otimizaÇÃo da extraÇÃo de ficocianina de spirulina … · 2018-08-28 · resumo otimizaÇÃo da...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
CAMPUS UNIVERSITÁRIO PROF. ANTÔNIO GARCIA FILHO
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA DE LAGARTO
HEITOR DIKSON RODRIGUES MEIRELES
OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE FICOCIANINA DE
Spirulina platensis
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Lagarto, Sergipe
Abril, 2018
HEITOR DIKSON RODRIGUES MEIRELES
OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE FICOCIANINA DE Spirulina platensis
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Farmácia do Campus de Lagarto da Universidade Federal de Sergipe, como requisito para obtenção do diploma de Bacharel em Farmácia.
Orientador: Prof. Dr. James Almada da Silva
Lagarto, Sergipe
Abril, 2018
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus por ele estar presente em nossas
vidas em todos os momentos, por ele me guiar nesse mundo, nas minhas escolhas
e por me iluminar quando parecia algo confuso. “Tudo posso naquele que me
fortalece” (Filipenses, 4-13). Com Deus tudo fica mais fácil, pois ele nos fortalece e
nos mostra o caminho a ser seguido sempre.
Agradecer aos meus pais (Roberto e Simone), pelos ensinamentos, conselhos e a
sempre confiar em mim e acreditarem no meu sonho. Sei que não foram fáceis
esses cinco anos de universidade, mas espero orgulha-los com uma conduta ética e
profissional sempre. Agradecer a minha irmã (Larissa), que hoje está morando fora,
mas quando precisei me ajudou nessa caminhada universitária. Gostaria de
agradecer também a minha família pelo apoio que sempre me deram em especial ao
meu avô (José), que eu tenho muito orgulho, pois se eu escolhi fazer uma faculdade
foi por causa dele. Amo todos vocês.
Agradecer a todos os meus amigos que eu fiz nessa minha trajetória em Lagarto,
porém, não esquecendo dos meus amigos de infância, da época de escola (CEPJSS
e SALESIANO), dentre outros. Em especial, agradecer a uma amiga que se tornou
minha namorada (Yasmin), pois foi ela quem me apoiou quando eu ficava
estressado com a faculdade, que me acalmou e me deu forças para seguir em frente
e concluir o curso, além de ler meu TCC inúmeras vezes e se tornar “expert” em
ficocianina.
Agradecer a todos os professores pelos ensinamentos dentro da sala de aula,
laboratório, ou até mesmo para falar da vida. Em especial, gostaria de agradecer ao
meu orientador James, por ter confiado em mim, ter tido muita paciência comigo, por
me fazer evoluir academicamente e por me fazer gostar mais de química do que já
gostava. Gostaria de agradecer a minha banca por aceitarem me avaliar, e obrigado
pelas sugestões e criticas construtivas.
Enfim, gostaria de agradecer a todos que de uma forma ou outra me ajudaram a
concluir essa vida acadêmica. Muito obrigado.
RESUMO
OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE FICOCIANINA DE Spirulina platensis
Heitor Dikson Rodrigues Meireles, Lagarto, 2018.
A Spirulina platensis é uma microalga azul-esverdeada fotossintetizante que
apresenta além da clorofila A, os pigmentos: luteína, β-caroteno e ficobiliproteínas,
sendo que a principal proteína é a ficocianina. Essa ficobiliproteína possui
propriedades terapêuticas importantes, tais como antioxidante, anti-inflamatória e
anticancerígena, além de possuir características cromóforas que a tornam
promissora na aplicação em diagnósticos. Devido a sua importância terapêutica e
nutricional, a S. platensis tem sido foco de importantes pesquisas biotecnológicas.
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar a extração de ficocianina da
espécie S. plantesis. A técnica de extração empregada foi a maceração dinâmica,
além das técnicas de pré-tratamento (turbo-extração, ultrassom e micro-ondas). O
tempo de extração para as técnicas que foram utilizadas como pré-tratamento foi de
90 s, enquanto que para a maceração foi de 6, 24 e 48 h. A extração foi realizada
utilizando a alga seca e pulverizada, cultivada em laboratório, com diferentes
solventes. Alíquotas foram retiradas em determinados períodos de tempo,
centrifugadas e analisadas em espectrofotômetro (615 e 652 nm). Em seguida
determinou-se a quantidade de ficocianina extraída em cada condição. A melhor
técnica de extração em termos de rendimento foi utilizada para a obtenção do
extrato, que foi purificado utilizando a partição em três fases (TPP). Obteve-se como
melhor resultado a quantidade de ficocianina equivalente a 19,10 ± 3,37 mg/g, por
maceração dinâmica (48h) utilizando água destilada como solvente extrator, sem
pré-tratamento. A associação da maceração com outras técnicas de extração não se
mostrou vantajoso. Portanto, um elevado rendimento de extração, ainda é obtido
utilizando o clássico método extrativo, a maceração dinâmica. O extrato purificado
por TPP atingiu uma pureza 17% maior do que o extrato bruto. Têm-se como
perspectiva ainda, contribuir com a introdução dos métodos de extração e
purificação do pigmento proteico no mercado farmacêutico/alimentício.
Palavras-Chave: microalga, ficobiliproteínas, técnicas de extração.
ABSTRACT
OPTIMIZATION OF PHYCOCYANIN EXTRACTION OF Spirulina platensis
Heitor Dikson Rodrigues Meireles, Lagarto, 2018.
Spirulina platensis is a blue-green photosynthetic microalga that exhibits, in addition
to chlorophyll A, pigments: lutein, β-carotene and phycobiliproteins, the main protein
being phycocyanin. This phycobiliprotein has important therapeutic properties, such
as antioxidant, anti-inflammatory and anticancer, besides having chromophores
characteristics that make it promising in the application in diagnostics. Due to its
therapeutic and nutritional importance, S. platensis has been the focus of important
biotechnological research. Therefore, the objective of this work was to optimize the
extraction of phycocyanin from the S. platensis species. The extraction technique
employed was dynamic maceration, in addition to pre-treatment techniques (turbo-
extraction, ultrasound and microwave). The extraction time for the techniques that
were used as pre-treatment was 90 s, while for maceration it was 6, 24 and 48 h. The
extraction was carried out using dry and pulverized seaweed, cultivated in the
laboratory, with different solvents. Aliquots were collected at certain periods of time,
centrifuged and analyzed in a spectrophotometer (615 and 652 nm). The amount of
phycocyanin extracted in each condition was then determined. The best extraction
technique in terms of yield was used to extract the extract, which was purified using
the three-phase partition (TPP). The amount of phycocyanin equivalent to 19.10 ±
3.37 mg/g was obtained as the best result by dynamic maceration (48 h) using
distilled water as the extracting solvent, without pretreatment. The association of
maceration with other extraction techniques did not prove to be advantageous.
Therefore, a high yield of extraction, is still obtained using the classic extractive
method, the dynamic maceration. The extract purified by TPP achieved a purity 17%
greater than the crude extract. It is also intended to contribute to the introduction of
methods of extraction and purification of protein pigment in the pharmaceutical/food
market.
Key words: microalgae, phycobiliproteins, extraction techniques.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microscopia das principais microalgas. ..................................................... 14
Figura 2. Alguns produtos comerciais a base de microalgas. ................................... 14
Figura 3. Micrografia da Spirulina platensis. ............................................................. 17
Figura 4. Organização estrutural da ficobilissoma. ................................................... 18
Figura 5. Estrutura cristalina da ficocianina (1GH0). ................................................ 19
Figura 6. Estrutura química da ficobilina: cromóforo presente na estrutura da
ficocianina. ............................................................................................................... 19
Figura 7. Estrutura celular das cianobactérias, como a S. platensis. ........................ 20
Figura 8. . Produto vendido no Brasil à base de Spirulina, mostrando alguns
benefícios. ............................................................................................................... 21
Figura 9. S. platensis seca e pulverizada. ................................................................ 29
Figura 10. Fotografia do sistema utilizado na maceração da S. platensis em pó. ..... 32
Figura 11. Modelo esquemático da técnica TPP. ..................................................... 35
Figura 12. Comparação da eficiência de extração (%) ao longo do tempo, por
maceração dinâmica como técnica, utilizando os solventes extratores: agua
destilada, PBS, etanol 20%, etanol 40% e água do mar, à 25°C. ............................. 38
Figura 13. Eficiência de extração da ficocianina utilizando turbólise (T), ultrassom
(US), micro-ondas (MO) (90 s) e maceração dinâmica (MACd) por 30 minutos a
25°C. ........................................................................................................................ 40
Figura 14. Quantidade de ficociania extraída (QFCE) utilizando turbo-extração,
ultrassom e micro-ondas (90 s) associadas à maceração dinâmica (6 h) e por
maceração dinâmica (MACd) a 25°C.. .................................................................... 41
Figura 15. Quantidade de ficocianina extraída em 48 h utilizando MACd, 25°C. ...... 43
Figura 16. Fotografia dos extratos obtidos no início da extração e nos tempos de 24
e 48 h, evidenciando as diferentes intensidades de cor das soluções obtidas após a
extração da ficocianina por maceração dinâmica/agitação magnética. .................... 44
Figura 17. Extração de ficocianina utilizando agitação orbital (180 rpm) nas
temperaturas de 30, 40 e 50°C ................................................................................ 44
Figura 18. Estabilidade da ficocianina em diferentes temperaturas por um período de
24 h .......................................................................................................................... 47
Figura 19. A formação das 3 fases do TPP .............................................................. 49
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Taxonomia da Spirulina platensis. ......................................................... .16
Quadro 2. Condições utilizadas na otimização de extração da ficocianina... .. ..........30
Quadro 3. Solventes utilizados na extração de ficocianina por maceração...............31
Quadro 4. Quantidade de ficocianina extraída utilizando diferentes técnicas............41
Quadro 5. Melhores rendimentos de extração da ficocianina de outros autores,
comparando com o presente trabalho........................................................................46
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 13
2.1 Microalgas ...................................................................................................... 13
2.2 Spirulina platensis ........................................................................................... 17
2.2.1 Importância farmacológica da S. platensis e de seu principal pigmento....20
2.2.2 Importância industrial da ficocianina...........................................................23
2.3 Técnica de extração e purificação de pigmentos proteicos ............................. 24
3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 28
3.1. Objetivo geral ................................................................................................. 28
3.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 28
4. MATERIAL E METÓDOS .................................................................................... 29
4.1 Microalga e condições de cultivo .................................................................... 29
4.2 Parâmetros utilizados na extração da ficocianina a partir da S. platensis ....... 30
4.2.1 Extração por maceração dinâmica utilizando diferentes solventes............31
4.2.2 Pré-tratamento utilizando turbo-extração, ultrassom e micro-
ondas...................................................................................................................32
4.2.3 Extração da ficocianina com maceração dinâmica utilizando agitação
magnética e agitação orbital................................................................................33
4.2.4 Extração da ficocianina com maceração dinâmica utilizando agitação
orbital e diferentes temperaturas.........................................................................33
4.3 Análise de estabilidade térmica da ficocianina ................................................ 33
4.4 Análise espectrométrica da ficocianina nos extratos ....................................... 34
4.5 Quantificação da ficocianina ........................................................................... 34
4.6 Purificação da ficocianina ............................................................................... 35
4.7 Análise estatística ........................................................................................... 36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 37
5.1 Avaliação dos diferentes solventes extratores na extração de ficocianina ...... 37
5.2 Avaliação do pré-tratamento na extração de ficocianina utilizando diferentes
técnicas de extração ............................................................................................ 39
5.3 Avaliação da extração de ficocianina utilizando a maceração dinâmica
(agitação magnética e orbital) ............................................................................... 42
5.4 Avaliação da estabilidade da ficocianina ......................................................... 47
5.5 Purificação da ficocianina ............................................................................... 48
6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 51
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 52
11
1. INTRODUÇÃO
O interesse de pesquisadores no estudo de microrganismos tais como
bactérias e alguns fungos deve-se a importância destes nas diversas cadeias
tróficas e na possibilidade da aplicação comercial. Por meio da obtenção de
metabólitos de interesse industrial, esses microrganismos podem ser aplicados em
distintas áreas como na nutrição e na saúde humana e animal (DERNER et al.,
2006).
