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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA
DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE
MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL
MARIA REGINA MACEDO COSTA
NATAL/RN
2016
Maria Regina Macedo Costa
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA
DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE
MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde
Orientador: Kenio Costa de Lima
NATAL/RN
2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Costa, Maria Regina Macedo.
Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do
meio ambiente bucal / Maria Regina Macedo Costa. - 2016.
153f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima.
1. Microbiologia - Tese. 2. Fitoterapia - Tese. 3.
Cromatografia em Camada Delgada - Tese. 4. Toxicidade - Tese. I.
Lima, Kenio Costa de. II. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 615.011
iii ii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde:
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
iii
Maria Regina Macedo Costa
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA, CITOTOXICIDADE E AÇÃO ANTIMICROBIANA
DE EXTRATOS VEGETAIS SOBRE
MICRO-ORGANISMOS SUPERINFECTANTES DO MEIO AMBIENTE BUCAL
Aprovada em: __/__/____
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Prof. Dr. Kenio Costa de Lima
Membros da Banca:
________________________________________
Prof. Dr. Kenio Costa de Lima
________________________________________
Profa. Dra. Aurigena Antunes de Araújo
________________________________________
Profa. Dra. Ruthineia Diógenes Alves Uchoa Lins
________________________________________
Profa. Dra. Jozinete Vieira Pereira
________________________________________
Profa. Dra. Edja Maria Melo de Brito Costa
MEMBROS SUPLENTES
________________________________________
Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves
________________________________________
Prof. Dr. Fábio Roberto Dametto
________________________________________
Profa. Dra. Ana Carolina Lyra de Albuquerque
________________________________________
Profa. Dra. Francinalva Dantas de Medeiros
iv
DEDICATÓRIA
A Deus, Senhor e Salvador da minha vida,
que conhece cada um dos meus sonhos
Quer deitada ou quer andando
Sabe todos os meus passos
E antes que haja em mim palavras
em tudo me conhece
“Porque Dele por Ele e para Ele são todas as coisas. Glória, pois, a Ele
eternamente” Romanos 11:36
Aos meus pais, José Macêdo Costa e Rejane Costa Macêdo,
graduados em paciência, especialistas em amor incondicional,
mestres em doação e doutores na arte de encurtar a distância entre o
sonho e a vida sonhada. Não há vida de fé que não te coloque em provas
durante a jornada...mas não há provas que não nos tenhamos vestidos
da Graça.
VOCÊS SÃO O MELHOR DE DEUS PARA MIM
Eduardo Roberto de Lucena...
Deus mudou o teu caminho até juntares ao meu
e guardou tua vida, separando-a para mim.
Para onde tu fores, irei; onde tu repousares,
repousarei...
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Kênio Costa de Lima, o orientador, amigo e anjo. Antes de
conhecê-lo eu achava que sabia que professora eu gostaria de ser...mas
através do seu exemplo e excelência pude compreender o educador que todo
aluno merece ter. E diariamente, nosso conviver, me faz convicta de que a
docência e a responsabilidade acadêmica dependem da aplicação dos nossos
dons... No tempo, no espaço, mas sobretudo no interior da alma...alheia. Que
Deus me permita sempre o honrar. Professor, depois de pai, é o nome mais
nobre e doce que um homem pode dar a outro. És único para mim.
Às Profa. Dra. Maria do Socorro Vieira Pereira e Profa. Dra. Andressa
Feitosa Bezerra de Oliveira por me iniciarem no Programa Voluntário de
Iniciação Científica e Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica
desde o segundo período da minha graduação, me permitindo iniciar a
pesquisa e compartilhando o vasto conhecimento. Muito obrigada por sempre
enxergarem em mim uma docente em potencial, por inúmeras oportunidades,
amizade e imensa generosidade.
Ao Prof Dr. Fábio Correia Sampaio e Prof Dr. Franklin Delano Soares Forte
pelo aprendizado e incentivo, me permitindo através das monitorias e projetos
de extensão me dedicar, ao que eu já sabia... Era a melhor porção que Deus
tinha para mim (docência).
.À todos os professores e todos os funcionários do Departamento de
Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela
receptividade, pelo carinho, pelo favor, pelas experiências compartilhadas...por
tornar precioso e leve os quase 1500 trechos de estrada. Por permitirem que
essa seja a minha segunda casa e muito mais do que pedi ou jamais pensei.
Não estaria comemorando essa Graça sem a colaboração e apoio de cada um
deste departamento.
vi
Aos queridos e sempre presentes Ângela Maria de Medeiros, Jânio
Rodrigues Rêgo, Pedro Henrique Sette de Souza, Laércio Almeida de Melo,
Meily de Mello Sousa, Yan Nogueira Leite de Freitas, Victor de Farias, Valdison
Ribeiro... pelo carinho, dedicação, conforto em momentos dolorosos, por se
alegrarem com minhas vitórias, pelo oportunidade de aprender e pelo privilégio
da amizade.
À aluna Isabelle Helena Gurgel de Carvalho pela disponibilidade, pela
companhia nas noites de laboratório, pelas mãos estentidas, pela dedicação e
pela grata e feliz amizade. Através da sua vida agradeço a cada um
(graduação e pós graduação) que se apaixonou pela Microbiologia e
Fitoterapia, se doou aos experimentos, a pesquisa e muito também me
ensinaram.
À colaboração dos Laboratório de Microbiologia (DOD-UFRN), Laboratório de
Farmacognosia (UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros naturais
(UFRN), Laboratório de Pesquisa em Petróleo (UFRN), Laboratório de
Microbiologia Clínica (UFRN), Laboratório de Cultura de Células (UFRN),
Laboratório de Microbiologia (Universidade Estácio de Sá- Rio de Janeiro/RJ),
e Laboratório de Microbiologia (UFRN) e professores, alunos e funcionários
ligados aos mesmos.
À todos os membros da Primeira Igreja Batista de Intermares, por tantos
anos de convivência, pelos joelhos dobrados e pelo levantar em oração pela
minha vida. Quando o sonho é divino, o Rei manda a provisão. Amo vocês.
Às minhas “mães” Dilá e Lúcia (Dinda) e aos meus “pais” Jorge e Rogério
(Dindo), pelo profundo amor... em espírito e em oração estamos sempre
juntos.
À todos os meus alunos, aos que ainda virão... aos meus amados
afilhados (93, 100, 101)... Não houve obstáculos na minha graduação (sim, eu
já esperava por vocês) e na pós graduação que pudesse ser difícil a superar
quando eu sabia que teria brevemente pessoas a cuidar, ensinar, transformar
vii
e ser transformada. Vocês são resposta, promessa, saudade! Vocês são meus
sábios professores, meu conto de fadas, meu final feliz!
Aprendi com vocês que é possível amar a todos como se apenas UM
houvesse. Meu trabalho...Meu ministério.
À todos aqueles (incontáveis) que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização deste trabalho e sobretudo para a minha formação pessoal e
acadêmica.
MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS
viii
“OS JOVENS SE CANSAM E SE FATIGAM, E OS MOÇOS DE EXAUSTOS
CAEM, MAS OS QUE ESPERAM NO SENHOR RENOVAM AS SUAS
FORÇAS, SOBEM COM ASAS COMO ÁGUIAS, CORREM E NÃO SE
CANSAM, CAMINHAM E NÃO SE FATIGAM...” (ISAÍAS,40:30-31)
POR ISSO MESMO, EMPENHEM-SE PARA ACRESCENTAR
À SUA FÉ A VIRTUDE;
À VIRTUDE O CONHECIMENTO;
AO CONHECIMENTO O DOMÍNIO PRÓPRIO;
AO DOMÍNIO PRÓPRIO A PERSEVERANÇA;
À PERSEVERANÇA A PIEDADE;
À PIEDADE A FRATERNIDADE;
E À FRATERNIDADE O AMOR...
PORQUE, SE ESSAS QUALIDADES EXISTIREM
E ESTIVEREM CRESCENDO EM SUAS VIDAS,
ELAS IMPEDIRÃO QUE VOCÊS,
NO PLENO CONHECIMENTO DE NOSSO SENHOR
JESUS CRISTO, SEJAM INOPERANTES E IMPRODUTIVOS. (2 PEDRO 1:5-8)
ix ix
RESUMO
A presente pesquisa teve como objetivo avaliar in vitro a ação antimicrobiana dos extratos da raiz de Solanum paniculatum (jurubeba), da folha de Spondias mombin (cajá) e do fruto de Lycium barbarum (gojiberry) sobre micro-organimos superinfectantes do meio ambiente bucal, bem como analisar fitoquimicamente os materiais vegetais e seus potenciais efeitos citotóxicos. O screening fitoquímico dos extratos foi investigado por reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Nas análises por CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60; AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v), Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v), tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v), acetato de etila:n-propanol:ácido acético: água (4:2:2:0,6, v/v/v/v), como fases móveis; e para detecção dos metabólitos secundários, usou-se vanilina sulfúrica, solução FeCl3 1 %, Reagente Natural A 0,5%, Reagente Natural A 0,2%/UV 365 nm, KOH a 5%(v/v), e Dragendorff. Posteriormente, foi determinada a Concentração Inibitória Mínima, Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) Cinética bactericida (CF) e fungicida (CF) dos extratos sobre Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans (cepas ATCC e isolados clínicos). Ao nível de 5% de significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann-Whitney (p<0,05). Cada ensaio foi realizado em duplicata e utilizou-se como controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% e nistatina 100.000 U.I. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado através da viabilidade celular de fibroblastos da linhagem 3T3. As análises por CCD sugeriram a presença de ácidos fenólicos, taninos, saponinas, alcaloides, flavonoides, ácido elágico, quercetina, canferol, cumarinas e carboidratos. Todos os extratos apresentaram ação bacteriostática e fungistática. S. paniculatum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:16 (31,25 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. Lycium barbarum apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e estatisticamente significativo até a diluição 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL) sobre Enterococcus faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. S. paniculatum apresentou ação bactericida e fungicida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e efeito antiaderente sobre todos os micro-organismos testados até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), exceto para S. aureus ATCC (1:8) e P. aeruginosa ATCC (1:2). S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB), fungicida sobre C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). Lycium barbarum não apresentou ação bactericida e fungicida, entretanto apresentou efeito antiaderente até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. Os extratos apresentaram citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas (100 mg/ mL, 31,25 mg/mL, 15,65 mg/mL, 7,81 mg/mL, 6,67 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL) suscitando a necessidade de testes que indiquem quantas vezes os produtos são mais eficazes frente a determinados alvos do
x
que sobre células humanas. Conclui-se que S. paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum apresentaram significativa ação antimicrobiana, justificada pelos achados farmacológicos, estimulando a pesquisa de substâncias naturais bioativas, alvo-específicas, para tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias.
Palavras-chave: Microbiologia; Fitoterapia; Cromatografia em camada delgada; Toxicidade
xi xi
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the in vitro antimicrobial activity of the root extract of Solanum paniculatum (jurubeba), the leaf of Spondias mombin (hog or java plum) and the fruit of Lycium barbarum (gojiberry) on superinfecting micro-organisms in the oral environment, as well as phytochemically analyze plant material and potential cytotoxic effects. The phytochemical screening of the extracts was carried out by chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC). In the analysis by TLC silica gel 60 plates were used; EtOAc: formic acid: MeOH: Water (10: 0.5: 0.6: 0.2 v / v / v / v), BuOH: formic acid: water (3: 1: 1, v / v / v ) Chloroform: MeOH (8: 2, v / v) toluene: ethyl acetate: formic acid (5: 2.5: 0.25 v / v / v) and ethyl acetate: n-propanol: acid acetic acid: water (4: 2: 2: 0.6 v / v / v / v) as mobile phase; and for detection of secondary metabolites the following were used: vanillin sulfuric acid, FeCl 3 solution of 1%, 0.5% Natural Reagent A, Reagent A 0.2% Natural UV / 365 nm KOH 5% (v / v) and Dragendorff . Subsequently, the minimum inhibitory concentration, Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) Bactericidal Kinetics (BK) and fungicidal (FC) were determined from the extracts of Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans (ATCC and clinical isolates). The t-Student test or Mann-Whitney test was applied with 5% significance (p <0.05). Each assay was performed in duplicate and chlorhexidine digluconate at 0.12% and nystatin 100,000 I.U. were used as positive controls. The cytotoxic potential of the extracts was assessed by cell viability from fibroblasts from the 3T3 cell line. Analysis by TLC suggested the presence of phenolic acids, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, ellagic acid, quercetin, kaempferol, coumarins and carbohydrates. All extracts showed bacteriostatic and fungistatic action. S. paniculatum demonstrated a higher mean performance than the positive control and was statistically significant up till the dilution 1:16 (31.25 mg / mL) of P. aeruginosa ATCC. S. mombin had a mean performance superior to chlorhexidine and was statistically significant at the dilutions 1: 512 (0.97 mg / mL) and 1: 256 (1.95 mg / mL) of E. faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. Lycium barbarum showed a mean performance higher than the positive control and was statistically significant at the 1:4 dilution (125 mg / mL) and 1:16 (31.25 mg/mL) of Enterococcus faecalis ATCC and P. aeruginosa ATCC, respectively. S. paniculatum presented bactericidal and fungicidal action on E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick effect on all microorganisms tested until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL), except for S. aureus ATCC (1:8) and P. aeruginosa ATCC (1: 2). S. mombin showed bactericidal action against E. faecalis (ATCC and OE) and C. albicans (ATCC and OE) and non-stick action on all tested bacteria, especially P. aeruginosa ATCC and E. faecalis (ATTC and OE) until the dilution 1: 512 (0.97 mg/mL). Lycium barbarum showed no bactericidal and fungicidal action, but showed non-stick effect until the 1:32 dilution (15.65 mg/mL) of P. aeruginosa ATCC. The extracts showed cytotoxicity in cell culture at the concentrations tested (100 mg / mL, 31.25 mg / mL, 15.65 mg / mL, 7.81 mg / mL, 6.67 mg / mL, 1.95 mg / mL and 0.97 mg / mL) indicating the need for tests that indicate how much more the tested products are effective against the determined targets than the human cell. It can be concluded that S. paniculatum, Spondias mombin and Lycium barbarum showed significant antimicrobial action,
xii
justified by the pharmacological findings, thus stimulating the need for further research of target-specific, bioactive natural substances in the treatment of persistent or refractory oral infections.
Keywords: Microbiology; Phytotherapy; Thin layer chromatography; Toxicity
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AB: Ambiente Bucal
ATCC: American Type Culture Collection
BHI: Brain Heart Infusion
C. albicans: Candida albicans
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CB: Cinética Bactericida
CIM: Concentração Inibitória Mínima
CIMA: Concentração Inibitória Mínima de Aderência
E. faecalis: Enterococcus faecalis
OMS: Organização Mundial de Saúde
PPGCSa: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa
SUS: Sistema Único de Saúde
S. aureus: Staphylococcus aureus
UFC: Unidade Formadora de Colônia
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da
atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada 27
Figura 2: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da
Cinética Bactericida e Fungicida dos extratos testados para cada amostra
ensaiada
29
Figura 3: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da
Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra
ensaiada
31
Figura 1 (Artigo 5.1): TLC of ethanolic extract of S. paniculatum roots. 57
Figura 1 (Artigo 5.3): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da
fase móvel A 92
Figura 2 (Artigo 5.3): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da
fase móvel B 92
Figura 1 (Artigo 5.4): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da
fase móvel A 110
Figura 2 (Artigo 5.4): Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da
fase móvel B 110
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Preliminary phytochemical screening of S. paniculatum roots
57
xvi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
2 JUSTIFICATIVA 22
3. OBJETIVOS 23
3.1 OBJETIVO GERAL 23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23
4 MÉTODOS 24
4.1 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN
(JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM
LINN (GOJIBERRY)
24
4.1.1 Local de execução e Obtenção do material
24
4.1.2 Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum e folhas de
Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum e determinação de
sua concentração
24
4.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 25
4.2.1 Triagem Fitoquímica 25
4.2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 25
4.3 ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM
LINN., SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM
26
4.3.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de
Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum
26
4.3.2 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de
Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum
28
4.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos
extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin
e Lycium barbarum
30
4.3.4 Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum
paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
32
4.3.5 Análise Estatística 33
5 ARTIGOS PRODUZIDOS 34
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 111
7 REFERÊNCIAS 114
8 APÊNDICE 117
9 ANEXO 150
xviii
19
1 INTRODUÇÃO
No cenário atual, deparamo-nos com informações diárias que refletem a
necessidade de continuar a busca por inovações terapêuticas para o cuidado
em saúde. Veem-se rotineiramente infecções nosocomiais causadas por
superbactérias, com consequências catastróficas. Em acréscimo, a indústria
farmacêutica mundial tem diminuído o seu investimento na descoberta de
novas drogas antimicrobianas ou para doenças negligenciáveis, acarretando a
falta de inovação terapêutica neste seguimento, o que poderá levar a uma
dificuldade no tratamento das afecções em médio e longo prazo1.
Nesse sentido, a humanidade tem continuadamente se beneficiado de
produtos de origem natural, ou derivados, para a prevenção e/ou tratamento de
um amplo espectro de doenças que afetam os seres humanos. A descoberta
de metabólitos secundários de plantas, produtos de algas marinhas, peptídeos
antimicrobianos produzidos por fungos, e tantas outras fontes, serve de base
para o desenvolvimento da indústria farmacêutica e, consequentemente, cria
novas modalidades e alternativas terapêuticas, sobretudo para a Odontologia.
No que diz respeito ao ambiente bucal, trata-se de um reservatório que
pode abrigar uma composição heterogênea de micro-organismos, inclusive, os
considerados superinfectantes desse ambiente, comumente associados a
infecções oportunistas e persistentes, tais como: micro-organismos entéricos,
pseudomonados, do gênero estafilococos e leveduras.
Enterococcus faecalis é uma bactéria gram-positiva que faz parte da
microbiota do trato gastrointestinal e urinário2 . E. faecalis é responsável por
mais de 90% dos casos de infecções causadas por bactérias do gênero
Enterococcus3, incluindo endocardite bacteriana, infecções no trato urinário4,
além de infecções endodônticas5,6,7, podendo estar associada à cárie e a
doença periodontal2,7,8.
Os microrganismos do gênero estafilococos não são considerados parte
da microbiota residente bucal humana, mas podem atuar como agentes
patogênicos oportunistas em pacientes submetidos a tratamento sistêmico
prolongado com agentes antimicrobianos ou imunossupressores9,10.
Candida spp. podem ser consideradas leveduras comensais do
ambiente bucal. C. albicans é a espécie predominante, representando 60 a
20
70% de todos os isolamentos11,12,13 em boca. As razões para o estabelecimento
de infecções causadas por esse micro-organismo têm sido associadas à
imunossupressão, lesões nas mucosas, má higiene bucal e tratamento a longo
prazo com antibióticos ou corticóides14,15.
