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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE
NANOEMULSÕES COM EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
DAS FOLHAS DE Melaleuca leucadendron E CLORIDRATO
DE PILOCARPINA PARA O USO POTENCIAL COMO
RADIOPROTETOR TÓPICO
KAREN VITOR CARVALHO
OURO PRETO – MG
2014
KAREN VITOR CARVALHO
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE
NANOEMULSÕES COM EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
DAS FOLHAS DE Melaleuca leucadendron E CLORIDRATO
DE PILOCARPINA PARA O USO POTENCIAL COMO
RADIOPROTETOR TÓPICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia da Universidade
Federal de Ouro Preto como parte das exigências
para obtenção do grau de mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Orlando David Henrique
dos Santos - UFOP
OURO PRETO – MG
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
C331d Carvalho, Karen Vitor.
Desenvolvimento e avaliação de nanoemulsões com extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso potencial como radioprotetor tópico [manuscrito] / Karen Vitor Carvalho. - 2014. 129f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Santos Orlando David Henrique dos.
Coorientador: Prof. Dr. Souza Gustavo Henrique Bianco de.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro
Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas.
Departamento de Farmácia. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de Concentração Biotecnologia aplicada a processos e
ao tratamento de doenças.
1. Radioterapia - Teses. 2. Agentes de radiopreteção -
Teses. I. Santos, Orlando David Henrique dos. II. Souza,
Gustavo Henrique Bianco de. III. Universidade Federal de
Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 615.849
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
“Eu me sinto como uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me
em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos.”
Isaac Newton
Aos meus pais,
meus maiores exemplos e minha
maior fonte de energia e coragem
Com amor, dedico!
Agradecimentos
À Deus por estar comigo a cada instante! Obrigada por cuidar de mim, da minha família
e dos meus amigos, permitindo que encontremos apoio uns nos outros!
Ao Orlando, pela oportunidade proporcionada ao aceitar ser meu orientador! Obrigada
por confiar na minha capacidade, compartilhar conhecimentos e se empenhar em me
amparar mesmo de longe!
Aos meus pais, ao Ritchelly e à vó Geralda, por serem a minha família, o meu porto
seguro! Obrigada pelo amor, pela dedicação e por acreditarem em mim mesmo quando
eu duvidei!
Aos meus demais familiares, pelos bons conselhos, palavras de incentivo e por cada
pequeno gesto de afeto e cuidado! Em especial ao tio Hariph, à tia Zenaidia, à tia
Elisama e suas respectivas famílias, por estarem sempre presentes!
Ao amigo Ricardo Zatti, por me incentivar a escolher esse caminho, me indicar ao
Orlando e me motivar sempre!
Aos hermanos Ricardo, Simone e Vanessa, por toda amizade, cumplicidade e
crescimento! Obrigada pelos momentos e conhecimentos compartilhados, desde os dias
de trabalho intenso no laboratório até as risadas mais despreocupadas fora dele!
Aos amigos que me receberam no mestrado, Liliam, Zabelê, Shiara, Diego, Thais e
Fred, por me acolherem com os corações abertos! Obrigada pelo cuidado, pelas dicas,
pelas alegrias, enfim, pelo companheirismo que fez de vocês tão especiais para mim!
Aos amigos que vieram com o tempo, em especial Thales, Patrícia e Quênia, por
tornarem o meu dia-a-dia muito mais agradável! Obrigada por todo apoio, conversas e
descontrações!
Ao Gustavo e à Marina, por sua imensa dedicação e disponibilidade! Obrigada por toda
a boa vontade, abrindo mão de finais de semana e feriados para me ajudar! Sou muito
grata pela amizade que construímos e por me fazerem acreditar que era possível
concluir os experimentos!
Aos amigos de Sericita, que eu trago sempre na bagagem, por serem parte de mais essa
conquista! Obrigada por todo amor e torcida dedicados a mim!
Aos amigos feitos durante a graduação, em especial à galera do PAH e às amigas do
ninho, por continuarem sendo parte da minha vida! Obrigada pela cumplicidade que
mantivemos e por nunca deixarem que eu perca a motivação!
À Andressa, à Rose e à Carol, por cada um dos milhares de bons momentos que
tivemos como As vizinha! À Isa e à Zuck por completarem esse time! Obrigada pela
amizade e companheirismo de sempre!
À Republica Hipnose, com suas moradoras, ex-alunos e agregados, por me conceder a
fantástica experiência de morar em uma república com o meu perfil! Obrigada Neylli,
Satto, Lorens, Sílvia e Raquel por se tornarem as amigas com quem eu vivi tudo isso!
À gloriosa Republica Tcheca, por ser uma segunda casa para mim! Obrigada Ricardo,
por me levar até eles! Obrigada moradores, ex-alunos e agregados, por serem amigos
admiráveis, que o convívio transformou em família!
Às republicas estudantis, em especial à Alforria, Mata Burro, Skulaxu, Saideira, Mata
Virgem e Molotov, por serem fonte de amizade e descontração!
Ao professor Gustavo, meu co-orientador, por sua assistência! Obrigada pelas sugestões
enriquecedoras que fez!
À professora Sandra, por sua colaboração! Obrigada por aceitar essa parceria, me
ensinar sobre uma área nova e me disponibilizar o Gustavo e a Marina!
Ao professor Bibo, por todo o conhecimento científico e pessoal compartilhados!
Obrigada por ser um exemplo de professor e de pessoa!
Aos professores Milton e Daniel por aceitarem participar da banca e contribuir para o
enriquecimento desse estudo! Obrigada pela prontidão!
Aos funcionários do Cipharma, em especial à Mirella, Léo, Paty, Ramon e Jhon, por
sua disponibilidade e boa vontade! Obrigada pelo apoio e convívio!
Ao Josino e à Renata Guerra, por todo esclarecimento e ajuda que foram prestados!
Obrigada pela disposição!
A todos com quem dividi tempo e espaço no Laboratório de Nanotecnologia e
Desenvolvimento Galênico, no Laboratório de Farmacognosia e no Laboratório de
Imunoparasitologia, por toda contribuição e boa convivência!
À Prefeitura Municipal de Sericita, em especial à Marilda, Robson, Elielma e Wagner,
por me cederem um espaço com internet de qualidade para escrever! Obrigada pela
prestatividade e amizade!
À ilustre Escola de Farmácia, por ter a honra de fazer parte da sua história!
À Fapemig, por conceder a bolsa que tanto me ajudou financeiramente!
A todos que colaboraram, os meus sinceros agradecimentos!
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................... i
ABSTRACT............................................................................................................... ii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... iii
LISTA DE TABELAS.............................................................................................. v
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................................. vii
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................ 4
2.1. O câncer............................................................................................................... 5
2.2. Radioterapia......................................................................................................... 6
2.2.1.Radiodermatites................................................................................................. 7
2.3. Radioprotetores.................................................................................................... 9
2.3.1. Atividade antioxidante...................................................................................... 10
2.3.1.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 12
2.3.1.2. Método de redução do radical ABTS............................................................ 12
2.4. Melaleuca leucadendron..................................................................................... 13
2.5. Cloridrato de pilocarpina..................................................................................... 15
2.6. Óleo de girassol................................................................................................... 16
2.7. Nanoemulsões...................................................................................................... 17
2.7.1. Estabilidade das nanoemulsões......................................................................... 19
2.7.2. Emulsificação pelo método da temperatura de inversão de fases..................... 20
2.7.3. Vantagens das nanoemulsões........................................................................... 20
3. OBJETIVOS......................................................................................................... 22
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 24
4.1. Materiais.............................................................................................................. 25
4.1.1. Material Botânico............................................................................................. 25
4.1.2. Material para o desenvolvimento das nanoemulsões........................................ 25
4.2. Obtenção do extrato............................................................................................. 26
4.3. Prospecção Fitoquímica....................................................................................... 27
4.3.1. Compostos fenólicos......................................................................................... 28
4.3.2. Triterpenos e esteróides.................................................................................... 28
4.3.3. Taninos............................................................................................................. 28
4.3.4. Flavonóides....................................................................................................... 28
4.3.5. Antranóides e cumarinas................................................................................... 29
4.3.6. Saponinas.......................................................................................................... 29
4.3.7. Alcalóides......................................................................................................... 29
4.4. Determinação do teor de fenóis totais................................................................. 29
4.5. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro.................................................... 30
4.5.1. Método de redução do radical DPPH............................................................... 30
4.5.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado.............................................. 31
4.6. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A........................................................... 32
4.6.1. Emulsificação por inversão de fases................................................................. 32
4.6.2. Determinação da composição das nanoemulsões............................................. 32
4.6.3. Determinação do sistema tensoativo................................................................ 33
4.7. Avaliação macroscópica das formulações........................................................... 34
4.8. Avaliação microscópica das formulações............................................................ 34
4.9. Determinação da distribuição granulométrica..................................................... 34
4.10. Testes preliminares de estabilidade................................................................... 35
4.10.1. Estresse térmico.............................................................................................. 36
4.10.2. Centrifugação.................................................................................................. 36
4.11. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões.................................................. 36
4.11.1. Adição do EEB............................................................................................... 36
4.11.2. Adição do cloridrato de pilocarpina............................................................... 37
4.12. Caracterização físico-química das nanoemulsões.............................................. 37
4.12.1. Avaliação macroscópica................................................................................. 37
4.12.2. Avaliação microscópica.................................................................................. 38
4.12.3. Determinação da distribuição granulométrica................................................ 38
4.12.4. Determinação do pH....................................................................................... 38
4.12.5. Determinação da temperatura de inversão de fases........................................ 38
4.12.6. Determinação do potencial zeta...................................................................... 38
4.13. Testes de estabilidade........................................................................................ 39
4.14. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT.............. 39
4.15. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões................. 41
4.16. Análises estatísticas........................................................................................... 43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 44
5.1. Obtenção do extrato............................................................................................. 45
5.2. Prospecção fitoquímica........................................................................................ 45
5.3. Determinação do teor de fenóis totais................................................................. 46
5.4. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro.................................................... 48
5.4.1. Avaliação da capacidade antioxidante do extrato............................................. 48
5.4.1.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 48
5.4.1.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado........................................... 49
5.4.2. Avaliação da capacidade antioxidante do cloridrato de pilocarpina................. 51
5.4.3. Avaliação da capacidade antioxidante do óleo de girassol............................... 51
5.4.3.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 51
5.4.3.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado........................................... 53
5.5. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A........................................................... 54
5.6. Determinação da distribuição granulométrica..................................................... 59
5.7. Testes preliminares de estabilidade..................................................................... 59
5.7.1. Estresse térmico................................................................................................ 60
5.7.2. Centrifugação.................................................................................................... 60
5.8. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões.................................................... 61
5.8.1. Adição do EEB................................................................................................. 61
5.8.2 Adição do cloridrato de pilocarpina.................................................................. 63
5.9. Caracterização físico-química das nanoemulsões................................................ 64
5.9.1. Avaliação macroscópica................................................................................... 65
5.9.2. Avaliação microscópica.................................................................................... 65
5.9.3. Determinação da distribuição granulométrica.................................................. 65
5.9.4. Determinação do pH......................................................................................... 66
5.9.5. Determinação da temperatura de inversão de fases.......................................... 67
5.9.6. Determinação do potencial zeta........................................................................ 69
5.10. Testes de estabilidade........................................................................................ 71
5.10.1. Estresse térmico.............................................................................................. 71
5.10.2. Centrifugação.................................................................................................. 72
5.11. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT.............. 73
5.12. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões................. 75
6. CONCLUSÃO....................................................................................................... 80
7.PERSPECTIVAS................................................................................................... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 84
i
RESUMO
CARVALHO, K. V. Desenvolvimento e avaliação de nanoemulsões com extrato
etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina
para o uso potencial como radioprotetor tópico. 2014. Dissertação (Mestrado).
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
As radiodermatites são efeitos secundários que podem comprometer a dose e a
adesão à radioterapia, em pacientes com câncer. Substâncias radioprotetoras não
tóxicas, capazes de prevenir ou minimizar esses danos, são necessárias. A espécie
Melaleuca leucadendron e a pilocarpina possivelmente apresentam essa capacidade. O
objetivo da pesquisa foi desenvolver e avaliar nanoemulsões com extrato etanólico
bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso
potencial como radioprotetor tópico. O extrato de M. leucadendron foi obtido e
apresentou conteúdo fenólico de 10,23%. O cloridrato de pilocarpina não apresentou
capacidade antioxidante. O extrato e o óleo de girassol foram altamente antioxidantes,
apresentando CE50 de 17,0 ±0,59 µg/mL e 6,39 ±0,27 mg/mL, respectivamente, pelo
método DPPH. Nanoemulsões estáveis foram obtidas combinando óleo de girassol,
monoestearato de sorbitano e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado, através do método
de inversão de fases. Boa incorporação do extrato às nanoemulsões foi obtida
ultrassonicando o mesmo com o tensoativo hidrofílico previamente ao aquecimento da
fase oleosa. O cloridrato de pilocarpina foi adicionado durante o processo de
resfriamento das formulações. A nanoemulsão base e as nanoemulsões com extrato,
pilocarpina ou ambos ativos apresentaram tamanho de partícula entre 70 e 80 nm, com
baixo índice de polidispersão. Essas quatro emulsões apresentaram pH e temperatura de
inversão de fases característicos de sistemas estáveis e condizentes com o método de
obtenção utilizado. O potencial zeta dessas nanoemulsões foi superior a 30 mV em
módulo, conferindo estabilidade eletrostática às mesmas. As formulações
permaneceram inalteradas em até 60 dias de armazenamento, mesmo após os ensaios de
estabilidade. Foi observada citotoxicidade dependente das concentrações do extrato e/ou
pilocarpina, sendo que nanoemulsões com quantidades totais de ativos inferiores a 500
µg/ mL apresentaram viabilidade celular superior a 80%. As nanoemulsões foram
capazes de manter, com certa redução, os potenciais antioxidantes do extrato e do óleo
de girassol e um possível sinergismo entre os dois foi observado. As formulações com
pilocarpina apresentaram atividade antioxidante decorrente do óleo na composição. As
concentrações eficazes foram bastante inferiores às com toxicidade acima do aceitável.
As nanoemulsões obtidas foram caracterizadas como potenciais radioprotetores para uso
tópico, sendo necessário confirmar essa ação em estudos posteriores.
Palavras-chave: Radioterapia, radioproteção, Melaleuca leucadendron, cloridrato de
pilocarpina, nanoemulsões.
ii
ABSTRACT
CARVALHO, K. V. Development and evaluation of nanoemulsions with crude
ethanol extract of Melaleuca leucadendron’s leaves and pilocarpine hydrochloride
for potential use as a radioprotective topic. 2014. Dissertação (Mestrado). Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Radiodermatites are side effects that may compromise dose and adherence to
radiotherapy in cancer patients. Non-toxic radioprotectors, to prevent or minimize these
damages, are necessary. Melaleuca leucadenron specie and pilocarpine possibly present
this ability. The aim of this study was to develop and evaluate nanoemulsions
containing crude ethanol extract of Melaleuca leucadendron’s leaves and pilocarpine
hydrochloride for potential use as a radioprotective topic. Extract of M. leucadendron
was obtained and presented phenolic content of 10.23%. Pilocarpine hydrochloride did
not show antioxidant activity. Extract and sunflower oil were highly antioxidant, with
IC50 of 17.0 ± 0.59 µg / mL and 6.39 ± 0.27 mg / mL, respectively, by DPPH method.
Stable nanoemulsions were obtained by combining sunflower oil, sorbitan
monostearate, and ethoxylated hydrogenated castor oil, by phase inversion method.
Good incorporation of the extract in nanoemulsion was obtained by sonication with the
hydrophilic surfactant before heating the oil phase. Pilocarpine hydrochloride was
added during the cooling process of the formulations. Free nanoemulsion and
nanoemulsions with extract, pilocarpine or both, presented particle size in the range of
70 and 80 nm, with low polydispersity. These four emulsions showed pH and phase
inversion temperature characteristic of stable systems, consistent with the method of
production used. Zeta potential of these nanoemulsions was more than 30 mV in
magnitude, giving them electrostatic stability. Formulations have not changes during the
period of 60 days, even after stability tests. Depending on the concentrations of the
extract and / or pilocarpine cytotoxicity was observed, and nanoemulsions with total
quantities of active lower 500 µg / mL showed a 80% cell viability. Nanoemulsions
were able to maintain, with just a sligth reduction, the antioxidant potential of the
extract and sunflower oil, and possible synergism between the two was observed.
Formulations with pilocarpine showed antioxidant activity due to the oil in its
composition. Effective concentrations were much lower than concentrations with
toxicity above the acceptable. Nanoemulsions obtained were characterized as potential
radioprotective for topical use, being necessary to confirm this action in subsequent
studies.
Keywords: Radiotherapy, radioprotection, Melaleuca leucadendron, pilocarpine
hydrochloride, nanoemulsions.
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Pele e anexos cutâneos. Fonte: MEZADRI, 2010.....................................
8
Figura 2: Reação de redução do radical DPPH pelo antioxidante sintético BHT.
Fonte: TIVERON, 2010..............................................................................................
12
Figura 3: Redução do radical ABTS por um antioxidante e sua formação por
persulfato de potássio. Fonte: HUANG et al., 2005...................................................
13
Figura 4: Árvores da espécie Melaleuca leucadendron, localizadas no campus da
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).............................................................
14
Figura 5: Folhas, frutos e partes do caule da espécie Melaleuca leucadendron....... 14
Figura 6: Fórmula estrutural do cloridrato de pilocarpina. Fonte: Farmacopéia
Brasileira V, 2010.......................................................................................................
16
Figura 7: Aspecto translúcido de uma nanoemulsão em comparação com água
purificada. Fonte: ROCHA-FILHO 2014...................................................................
18
Figura 8: Estrutura molecular do monooleato de sorbitano. Fonte:
www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s6760...............................................
25
Figura 9: Estrutura molecular do monoestearato de sorbitano. Fonte:
www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/w302805........................................
