através de radiografias panorâmicas ou periapicais de rotina e radiograficamente
constitui-se de uma área radiolúcida associada a um dente não irrompido ou retido,
circundado por uma linha esclerótica (MARZOLA; PEREIRA; TOLEDO FILHO, 2007;
DANTAS et al., 2012). O tratamento da lesão é realizado através de intervenção
37
cirúrgica com remoção completa da lesão, precedida por punção aspirativa e biópsia
incisional. O índice de recidiva é baixo e possui um prognóstico favorável (VAZ;
RODRIGUES; JUNIOR, 2010).
A histogênese exata não é conhecida, porém o fator chave parece ser o
acúmulo de fluido entre o EROE e o esmalte ou no OE, entre suas camadas. Esse
acúmulo ocorre como resultado da pressão exercida no folículo, pela tentativa de
erupção de um dente incluso, que obstrui o fluxo venoso e, assim, induz a rápida
transudação de soro através das paredes capilares. Por outro lado, acredita-se que
a origem provável deste cisto possa ser a destruição de células em proliferação do
FP, após a interrupção da erupção. Esta destruição celular resulta no aumento da
tensão osmótica e, portanto, na formação do cisto (BENN; ALTINI, 1996;
TAMGADGE et al., 2011).
Afirma-se ainda que se desenvolva a partir da proliferação de remanescentes
do OE ou do EROE após a formação completa ou parcial da coroa dental, em uma
fase em que o retículo estrelado (RE) deveria ser reabsorvido biologicamente e, não
o sendo, permanece como elemento responsável pelo desencadeamento cístico, e
seu crescimento está relacionado tanto com a proliferação epitelial, como por fatores
de reabsorção do osso e aumento da osmolaridade do fluido cístico (MARZOLA,
2005; XU et al., 2011; DANTAS et al., 2012; LIMA et al, 2013).
O EROE é formado por uma camada interna e uma externa. A interna
consiste na camada onde os ameloblastos transformam-se e ficam firmemente
aderidos à superfície do esmalte. A camada externa consiste de células mais
achatadas, a remanescente de todas as camadas do órgão do esmalte. No
desenvolvimento do CD, há acúmulo de líquido entre o EROE e o esmalte do dente,
ou entre as camadas do EROE, líquido este proveniente do espaço intersticial. À
medida que o cisto cresce, células epiteliais são descamadas para o interior do
lúmem aumentando assim o conteúdo proteico do líquido cístico, atraindo mais
líquido do conjuntivo para a cavidade cística (GIL; DOMINGUES, 2007).
Dependendo do estado de involução do RE, o CD apresenta os subtipos:
Central, aderido à coroa dental; Lateral, aderido à face mesial, distal, lingual ou
vestibular; Extrafolicular, no qual o retículo se solta da coroa dental, individualizando-
se, sendo central quando superficializa a coroa; lateral, já que se desprende para os
lados (MARZOLA, 2005).
38
Quando esta lesão é removida cirurgicamente e enviada para análise
histopatológica evidencia-se aspectos diferentes caso o cisto esteja inflamado ou
não (NEVILLE et al., 2009). No CD não inflamado é observada parede cística fibrosa
delgada que, sendo derivada do FP, consiste em fibroblastos jovens amplamente
separados pelo estroma e uma substância fundamental rica em
mucopolissacarídeos ácidos (SHEAR; SPEIGHT, 2011). A cápsula de tecido
conjuntivo fibroso é arranjada frouxamente e a substância fundamental contém
quantidade considerável de glicosaminoglicanas. Pequenas ilhas ou cordões de
restos de epitélio odontogênico aparentemente inativo podem estar presentes na
cápsula. O revestimento epitelial, que na verdade é o EROE, consiste de duas a
quatro camadas de células achatadas não ceratinizadas, e a interface entre epitélio
e tecido conjuntivo é plana (SHEAR; SPEIGHT, 2011; RAVI et al., 2012).
Em um CD inflamado, a cápsula fibrosa é mais colagenizada e o infiltrado
crônico de células inflamatórias é variável. O limitante epitelial mostra quantidade
variável de hiperplasia com desenvolvimento de projeções epiteliais e aspecto
escamoso mais definido (NEVILLE et al., 2009). Células mucosas ocasionalmente
são evidenciadas no limitante epitelial e raramente são encontrados na cápsula
células colunares ciliadas e pequenos conglomerados de células sebáceas
(NEVILLE et al., 2009; SHEAR; SPEIGHT, 2011).
Godoy, em 2001, desenvolveu um estudo que teve como objetivo realizar
uma análise clinicopatológica de 108 casos de CDs previamente diagnosticados.
Pretendeu-se correlacionar os achados histomorfológicos e os dados
epidemiológicos, que constavam nas fichas de solicitação de exame histopatológico,
no intuito de caracterizar uma possível variante da lesão, denominada CD de origem
inflamatória. A análise histomorfológica revelou que as lesões exibiram, em sua
maioria, um limitante epitelial delgado, com uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso
ricamente vascularizado, colageinizado e com uma relativa predominância de um
intenso infiltrado inflamatório mononuclear. A correlação clinicopatológica mostrou
que 11 dos 12 casos de cistos que apresentaram um limitante epitelial espesso, com
alto grau de vascularização e colageinização, e intenso infiltrado inflamatório na
cápsula cística estiveram localizados na região de pré-molares, em pacientes abaixo
de 12 anos de idade e que, em sua maioria, apresentaram sintomatologia dolorosa,
características compatíveis com o CD inflamatório. Concluiu-se, frente a esses
39
resultados, que esta lesão, é passível de ser considerada uma variante do CD,
levando a sugerir a denominação de “cisto folicular inflamatório” para esta entidade.
2.3 EGFR
O EGFR é uma glicoproteína transmembranar que constitui um dos quatro
membros da família erbB de receptores da tirosina cinase. A ligação do EGFR aos
seus ligantes leva à auto fosforilação do receptor de tirosina cinase e ativação
subsequente de vias de transdução de sinal que estão envolvidos na regulação da
proliferação e diferenciação celular epitelial. A família do EGFR inclui quatro
receptores: o receptor do fator de crescimento epidérmico 1 (EGFR, c-erbB-1, HER-
1), c-erbB-2 (HER-2), c-erbB-3 (HER- 3) e c-erbB-4 (HER-4). EGFR foi o primeiro
membro deste grupo a ser descrito. É uma glicoproteína com 170-kd, e consiste de
um receptor com um domínio extracelular, uma região transmembranar, e um
domínio intracelular com função de tirosina cinase (HERBST, 2004; PAYERAS et al.,
2007; BERNARDES et al., 2010; MICHIKAWA et al., 2011).
Vários ligantes podem ativar o EGFR, incluindo o EGF, TGF-α, anfiregulina,
EGF de ligação à heparina e betacelulina, sendo o EGF e o TGF-α considerados os
mais importantes. Esta ligação ocasiona a homo ou heterodimerização do receptor
na superfície da célula, seguida pela internalização do receptor dimerizado. Após
estas etapas, ocorre a autofosforilação dos domínios de tirosina cinase na região
intracitoplasmática. Resíduos de tirosina cinase fosforilados servem como locais de
ligação para o recrutamento de transdutores e ativadores de sinalização intracelular
tais como o Ras, que em seguida estimulam uma cascata de transdução de sinal
intracelular. O Ras-Raf, ativado pela proteína cinase, e o fosfatidil-inositol 3 cinase e
Akt, são as duas principais rotas de sinalização para a família HER, onde o EGFR
também está incluído. Estas vias regulam múltiplos processos biológicos de
proliferação celular, angiogênese e inibição da apoptose (JORISSEN et al., 2003;
HERBST, 2004).
Todas as células epiteliais normais requerem estimulação com base em sinais
para se submeterem ao crescimento, diferenciação e proliferação, muitos dos quais
realizados por fatores de crescimento. O EGFR desempenha, portanto, um papel
40
importante na diferenciação e morfogênese de diversos órgãos e na proliferação e
sobrevivência de células em mamíferos (SARKIS et al., 2010).
Embora esteja presente em células normais, o EGFR tem sua expressão
elevada na maioria dos tumores sólidos incluindo o câncer de mama, câncer de
cabeça e pescoço, câncer oral, carcinoma de células não pequenas de pulmão,
câncer renal, câncer de ovário e câncer de cólon. Nas células normais, sua
expressão varia de 40.000 a 100.000 receptores por célula. Alguns cânceres de
mama, por exemplo, podem expressar até 2 x 106 moléculas do EGFR por célula.
Essa superexpressão produz intenso sinal de ativação de vias de sinalização,
resultando em células que têm um crescimento mais agressivo, características de
invasão, e associação com prognóstico pobre e menor sobrevida. Também
desempenha um papel na resistência à quimioterapia e tratamento de radiação em
células tumorais (HERBST, 2004; HIRAISHI et al., 2006; LEE et al., 2010).
Além de estudos que avaliaram a expressão do EGFR em tumores malignos,
autores direcionaram suas pesquisas na avaliação da expressão deste receptor em
lesões odontogênicas, visto que sua expressão tem sido observada no epitélio de
mucosa oral normal, gengiva saudável e inflamada, lesões inflamatórias periapicais,
tecidos envolvidos com o desenvolvimento dentário e em FP, analisando
remanescentes do epitélio odontogênico (WANG et al., 1990; NORDLUND et al.,
1991; COBO et al., 1992; LIN et al., 1996; BAUMGART, 2003).
Wang et al. (1990) estudaram a presença do EGFR, através de “western blot”,
em 12 espécimes de mucosa oral normal obtidas de indivíduos saudáveis. Foi
descrita uma proteína com uma banda principal de 160K e uma banda menor de
170K, características estas partilhadas com os receptores do EGF em outros
tecidos. Este estudo foi o primeiro a demonstrar a presença do receptor do EGF em
mucosa oral humana.
Nordlund et al. (1991) examinaram espécimes gengivais de indivíduos adultod
periodontalmente saudáveis, com periodontite, pacientes diagnosticados com
periodontite juvenil (atualmente denominada periodontite agressiva), e em REM,
obtidos do ligamento periodontal de um terceiro molar mandibular e um pré-molar,
que foram removidos por causa de cáries e motivos ortodônticos, respectivamente.
Além disso, foram detectados restos celulares a partir de uma biópsia de gengiva
saudável. Utilizaram um anticorpo monoclonal dirigido contra o receptor do EGF
41
através da técnica de imunoistoquímica. Os receptores foram expressos em níveis
elevados na superfície de células da camada basal do epitélio gengival. No epitélio
juncional normal, por outro lado, a imunomarcação foi fraca ou negativa, indicando
que os receptores são mal expressos ou ausentes nestas células. Não foram
detectadas diferenças entre espécimes gengivais não inflamados de indivíduos
adultos saudáveis e de pacientes com periodontite juvenil. Em biópsias de tecido
gengival inflamado de pacientes adultos com periodontite, foi observada uma
marcação intensa na superfície celular de células epiteliais em proliferação. Células
epiteliais dos restos de Malassez ligaram-se intensamente ao anticorpo. Os
resultados sugerem que o EGF está envolvido no controle do crescimento e
diferenciação do epitélio em tecidos periodontais.
A expressão do EGF e seu receptor (EGFR) no desenvolvimento de dentes
foram estudados por imunoistoquímica em embriões de rato (E-16 e E-21).
Imunocoloração muito fraca foi observada nas células germinativas odontogênicas
durante o estágio de broto, capuz e sino, bem como em algumas células
ectomesenquimais. Em dentes desenvolvidos, mas que não erupcionaram, uma
imunoreatividade moderada para EGF e EGFR estava presente nos odontoblastos,
ameloblastos, e células do epitélio interno do órgão do esmalte, contudo, foi mais
forte na dentina (COBO et al., 1992).