Pseudomonas aeruginosa trata-se de um bacilo gram negativo,
responsável por 70% das infecções por pseudomonas no ser humano; a
exemplo do S. aureus, é uma bactéria oportunista e possui diversos fatores de
patogenicidade, tais como: capacidade de se organizar em biofilme, produção
de enzimas extracelulares e toxinas, mecanismos de quorum sensing e
resistência a muitos antimicrobianos16,17 .
Consi*derando o aumento da ocorrência de infecções bucais
persistentes ou refratárias relacionadas com micro-organismos
superinfectantes do meio ambiente bucal, é requerido o desenvolvimento de
soluções naturais alternativas e economicamente viáveis, substituindo
antimicrobianos usualmente utilizados.
No Brasil, existem várias espécies de plantas nativas potencialmente
medicinais, tais como Solanum paniculatum Linn. Essa espécie é conhecida
popularmente por “jurubeba” e está listada na Farmacopeia Brasileira18 e
pertence a "Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema
Único de Saúde (Renisus)”19 por apresentar potencial em gerar produtos de
interesse do Ministério da Saúde. A raiz de jurubeba é considerada a parte
mais ativa da planta. No que se refere a aspectos científicos, são constatadas
ação antibacteriana, antifúngica, antiviral, moluscicida, anticancerígena, anti-
inflamatória, antioxidante, diurética, antidiarreica, hepatoprotetora,
gastroprotetora e antiulcerogênica20-25 .
Spondias mombin, popularmente conhecida como “cajá”, é amplamente
utilizada na medicina popular por apresentar componentes com atividade anti-
inflamatória26, embora também seja utilizada no tratamento da diarreia aguda,
do diabetes mellitus e da anemia27.
Os frutos de Lycium barbarum Linn, também chamado de “gojiberry” ou
“wolfberry”, é um tradicional fitoterápico de origem chinesa que tem sido
utilizado por mais de 2300 anos na Ásia Oriental28 No que se refere a
evidências científicas, possui relatos de ação antioxidante, imunomodulador,
21
antitumoral, neuroprotetor, radioprotetor29,30, antidiabetes, anti-osteoporose,
antifatiga28 e antifúngica e antibacteriana31.
Nesse sentido, torna-se de grande valia a realização deste estudo, para
a determinação da ação antimicrobiana, antiaderente, bactericida e fungicida
dos extratos de Solanum paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá)
e Lycium barbarum Linn (gojiberry). Ademais, é de fundamental importância a
investigação dos seus perfis fitoquímicos e citotoxicidade, favorecendo a
aplicação segura de substâncias naturais bioativas sobre micro-organismos
associados com infecções persistentes ou refratárias.
22
2 JUSTIFICATIVA
A utilização de plantas na prevenção e tratamento de doenças
infecciosas bucais e como agente antibiofilme, continua a ser valorizada em
muitas partes do mundo, é recomendado pela Organização Mundial de Saúde
(OMS) (1987), e em nosso país muitos estudos têm sido desenvolvidos visando
avaliar o uso popular de plantas na Odontologia, tornando possível a
identificação de espécies vegetais com potencial atividade biológica.
Pesquisas sobre novos agentes antimicrobianos são o resultado da
colaboração interdisciplinar baseada no conhecimento empírico oriundo de
“raizeiros”, “mateiros”, “rezadeiras”, erveiros, curandeiros, pajés e outros; aliada
à etnofarmacologia, botânica, química dos compostos naturais, Microbiologia,
Farmacologia e clínica. Muitos extratos e seus compostos fitoquímicos, exibem
in vitro e in vivo propriedades antimicrobianas estimulando a pesquisa de
substâncias naturais bioativas para tratamento de infecções bucais associadas
a micro-organismos endógenos e superinfectantes do ambiente bucal.
Além disso, tomando como base o conceito de Atenção Primária de
Saúde, a Fitoterapia se configura como uma ótima alternativa terapêutica e de
grande aceitação social, estando, portanto, este recurso em consonância com
os pressupostos do Sistema Único de Saúde.
A utilização das plantas medicinais, nos Programas de Atenção Básica,
só viria a melhorar a assistência à saúde, sobretudo em Odontologia na medida
em que tal uso é acorde com os princípios da Estratégia de Saúde da Família,
visando à integralidade das ações e a utilização de uma tecnologia prática e
acessível a todas as famílias e comunidades, com um custo reduzido, não
levando a descontinuidade das ações.
Logo, justifica-se a realização do presente estudo e o investimento no
desenvolvimento de soluções naturais alternativas e economicamente viáveis,
inclusive, para o tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias.
Além disso, vislumbra-se a possibilidade concreta de inserção da prática de
uso de fitoterápicos e das plantas medicinais como recurso terapêutico nas
Unidades Básicas de Saúde ofertada pelo Sistema Único de Saúde (SUS),
mormente representada pela Estratégia de Saúde da Família.
23
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
A presente pesquisa teve como objetivo avaliar a ação antimicrobiana,
bactericida, fungicida e antiaderente, dos extratos vegetais de Solanum
paniculatum Linn (jurubeba), Spondias mombin (cajá) e Lycium barbarum Linn
(gojiberry) sobre micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal,
bem como investigar os seus perfis químicos e citotoxicidade.
3.2 Objetivos Específicos
3.2.1 Realizar um screening fitoquímico dos extratos de Solanum
paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn através de
reações químicas e Cromatografia em Camada Delgada (CCD).
3.2.2 Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Cinética
Bactericida (CB) e Fungicida (CF) dos extratos de Solanum paniculatum Linn,
Spondias mombin e Lycium barbarum Linn frente Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e
isolados do ambiente bucal.
3.2.3 Determinar a Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
dos extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium
barbarum Linn frente Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente
bucal.
3.2.4 Avaliar o potencial citotóxico dos extratos de Solanum paniculatum
Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn sobre fibroblastos da linhagem
3T3.
24
4 MÉTODO
4.1 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE SOLANUM PANICULATUM LINN
(JURUBEBA), SPONDIAS MOMBIN (CAJÁ) E LYCIUM BARBARUM LINN
(GOJIBERRY)
4.1.1 Local de execução e Obtenção do material
As raizes de Solanum paniculatum foram coletadas na cidade do Natal –
RN (Tabua- RN S 5º 51’ 30” W 5º 51’ 30”). A preparação do extrato de S.
paniculatum Linn. foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia,
Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.
As folhas de Spondias mombin foram coletadas em uma fazenda
particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S°
28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A preparação do extrato de Spondias mombin foi
conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia,
Centro de Ciências da Saúde, UFRN.
Os frutos secos de Lycium barbarum foram obtidos em loja
especializada na cidade do Rio de Janeiro-RJ. A preparação do extrato de
Lycium barbarum Linn foi conduzida no Laboratório de Farmacognosia,
Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, UFRN.
4.1.2 Obtenção dos extratos da raiz de Solanum paniculatum Linn, folhas
de Spondias mombin e frutos de Lycium barbarum Linn, e determinação
de sua concentração
As raízes secas de Solanum paniculatum foram submetidas à
maceração (1:2 p/ v, planta / etanol) durante 72 h à temperatura ambiente para
se obter o extrato etanólico de S. paniculatum. O macerado foi filtrado a vácuo,
obtendo-se o extrato etanólico (EE) das raízes de S. paniculatum e seco sob
pressão reduzida, com auxílio do Rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®,
Nova Castel, DE). Para os testes biológicos o EE foi liofilizado.
As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob
temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em
25
um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol:
H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato
hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente
orgânico com auxílio de um rotaevaporador (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova
Castel, DE) à temperatura de 45° C. Para os testes biológicos o EH foi
liofilizado.
O extrato dos frutos secos de Lycium barbarum foi preparado por
maceração por 7 dias com álcool etílico 70 %, na proporção 1:5 (droga vegetal:
solvente, p/v). O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato
hidroetanólico (EH) dos frutos de L. barbarum. O EH foi seco sob pressão
reduzida com auxílio de um evaporador rotatório (Buchi R-210 Rotavapor®,
Nova Castel, DE) a temperatura não superior a 45º C, obtendo-se o extrato
seco de L. barbarum. Para os testes biológicos o EH foi liofilizado.
4.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA
4.2.1 Triagem Fitoquímica
As reações de identificação dos grupos fitoquímicos foram realizadas por
métodos clássicos, descritos por Carvalho, Gosmann e Schenkel (2007);
Zuanazzi e Montanha, (2007); Santos e Mello (2007). Os resultados foram
observados por meio do desenvolvimento de coloração e formação de
precipitado. Os metabólitos secundários investigados foram: compostos
fenólicos (reação de cloreto férrico); flavonoides (reação de Schinoda ou
cianida), taninos (reação de gelatina) e alcaloides (reações de precipitação com
os reagentes Mayer, Bertrand, Wagner e Dragendorff). O procedimento foi
realizado conforme Langassner e Giordani (2013).
4.2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
As condições cromatográficas utilizadas na análise por CCD foram:: i.
adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F254; ii: fase móvel:
foram escolhidos sistemas eluentes específicos, de acordo com os metabólitos
secundários de interesse e otimizados de acordo com o resultado obtido e iii:
26
reveladores: vanilina sulfúrica (como revelador universal); cloreto férrico
(detecção de compostos fenólicos); Reagente Natural A 0,5 %
(difenilboriloxietilamina), (detecção específica de flavonoides)/seguido de
observação sob luz ultravioleta em 365 nm; e Reagente de Drangendorf
(detecção de alcaloides) (Wagner; Bladt, 2001).
4.3 ENSAIOS IN VITRO DOS EXTRATOS DE SOLANUM PANICULATUM
LINN, SPONDIAS MOMBIN E LYCIUM BARBARUM LINN
4.3.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima dos extratos de
Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum Linn
A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a
metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação
da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As linhagens microbianas foram
cultivadas em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan,
Estados Unidos) e incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri
contendo Agar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi
introduzida solução salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram
confeccionados cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de
diâmetro em cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até
a diluição em água destilada 1:512) nos orifícios, e as placas foram incubadas
a 37°C por 24 horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada
linhagem. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o
digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company,
Nova York, EUA) e nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São
Paulo, Brasil).
Foi considerada CIM, a menor concentração dos extratos capaz de inibir
o crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,
aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).
27
Figura 1 - Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da atividade antimicrobiana dos extratos sobre cada amostra ensaiada.
28
4.3.2 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida do extrato de
Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium barbarum
A curva microbiana frente aos extratos de Solanum paniculatum Linn,
Spondias mombin e Lycium barbarum foi avaliada pelo método de Peyret et al.
(1990). As amostras foram inoculadas em caldo nutritivo (BHI- DIFCO®,
Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e
subcultivadas em Caldo Mueller Hinton – (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos)
por 1 hora, obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. A 9mL da cultura
microbiana, foi adicionado 1mL de cada extrato (bruto e na CIM), e ao tubo
controle foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram
mantidos na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4,
6, 8, 10 e 24 horas de incubação e semeadas em placas com Agar Mueller
Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada ensaio foi realizado em
duplicata.
A leitura das placas foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC,
pelo método padrão de contagem de unidades formadoras de colônias
(UFC/mL) placas, observando o potencial bactericida e fungcida dos extratos
por um determinado tempo. O tempo de morte de bactérias e levedura foi
expresso em Log10.
29
Figura 2: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética
Bacteriana e Fungicida dos extratos testados para cada amostra ensaiada.
1mL de extrato +
9mL do subcultivo
1mL de água
destilada + 9mL do
subcultivo
Plaqueamento em Agar Mueller
Hinton Plaqueamento em Agar
Mueller Hinton
Plaqueamento em Agar Mueller Hinton
2, 4, 6 e 24 h 2, 4, 6 e 24 h
18-20 h
48 h
30
4.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência dos
extratos de Solanum paniculatum Linn, Spondias mombin e Lycium
barbarum Linn
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) das bactérias e
leveduras ao vidro, foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer
(1996).
A partir dos crescimentos bacterianos e fúngicos, as linhagens foram
sub-cultivadas a 37ºC em caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados
Unidos), obtendo-se um inoculo de 106 UFC/mL. Foram distribuídos 1,8 mL dos
subcultivos em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL da
soluções correspondentes às escalas (diluições) dos extratos. A incubação foi
feita a 37°C por 24 horas, com os tubos inclinados a 30°. A leitura foi realizada
através da observação visual da aderência das bactérias e leveduras às
paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em
duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi
utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%
(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e nistatina
100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu
a aderência ao tubo de vidro.
31
Figura 3: Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Concentração
Inibitória Mínima de Aderência dos extratos sobre cada amostra ensaiada.
Overnight em caldo BHI
Estufa (37ºC)
24h
Caldo Mueller-
Hinton
1,8 mL da
cultura
0,2 mL do
extrato
CONTROLE
NEGATIVO
Incubação
CONTROLE
POSITIVO
32
4.3.4 Avaliação do potencial citotóxico dos extratos de Solanum
paniculatum, Spondias mombin e Lycium barbarum sobre fibroblastos da
linhagem 3T3
Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório
de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica,
UFRN). Nesse teste foi analisada a capacidade de celulas tratadas com os
extratos em reduzir o composto MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difenil tetrazolio) a sais de formazam.
Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com
7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em
4 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado em
meio básico; (ii) grupo Solanum paniculatum: cultivado em meio básico
adicionado do extrato em concentração avaliada pelos testes supracitados; (iii)
grupo Spondias mombin: cultivado em meio básico adicionado do extrato em
concentração avaliada pelos testes supracitados; (iv) grupo Lycium barbarum:
cultivado em meio básico adicionado do extrato em concentração avaliada
pelos testes supracitados.
A citotoxicidade dos extratos foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h
depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade
mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das
células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao
NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso,
as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de
5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram
incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4
horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com
100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de
ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments,
USA).
33
4.3.5 Análise Estatística
Os resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima
(difusão em ágar) foram coletados, organizados e apresentados em forma de
tabelas com os seus respectivos valores das médias dos halos, indicando a
inibição do crescimento microbiano. Posteriormente, foram transferidos para
um banco de dados informatizado e calculados os parâmetros estatísticos que
incluiram valores das respectivas medidas descritivas: mínimo, máximo, média
e desvio padrão. O nível de confiança utilizado para a obtenção dos intervalos
foi de 95%. Ao nível de 5% de significância foi utilizado o teste t-Student ou de
Mann-Whitney na comparação da inibição microbiana mínima dos extratos em
relação aos controles positivos.
Para a Cinética Bactericida e Fungicida e a Concentração Inibitória
Mínima de Aderência a análise foi descritiva, através do método padrão de
contagem de UFC/mL e através da observação visual da aderência dos
microrganismos às paredes do tubo de vidro, respectivamente.
Na avaliação do potencial citotóxico, a reducao do composto MTT a
formazana foi verificada por espectrofotometria e foi considerada diretamente
proporcional a atividade mitocondrial e viabilidade celular.
Os dados foram analisados mediante o emprego do programa SPSS
(Statistical Package for Social Sciences), versão 22.0.
34
5 ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 O artigo “Phytochemical screening and antimicrobial effect of Solanum
paniculatum L. on superinfecting microorganisms from an oral environment” foi
enviado para o periódico “Complementary Therapies in Medicine” e
encaminhado pela revista para o periódico “Journal of Ethnopharmacology”,
que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina
II.
35
Phytochemical screening and antimicrobial effect of Solanum
paniculatum L. on superinfecting microorganisms from an oral
environment
Maria Regina Macêdo-Costaa*, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria
Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa
a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.
Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil.
b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R.
Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.
1 Corresponding author:
Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83
99921-4856, E mail: [email protected]
36
E-mail addresses: [email protected] (Maria Regina Macêdo-Costa),
[email protected] (Julia Morais Fernandes), [email protected] (Silvana Maria
Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de Lima).
37
Abstract
Objectives: The aim of the study was to assess the antimicrobial effect of
Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida albicans, as well
as to characterize its phytochemical profile. Method: The phytochemical
screening was investigated through chemical reactions and Thin Layer
Chromatography (TLC). During the TLC analysis were used the mobile phases:
AcOEt: formic acid: MeOH: water; (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v); BuOH: formic acid:
water (3:1:1, v/v/v) and chloroform: MeOH (8:2, v/v). Sulfuric vanillin, 1% FeCl3
solution, 0.5% natural reagent and Dragendorff reagent were used to detect
secondary metabolites. Subsequently, the Minimum Inhibitory Concentration
(MIC), Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) and the
Bactericidal and fungicidal Kinetics of S. paniculatum were determined. The
student´s t-test was applied, with the level of significance set at p<0.05.
Chlorhexidine digluconate and Nystatin were used as the positive controls.
Results: The results were confirmed through chemical reactions: phenolic
compounds; flavonoids; tannins and alkaloids. The TLC analysis suggested that
flavonoids were the most common compounds. S. paniculatum exhibited a
bacteriostatic and fungistatic effect and there was a statistically significant
difference between the products in relation to the dilutions/concentrations: 1:64/
7.81 mg/mL (E. faecalis ATCC); 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis - isolated from
oral environment- OE); 1:128/ 3.90 mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90
mg/mL (C. albicans ATCC). S. paniculatum exhibited a greater anti-adherent
effect (1:512/ 0.97 mg/mL) than the controls and a bactericidal and fungicidal
effect when the crude extract was used. Conclusion: S. paniculatum exhibited a
significant antimicrobial effect, confirmed by the pharmacological findings, and
thus stimulates further research of bioactive natural substances for the
treatment of persistent or refractory oral infections.
38
Keywords: Solanum paniculatum; Microbiology; Phytotherapy; Thin layer
chromatography
39
1.Introduction
Health professionals often need to treat infections caused by specific
microorganisms that are usually not found in the site of interest, or by
microorganisms that colonize a site that is generally sterile. The mouth is a
natural microbiome that is essential to the normal physiological development of
the host1.
However, some microorganisms, such as Enterococcus faecalis and
Candida albicans, have become opportunistic pathogens and are now
considered the most resistant species in the mouth.2 They are also considered
as superinfecting microorganisms in persistent periodontal, endodontic and
peri-implant infections3-8.
Enterococci are natural inhabitants of the intestinal and genital microbiota
of humans. The odontological source of infection by enterococci is probably
exogenous, given that they are only transitory colonizers of the oral
environment and have the capacity to adhere and survive in dental biofilm. E.
faecalis is one of the most commonly isolated species of enterococci. This
species is a gram-positive anaerobic facultative coccus, which is often
correlated with hospital infections.6,7 It exhibits several different pathogenicity
factors, including: the capacity to survive long-term starvation; the ability to
adapt and persist in a variety of adverse environments, without the support of
other bacteria; the production of gelatinase, which provides thicker biofilm; the
capacity to grow in an alkaline pH and survive at temperatures of 60°C for 30
minutes; the ability to suppress the action of lymphocytes and stimulate an
inflammatory response, indirectly damaging tissues and generating a natural
resistance to several antimicrobial drugs.6,7
Candida albicans is the most commonly isolated fungus in the oral
environment. The prevalence of C. albicans ranges from 47% to 75% among
the yeast species isolated in the mouth. The back of the tongue is the main
habitat of yeasts, although these microorganisms can be found in the buccal
mucosa, palate, saliva and on dental surfaces. Its pathogenicity factors include
the following: the ability to adhere to hydroxyapatite coated with saliva; the
capacity to bind with native or denatured collagen; the capacity to degrade
40
dental collagen and induce inflammatory reactions; the ability to arrange itself
as biofilm on biotic and abiotic surfaces and survive as a monoinfection. 4, 6, 9
41
Due to the prevalence of these multi-resistant strains, the search for new
strategies to combat oral infections has been encouraged,2 particularly in terms
of strategies that involve the use of natural antimicrobials and phytochemicals.