26
Figura 10: Etapas do processo de obtenção do extrato etanólico bruto das folhas
de Melaleuca leucadendron. A – Folhas secas pulverizadas. B – Solvente sendo
eliminado do extrato em evaporador rotativo.............................................................
26
Figura 11: Representação esquemática da determinação da distribuição
granulométrica pela técnica de espectroscopia de correlação de fótons (PCS).
Fonte: YAJING et al., 2014........................................................................................
35
Figura 12: Extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron.............. 45
Figura 13: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o
ácido-gálico pelo método Folin-Ciocalteu para quantificação de compostos
fenólicos (média ± desvio padrão, n = 3)...................................................................
46
Figura 14: Reação de neutralização de radical livre por estrutura fenólica básica,
através da doação de hidrogênio, originando intermediário pouco reativo................
47
Figura 15: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração
do EEB de Melaleuca leucadendron após 30 e 60 minutos de reação (média ±
desvio padrão, n = 3)..................................................................................................
48
iv
Figura 16: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o α-
tocoferol pelo método de redução do radical ABTS liofilizado (média ± desvio
padrão, n = 3)..............................................................................................................
49
Figura 17: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração
do óleo de girassol após 30 e 60 minutos de reação. (média ± desvio padrão, n = 3)
52
Figura 18: Fotomicrografia de formulações utilizando o sistema tensoativo Span
80/ Croduret 50 Special, 24 horas após o preparo, aumento de 400X. A – emulsão
SC5 sob luz branca comum. B – emulsão SC3 sob luz polarizada............................
55
Figura 19: Fotomicrografia, sob luz polarizada, de uma das formulações
utilizando o sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 10 % de
fase oleosa, emulsão CC5, 24 horas após o preparo, aumento de 400X....................
56
Figura 20: Fotomicrografia, sob luz polarizada, da emulsão CC15, utilizando o
sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 20 % de fase oleosa,
24 horas após o preparo, aumento de 400X................................................................
57
Figura 21: Emulsão CC13 durante resfriamento sob agitação, com aspecto
transparente azulado...................................................................................................
58
Figura 22: Fotomicrografia sob luz polarizada, das formulações com aspecto
macroscópico de nanoemulsões, 24 horas após o preparo, aumento de 1000X. A –
emulsão CC13. B – emulsão CC14............................................................................
58
Figura 23: Incorporação de 0,5% do EEB previamente ao aquecimento da fase
oleosa. A – método I: EEB adicionado à fase oleosa completa. B – método II: EEB
adicionado ao Croduret 50 Special e sonicado por 2 horas. C – método III: EEB
adicionado ao Croduret 50 Special e sonicado por 4 horas........................................
62
Figura 24: Formulações contendo 0,1% de EEB. A – nanoemulsão obtida pelo
método I. B – nanoemulsão obtida pelo método III...................................................
62
Figura 25: Condutividade elétrica das nanoemulsões em função da temperatura..... 68
Figura 26: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB (E1 a E7) e das
nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina (P1 a P7), avaliada pelo método
MTT, frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3)........................................
74
Figura 27: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB e cloridrato de
pilocarpina, avaliada pelo método MTT, frente a macrófagos (média ± desvio
padrão, n = 3). Nessas formulações, as concentrações em %, de EEB e pilocarpina,
respectivamente, são: EP1 = 0,01/0,01; EP2 = 0,02/0,01; EP3 = 0,02/0,02 e EP4 =
0,05/0,05.....................................................................................................................
74
Figura 28: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração
de EEB nas nanoemulsões após 30 e 60 minutos de reação (média ± desvio
padrão, n = 3)..............................................................................................................
77
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composições testadas para a obtenção das nanoemulsões........................ 33
Tabela 2: Composição, denominação e proporção do sistema tensoativo
empregado para cada uma das formulações desenvolvidas........................................
33
Tabela 3: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões
avaliadas quanto à citotoxicidade pelo método MTT.................................................
41
Tabela 4: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões
avaliadas quanto à capacidade antioxidante pelo método DPPH...............................
42
Tabela 5: Triagem da presença dos principais metabólitos secundários no EEB
das folhas de Melaleuca leucadendron.......................................................................
45
Tabela 6: Comparação da capacidade redutora de DPPH do EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron, com alguns antioxidantes sintéticos e extratos vegetais...
49
Tabela 7: Comparação da capacidade redutora de DPPH do óleo de girassol e
alguns outros óleos.....................................................................................................
52
Tabela 8: Concentração de α-tocoferol com capacidade redutora do radical ABTS
equivalente a da solução de óleo de girassol diluído 10 vezes...................................
53
Tabela 9: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Span
80/Croduret 50 Special como sistema tensoativo.......................................................
54
Tabela 10: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Crill
3/Croduret 50 Special como sistema tensoativo.........................................................
55
Tabela 11: Resultados da distribuição granulométrica após o teste de estresse
térmico (média ± desvio padrão, n = 3)......................................................................
60
Tabela 12: Resultados da distribuição granulométrica após o teste de
centrifugação (média ± desvio padrão, n = 3)............................................................
61
Tabela 13: Composições centesimais das nanoemulsões utilizadas nos ensaios de
caracterização..............................................................................................................
64
Tabela 14: Distribuição granulométrica obtida para caracterização das
nanoemulsões, 24 horas após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3) ..................
65
Tabela 15: Valores de pH das nanoemulsões após 1, 7 e 30 dias do preparo
(média ± desvio padrão, n = 3)...................................................................................
66
Tabela 16: Tabela 16: Temperatura de inversão de fases (TIF) obtida para
caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o preparo.......................................
69
vi
Tabela 17: Potencial zeta obtido para caracterização das nanoemulsões, 24 horas
após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3)............................................................
70
Tabela 18: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos
testes de estresse térmico realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média
±desvio padrão, n = 3)................................................................................................
71
Tabela 19: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos
testes de centrifugação realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média
±desvio padrão, n = 3)................................................................................................
72
Tabela 20: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60
minutos, apresentada pelas nanoemulsões com EEB, de E1 a E6..............................
76
Tabela 21: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60
minutos, apresentada pelas nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina, de P1 a
P6................................................................................................................................
78
Tabela 22: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60
minutos, apresentada pelas nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina, de
EP1 a EP4...................................................................................................................
78
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A/O Água em óleo
ABTS 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-acidosulfónico)
ANOVA Análise de variância
BHT Butilhridroxitolueno
CC Crill 3 / Croduret 50 Special
CCD Cromatografia em camada delgada
CE50 Concentração eficaz a 50 %
CT50 Concentração tóxica a 50 %
DEMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DNA Ácido desoxirribonucléico
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EAG Equivalentes de ácido gálico
EAT Equivalentes de α-tocoferol
EEB Extrato etanólico bruto
EHL Equilíbrio hidrofílico-lipofílico
ELISA Ensaio imunoenzimático
EROs Espécies reativas de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
IDPPH Inibição do radical DPPH
INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva
IP Índice de polidispersão
Log P Coeficiente de partição óleo-água
MTT 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio
NB Nanoemulsão base
NE Nanoemulsão com EEB
NEP Nanoemulsão com EEB e pilocarpina
NP Nanoemulsão com pilocarpina
O/A Óleo em água
OMS Organização Mundial da Saúde
P.A Padrão analítico
PBS Tampão fosfato-salina
viii
PCS Espectroscopia de correlação de fótons
SC Span 80 / Croduret 50 Special
SPSS Statistical Package for Social Sciences
TE Equivalentes de Trolox
TIF Temperatura de inversão de fases
UV Ultravioleta
UV- vis Ultravioleta-visível
VC Viabilidade celular
Introdução
Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. A
terapia com radiação tem sido utilizada, por aproximadamente 100 anos, como um
modo efetivo de tratamento dessa patologia, sendo necessária em mais da metade dos
casos (MAURYA et al., 2006; GUERRA et al., 2012; JEONG et al., 2014;
HALVORSEN et al., 2014).
A radioterapia tem como fundamento a aplicação de uma dose determinada de
radiação ionizante, num volume tumoral previamente definido, com a finalidade de
diminuir ou erradicar o tumor. No entanto, para chegar às células cancerosas, a radiação
atravessa os tecidos adjacentes causando danos aos mesmos (REIS, 2008; KHAN e
ALHOMIDA, 2011). A base dessa terapia é lesionar direta ou indiretamente o DNA,
causando danos irreparáveis. Geralmente a morte das células ocorre na primeira ou em
uma das primeiras divisões celulares pós-radiação, acometendo preferencialmente os
tecidos com maior proliferação (STONE et al., 2003; MARKOUIZOU et al., 2007;
BURDAK-ROTHKAMM e PRISE, 2009).
A pele é uma barreira de defesa biológica e, devido à sua elevada taxa
proliferativa, é também um dos principais órgãos afetados pelos danos que essa terapia
promove. Muitas vezes apresenta a inflamação específica da radiação, denominada
radiodermatite. Essas lesões cutâneas podem ser limitantes da dosagem aplicada na
sequência do tratamento, comprometendo sua eficácia ou a qualidade de vida do
paciente. E, algumas reações agudas graves, podem requerer a suspensão temporária ou
permanente da radioterapia (MARKOUIZOU et al., 2007; MEI et al., 2014).
Com a intenção de proteger os tecidos não alvo dos efeitos da radiação, têm sido
utilizados agentes químicos com capacidade radioprotetora. Esses compostos agem
diminuindo a interação da radiação com as células dos tecidos saudáveis. Como
exemplos podem-se citar as substâncias com propriedades antioxidantes, que diminuem
a ação dos radicais livres formados, protegendo dos danos celulares subsequentes
(BALIGA e RAO, 2010; CITRIN et al., 2010; BEGG et al., 2011). Embora haja certo
número de compostos descritos com função radioprotetora, apenas a amifostina está
atualmente em uso clínico. Esse agente tem limitações decorrentes da sua toxicidade.
Assim, há uma carência de substâncias, especialmente de origem natural, que protejam
as células normais, apresentando baixo nível tóxico e fácil administração (YOU et al.,
2009; BEGG et al., 2011; RAZZAGHDOUST et al., 2014).
Introdução
3
O desenvolvimento de medicamentos, historicamente, é sinônimo do estudo de
princípios ativos derivados de fontes naturais, principalmente espécies vegetais. A
espécie Melaleuca leucadendron é pertencente à família Myrtaceae, proveniente da
Austrália e comum em regiões de clima tropical a temperado. Alguns extratos da
espécie e o óleo essencial das folhas tem sido relacionados com potenciais antioxidantes
e anti-inflamatórios (FU et al., 2010; PUJIARTI et al., 2011; YUN et al., 2012).
A pilocarpina é um alcalóide presente nas folhas da espécie vegetal Pilocarpus
microphyllus, conhecida popularmente como jaborandi. É um agonista muscarínico
utilizado nos tratamentos de glaucoma e xerostomia. Em muitos países tem sido
utilizada para amenizar efeitos adversos consequentes do tratamento radioterápico,
sendo o seu uso aprovado para tratar a baixa salivação decorrente da radioterapia
(RODRÍGUEZ-CABALLERO et al. 2012; SAWAYA et al., 2011; ARARUNA et al.,
2012; KIM et al., 2014).
As nanoformulações, incluindo nanoemulsões, têm sido constantemente
utilizadas como carreadoras de substâncias de origem vegetal, melhorando as
propriedades farmacocinéticas dos produtos e protegendo contra toxicidade e
degradação (ANSARI et al., 2012; KUMARI et al., 2012). As nanoemulsões
apresentam as vantagens de aumentar a solubilidade e a permeabilidade das substâncias
ativas. Quando aplicadas topicamente, são capazes de penetrar nas rugosidades até
mesmo da pele áspera. Além disso, apresentam caráter estético agradável e causam boa
sensação quando aplicadas (TADROS et al., 2004; MORAIS et al. 2006; KUMARI et
al., 2012).
Considerando o elevado número de pacientes acometidos por radiodermatites, a
finalidade desse estudo foi associar as propriedades da Melaleuca leucadendron e da
pilocarpina às vantagens oferecidas por sistemas nanoemulsionados, tentando suprir a
necessidade de medicamentos, de origem natural, capazes de prevenir ou minimizar
essas lesões cutâneas. Assim, o objetivo geral foi desenvolver nanoemulsões com
extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de
pilocarpina, e avaliar essas formulações quanto a um potencial uso como radioprotetores
tópicos.
Revisão da Literatura
Revisão da Literatura
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O câncer
O câncer é uma das principais causas de óbito no mundo. Segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS) (2014), causou 8,2 milhões de mortes em 2012.
São milhões de casos incidentes anualmente, sendo que, de acordo o Instituto Nacional
de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA) estima-se que só no Brasil, ocorram
aproximadamente 576 mil novos casos, no biênio 2014/2015 (BRASIL, 2014).
A doença se caracteriza pelo crescimento rápido e incontrolável de células
anormais e pode afetar qualquer parte do organismo. Essas células cancerosas podem
romper seus limites habituais, atingir tecidos adjacentes e posteriormente invadir outros
órgãos, fenômeno denominado metástase (CASTLE et al., 2014; CHEN et al., 2014).
Muitos tipos de câncer ainda não respondem totalmente às intervenções
terapêuticas. Para uma maior eficácia do monitoramento e tratamento, com chances de
cura, é necessário um diagnóstico precoce e exato (ILYAS et al., 2014; VULAPALLI,
2014; SU et al., 2015).
O objetivo da terapia é curar a doença ou prolongar consideravelmente a
sobrevida do paciente, assim como melhorar a qualidade de vida. O tratamento dessa
patologia requer uma seleção cuidadosa de uma ou mais intervenções. As principais
alternativas são cirurgia, radioterapia e quimioterapia (BALIGA e RAO, 2010; KHAN e
ALHOMIDA, 2011; OMS, 2014).
A quimioterapia citotóxica é a intervenção mais comum. Nesse tratamento, as
células cancerosas que se dividem rapidamente são mortas. Algumas células saudáveis,
que apresentam maiores taxas proliferativas, também costumam ser eliminadas por
dificuldades na especificidade da medicação (VULAPALLI, 2014).
A radioterapia é considerada a primeira linha de tratamento para uma grande
variedade de tumores malignos. É necessária em cerca de 50 % dos casos, sendo
comumente associada à quimioterapia, para uma maior eficiência. (BEIJER et al., 2013;
JEONG et al., 2014).
Revisão da Literatura
6
2.2. Radioterapia
Desde o final do século XIX, quando houve a descoberta de meios de gerar
Raios X por Wilhelm Conrad Roentgen, a terapia com radiação ionizante tem sido
desenvolvida como uma parte essencial do diagnóstico e do tratamento de vários tipos
de câncer. A intervenção por esse método pode ser realizada como uma modalidade
primária ou como adjuvante, em combinação com cirurgia, quimioterapia, terapia
hormonal e imunoterapia (VUJOŠEVIĆ e BOKOROV, 2010; KHAN e ALHOMIDA,
2011).
A radioterapia tem como princípio geral causar danos irreparáveis ao DNA das
células cancerosas, impedindo que as mesmas cresçam ou se reproduzam. É utilizada
com intenção curativa ou paliativa. Pode ser aplicada de formas diferentes, dependendo
do tipo de câncer e dos objetivos do tratamento. Pode ser através de feixe externo,
denominada teleterapia, através de braquiterapia, que consiste em incidir a radiação
diretamente nos tecidos tumorais e ainda, por meio de radiofármacos (RADVANSKY et
al., 2013; JEONG et al., 2014; PLITEA et al., 2015).
O tratamento básico com irradiação consiste em administrar uma dose total,
dividida em frações. Essas frações são aplicadas com frequência predeterminada, por
um período de tempo. Cada fração elimina a mesma quantidade de células tumorais,
sendo que a cada dose diária, o tumor estará menor e, com isso, a proporção de
destruição será maior. Logo, o intuito do fracionamento é obter um declínio geométrico
do número de células sobreviventes a cada aplicação, ocasionando uma regressão do
câncer (WITHERS, 1992; MURIEL, 2002; BOURGIER et al., 2013).
De acordo com Connell e Hellman (2009) a administração da dose em frações
parece amplificar uma pequena vantagem de sobrevivência que os tecidos normais
apresentam sobre as células tumorais, quando irradiados com pequena exposição.
Assim, o fracionamento permite minimizar os efeitos adversos e aperfeiçoar o efeito
citotóxico sobre os tecidos cancerosos (BOURGIER et al., 2013).
Os efeitos da radioterapia podem ser divididos em quatro etapas:
Física, na qual a radiação é absorvida pelos tecidos, resultando na ionização e
excitação dos átomos;
Química, na qual os átomos e moléculas alterados reagem com outros
componentes celulares, ocasionando a quebra de ligações químicas e formação
de radicais livres;
Revisão da Literatura
7
Biológica, que representa os processos subsequentes, como danos ao material
genético, lesões na membrana da célula e alteração de processos bioquímicos;
Clínica, onde ocorre a manifestação dos sinais e sintomas da exposição à
radiação (JERÔNIMO, 2013).
Os danos causados pela radiação ionizante podem ser letais às células tumorais.
Caso ocorra reparação, parcial ou total das mesmas, ainda podem exibir uma variedade
de anormalidades cromossômicas capazes de comprometer sua divisão e viabilidade
(FALK, 2003).
As fases do ciclo celular mais sensíveis à radiação são a fase pré-mitótica (G2) e
a fase mitótica (M), na qual ocorre a divisão celular. Com isso, células que se dividem
rapidamente, como é o caso das tumorais, tendem a ser os alvos dessa terapia (FALK,
2003).
Para atingir os tumores, a radiação atravessa tecidos saudáveis, deixando-os
expostos aos danos que pode causar. A natureza e o grau dos efeitos colaterais
dependem da dose de radiação ionizante e da sensibilidade dos órgãos irradiados
(JEONG et al., 2014). Segundo Gontarz et al. (2014) a radiossensibilidade celular é
proporcional à sua atividade proliferativa. Portanto, a radioterapia é um balanço entre a
destruição de células tumorais e a minimização dos danos aos tecidos normais.