Shrestha et al. (1992) analisaram a imunoexpressão do EGFR em células
epiteliais de 67 casos de cistos odontogênicos e 35 casos de tumores
odontogênicos, utilizando anticorpo monoclonal para este receptor. As lesões
císticas incluíam ceratocistos odontogênicos (atualmente denominado de tumor
odontogênico ceratocístico-20 casos), cisto primordial (8 casos), CRs (20 casos) e
em CDs (19 casos). Os tumores eram constituídos por ameloblastomas (21 casos),
ameloblastoma de células granulares (4 casos), cisto odontogênico calcificante
(TOC-4 casos), tumor odontogênico adenomatóide (TOA-4 casos), tumor
odontogênico escamoso (2 casos) e fibroma ameloblástico (2 casos). Destes,
ceratocisto e cisto primordial apresentaram 75% dos casos com imunopositividade
para esse receptor. O CR apresentou imunopositividade em 35% dos casos, e o CD
em 47,4% dos casos. Em todos os casos positivos a imunomarcação era apenas
membranar. Imunomarcação negativa do EGFR foi um achado característico nos
tumores odontogênicos de origem epitelial. Sugeriram então, que os cistos
42
odontogênicos, ao contrário dos tumores odontogênicos, são capazes de
proliferação mediada por esse receptor.
Li et al. (1993) analisaram a imunoexpressão do EGFR em ceratocistos
odontogênicos (13 casos), CDs (11 casos), CRs (11 casos), ameloblastomas (6
casos) e em GPs (7 casos). Os resultados mostraram que o revestimento epitelial de
ceratocistos odontogênicos e de CDs geralmente expressavam níveis mais elevados
de imunomarcação para o EGFR do que no revestimento de CRs (derivados dos
REM). A menor imunomarcação do EGFR em CRs coincidia com a presença de
alterações degenerativas no interior do epitélio associadas com infiltrados de células
inflamatórias no local. Esta associação de reduzida expressão do EGFR e
inflamação também foi detectada no revestimento de ceratocistos odontogênicos
(derivados dos remanescentes da lâmina dental). Em qualquer caso, a maior
expressão do EGFR nos cistos de desenvolvimento contra cistos inflamatórios
apoiam a idéia de que diferentes mecanismos de iniciação e controle de proliferação
de células epiteliais estão envolvidos em suas formações. O nível de expressão
desse receptor parece estar relacionado com a presença de inflamação no interior
do tecido conjuntivo adjacente em vez da proliferação de células epiteliais.
No estudo de Lin et al. (1996) foram examinados, através da imunoexpressão
do EGFR, 15 lesões inflamatórias periapicais (10 GPs e 5 CRs), obtidos a partir de
cirurgias periapicais, e 6 lesões periapicais adicionais (4 GPs e 2 CRs) coletados de
dentes extraídos. Os resultados indicaram que os GPs apresentaram uma fraca
imunocoloração ou baixa ligação específica. Em contraste, os CRs exibiram uma
forte imunocoloração em células epiteliais e elevada ligação específica.
A imunoexpressão do EGFR foi investigada no trabalho de Bastawisy e
Nouaem (2000) no revestimento epitelial de 20 cistos odontogênicos (CRs, CDs,
ceratocistos, cistos odontogênicos calcificantes) e 17 tumores odontogênicos
(ameloblastomas), utilizando anticorpo monoclonal dirigido contra esse receptor. Os
resultados revelaram que houve expressão mais elevada desse receptor em
ceratocistos, seguidos por cisto odontogênico calcificante e em menor quantidade
nos CRs. Alguns casos de tumores odontogênicos mostraram expressão do EGFR
que parecia estar relacionada à ceratinização. A ausência de sua expressão, em
alguns cistos e tumores, indica que o crescimento nestes é EGF independentes, ou
seja, não necessitam deste fator de crescimento para crescerem.
43
Todos os receptores, incluindo os da família erbB, são sintetizados e
encaminhados para a sua localização celular específica, mesmo na ausência do
ligante. No entanto, diferentes localizações do EGFR podem ser observadas, de
acordo com o tipo celular específico e o anticorpo utilizado (WILEY, 2003). A
importância potencial dos efeitos do EGF e, por conseguinte, a distribuição e
expressão do seu receptor, em processos de desenvolvimento normais e
patológicos, têm estimulado muitos estudos sobre a localização imunoistoquímica do
EGFR e sua expressão diferencial (LI et., 1993).
Baumgart et al. (2007) investigaram a distribuição imunoistoquímica do EGFR
em FPs como um preditor de progressão para cistos e tumores odontogênicos.
Foram analisados os padrões de coloração no EROE e em ninhos de epitélio
odontogênico associado com folículos de molares impactados. O padrão de
coloração de 20 espécimes de FPs foi comparado com o de 16 amostras de mucosa
oral normal e amostras de carcinomas epidermóides orais (CEOs). Os resultados
mostraram que colorações citoplasmáticas e membranares foram observadas na
mucosa oral normal, principalmente nas camadas proliferativas (basal e suprabasal),
diminuindo de intensidade em direção à superfície. Os padrões de coloração
observados no EROE foram citoplasmáticos apenas e combinados, resultado que é
semelhante aos resultados da mucosa oral normal. Marcação do EGFR apenas na
membrana pode ser um indicador de potencial aumentado para ninhos epiteliais de
se tornarem cistos ou tumores odontogênicos.
Vicente et al. (2010) compararam o padrão de imunoexpressão do EGFR,
ciclina D1, Ki-67, p-53 e antígeno carcinoembrionário (CEA) no revestimento epitelial
de 11 ceratocistos odontogênicos, 10 CDs, 10 CRs e 10 ameloblastomas. A
expressão do EGFR foi positiva em 100% dos ameloblastomas, 73% dos
ceratocistos, 40% dos CDs e em 30% dos CRs. Em 9 casos de ameloblastomas a
imunomarcação do EGFR era difusa, enquanto em 1 caso, a reação era focal. Em
ceratocistos, o EGFR foi localizado na camada de células basais, e foi focal em 8 e
difusa em nenhum caso. Em todos os casos de CDs e CRs positivos, a
imunocoloração foi focal. Em todos os casos positivos a localização celular do EGFR
foi membranar. Algumas destas descobertas podem apoiar a teoria de que
ceratocistos odontogênicos são de origem neoplásica, mas outros resultados apoiam
44
claramente que estas lesões são cistos de desenvolvimento com algumas
propriedades neoplásicas por causa do elevado potencial de crescimento intrínseco.
Oliveira et al. (2011) realizaram um estudo para avaliar o perfil de
imunomarcação do EGFR, Ki-67 e survivina em tumores odontogênicos
ceratocísticos (TOC-13 casos), CDs (14 casos) e em FPs (9 casos). A
imunomarcação foi analisada nas camadas basal e suprabasal de TOCs e CDs, e
em FPs, nas ilhas de epitélio odontogênico e/ou no EROE. Ceratocistos
apresentaram a maior taxa de proliferação entre os três grupos, principalmente na
camada suprabasal. Imunomarcação para EGFR foi observada principalmente no
citoplasma nas camadas basal e suprabasal de ceratocistos e na camada
suprabasal de CDs. Imunomarcação tanto membranar e citoplasmática foi maior em
PFs, sendo que nestes a coloração apenas membranar também foi obsevada. Em
CDs, a camada basal parecia proliferar em resposta ao estímulo. Embora FPs
mostrassem baixa atividade proliferativa, a expressão do EGFR indica que algumas
células apresentam uma elevada capacidade de resposta a estímulos, que
provavelmente poderia explicar a origem de lesões odontogênicas.
O objetivo do estudo de Gonçalves et al. (2012) foi avaliar a expressão
imunistoquímica da proteína p63, EGFR e Notch-1 no revestimento epitelial de CRs
(35 casos), CDs (22 casos) e em TOCs (17 casos). Quase todos os casos
demonstraram expressão de p63, EGFR e Notch-1. Para os CRs, a reação
inflamatória crônica na cápsula fibrosa não influenciou a expressão do EGFR no
revestimento epitelial. Não houve diferença estatística significativa entre quantidade
da expressão e a intensidade da expressão do EGFR entre as lesões. Em CRs e
CDs, para o EGFR, foi observada correlação positiva entre a quantidade da
expressão e intensidade de coloração. Os autores sugeriram que o epitélio das
lesões císticas é capaz de proliferar, sendo esta mediada pelo EGFR e que este é
um fator importante para a manutenção do revestimento epitelial cístico, onde a
maioria dos casos analisados para o EGFR mostrou padrão de coloração
membranar e citoplasmática. Foi observada correlação positiva entre os
imunomarcadores. Estes resultados sugerem a participação de p63, EGFR e Notch -
1 no desenvolvimento, manutenção e integridade dos cistos epiteliais odontogênicos
favorecendo a persistência da lesão.
45
Ressalta-se, portanto, que a distribuição do EGFR na membrana celular e/ou
citoplasma indica a forma como as células irão responder a um estímulo de
proliferação. Se este receptor estiver restrito à membrana da célula, a resposta de
proliferação na presença do ligante circulante será rápida. Se o EGFR estiver
internalizado no citoplasma, a resposta de proliferação será mais lenta. Se for
observada sua presença tanto na membrana quanto no citoplasma, tem sido
sugerido que a capacidade das células para responder a um estímulo de
proliferação é semelhante a uma resposta do tipo fisiológica (BAUMGART et al.,
2007; OLIVEIRA et al., 2011).
2.4 PODOPLANINA
A PDPN é uma glicoproteína transmembranar do tipo mucina expressa em
podócitos renais humanos e é homóloga à T1α-2, um antígeno expresso sobre a
superfície apical de células alveolares pulmonares do tipo I (ZUSTIN; SCHEUER;
FRIEDRICH, 2010; FRIEDRICH; SCHEUER; ZUSTIN, 2012). Ela tem homólogos em
humanos, camundongos, ratos, cães e hamsters e é relativamente bem conservada
entre as espécies. Apresenta uma ampla variedade de funções, incluindo a
regulação do desenvolvimento dos órgãos, motilidade celular, tumorigênese e
metástases (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Desde que o anticorpo
monoclonal D2-40, que é anti-PDPN, tornou-se conhecido por identificar
especificamente células endoteliais linfáticas, tem sido considerada como um
marcador imunistoquímico importante para linfangiogênese (ZUSTIN; SCHEUER;
FRIEDRICH, 2010; KREPPEL et al., 2010; OKAMOTO et al., 2010; CAETANO et al.,
2012; TSUNEKI et al., 2012; TJIOE et al., 2012).
Foi identificada e estudada em diferentes contextos, por isso é conhecida por
vários nomes. A primeira descrição foi em células endoteliais linfáticas como E11 e
sobre as células fibroblásticas reticulares de órgãos linfóides e como GP38 em
células epiteliais tímicas como. É homóloga a T1a/rTI40, um dos primeiros
marcadores moleculares de células epiteliais alveolares do tipo I; PA2.26, que é
regulada positivamente nos queratinócitos da pele após lesão; OTS-8, uma molécula
induzida em osteoblastos mediante tratamento com éster de forbol; e Aggrus, um
fator de agregação plaquetária. Finalmente, a esta molécula foi dado o nome de
46
PDPN devido à sua expressão em podócitos renais e possível envolvimento no
achatamento dos processos podálicos (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012).