10,11
In Brazil, several species of potentially medicinal native plants exist,
including Solanum paniculatum. This species is commonly known as “jurubeba”
and belongs to the Solanaceae family, which is found in several regions in
Brazil.12 Stehman It is widely used as a remedy for bronchitis, coughs, arthritis,
jaundice, hepatitis, fever and stomach problems. The plant is believed to
possess anti-viral, anti-cancer, anti-inflammatory, antioxidant, diuretic,
hepatoprotective and antimicrobial properties.13-17 The chemical constitution of
the species contains flavonoids, amides, steroids, lignans, steroidal saponins
and steroidal alkaloids.14-19 This species is listed in the Brazilian
Pharmacopoeia20 and the "National Report on Medicinal Plants of Interest to
the Single Health System (Renisus),” 21 due to its potential for use in products of
interest to the Brazilian Ministry of Health.
The aim of the present study was to phytochemically analyze and assess
in vitro the antimicrobial, anti-adherent, bactericidal and fungicidal effects of root
extract of Solanum paniculatum on Enterococcus faecalis and Candida
albicans, which were provided by the ATCC and isolated from an oral
environment (OE).
2.Materials and Methods
2.1 Preparation of the Solanum paniculatum extract
The roots of S. paniculatum were obtained in the Brazilian city of Natal-
RN, which has the following geographical coordinates: latitude 5º 51’ 30” S and
longitude 5º 51’ 30” W. The botanical identification was performed by Prof. Dr.
Maria Iracema Bezerra Loyola (Biology Department/UFRN). The voucher
specimen was deposited in the Herbarium of the Biosciences Center of the
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN 5468).
The dry roots were submitted to maceration (1:2 p/ v, plant / ethanol) for
72 h at room temperature to obtain the ethanolic extract of S. paniculatum
42
(yield: 1, 0.80% in relation to the dry plant). The macerate was vacuum filtered
to obtain the ethanolic extract (EE) of the roots of S. paniculatum and dried
under reduced pressure from a
43
Rota evaporator (Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). The dry extract
was then placed in distilled water, prior to lyophilization.
2.2 Phytochemical screening of the roots of Solanum paniculatum
The identification reactions for the phytochemical screening were
performed using standard methods.22-24 The results were recorded based on
the development of coloration and precipitate formation. The following
secondary metabolites were investigated: phenolic compounds (reaction of
ferric chloride); flavonoids (reaction of Shinoda or cyanide), tannins (reaction of
gelatin) and alkaloids (precipitation reactions with Mayer, Bertrand, Wagner and
Dragendorff reagents).
2.3 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
The chromatographic conditions used in the TLC analysis were as
follows: i. adsorbent: F254 silica gel aluminum chromatoplates (Merck®,
Darmstadt, Germany); ii: mobile phase: AcOEt: formic acid: MeOH: water
(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v) and chloroform:
MeOH (8:2, v/v) and iii: developers: vanillin sulfuric acid (bitter compounds,
saponins and essential oil compounds); ferric chloride (detection of phenolic
compounds); natural reagent A 0.5% (specific detection of flavonoids)/followed
by observation under ultraviolet light (365 nm); Dragendorff reagent (detection
of alkaloids). The retention factors (Rf), the color and the behavior of the points
were compared with the chromatographic profiles of reference substances in
the literature. 25
2.4 Microbial strains
Samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012) and Candida albicans
(ATCC 36802) were obtained from the culture collection of the Laboratory of the
Universidade Estácio de Sá (UNESA) and the Laboratory of Mycology of the
UFRJ (Rio de Janeiro/RJ). These samples were then reactivated in the
Laboratory of Microbiology in the Dentistry Department of the CCS/UFRN.
44
Enterococcus faecalis (OE 44) was obtained from the culture collection of
the Laboratory of Microbiology in the UNESA (Research Ethics Committee of
the Hospital Universitário Clementino Fraga Filho protocol no. 140/04). Samples
were collected from patients in endodontic clinics of the UFRJ and UNESA.
Filter paper cones were introduced in the root canals. The material was
transferred to Enterococcosel agar and incubated for 72 hours at 35°C.
Subsequently, they were introduced to blood agar plates and incubated at 35°C
for 72 hours. Pure colonies were submitted to tests to identify the enterococci
species (Gram-staining, morphology of the colony, catalase test, growth in NaCl
broth, arginine hydrolysis, use of pyruvate, motility, pigmentation production and
carbohydrate fermentation). The identification was conducted using the PCR
and specific E. faecalis primers.
Candida albicans (OE 100) was obtained from the culture collection of
the Laboratory of Microbiology in the Department of Clinical and Toxicological
Analysis of the UFRN (Research Ethics Committee of the Hospital Universitário
Onofre Lopes protocol no. 152/07). The clinical samples were collected from the
saliva of patients, which was seeded in Sabouraud-dextrose agar. They were
identified using germ tube evidence, hypertonic broth, tolerance to temperatures
of 42ºC, micro-cultivation, the assimilation of carbohydrates, sugar fermentation
and the PCR.
2.5 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
Antimicrobial activity on the plates (to determine the MIC) was analyzed
in accordance with the adapted methodology of Bauer and collaborators.26 The
microbial strains Enterococcus faecalis (ATCC 292012), Enterococcus faecalis
(OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida albicans (OE 100) were
cultured in a nutrient broth (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan,
USA) and then incubated at 37°C for 18-20 hours. Saline solution was
inoculated with each microbial growth and was then added to petri dishes
containing Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Five standardized
holes (approx. six mm in diameter) were created in each plate. In total, 50μL of
the test substance (crude extract up to a dilution of 1:512 in distilled water) was
added to the holes and the plates were incubated at 37°C for 24 hours. Each
45
trial was conducted in triplicate for each strain. The same procedure was used
for the positive control, chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, Colgate-
Palmolive
46
Company, New York, USA) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-
Myers, São Paulo, Brazil).
The MIC was considered the lowest concentration of the extract capable
of inhibiting microbial growth, represented by the presence of an inhibition halo,
which was measured using a caliper (Digimess®, São Paulo, Brazil).
Using these MIC results and a level of significance of 5%, the students t-
test was conducted (p<0.05) to compare the antimicrobial activity of the extract
and the positive controls.
2.6 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics
The bactericidal and fungicidal potential of the S. paniculatum extract
was assessed using an adapted version of the method described by Peyret and
collaborators.27 The samples of Enterococcus faecalis (ATCC 292012),
Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and Candida
albicans (OE 100) were inoculated in a BHI nutrient broth (DIFCO®, Michigan,
USA), incubated at 37º C for 18 to 20 hours and sub-cultured in Mueller Hinton
agar (BROTH) (DIFCO®, Michigan, USA) for one hour. To the 9mL of each
microbial culture, we added 1mL of the extract (crude extract and the MIC).
Subsequently, 1mL of distilled and sterilized water was added to the control
tube. The tubes were stored at 37º C for 24 hours, with aliquots collected after
2, 4, 6 and 24 hours of incubation. These were then seeded in petri dished with
Mueller Hinton agar (DIFCO®, Michigan, USA). Each procedure was performed
in duplicate.
Readings were taken after incubation for 48 hours at 37ºC using the
standard method of counting colony forming units (CFU/mL) at specific times.
2.7 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence
(MICA)
47
The Minimum Inhibitory Concentration Adherence (MICA) of the S.
paniculatum extract was determined as described by Gerbara, Zardetto and
Mayer, 28 Enterococcus faecalis (OE 44), Candida albicans (ATCC 36802) and
Candida albicans (OE 100) strains were sub-cultured at 37ºC in Mueller-Hinton
agar (DIFCO®, Michigan, USA). Subsequently, 1.8 mL of the sub-culture was
placed in hemolysis tubes and then 0.2mL of the corresponding solution was
added to the extract dilutions. The readings were taken 24 hours later through
visual observations of the adherence of the microorganisms to the walls of the
tube (after shaking). Each trial was performed in duplicate against each strain
selected. The same procedure was used for the positive control, the
chlorhexidine digluconate 0.12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company,
New York, USA.) and nystatin 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São
Paulo, Brazil).
The MICA was defined as the lowest concentration of the agent that
impeded the adherence to the glass tube.
3.Results
3.1 Identification Reactions
Table 1 displays the results obtained in the preliminary phytochemical
screening performed with root extracts of S. paniculatum. The phytochemical
screening of the S. paniculatum extract confirmed the presence of phenolic
compounds, flavonoids, tannins and alkaloids.
.
3.2 Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
The digital prints of the extract were obtained from the TLC. When the
mobile phase involved the use of AcOEt: formic acid: MeOH: water
(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v) and BuOH: formic acid: water (3:1:1, v/v/v), both of
which were developed with vanillin sulfuric acid + heating, yellow and violet
colored bands were observed, suggesting the presence of flavonoids and
saponins (steroids or terpenes), respectively. When the development was
performed with ferric chloride, brown colored bands were visualized, suggesting
48
the presence of phenolic compounds. Subsequently, natural reagent A (0.5%)
was used and the samples were studied under UV light (365 nm), which
confirmed the strong presence of bands characteristic of flavonoids in these
fractions (Figure 1). When chloroform: MeOH (8:2, v/v) was used as the mobile
phase and Dragendorff reagent was used for development, two orange-colored
bands were visualized, suggesting the presence of alkaloids (Figure 1).
3.3 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
The S. paniculatum extract had an effect on all of the microorganisms
tested, with inhibition halos ranging from 12 to 20 mm. The extract exhibited an
antibacterial affect up to the dilution of 1:64 (7.81 mg/mL) for E. faecalis ATCC
and an antifungal effect up to the dilution of 1:256 (1,95 mg/mL) for C. albicans
(OE), which was the most sensitive microorganism to the extract. The positive
controls were effective on all of the microorganisms and the inhibition halos
ranged from 10 to 24 mm. A statistically significant difference was found
between the products in relation to the dilutions/concentrations of 1:64/ 7.81
mg/mL (E. faecalis ATCC), 1:32/15.65 mg/mL (E. faecalis OE), 1:128/ 3.90
mg/mL (C. albicans OE) and 1:64/3.90 mg/mL (C. albicans ATCC).
3.4 Determination of Bactericidal and Fungicidal Kinetics
The bactericidal and fungicidal effect of the crude extract of S.
paniculatum was observed in the first two hours of contact between the extract
and the sample of C. albicans (OE) and in the first six hours of contact between
the extract and E. faecalis (ATCC and clinical isolate), as well as C. albicans
ATCC.
3.5. Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence
(MICA)
The S. paniculatum extract exhibited an anti-adherent effect on all of the
microorganisms tested up to the dilution of 1:512 (0.97 mg/mL). Chlorhexidine
49
exhibited an anti-adherent effect up to a dilution of 1:512, while nystatin´s effect
was recorded up to 1:4.
4. Discussion
Studies of new antimicrobial agents are the result of interdisciplinary
collaboration involving ethnopharmacological, botanical, chemical (natural
compounds) microbiological, pharmacological and clinical data, as well as input
from healers. Many extracts and their phytochemical compounds, particularly
secondary metabolites, exhibit in vitro and in vivo antimicrobial properties that
are recommended in the prevention and treatment of infectious diseases,
including those that involve superinfecting microorganisms. 29
Therefore, the present study sought to chemically characterize and
assess the bacteriostatic, fungistatic, anti-adherent, bactericidal and fungicidal
activity of an extract from the roots of S. paniculatum.
To do so, the S. paniculatum extract was analyzed through preliminary
phytochemical screening using TLC with different developers to identify the
classes of secondary metabolites. The results obtained corroborate previous
pharmacological studies. 15, 16,19
Allaker and Douglas (2009)30 described several plant constituents with
antimicrobial properties and highlighted the presence of phenolic compounds,
flavonoids and tannins. Recently, Xie et al. (2015)31, 32 reported that the
antimicrobial effect of flavonoids against a wide range of pathogenic
microorganisms could be due to the inhibition of the synthesis of nucleic acid,
the inhibition of the function of the cytoplasmic membrane and the inhibition of
the formation and fixation of biofilm. According to Silva et al (2005),33 flavonoids
are the most abundant active metabolites in the Solanum genus.
Concerning the active mechanism of tannins, Loguercio and
collaborators (2005) 34 suggested that they inhibit bacterial and fungal enzymes
and/or complex with the substrates of these enzymes. Tanins act on the cellular
mechanisms of microorganisms, modifying their metabolism, and may mix with
metal ions, decreasing the availability of the ions needed for the microbial
metabolism (Scalbert, 1991).35 Nordin et al. (2013)36 reported that the
50
adherence of Candida species was reduced by up to 80% after exposure to
phenolic compounds.
Saponins are polyphenolic compounds that were also found in the
present study. The biological activity exhibited by these compounds has been
widely described in the literature, leading to their use in the pharmaceutical
industry.16 Saponins were also identified in the roots of this species as
isojuripidine, isojurubidine, isopaniculidine and jurubidine.37-39 Recently, it has
also been confirmed that a polyphenol found in green tea inhibits bacterial
growth and the formation of the E. faecalis biofilm.40 Thus, the presence of
phenolic and polyphenolic compounds in plant extracts can affect the
organization of microbial biofilm. 2
Alkaloids are also an important class of secondary metabolites, and they
exhibit several pharmacological properties, including antimicrobial, 41,42, anti-
tumoral 43 and anti-herpes effects.44 Alkaloids are notable in the Solanaceae
family, particularly tropane alkaloids.45 Many alkaloids have been identified in
connection with the species S. paniculatum, including jurubeba, jurubebine,
jubebine, and solanine.46,47
Once the secondary metabolites with previously known and studied
antimicrobial activity had been identified, an in vitro assessment of antibacterial
and anti-fungal activity was conducted. ATCC strains are standard strains,
with well-known susceptibility profiles. However, in order to assess the
antimicrobial activity of a new product, it was necessary to include strains
with a clinical origin, as they exhibit different susceptibility profiles, thereby
ensuring greater accuracy in the assessment of the antimicrobial action of
the agents of interest.
The S. paniculatum extract had a bacteriostatic and fungistatic effect on
all of the strains tested. In the case of the Enterococcus faecalis isolated from
the oral environment (CIM= 15.65 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly
higher activity levels (p<0.05) in the dilution of 1:32. For the Enterococcus
faecalis ATCC (CIM=7.81 mg/mL), chlorhexidine exhibited significantly higher
activity levels (p<0.05) in the dilutions of 1:2 and 1:64. However, there were no
statistically significant differences (p>0.05) between the products for the
dilutions of 1:4 and 1:16, both of which produced the same effect. Note that for
both the extract and the control, the samples isolated from the oral environment
51
exhibited greater resistance to chemical agents, probably due to the fact that
they were in an oral environment and had been exposed to antimicrobials and
interacted with other species, thereby contributing to the increase in selective
pressure and the acquisition of resistance mechanisms.
Chlorhexidine digluconate (the gold standard) has been suggested for
the irrigation of root canals, as well as periodontal and peri-implant sites, due to
its wide spectrum of activity and substantiality. However, in the case of
persistent or refractory infections, in which Enterococcus faecalis is often
isolated and organized in biofilm, permanent infections can occur after
conventional antimicrobial procedures.7, 8 In addition, previous studies have
reported an increase in the resistance of strains to conventional synthetic
chemical agents and this, allied to the high cost, the potential side effects and
the limitations on use for prolonged periods, has led to the suggested use of
natural products.30,48 In the present study, both chemical agents had an
antimicrobial effect on Enterococcus faecalis in its planktonic form, although it
was also necessary to perform experiments on microorganisms growing in the
biofilm.
Concerning Candida albicans isolated from the oral environment
(MIC=1.95 mg/mL), nystatin exhibited significantly higher activity levels (p<0.05)
in the dilution of 1:128. In the dilution of 1:256 (corresponding to MIC), no
statistically significant difference was found between the products (p>0.05). For
the ATCC strain of Candida albicans (MIC =3.90 mg/mL), nystatin exhibited
significantly higher activity levels (p<0.05) up to a dilution of 1:64. In the dilution
of 1:128 (MIC), only the extract exhibited a fungistatic effect.
Nystatin and fluconazole are the most commonly used antifungals in
dental practice.49-51 However, the use of these agents can be limited, due to
microbial resistance to conventional synthetic agents, which leads to inefficient
therapy.50 Studies have also shown that a mature biofilm of C. albicans
increases the resistance of fungal cells when faced with antimicrobial agents.
The search for new antifungal agents and the characterization of new targets,
including resistant strains, has therefore been proposed. Antifungal agents
ideally should exhibit broad spectrum activity and no toxicity for the host. In the
present study, the fungistatic activity of the extract was higher when faced with
the most prevalent yeast in the oral environment. 4
52
The bactericidal and fungicidal kinetics of the crude extract were also
determined in relation to the MIC of S. paniculatum. The bactericidal/fungicidal
effect of the crude extract of S. paniculatum (no dilution) was observed in the
first two hours of contact with the C. albicans sample (isolated from the oral
environment) and in the first six hours of contact with E. faecalis (ATCC and
OE) and C. albicans ATCC. When the extract was diluted (MIC), it only had a
bactericidal effect on E. faecalis ATCC.
When determining the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence
(MICA), it was noted that the extract exhibited an anti-adherent effect,
represented by the absence of microbial adherence to the glass tube, which
simulated a surface of the oral environment. This was the case for all of the
samples tested. An anti-adherent effect was confirmed up to the dilution of
1:512 (MICA: 0.97 mg/mL), which was similar to that observed for chlorhexidine
against E. faecalis (ATCC and the clinical isolate) and higher than that recorded
for nystatin against Candida albicans (ATCC and the clinical isolate).
Macedo-Costa et al. (2014)24 also assessed the antibacterial effect of
root extracts of S. paniculatum, although they assessed the effect on
endogenous oral bacteria: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S.
oralis, S. salivarius and Lactobacillus casei. The extract exhibited an MIC of
7.81 mg/mL and a MICA value of 62.5 mg/mL. It was bactericidal at a
concentration of 500 mg/mL in two hours of contact with S. mutans and in four
hours for the MIC. The phytochemical analysis confirmed the presence of sulfur
compounds, gums and lactones (alkaloids), with a notable presence of phenols
(flavonoids and tannins), both of which were also found in the present study.