2.2.1. Radiodermatites
Devido à sua elevada taxa de proliferação, a pele é um dos órgãos mais afetados
pelo tratamento radioterápico. Danos cutâneos precoces e tardios são descritos desde os
estudos pioneiros da radioatividade. As radiodermatites, como são denominadas, são
esperadas em cerca de 95 % dos pacientes que fazem terapia com radiação (KIROVA et
al., 2011; CHAN et al., 2014).
A pele normal é composta por epiderme, derme e hipoderme (FIGURA 1). A
epiderme encontra-se num processo constante de renovação celular, em equilíbrio com
as células que se descamam naturalmente. Aproximadamente 10 % das células basais da
epiderme são submetidas à mitose a cada dia, ocorrendo uma total substituição das
células epidérmicas a cada quatro semanas. A derme, parte subjacente, contém
estruturas de apoio, como vasos sanguíneos, nervos, glândulas, e folículos pilosos
(MCQUESTION, 2011).
Revisão da Literatura
8
Figura 1: Pele e anexos cutâneos
Fonte: MEZADRI, 2010
As dermatites são consequência do tratamento por radiação interromper o
processo normal de divisão celular e comprometer a regeneração, resultando em danos
ou morte celular. A patofisiologia dessas reações envolve uma combinação de lesão
direta pela radiação e uma resposta inflamatória subsequente, que afetam as células da
epiderme, a derme e a vascularização (RADVANSKY et al., 2013; CHAN et al., 2014).
Segundo os Critérios Comuns de Terminologia para Eventos Adversos v3.0 (do
inglês: CTCAE – Common Terminology Criteria for Adverse Events) (2006), definidos
pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos, as radiodermatites podem ser
classificadas em 5 graus, de acordo com a gravidade:
Grau 1, ocorre eritema fraco ou descamação seca;
Grau 2, ocorre eritema moderado a vigoroso, descamação úmida desigual,
confinada principalmente às dobras e rugosidades cutâneas e edema moderado;
Grau 3, ocorre descamação úmida fora das dobras e rugosidades, com
hemorragia induzida por trauma menor ou abrasão;
Grau 4, ocorre necrose da pele ou ulceração de toda a espessura da derme e
sangramento espontâneo do local envolvido;
Grau 5, ocorre a morte do paciente.
As radiodermatites geralmente são observadas depois de alguns dias a semanas
do início do tratamento e podem persistir por duas a quatro semanas posteriores à
terapia. Contribuem para dor, desconforto, irritação, coceira e queimação. Muitas vezes
Revisão da Literatura
9
são um fator limitante da dose ou até mesmo um motivo para a interrupção do
tratamento (KIROVA et al., 2011; MCQUESTION, 2011).
2.3. Radioprotetores
O diagnóstico precoce e as novas abordagens multidisciplinares têm contribuído
para um aumento na expectativa de vida dos pacientes. Com isso, a preocupação com a
redução dos efeitos tóxicos da radiação e melhoria da qualidade de vida é cada vez
maior (BOURGIER et al., 2012).
Os denominados radioprotetores são agentes que protegem contra a lesão
induzida por radiação, se administrados antes, durante, ou depois da irradiação. Um
protetor ideal deve evitar os efeitos adversos graves ou tardios em tecidos normais, ser
facilmente dispensado, com a mínima toxicidade inerente e não proteger o tumor das
radiações ionizantes (WEISS e LANDAUER, 2009; BOURGIER et al., 2012).
Os radioprotetores têm sido classificados de acordo com o período de aplicação.
São denominados profiláticos quando administrados anteriormente à radioterapia para
prevenir a ocorrência de efeitos agudos ou tardios. Os mitigadores são aqueles aplicados
durante ou um pouco depois da terapia, com a finalidade de reduzir as ações da radiação
sobre os tecidos normais, antes do surgimento de sintomas. E os que são os utilizados
após a irradiação para evitar seus efeitos tardios, quando os sintomas já foram
desenvolvidos, são os agentes terapêuticos (BEGG et al., 2011; BOURGIER et al.,
2012).
Os agentes protetores da radiação podem exercer sua ação por diversos
mecanismos, como suprimir a formação de espécies reativas, detoxificar as espécies
reativas formadas, estabilizar o alvo ou, ainda, aumentar os processos de recuperação e
reparo (NAIR et al., 2001).
Agentes que tem capacidade de induzir hipóxia local suprimem a formação de
espécies reativas. Como no caso dos que realizam reações que resultam no consumo
químico ou bioquímico de oxigênio, tornando esse menos disponível para a formação de
espécies reativas de oxigênio (EROs) (JERÔNIMO, 2013).
Outra forma dos radioprotetores agirem é neutralizando as espécies reativas para
que não interajam com estruturas celulares, evitando que danos sejam causados. Essa
ação pode ser decorrente do sequestro de radicais livres, da doação de hidrogênio para
essas espécies ou por estimulação das enzimas com atividade antioxidante, como a
Revisão da Literatura
10
glutationa redutase e a superóxido dismutase (NAIR et al., 2001; BALIGA e RAO,
2010; CHATTERJEE, 2013).
A estabilização que os radioprotetores promovem deve-se à capacidade que
alguns compostos têm de interagir com alvos celulares, como o DNA, originando
complexos que protegem dos danos da radiação (NAIR et al., 2001; JERÔNIMO,
2013).
O aumento dos processos de recuperação ocorre através da ativação de uma ou
mais vias de reparo do DNA, que geralmente agem em conjunto para eliminar os danos
e restabelecer as funções celulares (YOUSRI et al., 2011; CHATTERJEE, 2013).
Os efeitos de radioproteção são, de maneira geral, consequência das capacidades
sequestradora de radicais livres, quelante de metais, antioxidante, anti-inflamatória,
antimutagênica ou do aprimoramento dos processos de reparo do DNA (BALIGA e
RAO, 2010; BEGG et al., 2011).
Muitos estudos avaliando a eficácia de agentes tópicos e orais, para a prevenção
e tratamento de radiodermatites, têm sido desenvolvidos no decorrer dos últimos anos.
Nem todos esses agentes tiveram alguma capacidade de reduzir ou eliminar os efeitos
tóxicos da radiação à pele comprovada. Apenas a amifostina foi aprovada pela FDA (do
inglês: Food and Drug Administration) (HOSSEINIMEHR, 2009; MASFERRER et al.,
2010).
A amifostina é um potente radioprotetor, capaz de ligar-se a radicais livres,
desintoxicando moléculas potencialmente prejudiciais geradas pela radiação. No
entanto, não pode ser utilizada quando a quimioterapia estiver associada ao tratamento
radioterápico, o que comumente acontece. Esse fármaco tem seu uso clínico limitado,
devido aos efeitos colaterais e à toxicidade que apresenta (HOSSEINIMEHR, 2009;
CITRIN et al., 2010; MADERO-VISBAL et al., 2012).
O desenvolvimento de radioprotetores efetivos e não tóxicos é uma necessidade
cada vez mais evidente. Muitas espécies vegetais têm sido investigadas com essa
finalidade. No entanto, até o momento, nenhum medicamento que apresente todas as
características ideais foi relatado (ARORA et al., 2005; YOU et al., 2009).
2.3.1. Atividade antioxidante
As EROs são formadas normalmente no organismo. As células possuem
mecanismos endógenos capazes de combatê-las. Porém, quando essas espécies são
Revisão da Literatura
11
formadas em elevada quantidade, como no caso de células expostas à radiação, ocorre
um desequilíbrio entre EROs e os antioxidantes do organismo, gerando uma condição
denominada estresse oxidativo (YOUSRI et al., 2011; BARRERA, 2012).
Os danos celulares causados pela radiação ionizante são predominantemente
mediados pela geração excessiva de EROs. A interação da radiação com a água, que é o
maior constituinte das células, desencadeia a formação dessas espécies. Os radicais
livres originados reagem com as macromoléculas celulares, como DNA, RNA,
proteínas e membrana, resultando em disfunção ou mortalidade celular (BAÑO et al.,
2006; SRINIVASAN et al., 2006).
A redução desses radicais livres por ação de substâncias com propriedades
antioxidantes, especialmente de origem natural, representa uma possível forma de
proteção contra as injúrias causadas pela radiação (GREENBERGER e EPPERLY,
2004; SRINIVASAN et al., 2006; BOURGIER et al., 2012).
Os compostos fenólicos, encontrados em uma grande variedade de espécies
vegetais, têm recebido atenção especial. Geralmente apresentam efetivo potencial
antioxidante, originando um radical fenoxi, cuja estrutura é altamente estabilizada por
ressonância e incapaz de propagar reações radicalares em cadeia. Devido a essa elevada
capacidade sequestradora de radicais livres, esses compostos têm sido estudados como
substâncias potencialmente radioprotetoras (SRINIVASAN et al., 2007;
HOSSEINIMEHR, 2009; MACEDO et al., 2013).
A atividade antioxidante pode ser decorrente de mecanismos diversos, como
inibição de reações de oxidação de radicais livres; inibição da formação de radicais
livres; interrupção da propagação de auto-oxidação em cadeia; supressão de oxigênio
singlete; conversão de hidroperóxidos em compostos estáveis; conversão de metais pró-
oxidantes em produtos estáveis e, finalmente, inibição de enzimas pró-oxidantes
(CAROCHO e FERREIRA, 2013).
Há muitos métodos para avaliar a atividade antioxidante dos derivados vegetais,
mas nenhum deles está livre de resultados equivocados. É interessante que a avaliação
seja realizada pela combinação de ensaios distintos. Métodos colorimétricos, biológicos
e eletroquímicos têm sido empregados. Os mais utilizados são os colorimétricos,
destacando-se aqueles relacionados à habilidade dos antioxidantes em neutralizar
radicais livres (BADARINATH et al., 2010; BORGES et al., 2011; CAROCHO e
FERREIRA, 2013).
Revisão da Literatura
12
2.3.1.1. Método de redução do radical DPPH
O 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) em sua forma radicalar apresenta
coloração roxa e absorve em 517 nm. Após ser reduzido por um antioxidante a absorção
desaparece, como pode ser observado na Figura 2 que ilustra a reação desse radical com
o antioxidante sintético BHT. Atualmente esse é um dos métodos mais utilizados para
avaliar capacidade antioxidante. (BRAND-WILLIAMS et al., 1995; TIVERON, 2010).
Figura 2: Reação de redução do radical DPPH pelo antioxidante sintético BHT
Fonte: TIVERON, 2010
Alguns fenóis, como o α-tocoferol, reagem rapidamente com o radical DPPH.
No entanto, devido a várias reações secundárias que ocorrem lentamente causando uma
diminuição progressiva de absorbância, pode ser difícil alcançar o estado estacionário
mesmo após algumas horas. Normalmente é determinada a concentração de
antioxidante necessária para captar 50% dos radicais DPPH (CE50) após 30 minutos de
reação e o tempo para alcançar estabilidade (PEREIRA, 2010).
2.3.1.2. Método de redução do radical ABTS
O radical 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-acidosulfónico) (ABTS) precisa
primeiramente ser formado através de reações enzimáticas ou químicas, como com o
persulfato de potássio. O radical originado apresenta coloração esverdeada que vai
sendo eliminada à medida que é reduzido por uma substância antioxidante (Figura 3). A
atividade por esse método é avaliada por comparação, sendo expressa como
equivalentes de um antioxidante padrão (ARNAO, 2000; TIVERON et al., 2012).
Revisão da Literatura
13
O ABTS é mais reativo que o DPPH, completando a reação após 1 minuto. Por
ser solúvel tanto em água quanto em solventes orgânicos permite a análise de amostras
com diferentes polaridades (ARNAO, 2000; TIVERON et al., 2012).
Figura 3: Redução do radical ABTS por um antioxidante e sua formação por persulfato
de potássio.
Fonte: HUANG et al., 2005
2.4. Melaleuca leucadendron
A família Myrtaceae compreende cerca de 130 gêneros e de 3800 a 5800
espécies, sendo composta de arbustos lenhosos a árvores altas. Apresenta elevada
ocorrência na Austrália, sudeste da Ásia e nas regiões tropicais e temperadas da
América. É considerada uma das mais diversificadas famílias do cerrado brasileiro
(STEFANELLO et al., 2011; VILLARROEL et al., 2014).
O gênero Melaleuca é pertencente a essa família, sendo representado por
aproximadamente 250 espécies. Dentre essas espécies encontra-se a Melaleuca
leucadendron (Figura 4), cuja árvore apresenta caule branco acinzentado e esponjoso
com folhas geralmente verde-escuras. As flores são branco-amareladas e pequenas e os
frutos são lenhosos, capsulados e globosos (TSURUGA et al., 1991; RINI et al., 2012;
AHMED et al., 2013; SHAH et al., 2013).
Conhecida popularmente como melaleuca ou cajuputi, a Melaleuca
leucadendron possui elevada capacidade de adaptação e pode crescer bem em solos
pobres, ambientes secos ou submersos, sendo resistente a pragas e poluição (AHMED et
al., 2013; TIA et al., 2013).
A casca, as folhas e os frutos de M. leucadendron (Figura 5) são usados na
medicina popular como tranquilizantes, sedativos, analgésicos e em várias patologias da
pele. O óleo essencial das folhas dessa espécie tem sido utilizado em fitoterápicos e
cosméticos e apresenta atividades como antioxidante, antibacteriana, antiviral e
Revisão da Literatura
14
antifúngica (YOSHIDA et al., 1996; PUJIARTI et al., 2011; RINI et al., 2012; SURH e
YUN, 2012).
Figura 4: Árvores da espécie Melaleuca leucadendron, localizadas no campus da
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
Figura 5: Folhas, frutos e partes do caule da espécie Melaleuca leucadendron
Revisão da Literatura
15
Fu et al. (2010) avaliaram extratos dos frutos de M. leucadenron, em
tetrahidrofurano ou em mistura de metanol /ácido acético/ água, encontrando grande
potencial antioxidante e elevado conteúdo fenólico. Segundo estudo realizado por Surh
e Yun (2012) a fração butanólica do extrato metanólico de M. leucadendron apresenta
propriedades que sugerem que essa espécie possa ser utilizada como uma fonte de
antioxidantes e anti-inflamatórios naturais.
2.5. Cloridrato de pilocarpina
A espécie vegetal Pilocarpus microphyllus, conhecida popularmente como
jaborandi, é um tipo de arbusto originário do Brasil, que ocorre mais intensamente no
estado do Maranhão. As folhas dessa espécie são a principal fonte de pilocarpina, um
alcalóide que age como agonista colinérgico muscarínico (ARARUNA et al., 2012;
CHO et al., 2013; JENSEN et al., 2013).
A pilocarpina possui muitas propriedades farmacêuticas, predominantemente
relacionadas às suas ações parassimpatomiméticas. É um princípio ativo que exerce
funções semelhantes à acetilcolina e é capaz de estimular a secreção das glândulas
sudoríparas, lacrimais e salivares (MACKNELLY e DAY, 2009; SAWAYA et al.,
2011; CHO et al., 2013).
Esse fármaco tem sido utilizado a mais de um século para reduzir a pressão
intraocular no tratamento do glaucoma. É geralmente empregado na forma de cloridrato
de pilocarpina, como solução oftálmica, em concentrações de 1 à 4 % (FRONZA et al.,
2004; ABREU et al., 2011; CHANG et al., 2013).
O cloridrato de pilocarpina (Figura 6) apresenta a forma de um pó branco
cristalino ou de cristais incolores, caracterizando-se por ser altamente higroscópico.
Esse princípio ativo é altamente solúvel em água e etanol, com coeficiente de partição
óleo/água hidrofílico (log P = 0,01) (JARVINEN et al., 1991; FARMACOPÉIA
BRASILEIRA V, 2010).
A administração oral de cloridrato de pilocarpina é indicada em muitos países
para tratar a xerostomia induzida pela radiação. Essa capacidade de minimizar um dos
efeitos colaterais da radioterapia tem sido relacionada ao estímulo da secreção salivar
pelo fármaco (SCARANTINO et al., 2006; MACKNELLY e DAY, 2009;
RODRÍGUEZ-CABALLERO et al. 2012).
Revisão da Literatura
16
Figura 6: Fórmula estrutural do cloridrato de pilocarpina
Fonte: Farmacopéia Brasileira V, 2010
Um gel de pilocarpina a 4% foi eficaz para o tratamento de pênfigo vulgar, uma
doença caracterizada por lesões na pele. O índice de epitelização observado em lesões
tratadas topicamente, com esse gel, foi significativamente maior que o do grupo placebo
(IRAJI e YOOSEFI, 2006).
Aragona et al. (2006) relataram uma melhoria no epitélio conjuntival, após
tratamento com pilocarpina sistêmica, em pacientes com síndrome de Sjögren, doença
autoimune que acomete as glândulas salivares e lacrimais levando ao desenvolvimento
de xerostomia e olhos secos. E determinaram que o benefício obtido não foi dependente
da secreção glandular.
O uso de pilocarpina diminuiu a perda de peso corporal total, em ratos, ao final
de 48 horas pós hepatectomia parcial e reduziu o edema hepático durante sua
regeneração (KALIL et al., 1998).
2.6. Óleo de girassol
O girassol (Helianthus annuus L.) é uma das mais importantes oleaginosas
comestíveis cultivadas no mundo, junto à soja e ao amendoim. Essa espécie tem sua
origem na América Central, sendo conhecida desde o século 26 a.C. (WEISZ et al.,
2009; WANG et al., 2012).
Os óleos vegetais desempenham importantes papéis funcionais e sensoriais em
produtos alimentares, como, por exemplo, carreando vitaminas lipossolúveis (A, D, E e
K). O óleo de girassol é muito utilizado na alimentação e amplamente apreciado como
uma fonte de ácidos graxos, incluindo o ácido linoléico, que é considerado essencial.
Além disso, apresenta compostos fenólicos, como variados tipos de tocoferóis, em sua
composição (VALANTINA e NEELAMEGAM, 2012; WANG et al., 2012).