A microalga Spirulina platensis tem sido o foco de importantes pesquisas
biotecnológicas, devido, principalmente, a sua importância nutricional. Esta
microalga tem um grande potencial na produção de produtos alimentícios e de
materiais nutricionais relacionados, tais como corantes, vitaminas, e ácidos graxos
como o ácido linoleico (ômega-3) (ANTELO et al., 2010).
A S. platensis é uma microalga verde-azulada, classificada como
cianobactéria, que possui pigmentos fotossintéticos incluindo clorofila A, luteína, β-
caroteno e ficobiliproteínas. As principais ficobiliproteínas são: ficocianina,
aloficocianina e ficoeritrina. O pigmento mais abundante e importante das
ficobiliproteínas é a ficocianina, que possui várias propriedades terapêuticas,
incluindo atividades antioxidante (20 vezes mais ativa do que o ácido ascórbico),
anti-inflamatória e anticancerígena (SUBHASHINI et al., 2004; MORAES et al., 2007;
SILVA, 2008; DATLA et al., 2011).
O “Food Drugs Admnistration” (FDA) autorizou, em 1981, o consumo da
ficocianina no EUA, pois determinou que por ser uma boa fonte de nutrientes, pode
ser comercializada legalmente como suplemento alimentício. Já no Brasil ainda não
há essa legalização por parte da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
Entretanto, permite-se a comercialização da Spirulina, desde que o produto final
contendo o microrganismo esteja devidamente registrado. Espirulina é o nome
comercial utilizado no Brasil, porém, pode ser utilizado Spirulina também (BARROS,
2010; BRASIL, 2016). Segundo Ambrosi e colaboradores (2008), a ficocianina
apresenta um perfil nutricional que a torna ideal como suplemento alimentar, pois
substitui satisfatoriamente as fontes artificiais de nutrientes, por combinar diversos
constituintes de maneira equilibrada.
12
O valor econômico da ficocianina no mercado varia de US$ 3 – 25 por mg,
para o pigmento bruto, e até US$ 1500 por mg para o pigmento purificado. Esses
valores tornam a ficocianina um pigmento proteico caro, estimando esse valor a uma
possível dificuldade em seu processo de extração e purificação (SILVA, 2008;
CHAIKLAHAN et al., 2012).
O método de extração utilizado é de suma importância na obtenção desses
pigmentos proteicos. A extração de ficobiliproteínas envolve a ruptura da parede
celular, extremamente resistente, e a liberação das proteínas para o meio extrator.
Já foram testados vários métodos de extração, tais como: técnicas que permitem
variações na pressão osmótica, condições abrasivas, além de diferentes tratamentos
químicos utilizando maceração, congelamento-descongelamento e sonicação
(MORAES et al., 2011).
Um dos métodos bastante utilizado por diferentes autores é a maceração.
Silveira e colaboradores (2007), por meio da maceração, obtiveram um rendimento
de ficocianina de 113,5 mg/g, utilizando a água destilada por 72h, a temperatura
ambiente.
A indústria tem um grande interesse em desenvolver tecnologias inovadoras
que além de apresentarem baixo custo, sejam capazes de promover maior
rendimento, rapidez e eficiência no processamento industrial sem, principalmente,
agredir o meio ambiente.
Nesse contexto, o presente trabalho visou otimizar o processo de extração da
ficocianina a partir da espécie S. platensis, utilizando a turbo-extração, ultrassom,
micro-ondas (como pré-tratamento) e maceração dinâmica, na tentativa de aumentar
o rendimento da extração da proteína quando comparado com outros trabalhos.
Como possivelmente o valor econômico da ficocianina deve-se ao alto custo do
processo de extração e purificação, é necessário que encontre métodos extrativos
rentáveis e que consiga extrair uma grande quantidade da proteína, utilizando
técnicas de extração individuais e/ou em associação. Além da otimização do
processo de extração, o presente trabalho visa a purificação da ficocianina através
da técnica de extração em três fases (TPP) (OLIVEIRA et al., 2016).
13
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Microalgas
O aumento do interesse de pesquisadores no estudo de microrganismos
como fungos e bactérias, incluindo as microalgas, deve-se a importância destes nas
diversas cadeias tróficas e na possibilidade da aplicação comercial em distintas
áreas, tais como nutrição, saúde humana e animal, entre outras aplicações. Dentro
desse contexto estes produtos naturais podem ser utilizados para a obtenção de
compostos de alto valor agregado, de interesse das indústrias alimentares, químicas
e farmacêuticas. Quando comparado com vegetais e animais, as microalgas têm
como vantagens: o cultivo contínuo e a rápida multiplicação desses microrganismos.
Além das inúmeras aplicações desses microrganismos, leva-se em conta também o
seu baixo custo de produção (DERNER et al., 2006; SILVA, 2008).
Para ser considerada uma microalga, o organismo precisa ser unicelular e ter
dimensões que variem de algumas a poucas centenas de micrômetros.
Normalmente são coloridos, devido à presença de pigmentos proteicos e pigmentos
acessórios. As microalgas são microrganismos capazes de realizar fotossíntese,
pois possuem clorofila A e outros pigmentos fotossintéticos. Têm sido
tradicionalmente classificadas quanto aos tipos de pigmentos, a natureza química
dos produtos de reserva e pelos constituintes da parede celular. Também têm sido
considerados aspectos citológicos e morfológicos, tais como a ocorrência de células
flageladas, a estrutura dos flagelos, os processos de formação do núcleo e da
divisão celular, a presença e a caracterização de envoltório do cloroplasto e a
possível conexão entre o retículo endoplasmático e a membrana nuclear. Além
disso, as microalgas são classificadas em procariontes e eucariontes (DERNER et
al., 2006; OSHE et al., 2007; MORAES, 2007).
Ohse e colaboradores (2007) classificaram as microalgas de acordo com as
características acima citadas, e conforme a abundância. Estes pesquisadores
descreveram as quatro classes mais importantes (Figura 1), que são: diatomáceas
(Bacillariophyceae), algas verdes (Chlorophyceae), algas verde-azuladas
(Cyanobacteria) e algas douradas (Chrysophyceae).
14
Figura 1. Visão microscópica das principais microalgas.
A) Bacillariophyceae (Fonte: AO MAR BIOLOGICO, 2017); B) Chlorophyceae (Fonte: WIKWAND, 2017);
C) Cyanobacteria (Fonte: WRITEOPINIONS, 2017), D) Chrysophyceae (Fonte: PENARD, 2017).
Atualmente, as microalgas vêm sendo bastante utilizadas como fonte de
alimento para animais aquáticos e terrestres. O valor nutricional das microalgas e de
sua biomassa inclui o uso como corante em aquicultura, e na dieta humana como
suplemento, devido a sua alta quantidade de pigmentos, proteínas e ácidos graxos
poli-insaturados. O mercado de cosméticos, alimentos, produtos farmacêuticos têm
consequentes benefícios de uma gama crescente de produtos a partir de microalgas
(Figura 2) (GUEDES et al., 2011).
Figura 2. Produtos comerciais a base de microalgas.
(Fonte: LUCKYVITAMIN, 2017; VITAMINSHOPPE, 2017; IHERB, 2017).
A maioria das microalgas encontradas são algas verdes ou verde-azuladas.
Estas algas usam energia solar, dióxido de carbono e minerais para o seu
A B
C D
15
crescimento. Dentre elas, a microalga verde-azulada S. platensis se destaca como
alimento por ser facilmente digerida e absorvida pelo corpo humano, uma vez que
sua membrana celular não conter celulose (SEO et al., 2013).
Os primeiros relatos do uso de Spirulina spp. na alimentação datam da pré-
história, a partir da informação de que tribos de caçadores coletavam massas
gelatinosas de algas verde-azuladas e as consumiam cruas ou cozidas. Para
enriquecer suas dietas, também consumiam algas filamentosas coletadas em lagos
alcalinos, as quais foram classificadas no gênero Spirulina (AMBROSI et al., 2008).
A microalga Spirulina foi utilizada em programas espaciais, sendo
recomendada pela National Aeronautics and Space Administration (NASA) como
suplemento alimentar primário durante as missões. Atualmente, a Spirulina possui
status GRAS (Generally Regarded As Safe), isto é, produto geralmente reconhecido
como seguro, sendo a microalga (ou cianobactéria) mais estudada em todo mundo.