In these experiments, S. paniculatum exhibited bacteriostatic,
fungistatic, anti-adherent, bactericidal and bacteriostatic activity in vitro on the
microbial suspension of the monoculture and confirmed the strong presence of
flavonoids, tannins, saponins and alkaloids, which provides a probable
explanation for the pharmacological activity of the extract. However, in order to
extrapolate these data for use in clinical dentistry against persistent infections,
further studies that consider the antimicrobial effects of S. paniculatum on
superinfecting microorganisms in monoculture biofilm and multi-species biofilm
are required.
53
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Acknowledgment
No financial support was received during the current study.
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57
Table
Figure
Figure 1 – TLC of ethanolic extract of S. paniculatum roots. A) Mobile phase: ethy acetate: formic acid: methanol: water (10:0.5:0.6:0.2, v/v/v/v). Adsorbent: sílica gel plates 60 F254. Spray reagent: sulfuric vanillin + heating. Observation: Visible. B) Chromatographic conditions similar to plate A. Spray Reagent: Ferric chloride. Observation: Visible C) Chromatographic conditions similar to plate B. Spray Reagent: Natural Product 0.5%. Observation: UV = 365 nm. D) Mobile phase: chloroform: methanol (8:2, v/v). Spray reagent: Dragendorff reagent. Observation: Visible.
Table 1 Preliminary phytochemical screening of S. paniculatum roots.
Reactions Ethanolic extract
Ferric chloride Reaction +
Shinoda Reaction +
Gelatina Assay +
Alkaloids Assay +
58
5.2 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antimicrobial action of Spondias mombin on superinfecting microorganisms from an oral environment” será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.
59
Phytochemical screening, cytotoxicity and antimicrobial action of
Spondias mombin on superinfecting microorganisms from an oral
environment
Maria Regina Macêdo-Costaa*, Isabelle Helena Gurgel de Carvalhoa, Bárbara
Cabralb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa
a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.
Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil.
b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R.
Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.
1 Corresponding author:
Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83
99921-4856, E mail: [email protected]
E-mail addresses: [email protected] (Maria Regina Macêdo-Costa),
[email protected] (Isabelle Helena Gurgel de Carvalho),
[email protected] (Bárbara Cabral), [email protected] (Silvana Maria
Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de Lima).
60
Abstract
O objetivo do estudo foi avaliar a ação antimicrobiana de Spondias mombin
sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans, Staphylococcus aureus e
Pseudomonas aeruginosa, ATCC e isolados do ambiente bucal, bem como
caracterizar seu perfil fitoquímico e citotoxicidade. O screening fitoquímico do
extrato foi investigado por reações químicas e Cromatografia em Camada
Delgada (CCD). Nas análises por CCD foram utilizadas placas de sílica gel 60;
acetato de etila: ácido fórmico: água 8,4:0,7:0,7 v/v/v) e (Tolueno: Acetato de
etila:ácido fórmico 5:5:0,5 v/v/v) como fases móveis; e para detecção dos
metabólitos secundários, usou-se Reagente A natural. Posteriormente, foi
determinada a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória
Mínima de Aderência (CIMA) e Cinética bactericida e fungicida de Spondias
mombin. Utilizou-se como controle positivo, o digluconato de clorexidina a
0,12% e nistatina 100.000U.I. Ao nível de 5% de significância aplicou-se o teste
t-Student ou de Mann Whitney (p<0,05). O potencial citotóxico do extrato foi
avaliado através da viabilidade celular de fibroblastos da linhagem 3T3. Foram
detectados através de reações químicas: compostos fenólicos, flavonoides,
taninos e saponinas. As análises por CCD revelam a presença de flavonoides,
ácido fenólico, ácido elágico, quercetina e canferol. S. mombin apresentou
desempenho médio superior à clorexidina e estatisticamente significativo até a
diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e
P. aeruginosa ATCC, respectivamente. S. mombin apresentou ação bactericida
sobre E. faecalis (ATCC e AB) e C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente
sobre todas as bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e
E. faecalis (ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). O extrato
apresentou citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas.
Conclui-se que S. mombin apresentou expressiva atividade bacteriostática,
fungistática, antiaderente, bactericida e fungicida porém são necessários
estudos que considerem a ação antimicrobiana do extrato sobre biofilme, e
outros testes que avaliem a toxicidade seletivamente a fim de permitir futura
aplicabilidade clínica em canais radiculares e sítios periodontais e
perimplantares.
Palavras-chaves: Spondias mombin; Fitoterapia; Cromatografia em Camada
Delgada; Microbiologia; Toxicidade
61
Introduction
Infecções polimicrobianas tendem a ser complexas, resultar em formas
agressivas de doenças e seus agentes frequentemente apresentam resistência
a antibióticos e ao impacto de medidas terapêuticas (Brogden, 2002; Harriott,
Noverr, 2009; Jenkinson, 1990; Douglas, 2002; Lynch, Robertson, 2008;
Schlecht et al, 2015).
No que diz respeito a infecções polimicrobianas do ambiente bucal,
espécies de bactérias comumente associadas com infecções hospitalares e
multirresistência aos antimicrobianos, tais como Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis, são detectados em
proporções elevadas no biofilme subgengival de indivíduos com periodontite
(Slots et al., 1990;. Colombo et al., 2002) , em canais endodônticos (Brito et al.,
2007; Gupta et al., 2015), e em sítios de implantes falhos (Persson, Renvert,
2014; Aguayo et al., 2015; Verdugo 2016).
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo que pode ser
encontrado na água, solo, bem como no ambiente bucal de indivíduos
hospitalizados. Essa espécie apresenta capacidade para produzir e secretar
enzimas extracelulares e toxinas, aderir e formar biofilme, bem como apresenta
resistência a muitos antibióticos (Souto et al., 2014).
Staphylococcus aureus é um agente patogênico, gram positivo e
representa a bactéria mais importante em infecções de pele em seres
humanos. Apresenta uma variedade de fatores de patogenicidade incluindo a
produção de toxinas, formação de biofilme, transferência horizontal de genes
de resistência e estratégias de evasão do sistema imunológico (Cuesta et al.,
2010).
A prevalência de E. faecalis no ambiente bucal é baixa em indivíduos
saudáveis, isto é, 1-20% (Sedgley et al., 2004, 2006), porém elevada, até 68%
em pacientes com doenças bucais como periodontite, cáries e infecções
endodônticas (Sedgley et al., 2006; Souto et al., 2014; Kouidhi et al., 2011).
Essa bactéria é capaz de sobreviver a desafios ambientais extremos e é
particularmente resistente a agentes antimicrobianos convencionais utilizados
rotineiramente (Gupta et al,2015). Trata-se de um patógeno oportunista típico
62
da microbiota gastrointestinal humana e representa a terceira causa mais
comum de infecções nosocomiais (Colombo et al, 2013).
Candida albicans também é um agente patogênico oportunista, e vive
comensalmente no intestino, faringe, trato genito-urinário, pele e boca. A
patogenicidade das espécies de Candida é atribuída a fatores como a evasão
de defesas do hospedeiro, aderência a superfícies, formação de biofilme e
produção de enzimas proteolíticas. Tal espécie tem sido relacionada a doenças
periodontais e perimplantares refratárias, além de cáries dentárias (Sardi et al,
2011).
Torna-se claro, portanto, que a presença e interações entre agentes
superinfectantes exógenos ao ambiente bucal podem resultar em
comportamentos alterados, como patogenicidade aumentada, a formação de
biofilme, a tolerância aos antibióticos ou antifúngicos, o que pode influenciar na
progressão da doença e em sua manifestação clínica, caracterizando infecções
persistentes. Nesse sentido, a análise dos efeitos biológicos de plantas poderia
ajudar na síntese de novas drogas antimicrobianas frente a esses micro-
organismos.
O Brasil tem uma enorme biodiversidade, incluindo várias plantas de
interesse econômico (Albuquerque et al., 2007). As regiões Norte e Nordeste
do país são as que concentram a maior parte da biodiversidade existente, o
que permite acesso a inúmeros tipos de plantas e espécies frutíferas (Mattietto;
Lopes; Menezes, 2010).
Dentre estas, destaca-se Spondias Monbim, popularmente conhecida
como “cajá”, pertencente à família Anacardiaceae, encontrada em países
como Peru, Brasil, Venezuela, Bolívia, Colômbia, as Três Guianas, bem como
o sul do México, Belize, Costa Rica e as Antilhas (Adedokun et al., 2010). O
uso das folhas é indicado popularmente em gargarejos, como adstringente, nas
inflamações da boca e da garganta. Há relatos de uso bucal em casos de
prostatite e de herpes labial. No que se refere às atividades biológicas, foram
citadas: atividade antimicrobiana (Corthout et al. 1994; Abo et al., 1999; Silva et
al. 2012); moluscida (Corthout et al. 1994); antiviral (Silva et al. 2011);
leishmanicida (Accioly, 2001) e antioxidante (Silva et al. 2012). Em relação à
composição química foi descrita a presença de compostos fenólicos simples
(Corthout et al., 1992; Corthout et al. 1994), taninos (Corthout et al., 1991; Abo
63
et al., 1999; Njoku; Akumefula, 2007; Silva et al., 2011), flavonoides (Njoku,
Akumefula, 2007; Silva et al., 2012), triterpenos (Fred-Jaiyesimi, Kio, Wilkins,
2009), alcaloides (Njoku; Akumefula, 2007), saponinas e antraquinonas
glicosiladas (Abo et al., 1999; Njoku, Akumefula, 2007).
Nesse sentido, o objetivo do estudo foi avaliar in vitro a ação
antimicrobiana, antiaderente, bactericida e fungicida do extrato das folhas de
Spondias mombin sobre Enterococcus faecalis, Candida albicans,
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, ATCC e isolados do
ambiente bucal, bem como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu
potencial efeito citotóxico.
2. Materials and Methods
2.1 Coleta e preparação do extrato das folhas de Spondias mombin
As folhas de S. mombin foram coletadas em uma fazenda particular na
região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN (Tabua- RN S S° 28’ 14’’ W
35° 27’ 37’’). A espécie foi identificada pelo botânico Alan de Araújo Roque,
com número de exsicata 12252.
As folhas de S. mombin foram submetidas à secagem na sombra, sob
temperatura ambiente durante duas semanas. Após secas, foram trituradas em
um moinho de facas. O extrato foi preparado por maceração utilizando etanol:
H2O (70:30), durante um período de sete dias, obtendo-se assim o extrato
hidroetanólico das folhas (EH). O extrato foi filtrado e eliminado todo solvente
orgânico com auxílio de um rotaevaporador à temperatura de 45° C. Para os
testes biológicos o EH foi liofilizado.
2.2 Prospecção fitoquímica
Foi realizada uma triagem fitoquímica preliminar em que foram testadas
as principais reações de caracterização para metabólitos secundários. Para a
identificação de fenóis adicionou-se ao extrato bruto uma quantidade do agente
oxidante cloreto férrico (FeCl3). Para a identificação de flavonoides foi utilizado
64
o teste de Shinoda. Os taninos foram caracterizados pela reação de
precipitação com gelatina. Para detecção da presença de saponinas,
empregou-se o teste de formação de espuma. O teste para alcaloides baseou-
se em reações de formação de complexos insolúveis produzidos por reagentes
específicos como: Dragendorff; Mayer; Wagner e Bertrand (Langassner e
Giordani 2013).
2.3 Caracterização química por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
O E.H foi analisado por CCD utilizando como fase estacionária
cromatoplacas de alumínio de sílica gel 60 GF254 e como fase móvel vários
sistemas de eluentes (Wagner; Bladt, 2001). O revelador utilizado foi o
Reagente Natural A (difenilboriloxietilamina 0,5% em metanol). Os
cromatogramas foram visualizados sob luz UV 254 e 365 nm. Para a
identificação dos compostos presentes no extrato foram utilizados padrões de
referências adquiridos da Sigma Aldrich® (St. Louis, Missouri, EUA).
2.4 Linhagens microbianas
Foram utilizadas amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 292012) e
Candida albicans (ATCC 36802) da coleção de cultura do Laboratório da
Universidade Estácio de Sá e Laboratório de Micologia da UFRJ (Rio de
Janeiro/RJ) que foram reativadas no Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Odontologia/CCS/UFRN. As amostras de Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 19429) e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) foram
obtidas obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de
Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.
Enterococcus faecalis isolado clinicamente (AB 44) foi obtido da coleção
de cultura do Laboratório de Microbiologia da UNESA (Comitê de Ética em
Pesquisa CEP protocolo nº. 0248/08), coletado de pacientes de clínicas
endodônticas da UFRJ e UNESA. Inicialmente, cones de papel de filtro foram
65
introduzidos nos canais radiculares desses pacientes. O material foi transferido
para caldo Enterococcosel e incubadas durante 72 h a 35 °C. Posteriormente
foram introduzidos em placas de Agar sangue e incubadas a 35 °C durante 72
h. Colônias puras foram submetidas a testes para a identificação de espécies
de enterococos (coloração de Gram, morfologia da colônia, teste de catalase,
crescimento em caldo de NaCl, hidrólise de arginina, utilização de piruvato,
motilidade, produção de pigmentação e testes de fermentação de carboidratos.
A identificação foi confirmada pela PCR utilizando iniciadores específicos de E.
faecalis.
Candida albicans isolada clinicamente (AB 100) foi obtida da coleção de
cultura do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas da UFRN (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário
Onofre Lopes - CEP-HUOL protocolo nº. 152/07). As amostras clínicas foram
coletadas de pacientes a partir de saliva estimulada e semeadas em ágar
Sabouraud-dextrose. As mesmas foram identificadas através das provas do
tubo germinativo, caldo hipertônico, tolerância à temperatura de 42ºC ,
microcultivo, assimilação de hidratos de carbono, fermentação de açúcares e
PCR.
2.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a
metodologia adaptada de Bauer et al. (1966) para a determinação da
Concentração Inibitória Mínima . As linhagens microbianas foram cultivadas em
caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados
Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar
Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução
salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados
cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em
cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em
água destilada 1:512) nos orifícios e as placas foram incubadas a 37°C por 24
horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo
procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina
66
a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e
nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
Foi considerada CIM, a menor concentração do extrato capaz de inibir o
crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,
aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).
Aos resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima
aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann
Whitney (p<0,05), comparando a atividade antimicrobiana entre o extrato e os
controles positivos.
2.6 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida
O potencial bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi avaliado
pelo método adaptado de Peyret et al. (1990). As amostras foram inoculadas
em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), incubadas a 37º C
por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton (DIFCO®,
Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura microbiana, foi
adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle foi adicionado
1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos na estufa a 37º
C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24 horas de
incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton (DIFCO®,
Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em duplicata.
A leitura foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC pelo método
padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) nos
tempos determinados.
2.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S.
mombin foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),
utilizando concentrações correspondentes ao extrato bruto e diluído até 1:512.
A partir do crescimento microbiano, as cepas foram subcultivadas a 37ºC em
caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Foram distribuídos
1,8 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL
67
da solução correspondente às diluições do extrato. A leitura foi realizada após
24 horas através da observação visual da aderência dos microrganismos às
paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em
duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi
utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%
(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.) e Nistatina
100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
A CIMA foi definida como a menor concentração do agente que impediu
a aderência ao tubo de vidro.
2.8 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório
de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica,
UFRN).
Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com
7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em
2 grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado
apenas em meio básico; (ii) grupo de Spondias mombin : cultivado em meio
básico adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes
supracitados.
A citotoxicidade do extrato foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h
depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade
mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das
células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao
NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso,
as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de
5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram
incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4
horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com
100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de
ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments,
USA).
68
3.Results
3.1 Reações de identificação
Na prospecção fitoquímica foram observados a presença de compostos
fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas.
3.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Na análise por CCD após a revelação com o Reagente Natural A, quatro
bandas com coloração amarela foram observadas, indicando a presença de
flavonoides, sendo ainda verificada uma banda de coloração azul, sugestiva de
ácido fenólico. A análise ainda confirmou através da comparação do Fator de
retenção (Rf), coloração e Co-CCD com padrões de referência a presença do
ácido elágico, quercetina e canferol no EH das folhas de S. mombin.
3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O extrato de S. mombin apresentou atividade antimicrobiana sobre todos
os micro-organismos testados e os halos de inibição variaram entre 8 e 30 mm.
O extrato apresentou efeito antibacteriano até a diluição de 1:512 (CIM-0,97
mg/mL) para E. faecalis ATCC, S. aureus ATCC e P. aeruginosa ATCC; 1:32
(CIM-15,65 mg/mL) para E. faecalis AB; e ação antifúngica até a diluição 1:128
(CIM-3,90 mg/mL) para C. albicans ATCC e 1:2 (CIM-250 mg/mL) para C.
albicans (AB). S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina
e estatisticamente significativo até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e 1:256 (1,95
mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, respectivamente. E
para C. albicans ATCC e S. aureus ATCC o extrato apresentou ação
bacteriostática em uma maior diluição/menor concentração do que os grupos
controles.
3.4 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida
69
O efeito bactericida e fungicida do extrato de S. mombin foi observado
sobre E. faecalis (ATCC e AB) quando o extrato se encontrava bruto nas duas
primeiras horas de contato com a bactéria e .após vinte e quatro horas de
contato com C. albicans (ATCC e AB).
3.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
O extrato de S. mombin apresentou efeito antiaderente sobre todas as
bactérias testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis
(ATTC e AB) até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL). A clorexidina apresentou efeito
antiaderente até a diluição 1:512 apenas para E. faecalis.
3.6 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Spondias mombin sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
O extrato de S. mombin apresentou citotoxicidade nas concentrações
testadas (250 mg/mL, 1,95 mg/mL e 0,97 mg/mL), representada pela baixa
densidade óptica comparada ao grupo controle (cultivo em meio básico),
indicando ausência de proliferação celular.
4. Discusson
A crescente resistência entre os micro-organismos aos medicamentos,
suscitou a pesquisa por métodos alternativos para tratamento através da
obtenção de drogas com menos efeitos colaterais e toxicidade.
. A etnofarmacologia associada com o estudo químico tornou-se uma
ferramenta importante na bioprospecção. Muitos estudos têm associado às
informações sobre o uso tradicional de plantas medicinais a fitoquímica e
estudos farmacológicos para o desenvolvimento de novos fármacos e
medicamentos fitoterápicos (Medeiros et al., 2013).
Nesse sentido, este trabalho buscou caracterizar quimicamente e avaliar
a atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e fungicida do
extrato de folhas de S. mombin e seu potencial efeito citotóxico.
70
Os resultados evidenciaram através de uma prospecção fitoquímica
prévia, a presença de alguns metabólitos secundários, dentre eles: compostos
fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas, em concordância aos achados de
Silva et al. (2012) e Corthout et al. (1992). Tendo em vista que diversos
estudos têm comprovado a efetividade dos compostos fenólicos, flavonoides e
taninos como agentes antimicrobianos e antioxidantes (Nascimento et al.,
2000; Elzaawely et al., 2005; Kumar, 2013; Corthout et al., 1994), pode-se
sugerir que a grande atividade antibacteriana apresentada por S. mombin
deve-se à presença desses metabólitos em sua composição.