Revisão da Literatura
17
A vitamina E previne o câncer e doenças cardiovasculares, além de agir como
um antioxidante natural. O α-tocoferol, que é a forma mais ativa dessa vitamina, é
encontrado em uma considerável concentração no óleo de girassol, na faixa de 500 a
600 mg/ kg de óleo (WARNER e MOUNTS, 1990; BAKRE et al., 2014; THAKORE et
al., 2014).
Os compostos fenólicos presentes no óleo de girassol possuem elevada
capacidade sequestradora de radicais livres, exercendo ação antioxidante. Muitos
estudos têm descrito que antioxidantes fenólicos apresentam diversas atividades
biológicas, incluindo anti-inflamatória e preventiva de câncer e aterosclerose
(VALAVANIDIS et al., 2004; VALANTINA e NEELAMEGAM, 2012).
O ácido linoléico é o principal componente do óleo de girassol, representando
cerca de 48 a 74 % da composição. Esse ácido graxo tem sido descrito com atividades
biológicas como anti-inflamatória, desempenhando um papel positivo na cicatrização de
feridas (STUYVESANT e JOLLEY, 1967; BONFERONI et al., 2014; THAKORE et
al., 2014).
O valor medicinal do óleo de girassol pode ser aumentado pela conjugação com
nanopartículas. O emprego desse óleo em formulações tópicas, devido à sua origem
vegetal, contribui para o desenvolvimento de produtos seguros e compatíveis com a pele
(MORAIS, 2008; THAKORE et al., 2014).
2.7. Nanoemulsões
Emulsões são sistemas metaestáveis que consistem de dois líquidos imiscíveis,
em que um encontra-se disperso no outro, na forma de glóbulos. Um exemplo
primordial de emulsões é o leite excretado por mamíferos do sexo feminino. No leite,
pequenas gotículas de óleo encontram-se dispersas num meio líquido aquoso, servindo
como um carreador de substâncias nada ou pouco solúveis em água (WALSTRA, 2005;
CHOI et al., 2014; HÖHLER et al., 2014).
A instabilidade termodinâmica das emulsões faz com que necessitem de uma
terceira fase, a emulsionante. Os tensoativos presentes nessa fase são substâncias
caracterizadas pela presença de uma região polar e outra apolar em suas estruturas
moleculares. De acordo com suas características podem formar emulsões do tipo água
em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A). Possuem a capacidade de reduzir a tensão
Revisão da Literatura
18
interfacial, diminuindo a probabilidade de coalescência e melhorando a estabilidade
(CUNHA-JÚNIOR et al., 2003; HÖHLER et al., 2014).
Os agentes tensoativos costumam ser classificados de acordo com o equilíbrio
hidrofílico-lipofílico (EHL) das regiões de diferentes polaridades. Existe uma escala
adimensional para o EHL que varia de 0 a 20. No caso de tensoativos não-iônicos,
valores inferiores a 9 referem-se a agentes lipofílicos e valores superiores a 11 são
relativos a agentes hidrofílicos. Sendo que, geralmente, são formadas emulsões O/A na
faixa de EHL de 8 a 18. No entanto, a solubilidade dos tensoativos varia com a
temperatura, ocasionando um deslocamento no equilíbrio e nas características da
formulação originada (SCHRAMM et al., 2003).
As nanoemulsões são emulsões com tamanho de partícula reduzido,
apresentando diâmetro médio geralmente na faixa de 20 a 200 nm, podendo apresentar
granulometria de até 500 nm. São caracterizadas como sistemas cineticamente estáveis,
possuem baixa viscosidade e aspecto transparente ou translúcido (Figura 7)
(IZQUIERDO et al., 2004; KOMAIKO e MCCLEMENTS, 2014; ROCHA-FILHO
2014).
Figura 7: Aspecto translúcido de uma nanoemulsão em comparação com água
purificada
Fonte: ROCHA-FILHO 2014
Nanoemulsões são preparadas em concentrações moderadas de tensoativo (3 a
10 %) e não sofrem alterações no tamanho decorrentes de diluição. Essas características
podem ser utilizadas para diferenciá-las das microemulsões, que são
Revisão da Literatura
19
termodinamicamente estáveis e exigem uma elevada quantidade de tensoativos (acima
de 20 %) para serem formadas. (IZQUIERDO et al., 2002; MCCLEMENTS, 2012).
2.7.1. Estabilidade das nanoemulsões
Para serem aplicadas às mais diversas áreas, as emulsões precisam apresentar
um período pré-determinado de estabilidade físico-química. Os fenômenos de
instabilidade mais comuns, que podem comprometer a qualidade dessas formulações,
são coalescência, floculação, cremeação, maturação de Ostwald e inversão fases
(RAHN-CHIQUE et al., 2012; RAO e MCCLEMENTS, 2012).
Um dos fatores que mais influenciam na estabilidade de nanoemulsões é o
tamanho dos glóbulos. Quanto menores são os mesmos, mais estável é o sistema. O
tamanho reduzido protege as partículas da sedimentação ou coalescência por reduzir a
ação da força gravitacional sobre as mesmas, fazendo com que o movimento
Browniano, que essas realizam naturalmente, supere a gravidade (IZQUIERDO et al.,
2004; TADROS et al., 2004).
Os tensoativos e a fase oleosa também influenciam na estabilidade, por
interferirem no tamanho e na polidispersivdade dos glóbulos, devendo ser
adequadamente selecionados. De acordo com a literatura, o uso em conjunto de
tensoativos que apresentem liofilia diferente contribui para a obtenção de emulsões mais
estáveis. (SCHRAMM et al., 2003; MORAIS, 2008; ALMEIDA et al., 2009).
A estabilização das nanoemulsões, utilizando tensoativos não-iônicos, pode
ocorrer através de impedimento estérico, por repulsão eletrostática ou por um
mecanismo combinando esses dois métodos. O mecanismo eletrostático produz forças
repulsivas na superfície das partículas, impedindo que as mesmas colidam pela ação das
forças de van der Waals, que são atrativas (SANTOS et al., 2011; HONARY e ZAHIR,
2013).
O potencial zeta é mais uma característica das nanoemulsões que pode interferir
na estabilidade. É definido como a diferença de potencial entre a superfície de íons
fortemente ligados à superfície da partícula e uma região neutra da formulação. Quando
o valor desse potencial é elevado, acima de 30 mV em módulo, as forças de repulsão
são suficientes para superar as forças atrativas de van der Waals, impedindo que ocorra
floculação (MORAIS, 2008; MAHDI et al., 2011).
Revisão da Literatura
20
2.7.2. Emulsificação pelo método da temperatura de inversão de fases
Nanoemulsões podem ser obtidas pelo processo de inversão de fases. Durante
esse processo a fase contínua vai sendo acrescentada à fase dispersa sob agitação.
Ocorre inversão de um sistema O/A em A/O ou vice-versa. No ponto onde a inversão de
fases acontece, a tensão interfacial é mínima, envolvendo gasto energético ínfimo
(MORAIS et al., 2006; SAJJADI, 2006).
A inversão espontânea pode ocorrer mantendo-se a temperatura constante e
alterando a composição ou mantendo-se a composição constante e alterando a
temperatura, que é o método da temperatura de inversão de fases (método TIF) (PATEL
et al., 2011; ROCHA-FILHO 2014).
No método TIF os tensoativos não-iônicos etoxilados desidratam durante o
aquecimento, alterando a sua afinidade pelas fases aquosa e oleosa. No aquecimento
esses tensoativos tornam-se mais lipofílicos, originando emulsões A/O. Quando o
sistema é resfriado, os tensoativos alcançam a curvatura espontânea, onde a tensão
interfacial é mínima, ocorrendo a inversão de fase para O/A (GUMIERO e ROCHA-
FILHO, 2012; CARNEIRO, 2013).
Nesse método ocorre inversão transicional, onde uma igualdade na afinidade por
ambas as fases pode ser observado. Também é definido como método da temperatura de
equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL). Essa definição é recebida porque o ponto onde o
par de tensoativos atinge o EHL na superfície dos glóbulos é onde ocorre a mínima
tensão interfacial que proporciona a inversão (MAALI e MOSAVIAN, 2013;
ONTIVEROS et al., 2014).
2.7.3. Vantagens das nanoemulsões
A eficácia de medicações tópicas é muitas vezes limitada pela sua baixa
penetração na pele. Assim, como estratégia de aprimoramento, há uma preocupação em
desenvolver veículos que melhorem a permeação dos ativos (MOSER et al., 2001). As
nanoemulsões representam uma eficiente alternativa para essa necessidade. Devido ao
seu tamanho de partícula reduzido, essas formulações possuem elevada superfície de
contato, proporcionando maior penetração dos ativos e uma melhor aderência dos
mesmos. São eficientes para carrear substâncias ativas até mesmo através das
rugosidades da pele (TADROS et al., 2004; KONG et al., 2011).
Revisão da Literatura
21
Esses sistemas são uma excelente escolha para o encapsulamento e entrega de
fármacos, podendo carrear tanto substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas. A grande
área interfacial entre o óleo e a água pode melhorar a solubilidade dos ativos e, também,
modificar adsorção e biodisponibilidade (MCCLEMENTS, 2013; SANTANA et al.,
2013).
O pequeno tamanho dos glóbulos, associado às características conferidas pelos
componentes e o método de preparo, confere boa resistência à força gravitacional e é
capaz de prevenir fenômenos de instabilidade, como floculação e cremeação (TADROS
et al., 2004).
Nanoemulsões podem ser aplicadas em várias áreas, como nas indústrias
cosméticas, de alimentos e farmacêuticas. Muitos estudos têm avaliado os possíveis
usos desse tipo de formulação para a encapsulação de fármacos, assim como para
liberação controlada dos mesmos no organismo humano (TADROS, 1994;
KOROLEVA e YURTOV, 2012; CARNEIRO, 2013; SANTANA et al., 2013).
Sistemas nanoemulsionados, devido à sua baixa viscosidade e relativa
transparência, são agradáveis tanto esteticamente quanto sensorialmente. No caso das
nanoemulsões O/A, ainda apresentam a vantagem de não deixarem a pele pegajosa após
sua aplicação. Fatores que contribuem para uma boa aceitação de produtos
desenvolvidos com nanoemulsões (TADROS et al., 2004; ROCHA-FILHO 2014).
Objetivos
Objetivos
23
3. OBJETIVO GERAL
Desenvolver e avaliar nanoemulsões com extrato etanólico bruto das folhas de
Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina para o uso potencial como
radioprotetor tópico.
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter extrato etanólico bruto (EEB) das folhas da espécie Melaleuca
leucadendron e determinar as principais classes de metabólitos secundários
presentes no mesmo.
Quantificar compostos fenólicos presentes no extrato obtido.
Avaliar a capacidade antioxidante in vitro do EEB das folhas de Melaleuca
leucadendron, do cloridrato de pilocarpina e do óleo de girassol, por DPPH e
ABTS.
Desenvolver nanoemulsões utilizando óleo de girassol e incorporar o extrato de
Melaleuca leucadendron e o cloridrato de pilocarpina nas mesmas.
Caracterizar e estudar a estabilidade das nanoemulsões obtidas.
Determinar a citotoxicidade das nanoemulsões in vitro pelo método de MTT.
Avaliar a capacidade antioxidante das nanoemulsões in vitro por DPPH.
Material e Métodos
Material e Métodos
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Materiais
4.1.1. Material Botânico
As folhas de Melaleuca leucadendron foram coletadas no campus da
Universidade Federal de Ouro Preto, situada no município de Ouro Preto, Minas Gerais,
no ano de 2012.
Foram retirados fragmentos de caules, de partes infectadas por fungos (manchas
pretas e/ou brancas) e de outros materiais considerados como sujidades e em sequência
as folhas foram secas em estufa com circulação de ar a 40 ºC, pulverizadas em moinho
de facas e pesadas.
4.1.2. Material para o desenvolvimento das nanoemulsões
Para o desenvolvimento das nanoemulsões foram utilizados:
Óleo de girassol (Liza) – óleo de grau alimentício;
Span 80® (Croda) – monooleato de sorbitano (Figura 8), tensoativo com EHL de
4,3; denominado pelo CTFA como Sorbitan oleate (C24H44O6);
Figura 8: Estrutura molecular do monooleato de sorbitano
Fonte: www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s6760
Crill 3®
(Croda do Brasil) – monoestearato de sorbitano (Figura 9), tensoativo
com EHL de 4,7; denominado pelo CTFA Sorbitan stearate (C24H46O6);
Material e Métodos
26
Figura 9: Estrutura molecular do monoestearato de sorbitano
Fonte: www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/w302805
Croduret 50 Special®
(Croda) – óleo de rícino hidrogenado e etoxilado,
tensoativo com EHL de 14,1; denominado pelo CTFA como PEG-40
Hydrogenated Castor Oil.
Cloridrato de pilocarpina (All Chemistry, lote ALL 50206) – princípio ativo;
EEB das folhas de Melaleuca leucadendron – princípio ativo;
Água destilada recém obtida.
4.2. Obtenção do extrato
Em erlenmeyer de 5000 mL, 600 g de folhas de Melaleuca leucadendron secas
fragmentadas (Figura 10A) foram maceradas com 3000 mL de álcool etílico padrão
analítico (P.A). Essa maceração foi realizada por um período de seis dias.
Figura 10: Etapas do processo de obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de
Melaleuca leucadendron. A – Folhas secas pulverizadas. B – Solvente sendo eliminado
do extrato em evaporador rotativo.
Material e Métodos
27
Inicialmente as folhas foram umedecidas com o etanol e esse solvente foi
acrescentado até totalizar 1000 mL. Após 48 horas foi realizada filtração do sistema.
Esse processo foi repetido por mais duas vezes, totalizando os 3000 mL de etanol
utilizados na extração. O filtrado obtido foi concentrado, por eliminação do solvente,
utilizando evaporador rotatório, sob pressão reduzida e mantendo-se a temperatura de
aquecimento entre 40 e 50 ºC (Figura 10B).
Para uma completa eliminação do solvente, após a concentração em evaporador
rotatório, o extrato foi mantido em estufa à 40 ±5 ºC por 5 dias.
4.3. Prospecção Fitoquímica
Para realizar a triagem de metabólitos secundários, o EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron foi ressuspendido em metanol/água (9:1) e submetido à
partição com clorofórmio. Os solventes das frações obtidas foram eliminados em
evaporador rotativo, sob pressão reduzida e aquecimento entre 40 e 50 ºC.
Foi realizada prospecção fitoquímica por cromatografia em camada delgada
(CCD). Na fração hidroalcoólica, rica em compostos mais polares, foi investigada a
presença de compostos fenólicos, triterpenos, taninos, flavonóides, antranóides,
cumarinas, saponinas e alcalóides. Na fração clorofórmica, rica em compostos apolares,
foi avaliada a presença de esteróides.
Para realização de CCD foram utilizadas placas cromatográficas contendo uma
fina camada de sílica gel 60 GF254 (Vetec®, Brasil). Esse material foi preparado
depositando sílica gel/ água (1:2) sobre placas de vidro (10 x 10 cm) e armazenando
essas placas em estufa (100 a 150 ºC) por no mínimo uma hora.
Utilizando tubos capilares, foram adicionadas alíquotas das frações a 1 cm da
base das placas. Quando utilizados padrões, alíquotas dos mesmos foram adicionadas 3
cm à direita das amostras. Em sequência, foram realizadas eluição e revelação das
cromatoplacas.
As fases móveis, os padrões e os reveladores utilizados nas cromatografias
foram específicos para cada classe de metabólitos, conforme metodologias descritas por
Wagner e Bladt (2001).
Material e Métodos
28
Também foram realizados, com a fração hidroalcoólica, ensaios de coloração ou
precipitação, de acordo com o descrito por Matos (1997). Esses testes foram executados
como complemento para a triagem de taninos, flavonóides e alcalóides.
4.3.1. Compostos fenólicos
Foi realizada CCD, utilizando acetato de etila/clorofórmio/água (88:6:6) como
fase móvel. As placas foram reveladas com cloreto férrico (FeCl3) a 2%, avaliando a
presença de compostos fenólicos através dessa reação. O teste foi considerado positivo
quando observadas manchas negro-azuladas (WAGNER e BLADT, 1996).
4.3.2. Triterpenos e esteróides
A reação de Liebermann-Burchard por CCD foi utilizada para investigar a
presença dessas classes. A fase móvel foi tolueno/acetato de etila (93:7). Triterpenos
foram investigados na fração hidroalcoólica e esteróides na fração clorofórmica. A
observação de manchas escuras no visível ou de fluorescência no ultravioleta em 365nm
(UV365nm) foi considerada como resultado positivo.
4.3.3. Taninos
Utilizando clorofórmio/ácido acético glacial/água (50:45:5) como fase móvel,
foi realizada CCD. Taninos foram considerados presentes quando observadas manchas
negro-azuladas ou negro-esverdeadas após revelação com cloreto férrico (FeCl3) a 2%.
Também foi realizado ensaio de precipitação. A uma alíquota da fração
hidroalcoólica do extrato foi adicionado NaCl a 2% e gelatina a 1%. O surgimento de
precipitado foi considerado indicativo da presença de taninos.
4.3.4. Flavonóides
A CCD foi realizada utilizando clorofórmio/acetato de etila (60:40) como
eluente. Para averiguação de flavonóides foi utilizado Reagente de Produtos Naturais
(solução do éster β-aminoetílico do ácido bórico a 1% em metanol) como revelador das
Material e Métodos
29
cromatoplacas. A ocorrência de fluorescências amarelas e verdes foi caracterizada como
indicativo desses metabólitos.
A presença de flavonóides também foi avaliada pela reação de Shinoda. Uma
amostra da fração hidroalcoólica foi acidificada e acrescida de um pequeno fragmento
de magnésio granulado. Foi considerado positivo o desenvolvimento de coloração
avermelhada.
4.3.5. Antranóides e cumarinas
Foi realizada CCD utilizando tolueno/éter (1:1) saturado com ácido acético
glacial a 10% como fase móvel para análise de cumarinas. Para avaliar a presença de
antranóides a fase móvel utilizada foi acetato de etila/metanol/água (100:13,5:10).