Embora a proteína tenha sido considerada como um marcador específico
para células endoteliais linfáticas, sua expressão tem sido demonstrada também em
várias células normais, bem como em células neoplásicas. No geral, é crucial para o
desenvolvimento de múltiplos órgãos, incluindo o sistema linfático, pulmões e
coração (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Em células e tecidos humanos
normais, além do endotélio linfático, sua expressão tem sido detectada em células
epiteliais basais da pele, no colo do útero, no esôfago, em células mesoteliais
peritoneais, osteócitos, células ependimais, células estromais, células reticulares,
células dendríticas foliculares de órgãos linfóides (OKAMOTO et. al., 2010), além de
podócitos, células alveolares tipo I, células mioepiteliais, células das glândulas
mamárias, glandulares salivares, assim como em miofibroblastos da próstata,
condrócitos, epêndima, plexo coróide e epitélio subependimário (ZUSTIN;
SCHEUER; FRIEDRICH, 2010).
A PDPN foi mais estudada no câncer devido sua atuação na linfangiogênese,
sendo sua imunoexpressão aumentada muitas vezes correlacionada com
prognóstico desfavorável. Em pessoas com câncer, o número de vasos tumorais
positivos para esta proteína é frequentemente utilizado como marcador de
diagnóstico (ASTARITA; ACTON; TURLEY, 2012). Sua expressão também foi
observada em células tumorais de diferentes neoplasias, incluindo o CEO, de
pulmão, de pele, de células granulares e mesotelioma, bem como o condrossarcoma
de baixo grau. Além disso, tem sido implicada no processo de progressão do câncer
oral (ZUSTIN; SCHEUER; FRIEDRICH, 2010).
É sabido que a expressão da PDPN acelera a motilidade celular in vitro e
induz a invasão e metástase de células tumorais malignas. Além disso, sua
superexpressão promove a formação de células alongadas e extensões
citoplasmáticas, aumentando a adesão e migração celular, sugerindo um papel para
essa proteína na reorganização do citoesqueleto. Tem sido demonstrado que o
rearranjo do citoesqueleto de actina ocorre através da ativação de RhoA GTPase
para fosforilar ezrina, que promove a transição epitélio-mesênquima facilitando a
migração celular e metástase (CAETANO et al., 2012; SAWA, 2010; MIYAZAKI et
al., 2009).
47
Kreppel et al. (2010) investigaram a influência da imunoexpressão da PDPN
em células epiteliais tumorais de CEOs (80 casos). Tentaram correlacionar a
imunoexpressão dessa proteína com o prognóstico e disseminação metastática via
linfática. Em 67 casos (84%) a PDPN foi expressa nas células tumorais e 19 casos
(24%) apresentaram altos níveis de expressão. A sobrevida global em 5 anos para
os pacientes com altos níveis de expressão dessa proteína foi significativamente
inferior (31%), do que para os pacientes com baixa e moderada expressão (93% e
65%, respectivamente). Houve associação entre a expressão da PDPN e a
freqüência de metástases em linfonodos cervicais. Metástases em linfonodos
cervicais foram encontradas em 79% da pacientes com alta expressão da proteína,
enquanto pacientes com baixa expressão apresentaram metástases em apenas
22%. Nenhum dos 13 casos com ausência de imunoexpressão apresentou
metástase em linfonodos cervicais. Concluíram que a PDPN é expressa
freqüentemente em CEO, e sua expressão elevada está correlaciona com
metástases linfáticas cervicais e com piores prognósticos.
O estudo de Sousa et al. (2012) teve a finalidade de avaliar a densidade de
vasos linfáticos (DVL) e a microdensidade vascular (MDV) em CEOs, por meio dos
anticorpos D2-40 e CD105, respectivamente. A análise foi realizada em áreas
intratumorais e peritumorais do tumor primário, e em linfonodos normais e
metastáticos. A maioria dos casos com envolvimento nodal apresentou alta DVL
peritumoral. A MDV foi estatisticamente associada à metástase. LVD e MVD foram
maiores nos linfonodos metastáticos do que em linfonodos não metastáticos. Assim,
um elevado número de vasos linfáticos em tumores pôde indicar a ocorrência de
linfangiogênese em CEO neste estudo. Os vasos linfáticos e microvasos parecem
regular a propagação e progressão do câncer.
Inoue et al. (2012) analisaram a importância da expressão da PDPN em
células epiteliais de 103 lesões orais pré-cancerígenas (79 leucoplasias, 4
eritrolasias e 20 carcinomas in situ), em células tumorais de 69 CEOs primários sem
metástase, e em 31 CEOs com metástase. Foi realizada análise imunoistoquímica e
de biologia molecular. A imunorreatividade para PDPN foi detectada em 89 (86,4%)
lesões pré-cancerígenas e a intensidade da marcação foi correlacionada com o grau
de displasia epitelial. Elevada expressão foi observada em 66 (95,7%) dos CEOs e
foi significativamente associada com baixo grau de diferencição histopatológica. Na
48
transição epitélio-mesênquima foi observada imunocoloração em 18 (58,1%) dos
CEOs primários com metástase para linfonodos regionais. Os achados sugerem que
a PDPN está associada com o desenvolvimento do tumor através da seqüência
displasia oral/carcinoma e poderia estar envolvida em vias de sinalização de
crescimento tumoral e invasão.
Além de sua expressão ter sido confirmada em vários tipos de células
tumorais malignas, incluindo as células do CEO, destaca-se sua positividade em
tecidos embrionários, o que demostra sua propriedade multifuncional. Por
apresentar expressão em germe dentário, foi sugerida uma associação na atividade
celular proliferativa. Nesses, a PDPN está presente em células com atividade
mitótica elevada, isto é, na porção terminal da lâmina dental, bainha epitelial de
Hertwig e pré-ameloblastos. Este padrão de imunomarcação sugere que sua
expressão é necessária durante os processos que exigem alta atividade celular tais
como a proliferação e diferenciação (CAETANO et al., 2012; SAWA, 2010).
O estudo de Imaizumi et al. (2010) teve como objetivo investigar a distribuição
de células que imunoexpressavam PDPN em germes dentários de camundongos,
em vários estágios de desenvolvimento. Na fase de botão, a PDPN foi expressa nas
células epiteliais do germe dentário. Na fase de capuz, ela foi expressa no OE
(epitélio interno e externo). Na fase inicial de campânula, foi observada
imunorreatividade forte no epitélio interno e externo das alças cervicais, e nos
odontoblastos da papila dentária. Na fase final da odontogênese, nos estágios de
formação da coroa e da raiz, a PDPN foi expressa em odontoblastos que estavam
gerando dentina radicular e na bainha epitelial de Hertwig. Estes resultados sugerem
que as células epiteliais do germe dentário adquirem a capacidade de expressar a
PDPN e mantém essa capacidade no epitélio da mucosa oral. A expressão desta
proteína em odontoblastos foi induzida com o desenvolvimento do germe dentário,
mas foi suprimida após a formação completa da dentina primária, o que sugere que
a PDPN pode estar envolvida no crescimento de odontoblastos.
A discussão sobre essa glicoproteína e sua participação nos tumores
odontogênicos é um tema muito recente de estudo. Em ameloblastomas, TOCs,
TOAs, tumores odontogênicos epiteliais calcificantes (TOEC), tumor odontogênico
cístico calcificante e fibro-odontoma ameloblástico a imunoexpressão é membranar
e citoplasmática predominantemente observada nas células epiteliais odontogênicas
49
na periferia destes tumores. Em contraste, não se observa a expressão nos
ameloblastos do fibro-odontoma, que são células menos ativas, assim como na
camada superior do revestimento epitelial de TOCs e em TOECs nas células
fantasmas. Apesar dos numerosos estudos sobre a presença de expressão de
PDPN em vários tecidos e tumores orais, pouco se sabe sobre a sua função
fisiológica ou patológica, porém ela parece estar relacionada com a atividade
proliferativa do TOCS e pode tem um papel importante no processo de invasão local
de tumores odontogénicos com e sem ectomesênquima. (CAETANO et al., 2012).
O estudo de Tsuneki et al. (2012) mostrou a imunolocalização diferencial de
PDPN entre quatro tumores odontogênicos, dentre eles o ameloblastoma, TOA,
tumor odontogênico cístico calcificante e TOC, em comparação com outras
moléculas relacionadas com a proliferação celular e via de sinalização da matriz
extracelular. As células PDPN positivas foram localizadas no centro da proliferação
celular, pois coincidiam com as células PCNA (antígeno nuclear de proliferação
celular) positivas, que também estavam distribuídas na periferia/zona basal dos
ninhos de células tumorais. Outro resultado interessante foi que células PDPN
positivas foram sobrepostas por células positivas para a integrina 1, fibronectina, e
MMP-9, sendo a co-localização de MMP-9 também relatada em células endoteliais
linfáticas. Com base nestes dois resultados principais, foi sugerido que esta
glicoproteína está envolvida na remodelação de moléculas de sinalização de matriz
extracelular, que é eventualmente relacionada com o crescimento celular. Portanto
ela não é sempre diretamente envolvida no ciclo celular em si, mas que serve como
uma das moléculas chave, que incluem as vias de sinalização de moléculas de
matriz extracelular para a proliferação celular nestes tumores.
Friedrich, Scheuer e Zustin (2012) analisaram a imunoexpressão da PDPN e
p63 em 6 TOCs de pacientes com a síndrome de Gorlin-Goltz. Imunorreatividade
linear contínua nas células epiteliais basais para PDPN foi observada em todos os
casos. A intensidade da coloração era forte e não diferiu dos casos relatados
anteriormente na literatura. Forte expressão de p63 nuclear foi detectada em
camadas de células basais, e diminuição nas camadas suprabasais. Observaram
que TOCs exibiram aumento da expressão de PDPN em casos associados com a
síndrome. Embora as funções biológicas desta proteína ainda não tenham sido
totalmente reconhecidas, sua expressão é capaz de promover a formação de
50
extensões celulares alongadas e aumentar a adesão e migração de células
inflamatórias. Expressão desta proteína em TOC está possivelmente associada com
invasão lenta das estruturas adjacentes e às frequentes recorrências locais deste
tumor odontogênico.
O estudo de Gonzáles-Alva et al. (2010) investigou a imunoexpressão da
PDPN, E-caderina e da vimentina em amostras de ameloblastomas (38 casos) e em
CDs (15 casos). Os resultados mostraram que expressão para PDPN foi detectada
na membrana celular e no citoplasma na maioria das células epiteliais tumorais
odontogênicas dos ameloblastomas. Para os CDs esta proteína foi negativa em 60%
dos casos (9 cistos), mas algumas áreas com reação inflamatória foram fracamente
positivas em 40% dos casos (6 cistos) na camada basal. A imunoexpressão para
PDPN em ameloblastomas foi significativamente mais elevada do que em CDs
(p<0,01). Concluíram que sua expressão está associada com tecidos odontogênicos
neoplásicos e desempenha um papel na migração coletiva de ninhos de células
tumorais em ameloblastomas, sendo que este processo pode estar relacionado com
a reorganização do citoesqueleto.
Okamoto et al. (2010) analisaram a imunoexpressão da PDPN em TOCs (46
casos), cistos odontogênicos ortoceratinizados (COO-11 casos) e CDs (15 casos).
Os resultados mostraram que os TOCs apresentaram positividade para PDPN na
membrana celular e no citoplasma na maioria das camadas basais e suprabasais e
na periferia dos cistos filhos. No caso de COO e CD, somente os casos associados
com inflamação foram positivos para PDPN, fenômeno este semelhante ao que
acontece com gengivas inflamadas. Quando comparado a expressão da PDPN entre
TOC, COO e CD concluiu-se que a PDPN é fortemente expressa em TOC em
comparação com os dois últimos cistos. O padrão de coloração em TOC pode estar
relacionado com a sua natureza neoplásica, e sugere um papel da proteína no
processo de crescimento tumoral.