Foi constatada ainda a presença de ácido elágico e quercetina. A
presença desses metabolitos no extrato de S. mombin já foi relatado por Silva
et al. (2012), que acreditam que a existência dos mesmos garante ao referido
extrato suas atividades antibacteriana e antioxidante. Além de possuir atividade
antibacteriana (Cushnie; Lamb, 2005), a literatura relata que a quercetina
exibe atividade antioxidante, atividade de proteção do DNA (Undeger et al.,
2004) e efeito anti-humoral (Ren et al., 2003), enquanto que o ácido elágico
apresenta atividades antioxidante (Hassoun et al.,1997, 2004; Hayes et al.,
2010), anticancro (Whitley et al., 2003), antimutagênica (Loarca-Piña et al.,
1998) e antiproliferativa (Seeram et al., 2005).
Uma vez identificados metabólitos secundários com atividade
antimicrobiana já conhecida, foi avaliada in vitro a atividade antibacteriana e
antifúngica do extrato.
S. mombin apresentou desempenho médio superior à clorexidina e
estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:512 (0,97 mg/ mL) e
1:256 (1,95 mg/mL) sobre E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC,
respectivamente.
Embora Silva et al. (2012) não tenham encontrado atividade
antimicrobiana no extrato de S. mombin sobre P. aeruginosa, Sethi, Ramasamy
(2012) e Abo et al. (1999) a encontraram, corroborando assim os resultados
deste estudo, que comprovaram a atividade do extrato de S. mombin sobre
essa bactéria.
De um modo geral, as cepas isoladas clinicamente apresentaram menos
susceptibilidade ao extrato quando comparadas com as ATCC, que possuem
perfil conhecido. Entretanto, para se avaliar a atividade antimicrobiana de um
71
novo produto se faz necessário a inclusão de cepas de origem clínica, pois
apresentam diferentes perfis de susceptibilidade, assegurando maior fidelidade
na avaliação.
S. mombin apresentou ação bactericida sobre E. faecalis (ATCC e AB) e
C. albicans (ATCC e AB) e ação antiaderente sobre todas as bactérias
testadas, com destaque para P. aeruginosa ATCC e E. faecalis (ATTC e AB)
até a diluição 1:512 (0,97 mg/mL), confirmando a expressiva atividade
antimicrobiana do extrato sobre micro-organismos superinfectantes do
ambiente bucal.
No que diz respeito à citotoxicidade, as celulas 3T3 são comumente
utilizadas para se avaliar a toxicidade de compostos. Os dados mostraram que
através desse método e nas concentrações testadas, o extrato apresentou
citotoxicidade, uma vez que a densidade óptica obtida foi inferior ao do controle
positivo. Quando o extrato se encontrava na concentração de 250 mg/mL, o
valor da densidade óptica foi similar ao grupo controle. Entretanto, essa leitura
não representa um aumento na proliferação celular, uma vez que antes de
introduzir o MTT, as células apresentavam morfologia diferente. Pode-se
aventar que provavelmente houve alguma reação do MTT com o corante da
amostra.
No trabalho realizado por Cabral et al (2016), foi observado que o
extrato hidroetanólico das folhas de S. mombin não apresentaram toxicidade.
Foi observado, inclusive, um aumento no metabolismo mitocondrial dos
fibroblastos 3T3, com uma proliferacao de 25 -100% a mais que o controle,
podendo inferir que essa amostra possue atividade mitogênica, contrariando o
nosso estudo.
Na literatura não há outros relatos de viabilidade celular com fibroblastos
3T3 para a espécie S. mombin. Devido a esses resultados referentes à
toxicidade contraditórios, outros testes tais quais como o de citoxicidade em
hemácias e de índice de seletividade (indica quantas vezes o produto testado é
mais eficaz frente a determinados alvos do que a células humanas) podem ser
indicados para nosso objetivo e futura aplicabilidade clínica em canais
radiculares e sítios periodontais e perimplantares.
Os resultados dessa pesquisa demonstraram que S. mombin apresentou
expressiva atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida e
72
fungicida sobre todos os micro-organismos associados a infecções
persistentes, justificado pelos achados farmacológicos. O extrato apresentou
citotoxicidade sendo necessários outros testes que o avaliem seletivamente
permitindo a extrapolação para o uso clínico odontológico.
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Acknowledgment
No financial support was received during the current study.
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76
5.3 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of
Lycium barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections”
será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que possui fator
de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.
77
Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial action of Lycium
barbarum L. on microorganisms involved in persistent oral infections
Maria Regina Macêdo-Costaa*, Isabelle Helena Gurgel de Carvalhoa, Manoel
André de Souza Netob, Julia Morais Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto
Langassnerb, Kenio Costa de Limaa
a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.
Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil.
b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R.
Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.
1 Corresponding author:
Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83
99921-4856, E mail: [email protected]
E-mail addresses: [email protected] (Maria Regina Macêdo-Costa),
[email protected] (Isabelle Helena Gurgel de Carvalho), [email protected]
(Manoel André de Souza Neto), [email protected] (Julia Morais Fernandes),
[email protected] (Silvana Maria Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa
de Lima).
78
Abstract
Os fitoterápicos têm sido uma alternativa viável para eliminar micro-organismos
oportunistas e resistentes a múltiplos antimicrobianos, que ocasionalmente
colonizam o ambiente bucal, como Enterococcus faecalis, Candida albicans,
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. O objetivo do estudo foi
avaliar a ação antimicrobiana dos frutos de Lycium barbarum Linn sobre micro-
organismos relacionados a infecções bucais persistentes. Também foi
realizado um screening fitoquímico e investigada a citotoxicidade do extrato.
Foi realizada Cromatografia em Camada Delgada (CCD) através de placas de
sílica gel 60; tolueno:acetato de etila:ácido fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v), acetato
de etila:n-propanol:ácido acético:água (4:2:2:0,6, v/v/v/v) como fases móveis; e
para detecção dos metabólitos secundários, usou-se KOH a 5% (v/v),
Reagente Natural A 0,2 %/ luz ultravioleta em 365 nm, vanilina sulfúrica e
reagente de Drangendorff. Posteriormente, foi determinada a Concentração
Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) e
Cinética bactericida e fungicida de L. Barbarum Linn. Utilizou-se como controle
positivo o digluconato de clorexidina a 0,12% e nistatina 100.000U.I. Ao nível
de 5% de significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann Whitney
(p<0,05). As análises por CCD evidenciaram a presença de ácidos fenólicos,
cumarinas, flavonoides e carboidratos. L. barbarum apresentou atividade
bacteriostática sobre E. faecalis ATCC, P. aeruginosa ATCC e C. albicans AB.
O extrato apresentou desempenho médio superior ao controle positivo e
estatisticamente significativo até a diluição 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25
mg/mL) sobre Enterococcus faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC,
respectivamente. L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida
sobre os micro-organismos testados, mas apresentou efeito antiaderente até a
diluição 1:32 (15,65 mg/mL) sobre P. aeruginosa ATCC. Foi verificada
citotoxicidade em cultura de células nas concentrações testadas (15,65 mg/mL
e 6,67 mg/mL). L. barbarum apresentou ação antimicrobiana expressiva sobre
P. aeruginosa, porém é necessário a realização de testes de toxicidade que
indiquem quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinado
alvo do que a célula humana, para permitir sua futura aplicação clínica.
Palavras-chave: Lycium barbarum; Microbiologia; Fitoterapia; Cromatografia
em camada delgada; Toxicidade.
79
1 Introduction
Nas últimas duas décadas, a prevalência de bactérias resistentes a uma
série de antibióticos e linhagens multirresistentes aos medicamentos, têm
causado doenças no homem. Não há tratamentos disponíveis para infecções
causadas por micro-organismos-antimicrobianos-resistentes e a resistência a
agentes comumente utilizados é expressiva (Orhan et al., 2010).
No que diz respeito a infecções bucais, diversos estudos têm identificado
a participação de micro-organismos que não são frequentemente encontrados
nessa microbiota, tais como Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae,
Candida albicans e Pseudomonas aeruginosa (Renvert et al., 2008; Salvi et al.,
2008; Seelan et al., 2015).
Enterococcus faecalis é a espécie mais comumente isolada de infecções
bucais, incluindo periodontite, infecção em canais radiculares infectados,
abcessos perirradiculares e também são detectados em terapia endodôntica
falha (Tennert et al, 2014).
P. aeruginosa é capaz de expressar diferentes fenótipos devido ao seu
alto grau de flexibilidade genômico e é reconhecida por sua resistência
intrínseca a antibióticos. Essa resistência pode ser atribuída à baixa
permeabilidade da sua parede celular, a ação de bombas de efluxo que
removem as moléculas antibióticas que penetram nos canais
intramembranosos, as mutações que podem alterar a expressão e função dos
cromossomos, a aquisição de resistência a genes por elementos genéticos
móveis, tais como plasmídeos, bacteriófagos e transposons, e a capacidade
para invadir as células eucarióticas e tornar-se um patógeno intracelular
oportunista. Em biofilmes, a resistência a antibióticos de P. aeruginosa pode
ser 10-1000 vezes maior do que na cultura planctônicas. Devido a estes
mecanismos de resistência, infecções crônicas e difíceis de erradicar estão
associadas a biofilmes de P. aeruginosa (Prochnow et al., 2016).
Cerca de 80% das infecções relacionadas com implantes podem ser
causadas por estafilococos e o patógeno nosocomial Staphylococcus aureus
representa 34% dos casos. Fungos patogênicos, incluindo Candida spp.,
também são capazes de colonizar implantes, sobretudo Candida albicans.
Ambos S. aureus e C. albicans são conhecidos por sua capacidade de formar
80
biofilmes (Kuchar kova et al., 2016). Infec es associadas a biofilme s o
difíceis de erradicar, visto que a estrutura em consórcio representa diminuição
da sensibilidade para acolher as defesas imunológicas e resistência a
tratamentos com antibióticos e antifúngicos (Tennert et al., 2014).
Nesse sentido, a busca pela farmacologia alternativa apresenta
destaque entre a comunidade cientifica nos últimos anos em virtude do alto
potencial antimicrobiano dos produtos naturais.
Nessa perspectiva, Goji berry (Lycium barbarum Linn, Solanaceae) é um
medicamento e alimento tradicional na Ásia Oriental e, mais recentemente, na
Europa e na América do Norte. Os frutos de L. barbarum têm sido amplamente
utilizados na prevenção e tratamento de várias doenças no leste da Ásia há
mais de 2000 anos (Amagase et al., 2011). Tais frutos vermelhos contêm 18
tipos de aminoácidos incluindo 8 tipos de aminoácidos essenciais, 21 tipos de
minerais, tais como zinco, ferro, cobre, cálcio, germânio, selénio e fósforo e
alguns componentes funcionais da natureza tais como flavonoides,
carotenoides e polissacarídeos (Yin et al., 2008; Wang et al., 2010; Liu et al.,
2014). Polissacarídeos são os componentes bioativos mais importantes do
fruto em termos quantitativos (arabinose, glucose, galactose, manose,
ramnose, xilose e/ou ácido galacturônico) (Fit et al., 2013). Nos últimos anos,
os polissacarídeos isolados dos extratos aquosos de L. barbarum têm sido
identificados como um dos principais ingredientes ativos responsáveis por sua
atividade biológica (Jin et al., 2013). Muitos estudos sobre Farmacologia e
fitoquímica demonstraram que L. barbarum apresenta resultados biológicos
atuando como antioxidante, imunomodulador, antitumoral, neuroprotetor,
radioprotetor (Li; Zhou, 2007; Gong et al., 2005), antidiabetes (Zhu et al., 2013),
protetor hepático , antiosteoporose, antifadiga (Jin et al., 2013) e antifúngica
(Lee et al., 2004).
Nesse sentido, o objetivo do estudo foi avaliar in vitro a ação
antimicrobiana, antiaderente e bactericida do extrato dos frutos de Lycium
barbarum Linn sobre Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus e Candida albicans, ATCC e isolados do ambiente
bucal, bem como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial
efeito citotóxico.
81
2. Materials and Methods
2.1 Preparação do extrato de Lycium barbarum Linn
Os frutos secos de Lycium barbarum Linn (gojiberry), foram obtidos em
loja especializada na cidade do Rio de Janeiro-RJ. A preparação do extrato foi
conduzida no Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia,
Centro de Ciências da Saúde, UFRN. O extrato foi preparado por maceração
por 7 dias com álcool etílico 70 %, na proporção 1:5 (droga vegetal: solvente,
p/v). O macerado foi filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato hidroetanólico (HE)
dos frutos de L. barbarum. O HE foi seco sob pressão reduzida com auxílio de
um evaporador rotatório a temperatura não superior a 45º C, obtendo-se o
extrato seco (EC) de L. barbarum. O EC foi retomado em água destilada, e
depois liofilizado.
2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
As condições cromatográficas utilizadas na análise por CCD foram: i.
adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica F254 (Macherey-
Nagel®, Düren, Germany); ii: fase móvel A: tolueno:acetato de etila:ácido
fórmico (5:2,5:0,25, v/v/v); fase móvel B: acetato de etila:n-propanol:ácido
acético: água (4:2:2:0,6, v/v/v/v). iii: reveladores: KOH a 5% (v/v), Reagente
Natural A 0,2 %/ luz ultravioleta em 365 nm (flavonoides); vanilina sulfúrica
(terpenos); reagente de Drangendorff (alcaloides). Os fatores de retenção (Rf),
a cor e o comportamento das zonas foram comparados com perfis
cromatográficos de substâncias de referência na literatura (Wagner; Bladt,
2001).
2.3 Linhagens microbianas
Foram utilizadas amostras de Enterococcus faecalis (ATCC 292012) e
Candida albicans (ATCC 36802) da coleção de cultura do Laboratório da
Universidade Estácio de Sá e Laboratório de Micologia da UFRJ (Rio de
Janeiro/RJ) que foram reativadas no Laboratório de Microbiologia do
82
Departamento de Odontologia/CCS/UFRN. As amostras de Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 19429) e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) foram
obtidas obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de
Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia do
Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.
Enterococcus faecalis isolado clinicamente (AB 44) foi obtido da coleção
de cultura do Laboratório de Microbiologia da UNESA (Comitê de Ética em
Pesquisa CEP protocolo nº. 0248/08), coletado de pacientes de clínicas
endodônticas da UFRJ e UNESA. Inicialmente, cones de papel de filtro foram
introduzidos nos canais radiculares desses pacientes. O material foi transferido
para caldo Enterococcosel e incubadas durante 72 h a 35 °C. Posteriormente
foram introduzidos em placas de Agar sangue e incubadas a 35 °C durante 72
h. Colônias puras foram submetidas a testes para a identificação de espécies
de enterococos (coloração de Gram, morfologia da colônia, teste de catalase,
crescimento em caldo de NaCl, hidrólise de arginina, utilização de piruvato,
motilidade, produção de pigmentação e testes de fermentação de carboidratos.
A identificação foi confirmada pela PCR utilizando iniciadores específicos de E.
faecalis.
Candida albicans isolada clinicamente (AB 100) foi obtida da coleção de
cultura do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas da UFRN (Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário
Onofre Lopes - CEP-HUOL protocolo nº. 152/07). As amostras clínicas foram
coletadas de pacientes a partir de saliva estimulada e semeadas em ágar
Sabouraud-dextrose. As mesmas foram identificadas através das provas do
tubo germinativo, caldo hipertônico, tolerância à temperatura de 42ºC,
microcultivo, assimilação de hidratos de carbono, fermentação de açúcares e
PCR.
2.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a
metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação
da Concentração Inibitória Mínima. As linhagens microbianas foram cultivadas
em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados
83
Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de Petri contendo Agar
Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução
salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados
cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em
cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em
água destilada 1:512) nos orifícios e as placas foram incubadas a 37°C por 24
horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo
procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina
a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) e
nistatina 100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
Foi considerada CIM, a menor concentração do extrato capaz de inibir o
crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,
aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).
Aos resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima
aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann-
Whitney (p<0,05), comparando a atividade antimicrobiana entre o extrato e os
controles positivos.
2.5 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida
O potencial bactericida e fungicida do extrato de L. barbarum foi avaliado
pelo método adaptado de Peyret e colaboradores (1990). As amostras foram
inoculadas em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos),
incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton
(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura
microbiana, foi adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle
foi adicionado 1mL de água destilada esterilizada. Os tubos foram mantidos na
estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24
horas de incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton
(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em
duplicata.
A leitura foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC pelo método
padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) nos
tempos determinados.
84
2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de L.
barbarum foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),
utilizando concentrações correspondentes ao extrato bruto e diluído até 1:512.
A partir do crescimento microbiano, as cepas foram subcultivadas a 37ºC em
caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Foram distribuídos
1,8 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL
da solução correspondente às diluições do extrato. A leitura foi realizada após
24 horas através da observação visual da aderência dos microrganismos às
paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em
duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi
utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%
(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.) e Nistatina
100.000 U.I. (Micostatin®, Bristol-Myers, São Paulo, Brasil).
A CIMA foi definida como a menor concentração do agente impediu a
aderência ao tubo de vidro.
2.7 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Lycium barbarum sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório
de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica,
UFRN).
Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7
mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 2
grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado
apenas em meio básico; (ii) grupo de Lycium barbarum: cultivado em meio
básico adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes
supracitados.
A citotoxicidade do extrato foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h
depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade
mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das
85
células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao
NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso,
as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de
5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram
incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4
horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com
100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de
ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments,
USA).
3. Results
3.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Após a análise por CCD, utilizando reveladores específicos e universais,
foi observada a presença de zonas de cor azul esverdeado fluorescente (luz
UV365 nm), azul fluorescente (KOH 5%/ UV 365 nm), laranja e verde
fluorescentes (Reagente Natural A), assim como zonas de cor negra e laranja
(vanilina sulfúrica/luz visível) (figuras 1 e 2), sugestivas da presença de ácidos
fenólicos, cumarinas, flavonoides e carboidratos (Wagner et al, 2001). Usando-
se o reagente de Drangendorff não foi possível visualizar zonas de cor laranja,
o que permite sugerir a ausência de alcaloides nesse extrato.
3.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O extrato de L. barbarum apresentou atividade sobre E. faecalis ATCC,
P. aeruginosa ATCC e C. albicans AB. Os halos variaram entre 14 e 35 mm. O
extrato apresentou ação antimicrobiana até a diluição de 1:8 (62,5 mg/mL) para
E. faecalis ATCC e até 1:16 (31,25 mg/mL) para P. aeruginosa e C. albicans
(AB). Os controles positivos se apresentaram eficazes sobre todos os micro-
organismos. Observou-se que para E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC, o
86
extrato apresentou desempenho médio superior ao controle e estatisticamente
significativo até a diluição 1:4 (62,5 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL),
respectivamente.
3.3 Determinação da Cinética Bactericida e Fungicida
O extrato de L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida
sobre os micro-organismos testados.