O hidróxido de potássio metanólico foi o reagente de detecção. A reação foi
considerada positiva nas seguintes situações: sob a luz visível, antraquinonas
desenvolvem coloração vermelha; sob a luz UV365nm, antronas desenvolvem coloração
amarela e cumarinas ficam azuis.
4.3.6. Saponinas
Na determinação de saponinas foi utilizado clorofórmio/metanol/água (70:30:4)
como fase móvel e reagente anisaldeído/ácido sulfúrico como revelador das
cromatoplacas. A placa foi aspergida e aquecida a 105 ºC por 10 minutos. O surgimento
de manchas azuis ou azul-violeta indica a presença dessa classe de metabólitos.
4.3.7. Alcalóides
A fase móvel utilizada na CCD foi acetato de etila/metanol/água (100:13,5:10).
Para analisar a presença de alcalóides foi observado o aparecimento de manchas
marrons ou alaranjadas em cromatoplaca revelada com reagente de Dragendorff.
4.4. Determinação do teor de fenóis totais
Para avaliação do total de fenóis no extrato etanólico bruto foi utilizado o
reagente de Folin-Ciocalteu. Esse reagente consiste de uma mistura dos ácidos
Material e Métodos
30
fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se
num estado de oxidação que em presença de certos agentes redutores, como os
compostos fenólicos, originam os chamados molibdênio azul e tungstênio azul, cuja
coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras.
A determinação foi realizada de acordo com o descrito por Michel et al. (2011),
utilizando uma solução do extrato em metanol na concentração de 3 mg/mL e uma
curva de ácido gálico nas concentrações de 10 a 250 µg/mL. Em tubos de ensaio foram
misturados 100 µL de reagente de Folin-Ciocalteu e 20 µL da solução do extrato ou 20
µL das concentrações 10, 50, 75, 100, 150, 200 e 250 µg/mL de ácido gálico ou 20 µL
de água destilada, definida como branco. Após 1 minuto de agitação, foram
acrescentados a cada tubo 300 µL de solução aquosa de carbonato de sódio a 20%. Um
volume final de 2 mL foi completado com água destilada e a mistura foi incubada à
temperatura ambiente por 2 horas.
O experimento foi desenvolvido em triplicata e a leitura das absorbâncias foi
realizada a 760 nm em Espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-vis) Helios α
Thermo Electron Corporation. Foi elaborada uma curva de calibração com as
absorbâncias médias das concentrações do padrão ácido gálico. O teor de fenóis totais
foi determinado pela interpolação da média das absorbâncias da amostra através da
equação linear originada da curva e foi expresso em mg equivalentes de ácido gálico
(EAG) por grama de extrato.
4.5. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro
A determinação da capacidade antioxidante do EEB das folhas de Melaleuca
leucadendron, do cloridrato de pilocarpina e do óleo de girassol foi realizada por dois
métodos de redução de radicais livres.
4.5.1. Método de redução do radical DPPH
A capacidade das amostras reduzirem o radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH) foi avaliada através do decréscimo de sua absorbância a 517 nm, de acordo
com o descrito por Quintão et al. (2013). Para o EEB foram utilizadas soluções
etanólicas nas concentrações 1, 5, 10, 25 e 50 µg/ mL. Para o cloridrato de pilocarpina
Material e Métodos
31
soluções etanólicas nas concentrações 0,5; 1; 2,5 e 5 mg/mL e para o óleo de girassol
soluções em acetona nas concentrações 2,5; 5; 7,5 e 10 mg/ mL.
Em tubos com 2,5 mL das variadas concentrações das amostras ou com 2,5 mL
de etanol puro, utilizado como controle negativo, foram acrescentados 1 mL de solução
etanólica de DPPH (Sigma-Aldrich) 0,004% m/v. Para o branco, à 2,5 mL das
diferentes concentrações, foram acrescentados 1 mL de etanol puro. Após 30 e 60
minutos, de incubação à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, foi efetuada a leitura
das absorbâncias a 517 nm em Espectrofotômetro UV-vis Helios α Thermo Electron
Corporation.
As absorbâncias das amostras, após descontar o respectivo branco, foram
utilizadas para calcular o percentual de inibição do radical livre DPPH (%IDPPH), com
base na seguinte fórmula:
% IDPPH = [(CN-AM)/CN] x 100, onde:
IDPPH = inibição do DPPH;
CN = absorbância do controle negativo e
AM = absorbância da amostra descontada a absorbância do branco.
O experimento foi realizado em triplicata e com os valores médios foi elaborada
uma curva de inibição para o EEB, uma para o cloridrato de pilocarpina e uma para o
óleo. Com base nas equações lineares obtidas para cada curva foi calculada a
concentração das amostras que provocou 50% de inibição do DPPH (CE50), sendo os
valores expressos como média ± desvio padrão.
4.5.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado
O radical catiônico ABTS foi produzido de acordo com o descrito por Re et al.
(1999), para isso uma solução aquosa a 7 mM do ABTS (Sigma-Aldrich) com 2,75 mM
de persulfato de potássio foi preparada. Essa solução foi deixada em repouso ao abrigo
da luz e à temperatura ambiente por 16 horas.
Após esse tempo, a solução foi utilizada para determinação da atividade
antioxidante segundo o método proposto por Durmaz (2012), utilizando α-tocoferol
como padrão. A solução com o radical foi completamente congelada a -80 ºC e
liofilizada em equipamento Liobras®
L101, totalizando um tempo de 6 horas. O pó
obtido foi utilizado nas análises.
Material e Métodos
32
As amostras testadas foram uma solução de óleo de girassol diluído 10 vezes,
uma solução do EEB a 150 µg/ mL e uma solução de cloridrato de pilocarpina a 5 mg/
mL. Todas preparadas em metanol/clorofórmio (1:1 v/v). Nessa mesma mistura de
solventes foram produzidas soluções de α-tocoferol nas concentrações de 2,5; 5; 10; 25;
50; 100; 200; 300; 400 e 500 µg/ mL.
O ABTS liofilizado foi dissolvido em metanol/clorofórmio (1:1 v/v) para formar
uma solução com absorbância de 0,700±0,030 no comprimento de onda de 752 nm. A
2,9 mL dessa solução foram acrescentados 100 µL das amostras ou 100 µL de cada
concentração de α-tocoferol. Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente e
ao abrigo da luz, foi realizada a leitura das absorbâncias, em triplicata, a 752 nm em
Espectrofotômetro UV-vis Helios α Thermo Electron Corporation.
Foi construída uma curva de calibração com as absorbâncias médias das
concentrações do α-tocoferol. A capacidade antioxidante foi determinada pela
interpolação da média das absorbâncias das amostras na equação linear originada da
curva e foi expressa em mg equivalentes de α-tocoferol (EAT) por g de EEB ou de
cloridrato de pilocarpina ou por kg de óleo de girassol.
4.6. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A
4.6.1. Emulsificação por inversão de fases
As nanoemulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases, conforme
descrito por Morais et al. (2006), com algumas modificações. A fase oleosa foi
constituída do óleo de girassol em combinação com os tensoativos. Essa fase e a fase
aquosa foram aquecidas separadamente à temperatura de 75 ±2 ºC, sendo então a fase
aquosa vertida lentamente sobre a oleosa sob agitação constante a 600 rpm (agitador
mecânico Fisatom®
Mod.713). A agitação foi mantida até que as emulsões obtidas
adquirissem a temperatura ambiente (25 ±2 ºC).
4.6.2. Determinação da composição das nanoemulsões
Formulações com 10 e 20 % de fase oleosa foram testadas para encontrar as
combinações em que são formadas nanoemulsões. Na tabela 1 podem ser observadas
essas duas composições de forma mais detalhada.
Material e Métodos
33
Tabela 1: Composições testadas para a obtenção das nanoemulsões
Componente Composição A Composição B
Óleo de girassol (FO) 5 % 10 %
Sistema Tensoativo (FO) 5 % 10 %
Água (FA) 90 % 80 %
Legenda: FO = fase oleosa; FA = fase aquosa
4.6.3. Determinação do sistema tensoativo
Foram desenvolvidas 36 emulsões com a intenção de avaliar dois sistemas
tensoativos: o sistema Span 80/ Croduret 50 Special (SP/CRO) – formulações SC1 a
SC18 e o sistema Crill 3/ Croduret 50 Special (CRI/CRO) – formulações CC1 a CC 18
(Tabela 2). Essas emulsões foram obtidas combinando diferentes proporções dos
tensoativos nos 5 ou 10% destinados ao sistema tensoativo nas composições descritas
no item 4.7.2.; composição A: de SC1 a SC9 e CC1 a CC9 e composição B: de SC10 a
SC18 e CC10 a CC18.
Tabela 2: Composição, denominação e proporção do sistema tensoativo empregado para
cada uma das formulações desenvolvidas
Composição Formulação
Proporção de
tensoativos (%)
SP/CRO
Formulação
Proporção de
tensoativos (%)
CRI/CRO
Composição A
(total de 5 % de
sistema
tensoativo)
SC1 10/90 CC1 10/90
SC2 20/80 CC2 20/80
SC3 30/70 CC3 30/70
SC4 40/60 CC4 40/60
SC5 50/50 CC5 50/50
SC6 60/40 CC6 60/40
SC7 70/30 CC7 70/30
SC8 80/20 CC8 80/20
SC9 90/10 CC9 90/10
Composição B
(total de 10 %
de sistema
tensoativo)
SC10 10/90 CC10 10/90
SC11 20/80 CC11 20/80
SC12 30/70 CC12 30/70
SC13 40/60 CC13 40/60
SC14 50/50 CC14 50/50
SC15 60/40 CC15 60/40
SC16 70/30 CC16 70/30
SC17 80/20 CC17 80/20
SC18 90/10 CC18 90/10
Legenda: SP/CRO = Span 80/Croduret 50 Special; CRI/CRO = Crill 3/Croduret 50
Special
Material e Métodos
34
4.7. Avaliação macroscópica das formulações
As 36 formulações foram avaliadas macroscopicamente logo após sua
manipulação e 24 horas depois. Foram analisadas as características organolépticas,
homogeneidade, cremeação e floculação das emulsões.
4.8. Avaliação microscópica das formulações
Após 24 h da manipulação, foram colocadas uma gota de cada emulsão em uma
lâmina de vidro, cobrindo com uma lamínula. As lâminas foram analisadas em
microscópio óptico Zeiss – Axio Scope A1 e as fotos obtidas com câmera AxioCam
ICc3. Para determinar áreas de anisotropia, indicando a presença de estruturas
birrefringentes como os cristais líquidos, foram realizadas análises sob luz polarizada.
As nanoemulsões apresentam glóbulos menores que 1µm, não sendo passíveis
de visualização ao microscópio. Portanto, as formulações consideradas estáveis
macroscopicamente em que nenhuma estrutura foi observada, foram selecionadas como
possíveis nanoemulsões e submetidas a análises de distribuição granulométrica e testes
preliminares de estabilidade.
4.9. Determinação da distribuição granulométrica
As formulações foram analisadas quanto à distribuição granulométrica por
espectroscopia de correlação de fótons (do inglês: PCS – Photon Correlation
Spectroscopy). Essa técnica tem como base a incisão de um feixe de laser sobre a
amostra para avaliar o espalhamento da luz decorrente do movimento Browniano
realizado pelas partículas (Figura 11). A intensidade da luz espalhada forma um padrão
de movimento que permite definir o diâmetro médio dessas partículas, sendo que as
menores movimentam-se mais rapidamente, promovendo maiores modificações nessa
intensidade (PEDERSEN e KRISTENSEN, 1981; YAJING et al., 2014).
Material e Métodos
35
Figura 11: Representação esquemática da determinação da distribuição granulométrica
pela técnica de espectroscopia de correlação de fótons (PCS)
Fonte: YAJING et al., 2014
As amostras foram inicialmente diluídas à temperatura ambiente em água
ultrapura (Milli-Q®) na proporção de 1:1000, sendo então transferidos 3 mL para uma
cubeta de quartzo para realização das análises em Nanosizer N5 Plus (Beckmann
Coulter – EUA). Nesse equipamento, as amostras foram submetidas a espalhamento de
luz com um ângulo fixo de 90˚, à temperatura de 25˚C, sendo as medições realizadas em
triplicatas (MEZADRI, 2010).
Os resultados foram fornecidos como diâmetro médio das partículas ± desvio
padrão e índice de polidispersão (IP), que representa a faixa de distribuição das mesmas.
Amostras com IP inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas, conforme instruções
do fabricante do equipamento – Beckmann Coulter.
4.10. Testes preliminares de estabilidade
As formulações que após 24 horas de seu preparo foram consideradas
macroscopicamente estáveis e que após análise microscópica e de distribuição
granulométrica foram confirmadas como nanoemulsões, foram submetidas aos testes de
estresse térmico e centrifugação. Para isso, amostras dessas nanoemulsões, armazenadas
desde a manipulação em frascos vedados, limpos, mas não estéreis, foram utilizadas.
Material e Métodos
36
4.10.1. Estresse térmico
Alíquotas de cada nanoemulsão, em triplicatas, foram submetidas a aquecimento
em banho-maria (Quimis® Q334M-28) na faixa de temperatura de 40 a 80 ±2 ºC, com
um aumento gradativo de 5 ºC a cada 30 minutos (OLIVEIRA et al., 2011).
A cada aumento de temperatura as nanoformulações foram analisadas
macroscopicamente quanto à homogeneidade e a ocorrência de separação de fases. Ao
final do teste, para avaliar variações no diâmetro das partículas, foi analisada a
dispersão granulométrica das mesmas conforme descrito no item 4.9.
4.10.2. Centrifugação
Amostras de cada nanoemulsão foram adicionadas a tubos de ensaio cônicos
graduados para centrífuga e submetidas à centrifugação no equipamento Centrifuge
eppendorf 5415 D, sob ciclos de 15 minutos de duração a 1000, 2500 e 3500 rpm (70,
440 e 863 G, respectivamente) (OLIVEIRA et al., 2011).
O experimento foi realizado em triplicata e a cada ciclo de centrifugação as
nanoemulsões foram analisadas macroscopicamente quanto à homogeneidade e a
ocorrência de separação de fases. Ao final do teste, para avaliar variações no diâmetro
das partículas, foi analisada a dispersão granulométrica das mesmas conforme descrito
no item 4.9.
4.11. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões
A nanoemulsão considerada mais estável através dos testes preliminares de
estabilidade foi selecionada para ser adicionada de EEB das folhas de Melaleuca
leucadendron ou de pilocarpina ou da combinação de ambos ativos.
4.11.1. Adição do EEB
Foram testados três métodos para incorporar o EEB à nanoemulsão. No método
1, o extrato foi adicionado diretamente à fase oleosa. Nos métodos 2 e 3, inicialmente o
extrato foi acrescentado ao tensoativo hidrofílico – Croduret 50 Special, sendo a mistura
sonicada em Ultrassom Unique® – Ultra Cleaner 1600, por 2 e 4 horas respectivamente
Material e Métodos
37
e, então, acrescido do restante da fase oleosa. Em sequência, em todos os métodos, a
manipulação da nanoemulsão foi realizada conforme descrito no item 4.6.1.
Foram preparadas nanoemulsões contendo 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 e 1% de
EEB. A nanoemulsão em que foi observada macroscopicamente uma melhor
incorporação do extrato foi selecionada.
4.11.2. Adição do cloridrato de pilocarpina
A manipulação da nanoemulsão foi realizada conforme relatado no item 4.6.1. e
quando a mesma se encontrava à 45 ±2 ºC, foi acrescentado o cloridrato de pilocarpina.
A agitação foi mantida até a temperatura ambiente ser alcançada. Foram preparadas
nanoemulsões contendo 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 e 1% de pilocarpina.
No caso da nanoemulsão que combinou o EEB e o cloridrato de pilocarpina, a
incorporação foi realizada da mesma maneira, no período de resfriamento (45 ±2 ºC),
sob agitação. A pilocarpina foi adicionada à nanoemulsão cujo método de incorporação
do EEB (item 4.11.1) foi considerado mais eficaz. Foram preparadas nanoemulsões
contendo EEB/ pilocarpina, respectivamente, nas combinações 0,01/0,01; 0,02/0,01;
0,02/0,02 e 0,05/0,05 %.
4.12. Caracterização físico-química das nanoemulsões
Foram submetidas aos ensaios de caracterização:
NB: nanoemulsão selecionada como base (sem ativo);
NE: nanoemulsão com 0,1% de EEB das folhas de Melaleuca leucadendron;
NP: nanoemulsão com 0,1% de cloridrato de pilocarpina e
NEP: nanoemulsão com 0,05% de EEB e 0,05% de cloridrato de pilocarpina.
4.12.1. Avaliação macroscópica
Após 24 horas de seu preparo, as nanoemulsões foram avaliadas
macroscopicamente conforme descrito no item 4.7.
Material e Métodos
38
4.12.2. Avaliação microscópica
As nanoemulsões foram avaliadas microscopicamente conforme descrito no item
4.8., 24 horas após seu preparo.
4.12.3. Determinação da distribuição granulométrica
O diâmetro médio ± desvio padrão das partículas e o índice de polidispersão de
cada uma das quatro nanoemulsões foram avaliados através da técnica de
espectroscopia de correlação de fótons, realizada conforme descrito no item 4.9.
4.12.4. Determinação do pH
O pH das nanoemulsões foi determinado inserindo o eletrodo diretamente nas
amostras (pHmetro Lutron® modelo PH-221 – devidamente calibrado). As análises
foram realizadas em triplicatas, 1, 7 e 30 dias após o preparo das formulações.
4.12.5. Determinação da temperatura de inversão de fases
O teste foi realizado utilizando um condutivímetro CD 820 - Instrutherm,
ajustado com solução de KCl 0,1N. A temperatura de inversão de fases (TIF) foi
determinada através da variação nos valores de condutividade elétrica em função da
temperatura. As amostras foram aquecidas em banho-maria, com um aumento
monitorado de temperatura, na faixa de 25 a 85 ºC.