Em um estudo de Miyazaki et al. (2009) que utilizou anticorpo anti-PDPN em
40 amostras de tecido gengival inflamado foi observada uma forte imunorreatividade
na porção membranar e citoplasmática de células basais epiteliais de gengiva que
exibiam intenso infiltrado inflamatório na lâmina própria subepitelial. Quando existia
leve ou ausente infiltrado inflamatório subepitelial, pouca ou nenhuma
imunorreatividade nas células basais foram observadas. Esta Imunorreatividade
51
também foi detectada em extensões de células basais, que são frequentemente
observadas no epitélio gengival, mas não em outros tipos de epitélio bucal e implica
que o epitélio gengival pode apresentar características de epitélio odontogênico.
Estes resultados sugerem que os estímulos inflamatórios dos periodontopatógenos
podem induzir a imumoexpressão de PDPN no epitélio sulcular e juncional oral,
aumentando a capacidade migratória do epitélio, essencial para a progressão da
periodontite.
O estudo de Zustin, Scheuer e Friedrich (2010) teve como objetivo analisar a
imunoexpressão da PDPN em 9 germes dentários humanos e 7 dentes
permanentes, extraídos por motivos ortodônticos, assim como em lesões
odontogênicas (10 CRs, 10 CDs, 3 TOCs, 5 ameloblastomas e 2 TOAs). A
expressão da proteína foi detectada na maioria das células epiteliais e
ectomesenquimais dos tecidos dos germes dentários humanos, e nos odontoblastos
e fibroblastos superficiais da polpa de dentes permanentes. Em CRs e CDs houve
forte marcação membranar e citoplasmática na camada basal do revestimento
epitelial. TOC, ameloblastoma plexiforme e TOA revelaram forte marcação
membranar e citoplasmática nas camadas epiteliais basais e parabasais da periferia
do tumor. Concluíram, então, que a PDPN parece estar envolvida em processos
fisiológicos e patológicos, formando extensões celulares alongadas e fibras
odontoblásticas, na transição epitélio-mesênquima, durante o desenvolvimento do
germe dentário, assim como em lesões odontogênicas císticas e neoplásicas.
Sugeriram então que mecanismos semelhantes de adesão celular, envolvimento
epitélio-mesênquima e crescimento são, provavelmente, envolvidos na formação
destas lesões.
A razão pela qual a expressão da PDPN é aumentada durante os processos
com grande atividade celular, bem como durante a resposta inflamatória, permanece
desconhecida (TJIOE et al., 2012). Além disso, existe uma escassez de pesquisas
sobre sua expressão em cistos odontogênicos, sobretudo em CRs e CDs, já que
apresentam alta frequência de acometimentos, porém são de etiologias diferentes.
Dessa forma, novas pesquisas são necessárias para que haja um melhor
entendimento da atuação da PDPN nessas lesões císticas.
25
Proposição
53
3 PROPOSIÇÃO
Esta pesquisa se propôs a avaliar e comparar a expressão imunoistoquímica
do EGFR e da PDPN em cistos radiculares e cistos dentígeros, bem como associá-la
com o grau de inflamação, localização celular da imunomarcação e com as camadas
epiteliais imunomarcadas. Pretendeu-se que os resultados contribuíssem para o
melhor entendimento da participação dessas proteínas na patogênese das lesões
císticas analisadas.
54
Materiais e Métodos
55
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O presente estudo foi cadastrado na Plataforma Brasil e seu conteúdo foi
submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, de acordo com a resolução 466/12 do Conselho Nacional de
Saúde (CNS). O projeto foi aprovado com parecer nº 349.001 (ANEXO A).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O estudo consistiu de uma avaliação observacional, descritiva e retrospectiva
da expressão imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em CRs e CDs.
4.2.1 Variáveis
As variáveis analisadas neste estudo foram classificadas segundo informações
que constam nos Quadros 1 e 2.
Quadro 1 – Classificação das variáveis dependentes. Natal-RN, 2014.
VARIÁVEIS DEPENDENTES
TIPO CLASSIFICAÇÃO
Imunoexpressão para EGFR Qualitativa ordinal
Imunoexpressão para podoplanina
Qualitativa ordinal
Quadro 2 – Classificação das variáveis independentes. Natal-RN, 2014.
VARIÁVEIS INDEPENDENTES
TIPO CLASSIFICAÇÃO
Tipo de cisto Qualitativa nominal mutualmente
exclusiva
Grau de inflamação Qualitativa ordinal
Localização celular da imunocoloração
Qualitativa nominal exaustiva
Camadas epiteliais imunomarcadas
Qualitativa ordinal
56
4.3 POPULAÇÃO
Todos os casos de CRs e CDs diagnosticados e arquivados no Setor de
Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), entre os
anos de 1985 e 2013.
4.4 AMOSTRA
A amostra foi intencional e composta por 60 espécimes de CRs e CDs incluídos
em parafina, obtidos a partir dos registros do Serviço de Patologia Oral da UFRN.
Estes foram selecionados com a finalidade de se obter 30 casos de CRs e 30 casos
de CDs segundo os critérios de seleção da amostra.
4.4.1 Critérios de seleção da amostra
4.4.1.1 Critérios de Inclusão da Amostra
Foram incluídos casos diagnosticados como CRs e CDs, que exibiram aspectos
histopatológicos bem definidos pré-estabelecidos e confirmados por dados
radiográficos. Foram selecionados apenas os casos que exibiram uma cavidade
patológica revestida total ou parcialmente por epitélio pavimentoso estratificado
não ceratinizado que apresentaram subjacente ao mesmo uma quantidade
suficiente de cápsula fibrosa para realização da análise morfológica.
Para os CRs, não houve restrição com relação ao local de acometimento.
Para os CDs, foram incluídos apenas os espécimes provenientes de lesões em
região de terceiro molar (maxilar ou mandibular) e região anterior da maxila,
associadas a dentes totalmente inclusos.
Foram selecionados apenas os casos que possuíram material biológico
suficiente nos blocos de parafina para o desenvolvimento da pesquisa.
4.4.1.2 Critérios de Exclusão da Amostra
57
Foram excluídos do estudo os casos que não satisfizeram os critérios de
inclusão anteriormente citados.
4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO
O estudo morfológico foi realizado em lâminas coradas pela técnica de rotina
da hematoxilina e eosina, já existentes no arquivo do laboratório de Anatomia
Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da
UFRN. Por meio da microscopia de luz, investigou-se a intensidade do infiltrado
inflamatório presente no tecido conjuntivo/cápsula, que foi classificada de acordo
com critérios adaptados do estudo de Tsai et.al. (2004).
No aumento de 100x, a partir da porção luminal das lesões císticas em
direção à periferia, ou seja, a partir da região subepitelial, a cápsula fibrosa foi
dividida em terços, formando três campos microscópicos consecutivos. Os
espécimes cujo infiltrado inflamatório era ausente ou se apresentou restrito ao
primeiro campo microscópico, foram classificados como grau 1 (ausente ou leve
infiltrado inflamatório); as lesões com células inflamatórias presentes até o segundo
campo microscópico foram definidas como grau 2 (moderado infiltrado inflamatório);
e as lesões que exibiram infiltrado inflamatório até o terceiro campo microscópico,
foram categorizadas como de grau 3, conforme ilustra a figura 1. As avaliações
foram realizadas por um único examinador previamente treinado e os dados
transcritos para uma ficha elaborada para o estudo (Apêndice A).
Figura 1: Ilustração da análise do infiltrado inflamatório em CRs, segundo metodologia adaptada do estudo do estudo de Tsai et al. (2004).
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da UFRN. Fotomicrografia obtida em microscópio de luz no aumento de 100x.
58
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
Os espécimes fixados em formol a 10%, incluídos em parafina e selecionados
para a pesquisa, foram submetidos a cortes histológicos de 3 µm de espessura e
estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas, desengorduradas e
preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano,
Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido
ao método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano
(ADVANCETM HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando
anticorpos monoclonais anti-EGFR e anti-PDPN, conforme mostra o quadro 3.
Quadro 3 - Especificações dos anticorpos primários utilizados na pesquisa. Natal-RN, 2014.
*Spring Bioscience, Inc., Pleasanton, CA, USA; **Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA.
Como controle positivo foi utilizado espécime de carcinoma epidermóide oral. O
controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de
soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.
A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:
Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos em temperatura
ambiente;
Reidratação em cadeia descendente de etanóis:
Álcool etílico absoluto I (3 minutos);
Álcool etílico absoluto II (3 minutos);
Álcool etílico absoluto III (3 minutos);
Álcool etílico 95°GL (3 minutos);
Álcool etílico 80°GL (3 minutos);
Especificidade/ Clone
No
do Catálogo Fabricante Diluição
Sistema
Recuperação Antigênica
Incubação
EGFR (SP9)
SPB
M3090 Spring
Bioscience* 1:200
Advance
Citrato ph 6,0 Pascal
60 minutos
Podoplanina (D2-40)
M3619 Dako** 1:400
Advance
Tris/EDTA ph 9,0 Pascal
Overnight
59
Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol
95° em temperatura ambiente (10 minutos);
Lavagem em água corrente (5 minutos);
Duas passagens em água destilada (3 minutos cada);
Recuperação antigênica (Quadro 3);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Uma incubação dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes
para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (15 minutos cada);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Uma passagem em solução tampão TRIS-HCl (tris-hidroximetil-aminometano,
Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) pH 7,4;
Incubação dos cortes com anticorpos primários (Quadro 3) em solução diluente
(Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc.,
Carpinteria, CA, USA);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4;
Incubação com anticorpo secundário (ADVANCETM HRP Link, Dako North
America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos
cada);
Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase (ADVANCETM HRP Enzyme,
Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA e Kit LSAB HRP, Dako Cytomation,
Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada);
Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid
DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (10 minutos);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10
minutos);
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
60
Álcool etílico 95°GL (2 minutos);
Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
Álcool etílico absoluto II (5 minutos);
Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
Duas passagens em xilol (2 minutos cada);
Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA),
para análise em microscópio de luz.
4.7 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA
As lâminas coradas pela técnica de imunoistoquímica foram analisadas em
microscópio de luz, em um aumento de 400x e as características do padrão de
expressão celular de cada imunomarcador anotadas em fichas especiais
previamente elaboradas para o estudo (Apêndice B).
A análise das células imunomarcadas para EGFR e PDPN foi realizada
somente no revestimento epitelial, de forma semiquantitativa, segundo metodologia
adaptada do estudo de Gonçalves et al. (2012). Foram consideradas imunopositivas
as células do revestimento epitelial cístico que apresentaram coloração
acastanhada, independente da intensidade. Os casos foram classificados de acordo
com a porcentagem de células positivas em: Escore I - 0 a 5% de células positivas;
Escore II - 5 a 50% de células positivas; Escore III - acima de 50% das células
positivas.
Seguindo a metodologia adaptada do estudo de Oliveira et al. (2011), foi
analisada também a localização da imunomarcação nas células individualmente
(membranar, citoplasmática, ou em ambas) e nas diferentes camadas do epitélio
(basal, suprabasal e superficial).
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise descritiva e inferencial dos dados foi realizada por meio do software
Statistics Package of the Social Sciences versão 20 (IBM, São Francisco, CA, EUA).
Para avaliar as possíveis associações entre as variáveis dependentes
(Imunomarcação para EGFR e PDPN) com as variáveis independentes (tipo de
61
cisto, intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e
número de camadas epiteliais imunomarcadas) utilizou-se o teste de Qui-quadrado e
Exato de Fisher, ambos com nível de significância estatística de 5%. Foram utilizados
estes testes, tendo em vista que os dados são de natureza qualitativa e, portanto,
sem distribuição normal.
25
Resultados
63
5 RESULTADOS 5.1 RESULTADOS DO ESTUDO MORFOLÓGICO
A análise morfológica dos casos de CRs e CDs revelou que estes
apresentaram aspectos histopatológicos compatíveis com os descritos na literatura.