No Brasil, pesquisas estão sendo conduzidas para sua utilização como aditivo
alimentar em diferentes produtos e na merenda escolar devido a um projeto de
pesquisadores do sul, com parcerias entre os setores público e privado (WALTER,
2011; OLIVEIRA, 2012).
A Spirulina possui vitaminas, proteínas e minerais, dentre eles um alto teor de
ferro. Os polissacarídeos purificados e a ficocianina da S. platensis influenciam a
proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas comprometidas
e podem diminuir o grau anêmico de camundongos. Um estudo realizado com ratos
alimentados com Spirulina revelou que estes absorveram 60% mais ferro do que os
ratos que utilizaram o suplemento sulfato ferroso. Já para humanos, foi realizado no
Japão um estudo com oito mulheres jovens que haviam se tornado anêmicas por
restrições alimentares, e após ingestão de 4 g de Spirulina depois de cada refeição
durante 30 dias, houve aumento no conteúdo de hemoglobina de 10.9 para 13.2
g/dL. A terapia medicamentosa da anemia por via oral, frequentemente apresenta
efeitos colaterais, principalmente gastrointestinais, como náuseas, vômitos,
epigastralgia, diarreia e constipação. Em aproximadamente 10 a 40% dos pacientes,
a intolerância é tão intensa que inviabiliza o tratamento, e com a Spirulina isso não
aconteceu. A Spirulina é a fonte mais rica de vitamina B12 já estudada (JIANG et al.,
2017; WALTER, 2011; OLIVEIRA, 2012).
16
O gênero Spirulina, também conhecido como Arthrospira, faz parte do reino
Bactéria, classe Cyanophyceae e família Oscillatoriaceae, como pode ser observado
no Quadro 1 (SILVA, 2008).
Quadro 1. Taxonomia da Spirulina platensis.
Reino Bactéria
Filo Cyanobacterium
Classe Cyanophyceae
Ordem Nostocales
Família Oscillatoriaceae
Gênero Spirulina
(Fonte: Elaborado pelo autor).
O gênero Spirulina está inserida no filo Cyanobacterium, também conhecido
como grupo das microalgas verde-azuladas, e apresenta diversas espécies, dentre
elas S. platensis, S. maxima, S. fusiformis e S. major. As cianobactérias também
podem ser chamadas de extremófilas, pois podem ser encontradas em uma
variedade de condições extremas, incluindo temperaturas entre -20 e 75 ºC, embora
seu crescimento seja lento nestas condições. As condições de crescimento como
temperatura e luminosidade parecem não afetar a ultraestrutura da parede celular
das microalgas (AMBROSI et al., 2008; BERTOLIN et al., 2011a; SEO et al., 2013;
SINGH et al., 2015).
As espécies S. platensis e S. maxima são as mais estudadas para uso na
alimentação humana por apresentarem perfil nutricional que as torna ideal como
suplemento alimentar, pois substituem satisfatoriamente as fontes artificiais de
nutrientes, por combinarem diferentes constituintes de maneira equilibrada. A
ANVISA recomenda a ingestão diária máxima de 1,6 g de S. platensis para uma
pessoa adulta (AMBROSI et al., 2008; SILVA, 2008; BERTOLIN et al., 2011a).
17
2.2 Spirulina platensis
A Spirulina é encontrada, geralmente, em lagoas tropicais e subtropicais na
África e nas Américas Central e do Sul. A S. platensis têm como locais de habitação
as águas tropicais e subtropicais caracterizado por elevados níveis de carbonato e
bicarbonato, sendo encontrada nos mais diferentes ambientes como águas salobras,
mar, piscinas de maré, lagoas salinas, águas subárticas, lagoas tropicais, e fontes
de águas termais. Ainda, estes organismos são capazes de adaptar-se a condições
ambientais extremas (GADELHA, 2013; RODRIGUES, 2017).
A estrutura celular da S. platensis é semelhante a de outros organismos
procariontes, pois é caracterizada pela ausência de um núcleo morfologicamente
delineado ou plastídio, envolvido por uma parede celular gram-negativa
(RODRIGUES, 2017).
A S. platensis possui filamentos helicoidais (Figura 3) com comprimento de
aproximadamente 200-300 μm e 5-10 μm de largura. As suas paredes celulares são
muito resistentes, sendo necessária uma força maior para poder quebrá-las (SILVA,
2008).
Figura 3. Micrografia dos filamentos helicoidais de Spirulina platensis (Fonte: WALTER, 2011).
Na Figura 3, pode ser observada a micrografia de um filamento da S.
platensis com a presença de seus tricomas num sistema helicoidal contínuo, onde
também é possível constatar as seções transversais que dividem os tricomas em
18
células e a fina capa que os cobrem, na forma de sutis nervuras entrelaçadas
(WALTER, 2011).
Essa espécie é conhecida por ter vantagens nutricionais devido ao teor de
proteína de alta qualidade e outros componentes, tais como vitaminas, minerais, e
ácidos graxos essenciais, incluindo ácido α-linoleico (ômega-3). É composta por 55-
70% de proteína, 6-9% de gordura e 15-20% de carboidratos (ANTELO et al., 2010;
DATLA et al., 2011; FIGUEIRA et al., 2012).
A S. platensis possui vários pigmentos fotossintéticos incluindo clorofila A,
luteína, β-caroteno e ficobiliproteínas que fazem parte da família de proteínas
pigmentadas solúveis em água de cores brilhantes. As principais ficobiliproteínas
são a ficocianina, aloficocianina e ficoeritrina, como pode ser observado na Figura 4,
dentro de uma estrutura denominada ficobilissoma (MORAES et al., 2007;
FIGUEIRA et al., 2012; SONANI et al., 2016).
As ficobiliproteínas estão localizadas nas ficobilissomas (Figura 4), os quais
estão situadas sobre a superfície externa da membrana do tilacoide e atuam como
importantes pigmentos fotossintéticos acessórios, participando de um conjunto de
transferência de energia muito eficiente na fotossíntese, sendo responsável por
cerca de 50% da captação de luz a partir de cianobactérias (MORAES et al., 2011;
HORVÁTH et al., 2013).
Figura 4. Organização estrutural do ficobilissoma (Fonte: Adaptado de SONANI, 2016).
Das três ficobiliproteínas, a ficocianina (Figura 5) é a mais pesquisada e
estudada, pois pode chegar a 20% em peso seco de microalga, e possui
19
características importantes tais como: boa solubilidade em água, alta estabilidade na
faixa de pH 5-7, coloração azulada e fluorescência, característica que a torna
promissora na aplicação em diagnósticos (BERTOLIN et al., 2011b, SONANI, 2017).
Figura 5. Estrutura cristalina da ficocianina (1GH0) (PDB, 2017).
A coloração azulada da ficocianina se dá devido aos grupos prostéticos, que
fazem parte de sua estrutura. Estes grupos prostéticos são cromóforos com
estrutura química tetrapirrólica de cadeia aberta (Figura 6), denominados ficobilinas.
As proteínas contendo cromóforo têm capacidade de absorver e transferir a luz solar
em direção ao fotossistema com ótimo rendimento quântico. Com base na sua faixa
de absorção de luz, as ficobiliproteínas são subdivididas em três principais sub-
classes, ficoeritrina (PE, λmax: 540-560 nm), ficocianina (PC, λmax: 610-620 nm) e
aloficocianina (APC, λmax: 650-655 nm) (FIGUEIRA, 2014; SONANI, 2017).
Figura 6. Estrutura química da ficobilina: cromóforo presente na estrutura da ficocianina.
(Chemsketch, ACDLabs®). (Fonte: Elaborado pelo autor).
Um número crescente de estudos sugere que a ficocianina pode ser usada na
nutracêutica devido aos seus efeitos antimicrobianos, anti-inflamatórios,
NH
NNH
NH
O
COOHCOOH
O
20
antioxidantes, neuroprotetores e hepatoprotetores. No entanto, essas propriedades
diferem entre ficobiliproteínas de origens diferentes devido à variação em suas
sequências de proteínas (LIANG, 2017; SONANI, 2017).
O método de extração é de suma importância para obter o máximo de
pigmentos proteicos. A extração de ficobiliproteínas envolve a ruptura de células e
liberação das proteínas. As paredes celulares das cianobactérias possuem
multicamadas (Figura 7) que são extremamente resistentes, por isso, vários métodos
de extração em condições extremas já foram utilizados. Variações na pressão
osmótica, condições abrasivas, tratamento químico, congelamento-
descongelamento e sonicação, entre outros métodos de ruptura já foram avaliados
(ZHU et al., 2007; MORAES et al., 2011).
Figura 7. Estrutura celular das cianobactérias (Fonte: UNIVERSIAENEM, 2017).
2.2.1 Importância farmacológica da S. platensis e de seu
principal pigmento
A ação da Spirulina spp. foi comprovada em nível experimental in vivo e in
vitro, onde verificou-se sua eficácia como antimicrobiano, antiviral, imunoestimulante,
anti-inflamatória, antioxidante, anticarcinogênico, além de ser utilizado na prevenção
de envenenamento por metais pesados. Além dessas atividades, ela atua também
na redução de lipídios e glicose no sangue e redução da pressão sanguínea
(AMBROSI et al., 2008; CHAIKLAHAN et al., 2012; SALGUEIRO et al., 2017).
21
No Brasil pode-se encontrar no mercado com o nome espirulina ou spirulina.
Geralmente vendidos em lojas de suplementação e com propagandas acerca de
seus benefícios farmacológicos (Figura 8) (BARROS, 2010).
Figura 8. Produto vendido no Brasil à base de Spirulina, mostrando alguns benefícios dela (Fonte:
NUTRIUMEF, 2018).
As ficobiliproteínas presentes na S. platensis são utilizadas principalmente
como corantes, porém, pesquisas mostram que as mesmas possuem propriedades
biológicas importantes. O pigmento mais abundante e importante entre as
ficobiliproteinas é a ficocianina. A primeira e mais importante aplicação é como
pigmento alimentício, substituindo pigmentos sintéticos, no entanto apresenta outras
aplicações, pelo fato de apresentar diversas atividades biológicas (SILVA, 2008;
SUBHASHINI et al., 2004).