3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
O extrato de L. barbarum apresentou efeito antiaderente sobre
Pseudomonas aeruginosa ATCC até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL). Os
controles apresentaram efeito antiaderente até a diluição 1:512.
3.5 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de Lycium barbarum sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
O extrato de L. barbarum apresentou citotoxicidade nas concentrações
testadas (15,65 mg/mL e 6,67 mg/mL), representada pela baixa densidade
óptica comparada ao grupo controle (cultivo em meio básico), indicando
ausência de proliferação celular.
4. Discussion
Segundo Wang et al., (2016), durante a última década, o rápido
aparecimento de patógenos multirresistentes tornou-se uma preocupação
global. As infecções bucais refratárias são multifatoriais e a composição
microbiana do biofilme dentário é considerada como determinante direto
dessas doenças.
O surgimento de resistência aos antibióticos e antifúngicos, seja
devido a tensões mutagênicas ou devido a seus vários efeitos colaterais,
87
sublinhou a necessidade de se desenvolver estratégias seguras e potentes
contra os micro-organismos. Nesse sentido, os agentes naturais bioativos
parecem ser promissores (Vadekeetil et al., 2016; Aghazadeh et al., 2016).
Este trabalho buscou avaliar a atividade bacteriostática, fungistática,
antiaderente, bactericida e fungicida do extrato de frutos de L. Barbarum, bem
como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial efeito
citotóxico.
Para tanto, o extrato de L. barbarum foi submetido a triagem por CCD
com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de metabólitos
secundários. Nesse sentido, foi observada a presença de ácidos fenólicos,
cumarinas, flavonoides e carboidratos, corroborando a literatura (Yin et al.,
2008; Wang et al., 2010; Liu et al., 2014).
Flavonoides são compostos que tem uma gama de atividades biológicas,
incluindo antialérgica, antibacteriana, antidiabética, anti-inflamatória, antiviral,
antiproliferativa, antimutagênica, antitrombótico, anticarcinogênico,
hepatoprotector, estrogênico, inseticida e antioxidante (Trigali, 2001). Três
flavonoides foram identificados por meio de LC-MS: campferol, quercetina e
miricetina (Le, Chiu, Ng, 2007).
Cumarinas são metabólitos secundários que podem apresentar atividade
antiagregante plaquetária, anti-inflamatória e potente efeito anti-tumoral (Ito et
al., 1999; Souza et al, 2005).
Uma vez identificados metabólitos secundários com atividade
antimicrobiana já conhecida e estudada, foi avaliada in vitro a atividade
antibacteriana e antifúngica do extrato.
O extrato de L. barbarum apresentou efeito bacteriostático sobre E.
faecalis ATCC e Pseudomonas aeruginosa ATCC e fungistático frente Candida
albicans AB. Observou-se que para E. faecalis ATCC e P. aeruginosa ATCC o
extrato apresentou desempenho médio superior ao controle e estatisticamente
significativo (p 0,001) até as diluições 1:4 (125 mg/mL) e 1:16 (31,25 mg/mL),
respectivamente. Ambas espécies ATCC foram as mais susceptíveis ao extrato
do que as correspondentes isoladas clinicamente, uma vez que as cepas
padrão possuem perfil de sensibilidade conhecida.
O extrato de L. barbarum não apresentou efeito bactericida e fungicida
sobre nenhum micro-organismo testado o que surpreende, visto que segundo
88
Orhan e colaboradores (2010) a presença de compostos, tais como
flavonoides, justificam ação antimicrobiana in vitro. Entretanto é importante
salientar a multirresistência dos micro-organismos envolvidos nesse estudo.
Na determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência
(CIMA) foi observado que o extrato apresentou efeito antiaderente,
representado pela ausência de aderência microbiana ao tubo de vidro,
simulando uma superfície do ambiente bucal até a diluição 1:32 (15,65 mg/mL)
sobre P. aeruginosa ATCC.
Alguns estudos relatam o efeito antimicrobiano do extrato aquoso de
gojiberry sobre E. coli, com halos de inibição de até 25 mm (Fit et al., 2013).
Em outro estudo, a atividade antimicrobiana do extrato da flor de L. barbarum
foi avaliada por meio do ensaio de difusão em ágar, revelando que o extrato foi
mais ativo nas cepas de bactérias Gram-positivas, sobretudo sobre
Staphylococcus aureus.
Era esperado que o extrato de L. barbarum apresentasse uma ação
antimicrobiana mais expressiva, visto a identificação de flavonoides. Entretanto,
muitos estudos estão sendo realizados a partir do isolamento das principais
classes de flavonoides encontrados na planta. Estes têm sido propostos como
agentes modernos e adjuntos para o tratamento de infecções bacterianas,
terapias antipatogenicidade e como moléculas de captura para a remoção de
endotoxina a partir de preparações farmacêuticas (Cushnie et al 2011).
No que diz respeito ao potencial citotóxico sobre filbroblastos 3T3, o
extrato de L. barbarum, nas concentrações testadas (15,65 mg/mL e 6,67
mg/mL), apresentou toxicidade. Na literatura nao há outros relatos de
viabilidade celular com fibroblastos 3T3 para a espécie L. Barbarum.
Entretanto, esses resultados referentes à toxicidade são contraditórios, visto
que tais frutos são um ingrediente popular na culinária chinesa e em demais
países asiáticos. Outros testes tais quais o índice de seletividade (indica
quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinados alvos do
que a células humanas) podem ser indicados para esse objetivo e para que
possa ter futura aplicabilidade clínica.
89
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Acknowledgment
No financial support was received during the current study
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92
Figuras Figura 1. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel A
Rf Cor
UV 365 nm
KOH 5% (v/v)/UV 365 nm
Vanilina Sulfúrica
Reagente Natural A/ UV
365 nm Dragendoff
0,25 - Azul-verde - - -
0,31 - - - Verde -
0,42 - - - Laranja -
0,50 - Azul-verde Negro - -
0,68 - - - Verde -
0,78 - - Laranja Laranja -
0,80 - Azul-verde - - -
0,95 - Azul-verde - - -
Figura 2. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel B
Rf Cor
UV 365 nm
KOH 5% (v/v)/UV 365 nm
Vanilina Sulfúrica
Reagente Natural A/
UV 365 nm Dragendoff
0,10 - - Negro - -
0,25 - - - Laranja -
0,30 - - - Verde -
0,44 Azul Azul brilhante - Azul -
93
5.4 O artigo “Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial potential of
Solanum paniculatum Linn on Staphylococcus aureus e Pseudomonas
aeruginosa” será enviado para o periódico “Journal of Ethnopharmacology” que
possui fator de impacto 3.055 e Qualis A1 da CAPES para a área Medicina II.
94
Phytochemical screening, cytotoxicity and antibacterial potential of
Solanum paniculatum Linn root extract on Staphylococcus aureus and
Pseudomonas aeruginosa
Maria Regina Macêdo-Costaa*, Manoel André de Souza Netob, Julia Morais
Fernandesb, Silvana Maria Zucolotto Langassnerb, Kenio Costa de Limaa
a Department of Dentistry of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av.
Salgado Filho, 59056-000 - Natal, RN – Brasil.
b Department of Pharmacy of Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R.
Gen. Gustavo Cordeiro de Farias, 59012- Natal, RN – Brasil.
1 Corresponding author:
Av. Oceano Atlântico 1041/ap 801, Ponta de Campina, Cabedelo, Paraíba, 58310-000, +55 83
99921-4856, E mail: [email protected]
E-mail addresses: [email protected] (Maria Regina Macêdo-Costa),
[email protected] (Manoel André de Souza Neto), [email protected] (Julia
Morais Fernandes),(Silvana Maria Zucolotto Langassner), [email protected] (Kenio Costa de
Lima).
95
Abstract
O objetivo do estudo foi avaliar a ação antimicrobiana de Solanum paniculatum
Linn sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, bem como
caracterizar o perfil fitoquímico e citotoxicidade. Nas análises por CCD foram
utilizadas placas de sílica gel 60; AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água
(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v) e
Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v) como fases móveis; e para detecção dos
metabólitos secundários, usou-se vanilina sulfúrica, solução FeCl3 1 %,
Reagente Natural A 0,5% e Dragendorff. Posteriormente, foi determinada a
Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Inibitória Mínima de
Aderência (CIMA) e Cinética bactericida de S. paniculatum. Utilizou-se como
controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%. Ao nível de 5% de
significância aplicou-se o teste t-Student ou de Mann Whitney (p<0,05). O
potencial citotóxico do extrato foi avaliada através da viabilidade celular de
fibroblastos da linhagem 3T3. As análises por CCD sugerem a presença de
terpenos, flavonoides, compostos fenólicos, glicosídeos de ácidos fenólicos,
cumarinas e alcaloides. O extrato apresentou desempenho médio superior à
clorexidina e estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:16 (31,25
mg/mL) sobre P. aeruginosa. S. paniculatum não apresentou efeito bactericida
sobre os micro-organismos testados, mas apresentou efeito antiaderente até a
diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para S. aureus e 1:2 (250 mg/mL) para P.
aeruginosa. Foi verificada citotoxicidade nas concentrações testadas (31,25
mg/mL, 7,81 e 0,97 mg/mL). S. paniculatum apresentou ação bacteriostática e
antiaderente, sobretudo para P. aeruginosa despertando a busca de
metabólitos secundários bioativos a partir de fontes naturais frente a micro-
organismos superresistentes.
Palavras-chave: Solanum paniculatum; Microbiologia; Fitoterapia;
Cromatografia em camada delgada
96
1. Introduction
A ineficácia dos antibióticos contra vários micro-organismos é uma
ameaça crescente no campo da saúde bucal (Smith et al., 2013). A resistência
aos antimicrobianos e a presença de espécies superinfectantes têm levado a
periodontites refratárias e intervenções endodônticas e sítios de implantes
falhos, realçando as barreiras terapêuticas em infecções dentárias (Rôças;
Siqueira, 2013; Al-Ahmad et al., 2014; Karygianni et al., 2016).
Tendo em vista a crescente ineficiência na erradicação de bactérias que
causam infecções bucais persistentes, a implementação de novos tratamentos
inspirados pela natureza têm suscitado interesse.
Muitos estudos têm sido desenvolvidos visando avaliar o uso popular de
plantas na Odontologia, tornando possível a identificação de espécies vegetais
com potencial atividade biológica (Ocheng et al., 2014; Mogosanu et al., 2015),
inclusive contra micro-organismos superinfectantes do meio ambiente bucal,
tais como: Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa.
Staphylococcus aureus é uma bactéria gram-positiva, espécie ubíqua
encontrada na pele, cabelo, nariz e garganta de pessoas e animais. É o agente
causador de um amplo espectro de infecções em seres humanos (Otto, 2013).
S. aureus pode produzir um biofilme de várias camadas incorporado dentro de
uma estrutura de glicocálice com expressão de proteínas heterogêneas
(Laverty et al., 2013; Giaouris et al., 2015). S. aureus abriga uma variedade de
adesinas proteicas e não proteicas que medeiam a ligação com uma
multiplicidade de fatores do hospedeiro, tais como a matriz extracelular e
proteínas plasmáticas e células hospedeiras humanas, ou adesão intercelular,
que é essencial para a acumulação de biofilme (Heilmann, 2011; Giaouris et
al., 2015).
Pseudomonas aeruginosa, é um patógeno oportunista, que estabelece a
sua patogênese através de um arsenal de fatores, tais como exoenzimas
(protease e elastase), sideróforos, alginato e rhamnolipídeos. Para intensificar
a infecção, este organismo forma consórcios microbianos que o torna menos
vulnerável a agentes antimicrobianos e à imunidade do hospedeiro, além de
três mecanismos de quorum sensing. Assim, a era pós-antibiótica precisa de
estratégias alternativas para controlar a patogenicidade e resistência
97
antimicrobiana, bem como para manter a homeostase da microbiota
(Vadekeetil et al., 2016).
No Brasil, existem diversas plantas potencialmente medicinais, como a
Solanum paniculatum Linn (jurubeba). Esta espécie está listada na
Farmacopeia Brasileira (Brasil, 1959) e pertence a "Relação Nacional de
Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (Renisus)” (Brasil,
2008) por apresentar potencial em gerar produtos de interesse do Ministério da
Saúde. O gênero Solanum é considerado um dos mais vastos e complexos
entre as angiospermas, possuindo 1500 espécies Nativa do Brasil, pertence à
família Solanaceae, comum em vários estados do país, estende-se desde os
limites das Guianas até São Paulo e Minas Gerais. Também é comumente
encontrada no Paraguai, Bolívia e Argentina.
No que se refere a aspectos farmacológicos, são constatadas em
Solanum paniculatum são constatadas ação antibacteriana, antifúngica,
antiviral, moluscicida, anticancerígena, anti-inflamatória, antioxidante, diurética,
antidiarreica, hepatoprotetora, gastroprotetora e antiulcerogênica. No entanto,
Solanum paniculatum pode determinar sinais de toxicidade, diarreias, náuseas,
vômitos, gastrite e duodenite erosiva, elevação das enzimas hepáticas e
eventualmente sintomas neurológicos. (Mesia-Vela et al., 2002; Oliveira et al.,
2006; Valadares et al., 2009; Lôbo et al., 2010; Vieira et al., 2013; Silva et al.,
2013; Macêdo-Costa et al., 2014; Vieira Júnior et al., 2015; Gregoris et al.,
2013; Martins et al., 2015; Clementino-Neto et al., 2016).
Nesse sentido, o objetivo do estudo foi avaliar in vitro a ação
antibacteriana, antiaderente e bactericida do extrato das raizes de Solanum
paniculatum sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, bem
como analisar fitoquimicamente o material vegetal e seu potencial efeito
citotóxico.
2.Materials and Methods
2.1 Preparação do extrato de Solanum paniculatum
98
As raizes de S. paniculatum foram obtidas na cidade do Natal- RN,
possuindo como coordenadas geográficas latitude: 5º 51’ 30” S e longitude: 5º
51’ 30” W. A identifica o botânica foi realizada pela Profa. Dra. Maria Iracema
Bezerra Loyola (Departamento de Biologia/UFRN), e a exsicata depositada no
Herbário do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Brazil (UFRN 5468).
As raízes secas foram submetidas à maceração (1:2 p/ v, planta / etanol)
durante 72 h à temperatura ambiente para se obter o extrato etanólico de S.
paniculatum (rendimento: 1, 0,80% em relação à planta seca). O macerado foi
filtrado a vácuo, obtendo-se o extrato etanólico (EE) das raízes de S.
paniculatum e seco sob pressão reduzida, com auxílio do Rotaevaporador
(Buchi R-210 Rotavapor®, Nova Castel, DE). O extrato seco foi retomado em
água destilada, e depois liofilizado.
2.2 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
As condições cromatográficas utilizada na análise por CCD foram: i.
adsorvente: cromatoplacas de alumínio de gel de sílica F254 (Merck®,
Darmstadt, Germany); ii: fase móvel: AcOEt:Ácido fórmico:MeOH:Água
(10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), BuOH:Ácido fórmico:Água (3:1:1, v/v/v) e
Clorofórmio:MeOH (8:2, v/v) e iii: reveladores: vanilina sulfúrica (terpenos,
heterosídeos tritepênicos (saponinas) e substâncias de óleos essenciais);
cloreto férrico (detecção de compostos fenólicos); Reagente Natural A 0,5 %
(difenilboriloxietilamina), (detecção específica de flavonoides)/seguido de
observação sob luz ultravioleta em 365 nm; e Reagente de Drangendorf
(detecção de alcaloides). Os fatores de retenção (RF), a cor e comportamento
dos pontos foram comparados com perfis cromatográficos de substâncias de
referência na literatura (Wagner; Bladt, 2001).
2.3 Linhagens bacterianas
Foram utilizadas amostras de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 19429)
e Staphylococcus aureus (ATCC 23235) obtidas mediante solicitação à
99
Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ) e posteriormente reativadas no
Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia/CCS/UFRN.
2.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antimicrobiana em placas foi realizada segundo a
metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação
da Concentração Inibitória Mínima. As linhagens microbianas foram cultivadas
em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados
Unidos), incubadas a 37°C por 18-20 horas. Em placas de petri contendo Agar
Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzida solução
salina inoculada com cada crescimento microbiano e foram confeccionados
cinco orifícios padronizados de aproximadamente seis mm de diâmetro em
cada placa. Foram introduzidos 50µL da substância teste (EB até a diluição em
água destilada 1:512) nos orifícios e as placas foram incubadas a 37°C por 24
horas. Cada ensaio foi realizado em triplicata sobre cada linhagem. O mesmo
procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina
a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA).
Foi considerada CIM, a menor concentração do extrato capaz de inibir o
crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição,
aferido em mm com auxílio do paquímetro (Digimess®, São Paulo, Brasil).
Aos resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima
aplicou-se ao nível de 5% de significância, o teste t-Student ou de Mann-
Whitney (p<0,05), comparando a atividade antimicrobiana entre o extrato e os
controles positivos.
2.5 Determinação da Cinética Bactericida
O potencial bactericida do extrato de S. paniculatum foi avaliado pelo
método adaptado de Peyret e colaboradores (1990). As amostras foram
inoculadas em caldo nutritivo BHI (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos),
incubadas a 37º C por 18 a 20 horas e subcultivadas em Caldo Mueller Hinton
(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) por 1 hora. A 9mL de cada cultura
microbiana, foi adicionado 1mL do extrato (bruto e na CIM), e ao tubo controle
100
foi adicionado 1mL de água destilada e esterilizada. Os tubos foram mantidos
na estufa a 37º C por 24 horas, e alíquotas foram retiradas após 2, 4, 6, e 24
horas de incubação e semeadas em placas de petri com Agar Mueller Hinton
(DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Cada procedimento foi realizado em
duplicata.
A leitura foi efetuada após incubação por 48 horas a 37ºC pelo método
padrão de contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) nos
tempos determinados.
2.6 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S.
paniculatum foi determinada de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996),
utilizando concentrações correspondentes ao extrato bruto e diluído até 1:512.
A partir do crescimento microbiano, as cepas foram subcultivadas a 37ºC em
caldo Mueller-Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos). Foram distribuídos
1,8 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,2mL
da solução correspondente às diluições do extrato. A leitura foi realizada após
24 horas através da observação visual da aderência dos microrganismos às
paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em
duplicata frente a cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi
utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12%
(Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.).
A CIMA foi definida como a menor concentração do agente impediu a
aderência ao tubo de vidro.
2.7 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de S. paniculatum sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
Foram utilizadas fibroblastos da linhagem 3T3 cedidas pelo Laboratório
de Biotecnologia de polímeros naturais (BIOPOL, Departamento de Bioquímica,
UFRN).
Inicialmente as células 3T3 foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7
mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM) e foram divididos em 2
101
grupos, de acordo com o tratamento utilizado: (i) grupo controle: cultivado
apenas em meio básico; (ii) grupo de S. paniculatum: cultivado em meio básico
adicionado do extrato em concentrações definidas pelos testes supracitados.