Observou-se a presença de uma cavidade cística revestida total ou parcialmente por
epitélio pavimentoso estratificado não ceratinizado. Os CRs exibiram número de
camadas epiteliais variadas, apresentando 13 casos com epitélio hiperplasiado, 9
com epitélio hiperplasiado e áreas de atrofia e 8 com epitélio atrófico. A cápsula de
tecido conjuntivo fibroso destes cistos apresentou intenso infiltrado inflamatório (grau
3) na maioria dos casos, o que conferia ao epitélio alterações como espongiose,
degeneração hidrópica, exocitose e hiperplasia (Figura 2-A,B,C). Para os CDs, a
maioria dos casos exibiu um delgado revestimento epitelial e interface plana com o
tecido conjuntivo (14 casos com epitélio atrófico, 9 com epitélio atrófico e áreas de
hiperplasia e 8 com epitélio hiperplasiado). Na cápsula fibrosa destes cistos
predominou ausente ou leve infiltrado inflamatório (grau 1), apresentando alguns
casos com moderado infiltrado inflamatório (grau 2), que conferia a ele maior
número de camadas epiteliais e algumas alterações como espongiose e
degeneração hidrópica (Figura 2-D,E,F). Como a intensidade da inflamação foi o
critério morfológico analisado, constam na tabela 1 os dados referentes à
distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório quanto ao tipo de cisto.
Tabela 1: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014.
Cisto radicular Cisto dentígero
N % N %
Intensidade do infiltrado inflamatório
Grau 1- Ausente ou Leve 6 20 19 63,3
Grau 2 - Moderado 7 23,3 11 36,7
Grau 3 - Intenso 17 56,7 - -
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
5.2 RESULTADOS DO ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
64
O estudo imunoistoquímico mostrou que todos os casos de CRs e CDs
apresentaram imunomarcação para EGFR. Para PDPN, todos os casos de CDs e
quase a totalidade dos CRs apresentaram imunomarcação.
Os resultados revelaram que a maioria dos casos de ambos os cistos
apresentaram escore III de imunomarcação para o EGFR, ou seja, ambas as lesões
exibiram elevada expressão. Para a PDPN, os CRs apresentaram maior
imunomarcação, com a maioria dos casos apresentando escore III quando
comparado aos CDs, onde a maioria dos casos apresentarou escore II. A tabela 2
mostra a caracterização da amostra quanto aos escores de imunomarcação celular
para o EGFR e a PDPN, de acordo com o tipo de cisto.
Tabela 2: Distribuição dos escores de imunomarcação para EGFR e PDPN quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014.
Cisto radicular Cisto dentígero
Células epiteliais imunomarcadas para
EGFR N % N %
Escore I - Até 5% 1 3,3 - -
Escore II - De 5 a 50% 1 3,3 1 3,3
Escore III - Acima de 50% 28 93,3 29 96,7
Células epiteliais imunomarcadas para
PDPN
Escore I - Até 5% 6 20 2 6,7
Escore II - De 5 a 50% 8 26,7 21 70
Escore III - Acima de 50% 16 53,3 7 23,3
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
Quanto à localização celular da imunomarcação para o EGFR, ambos os
cistos apresentaram predominância de positividade apenas no citoplasma, seguida
pela associação de membranar e citoplasmática (Figuras 3 e 4). Com relação à
localização celular da imunomarcação para PDPN em ambos os cistos, predominou
a imunomarcação membranar e citoplasmática associadas, seguida pela membranar
e pela citoplasmática (Figuras 5 e 6), conforme mostra a tabela 3.
65
Tabela 3: Distribuição da localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014.
Cisto radicular Cisto dentígero
N % n %
Localização celular da imunomarcação para
EGFR
Membranar - - - -
Citoplasmática 17 56,7 23 76,7
Ambas 13 43,3 7 23,3
Localização celular da imunomarcação para
PDPN
Membranar 10 34,5 7 23,3
Citoplasmática 2 6,8 1 3,3
Ambas 17 58,6 22 73,3
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
A tabela 4 mostra o perfil de imunomarcação para EGFR e PDPN por
camadas epiteliais, de acordo com o tipo de cisto. As informações inicialmente foram
computadas por caso, havendo casos onde uma ou mais camadas apresentaram
células imunomarcadas. Para ambas as lesões houve imunomarcação do EGFR em
praticamente todas as camadas epiteliais, na maioria dos casos (Figuras 3 e 4).
Para PDPN, tanto em CRs como em CDs, a camada epitelial mais frequentemente
imunomarcada foi a basal (Figuras 5 e 6).
Tabela 4: Distribuição das camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN quanto ao tipo de cisto. Natal-RN, 2014.
Cisto radicular Cisto dentígero
N % n %
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para EGFR
Basal 28 93,3 30 100
Suprabasal 28 93,3 30 100
Superficial 30 100 30 100
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para PDPN
Basal 29 96,7 30 100
Suprabasal 19 63,3 15 50
Superficial 20 66,7 9 30
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
66
A distribuição dos escores de imunomarcação com relação à intensidade do
infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais
imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CRs, constam na tabela 5.
Quando se analisou a distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório
com os escores de imunomarcação, nos casos de CRs, pode-se perceber que a
maioria dos casos apresentou imunomarcação celular escore III para EGFR,
independente do grau de inflamação. Para PDPN, a maioria dos casos com infiltrado
inflamatório grau 3 apresentou imunomarcação escore III.
Tabela 5: Distribuição dos escores de imunomarcação com relação à intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CRs. Natal-RN, 2014.
EGFR PDPN
Escore I
(%)
Escore II
(%)
Escore III
(%)
Escore I
(%)
Escore II
(%)
Escore III
(%)
Intensidade do
infiltrado
inflamatório
Grau 1 - - 6 (100) 2 (33,3) 2 (33,3) 2 (33,3)
Grau 2 - - 7 (100) - 4 (57,1) 3 (42,9)
Grau 3 1 (5,9) 1 (5,9) 15 (88,2) 4 (23,5) 2 (11,8) 11 (64,7)
Localização
celular da
imunomarcação
Membranar - - - 2 (20) 2 (20) 6 (60)
Citoplasmática 1 (5,9) - 16 (94,1) 1 (50) 1 (50) -
Ambas - 1 (7,7) 12 (92,3) 2 (11,8) 5 (29,4) 10 (58,8)
Quantidade de
cada camada
epitelial
imunomarcada
Basal - - 28 (100) 5 (17,2) 8 (27,6) 16 (55,2)
Suprabasal - - 28 (100) 1 (5,3) 2 (10,5) 16 (84,2)
Superficial 1 (3,3) 1 (3,3) 28 (93,3) 2 (10) 3 (15) 15 (75)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
67
A tabela 6 mostra a distribuição dos escores de imunomarcação com relação
à intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e
camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CDs.
Para o EGFR, quase a totalidade dos casos apresentou escore III de
imunomarcação, independente da intensidade do infiltrado inflamatório. Para PDPN,
a maioria apresentou escore II de imunomarcação, independente da intensidade do
infiltrado inflamatório.
Tabela 6: Distribuição dos escores de imunomarcação com relação à intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CDs. Natal-RN, 2014.
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
A tabela 7 mostra a distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com
relação à localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos de
CRs. Na tabela 8, têm-se a distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com
EGFR PDPN
Escore I
(%)
Escore II
(%)
Escore III
(%)
Escore I
(%)
Escore II
(%)
Escore III
(%)
Intensidade do
infiltrado
inflamatório
Grau 1 - 19 (100) 2 (10,5) 14 (73,7) 3 (15,8)
Grau 2 - 1 (9,1) 10 (90,9) - 7 (63,6) 4 (36,4)
Grau 3 - - - - - -
Localização
celular da
imunomarcação
Membranar - - - 1 (14,3) 5 (71,4) 1 (14,3)
Citoplasmática - 1 (4,3) 22 (95,7) - - 1 (100)
Ambas - - 7 (100) 1 (4,5) 16 (72,7) 5 (22,8)
Quantidade de
cada camada
epitelial
imunomarcada
Basal - 1 (3,3) 29 (96,7) 2 (6,7) 21 (70) 7 (23,3)
Suprabasal - 1 (3,3) 29 (96,7) - 8 (53,3) 7 (46,7)
Superficial - 1 (3,3) 29 (96,7) - 2 (22,2) 7 (77,8)
68
relação à localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos de
CDs.
Tabela 7: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação à localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos de CRs. Natal-RN, 2014.
Intensidade do infiltrado inflamatório
Grau 1
(%)
Grau 2
(%)
Grau 3
(%)
Localização celular da imunomarcação do
EGFR
Membranar - - -
Citoplasmática 5 (29,4) 3 (17,6) 9 (52,9)
Ambas 1 (7,7) 4 (30,8) 8 (61,5)
Localização celular da imunomarcação da
PDPN
Membranar 2 (20) 1 (10) 7 (70)
Citoplasmática 2 (100) - -
Ambas 2 (11,8) 6 (35,3) 9 (52,9)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
Tabela 8: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação à localização celular da imunomarcação para EGFR e PDPN nos casos de CDs. Natal-RN, 2014.
Intensidade do infiltrado inflamatório
Grau 1
(%)
Grau 2
(%)
Grau 3
(%)
Localização celular da imunomarcação do
EGFR
Membranar - - -
Citoplasmática 14 (60,9) 9 (39,1) -
Ambas 5 (71,4) 2 (28,6) -
Localização celular da imunomarcação da
PDPN
Membranar 5 (71,4) 2 (28,6) -
Citoplasmática - 1 (100) -
Ambas 14 (63,6) 8 (36,4) -
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
A distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação às
camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CRs consta
69
na tabela 9. A tabela 10 mostra a distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório
com relação às camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos
de CDs.
Tabela 9: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação às camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CRs. Natal-RN, 2014.
Intensidade do infiltrado inflamatório
Grau 1
(%)
Grau 2
(%)
Grau 3
(%)
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para EGFR
Basal 6 (21,4) 7 (25) 15 (53,6)
Suprabasal 6 (21,4) 7 (25) 15 (53,6)
Superficial 6 (20) 7 (23,3) 15 (56,7)
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para PDPN
Basal 6 (20,7) 7 (24,1) 16 (55,2)
Suprabasal 2 (10,5) 4 (21,1) 13 (68,4)
Superficial 2 (10) 4 (20) 14 (70)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
Tabela 10: Distribuição da intensidade do infiltrado inflamatório com relação às camadas epiteliais imunomarcadas para EGFR e PDPN nos casos de CDs. Natal-RN, 2014
Intensidade do infiltrado inflamatório
Grau 1
(%)
Grau 2
(%)
Grau 3
(%)
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para EGFR
Basal 19 (63,3) 11 (36,7) -
Suprabasal 19 (63,3) 11 (36,7) -
Superficial 19 (63,3) 11 (36,7) -
Quantidade de cada camada epitelial
imunomarcada para PDPN
Basal 19 (63,3) 11 (36,7) -
Suprabasal 8 (53,3) 7 (46,7) -
Superficial 4 (44,4) 5 (55,6) -
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
70
A tabela 11 mostra a distribuição da localização celular da imunomarcação
com relação às camadas epiteliais imunomarcadas para os casos de CRs. Pode-se
observar que, para o EGFR, houve praticamente igual distribuição entre a
imunolocalização citoplasmática e associada (membranar e citoplasmática) entre as
camadas. Para PDPN, a maioria dos casos com imunomarcação na basal,
suprabasal e superficial apresentaram imunolocalização associada na membrana e
no citoplasma.