A condutividade foi avaliada inserindo o eletrodo diretamente em cada uma das
nanoemulsões. A temperatura em que ocorreu a inversão foi estabelecida como a média
da temperatura entre o maior e o menor valor alcançado pela condutividade e expressa
em µS.cm-1
(IZQUIERDO et al., 2005).
4.12.6. Determinação do potencial zeta
A determinação do potencial zeta foi realizada em equipamento Zetasizer®
Nano
ZS (Malvern, EUA), através da técnica do espalhamento de luz eletroforético para
partículas. Nessa técnica a amostra foi injetada em uma célula contendo dois eletrodos e
Material e Métodos
39
um campo elétrico foi aplicado aos mesmos. As partículas com potencial zeta migraram
em direção ao eletrodo de carga oposta com uma velocidade que está relacionada à
magnitude do potencial. Essa mobilidade foi medida via M3-PALS (FELIX et al., 2013;
HONARY e ZAHIR, 2013b).
As amostras foram diluídas na proporção de 1:20 em água destilada e aplicadas
na célula capilar semi-descartável com o auxílio de uma seringa hipodérmica. As
medidas de potencial zeta foram realizadas à temperatura ambiente (25 ±2 ºC) e em
triplicata para cada nanoemulsão. Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão.
4.13. Testes de estabilidade
Foram avaliadas amostras das nanoemulsões relatadas no item 4.12.,
armazenadas em frascos vedados desde a sua manipulação. Essas amostras foram
submetidas à análise macroscópica, para verificação da homogeneidade e aos testes de
estresse térmico e centrifugação, descritos, respectivamente, nos itens 4.10.1. e 4.10.2.
A avaliação da estabilidade foi realizada 1, 7, 15, 30 e 60 dias após o preparo das
nanoemulsões.
4.14. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT
O método MTT avaliou a viabilidade celular em presença das amostras. Para
isso, foi verificada a capacidade de células vivas, através de sua atividade metabólica,
reduzirem o brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT, Sigma-
Aldrich) em cristais insolúveis de formazana. Esses cristais apresentam coloração
violeta, com absorbância a 570 nm (TEO et al., 2013; PRANCZK et al., 2014).
Quanto menos citotóxico o composto testado, maior a viabilidade celular no
meio e consequentemente a intensidade da coloração roxa (TEO et al., 2013;
PRANCZK et al., 2014).
Foi avaliada a citotoxicidade das nanoemulsões frente a macrófagos murinos da
linhagem J774. Os macrófagos foram descongelados e cultivados em monocamadas em
garrafas de cultura contendo meio DEMEM, suplementado com 10% de soro fetal
bovino, 2mM de L-glutamina, 100 IU/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina.
Material e Métodos
40
O cultivo foi realizado a 37 ºC, em atmosfera de 5 % de CO2 (MONTES-FONSECA et
al., 2012).
Para realização do experimento, a metodologia descrita por Caldeira (2011) foi
realizada, sendo os procedimentos desenvolvidos em capela de fluxo laminar,
protegendo de contaminação. As células foram desprendidas da superfície da garrafa,
centrifugadas a 1100 rpm (210 G), por 10 minutos a 5 ºC e ressuspendidas em meio de
cultura (DEMEM suplementado). Foram diluídos 20 µL da suspensão em 20 µL de
Azul de Tripan, sendo metade dessa mistura transferida para uma Câmara de Neubauer
e realizada contagem das células. Em seguida, os macrófagos foram colocados em
microplacas de 96 poços, numa densidade de 5 x 104 células por poço, presentes em 90
µL de meio.
As amostras foram filtradas em filtros de 0,45 µm e acondicionadas em frascos
estéreis. Foram adicionados aos poços 10 µL de NB ou 10 µL das diferentes diluições
das formulações com EEB e/ou pilocarpina. Como controle, foram utilizados poços
contendo células não submetidas a tratamento (na mesma densidade dos poços com
amostras) e como branco, poços com apenas meio de cultura.
As nanoemulsões com EEB e as nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
foram testadas nas concentrações 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 e 1 %. As nanoemulsões
com ambos ativos foram testadas nas combinações 0,01/0,01; 0,02/0,01; 0,02/0,02 e
0,05/0,05 % de EEB/ pilocarpina, respectivamente. Na Tabela 3 foram relatadas as
concentrações de ativo por mL em cada amostra avaliada.
Após as formulações serem adicionadas, as microplacas foram incubadas em
estufa a 37 ºC, em atmosfera de 5 % de CO2 por 24 horas. Na sequência, o meio de
cultura foi retirado dos poços, sendo adicionados 100 µL de solução de MTT a 0,5
mg/mL em PBS . As placas foram novamente incubadas por mais quatro horas (37 ºC; 5
% de CO2) para reação e então, para solubilizar os cristais de formazana gerados, foram
adicionados 100 µL de solução de laurilsulfato de sódio a 10 % p/v em HCl 0,1M.
Após 16 horas em estufa (37 ºC; 5 % de CO2), foi realizada leitura das placas em
leitor de ELISA (Anthos 2010), a 570 nm. As absorbâncias das amostras, após
descontar a absorbância do branco, foram utilizadas para calcular a viabilidade celular
(VC), com base na seguinte fórmula:
%VC= [(AC- AA)/AC] x 100, onde:
%VC = percentual de viabilidade celular
AC = absorbância do controle (macrófagos não tratados)
Material e Métodos
41
AA = absorbância da amostra descontada do branco.
Tabela 3: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões avaliadas
quanto à citotoxicidade pelo método MTT
Amostra Ativo
(% na nanoemulsão)
Concentração
avaliada
Nanoemulsões com EEB
E1 EEB (0,01) 100 µg/ mL
E2 EEB (0,02) 200 µg/ mL
E3 EEB (0,05) 500 µg/ mL
E4 EEB (0,1) 1 mg/ mL
E5 EEB (0,2) 2 mg/ mL
E6 EEB (0,5) 5 mg/ mL
E7 EEB (1,0) 10 mg/ mL
Nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
P1 Pilocarpina (0,01) 100 µg/ mL
P2 Pilocarpina (0,02) 200 µg/ mL
P3 Pilocarpina (0,05) 500 µg/ mL
P4 Pilocarpina (0,1) 1 mg/ mL
P5 Pilocarpina (0,2) 2 mg/ mL
P6 Pilocarpina (0,5) 5 mg/ mL
P7 Pilocarpina (1,0) 10 mg/ mL
Nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina
EP1 EEB (0,01) + Pilocarpina (0,01) 100 µg/mL + 100 µg/mL
EP2 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,01) 200 µg/mL + 100 µg/mL
EP3 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,02) 200 µg/mL + 200 µg/mL
EP4 EEB (0,05) + Pilocarpina (0,05) 500 µg/mL + 500 µg/mL
Legenda: EEB = extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron
O experimento foi realizado em triplicata e com os valores médios foram
elaborados gráficos de viabilidade para as nanoemulsões avaliadas. Os dados foram
expressos como porcentagem de viabilidade celular média ± desvio padrão em relação
ao controle.
4.15. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões
As nanoemulsões foram submetidas ao método de redução do radical livre
DPPH para determinação do seu potencial antioxidante in vitro. Para isso, foi
desenvolvida a metodologia descrita por Quintão et al. (2013) com algumas
modificações.
As nanoemulsões com EEB e as nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
foram utilizadas nas concentrações 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 e 0,5%. As nanoemulsões
Material e Métodos
42
com ambos ativos foram testadas nas combinações 0,01/0,01; 0,02/0,01; 0,02/0,02 e
0,05/0,05 % de EEB/ pilocarpina, respectivamente. A NB foi utilizada para avaliar a
atividade do óleo de girassol.
Com a finalidade de conferir a transparência necessária para leitura das
absorbâncias, as amostras foram diluídas em etanol. Para isso, 150 µL de cada
nanoemulsão avaliada foram acrescentados a 2,35 mL desse solvente. As concentrações
resultantes, nos 2,5 mL totais, podem ser observadas na tabela 4.
Tabela 4: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões avaliadas
quanto à capacidade antioxidante pelo método DPPH
Amostra Ativo avaliado
(% na nanoemulsão)
Concentração final
(em 2,5 mL)
Nanoemulsão Base
NB Óleo de girassol (10) 6 mg/ mL
Nanoemulsões com EEB
E1 EEB (0,01) 6 µg/ mL
E2 EEB (0,02) 12 µg/ mL
E3 EEB (0,05) 30 µg/ mL
E4 EEB (0,1) 60 µg/ mL
E5 EEB (0,2) 120 µg/ mL
E6 EEB (0,5) 300 µg/ mL
Nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
P1 Pilocarpina (0,01) 6 µg/ mL
P2 Pilocarpina (0,02) 12 µg/ mL
P3 Pilocarpina (0,05) 30 µg/ mL
P4 Pilocarpina (0,1) 60 µg/ mL
P5 Pilocarpina (0,2) 120 µg/ mL
P6 Pilocarpina (0,5) 300 µg/ mL
Nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina
EP1 EEB (0,01) + Pilocarpina (0,01) 6 µg/ mL + 6 µg/ mL
EP2 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,01) 12 µg/ mL + 6 µg/ mL
EP3 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,02) 12 µg/ mL + 12 µg/ mL
EP4 EEB (0,05) + Pilocarpina (0,05) 30 µg/ mL + 30 µg/ mL
Legenda: EEB = extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron
Em tubos com 2,5 mL das variadas concentrações das amostras ou com 2,5 mL
de etanol puro, utilizado como controle negativo, foram acrescentados 1 mL de solução
etanólica de DPPH (Sigma-Aldrich) 0,004% m/v. Para o branco, à 2,5 mL das
diferentes concentrações, foram acrescentados 1 mL de etanol puro.
Após 30 e 60 minutos, de incubação à temperatura ambiente e ao abrigo da luz,
200 µL do conteúdo de cada tubo foi transferido para poços de placa de ELISA. Foi
efetuada a leitura das absorbâncias a 517 nm em Leitor de ELISA (Anthos 2010).
Material e Métodos
43
As absorbâncias das amostras, após descontar o respectivo branco, foram
utilizadas para calcular o percentual de inibição do radical livre DPPH (%IDPPH),
baseado na fórmula abaixo:
% IDPPH = [(CN-AM)/CN] x 100, onde:
IDPPH = inibição do DPPH;
CN = absorbância do controle negativo e
AM = absorbância da amostra descontada a absorbância do branco.
O experimento foi realizado em triplicata. Os resultados foram expressos como
média ± desvio padrão. Para as nanoemulsões com EEB e as com pilocarpina, foram
elaboradas curvas de inibição, utilizando os valores determinados para as diferentes
concentrações de ativo. Quando possível, foi obtida a equação linear para a curva e
calculada a concentração das amostras que provocou 50% de inibição do DPPH (CE50).
4.16. Análises estatísticas
Foram analisados estatisticamente:
a distribuição granulométrica das formulações;
a distribuição granulométrica após os testes de estabilidade, nos diferentes
tempos avaliados;
os valores de pH das formulações;
os valores de pH nos diferentes tempos avaliados;
os valores de potencial zeta das formulações e
as CE50 encontradas pelo método DPPH para os ativos livres e após
nanoemulsionados.
Os dados foram registrados como média ± desvio padrão e analisados pelo SPSS
(IBM SPSS Statistics versão 20). As análises foram realizadas utilizando ANOVA, com
pós-teste de Bonferroni. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente
significativo.
Com exceção das CE50, que tiveram suas médias avaliadas por Teste T de
Student. Também considerando um p < 0,05 como nível de significância.
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Obtenção do extrato
Foram obtidos 50,1g de EEB das folhas de Melaleuca leucadendron (Figura 12)
a partir das 600g de folhas secas pulverizadas. O rendimento do extrato, portanto, foi de
8,35%.
Figura 12: Extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron.
5.2. Prospecção fitoquímica
Os resultados obtidos através da prospecção fitoquímica do EEB das folhas
Melaleuca leucadendron podem ser observados na tabela 5.
Tabela 5: Triagem da presença dos principais metabólitos secundários no EEB das
folhas de Melaleuca leucadendron.
Metabólitos secundários Resultado
Compostos Fenólicos +
Triterpenos +
Esteróides +
Flavonóides +
Taninos +
Antranóides +
Cumarinas -
Saponinas +
Alcalóides -
Legenda: (+) Presente (-) Não detectado
Resultados e Discussão
46
Análises preliminares realizadas com extrato metanólico das folhas de
Melaleuca leucadendron, coletadas em Nilgiris (Índia), também indicaram a presença
de compostos fenólicos, triterpenos, esteróides, flavonóides, saponinas e taninos (SHAH
et al., 2013).
Compostos fenólicos de uma maneira geral, incluindo flavonóides e taninos, são
considerados potentes antioxidantes (CAO et al., 1997; SILVA et al., 2013; AMARAL
et al., 2014; SHAH et al., 2014). Além disto, metabólitos secundários como flavonóides,
compostos fenólicos, taninos, triterpenos e saponinas são frequentemente relacionados a
atividades anti-inflamatórias, antimicrobianas e cicatrizantes (FERRÁNDIZ e
ALCARAZ, 1991; LOPES et al., 2005; AMARAL et al., 2014; LAY et al., 2014).
Considerando os resultados da triagem fitoquímica, pode-se cogitar potencial do
EEB em apresentar atividades biológicas, dentre elas, antioxidante e capacidade
regeneradora tissular.
5.3. Determinação do teor de fenóis totais
Na Figura 13 está representada a curva de calibração obtida para o ácido gálico.
A absorbância média da solução 3 mg/mL do EEB foi 0,207 que, de acordo com a
equação linear (y= 0,0009x + 0,0034), foi equivalente a absorbância de 226,2 µg/mL de
ácido gálico. Portanto, o resultado obtido foi de 102,3 ±6,1 mg EAG/ g de EEB,
indicando que 10,23 % do extrato são de compostos fenólicos.
Figura 13: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o ácido-
gálico pelo método Folin-Ciocalteu para quantificação de compostos fenólicos (média ±
desvio padrão, n = 3)
y = 0.0009x + 0.0034
R² = 0.9936
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0 50 100 150 200 250 300
Ab
sorb
ân
cia
a 7
60
nm
Concentração de ácido gálico (µg/mL)
Resultados e Discussão
47
O EEB das folhas de Melaleuca leucadendron apresentou conteúdo de
compostos fenólicos muito elevado quando comparado a estudo realizado na Coréia do
Sul, em que o teor encontrado para o extrato metanólico dessa mesma espécie e suas
frações em butanol e clorofórmio foi, respectivamente, 0,29; 0,51 e 0,11 mg EAG/g de
extrato (SURH e YUN, 2012). Além de serem extrações com diferentes solventes, essa
variação na composição também pode estar relacionada a diferenças edafoclimáticas.
Variações de temperatura e localização geográfica são muito importantes na produção
de metabólitos secundários (SHOHAEL et al., 2006; CARALT et al., 2013; SHAH et
al., 2014).
Os compostos fenólicos estão presentes em uma grande variedade de plantas e
são capazes de neutralizar radicais livres através da doação de hidrogênio. Os
intermediários formados são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel
aromático na estrutura dessas substâncias, não propagando reação em cadeia (Figura 14)
(CAO et al., 1997; CHUN et al., 2005; SOUSA et al., 2007).
Figura 14: Reação de neutralização de radical livre por estrutura fenólica básica, através
da doação de hidrogênio, originando intermediário pouco reativo
Com isto, além de agirem como antioxidantes, esses compostos podem inibir o
óxido nítrico, um radical livre presente no organismo. Esse radical é um modulador da
inflamação e sua neutralização pode acelerar a cicatrização de feridas cutâneas
(PRIYADARSINI, 1997; NAKAJIMA et al., 2007; REBELO et al., 2014; TAIRA et
al., 2015).
A presença de compostos fenólicos tem sido constantemente relacionada com
potencial antioxidante e com outras atividades biológicas, como anti-inflamatória e
antiproliferativa (BASTIANETTO et al., 2000; SILVA et al., 2009; ABDEL-HAMEED
et al., 2014; LIU et al. 2014; LOU et al., 2014). De acordo com García-Lafuente et al.
Resultados e Discussão
48
(2014), que avaliaram extratos ricos em fenóis, um elevado teor desses compostos pode
ser associado a elevadas atividades antioxidante e anti-inflamatória.
5.4. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro
5.4.1. Avaliação da capacidade antioxidante do extrato
Foi encontrada atividade antioxidante para o EEB das folhas de Melaleuca
leucadendron em ambos os métodos avaliados.
5.4.1.1. Método de redução do radical DPPH
O EEB apresentou elevada capacidade sequestradora do radical DPPH e foi
observada estabilidade da inibição após 1 hora de reação. Numa concentração de apenas
25 µg/mL foi capaz de reduzir mais de 80 % desse radical (Figura 15).
Figura 15: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração do EEB
de Melaleuca leucadendron após 30 e 60 minutos de reação (média ± desvio padrão,
n=3).
A CE50, calculada através da equação linear da inibição após 30 minutos (y =
3,1987x – 4,3771), foi de 17,0 ±0,59 µg/mL. Esse potencial foi bem maior que o do
ácido ascórbico e da mesma ordem de grandeza do ácido gálico, eficazes antioxidantes
sintéticos, e ainda foi elevado quando comparado a outros extratos vegetais, como
y = 3.1987x - 4.3771
R² = 0.9904
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30
Inib
içã
o d
o D
PP
H (
%)
Concentração do extrato (µg/mL)
Inibição 30 minInibição 60 minLinear 30 min
Resultados e Discussão
49
representado na Tabela 6 (WU et al., 2009; SAHA et al., 2009; LAY et al., 2014; SHI et
al., 2014; YU et al., 2014).