A ficocianina apresenta efeitos benéficos no sistema imunológico, atuando no
aumento do número de leucócitos na corrente sanguínea, o que faz com que esta
proteína possa atuar como imunomodulador. A sua ação anti-inflamatória tem sido
demonstrada através da inibição da enzima ciclo-oxigenase 2 (COX-2). Este
pigmento causou aumento da proliferação e diferenciação de células
hematopoiéticas da medula óssea, aumentando assim os níveis de várias citocinas
tais como IL-1ß, IFN-g, GMCSF e IL-3, mostrando potenciais benefícios para a
melhoria do sistema imunológico enfraquecido causado pelo uso de drogas tóxicas
(DATLA et al., 2011; FIGUEIRA et al., 2012; CHAIKLAHAN et al., 2012).
22
A ficocianina mostrou uma maior capacidade de inibição de peróxidos,
comparada a outros antioxidantes naturais, possuindo atividade antioxidante 20
vezes maior que o ácido ascórbico. Quando colocada em contato com sistemas
formadores de radicais livres, a mesma demonstrou capacidade de sequestrar os
radicais hidroxila, causando um efeito inibitório da peroxidação lipídica (SPOLAORE
et al., 2006; SEKAR & CHANDRAMOHAN, 2008; BERTOLIN et al., 2011b).
A ficocianina tem sido estudada por seu efeito anti-câncer em tumores sólidos
malignos. Existem pesquisas que têm mostrado que a ficocianina desempenha um
papel anti-câncer eficaz e seletivo em vários tipos de células cancerígenas (como
câncer de mama, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de cólon, leucemia e
câncer de medula óssea e assim por diante) in vitro e in vivo. A maioria das drogas
com propriedades anticancerígenas é derivada de compostos naturais. Entre elas, a
ficocianina desempenha um efeito antiproliferação e pró-apoptótica em diferentes
linhagens de células cancerígenas in vitro (GARDEVA et al., 2014; JIANG et al.,
2017; RAMAKRISHNAN, 2013).
A ficocianina é capaz de ativar a via apoptótica (a via mitocondrial/citocromo
C), ativar a caspase e induzir a clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-
1). Além disso, a ficocianina pode alterar o potencial de membrana mitocondrial
(MMP), que pode estimular a liberação do citocromo c e promover a formação de
espécies reativas de oxigênio (ROS), levando à apoptose de células cancerígenas.
A ficocianina pode afetar a progressão do ciclo celular do câncer, levando à parada
do ciclo celular. A parada do ciclo celular na fase G0/G1 foi descrita no câncer de
mama MDA-MB-231, no câncer de cólon HT29 e no adenocarcinoma A549 (JIANG
et al., 2017; RAMAKRISHNAN, 2013).
Com relação a outras propriedades anticancerígenas, observou-se um efeito
na proliferação de linhas de células HCC (carcinoma hepatocelular), inibindo o
crescimento de células HCC sensíveis e resistentes à doxorrubicina. Estes estudos
indicam uma diminuição de 50% na proliferação de células de S- e R-HepG2. A
linhagem celular Hep G2 foi derivada do tecido do fígado de uma pessoa com
carcinoma hepatocelular. Geralmente, essa linhagem celular é usada para estudo do
metabolismo do fígado, bem como hepatocarcinogênese (ROY et al., 2007).
Os medicamentos anticancerígenos tradicionais são frequentemente
acompanhados por efeitos secundários graves e meias-vidas curtas e eficazes in
23
vivo. Quando combinada com outras drogas anticâncer e radiação, a ficocianina
poderia reduzir a dose efetiva de drogas anticâncer, melhorando a segurança e
eficácia de um único medicamento, além de minimizar os efeitos colaterais e
melhorar o efeito terapêutico A549 (JIANG et al., 2017; RAMAKRISHNAN, 2013).
A ficocianina purificada da Spirulina platensis enriquecida em selênio (Se-PC)
foi identificada como um agente antiproliferativo potente em células A375 de
melanoma humano e células MCF-7 de adenocarcinoma de mama humano. O Se-
PC induz apoptose pelo acúmulo de células sub-G1 e condensação nuclear,
fragmentação de DNA em ambas as células A375 e MCF7 (RAMAKRISHNAN,
2013).
Apesar de todas essas evidências, é importante ressaltar que a ficocianina
não é utilizada atualmente como droga anticâncer para uso clínico. Apesar do
interesse e do mecanismo da ficocianina terem sido estudados diversas vezes,
ainda é indispensável a investigação do mecanismo molecular da ficocianina na
morte de células cancerígenas (JIANG et al., 2017).
Estudos mostram que ficocianina não possui atividade tóxica, pois possui uma
DL50 > 30 g/kg (em ratos). Em experimentos no qual foi administrado ficocianina em
ratos, esse pigmento não exerceu nenhum efeito adverso sobre o peso corporal,
dieta e água. Outro ponto avaliado em testes com ratos foi que, glóbulos vermelhos,
plaquetas, glóbulos brancos, transaminase glutâmico-pirúvica (TGP), transaminase
glutâmico-oxalacética (TGO), fosforonoesterase alcalina, bilirrubina total e creatinina
sérica estiveram dentro da faixa normal (LIU et al., 2016).
Na avaliação tecidual dos órgãos de ratos, não foi notado nenhum inchaço,
necrose ou reação inflamatória no fígado, baço, rim ou qualquer outro importante
órgão. Esses resultados são importantes para indicar que a administração oral de
ficocianina não provoca toxicidade hepática, já que o fígado é responsável por
inúmeras funções, sendo assim um órgão de extrema importância (LIU et al., 2016).
2.2.2 Importância industrial da ficocianina
Os custos de produção de S. platensis são bastante altos, principalmente
quando comparado a farinha de peixe e de soja. Desta forma, é importante a
otimização da produção industrial dessa microalga. Os produtos dessa microalga,
como as ficobiliproteínas, também são muito caros também fazendo com que a
24
indústria tente aperfeiçoar o processo de extração, com o intuito de aumentar o
rendimento de ficocianina (principal pigmento proteico) e sua pureza, em menores
tempos (SILVA, 2008).
Os principais fatores que interferem no crescimento das microalgas como a S.
platensis, e que são altamente controlados em processos industriais, são:
luminosidade, temperatura, teor de sal, concentração de oxigênio e a deficiência de
nutrientes no meio como carbono, nitrogênio, fósforo, ferro e elementos traços para
o correto desenvolvimento destes organismos (SPOLAORE et al., 2006; SILVA,
2008; RICHMOND & HU, 2013).
2.3 Técnicas de extração e purificação de pigmentos proteicos
Antes de iniciar um processo de extração, o material vegetal, geralmente,
passa por um processo de secagem, a temperaturas que podem variar de 30 a 60
°C, seguida de moagem e tamização. É importante ficar atento às condições de
secagem, pois temperaturas acima de 45 °C podem degradar a ficocianina
(CHAIKLAHAN et al., 2012).
A maceração é um método de extração muito utilizado em pesquisas com
produtos naturais. Consiste em colocar o material vegetal a ser utilizado em contato
com uma determinada quantidade de solvente. O processo de maceração é
influenciado por fatores como temperatura e tempo. Dentre as desvantagens do
processo estão a impossibilidade de extrair totalmente os princípios ativos da droga
e a suscetibilidade de degradação dos compostos devido ao longo período de tempo
deste método extrativo. A maceração pode ser estática ou dinâmica, assim como
pode-se variar a temperatura de extração (5-30 °C). Esse método de extração já foi
bastante utilizado com sucesso na extração da ficocianina por alguns autores
(MELECHI, 2005; DAL’OSTO, 2012).
Um método de extração que não foi visto na literatura para extração da
ficocianina é a extração realizada sob ultra-agitação, denominado turbo-extração.
Neste método de extração utiliza-se um homogeneizador de tecido celular, o qual
tem a capacidade de romper as membranas e paredes celulares da célula vegetal,
permitindo que os metabólitos secundários entrem em contato com o solvente
extrator. Este método tem caráter inovador na área de biotecnologia, na busca de
25
produtos naturais bioativos, apresentando como principal vantagem: a rápida
extração de metabólitos secundários (ORTH et al., 1999).
Há uma patente depositada no Instituto Nacional de Propriedade Industrial
(INPI) que diz respeito a extração de ficocianina a partir da Spirulina sp. Como ainda
está em processo de concessão, as condições de extração do processo ainda não
estão disponíveis.
O uso de cavitação hidrodinâmica ou turbo-extração como técnica de
extração na área de produtos naturais é pouquíssimo relatado na literatura, e para
as microalgas em particular não há relato. Já o método de ultrassom foi descrito em
alguns trabalhos, como os realizados por Silveira e colaboradores (2007), Kamble e
colaboradores (2013), dentre outros. O ultrassom é uma técnica, que além de
possuir a capacidade de romper as membranas e paredes celulares da célula
vegetal, é de fácil manipulação e pode ser empregado em extrações de compostos
foliares. Essa técnica tem como vantagem a sustentabilidade, pois ela envolve
menos tempo, água e energia, além de possuir um rendimento, produtividade e
seletividade altos. A utilização do sistema ultrassom em tecnologia de alimentos
para o processamento, preservação e extração de compostos têm evoluído, devido
à diferença entre os métodos de extração, processamento e conservação de
alimentos convencionais (LIMA, 2014; OLIVEIRA et al., 2016).
Tratando-se de plantas, a técnica de ultrassom pode facilitar a dilatação e
hidratação do material da planta e causar alargamento dos poros da parede celular,
melhorando razão de transferência de massa, podendo assim quebrar a parede
celular, acarretando aumento da eficiência e redução do tempo de extração, assim
como aumento na penetração do solvente (OLIVEIRA et al, 2017).