A citotoxicidade do extrato foi analisada nos intervalos de 24h e 48 h
depois do cultivo celular através do ensaio do MTT (avaliação da atividade
mitocondrial por redução do MTT). O MTT avalia a atividade metabólica das
células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao
NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Para isso,
as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de
5 × 103 células/poço. Decorrido o tempo experimental, as células foram
incubadas com 100 μL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4
horas e, em seguida, o produto colorimétrico (formazam) foi solubilizado com
100 μL de álcool etílico absoluto. A leitura da placa foi realizada em um leitor de
ELISA em um comprimento de onda de 570 nm (μQuan Biotek®, Instruments,
USA).
3 Results
3.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Após a análise por CCD, com o uso do revelador universal vanilina
sulfúrica, foram observadas zonas de coloração negra, violácea e amarela,
sugestivas, respectivamente, de carboidratos, terpenos e flavonoides. A
presença de zonas violáceas (fase móvel A-Figura 1) mais afastadas do fronte
(Rf < 0,7) permite inferir que sejam glicosídeos de terpenos. Quando a
revelação foi feita com cloreto férrico, foram visualizadas bandas de coloração
marrom, sugerindo a presença de compostos fenólicos. Sob visualização em
luz UV a 365 nm e posterior revelação com o Reagente Natural A, foram
observadas zonas de cor azul fluorescente, indicativas de ácidos fenólicos,
cumarinas e flavonoides, que ocorreram principalmente após o uso da fase
móvel B (Figura 2), de maior polaridade, sendo possivelmente glicosídeos.
Após o uso da fase móvel C e revelação o reagente de Dragendorff, foi
visualizada uma banda alaranjada, sugerindo a presença de alcaloides.
102
3.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O extrato de S. paniculatum apresentou desempenho médio superior à
clorexidina e estatisticamente significativo (p 0,001) até a diluição 1:16 (31,25
mg/mL) sobre P. aeruginosa. Não houve ação bacteriostática sobre S. aureus
em nenhuma das diluições. O controle positivo apresentou eficácia sobre os
microrganismos até a diluição 1:256.
3.3 Determinação da Cinética Bactericida
O extrato de S. paniculatum não apresentou efeito bactericida sobre os
micro-organismos testados.
.
3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA)
O extrato de S. paniculatum apresentou efeito antiaderente sobre os
micro-organismos testados até a diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para S. aureus e 1:2
(250 mg/mL) para P. aeruginosa. A clorexidina apresentou efeito antiaderente
até a diluição 1:128.
3.5 Avaliação do potencial citotóxico do extrato de S. paniculatum sobre
fibroblastos da linhagem 3T3
O extrato de S. paniculatum apresentou citotoxicidade nas
concentrações testadas (31,25 mg/mL, 7,81 mg/mL e 1,95 mg/mL),
representada pela baixa densidade óptica comparada so grupo controle (cultivo
em meio básico), indicando ausência de proliferação celular.
4 Discussion
Diversas condições que afetam a saúde bucal podem ser prevenidas,
controladas e/ou tratadas com o uso de recursos naturais - medicamentos ou
103
formulações. Há uma longa lista de drogas baseadas e derivadas de produtos
naturais, tais como, antissépticos bucais, pastas de dentes, dentre outros, que
estão disponíveis para consumo ou são administradas sob prescrição
(Newman; Cragg, 2016). Entretanto, as razões pela busca de novas
modalidades de tratamento não cessa: resistência microbiana, toxicidade a
curto e longo prazo, efeitos adversos e colaterais e custos elevados (Freires;
Rosalen, 2016).
Nesse sentido, este trabalho avaliou a atividade bacteriostática,
antiaderente e bactericida do extrato de S. paniculatum sobre S. aureus e P.
aeruginosa, bem como analisou fitoquimicamente o material vegetal e seu
potencial efeito citotóxico.
Para tanto, o extrato de S. paniculatum foi analisado por triagem por
CCD com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de metabólitos
secundários.
Alguns estudos anteriores identificaram como constituintes químicos da
jurubeba: alcaloides (jurubebina, jubebina, isojuripidina); as solaninas
(solamina, solanidina, solasodina); as resinas (jupebina e jupebenina);
saponinas (isojurubidina, isopaniculidina, isojurupidina e jurubidina); os
compostos esteroidais nitrogenados (paniculina, jurubina); agliconas; ácidos
graxos; ácidos orgânicos; os glicosídeos (paniculoninas A e B), além de
mucilagens e princípios amargos (Mesia-Vela et al., 2002).
Análises fitoquímicas realizadas com o extrato etanólico da raiz de
jurubeba também indicam a existência de taninos flobabênicos (taninos
condensados ou catéquicos), flavonóis, flavanonas, triterpenoides pentacíclicos
livres e saponinas (Cordeiro, 2008).
Nosso estudo corrobora alguns citados acima visto que também
identificamos a presença de alcaloides (Rf 0,07). Identificamos manchas
sugestivas de terpenos (Rf 0,24, 0,53, 0,66, 0,75, 0,84, 0,92) e flavonoides (Rf
0,25, 0,43 e 0,55). Dessas, algumas manchas poderiam corresponder a
agliconas terpenoídicas, enquanto que as manchas entre os valores de Rf 0,24
e 0,84 podem ser heterosídeos triterpênicos (saponinas). Visualizamos também
a presença de bandas de compostos fenólicos, essas substâncias
possivelmente são glicosídeos de ácidos fenólicos ou cumarinas, mas ainda é
possível que algumas dessas substâncias sejam flavonoides, pois as zonas
104
fluorescentes de valor de Rf 0,31, 0,43 e 0,62 apresentaram-se como manchas
amarelas na placa revelada com vanilina sulfúrica. A literatura relata o aspecto
de apenas alguns flavonoides para o método de análise utilizado neste estudo.
Logo, são necessárias análises com técnicas de maior poder informativo para
esclarecer essas hipóteses, como técnicas espectroscópicas (espectroscopia
no ultravioleta e infravermelho, ressonância magnética nuclear) e
espectrométricas (espectrometria de massas).
Macedo-Costa et al. (2014) analisaram o extrato da raiz de S.
paniculatum por triagem fitoquímica preliminar e impressões digitais por CCD.
Os resultados obtidos revelaram a presença de fenóis (dentre os quais
flavonoides e traços de taninos pirogálicos), gomas, lactonas e alcaloides (em
presença dos reativos de Dragendorff e Bertrand) e saponinas. Na análise
qualitativa de fenóis, em relação aos flavonoides e taninos, encontrou-se
mancha sugestiva de isovitexina e ácido tânico, respectivamente.
Em estudo realizado por Vieira Júnior et al., (2015) através do
fracionamento dos extratos etanólicos (70%) de partes aéreas (folhas e galhos)
de S. paniculatum, foram isoladas as saponinas, (22R, 23S, 25R)-3b, 6a, 23-
trihydroxy-5a-spirostane 6-O-b-D-xylopyranosyl-(100 00 ?300 0)-O-[b-D-
quinovopyranosyl(100 0 ?20)]-O-[a-L-rhamnopyranosyl(100 ?30)]-O-b-D-
quinovopyranoside e diosgenin 3-O-b-D-glucopyranosyl(100 ?60)-O-b-D-
glucopyranoside, bem como quatro componentes já conhecidos: ácido cafeico,
diosgenina b-D-glucopiranósido, rutina, e quercetina 3-O-a-L-ramnopiranosil
(100 0? 600) -O-b-D-glucopiranósido.
Uma vez identificados metabólitos secundários com atividade
antimicrobiana já conhecida, foi avaliada in vitro a atividade antibacteriana do
extrato.
O extrato de S. paniculatum apresentou atividade bacteriostática sobre
P. aeruginosa até a diluição 1:16 (31,25 mg/mL) apresentando desempenho
médio superior à clorexidina, sendo estatiscamente significativa (p 0,001) até
essa concentração. Sobre S. aureus o extrato não apresentou atividade, o que
não surpreende visto que trata-se de uma bactéria extremamente patogênica,
resistente a antibióticos e comumemente envolvida na falha de implantes
dentários (Thurnheer et al, 2015) e, em alguns estudos, relatada em cáries com
comprometimento de dentina (Kaur et al., 2015).
105
Lôbo et al. (2010) e Pereira et al. (2010) constataram a ação
antibacteriana de raizes de S. paniculatum sobre Escherichia coli, P.
aeruginosa e S. aureus, contrariando o nosso estudo para essa última bactéria,
porém as linhagens de ambos estudos foi bovina.
Além da ação antibacteriana, foi avaliada in vitro por Valadares et al.,
(2009), a atividade antiviral do extrato de folhas de S. paniculatum sobre vírus
da Herpes tipo I (HSV-1), vírus da encefalomiocardite de murídeo (EMCV) e
vírus da vacínia (VACV). S. paniculatum inibiu a replicação de HSV-1
[Concentração eficaz 50% antiviral = (298,0 ± 11,2) µg / mL] e não mostrou
nenhum efeito sobre EMCV e VACV.
Em relação ao grupo controle, o digluconato de clorexidina, “gold
standard”, é um agente anti-séptico ou desinfetante, que é ativo contra diversas
bactérias, vírus e fungos. Seu mecanimo de ação se dá através da
desestabilização a parede celular bacteriana e interferência com a osmose.
Além disso, a absorção bacteriana de clorexdina é muito rápida, o que facilita a
ruptura da parede celular e membrana citoplasmática causando a morte celular
(Asokan et al., 2009; . Ilango et al., 2013). No nosso estudo ambas bactérias
apresentaram sensibilidade a essa substância, entretanto S. paniculatum
apresentou desempenho médio superior para P. aeruginosa.
No nosso estudo o extrato não apresentou efeito bactericida, e foi
verificada uma discreta ação antiaderente até a diluição 1:8 (62,5 mg/mL) para
S. aureus e 1:2 (250 mg/mL) para P. aeruginosa, salientando a capacidade que
essas bactérias possuem de aderir a estruturas duras e que não descamam, tal
qual fazem no ambiente bucal.
Ao contrário desse estudo, Macedo-Costa et al. (2014) avaliaram a
ação antibacteriana do extrato da raiz de S. paniculatum, sobre bactérias
bucais endógenas: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S.
salivarius e Lactobacillus casei. O extrato apresentou CIM de 7,81 mg/mL,
CIMA de 62,5 mg/mL e foi bactericida na concentração de 500 mg/mL em 2
horas de contato com S. mutans e na CIM em 4 horas. Esse estudo também
avaliou a ação do extrato bruto e diluído (CIM) de S. paniculatum sobre micro-
organismos em cultura mista na forma planctônica e organizados em biofilme, a
partir de saliva humana. Observou-se que o extrato bruto de jurubeba
apresentou ação antimicrobiana sobre os micro-organismos em cultura mista
106
na forma planctônica e organizados em biofilme, entretanto, considerando a
sua CIM, não foi evidenciada tal ação, visto que o extrato se encontrava
diluído, portanto não apresentando ação sobre cultura mista e tão pouco sobre
micro-organismos organizados em consórcios.
No que diz respeito à citotoxicidade, as celulas 3T3 são comumente
utilizadas para se avaliar a toxicidade de compostos. Os dados mostraram que
através desse método e nas concentrações testadas, o extrato apresentou
citotoxicidade, uma vez que a densidade óptica obtida foi inferior ao do controle
positivo.
Na literatura não há outros relatos de viabilidade celular com fibroblastos
3T3 para a espécie S. paniculatum, entretanto a toxicidade aguda da raiz de S.
paniculatum em camundongos pela determinação da dose letal (DL50) e o
potencial citotóxico em eritrócitos humanos foi avaliada por Macedo-Costa et al.
(2014). O extrato não provocou mortalidade em nenhuma das concentrações
testadas (500 mg/mL-0,97 mg/mL) após 24, 72 hs e 15 dias. Quanto às
principais alterações comportamentais observadas nos camundongos tratados
com o extrato nos tempos de 30, 60, 90 e 240 minutos, foram verificadas
apenas piloereção e movimentos intensos das vibrissas até os primeiros 60
minutos até a concentração de 31,25 mg/mL (diluição 1:16). Não foi observado
nenhum efeito colateral grave e os animais apresentaram apenas pequenas
alterações comportamentais sugestivas de estimulação do SNC. Na avaliação
de citotoxicidade, foi observado nesse estudo que S. paniculatum induziu uma
baixa atividade hemolítica (menor que 50%) frente a eritrócitos humanos dos
tipos A, B, O e AB na concentração de 7,81 mg/mL (CIM), entretando
apresentou citotoxicidade na concentração de 250 mg/mL (diluição de 1:2).
Ainda no que diz respeito à toxicidade, Vieira, Santos e Chen-Chen
(2010) avaliaram as atividades mutagênica e citotóxica dos extratos etanólico
das folhas e dos frutos de S. paniculatum, utilizando o teste do micronúcleo em
medula óssea de camundongos. Os resultados indicaram que os extratos
etanólicos, tanto das folhas quanto dos frutos de S. paniculatum, não
apresentaram ação mutagênica em medula óssea de camundongos, porém,
em doses mais elevadas, ambos extratos exibiram atividade citotóxica. No
entanto, este estudo não apresentou um aumento de citotoxicidade em dose-
resposta de 200 e 300 mg.kg-1.
107
Devido a esses resultados contraditórios referentes à toxicidade, outros
testes como o de citoxicidade em hemácias e de índice de seletividade (indica
quantas vezes o produto testado é mais eficaz frente a determinados alvos do
que a células humanas) podem ser indicados.
Conflict of interests
The authors declare no conflicts of interests.
Acknowledgment
No financial support was received during the current study.
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110
Figuras
Figura 1. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel A
Rf
Cor
Vanilina Sulfúrica
Cloreto férrico UV 365 nm Reagente Natural A/ UV 365 nm
0,05 negro Marrom azul Azul
0,24 violeta - - -
0,39 - - - Azul
0,53 violeta - - -
0,66 violeta - - -
0,75 violeta - - Azul
0,84 violeta - azul Azul
0,92 violeta - - -
Figura 2. Valores de Rf e cor das zonas observadas com o uso da fase móvel B
Rf
Cor
Vanilina Sulfúrica
Cloreto férrico UV 365 nm Reagente
Natural A/ UV 365 nm
0,25 amarelo - azul Azul
0,32 - marrom azul Azul
0,34 - - azul Azul
0,43 amarelo - azul Azul
0,47 - marrom - -
0,54 amarelo - azul -
0,64 - marrom azul Azul
0,69 - - azul Azul
0,78 violeta - - -
0,81 - - azul Azul
0,87 violeta - - -
111
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES
A tese “Caracterização química, citotoxicidade e ação antimicrobiana
de extratos vegetais sobre micro-organismos superinfectantes do meio
ambiente bucal” é resultado da colaboração do Laboratório de Microbiologia
(Departamento de Odontologia-UFRN), Laboratório de Farmacognosia
(Departamento de Farmácia-UFRN), Laboratório de Biotecnologia de polímeros
naturais (Departamento de Bioquímica-UFRN), Laboratório de Pesquisa em
Petróleo (Núcleo de Processamento Primário e Reúso de Água produzida e
resíduo-UFRN), Laboratório de Microbiologia Clínica (Departamento de
Microbiologia e Parasitologia-UFRN), Laboratório de Cultura de Células
(Departamento de Bioquímica-UFRN), Laboratório de Microbiologia
(Universidade Estácio de Sá- Rio de Janeiro/RJ), Laboratório de Micologia (Rio
de Janeiro/RJ-UFRJ) e Laboratório de Microbiologia (Departamento de
Análises Clínicas e Toxicológicas-UFRN).
Inicialmente, a doutoranda avaliou a atividade antimicrobiana de
diversos extratos vegetais (jenipapo, corama, urucum, umbu, juá, maracujá
amarelo, quixabeira, cajá, jurubeba e gojiberry). Dentre esses, as raízes de
Solanum paniculatum, os frutos de Lycium barbarum e folhas de Spondias
mombin apresentaram significativa ação biológica justificando a sua inclusão
na referida pesquisa. Foi aventada a possibilidade de se realizar ensaios
clínicos controlados randomizados com os extratos, entretanto é mandatório
que seja cumprido todo o protocolo, envolvendo inúmeros testes in vitro,
ensaios pré clínicos e a autorização da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) para iniciar tal estudo de intervenção. Todas essas etapas
não seriam concluídas no período de doutoramento, visto que a jornada
investigativa desde a identificação de uma planta até a confecção de um
produto é árduo, oneroso e dinâmico, exigindo até décadas de estudo e
experimentações. Alguns autores apontam o período de 15 anos para tal feito.
Todas as etapas da pesquisa foram realizadas pela doutoranda Maria
Regina Macedo Costa e contribuiu para a capacitação de alunos da graduação
em Odontologia, monitores da disciplina de Microbiologia e Imunologia Oral,
alunos de iniciação científica e pós graduandos do curso de Odontologia e
Farmácia.
112
Os recursos disponíveis para a pesquisa foram escassos, o acesso aos
laboratórios e equipamentos para confecção e liofilização dos extratos e
desenvolvimento dos métodos foram bastante restritos, mas o compromisso
das pessoas envolvidas, a motivação, e o amor à ciência fizeram com que
chegássemos à concretização de nossos objetivos de maneira exitosa.
A partir dos resultados da pesquisa, pretende-se: desenvolver soluções
naturais para tratamento de infecções bucais persistentes ou refratárias, que
apresentem custo mais acessível à população e aos serviços públicos de
saúde, a fim de que seu uso possa ser implementado prioritariamente nos
serviços de Atenção Básica; solicitação de patente dos fitoterápicos cuja
concentração a ser testada in vivo for determinada a partir dos resultados da
pesquisa; produção de cartilha referente ao uso de fitoterápicos no meio
ambiente bucal e distribuição das mesmas nas unidades de saúde do SUS da
cidade do Natal-RN.
Durante o período do doutorado houve participação da aluna em 3 cursos
relacionados à referida pesquisa; 53 resumos publicados em anais e
apresentados em Congressos internacionais, nacionais, regionais e locais
relacionados ao tema da pesquisa do doutorado e 6 trabalhos apresentados
contemplam diretamente os resultados da pesquisa da tese; 3 artigos
científicos publicados em periódico internacional e 1 artigo científico aceito em
periódico internacional; e 3 artigos científicos que serão submetidos à
publicação em periódicos internacionais. A aluna e seu orientador foram
contemplados com financiamento do Projeto de Pesquisa Científica,
Tecnológica ou de Inovação, do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação e
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq
(Edital N º 01/2016 – Universal, intitulado: “Caracterização química,
citotoxicidade e ação antimicrobiana de Solanum paniculatum Linn e Lycium
barbarum Linn sobre microrganismos superinfectantes do meio ambiente
bucal” (tese de doutorado). Foram publicados 2 livros: “Plantas medicinais e
produtos bioativos na Odontologia” (2016), em que a aluna Maria Regina
Macedo Costa é uma das autoras e organizadoras do mesmo, e um dos
capítulos do referido livro, intitulado: ”Solanum paniculatum Linn: Agente
antimicrobiano potencial frente a micro-organismos do meio ambiente bucal” foi
produzido a partir dos resultados da tese de doutorado e tem como autores,
113
além da aluna, o orientador Prof. Dr. Kenio Costa de Lima. O segundo livro
“Triagem Fitoquímica e a o antibacteriana de Spondias mombin L.”que inclui
uma das plantas pesquisadas na tese. Foi criado o Grupo de Pesquisa “Liga de
Microbiologia do ambiente bucal” envolvendo alunos dos cursos de graduação
em Odontologia e foi proposto e aprovado pelo Núcleo Docente Estruturante
(NDE-DOD-UFRN) o componente curricular “Práticas Integrativas e
Complementares na Odontologia”, que tem como objetivo estimular alternativas
inovadoras e socialmente contributivas (dentre elas, a Fitoterapia) ao
desenvolvimento sustentável de comunidades e possibilitar o resgate e
valorização do conhecimento tradicional propiciando a troca de informações
entre, detentores de conhecimento tradicional, pesquisadores e docentes,
discentes e trabalhadores em saúde.