Na tabela 12 constam os dados referentes à distribuição da localização
celular da imunomarcação com relação às camadas epiteliais imunomarcadas, para
os casos de CDs. Pode-se observar que, para o EGFR, a maioria dos casos com
imunomarcação na camada basal, suprabasal e superficial apresentou
imunolocalização citolasmática. Para PDPN, a maioria dos casos que
imunomarcaram a camada basal, subrabasal e superficial apresentavam
imunomarcação celular associados na membrana e no citoplasma.
71
Tabela 11: Distribuição da localização celular da imunomarcação com relação às camadas epiteliais imunomarcadas nos casos de CRs. Natal-RN, 2014.
Localização celular da imunomarcação para EGFR Localização celular da imunomarcação para PDPNa
Membranar (%)
Citoplasmática (%)
Ambas (%)
Membranar (%)
Citoplasmática (%)
Ambas (%)
Quantidade de cada camada epitelial imunomarcada
Basal - 16 (57,1) 12 (42,9) 10 (34,5) 2 (6,9) 17 (58,6)
Suprabasal - 16 (57,1) 12 (42,9) 7 (36,8) - 12 (63,2)
Superficial - 17 (56,7) 13 (43,3) 7 (35) - 13 (65)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN. a Um caso de cisto radicular foi excluído, por não apresentar imunomarcação celular para PDPN.
Tabela 12: Distribuição da localização celular da imunomarcação com relação às camadas epiteliais imunomarcadas nos casos de CDs. Natal-RN, 2014.
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
Localização celular da imunomarcação para EGFR
Localização celular da imunomarcação para PDPN
Membranar (%) Citoplasmática (%) Ambas (%) Membranar (%) Citoplasmática (%) Ambas (%)
Quantidade de cada camada epitelial imunomarcada
Basal - 23 (76,7) 7 (23,3) 7 (23,3) 1 (3,3) 22 (73,3)
Suprabasal - 23 (76,7) 7 (23,3) 4 (26,7) 1 (6,7) 10 (66,7)
Superficial - 23 (76,7) 7 (23,3) 1 (11,1) 1 (11,1) 7 (77,8)
72
5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os testes estatísticos foram aplicados associando as variáveis dependentes e
independentes. Foi realizado o teste Exato de Fisher para observar se existia ou não
diferença estatisticamente significativa dos escores de imunomarcação do EGFR e
da PDPN entre os dois tipos de cistos analisados. Houve diferença estatisticamente
significativa entre os cistos somente com relação à imunoexpressão da PDPN
(p=0,033), já que esta proteína apresentou maior escore de imunomarcação nos
CRs. Entretanto, para que fosse possível realizar o teste, a variável dependente
precisou ser recategorizada, juntando-se os escores I e II, permanecendo o escore
III separado. Optou-se por unir os escores I e II, pois, como as proteínas analisadas
são encontradas em quantidade de destaque mesmo na mucosa oral normal (escore
I e II), somente sua superexpressão (escore III) representaria ativividade mais
intensa dessas proteínas (Tabela 13).
Tabela 13: Teste Exato de Fisher entre escores de imunomarcação do EGFR e da PDPN quanto aos tipos de cistos analisados. Natal-RN, 2014.
EGFR
p
PDPN
P Escore I e II
(%)
Escore III (%) Escore I e II
(%)
Escore III
(%)
Tipo de
cisto
Radicular
2 (6,7) 28 (93,3)
1,000
14 (46,7) 16 (53,3)
0,033
Dentígero
1 (3,3) 29 (96,7) 23 (76,7) 7 (23,3)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
As tabelas 14 (CRs) e 15 (CDs) exibem a análise estatística da associação
entre os escores de imunomarcação para EGFR e PDPN e a intensidade do
infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais
imunomarcadas, de acordo com o teste de Qui-quadrado/Exato de Fisher. Para que
fosse possível realizar o teste, a variável independente, que diz respeito à
intensidade do infiltrado inflamatório, precisou ser recategorizada, juntando-se o
grau 2 e 3, permanecendo o grau 1 separado, uma vez que a presença de um
moderado a intenso infiltrado inflamatório nos CRs é um achado comum, e nos CDs
a ausência ou escassez é o achado mais frequente.
73
Os casos de CRs com imunomarcação do EGFR escore III exibiram maior
positividade nas camadas basal e suprabasal (p=0,002). Os casos de CRs com
imunomarcação para PDPN escore III apresentaram uma associação significativa
com imunomarcação nas camadas suprabasal e superficial (p<0,001) (Tabela 14).
Para os casos de CDs com imunomarcação da PDPN escore III, pôde-se obsevar
que estes também estão associados significativamente com a imunomarcação nas
camadas suprabasal e superficial (p= 0,006; p<0,001, respectivamente) (Tabela 15).
Tabela 14: Associação da imunomarcação para EGFR e PDPN quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas, de acordo com o Teste de Qui-quadrado/Exato de Fisher para os casos de CRs. Natal-RN, 2014.
EGFR
p
PDPN
P Escore I
e II (%)
Escore III
(%)
Escore I
e II (%)
Escore III
(%)
Intensidade do infiltrado
inflamatório
Grau 1 - 6 (100) 1,000
d
4 (66,7) 2 (33,3) 0,378
d
Grau 2 e Grau 3 2 (8,3) 22 (91,7) 10 (41,7) 14 (58,3)
Localização celular da
imunomarcaçãob
Membranar - -
0,448d
4 (40) 6 (60)
-c Citoplasmática - 16 (100) 2 (100) -
Ambas 1 (7,7) 12 (92,3) 7 (41,2) 10 (58,8)
Camada epitelial
imunomarcada
Basal
Presente - 28 (100) 0,002
d
13 (44,8) 16 (55,2) 0,467
d
Ausente 2 (100) - 1 (100) -
Suprabasal
Presente - 28 (100) 0,002
d
3 (15,8) 16 (84,2) <0,001
d
Ausente 2 (100) - 11 (100) -
Superficial
Presente 2 (6,7) 28 (93,3) -a
5 (25) 15 (75) <0,001
d
Ausente - - 9 (90) 1 (10)
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN. a Não foi possível realizar o teste de Exato de Fisher, devido a variável permanecer constante.
b Um caso de cisto radicular foi excluído, por não apresentar imunomarcação celular para PDPN.
c Não foi possível realizar o teste de Qui-quadrado, por haver caselas com contagem esperada menor
que 5. d Teste Exato de Fisher.
74
Tabela 15: Associação da imunomarcação para EGFR e PDPN quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, localização celular da imunomarcação e camadas epiteliais imunomarcadas, de acordo com o Teste Exato de Fisher para os casos de CDs. Natal-RN, 2014.
EGFR
P
PDPN
P Escore I e
II (%)
Escore III
(%)
Escore I e
II (%)
Escore III
(%)
Intensidade do
infiltrado inflamatório
Grau 1 - 19 (100) 0,367
16 (84,2) 3 (15,8) 0,372
Grau 2 e Grau 3 1 (9,1) 10 (90,9) 7 (63,6) 4 (36,4)
Localização celular da
imunomarcação
Membranar - -
1,000
6 (85,7) 1 (14,3)
-b Citoplasmática 1 (4,3) 22 (95,7) - 1 (100)
Ambas - 7 (100) 17 (77,3) 5 (22,7)
Camada epitelial
imunomarcada
Basal
Presente 1 (3,3) 29 (96,7) -a
23 (76,7) 7 (23,3) -a
Ausente - - - -
Suprabasal
Presente 1 (3,3) 29 (96,7) -a
8 (53,3) 7 (46,7) 0,006
Ausente - - 15 (100) -
Superficial
Presente 1 (3,3) 29 (96,7) -a
2 (22,2) 7 (77,8) <0,001
Ausente - - 21 (100) -
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN. a Não foi possível realizar o teste, pois a variável permaneceu constante.
b Não foi possível realizar o teste, por haver caselas com contagem esperada menor que 5.
75
Figura 2:
Figura 12- Imunomarcação citoplasmática para EGFR em cistos radicular.
Figura 13- Imunomarcação citoplasmática para
EGFR em cistos radicular.
A D
B E
F
Figura 2: Características morfológicas de CRs e CDs. A) CR com infiltrado inflamatório grau 1 e epitélio atrófico. B) CR com infiltrado inflamatório grau 2, epitélio hiperplasiado e com projeções. C) CR com infiltrado inflamatório grau 3. D) CD com infiltrado inflamatório ausente (grau 1) e epitélio atrófico. E) CD com infiltrado inflamatório grau 1 (leve infiltrado inflamatório). F) CD com infiltrado inflamatório grau 2 (H/E, 100x).
C
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
76
Figura 3: Imunoexpressão do EGFR em CRs. A) Imunolocalização citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 1. a) Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática. B) Imunolocalização citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 3. b) Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática. C) Imunolocalização membranar e citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 1. c) Maior detalhe da imulocalização membranar e citoplasmática associada. A seta preta mostra células com imunolocalização membranar (ADVANCE, 400x).
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
C
c
B
b
a
A
77
Figura 4: Imunoexpressão do EGFR em CDs. A) Imunolocalização citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 1. a) Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática. B) Imunolocalização citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 1. b) Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática. C) Imunolocalização membranar e citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 2. c) Maior detalhe da imunolocalização membranar e citoplasmática associada (ADVANCE, 400x).
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
C
c
B
b
A
a
78
Figura 5: Imunoexpressão da PDPN em CRs. A) Imunolocalização membranar nas camadas basal e
suprabasal, infiltrado inflamatório grau 3. a) Maior detalhe da imunolocalização membranar. B)
Imunolocalização membranar e citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório
grau 3. b) Maior detalhe da imunolocalização membranar e citoplasmática associada. C)
Imunolocalização citoplasmática nas camadas basal e suprabasal, infiltrado inflamatório grau 1. c)
Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática (ADVANCE, 400x).
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
C
c
B
b
A
a
79
Figura 6: Imunoexpressão da PDPN em CDs. A) Imunolocalização membranar nas camadas basal e suprabasal, infiltrado inflamatório grau 1. a) Maior detalhe da imunolocalização membranar. B) Imunolocalização membranar e citoplasmática em todas as camadas epiteliais, infiltrado inflamatório grau 2. b) Maior detalhe da imunolocalização membranar e citoplasmática associada. C) Imunolocalização citoplasmática na camada basal, infiltrado inflamatório grau 1. c) Maior detalhe da imunolocalização citoplasmática (ADVANCE, 400x).
Fonte: Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.
C
c
B
b
A
a
80
Discussão
81
6 DISCUSSÃO
Os CRs e CDs são as lesões císticas odontogênicas mais prevalentes,
tornando-as alvos de numerosas pesquisas que objetivam compreender melhor suas
etiopatogenias. Sabe-se que esses cistos apresentam etiologias diferentes, sendo
os CDs com estímulo indutor ainda desconhecido. Os mecanismos de
estabelecimento e crescimento dessas lesões não são completamente esclarecidos,
porém, acredita-se que a proliferação epitelial tenha um papel importante, o que
torna relevante o estudo de possíveis biomarcadores envolvidos neste processo.
Acredita-se que o EGFR e a PDPN possam participar da formação e crescimento
desses cistos, através do processo de estimulação epitelial.
A formação dos cistos está relacionada com a proliferação de restos epiteliais,
que são ativados pela liberação de citocinas e/ou fatores de crescimento, produzidos
principalmente durante processos inflamatórios (ISAAC et al., 2010; MORAES et al.,
2011). Nestes processos, estão presentes células como os macrófagos que, dentre
outras, são importantes por produzirem uma diversidade de fatores de crescimento,
dentre os quais incluem: EGF, FGF (fator de crescimento de fibroblastos), PDGF
(fator de crescimento derivado de plaquetas), TGF-β (fator de crescimento
transformante beta) e VEGF (fator de crescimento endotelial vascular). O EGF atua
realizando quimiotaxia e proliferação de fibroblastos, assim como proliferação e
quimioatração de queratinócitos. Assim, para que EGF atue, é necessária a
presença de seu receptor (EGFR), que também é expresso durante processos
inflamatórios (ISAAC et al., 2010). Acredita-se que a expressão da PDPN também
seja influenciada pela inflamação, porém a razão pela qual sua expressão é
reforçada durante os processos de alta atividade celular e resposta inflamatória
permanece desconhecida (TJIOE et al., 2012).