Alguns trabalhos de pesquisa realizados em métodos de extração baseados
em ultrassom podem ser classificados em duas categorias: I- métodos assistidos por
ultrassom, onde o ultrassom é usado para a interrupção das células e extração
melhorada; e II- métodos sinérgicos de ultrassom, em que o ultrassom é realizado
juntamente com outros métodos de quebra das paredes celulares a fim de obter
sinergia, aumentando, assim, o rendimento. Há vários estudos sobre essa sinergia
do ultrassom com outros métodos de extração, porém, há poucos estudos sobre
esses métodos de extração sinérgica para extração da ficocianina. Um dos poucos
estudos sobre esse método sinérgico, onde tem a junção de ultrassom + maceração,
26
demonstra um aumento na eficiência de extração de 47,28 para 83,53% de
ficocianina (TAVANANDIA et al, 2018).
Outro método com poucos relatos de uso para a extração de ficocianina, é a
extração assistida por micro-ondas. As micro-ondas são ondas eletromagnéticas
com componentes de campo elétrico e magnético. Essas micro-ondas trabalham na
faixa de frequência entre 0,3 a 300 GHz e comprimento de onda (λ) variando de 1
mm e 1 m. Os princípios envolvidos no aquecimento por micro-ondas fazem
referência a alguns conceitos físicos e químicos, tais como temperatura, ligação
química, estrutura molecular, momento de dipolo, polarização, capacidade calorífica
e constante dielétrica. Especificamente quanto à aplicação e o desempenho da
extração assistida por micro-ondas aos compostos ativos de produtos naturais,
observa-se uma maior eficiência da técnica em relação aos métodos convencionais
(TSUKUI & REZENDE, 2014).
A purificação de proteínas no geral é a etapa mais cara em processos
industriais, pois envolve algumas técnicas complexas. Entre as técnicas de
purificação, a partição trifásica (TPP) se apresenta como uma nova estratégia de
biosseparação, pois trata-se de um método mais simples que os demais e que
apresenta resultados rápidos, além de ser eficiente para a separação e
enriquecimento de compostos proteicos, como enzimas de misturas complexas. Por
possuir essas características, este processo se torna uma escolha popular na
purificação de proteínas em grande escala e também em diagnósticos em pequena
escala. A separação baseada em TPP é um processo barato em comparação com
os processos convencionais de purificação (ÖZER et al., 2010; RACHANA & LYJU,
2014; ZHANG et al., 2017).
A TPP foi desenvolvida pela primeira vez como uma técnica para a
precipitação em escala de litros de celulases brutas e outras enzimas, porém, ela é
mais utilizada no isolamento em escala de volumes menores. O desenvolvimento da
TPP iniciou-se a partir de 1972, mostrando que algumas enzimas mantiveram suas
atividades em misturas de agua e t-butanol. Por outro lado, outras enzimas e
proteínas perderam a atividade ou funcionalidade. A TPP também é empregada
como técnica de extração e purificação para ingredientes ativos, como proteínas,
óleo, polissacarídeo e enzima. A técnica consiste na adição sequencial de uma
quantidade suficiente de sal (geralmente sulfato de amônio, devido à sua alta
27
solubilidade e força iônica) e de um solvente orgânico (principalmente t-butanol),
como está ilustrado pela Figura 9. Por este método, as enzimas ou proteínas
desejadas são separadas em uma fase, enquanto contaminantes como lipídios e
inibidores estarão em outra fase da partição líquido-líquido (RACHANA & LYJU,
2014; ZHANG et al., 2017).
Um aumento adicional na concentração de sal implica que haverá menos
água disponível para solubilizar a proteína, portanto, a proteína começa a precipitar
quando não há moléculas de água suficientes para interagir com moléculas de
proteína. Este fenômeno de precipitação de proteína na presença de excesso de sal
é conhecido como "salting-out" (RACHANA & LYJU, 2014; ZHANG et al., 2017).
28
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Otimizar a extração de ficocianina da espécie S. platensis utilizando diferentes
condições extrativas bem como realizar a sua purificação.
3.2 Objetivos específicos
1. Avaliar o efeito da extração da ficocianina utilizando água do mar, água
destilada, tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4; PBS/etanol 20%, e PBS/etanol
40% como líquidos extratores;
2. Avaliar o efeito da extração de ficocianina utilizando as seguintes técnicas de
extração: turbo-extração, micro-ondas e ultrassom (como pré-tratamento) e
maceração dinâmica como método extrativo;
3. Avaliar o efeito da extração da ficocianina utilizando diferentes tempos de
extração;
4. Realizar a quantificação da ficocianina para cada extração;
5. Realizar testes de estabilidade térmica da ficocianina;
6. Purificar a ficocianina utilizando a partição em três fases (TPP).
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Microalga e condições de cultivo
A espécie S. platensis seca e triturada (Figura 10) foi gentilmente cedida pelo
laboratório de Planctologia do Departamento de Engenharia de Pesca da
Universidade Federal do Ceará, onde foi cultivada. As condições do cultivo utilizadas
por Rodrigues e colaboradores (2015) estão descritas a seguir.
O inóculo foi preparado em meio contendo cloreto de sódio (30 g/L),
bicarbonato de sódio (10 g/L) e os fertilizantes agrícolas NPK (1 g/L) e superfosfato
triplo (0,1 g/L). Inicialmente, o inóculo foi mantido sob iluminação constante de 1.000
μE.cm-2s-1, sendo periodicamente agitado. A cada dois dias, 250 mL de meio de
cultivo foram adicionados até que o volume final de 800 mL fosse atingido. Passados
seis dias, a cultura foi submetida à aeração constante (2 L/min) e luminosidade de
20 μE.cm-2s-1. A temperatura da sala de cultivo foi mantida constante (28 ± 2 °C).
Após vinte dias, as células foram separadas do meio de cultivo por floculação
química (90 mL de NaOH 2N). A completa floculação foi monitorada através de
espectrofotometria. O sobrenadante contendo o meio de cultivo foi sifonado e a
biomassa úmida foi lavada e seca em estufa (60 °C/24 horas). Após a secagem, a
biomassa foi triturada e selecionada (RODRIGUES et al, 2015).
Figura 9. S. plantesis seca e pulverizada (Fonte: Elaborado pelo autor).
30
4.2 Parâmetros utilizados na extração da ficocianina a partir de S. platensis
Os parâmetros variáveis utilizados no planejamento das extrações da
ficocianina foram: solvente, técnicas de pré-tratamento, tempo e temperatura de
extração. A principal técnica de extração utilizada neste estudo foi a maceração
dinâmica (MACd) Inicialmente avaliaram-se os três primeiros parâmetros, como
pode ser observado no Quadro 2.
Quadro 2. Condições utilizadas na otimização de extração da ficocianina (Fonte: Elaborado pelo autor).
N° Parâmetro Níveis (unidade) Parâmetros fixos
0
1
Solvente de
extração
Água destilada, PBS
(0,1M), Água do mar,
PBS/Etanol 20%,
PBS/Etanol 40%
MACd
Tempo: 6 h
Razão 1:10 m/v
Temperatura: 25°C
0
2
Técnica de pré-
tratamento
Turbo-extração
Micro-ondas
Ultrassom
MACd
Solvente: melhor condição
Tempo da maceração: 6 h
Razão 1:10 m/v
Tempo de pré-tratamento: 90 s
Temperatura: 25°C
0
3 Tempo de extração
0, 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6, 15,
24 e 48 h
Solvente: melhor condição
Técnica de pré-tratamento: melhor técnica
Razão 1:10 m/v
Tempo de pré-tratamento: 90 s
Temperatura: 25°C
4 Temperatura de
extração 30, 40 e 50 °C
Solvente: melhor condição
Técnica de pré-tratamento: melhor técnica
Razão 1:10 m/v
Técnica de extração: agitação orbital
Tempo: 48 h
Ao final deste planejamento, com as melhores condições, realizaram-se
extrações utilizando maceração dinâmica submetida a dois tipos de agitação
31
(agitador magnético/ barra magnética e agitação orbital em “Shaker”), e tempo de
extração de 48 horas.
O efeito de cada um dos parâmetros sob o rendimento de extração da
ficocianina foi estudado de maneira independente, mantendo-se constante todas as
outras condições selecionadas, como pode ser observado no Quadro 2.
4.2.1 Extração por maceração dinâmica utilizando diferentes
solventes
As condições fixas utilizadas na extração da ficocianina foram utilizadas de
acordo com a literatura e com alguns resultados preliminares obtidos pelo grupo de
pesquisa. As condições fixas foram: temperatura (25 °C), razão massa de
microalga/volume de solvente (1:10), tempo de pré-tratamento das microalgas secas
(90 s). O primeiro fator a ser avaliado foi o solvente, utilizando as condições fixas
acima sob maceração dinâmica (agitação mecânica/ barra magnética).
A S. platensis seca e triturada foi submersa em diferentes solventes (Quadro
3), na razão 1:10, m/v (material vegetal seco em gramas/volume em mL de solvente)
e submetida a maceração, sob agitação mecânica/ barra magnética. Alíquotas foram
retiradas nos tempos 0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 h, para realização da análise em
espectrofotômetro (Adaptado de SILVEIRA et al., 2007).
Quadro 3. Solventes utilizados na extração de ficocianina por maceração dinâmica (Fonte: Elaborado pelo autor).
Experimento Solvente
1 PBS (0,1M, pH 7,4)
2 Água Destilada (pH 7)
3 Água do Mar (pH 8,4)
4 PBS/Etanol 20%
5 PBS/Etanol 40%
É importante salientar que a água do mar foi coletada em um local onde
houvesse o mínimo de casas, bares, quiosques, movimentação de pessoas, além de
32
situar-se longes de portos, atracadouros, dentre outros. Esses pontos foram
analisados, com o fim de ter o mínimo de interferência (contaminantes).
Na Figura 11, pode-se observar o sistema utilizado para a realização das
extrações por maceração dinâmica, através da agitação magnética em determinados
tempos.
Figura 10: Sistema utilizado na maceração dinâmica/ barra magnética da S. platensis em pó (Fonte: Elaborado pelo autor).
4.2.2 Pré-tratamento utilizando turbo-extração, ultrassom e micro-ondas
Após a determinação do melhor solvente, as microalgas secas foram
submersas nesse solvente em um becker/proveta, na proporção 1:10 m/v (material
vegetal seco em gramas/volume em mL de solvente) e submetido a turbo-extração
(21.000 rpm) em homogeneizador de tecido celular (Turratec®), ultrassom (60 Hz,
135 Watts) ou micro-ondas (115 Watts), por 90 s, a 25 °C. Uma alíquota de 0,5 mL
foi retirada para a quantificação da ficocianina ao final de cada experimento
isoladamente (Adaptado de PINTO et al., 2011; KAMBLE et al., 2013; RODRIGUES,
2017).