Logo, a realização dessa pesquisa foi fundamental para o estudo, o
desenvolvimento ordenado e a aplicação da pesquisa nacional neste Campo,
visto que a partir da conclusão dessa tese foi possível determinar a
concentração dos extratos que servirá de base para formulação de
fitoterápicos, cuja autorização e comercialização será solicitada para a Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a fim de que os mesmos possam
ser testados in vivo. A pesquisa sugere a capacitação de profissionais em
saúde bucal e geral, além de contribuir com a inserção de uma prática de
saúde tradicional no âmbito da assistência pública, respaldada pelo uso
popular, porém à luz do conhecimento científico.
114
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APÊNDICES
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4 SOLANUM PANICULATUM LINN: AGENTE ANTIMICROBIANO
POTENCIAL FRENTE A MICRO-ORGANISMOS DO MEIO AMBIENTE BUCAL
Maria Regina Macêdo-Costaa
Kenio Costa de Limaa
aDepartamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
[email protected], [email protected].
Ao longo dos séculos, a humanidade tem se beneficiado da medicina
natural para tratar ou prevenir uma ampla gama de doenças. Metabólitos
secundários de plantas e produtos microbianos e marinhos têm sido
considerados uma valiosa fonte de novas moléculas com potencial para o
desenvolvimento de medicamentos (CRAGG; NEWMAN, 1860). Diversas
condições que afetam a saúde bucal podem ser prevenidas, controladas e/ou
tratadas com o uso de recursos naturais - medicamentos ou formulações. Há
uma longa lista de drogas baseadas e derivadas de produtos naturais,
antissépticos bucais, pastas de dentes, dentre outros, que estão disponíveis
para consumo ou são administradas sob prescrição (NEWMAN; CRAGG,
2014). Entretanto, as razões pela busca de novas modalidades de tratamento
não cessa: resistência microbiana, toxicidade a curto e longo prazo, efeitos
adversos e colaterais e custos elevados. Assim, parece consensual que exista
uma persistente necessidade de obtenção de formulações para higiene bucal
mais potentes, eficazes, de baixo custo, que não desequilibrem a microbiota,
sejam seguros e bem tolerados (FREIRES; ROSALEN, 2016).
Nesse sentido, a utilização de plantas na prevenção e tratamento de
doenças infecciosas bucais e como agente antibiofilme, continua a ser
valorizada em muitas partes do mundo, é recomendado pela OMS (WHO,
1987), e em nosso país muitos estudos têm sido desenvolvidos visando avaliar
o uso popular de plantas na Odontologia, tornando possível a identificação de
espécies vegetais com potencial atividade biológica (OCHENG et al., 2014;
MOGOSANU et al., 2015).
No Brasil, existem diversas plantas potencialmente medicinais, como a
Solanum paniculatum Linn. Esta espécie está listada na Farmacopeia Brasileira
139
(BRASIL, 1959) e pertence a "Relação Nacional de Plantas Medicinais de
Interesse ao Sistema Único de Saúde (Renisus)” (BRASIL, 2009) por
apresentar potencial em gerar produtos de interesse do Ministério da Saúde.
O gênero Solanum é considerado um dos mais vastos e complexos
entre as angiospermas, possuindo 1500 espécies (HAMEED; HUSSAIN, 2015).
Nativa do Brasil, pertence à família Solanaceae, comum em vários estados do
país, estende-se desde os limites das Guianas até São Paulo e Minas Gerais.
Também é comumente encontrada no Paraguai, Bolívia e Argentina.
Solanum paniculatum Linn. é uma espécie vegetal do tipo arbusto ereto,
1,5-1,7m de altura, caule e ramos com acúleos cônicos, folhas alternas, lâmina
largo-ovoide ou lanceolada, inflorescências ramificadas, flores com pétalas
estrelada-retácea, alva ou lilás e fruto tipo baga (MESIA-VELA et al., 2002;
BOTION et al., 2005) (Figura 1).
Figura 1. Solanum paniculatum Linn (Teixeira-PB e Natal-RN).
Fonte: Medeiros (2015); Macedo-Costa (2015).
Geralmente conhecida como Jurubeba, o nome desta planta é originado
do Tupi-guarani, yu’beba, referente à presen a de espinho em alguma das
espécies (SILVA et al., 2005). Também conhecida como Jurupeba, Juripeba,
Juvena, Jubeba Juina ou Juna (MESIA-VELA et al., 2002).
Seus principais farmacógenos são folhas, raízes e frutos que são
amplamente utilizados pela medicina tradicional como tônico, antitérmico, no
tratamento de disfunções gástricas, bronquite, anemia, artrite, icterícia e
hepatite. A raiz de jurubeba é considerada a parte mais ativa da planta.
(MESIA-VELA et al., 2002; BOTION et al., 2005). No que se refere a aspectos
140
científicos, são constatadas ação antibacteriana, antifúngica, antiviral,
moluscicida, anticancerígena, anti-inflamatória, antioxidante, diurética,
antidiarreica, hepatoprotetora, gastroprotetora e antiulcerogênica. No entanto,
Solanum paniculatum pode determinar sinais de toxicidade, diarreias, náuseas,
vômitos, gastrite e duodenite erosiva, elevação das enzimas hepáticas e
eventualmente sintomas neurológicos. (MESIA-VELA et al., 2002; OLIVEIRA et
al., 2006; CARVALHO et al., 2007; VALADARES et al., 2009; LÔBO et al.,
2010; VIEIRA et al., 2013; SILVA et al., 2013; MACÊDO-COSTA et al., 2014;
VIEIRA JÚNIOR et al., 2015; GREGORIS et al., 2013; STEHMANN et al., 2015;
MARTINS et al., 2015; MACÊDO-COSTA, 2016; CLEMENTINO-NETO et al.,
2016).
A planta é componente de várias formulações farmacêuticas incluindo
xaropes, infusos e decoctos, extratos, tinturas e elixir. Infuso das flores é
indicado para bronquite e tosse, enquanto as raízes maceradas são indicadas
para artrite e os frutos para anemia. O decocto das folhas é empregado para
tratar parasitas intestinais, mas também é indicado para desordens estomacais
(MESIA-VELA et al., 2002; . BOTION et al., 2005).
Há um fitofarmacêutico brasileiro, que possui em sua formulação extrato
fluido das folhas de Solanum paniculatum, a Ierobina® (Laboratório Belfar, Belo
Horizonte, Brasil). O produto, comercializado há décadas, também possui
extratos de Remijia ferruginea, Jacaranda caroba, e a exótica Erythraea
centarium. Com exceção desta última, tais plantas ocorrem no Brasil e são
popularmente empregadas para tratar diferentes doenças, dentre as quais a
dispepsia (280 mg/kg/dia). Entretanto, mais estudos são necessários para
identificar os compostos responsáveis pela ação antidispépica da Lerobina®
(BOTION et al., 2005; TAGLIATI et al., 2008).
Existem outros produtos disponíveis no mercado que apresentam
Solanum paniculatum em sua composição, tais como a Jurubeba Composta
Elixir® (Infabra Ind. Farm. Bras. Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) e a Atalaia
Jurubeba® (Farmabraz, Rio de Janeiro, Brasil). Ambos possuem extratos de
jurubeba e boldo na sua composição e são indicados como
colerético/colagogo, nas dispepsias, flatulências e desconforto gastrintestinal.
Bebidas clássicas como aguardentes Jurubeba Leão do Norte® (Leão do Norte
Ltda, Bahia, Brasil), Jurubeba Nordestina® (Pernambuco, Brasil) e Coleguinha
141
Jurubeba® (Colonial, Ceará, Brasil) representam uma combinação de
macerado de frutos de jurubeba, extratos alcoólicos de plantas aromáticas,
decoctos de plantas amargas, xarope de açúcar de cana e álcool etílico. Os
usuários salientam as propriedades medicinais da planta e suas qualidades
hepáticas, digestivas, tonificantes e afrodisíacas.
Justificando as inúmeras propriedades medicinais acima citadas, alguns
dos constituintes químicos da jurubeba são: os alcaloides (jurubebina, jubebina,
isojuripidina); as solaninas (solamina, solanidina, solasodina); as resinas
(jupebina e jupebenina); saponinas (isojurubidina, isopaniculidina, isojurupidina
e jurubidina); os compostos esteroidais nitrogenados (paniculina, jurubina);
agliconas; ácidos graxos; ácidos orgânicos; os glicosídeos (paniculoninas A e
B), além de mucilagens e princípios amargos (SCHREIBER; RIPPERGER,
1966; RIPPERGER et al., 1967; BLANKEMEYER et al., 1998; MESIA-VELA et
al., 2002).
Análises fitoquímicas realizadas com o extrato etanólico da raíz de
jurubeba também indicam a existência de taninos flobabênicos (taninos
condensados ou catéquicos), flavonóis, flavanonas, triterpenoides pentacíclicos
livres e saponinas (CORDEIRO, 2008).
Em diversos estudos fitoquímicos em espécies do gênero Solanum,
muitos alcaloides têm sido isolados como anteriormente descrito, bem como
uma grande variedade de esteroides, saponinas, glicoalcaloides e flavonoides
que são importantes na defesa natural das plantas e possuem diversas
atividades biológicas (SILVA et al., 2005; CHENG et al., 2008; CHANG et al.,
2013; CHOU et al., 2012; KANADA et al., 2012; LI et al., 2014; MANASE et al.,
2012; MIRANDA et al., 2013; PINTO et al., 2013; ZHANG et al., 2013).
Em estudo realizado por Lôbo (2009) foi detectado um valor médio
tanífero de 4,6% (46g de TC/kg de MS) da raiz de S. paniculatum, empregando
o método de Stiasny (GUANGCHENG et al., 1991), adaptado por Paes et al.
(2006).
Através do fracionamento dos extratos etanólicos (70%) de partes
aéreas (folhas e galhos) de S. paniculatum, Vieira Júnior et al, 2014 isolaram
novas saponinas, (22R, 23S, 25R)-3b, 6a, 23-trihydroxy-5a-spirostane 6-O-b-D-
xylopyranosyl-(100 00 ?300 0)-O-[b-D-quinovopyranosyl(100 0 ?20)]-O-[a-L-
rhamnopyranosyl(100 ?30)]-O-b-D-quinovopyranoside (1) e diosgenin 3-O-b-D-
142
glucopyranosyl(100 ?60)-O-b-D-glucopyranoside (2), bem como quatro
componentes já conhecidos: ácido cafeico (3), diosgenina b-D-glucopiranósido
(4), rutina (5), e quercetina 3-O-a-L-ramnopiranosil (100 0? 600) -O-b-D-
glucopiranósido (6).
Macedo-Costa et al. (2014) e Macedo-Costa (2016) analisaram o extrato
da raíz de S. paniculatum por triagem fitoquímica preliminar e impressões
digitais por CCD com diferentes reveladores, a fim de identificar as classes de
metabólitos secundários. Os resultados obtidos corroboram estudos
farmacológicos anteriormente realizados e revelaram a presença de fenóis
(dentre os quais flavonoides e traços de taninos pirogálicos), gomas, lactonas e
alcaloides (em presença dos reativos de Dragendorff e Bertrand) e saponinas.
Na análise qualitativa de fenóis, em relação aos flavonoides e taninos,
encontrou-se mancha sugestiva de isovitexina e ácido tânico, respectivamente.
Tendo em vista a potencial atividade antimicrobiana desses compostos, foi
avaliado in vitro a ação de S. paniculatum sobre micro-organismos bucais
planctônicos e organizados em biofilme.
Macedo-Costa et al. (2014) avaliaram a ação antibacteriana do extrato
da raiz de S. paniculatum, sobre bactérias bucais endógenas na forma
planctônica: Streptococcus mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S.
salivarius e Lactobacillus casei. O extrato apresentou Concentração Inibitória
Mínima (CIM) de 7,81 mg/mL, Concentração Inibitória Mínima de Aderência
(CIMA) de 62,5 mg/mL e foi bactericida na concentração de 500 mg/mL em 2
horas de contato com S. mutans e na CIM em 4 horas. Esse estudo também
avaliou a ação do extrato bruto e diluído (CIM) de Solanum paniculatum sobre
micro-organismos em cultura mista na forma planctônica e organizados em
biofilme, a partir de saliva humana. Observou-se que o extrato bruto de
jurubeba apresentou ação antimicrobiana sobre os micro-organismos em
cultura mista na forma planctônica e organizados em biofilme, entretanto,
considerando a sua CIM, não foi evidenciada tal ação.
Macedo-Costa (2016) avaliou também a ação antimicrobiana de
Solanum paniculatum sobre micro-organismos superinfectantes do ambiente
bucal: Enterococcus faecalis e Candida albicans, ATCC (American Type
Culture Collection) e isolados clínicos. S. paniculatum apresentou ação
bacteriostática e fungistática e houve diferença estatisticamente significativa
143
entre o extrato e o controle positivo (digluconato de clorexidina a 0,12% e
nistatina 100.000 UI) até as diluições/concentrações: 1:64/ 7,81 mg/mL (E.
faecalis ATCC), 1:32/15,65 mg/mL (E. faecalis isolado do ambiente bucal - AB),
1:128/ 3,90 mg/mL (C. albicans AB) e 1:64/3,90 mg/mL (C. albicans ATCC).
Apresentou ação antiaderente (1:512/ 0,97 mg/mL) superior aos controles e
ação bactericida e fungicida quando do extrato bruto.
Lôbo et al. (2010) e Pereira et al. (2010) constataram a ação
antibacteriana de raízes de S. paniculatum sobre Staphylococcus aureus
(origem bovina e ATCC), Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
Valadares et al. (2009) avaliaram in vitro a atividade antiviral do extrato
de folhas de S. paniculatum sobre vírus da Herpes tipo I (HSV-1), vírus da
encefalomiocardite de murídeo (EMCV) e vírus da vacínia. S. paniculatum
inibiu a replicação de HSV-1 [Concentração eficaz 50% antiviral = (298,0 ±
11,2) µg / mL] e não mostrou nenhum efeito sobre EMCV e VACV.
Diferentes doses (31,25-500 mg/kg) de extrato etanólico de folhas de S.
paniculatum foram avaliados contra a úlcera gástrica induzida em ratos. A dose
mais baixa do extrato capaz de promover efeito antiúlcera foi de 125 mg/kg. O
tratamento com S. paniculatum por via oral foi capaz de diminuir a área de
lesão gástrica e também reduzir níveis de mieloperoxidase (MPO) em mucosa
gástrica (VIEIRA JÚNIOR et al., 2014).
Endringer et al, 2010 verificaram in vitro que plantas brasileiras com
atividade anti-inflamatória, dentre as quais S. paniculatum, são promissoras
fontes de agentes quimiopreventivos do câncer. Porém, são necessários
estudos para identificação dos princípios ativos que estariam relacionados a
essa ação farmacológica.
No que diz respeito à toxicidade, Vieira, Santos e Chen-Chen (2010)
avaliaram as atividades mutagênica e citotóxica dos extratos etanólico das
folhas e dos frutos de S. paniculatum, utilizando o teste do micronúcleo em
medula óssea de camundongos. Os resultados indicaram que os extratos
etanólicos, tanto das folhas quanto dos frutos de S. paniculatum, não
apresentaram ação mutagênica em medula óssea de camundongos, porém,
em doses mais elevadas, ambos extratos exibiram atividade citotóxica. No
entanto, este estudo não apresentou um aumento de citotoxicidade em dose-
resposta de 200 e 300 mg.kg-1.
144
A toxicidade aguda da raiz de S. paniculatum em camundongos pela
determinação da dose letal (DL50) e o potencial citotóxico em eritrócitos
humanos foi avaliada por Macedo-Costa et al. (2014). O extrato não provocou
mortalidade em nenhuma das concentrações testadas (500 mg/mL-0,97
mg/mL) após 24, 72 hs e 15 dias. Quanto às principais alterações
comportamentais observadas nos camundongos tratados com o extrato nos
tempos de 30, 60, 90 e 240 minutos, foram verificadas apenas piloereção e
movimentos intensos das vibrissas até os primeiros 60 minutos até a
concentração de 31,25 mg/mL (diluição 1:16). Não foi observado nenhum efeito
colateral grave e os animais apresentaram apenas pequenas alterações
comportamentais sugestivas de estimulação do SNC. Na avaliação de
citotoxicidade, foi observado nesse estudo que S. paniculatum induziu uma
baixa atividade hemolítica (menor que 50%)158 frente a eritrócitos humanos
dos tipos A, B, O e AB na concentração de 7,81 mg/mL (CIM), entretando
apresentou citotoxicidade na concentração de 250 mg/mL (diluição de 1:2).
Diversos estudos demonstram que Solanum paniculatum Linn apresenta
atividade bacteriostática, fungistática, antiaderente, bactericida, fungicida e
antiviral, in vitro, sobre suspensão microbiana de monocultura, cultura mista
planctônica e sobre biofilme multiespécie, justificada pelos achados
farmacológicos. Também foi evidenciado praticamente a ausência de efeitos
deletérios em termos toxicológicos pré clínicos, viabilizando a realização de um
ensaio clínico controlado randomizado e estimulando a pesquisa de
substâncias naturais bioativas para tratamento de infecções bucais associadas
a micro-organismos endógenos e superinfectantes.
Claramente, existe um grande potencial para a utilização de compostos
terapeuticamente relevantes a partir da natureza. Estes devem ser resultado da
colaboração interdisciplinar baseada no conhecimento empírico oriundo de
“raizeiros”, “mateiros”, “rezadeiras”, erveiros, curandeiros, pajés e outros; aliada
à etnofarmacologia, botânica, química dos compostos naturais, Microbiologia e
Farmacologia, visando minimizar a lacuna entre o in vitro e in vivo,
proporcionando eficácia clínica e segurança em seres humanos. Até então
algum progresso foi alcançado, mas ainda há um longo caminho a ser
superado.
145
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ANEXOS
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ANEXO 1 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa CEP protocolo nº. 140/04 –
CEP – Faculdade de Medicina - UFRJ
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ANEXO 2 – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa CEP- HUOL –UFRN, protocolo
nº. 152/07