Assim, diante dos poucos trabalhos com essas proteínas (EGFR e PDPN),
nessas lesões císticas (CRs e CDs), este estudo buscou avaliar e comparar a
expressão imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em CRs e CDs e associá-la com
o grau de inflamação, localização celular da imunocoloração e com as camadas
epiteliais imunomarcadas, na tentativa de contribuir para o melhor entendimento da
participação dessas proteínas na patogenia dessas lesões.
82
O EGF atua em células alvo através da ligação a um receptor de superfície
célular específico (EGFR). Esta ligação leva à auto fosforilação do receptor de
tirosina cinase, sendo este considerado o primeiro passo para uma cadeia de
reações que culminam em mitose. As ativações de vias de transdução de sinal
estão, portanto, envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular
epitelial (VICENTE et al., 2010).
Pôde-se observar que para o EGFR, no presente estudo, todos os casos de
CRs e CDs apresentaram imunomarcação em células epiteliais. Além disso, dos 30
casos de cada cisto que foram analisados, quase a totalidade (28 casos de CR e 29
de CD) apresentaram imunomarcação escore III, ou seja, elevada imunoexpressão.
Adicionalmente, não houve diferença estatística significativa na imunoexpressão do
EGFR entre as lesões analisadas. Com isso, pode-se sugerir que o EGFR participa
da patogênese das lesões císticas analisadas, através da proliferação epitelial.
Resultados similares aos do presente estudo foram encontrados no trabalho
de Li et al. (1993) e Gonçalves et al. (2012). Os resultados do estudo de Li et al.
(1993) corroboram os dados de imunoexpressão apresentados pelo presente
estudo, visto que o revestimento epitelial de todos os CRs e CDs analisados
expressaram o EGFR, apesar da metodologia de análise ser diferente. O estudo de
Gonçalves et al. (2012) utilizou metodologia e número de casos semelhantes. Neste,
todos os CRs e CDs apresentaram alta imunoexpressão do EGFR (acima de 50% de
células positivas), e não houve diferença estatística significativa na imunoexpressão
deste receptor entre as lesões, resultados esses que também foram encontrados no
presente estudo.
No entanto, os resultados acima expostos estão em contradição aos
apresentados no trabalho de Shrestha et al. (1992), aos outros dados apresentados
no estudo de Li et al. (1993), e aos resultados do estudo de Vicente et al. (2010). No
estudo de Shrestha et al. (1992), os autores analisaram, dentre outras lesões, os
CRs, que apresentaram imunopositividade para EGFR em 35% dos casos, e os CDs
com imunopositividade em 47,4% dos casos. Estas porcentagens são inferiores as
encontradas no presente estudo, onde todos os casos, em ambos os cistos,
apresentaram imunopositividade, e não houve diferença de imunomarcação entre os
tipos de cistos.
83
Li et al. (1993) também encontraram que o revestimento epitelial dos cistos de
desenvolvimento apresentou imunocoloração mais intensa para EGFR, do que os
cistos inflamatórios. Os autores afirmaram que a maior expressão do EGFR nos
cistos de desenvolvimento apoia a ideia de que diferentes mecanismos de iniciação
e controle de proliferação de células epiteliais estão envolvidos em suas formações.
Assim, como no presente estudo não houve diferença estatística significativa entre a
imunoexpressão do EGFR entre os cistos e para os dois tipos de cistos a maioria
dos casos foi escore III, pode-se sugerir que, ao contrário do que afirmaram Li et al.
(1993), mecanismos semelhantes de iniciação e controle de proliferação de células
epiteliais podem estar envolvidos em suas formações, apesar de apresentarem
etiologias diferentes.
O estudo de Vicente et al. (2010) mostrou que houve imunoexpressão positiva
para EGFR em apenas 30% dos casos de CRs e 40% dos casos de CDs. Estas
porcentagens também mostraram-se-se inferiores as encontradas no atual estudo,
onde, como já relatado, ambos os cistos analisados apresentaram imunomarcação
positiva para EGFR em todos os casos e, portanto, não houve diferença de
imunoexpressão entre as lesões.
É sabido que os CRs são originados pela proliferação dos REM (LATOO et
al., 2009). Nordlund et al. (1991) encontraram que REM não proliferantes no
ligamento periodontal apresentaram a superfície de todas as células coradas
intensamente com o anticorpo anti-EGFR. No presente estudo, todos os casos de
CRs apresentaram imunomarcação para o EGFR, sendo que a grande maioria
apresentou escore III, ou seja, elevada imunomarcação. Esses resultados
associados sugerem que, no desenvolvimento dos CRs, os REM mantêm a
capacidade de proliferação mediada pelo EGF e, portanto, esse fator de crescimento
epidérmico e seu receptor contribuem para o estabelecimento e crescimento deste
tipo de cisto.
Acredita-se que os CDs possam se desenvolver a partir da proliferação de
remanescentes do OE ou do EROE, através de acúmulo de líquido entre as
camadas destes, após a formação completa ou parcial da coroa dental (LIMA et al,
2013). Cobo et al. (1992) mostraram que em dentes de ratos que não erupcionaram,
moderada imunorreatividade para EGF e EGFR estava presente nos ameloblastos e
nas células do epitélio interno do órgão do esmalte. Sabendo da constituição do
84
EROE e do OE, a moderada imunorreatividade encontrada nestes locais, associada
com os dados encontrados no atual estudo, onde todos os casos de CDs
apresentaram imunomarcação, sendo que quase a totalidade apresentou escore III
para EGFR, pode-se supor que no desenvolvimento de CDs, estas células epiteliais
do OE ou do EROE aumentam a capacidade de proliferação mediada pelo EGF e,
portanto, este fator de crescimento epidérmico e seu receptor poderiam contribuir,
também, para o estabelecimento e crescimento desse tipo de cisto. Apesar de o
estudo de Cobo et al. (1992) ter sido realizado em ratos, acredita-se que processos
semelhantes ocorram em humanos.
Quando se associa a intensidade do infiltrado inflamatório com as células
epiteliais imunomarcadas para EGFR em CRs e CDs, pode-se perceber que, para os
dois tipos de cistos, não foram observadas diferenças estatísticas significativas.
Portanto, a inflamação parece não influenciar na imunomarcação do EGFR nas
células epiteliais dessas lesões. Este resultado está em concordância com o estudo
de Gonçalves et al. (2012), porém, discorda dos resultados apresentados no estudo
de Li et al. (1993). Gonçalves et al. (2012) analisaram, em CRs, a imunoexpressão
do EGFR, bem como a sua associação com a intensidade do infiltrado inflamatório.
Foi observado que a reação inflamatória não influenciou a expressão do EGFR no
revestimento epitelial, corroborando, portanto, os resultados do presente estudo,
apesar de utilizarem forma de análise do infiltrado inflamatório diferente.
O estudo de Li et al. (1993) mostrou que o revestimento epitelial de
ceratocistos odontogênicos (atualmente denominados de tumor odontogênico
ceratocístico) e de CDs expressavam níveis mais elevados de imunomarcação do
EGFR do que o revestimento de CRs, como relatado anteriormente. A menor
intensidade de coloração do EGFR em CRs coincidia com a presença de alterações
degenerativas no interior do epitélio associadas com infiltrado de células
inflamatórias no local. Foi sugerido que níveis de expressão do EGFR parecem estar
relacionados com a presença de inflamação no interior do tecido conjuntivo
adjacente (inversamente relacionada) em vez da proliferação de células epiteliais.
A imunolocalização do EGFR parece ser importante por determinar a
velocidade da resposta celular proliferativa a estímulos (OLIVEIRA et al., 2011;
GONÇALVES et al. 2012). No estudo de Baumgart et al. (2007), os autores
observaram que expressões citoplasmáticas e associadas (membranares e
85
citoplasmáticas) foram observadas na mucosa oral normal, principalmente nas
camadas proliferativas (basal e suprabasal). As células que apresentam coloração
citoplasmática apenas ou coloração combinada (membranar e citoplasmática), em
que todos ou alguns dos receptores tenham sido interiorizados, mostram uma
resposta mais lenta, do tipo fisiológica.
Nos casos em que o EGFR é restrito à membrana celular, a resposta, na
presença de um ligante, é mais rápida. Caso contrário, se estiver internalizado no
citoplasma, a resposta proliferativa decorrente de estimulação é mais lenta.
(OLIVEIRA et al., 2011; GONÇALVES et al. 2012).
Os resultados apresentados sobre a localização celular da imunomarcação no
presente estudo indicaram que predominou, tanto em CRs como em CDs, a
imunorreatividade citoplasmática, seguida pela localização associada de membranar
e citoplasmática. Quase todas as camadas epiteliais, na maioria dos casos, de
ambos os cistos, apresentaram-se imunomarcadas e com elevada expressão
(escore III). Assim, os resultados revelaram que os casos de CRs com
imunomarcação do EGFR escore III estão mais associados com imunomarcação nas
camadas basal e suprabasal do epitélio. Já para os casos de CDs, não existiu
diferença estatísca entre células imunomarcadas e as camadas epiteliais, pois
houve intensa imunopositividade (escore III) igualmente em todas as camadas.
Vale ressaltar que, apesar da diferença estatística entre CRs e CDs, as
camadas basais e suprabasais, que são camadas consideradas mais proliferativas,
apresentaram elevada imunomarcação (escore III) na grande maioria dos casos,
para ambos os cistos. Porém, predominou a imunolocalização citoplasmática,
seguida pela membranar e citoplasmática associada. Isto poderia indicar que,
apesar de bastante expresso, o receptor, nestes cistos, na presença do ligante,
reage de forma mais lenta ao estímulo de proliferação celular epitelial, pois alguns
de seus receptores estão internalizados no citoplasma, fato este semelhante ao que
acontece na mucosa oral normal, em processos fisiológicos, como afirmam
Baumgart et al. (2007).
Em contradição, os resultados apresentados no estudo de Shrestha et al.
(1992) demonstraram que em todos os casos de CRs e CDs que apresentaram
imunomarcação, esta era apenas membranar, fato este que não foi encontrado no
86
atual estudo, pois não houve, para ambas as lesões, qualquer caso com
imunomarcação apenas membranar.
No estudo de Oliveira et al. (2011) observou-se que a imunolocalização do
EGFR em CDs foi somente citoplasmática, ou membranar e citoplasmática
associada, estando estas presentes na camada basal e suprabasal. Esses
resultados são semelhantes aos do presente estudo, com relação à localização
celular, porém foi divergente com relação às camadas epiteliais imunomarcardas,
pois neste, houve positividade praticamente igual em todas as camadas, e no estudo
de Oliveira et al. (2011) a camada superficial não foi avaliada. Ainda neste artigo, em
CDs, a imunolocalização do EGFR na camada basal foi semelhante no citoplasma
(57%), e na membrana e no citoplasma associados (42%), resultado que contrasta
com a camada suprabasal, em que a coloração era predominantemente observada
no citoplasma (82,8%). Esses resultados também discordam dos que foram
encontrados no presente estudo, pois neste, houve imunomarcação
predominantemente apenas citoplasmática (76,7%), na camada basal, suprabasal e
superficial.