Após o pré-tratamento utilizando as técnicas citadas anteriormente, o extrato
passou por uma maceração dinâmica (agitação magnética), sendo retiradas
alíquotas de 0,5 mL nos tempos 0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 e 6 h, para a quantificação da
ficocianina (Adaptado de PINTO et al., 2011; KAMBLE et al., 2013; RODRIGUES,
2017).
33
4.2.3 Extração da ficocianina com maceração dinâmica utilizando
agitação magnética e agitação orbital
Após a escolha do melhor solvente (4.2.1) e melhor técnica de pré-tratamento
(4.2.2), a microalga seca e triturada foi submersa no solvente selecionado
anteriormente, na razão 1:10, m/v (material vegetal seco em gramas/volume em mL
de solvente) e submetida a maceração dinâmica, sendo feito experimento utilizando
a agitação magnética (25 °C) e em outro experimento a agitação orbital (180 rpm, 30
°C). Alíquotas foram retiradas para análise, nos tempos 0; 0,5; 2; 4; 6; 15; 24 e 48 h
(Adaptado de SILVEIRA et al., 2007).
4.2.4 Extração da ficocianina com maceração dinâmica utilizando
agitação orbital e diferentes temperaturas
A S. platensis seca e triturada foi submersa no melhor solvente (4.2.1), na
razão 1:10, m/v (material vegetal seco em gramas/volume em mL de solvente) e
submetida a maceração, em Shaker, à 180 rpm e três temperaturas diferentes (30,
40 e 50°C). Alíquotas foram retiradas para análise espectrofotométricas, nos tempos
0; 0,5; 2; 4; 6; 15; 24 e 48 h (OLIVEIRA & MENEZES, 2017).
4.3 Análise de estabilidade térmica da ficocianina
A S. platensis seca e triturada foi submersa no melhor solvente (4.2.1), na
razão 1:10, m/v (material vegetal seco em gramas/volume em mL de solvente) e
submetida a maceração dinâmica por 4 horas. Ao final da extração centrifugou-se o
extrato por 15 min e o sobrenadante foi submetido às temperaturas de 30, 40 e 50°C
por 24h em banho-maria. As análises espectrofotométricas foram realizadas no
tempo inicial e após 24h de aquecimento.
34
4.4 Análise espectrométrica da ficocianina nos extratos
Ao final de cada um dos processos de extração, alíquotas de 0,5 mL foram
centrifugadas por 2 minutos a 10.000 rpm em uma mini-centrífuga. Após essa
centrifugação, 400 µL do sobrenadante foram transferidos para um novo microtubo e
centrifugados por 15 min. Em seguida, 200 µL de cada amostra foram transferidos
para um tubo de ensaio e depois adicionado 3,8 mL de solvente utilizado no
determinado processo. Finalmente, realizou-se a leitura da amostra em
espectrofotômetro. Os comprimentos de onda utilizados foram: 615, 652 nm. Estes
são os comprimentos de onda nos quais ocorre a absorção máxima para as
proteínas: ficocianina e aloficocianina, respectivamente (Adaptado de SILVEIRA et
al., 2007).
4.5 Quantificação e determinação da pureza de ficocianina
Para quantificação de ficocianina as amostras foram analisadas
espectrofotometricamente (4.4) utilizando as equações de Bennet & Bogorad (1973)
(1 e 3) e determinação da pureza da ficocianina nos extratos utilizará a Equação 3.
Equação 1
Equação 2
Equação 3
Onde: PE – Pureza do extrato
QFCE – Rendimento de extração (mg/g)
PC – Concentração de Ficocianina (mg/mL)
V – Volume do extrato (mL)
BS – Biomassa seca (g)
35
4.6 Purificação da ficocianina
Após escolher o melhor solvente (4.2.1), a melhor técnica de pré-tratamento
(4.2.2) e a melhor técnica de extração (4.2.3), foi feito a purificação dessa proteína.
Em um tubo contendo 1 mL do extrato contendo ficocianina (extrato em condições
otimizadas) foi adicionado 150 mg de sulfato de amônio, seguida de
homogeneização em vórtex. Em seguida, foi acrescentado t-butanol em uma
proporção extrato bruto: t-butanol de 1:1 (v/v). O sistema foi homogeneizado em
vórtex durante 1 min e mantido em repouso por 10 min, seguido de centrifugação a
10.000 rpm a 4 ºC durante 5 min para separação das fases (Adaptado de ÖZER et
al., 2010; ZHANG et al., 2017).
A fase superior (t-butanol) foi retirada cuidadosamente com o auxílio de uma
pipeta de Pasteur. Já a fase inferior (sal) foi recolhida por perfuração da camada de
precipitação interfacial (fase intermediária) utilizando uma pipeta. O precipitado
interfacial contendo a ficocianina foi recolhido e depois dissolvido em agua destilada.
Realizou-se a determinação da pureza da ficocianina como descrito no item 4.5,
utilizando a Equação 3 (Adaptado de RACHANA & LYJU, 2014; ZHANG et al.,
2017).
Figura 11. Modelo esquemático da técnica TPP. Adaptado de RACHANA & LYJU, 2014.
36
4.7 Análise estatística
Os gráficos e/ou os dados obtidos nos diversos experimentos foram tratados
estatisticamente utilizando-se o programa Origin 6.0 Professional e GraphPad
Prism, versão 5.01 através de Análise de Variância (ANOVA) de 1 via seguido de
teste de Tukey. Foram consideradas significativas as diferenças com p < 0,05.
37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Bertolin e colaboradores (2011a) preconizaram como parâmetros mais
importantes para extração da ficocianina: o tipo de solvente, a proporção
biomassa/solvente, a temperatura, o tempo de extração e o método de ruptura
celular, ocorrendo principalmente por choque mecânico.
Em ensaios preliminares de extração realizados para avaliar o efeito da razão
massa de microalga/volume de solvente sobre a eficiência de extração, observou-se
que entre as três razões testadas (1:10; 1:20 e 1:30) não houve diferença
significativa na extração da ficocianina. Por esse motivo selecionou-se a razão em
que há um menor consumo de solvente extrator (1:10) como um parâmetro fixo para
as extrações posteriores. Esse experimento foi realizado para padronizar a razão
massa de microalga/volume de solvente, tendo vista que os autores utilizam
diversas razões m/v, como 1:15, 1:25, 1:50 (SILVEIRA et al., 2007; RODRIGUES,
2017).
5.1 Avaliação dos diferentes solventes extratores na extração
de ficocianina
Com relação aos solventes utilizados para a extração da ficocianina, a
literatura mostra que o tampão fosfato salino (PBS), pH 7,0 é amplamente utilizado,
pelo fato de que esse pH mantêm a proteína intacta. Além do tampão fosfato, outros
solventes, tais como água destilada e água do mar também já foram utilizadas para
a extração da ficocianina. Foi observado que a quantidade e a pureza dos pigmentos
foram variáveis quando se utilizaram diferentes solventes (MORAES et al., 2007;
SILVA, 2008; SUDHAKAR et al., 2015).
Os solventes extratores utilizados na extração da ficocianina estão
apresentados no Quadro 3 (pág. 31). Nota-se que quando se utilizou a água
destilada como solvente extrator conseguiu-se extrair a maior quantidade de
ficocianina (Figura 12).
38
Figura 12: Eficiência de extração (%) ao longo do tempo, por maceração dinâmica em agitador
magnético, utilizando os solventes extratores: agua destilada, PBS, etanol 20%, etanol 40% e água do mar, à 25°C (Fonte: Elaborado pelo autor).
Na Figura 12 pode-se observar a diferença na eficiência de extração (%) para
os diferentes solventes utilizados. Nota-se que o melhor solvente utilizado foi a água
destilada. Existem dois fatores que permitem uma extração melhorada de
ficocianina: pH e força iónica (SILVEIRA et al., 2007). Segundo Antelo (2010) os
valores de pH entre 6 e 7, são os valores em que a proteína é estável. A água
destilada por ter força iônica diferente das condições intracelulares, permite uma
maior extração da ficocianina, pois a diferença de concentração de sais dentro e fora
da célula promove a ruptura da membrana celular.
No trabalho realizado por Silveira e colaboradores (2007) a extração de
ficocianina (razão biomassa seca/solvente, 1:25) utilizando tampão fosfato 0,01 M,
(pH 7,0), ou água destilada, foi realizada por maceração dinâmica a 30 ºC por um
tempo de 24, 48 e 72 h. Comparando-se os resultados da extração com água
destilada e tampão, observou-se que nas primeiras 48 h de extração, o tampão
fosfato de sódio apresentou uma melhor extração (105 mg/g), enquanto que após 72
h, a água extraiu uma quantidade ligeiramente superior (113,5 mg/g). Vale ressaltar
que estes rendimentos de extração da ficocianina foram os melhores apresentados
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
Efic
iênci
a d
e e
xtra
ção (
%)
Tempo (h)
Agua destilada
PBS
Agua do mar
Etanol 20%
Etanol 40%
39
até o momento utilizando maceração como técnica extrativa, mostrando que tanto a
água como o PBS são bons solventes para a extração da ficocianina.
Dentre os autores citados no presente trabalho, observou-se que os melhores
solventes utilizados na extração da ficocianina foram a água destilada e o tampão
fosfato, sendo este último o mais utilizado pelos autores. Outro parâmetro bastante
estudado por diversos autores é o método de extração, com destaque para a
maceração. Outro fator muito importante é o tempo de extração. Diversos trabalhos
utilizaram como tempo de extração 24, 48 e 72h, para obter rendimentos de
extração desejáveis.
A ideia em se utilizar a água do mar como solvente extrator foi devido ao fato
de se tratar do meio natural da microalga marinha, o qual preservaria o pigmento
durante o processo de extração. Como se pode observar na Figura 12, este solvente
foi o segundo melhor solvente extrator, ao lado do etanol/água 20%, atingindo uma
eficiência de extração em torno de 70%. O etanol foi usado como co-solvente, pois
este solvente, além de ser considerado seguro, é um solvente com grande poder
extrativo.