Tabela 6: Comparação da capacidade redutora de DPPH do EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron, com alguns antioxidantes sintéticos e extratos vegetais
Amostra CE50 (µg/mL) Referência
EEB de Melaleuca leucadendron 17,0 Esse estudo
Ácido ascórbico 190,0 SHI et al., 2014
Ácido gálico 10,8 LAY et al., 2014
EM das agulhas de pinheiro de
Cedrus deodara
35,94 YU et al., 2014
EM das frutas de Phaleria
macrocarpa (Scheff.)
9120,0 LAY et al., 2014
EE das folhas de Cajanus cajan
(L.) Millsp.
242,01 WU et al., 2009
EM das folhas de Mimusops
elengi Linn
43,26 SAHA et al., 2009
Legenda: EM = extrato metanólico; EE = extrato etanólico
5.4.1.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado
Com a curva de calibração originada das variadas absorbâncias em função da
concentração do α-tocoferol (Figura 16) foi obtida a equação linear y = -0,0005x +
0,6671; utilizada para calcular a capacidade das amostras de reduzirem o radical ABTS.
Figura 16: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o α-
tocoferol pelo método de redução do radical ABTS liofilizado (média ± desvio padrão,
n = 3)
y = -0.0005x + 0.6671
R² = 0.991
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Ab
sorb
ân
cia
a 7
20
nm
Concentração de α-tocoferol (µg/mL)
Resultados e Discussão
50
A solução do EEB na concentração de 150 µg/mL apresentou uma absorbância
média de 0,552 que é equivalente a 230,2 µg/mL de α-tocoferol. Foi encontrada uma
capacidade de reduzir o ABTS de 1530 mg EAT/ g de extrato, ou seja, o EEB
apresentou uma atividade antioxidante 1,53 vezes maior que a do padrão α-tocoferol.
Esses valores são expressos, geralmente, como mg equivalentes de Trolox (TE),
um análogo sintético do α-tocoferol (BADARINATH et al., 2010; ROOKE et al.,
2012). Segundo Durmaz (2012) esse análogo possui capacidade antioxidante duas vezes
maior que a do α-tocoferol por esse método, podendo-se estimar que seriam necessários
cerca de 765 mg de Trolox para obter a mesma atividade de 1 g de extrato.
A boa atividade do EEB pode ser observada de maneira mais evidente
confrontando esses valores com os encontrados para outras espécies vegetais. Xu et al.
(2014) encontraram de 50 a 667,5 mg TE/g de diferentes extratos das flores de Tagetes
ereta L. Duymuş et al. (2014) avaliaram diferentes extratos de sabugueiro, encontrando
atividades que variaram de 222,5 a 492,5 mg TE/g de extrato e, de acordo com
Mihaylova et al. (2013), o extrato hidroalcoólico das folhas de Haberlea rhodopensis
Friv. apresenta elevada atividade de 192,25 mg TE/g.
A capacidade antioxidante expressa pelo extrato é decorrente de sua
composição, sendo condizente com os metabólitos secundários indicados pela
prospecção fitoquímica e com seu considerável teor de compostos fenólicos. Podendo
também, ser decorrente de sinergismo entre as classes de metabólitos presentes.
Lee (1998) isolou ésteres triterpenóides das folhas de Melaleuca leucadendron e
relatou que, substâncias com estrutura semelhante, geralmente apresentam capacidade
anti-inflamatória. Em outro estudo, realizado com extrato em acetona das folhas dessa
espécie, foram isolados novos flavonóides, pertencentes à classe das flavanonas e
denominados leucadenonas (LEE, 1999).
Yoshida et al. (1996) avaliaram extrato do fruto dessa espécie em acetona e
conseguiram isolar alguns triterpenos e, também, dez taninos hidrolisáveis, incluindo
um inédito.
Tsuruga et al. (1991) identificaram, no extrato metanólico dos frutos de M.
leucadendron, a presença de quercetina e ácido gálico, dois compostos com atividade
antioxidante conhecida. Identificaram, ainda, oxiresveratrol, um composto com elevada
capacidade sequestradora de radicais livres (LORENZ et al., 2003).
O oxiresveratrol é geralmente encontrado nas raízes, folhas, caule e frutos de
muitas espécies. Apresenta estrutura muito similar à do resveratrol, um composto da
Resultados e Discussão
51
mesma classe, que tem sido estudado como um possível radioprotetor (SEBASTIÀ et
al., 2011; JEONG et al., 2014; XU, L. et al., 2014).
Fundamentado nos resultados e nos dados da literatura, o EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron representa uma boa fonte de princípios ativos para as
nanoemulsões. Foi observada elevada capacidade de redução de radicais livres, que é
um dos mecanismos pelos quais os radioprotetores agem. Além disto, pode apresentar,
em sua composição, substâncias capazes de proteger os danos causados pela
radioterapia através de outras formas de ação (NAIR et al., 2001; GAUTER-
FLECKENSTEIN et al., 2014).
5.4.2. Avaliação da capacidade antioxidante do cloridrato de pilocarpina
Em nenhum dos dois métodos de redução de radicais livres foi observada
atividade antioxidante do cloridrato de pilocarpina. Nem mesmo utilizando
concentrações superiores às usualmente empregadas por via tópica, que de acordo com
Brown e Taylor (2011) são de 0,5 a 4 %. Pode-se inferir que caso esse princípio ativo
apresente capacidade radioprotetora, ela seja consequência de um mecanismo de ação
diferente, sendo necessária a avaliação de seu potencial por outros métodos.
5.4.3. Avaliação da capacidade antioxidante do óleo de girassol
O óleo de girassol apresentou atividade antioxidante pelos dois métodos
avaliados.
5.4.3.1. Método de redução do radical DPPH
Na figura 17 pode ser observada a inibição do radical DPPH pelo óleo de
girassol e boa estabilidade da reação após 1 hora. A CE50, calculada através da equação
linear da inibição após 30 minutos (y = 9,2843x – 9,3558), foi de 6,39 ±0,27 mg/mL.
Resultados e Discussão
52
Figura 17: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração do óleo
de girassol após 30 e 60 minutos de reação (média ± desvio padrão, n = 3)
Com essa CE50, o óleo de girassol não se apresenta um antioxidante tão potente
quanto alguns antioxidantes sintéticos como o BHT (CE50 = 0,58 mg/mL) e o α-
tocoferol (CE50 = 0,10 mg/mL) (ZHANG et al., 2006). Contudo, em comparação a
outros óleos vegetais e essenciais como relatado na Tabela 7, sua atividade pode ser
considerada satisfatória (ZHANG et al., 2006; SHAHSAVARI et al., 2008;
VALAVANIDIS et al., 2004; BAUER et al., 2013).
Tabela 7: Comparação da capacidade redutora de DPPH do óleo de girassol e alguns
outros óleos
Amostra CE50 (mg/mL) Referência
Óleo de girassol 6,39 ±0,27 Esse estudo
Óleo de milho 15,0 ±0,9 VALAVANIDIS et al., 2004
Óleo de oliva 17,5 ±1,2 VALAVANIDIS et al., 2004
Óleo de soja 10,0 ±0,5 VALAVANIDIS et al., 2004
Óleo de Licuri (Syagrus
coronata)
0,3336 BAUER et al., 2013
Óleo essencial de
Petroselinum crispum
80,21 ±3,41 ZHANG et al., 2006
Óleo essencial de Bunium
persicum
0,88 ±0,04 SHAHSAVARI et al., 2008
y = 9.2843x - 9.3558
R² = 0.982
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Inib
içã
o d
o D
PP
H (
%)
Concentração do óleo (mg/mL)
Inibição 30 minInibição 60 minLinear 30 min
Resultados e Discussão
53
5.4.3.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado
Utilizando a curva de calibração do α-tocoferol (Figura 16), foi obtida a equação
linear que permitiu calcular a concentração deste com absorbância equivalente a da
solução de óleo de girassol diluído 10 vezes (Tabela 8).
Tabela 8: Concentração de α-tocoferol com capacidade redutora do radical ABTS
equivalente a da solução de óleo de girassol diluído 10 vezes
Concentração de
óleo de girassol
Absorbância
média a 720 nm Equação Linear
Concentração de
α-tocoferol
100 mg/mL 0,451 Y= -0,0005x + 0,6671
R2= 0,991
432,2 µg/mL
De acordo com esses dados foi encontrada uma capacidade de reduzir o radical
ABTS de 4322 mg EAT/ kg de óleo. Esses valores confirmam sua capacidade
antioxidante, que por esse método, utilizando α-tocoferol como padrão, também foi
superior à atividade descrita para os óleos de milho (1300 mg EAT/kg), oliva (300 mg
EAT/kg) e soja (1100 mg EAT/kg) (DURMAZ, 2012).
No óleo de girassol são encontrados antioxidantes naturais como os tocoferois e
compostos fenólicos. Essas substâncias apresentam elevada capacidade sequestradora
de radicais livres e podem ser relacionadas ao potencial antioxidante encontrado por
ambas as metodologias avaliadas (WARNER e MOUNTS, 1990; LUDWIG et al., 2011;
BAKRE et al., 2014).
O principal componente do óleo de girassol é um ácido graxo considerado
essencial, o ácido linoléico – cerca de 65 % (BETT et al., 2004; MARQUES et al.,
2004; KOWALSKI, 2007; HSIEH et al., 2008). Esse ácido graxo exerce papel de
mediador pró-inflamatório, sendo essencial para a regulação dos eventos bioquímicos
que precedem a fibroplasia e estando associado às ações cicatrizantes e anti-
inflamatórias comumente relatadas para o óleo (GLASGOW e ELING, 1990;
RODRIGUES et al., 2004; MAGALHÃES et al., 2008; BONFERONI et al., 2014).
Topicamente, segundo Marques et al. (2004), o óleo de girassol pode ser
considerado um tratamento alternativo para o processo cicatricial de segunda intenção,
contribuindo para o fechamento mais rápido de feridas com grande espessura. Ele já tem
sido utilizado para esses fins, como um dos componentes do Dersani®, um medicamento
empregado no tratamento de lesões cutâneas (MANDELBAUM et al., 2003;
GONÇALVES et al., 2010; PRICHOA et al., 2011).
Resultados e Discussão
54
Baseado no potencial antioxidante, na possível capacidade regeneradora tissular
e considerando sua acessibilidade, o óleo de girassol representa uma boa escolha como
fase oleosa de nanoemulsões tópicas cuja finalidade é a radioproteção. Apesar de
apresentar uma capacidade seqüestradora de radicais livres muito inferior a do EEB, por
ser utilizado em concentrações elevadas nas formulações, pode representar um
complemento dessa ação.
5.5. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A
Dentre as 36 formulações que foram obtidas, as emulsões desenvolvidas
utilizando Span 80/ Croduret 50 Special como sistema tensoativo, apresentaram
floculação seguida de separação de fases, logo após o preparo (Tabela 9).
Tabela 9: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Span
80/Croduret 50 Special como sistema tensoativo
Composição Formulação
Proporção de
tensoativos (%)
SP/CRO
Aspecto Macroscópico
(logo após o preparo)
Composição A
(5% de óleo e 5
% de sistema
tensoativo)
SC1 10/90 Separação de fases
SC2 20/80 Separação de fases
SC3 30/70 Separação de fases
SC4 40/60 Separação de fases
SC5 50/50 Separação de fases
SC6 60/40 Separação de fases
SC7 70/30 Separação de fases
SC8 80/20 Separação de fases
SC9 90/10 Separação de fases
Composição B
(10% de óleo e
10 % de sistema
tensoativo)
SC10 10/90 Separação de fases
SC11 20/80 Separação de fases
SC12 30/70 Separação de fases
SC13 40/60 Separação de fases
SC14 50/50 Separação de fases
SC15 60/40 Separação de fases
SC16 70/30 Separação de fases
SC17 80/20 Separação de fases
SC18 90/10 Separação de fases
Legenda: SP/CRO = Span 80/Croduret 50 Special
Microscopicamente, 24 horas após o preparo, foram observadas partículas
grandes, segregadas e com aspecto coagulado (Figura 18). Essas partículas confirmaram
a instabilidade das formulações, sugerindo incompatibilidade do óleo de girassol com o
Resultados e Discussão
55
sistema tensoativo. Os resultados estão de acordo com Walther et al. (2005) que
relataram que nenhuma emulsão combinando Span 80 e esse óleo apresenta
estabilidade. Segundo Yang et al. (2012) elevadas concentrações de monooleato de
sorbitano, em fase oleosa contendo óleo de girassol, provocam redução da estabilidade
e/ou coagulação de micropartículas.
Figura 18: Fotomicrografia de formulações utilizando o sistema tensoativo Span 80/
Croduret 50 Special, 24 horas após o preparo, aumento de 400X. A – emulsão SC5 sob
luz branca comum. B – emulsão SC3 sob luz polarizada
As análises macroscópicas, das formulações utilizando Crill 3/ Croduret 50
Special, realizadas após 24 horas do preparo, podem ser observadas na Tabela 10.
Tabela 10: Aspecto macroscópico das emulsões desenvolvidas utilizando Crill
3/Croduret 50 Special como sistema tensoativo
Composição Formulação
Proporção de
tensoativos (%)
CRI/CRO
Aspecto Macroscópico
(24 h após o preparo)
Composição A
(5% de óleo e 5
% de sistema
tensoativo)
CC1 10/90 Separação de fases
CC2 20/80 Separação de fases
CC3 30/70 Separação de fases
CC4 40/60 Separação de fases
CC5 50/50 Separação de fases
CC6 60/40 Separação de fases
CC7 70/30 Separação de fases
CC8 80/20 Separação de fases
CC9 90/10 Separação de fases
Composição B CC10 10/90 Separação de fases
Resultados e Discussão
56
(10% de óleo e
10 % de sistema
tensoativo)
CC11 20/80 Separação de fases
CC12 30/70 Separação de fases
CC13 40/60 Emulsão translúcida
CC14 50/50 Emulsão translúcida
CC15 60/40 Emulsão amarelada
CC16 70/30 Separação de fases
CC17 80/20 Separação de fases
CC18 90/10 Separação de fases
Legenda: CRI/CRO = Crill 3/Croduret 50 Special
As formulações CC1 a CC9, logo após o preparo apresentaram aspecto leitoso
característico de emulsões, mas após 24 horas foi observada separação de fases.
Microscopicamente, foram observadas floculação e partículas de tamanhos variados,
mas sem aspecto coalhado (Figura 19). Provavelmente, a pequena concentração de óleo,
apenas 5%, não contribuiu para a estabilidade do sistema. Walther et al. (2005) e Donsi
et al. (2012) obtiveram emulsões estáveis utilizando 10% de óleo de girassol na
composição da fase oleosa.
Figura 19: Fotomicrografia, sob luz polarizada, de uma das formulações utilizando o
sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 10 % de fase oleosa,
emulsão CC5, 24 horas após o preparo, aumento de 400X.
Nas formulações restantes, foram utilizados 10% de óleo de girassol, mas
mesmo assim, CC10 a CC12 e CC16 a CC18 apresentaram separação de fases após 24
horas. Microscopicamente, foram observadas floculação e partículas de tamanhos
variados, muito semelhantes às observadas de CC1 a CC9.
Resultados e Discussão
57
A formulação CC15 (60/40-CRI/CRO) apresentou aspecto leitoso característico
de emulsões, sendo considerada estável macroscopicamente após 24 horas do preparo.
Microscopicamente, foram observadas partículas pouco segregadas, mas de tamanhos
variados (Figura 20). Emulsões com glóbulos de tamanhos variados como essa são
geralmente pouco estáveis. Quanto mais polidisperso o sistema, maior a diferença de
solubilidade relativa do óleo dentro das partículas e mais provável a ocorrência de
maturação de Ostwald. Fenômeno onde os glóbulos menores, por sua elevada
solubilidade, transferem seu conteúdo para os maiores, levando, no final, à completa
separação de fases (CAPEK, 2004; SABERI et al., 2014; WU et al., 2014).
Figura 20: Fotomicrografia, sob luz polarizada, da emulsão CC15, utilizando o sistema
tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 20 % de fase oleosa, 24 horas após
o preparo, aumento de 400X
Além disto, o fato de terem sido observadas partículas grandes em CC15, ainda
no aumento de 400 vezes, não foi condizente com o esperado para uma nanoemulsão.
As formulações CC13 (40/60-CRI/CRO) e CC14 (50/50-CRI/CRO), estáveis
macroscopicamente após 24 horas, apresentaram aspecto transparente azulado (Figura
21) característico de nanoemulsões (SADURNÍ et al., 2005; KLASSEN et al., 2014).
Resultados e Discussão
58
Figura 21: Emulsão CC13 durante resfriamento sob agitação, com aspecto transparente
azulado
Quando avaliadas microscopicamente, não foram observadas partículas em
CC13 e CC14, mesmo no maior aumento (Figura 22). Esses resultados permitiram
sugerir que os glóbulos formados nas mesmas eram de tamanho reduzido, representando
possíveis nanoemulsões.
Figura 22: Fotomicrografia sob luz polarizada, das formulações com aspecto
macroscópico de nanoemulsões, 24 horas após o preparo, aumento de 1000X.
A – emulsão CC13. B – emulsão CC14
As combinações de tensoativos empregadas conferiram EHL de 10,34 e 9,4 a
CC13 e CC14, respectivamente. Esses valores corroboram para a estabilidade dos
sistemas obtidos, pois valores de EHL entre 8 e 13 costumam originar emulsões O/A
Resultados e Discussão
59
estáveis (AKOH e NWOSU, 1992; NASHY e ABO-ELWAFA, 2011). De acordo com a
literatura valores de EHL acima de 10 são ideais para a formação de nanoemulsões O/A,
permitindo a formação de gotículas uniformes (KOMMURU et al.,2001; ANJANA et
al., 2012).
Com esses resultados pode-se afirmar que para o desenvolvimento de sistemas
emulsionados é fundamental encontrar as concentrações de óleo e combinações de
tensoativos que originam formulações estáveis. Muitos autores relatam que a
composição e a concentração de tensoativos utilizados na fase oleosa influenciam no
tamanho dos glóbulos formados e na estabilidade das emulsões (MASON et al., 2006;
MORAIS et al., 2006; BAZYLINSKA et al., 2014; KOMAIKO e MCCLEMENTS,
2014).