Ainda em relação à imunolocalização do EGFR em CRs e CDs, os resultados
encontrados no trabalho de Gonçalves et al. (2012), apesar de metodologia e
número de casos semelhantes, também se mostraram diferentes aos do presente
estudo. Nesse, a maioria dos casos exibiu padrão de coloração membranar e
citoplasmática associada para o EGFR, fato este que não foi encontrado no estudo
atual, onde a maior parte dos casos apresentou imunomarcação citoplasmática
apenas.
A PDPN, além de ter sua imunoexpressão confirmada em vários tipos de
células tumorais malignas, incluindo as células do CEO, também teve sua
associação sugerida na atividade celular proliferativa de cistos e tumores
odontogênicos devido sua expressão em germe dentário, presente em células com
atividade mitótica elevada. Isto indica que sua expressão é necessária durante os
processos que exigem alta atividade celular tais como a proliferação e diferenciação
(CAETANO et al., 2012; SAWA, 2010).
Os resultados encontrados no presente estudo mostraram que todos os casos
de CDs e a grande maioria dos casos de CRs (29 casos) apresentaram
imunomarcação para PDPN. A imunoexpressão da PDPN, quanto ao tipo de cisto
87
analisado, revelou diferença estatística significativa, já que esta proteína apresentou
maiores escores de imunomarcação nesses últimos. Assim, pode-se sugerir que a
PDPN participa da patogênese das lesões císticas analisadas através da
estimulação epitelial, sendo que os CRs parecem expressar PDPN de forma mais
intensa do que os CDs.
González-Alva et al. (2010) mostraram que nos CDs, a imunoexpressão da
PDPN, em células epiteliais, esteve ausente em 60% das lesões, e foi somente
fracamente positiva em áreas com reação inflamatória, em 40% dos cistos. Estes
resultados estão em contradição com os que foram encontrados no presente
trabalho, já que para os CDs foi encontrado positividade em todos os casos.
O estudo de Imaizumi et al. (2010) relatou que a PDPN foi expressa nas
células epiteliais do germe dentário, no epitélio interno e externo do OE, no epitélio
interno e externo das alças cervicais, nos odontoblastos e na bainha epitelial de
Hertwig em germes dentários de camundongos. Os autores sugeriram que as
células epiteliais do germe dentário adquirem a capacidade de expressar a PDPN e
mantêm essa capacidade no epitélio da mucosa oral. Sabendo da origem dos CRs e
CDs através da proliferação dos restos epiteliais, e que os resultados do presente
estudo demonstraram marcante imunoexpressão para PDPN nas células epiteliais
desses dois tipos de cistos, pode-se sugerir, juntamente com os achados de
Imaizumi et al. (2010), que no desenvolvimento desses cistos, os restos epiteliais
mantêm ou aumentam a capacidade de expressar a PDPN, reiterando que esta
participa do processo de estabelecimento e crescimento dessas lesões, através da
estimulação epitelial.
A análise de associação entre a imunomarcação da PDPN e a intensidade do
infiltrado inflamatório revelou que tanto para os casos de CRs, quanto para os casos
de CDs, não houve diferença estatística significativa. Sendo assim, a inflamação
parece não influenciar na imunomarcação da PDPN, nas células epiteliais dessas
lesões. Com isso, pode-se inferir que apesar de ter sido observada maior
imunoexpressão da PDPN em CRs do que em CDs, essa diferença não se mostrou
indicador de distinção entre estas duas lesões, com relação às suas etiologias, uma
vez que nestes últimos esta proteína também apresentou expressão considerável,
independente da intensidade do infiltrado inflamatório.
88
Okamoto et al. (2010) encontraram que nos casos de COOs e CDs, somente
os que estiveram associados com inflamação foram positivos para PDPN, fenômeno
este, segundo os autores, semelhante ao que ocorre com gengivas inflamadas. Nos
casos de CDs, forte positividade para PDPN foi observada nas camadas basais
associadas com intensa resposta inflamatória no tecido conjuntivo, e fraca
positividade foi observada quando uma escassa a moderada reação inflamatória
estava presente. Este trabalho de Okamoto et al. (2010) está em contradição com o
presente estudo, quando da relação da imunoexpressão da PDPN com a
intensidade do infiltrado inflamatório, pois, pode-se observar, que todos os casos de
CDs do estudo atual apresentaram imunomarcação, mesmo tendo 19 casos com
ausente ou leve infiltrado inflamatório (grau 1). O mesmo fenômeno pode ser
relatado para os cistos radiculares, pois, para este, também não houve associação
entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a imunomarcação para PDPN, apesar
de serem reconhecidamente de etiologia inflamatória e a maioria dos casos
apresentarem infiltrado inflamatório grau 3 (intenso). O estudo de González-Alva et
al. (2010) também mostrou resultados contraditórios ao do atual estudo pois os
resultados mostraram imunopositividade para PDPN em apenas 40% dos casos de
CDs, e nestes, a expressão só esteve presente fracamente em áreas com reação
inflamatória.
Com relação à localização celular da imunomarcação da PDPN para ambos
os cistos, predominou a localização membranar e citoplasmática associadas. Com
relação às camadas epiteliais imunopositivas, tanto para os casos de CRs quanto
para CDs, a camada basal foi a que se apresentou mais comumente imunomarcada.
Apesar disto, nos dois cistos analisados, detectou-se que a imunomarcação escore
III para essa proteína está mais associada com positividade em células das
camadas suprabasal e superficial. Sabendo-se que é comumente na camada basal
dos epitélios que se encontra o maior potencial proliferativo, os resultados aqui
encontrados podem indicar que essa proteína está sendo produzida pelas células
epiteliais não só visando estímulos proliferativos, mas também outros processos
necessários ao crescimento cístico relacionados com adesão e vias de sinalização
da matriz extracelular.
O estudo de Zustin, Scheuer e Friedrich (2010) mostrou que em CRs e CDs
observou-se apenas forte imunomarcação membranar e citoplasmática na camada
89
basal epitelial. Este estudo apresentou resultados distintos aos encontrados no
estudo atual, pois neste, apesar de a maioria dos casos de CRs e CDs
apresentarem imunomarcação membranar e citoplasmática associadas, assim como
a camada basal mais comumente imunomarcada, também houve casos com
imunomarcações separadas, somente na membrana e somente no citoplasma,
assim como também houve casos que imunomarcaram a camada suprabasal e a
superficial.
Okamoto et al. (2010) mostraram que os TOCs apresentaram
imunopositividade para PDPN na membrana celular e no citoplasma na maioria das
camadas basais e suprabasais e na periferia dos cistos filhos. Nos casos de COOs e
CDs, somente os casos associados com inflamação foram positivos para
podoplanina. Os autores concluíram que a PDPN é fortemente expressa em TOC
em comparação com COO e CD. O padrão de coloração em TOC pode estar
relacionado com a sua natureza neoplásica e sugere um papel da proteína no
processo de invasão tumoral.
No estudo atual, a maioria dos casos de CDs apresentou imunomarcação
membranar e citoplasmática, sendo mais comumente na camada basal e
suprabasal, resultados estes semelhantes aos encontrados pelos autores acima
citados em TOCs. Com isso, presume-se que a podoplanina participa na formação e
crescimento tanto de TOC quanto de CDs, com imunoexpressões semelhantes.
Como os resultados apresentados no estudo atual sobre a imunoexpressão da
podoplanina foi semelhante para CRs e CDs, acredita-se que essa mesma
suposição pode ser também aplicada para os CRs.
Fundamentando ainda mais essas suposições, o estudo de Zustin, Scheuer e
Friedrich (2010) demonstrou que a PDPN parece estar envolvida em processos
fisiológicos e patológicos, formando extensões celulares alongadas e fibras
odontoblásticas, na transição epitélio-mesênquima durante o desenvolvimento do
germe dentário, assim como em lesões odontogênicas císticas e neoplásicas.
Sugeriram, então, que mecanismos semelhantes de adesão celular, envolvimento
epitélio-mesênquima e crescimento são, provavelmente, envolvidos na formação
destas lesões.
As discrepâncias entre os resultados do presente estudo e dos estudos
citados podem ser explicadas, na maioria dos casos, pela diferença na forma com
90
que foi realizada a análise morfológica, a análise da imunoexpressão celular, uso de
clones diferentes dos anticorpos, assim como diluição, tempo de incubação e
sistema também diferentes. Sabe-se que pequenas variações na técnica de
imunoistoquímica podem contribuir para alterações nos resultados. O estudo de Li et
al. (1993) confirma essa afirmação. Neste estudo, foi comparada a
imunorreatividade de quatro anticorpos monoclonais anti-EGFR comercialmente
disponíveis. Os resultados demonstram que os revestimentos epiteliais de todos os
tipos de cisto odontogênico analisados expressaram receptores de EGF, embora a
intensidade e o padrão de coloração variaram de acordo com o tipo de anticorpo
monoclonal utilizado. Adicionalmente, o reduzido número de casos utilizados pelos
estudos com resultados contraditórios, também pode ter contribuído para essas
diferenças nos resultados.
Como já é estabelecido o EGFR está envolvido no processo de proliferação
epitelial também em CRs e CDs, fato que foi confirmado pelos resultados
encontrados no presente estudo. Porém, a análise isolada da imunoexpressão da
PDPN indica que esta proteína participa do processo de estimulação epitelial em
CRs e CDs, porém, não é possível afirmar que está envolvida diretamente no ciclo
celular, pois segundo os resultados do estudo de Tsuneki et al. (2012) foi sugerido
que esta glicoproteína também possa estar envolvida na remodelação de moléculas
de sinalização de matriz extracelular, que é eventualmente relacionada com o
crescimento celular. Portanto, ela não é sempre diretamente envolvida no ciclo
celular em si, mas serve como uma das moléculas chave, que incluem as vias de
sinalização de moléculas de matriz extracelular para a proliferação celular. Assim,
para ajudar a desvendar o envolvimento da PDPN na estimulação epitelial de CRs e
CDs, novos estudos são necessários, correlacionando a imunoexpressão dessa
proteína com a de outras moléculas relacionadas com a adesão, proliferação celular
e vias de sinalização da matriz extracelular.
25
Conclusões
92
7 CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no presente estudo suportam as seguintes
conclusões:
1. A marcante expressão tanto do EGFR quanto da PDPN em CRs e CDs indica
importante participação destas proteínas na patogênese destas lesões
através da estimulação epitelial;
2. A imunoexpressão do EGFR e da PDPN em CRs e CDs parece não sofrer
influência direta da intensidade do infiltrado inflamatório;
3. Os CRs parecem expressar PDPN de forma mais intensa do que os CDs;
4. Apesar de ter sido observada maior imunoexpressão da PDPN em CRs do
que em CDs, essa diferença não se mostrou indicador de distinção entre
estas duas lesões, com relação às suas etiologias, uma vez que nestes
últimos esta proteína também apresentou expressão considerável,
independente da intensidade do infiltrado inflamatório.
25
Referências
94
REFERÊNCIAS
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25
Apêndices
101
APÊNDICE A
Ficha para coleta dos dados histopatológicos
( ) Cisto Dentígero ( )Cisto Radicular
Nº do caso
Grau 1
(ausente ou leve infiltrado inflamatório)
Grau 2
(moderado infiltrado
inflamatório)
Grau 3 (intenso infiltrado
inflamatório) 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
102
APÊNDICE B
Ficha para coleta dos dados Imunoistoquímicos
( ) Cisto Dentígero ( )Cisto Radicular
( ) EGFR ( )D2-40
Nº do caso
Escore I (0-5% de células
positiva)
Escore II (5-50% de
células positivas)
Escore III (Maior que
50% de células
positivas)
Localização celular da
imunomarcação
Camadas epitelias
imunomarcadas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
25
Anexo
104
ANEXO A
105
106