5.2 Avaliação do pré-tratamento na extração de ficocianina
utilizando diferentes técnicas de extração.
Atualmente, são utilizados inúmeros métodos de extração de produtos
naturais. Dentre os métodos utilizados estão a turbo-extração, ultrassom e micro-
ondas. Na extração da ficocianina, o método mais utilizado dentre essas três
técnicas citadas é o ultrassom. Na perspectiva de se avaliar o efeito dessas
técnicas, isoladamente, na extração de ficocianina, foi determinada a quantidade de
ficocianina ao final de 90 s de extração (Figura 13). Alguns estudos sobre métodos
sinérgicos, onde tem a junção de duas ou mais técnicas de extração, demonstram
aumento na eficiência de extração (TAVANANDIA et al., 2018).
40
Figura 13. Eficiêcnia de extração da ficocianina utilizando turbo-extração (T), ultrassom (US), micro-
ondas (MO) (pré-tratamento) (90 s) e maceração dinâmica (MACd) (tecnica de extração) por 30 minutos a 25°C. Diferenças com p < 0,05 foram consideradas significativas. Letras diferentes indicam
que há diferença estatística significativa. (Fonte: Elaborado pelo autor).
As análises de variâncias (ANOVA) seguido de teste de Tukey (Figura 13)
mostraram que há diferença estatística significativa entre as três técnicas de pré-
tratamento. No entanto, não há diferenças significativas entre a turbo-extração,
ultrassom e maceração dinâmica, onde se pode extrair uma quantidade maior de
ficocianina quando comparado com micro-ondas. A turbo-extração apresenta a
desvantagem de apresentar uma extração não seletiva, e desta forma reduzindo a
pureza da ficonianina no produto final. Isso torna a técnica de ultrassom a mais
promissora das técnicas testadas.
Fazendo uma comparação da turbo-extração e ultrassom (técnicas de pré-
tratamento) com a maceração dinâmica, nos tempos estabelecidos, conclui-se que
as duas técnicas de pré-tratamento são métodos promissores, uma vez que
alcançaram rendimentos iguais em tempo de extração muito inferiores à maceração
dinâmica.
Já na avaliação do método de pré-tratamento agindo sinergicamente com o
método extração da ficocianina, obteve-se os resultados expostos na Figura 14.
T 90s US 90s MO 90s MACd 30min
0
20
40
60
80
100
120
Eficiê
ncia
de e
xtr
ação (
%)
Técnicas de pré extração/extração
a
b ab
c
41
Figura 14. Quantidade de ficocianina extratida (QFCE) utilizando turboextração, ultrassom e microondas (90 s) associadas à maceração dinâmica (6 h) e somente por maceração dinâmica
(MACd) a 25°C. Diferenças com p < 0,05 foram consideradas significativas. Letras diferentes indicam que há diferença estatística significativa. (Fonte: Elaborado pelo autor).
Não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias nas
extrações realizadas com o pré-tratamento (turbo-extração e ultrassom) e sem pré-
tratamento (Figura 14). Entretanto, houve diferença significativa entre a extração em
que se utilizaram micro-ondas e as outras condições. Não houve diferença
significativa quando associou turbo-extração e ultrassom à maceração dinâmica,
quando comparada com a MACd isoladamente, portanto o pré-tratamento não
influenciou positivamente na obtenção da ficocianina (Quadro 4).
Quadro 4. Quantidade de ficocianina extraída (QFCE) utilizando diferentes técnicas de pre-tratamento (Fonte: Elaborado pelo autor).
Método de extração Tempo de
extração QFCE (mg/g)
Maceração (MACd) 6h 13,71±0,81
Turbo-extração+MACd 90s+6h 14,98±0,54
Ultrassom+MACd 90s+6h 14,82±0,94
Micro-ondas+MACd 90s+6h 10,91±0,77
T+MACd US+MACd MO+MACd MACd
0
2
4
6
8
10
12
14
16
QF
CE
(mg/g
)
Técnicas de pré extração/extração
a a a
b
42
5.3 Avaliação da extração de ficocianina utilizando a
maceração dinâmica (agitação magnética e orbital)
O tempo de extração é um ponto importante na obtenção da ficocianina. Pelo
fato do seu alto valor agregado, países como China, Índia, Japão, Estados Unidos
tentam diminuir o seu tempo de extração, fazendo com que a produtividade
aumente. Autores como Silveira e colaboradores (2007), Kamble e colaboradores
(2013), dentre outros, realizaram as extrações em 24, 48 e 72 h.
Neste trabalho, após 6 h de extração obteve-se uma produtividade de 2,29
mg/g/h, enquanto que Silveira e colaboradores (2007) chegaram a 1,57 mg/g/h e
Kamble e colaboradores (2013) a 0,61 mg/g/h. Entretanto, a quantidade de
ficocianina extraída em 24 e 48 h foi menor do que a obtida por Silveira e
colaboradores (2007).
Como foi visto na Figura 14, os rendimentos de ficocianina obtidos nas
extrações utilizando pré-tratamento não apresentaram valores estatisticamente
diferentes. A partir dessa constatação, decidiu-se prolongar o tempo de extração por
24 h e 48 h utilizando MACd sem pre-tratamento. As extrações foram realizadas
utilizando agitação magnética e agitação orbital, para efeito de comparação dessas
duas técnicas dinâmicas (Figura 15).
43
Figura 15. Quantidade de ficocianina extraída (QFCE) em diferentes tempos de extração por MACd, utilizando agitação orbital (vermelho) e agitação magnética (preto), a 25°C (Fonte: Elaborado pelo
autor).
Observando a Figura 15, é notável um crescimento da curva de QFCE em
relação ao tempo, atingindo a quantidade máxima de ficocianina em 24 h, tendo em
vista que em 48 h a QFCE é estatisticamente igual a obtida em 24 h. A quantidade
de ficocianina extraída com agitação magnética foi de 15,94 mg/g em 24h, um
rendimento de extração muito semelhante ao obtido por Kamble e colaboradores
(2013) (15,15 mg/g), porém foram menores que os valores obtidos por Silveira e
colaboradores (2007), onde foi extraída uma quantidade de ficocianina equivalente a
93,25 mg/g em 24 horas. A extração de ficocianina utilizando agitação orbital foi
ligeiramente superior (18,1 mg/g) à extração por agitação magnética, no período de
24 horas. Além disso, é possível controlar a temperatura de extração e a rotação da
agitação no equipamento utilizado com a agitação orbital, apresentando, portanto,
vantagens sobre a agitação magnética.
A Figura 16 ilustra os extratos obtidos em diferentes tempos de extração e
suas diferentes intensidades de cor azul. Percebe-se que não houve uma variação
de intensidade entre os tempos 24 e 48h, logo, corrobora com os resultados da
Figura 15, onde não há diferença estatística relevante entre os rendimentos nesses
tempos de extração.
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
QF
CE
(m
g/g
)
Tempo (h)
Agitação Magnética
Agitação Orbital
44
Figura 16: Fotografia dos extratos obtidos no início da extração e nos tempos de 24 e 48 h, evidenciando as diferentes intensidades de cor das soluções obtidas após a extração da ficocianina
por maceração dinâmica/ agitação magnética (Fonte: Elaborado pelo autor).
O possível motivo para a diferença nas quantidades de ficocianina extraídas
nesse trabalho quando comparado a outros autores, foi a diferente temperatura de
secagem da microalga. Kudus e colaboradores (2013) relataram que os métodos de
secagem da Spirulina resultaram em uma perda de 50% da ficocianina. No trabalho
realizado por Silveira e colaboradores (2007) foi utilizada uma temperatura de
secagem de 40 °C, enquanto que no presente trabalho a secagem da microalga foi
conduzida a 60 °C. Isso influenciou no rendimento de ficocianina deste trabalho, pois
temperaturas de secagem superiores a 40 °C possibilitam a degradação do
pigmento, antes mesmo dos processos extrativos.
Utilizando a maceração dinâmica, por agitação orbital, foi analisada a
influência da temperatura na extração da ficocianina. O gráfico com estes resultados
pode ser observado na Figura 17.
Figura 17. Extração de ficocianina utilizando agitação orbital (180 rpm), nas temperaturas de 30, 40 e
50°C (Fonte: Elaborado pelo autor).
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
QFCE (mg/g) x Tempo (h)
QF
CE
(m
g/g)
Tempo (h)
30°C
40°C
50°C
45
Observa-se na Figura 17 que a 30 °C obteve-se uma maior quantidade de
ficocianina extraída em comparação as demais temperaturas, a partir das 6 horas de
extração. Pode-se notar também que, para as temperaturas de 40 e 50°C, a partir de
24h a quantidade de ficocianina extraída começa a decair. Os resultados obtidos no
presente trabalho demonstraram que a quantidade de ficocianina extraída depende
da temperatura de operação no processo de extração (SILVEIRA et al., 2007).
A temperatura de extração da ficocianina é um importante fator, pelo fato de
que a proteína é degradada a temperaturas, acima de 40° C, logo, os experimentos
que foram realizados a uma temperatura igual ou superior a essa, conduziram a
degradação da proteína, o que explica o menor rendimento de extração. Nesse
experimento, pode-se observar mais claramente o fator da degradação da proteína,
pois a 40 e 50 °C, a quantidade de ficocianina extraída foi muito menor do que a 30
°C (CHAIKLAHAN et al., 2012; SILVEIRA et al., 2007; SUDHAKAR et al., 2015).
O Quadro 5 apresenta um resumo comparando os melhores rendimentos de
ficocianina obtidos pelo presente trabalho e suas condições, assim como os
melhores rendimentos obtidos por Silveira e colaboradores (2007), Kamble e
colaboradores (2013) e Sivasankari e colaboradores (2014) utilizando os mesmos
métodos de extração.
No quadro 5 pode-se observar que Silveira e colaboradores (2007)
conseguiram extrair uma quantidade alta de ficocianina, comparado aos demais
autores, provavelmente devido à preservação da ficocianina durante o processo de
secagem da alga, como já visto anteriormente (item 5.3, pág. 42), Já Kamble e
colaboradores (2013), utilizando a mesma razão de massa/solvente que Silveira
(2007), obtiveram uma quantidade de ficocianina muito menor. Esse fato pode ser
explicado pelo fato da secagem ter sido realizada em temperaturas maiores que
40°C, assim como pela diferente temperatura de extração utilizada na maceração a
frio.
46
Quadro 5. Melhores rendimentos de extração da ficocianina relatados na literatura e pelo presente trabalho, utilizando-se maceração como técnica de extração.
Autor Método de extração
Solvente de extração
Razão massa/
solvente
Tempo de
extração
QFCE (mg/g)
SILVEIRA et al (2007)
Maceração dinâmica
Tampão fosfato de sódio 10mM (pH
7,0) 1:25 48 h 105
Água destilada 1:25 24 h 93,25
Água destilada 1:25 48 h 90,75
Água destilada 1:25 72 h 113,5
KAMBLE et al (2013)
Maceração a frio
Tampão fosfato de sódio 0,1M (pH
7,0) 1:25 24 h 15,15
Água destilada 1:25 24 h 14,25
SIVASANKARI et al (2014)
Maceração
Ácido clorídrico (12M)
1:2 24 h 0,524
Ácido clorídrico (12M)
1:2 48 h 0,572
Ácido acético (1M) 1:2 24 h 0,054
Ácido acético (1M) 1:2 48 h 0,136
Este trabalho
Maceração dinâmica (agitação
magnética)
Água destilada 1:10 6 h 13,71
Água destilada 1:10 24 h 15, 94
Água destilada 1:10 48 h 19,10
Maceração dinâmica (agitação orbital)
Água destilada 1:10 6 h 10,11
Água destilada 1:10 24 h 18,55
Água destilada 1:10 48 h 18,45 g
(Fonte: Elaborado pelo autor).
Observando os valores obtidos por Sivasankari e colaboradores (2014), nota-
se que a extração de ficocianina foi a menor entre os autores presentes no quadro 5.
Essa baixa eficiência de extração foi obtida provavelmente pela ausência de
agitação na maceração, onde os autores utilizaram a maceração estática por 24 e
48h. Outro fator que pode ter influenciado na extração da ficocianina por Sivasankari
(2014), é a baixa razão massa de microalga/volume de solvente. Uma relação
massa/solvente alta leva a um maior rendimento na extração de ficocianina,
provavelmente por possibilitar a não saturação do solvente extrator com o pigmento,
entretanto, uma maior quantidade de ficocianina extraída não depende somente
desse fator, e sim dos métodos de extração, além da temperatura (SILVEIRA, 2007).
47
5.4 Avaliação da estabilidade da ficocianina
Um ponto importante na extração da ficocianina é o controle da temperatura,
pois ela interfere diretamente na quantidade de ficocianina extraída. Sabendo-se que
há relatos de que a ficocianina é termolábil, foi realizado o teste de estabilidade
térmica a fim de se observar sua estabilidade em diferentes temperaturas. Os
resultados desse experimento estão expostos na Figura 18.
Figura 18. Estabilidade da ficocianina em diferentes temperaturas por um período de 24h. Diferenças com p < 0,05 foram consideradas significativas. Letras diferentes indicam que há diferença estatística
significativa. (Fonte: Elaborado pelo autor).
Observa-se na Figura 18 que, a partir de 40 °C há uma redução da média da
quantidade de ficocianina, com uma redução ainda maior a 50 °C. Pesquisadores
investigaram o efeito da temperatura na estabilidade da extração e verificaram que a
ficocianina inicia a sua degradação a partir de 40 °C. Além disso, foi observado que
acima de 30 °C o pigmento perde gradativamente a sua cor (SILVEIRA et al., 2007;
SILVA, 2008; MORAES 2010; BERTOLIN et al., 2011a).
Silveira e colaboradores (2007) observaram que a extração utilizando água
destilada não difere muito da extração utilizando tampão fosfato de sódio 10 mM (pH
30°C 40°C 50°C
0
20
40
60
80
100
Est
abili
dad
e d
a F
ico
cia
nin
a (
%)
Temperaturas (°C)
a
a
b
48
7,0), provavelmente, devido à ruptura mecânica das células, que ocorre nos dois
casos, aumentando a liberação do pigmento, como foi visto anteriormente. Porém
uma mudança na temperatura de 23,6 para 41 ºC reduziu a concentração de
ficocianina, em 0,5 mg/g, provavelmente devido à desnaturação da ficocianina
(BERTOLIN, 2011b).
No trabalho de Rodrigues (2015), onde a extração foi realizada utilizando
tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 7) em reator encamisado acoplado a um
banho termostático, sob agitação mecânica, verificou-se a influência da temperatura
de extração entre 30 e 50 °C. A extração foi negativamente afetada pelo aumento da
temperatura, indicando que a ficocianina, pode ter sido degradada pelo calor durante
o processo (CHAIKLAHAN et al., 2012; SUDHAKAR et al., 2015). Como pode ser
visto, os resultados de estabilidade térmica obtidos neste trabalho corroboram com
os resultados dos outros autores, confirmando a baixa estabilidade da ficocianina
acima de 40 °C.
5.5 Purificação da ficocianina
A pureza da ficocianina é um fator importante que determina sua área de
aplicação. Extratos brutos obtidos a partir de S. platensis têm mostrado geralmente
pureza menor do que o grau alimentício, deste modo, o uso de de processos de
purificação é imprescindível para melhorar a pureza, como por exemplo: extração
aquosa de duas fases, extração aquosa em três fases (TPP), precipitação com
sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica (GÜROY et al., 2017, LEE et al.,
2015).
Para determinar a pureza da ficocianina utiliza-se uma equação onde se
divide os valores de absorbância obtidos nos comprimentos de onda de 615 e 280
nm (Equação 3, pág. 34). A taxa de pureza de ficocianina é considerada de
qualidade alimentar quando o resultado da equação (A615/A280) for menor que 0,7;
grau reagente quando estiver entre 0,7 e 3,9 e como grau analítico quando for maior
que 4,0 (ANTELO et al., 2015, GÜROY et al., 2017, LEE et al., 2015).
No presente trabalho foi realizada a purificação em três fases (TPP), técnica
de purificação de proteínas com poucos relatos na literatura com relação a
49
purificação da ficocianina. Após 6h de extração por maceração dinâmica (agitação
orbital), realizou-se a purificação da ficocianina por meio da técnica de TPP (Figura
19). Após determinação da pureza com a equação 3, (A615/A280) obteve-se uma
pureza de 0,24. O valor obtido nesse trabalho, conseguiu uma pureza de
aproximadamente 17% maior quando comparado com a pureza do extrato bruto.
Figura 19. A formação das 3 fases do TPP, onde a fase superior é fase orgânica (amarelada), a fase
inferior é a fase aquosa (azul claro), e a fase intermediária corresponde ao extrato enriquecido com
ficocianina (azul escuro) (Fonte: Elaborado pelo autor).
Antelo e colaboradores (2010) obtiveram uma razão A615/A280 igual a 0,7,
classificado como grau alimentar, após purificação utilizando a extração em duas
fases. Já Zhang e colaboradores (2017), utilizando o TPP conseguiram uma pureza
de 4,13. Estes autores atingiram um maior grau de pureza da ficocianina quando
comparado com este trabalho, que pode ser explicado pelas diferentes condições
utilizadas neste processo, além da realização de otimizações na purificação de
ficocianina.
A saturação do sulfato de amônio tem um papel muito importante na TPP. Isto
ocorre devido ao fenômeno “salting out”. O sulfato de amônio pode ser usado para
separar proteínas com base em sua solubilidade na presença de alta concentração
salina. Entretanto, uma concentração alta de sulfato de amônio faz com que ocorra
desnaturação da ficocianina (ZHANG et al, 2017).
Fase orgânica
Fase aquosa
Interface proteica
50
A fim de saber quanto de ficocianina obteve-se após purificação, foram
realizadas leituras espectrofotométricas do extrato bruto (inicial) e do extrato
purificado. A quantidade de ficocianina extraída, em porcentagem, do extrato
purificado, foi de 67,5% comparado ao extrato bruto (100%). Essa perda de
ficocianina pode ter se dado pela desnaturação da proteína devido à presença do
sulfato de amônio e pela distribuição deste pigmento para as outras fases na
partição líquido-líquido, principalmente, para a fase aquosa, como pode ser
observado pela coloração azulada na Figura 19.
51
6. CONCLUSÕES
Neste trabalho avaliou-se vários métodos de extração física como pre-
tratamento para a extração de ficocianina de S. platensis. As melhores condições de
extração (água, maceração dinâmica sem pré-tratamento e temperatura de
operação de 25-30°C) são menos agressivas a proteína, apresentando por isso,
vantagens com relação ao custo de extração, tão bem como a manutenção da
estrutura química deste pigmento, já que ela é instável em condições drásticas.
Os pré-tratamentos utilizados não obteve resultados estatisticamente
diferentes ao que foi obtido na maceração dinâmica. No entanto, a turbo-extração e
o ultrassom podem ser melhor explorados, uma vez que seus rendimentos de
extração em 90 segundos foram superiores ao rendimento obtido por maceração em
30 minutos.
Entre os dois tipos de agitação mecânica: magnética e orbital, merece
destaque a maceração dinâmica por agitação orbital (“shaker”), pois obteve-se
rendimentos de extração semelhantes a MACd (agitação magnética) com a
vantagem de possibilitar o controle da temperatura e velocidade de agitação. Isso
facilita o aumento de escala do processo extrativo tornando-se mais atrativo
industrialmente.
A estabilidade térmica da ficocianina corroborou com outros autores, onde se
observou que a partir de 40 °C a ficocianina é sensível e sofre degradação. Desta
forma é recomendado que temperaturas abaixo de 40°C sejam utilizadas nos
processos de extração desse pigmento.
Este estudo mostrou que uma pequena purificação da ficocianina foi atingida,
apesar de ter apresentado eficiência menor do que de outros autores. No entanto,
mais investigações precisam ser realizadas com a partição em três fases (TPP) para
que se atinja um extrato com uma maior pureza de ficocianina.
52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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BARROS, K. K. S. Produção de biomassa de Arthrospira platensis (Spirulina platensis) para alimentação humana. 2010. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos), Universidade Federal da Paraíba.
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