5.6. Determinação da distribuição granulométrica
As emulsões CC13 e CC14 foram selecionadas para determinação do diâmetro
das partículas e dispersão das mesmas. CC13 apresentou tamanho de 81,2 ±4,27 nm,
com IP de 0,09 ±0,094. CC14 apresentou tamanho de 77,1 ±1,28 nm, com IP de 0,156
±0,025. Em ambos os casos, os diâmetros das partículas encontram-se na faixa de
tamanho característico de nanoemulsões (IZQUIERDO et al., 2004; LI et al., 2011;
REBOLLEDA et al., 2015). O IP é uma medida da amplitude da distribuição de
tamanho. Tanto CC13 quanto CC14 apresentaram pequeno IP (inferior a 0,3), podendo
ser consideradas nanoemulsões monodispersas (LI et al., 2011; GORAIN et al., 2014).
O tamanho dos glóbulos de uma emulsão depende do método de emulsificação
empregado. Os resultados obtidos demonstram a eficiência do método de emulsificação
por inversão de fases na obtenção de nanoemulsões. Método esse que consome baixa
energia no processo de formação de emulsões, sendo econômico e indo de encontro à
demanda industrial (SADURNÍ et al., 2005; MORAIS, 2008; DAVIDOV-PARDO e
MCCLEMENTS, 2015).
5.7. Testes preliminares de estabilidade
As formulações CC13 e CC14 foram consideradas macroscopicamente estáveis
24 horas após seu preparo e, através da determinação do diâmetro médio das partículas,
Resultados e Discussão
60
foram confirmadas como nanoemulsões, sendo submetidas aos testes de estresse
térmico e centrifugação.
5.7.1. Estresse térmico
As nanoemulsões CC13 e CC14 permaneceram com suas características
macroscópicas inalteradas, mesmo quando submetidas à temperatura de 80 ± 2 ºC. Em
relação à distribuição granulométrica, CC14 não apresentou variação estatística
significativa (p > 0,05) e CC13 apresentou uma pequena variação na distribuição, com
significância de 0,07 (Tabela 11). Mesmo com essa pequena alteração observada no
diâmetro das partículas de CC13, a formulação apresentou aspecto e características de
uma nanoemulsão.
Tabela 11: Resultados da distribuição granulométrica após o teste de estresse térmico
(média ± desvio padrão, n = 3)
Amostra Após 24h do preparo Após estresse térmico
Tamanho (nm) IP Tamanho (nm) IP
CC13 81,2 ±4,27 0,090 90,93 ±1,75 0,132
CC14 77,1 ±1,28 0,156 77,23 ±1,59 0,147
Legenda: IP = índice de polidispersão
O teste de estresse térmico permite um incremento de energia cinética ao
sistema, observando a susceptibilidade do mesmo a essa situação. Apenas uma pequena
variação foi observada em CC13 após um aumento muito significativo da temperatura,
indicando que ambas nanoemulsões mantiveram a estabilidade (PEREIRA 2008;
GORIAN et al., 2014).
5.7.2. Centrifugação
Nenhuma alteração das características macroscópicas das nanoemulsões CC13 e
CC14 foi observada após as etapas de centrifugação, mesmo após 15 minutos a 3000
rpm. A distribuição granulométrica das mesmas, avaliada após realização do teste de
centrifugação (Tabela 12), permitiu concluir que as partículas em ambas nanoemulsões
não sofreram variação significativa do tamanho (p > 0,05) e o sistema permaneceu
monodisperso.
Resultados e Discussão
61
Tabela 12: Resultados da distribuição granulométrica após o teste de centrifugação
(média ± desvio padrão, n = 3)
Amostra Após 24h do preparo Após centrifugação
Tamanho (nm) IP Tamanho (nm) IP
CC13 81,2 ±4,27 0,090 83,53±3,21 0,115
CC14 77,1 ±1,28 0,156 77,36 ±0,92 0,177
Legenda: IP = índice de polidispersão
A integridade de CC13 e CC14 foi mantida mesmo sob o estresse mecânico
fornecido pela centrifugação, confirmando a estabilidade dos sistemas. O tamanho
reduzido dos glóbulos das nanoemulsões dificulta a atuação da gravidade e o
movimento Browniano dos mesmos pode ser suficiente para superá-la (TADROS et al.,
2004; WULFF-PÉREZ et al., 2012).
5.8. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões
A nanoemulsão CC14 foi considerada mais estável através dos testes
preliminares de estabilidade, pois uma pequena alteração na distribuição granulométrica
foi observada para CC13 no teste de estresse térmico.
Além do mais, analisando os diâmetros médios dessas formulações, observou-se
que CC14 apresentou partículas um pouco menores que CC13. Quanto menores os
glóbulos de uma nanoemulsão, maior sua estabilidade (JEONG et al., 2001; TADROS,
2013).
Portanto, a formulação CC14 foi selecionada como nanoemulsão base para ser
adicionada de EEB das folhas de Melaleuca leucadendron ou de pilocarpina ou de
ambos ativos.
5.8.1. Adição do EEB
Na figura 23 pode ser observada a incorporação de 0,5% de EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron previamente ao aquecimento da fase oleosa, nos três métodos
testados.
Resultados e Discussão
62
Figura 23: Incorporação de 0,5% do EEB previamente ao aquecimento da fase oleosa. A
– método I: EEB adicionado à fase oleosa completa. B – método II: EEB adicionado ao
Croduret 50 Special e sonicado por 2 horas. C – método III: EEB adicionado ao
Croduret 50 Special e sonicado por 4 horas
No método I o EEB foi adicionado à fase oleosa completa e, em seguida,
preparada a emulsão. Foram obtidas formulações amareladas com aspecto de
nanoemulsão. Porém, não foi observada boa incorporação do extrato, ocorrendo
deposição de partículas no fundo do recipiente utilizado para o preparo (Figura 24A).
Nos métodos II e III, foram obtidas formulações esverdeadas com aspecto de
nanoemulsões (Figura 24B). Foi observado que quanto maior o tempo sob ultrassom,
melhor a incorporação do extrato. Sendo assim, como no método II foram apenas 2
horas de sonicação frente a 4 horas no método III, a formulação obtida por esse último
método foi selecionada como a melhor.
Figura 24: Formulações contendo 0,1% de EEB. A – nanoemulsão obtida pelo método
I. B – nanoemulsão obtida pelo método III
Nas emulsões obtidas pelo método III foi alcançada excelente incorporação do
extrato. No entanto, em concentrações superiores a 0,5% de EEB foram notadas
Resultados e Discussão
63
partículas no fundo do recipiente utilizado para o preparo. Após a incorporação, todas as
nanoemulsões com EEB, foram filtradas em filtro de 0,45 µm previamente à utilização.
Este tipo de filtro não retém os glóbulos das formulações e é útil para a remoção de
quaisquer partículas insolúveis de EEB que não podem ser vistas macroscopicamente.
Um extrato bruto possui muitos constituintes distintos em sua composição
(SOUZA et al., 2012). Quando acrescentadas maiores concentrações do EEB, a
quantidade de tensoativos e o aquecimento podem não ter sido suficientes para
solubilizar os componentes com caráter muito hidrofílico. Contudo, a adição desse
extrato ao tensoativo hidrofílico e a ultrassonicação, previamente ao acréscimo do
restante da fase oleosa, favoreceram a incorporação. Além disto, após a adição da fase
aquosa, estes compostos mais polares podem ter sido solubilizados, contribuindo para a
obtenção de sistemas mais homogêneos e estáveis.
O desenvolvimento de formulações nanoestruturadas com extratos vegetais
agrega muitas vantagens aos medicamentos obtidos. Dentre elas, pode-se citar melhora
da solubilidade e biodisponibilidade desses princípios ativos, proteção contra a
toxicidade e contra a degradação química e física. Além disso, pode aumentar sua ação
farmacológica, através de sinergismo, por interação com os demais componentes da
fórmula (GOYAL et al., 2011; ANSARI et al., 2012; BONIFÁCIO et al., 2014).
5.8.2 Adição do cloridrato de pilocarpina
A incorporação do cloridrato de pilocarpina às nanoemulsões, na fase de
resfriamento, foi realizada sem alterações perceptíveis. Mesmo nas maiores
concentrações testadas não houve problemas com a metodologia utilizada.
No caso das nanoemulsões que combinaram o EEB e o cloridrato de pilocarpina,
a incorporação foi realizada em formulações adicionadas de extrato pelo método III. Por
esse método, como descrito anteriormente, houve boa incorporação do EEB através da
ultrassonicação por 4 horas com tensoativo hidrofílico. No caso dessas nanoemulsões, a
pilocarpina também foi adicionada sem comprometimento aparente da qualidade.
As nanoemulsões combinando os dois princípios ativos foram filtradas em filtros
de 0,45 µm, para evitar a presença de partículas não incorporadas do extrato.
O cloridrato de pilocarpina é um fármaco com coeficiente de partição O/A
característico de substâncias hidrofílicas, podendo-se esperar boa incorporação do
mesmo em componentes aquosos (JARVINEN et al., 1991; PALLICER et al., 2011).
Resultados e Discussão
64
Isto justifica os bons resultados obtidos com a sua adição após o preparo das
nanoemulsões O/A, em que a fase dispersante e, nesse caso, o maior componente, foi
água.
5.9. Caracterização físico-química das nanoemulsões
As nanoemulsões NB, NE, NP e NEP foram obtidas, conforme descrito
anteriormente, selecionando quantidade de fase oleosa, sistema tensoativo, concentração
de cada tensoativo no sistema e método de incorporação do EEB ideais. Na tabela 13
pode ser observada a composição detalhada dessas formulações.
Tabela 13: Composições centesimais das nanoemulsões utilizadas nos ensaios de
caracterização
Componente NB NE NP NEP
Óleo de girassol 10 % 10 % 10 % 10 %
Crill 3 5 % 5 % 5 % 5 %
Croduret 50 Special 5 % 5 % 5 % 5 %
EEB das f. M. leucadendron - 0,1 % - 0,05 %
Cloridrato de pilocarpina - - 0,1 % 0,05 %
Água 80 % 79,9 % 79,9% 79,9 %
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão
com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina; f. = folhas
Essas quatro nanoemulsões foram utilizadas nos ensaios de caracterização.
Como as nanoemulsões contendo extrato (NE e NEP) passaram por filtração, NB e NP
também foram filtradas em filtro de 0,45 µm. Esse procedimento teve a finalidade de
conceder a todas as nanoemulsões as mesmas condições, especialmente porque parte
delas foi destinada aos ensaios de estabilidade realizados posteriormente.
A filtração, nessa porosidade, é um método eficaz para remoção de boa parte dos
microrganismos, conferindo menor chance de contaminação às amostras (JORNITZ et
al., 2002; SINCLAIR et al., 2014). Segundo Vetten et al. (2014) a filtração é um método
seguro. Ela pode ser utilizada para eliminar a contaminação microbiana, sem alterar as
propriedades físico-químicas das nanopartículas, desde que sejam utilizados filtros com
porosidade adequada.
Resultados e Discussão
65
5.9.1. Avaliação macroscópica
Após 24 horas do preparo nenhum indício de separação de fases, floculação ou
cremeação foi observado nas formulações NB, NE, NP e NEP. Portanto, as mesmas
foram consideradas estáveis macroscopicamente.
As quatro emulsões apresentaram aspecto transparente azulado característico de
nanoemulsões (SADURNÍ et al., 2005; KOMAIKO e MCCLEMENTS, 2014).
5.9.2. Avaliação microscópica
Microscopicamente, após 24 horas do preparo, nenhuma estrutura foi observada
em NB, NE, NP e NEP. Nem mesmo sob luz polarizada ou sob o maior aumento
(1000x).
Resultados estes que corroboram com o desejado para nanoemulsões, que devem
apresentar partículas de tamanho reduzido. Além disso, a ausência de estruturas
birrefringentes confirma que não houve formação de cristais líquidos ao redor dos
glóbulos das emulsões, tampouco a precipitação da pilocarpina e/ou de compostos do
EEB (KINI et al., 2012; CHAUDHARY et al., 2014).
5.9.3. Determinação da distribuição granulométrica
O diâmetro médio e o IP obtidos para NB, NE, NP e NEP, 24 horas após o
preparo, estão descritos na tabela 14. Todas as quatro emulsões foram consideradas
sistemas monodispersos com glóbulos de tamanhos reduzidos.
Tabela 14: Distribuição granulométrica obtida para caracterização das nanoemulsões, 24
horas após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
Amostra Tamanho (nm) IP
NB 76,7±0,95 0,184±0,023
NE 74,7±0,55 0,148±0,026
NP 78,8±2,69 0,220±0,016
NEP 77,4±3,48 0,241±0,043
Legenda: IP = índice de polidispersão; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão
com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e
pilocarpina
Resultados e Discussão
66
O tamanho variou pouco de uma formulação para outra, mantendo-se na faixa
entre 70 e 80 nm. Analisando essa variação por ANOVA, a um grau de confiança de
95%, as médias de distribuição granulométrica não diferiram significativamente entre as
emulsões. Com isso, pode-se inferir que a incorporação dos ativos à nanoemulsão base,
além de não ter alterado suas características macroscópicas, também não influenciou no
tamanho dos glóbulos formados.
O pequeno diâmetro das partículas obtidas pode ser associado à composição das
nanoemulsões, ao método utilizado e também, ao modo como esse método foi
executado (SIMOVIC et al., 1999; IZQUIERDO et al., 2004; MORAIS et al., 2006). De
acordo com Pereira (2008) glóbulos menores são formados por elevada velocidade de
agitação e baixo fluxo de adição da fase aquosa.
As formulações NB, NE, NP e NEP apresentaram aspecto transparente azulado,
tamanho de glóbulos reduzido e foram desenvolvidas utilizando pequenas
concentrações de sistema tensoativo (10 %). Essas propriedades confirmam a obtenção
de nanoemulsões (MCCLEMENTS, 2012; TUBESHA et al., 2013; BAZYLINSKA et
al., 2014).
O tamanho pequeno dos glóbulos, além de contribuir para a estabilidade, pode
apresentar maior facilidade em permear a pele, alcançando estrato córneo e epiderme.
Essa propriedade pode colaborar para uma boa ação tópica dos ativos presentes nas
nanoemulsões (TADROS et al., 2004; OZTURK et al., 2014).
5.9.4. Determinação do pH
Os valores de pH obtidos para as formulações NB, NE, NP e NEP após 1, 7 e 30
dias do preparo, podem ser observados na tabela 15.
Tabela 15: Valores de pH das nanoemulsões após 1, 7 e 30 dias do preparo (média ±
desvio padrão, n = 3)
Amostra pH
1 dia 7 dias 30 dias
NB
NE
NP
NEP
6,46 ±0,04 6,49 ±0,06 6,48 ±0,04
6,48 ±0,03 6,47 ±0,04 6,52 ±0,03
6,53 ±0,04 6,55 ±0,05 6,57 ±0,07
6,53 ±0,03 6,56 ±0,07 6,55 ±0,07
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão
com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Resultados e Discussão
67
Os valores foram todos próximos a 6,5. Quando analisado por ANOVA, não
houve diferenças significativas entre o pH das diferentes nanoemulsões, a um nível de
significância de 0,05. Esses resultados, próximos da neutralidade à ligeiramente ácidos,
são geralmente característicos de sistemas nanoemulsionados. Schwarz et al. (2012),
Nirmala et al. (2014) e Rocha-Filho (2014) encontraram valores semelhantes para as
nanoemulsões desenvolvidas em seus estudos.
O pH é um parâmetro de caracterização e também de monitoramento da
estabilidade das formulações. De acordo com a literatura, nanoemulsões estáveis, física
e quimicamente, apresentam valores na faixa de 6,5 a 8 (FRONZA et al., 2004;
MASMOUDI et al., 2005; CARNEIRO, 2013). Segundo Ozturk et al. (2014) esses
sistemas são estáveis numa faixa ainda mais ampla de pH, de 3 a 8.
Alterações no valor do pH indicam a ocorrência de reações químicas ou
crescimento bacteriano. Um decréscimo nos valores pode ser decorrente da oxidação da
fase oleosa ou da hidrólise de triglicerídeos, gerando ácidos graxos livres (MASMOUDI
et al., 2005; PEREIRA 2008).
Com o decorrer dos 30 dias de armazenamento, não houve variação significativa
nos valores de pH em nenhuma das nanoemulsões (p > 0,05). Pode-se sugerir que as
formulações permaneceram estáveis, não sendo detectadas alterações químicas de seus
componentes.
O pH de produtos dérmicos é um fator importante para evitar irritação da pele e
para não deixá-la suscetível à infecção bacteriana. É interessante que formulações
tópicas apresentem valores ligeiramente ácidos, uma vez que o pH cutâneo encontra-se
em torno de 4,5 a 6. Portanto, os resultados obtidos, para NB, NE, NP e NEP,
confirmam a compatibilidade dessas nanoemulsões com o uso a que se destinam
(BORGES et al., 2013; CLARES et al., 2014).
5.9.5. Determinação da temperatura de inversão de fases
A condutividade elétrica, a 25 ºC, obtida para NB, NE, NP e NEP foi,
respectivamente, 254,7; 258,3; 257,9 e 237,5 µSm/cm. Esses valores são característicos
de nanoemulsões O/A. Ao contrário, emulsões em que a fase contínua é a oleosa,
apresentam baixa a nenhuma condutividade (BUMAJDAD e EASTOE, 2004;
KLASSEN et al., 2014). Essa diferença entre O/A e A/O, além de empregada para
Resultados e Discussão
68
determinar o tipo de emulsão, pode ser utilizada para caracterizar a inversão de fases
(BOUCHAMA et al., 2003).
Na Figura 25 está representada a condutividade elétrica das nanoemulsões, em
função da temperatura. As formulações aumentaram levemente a condutividade à
medida que a temperatura aumentou. Chegaram, então, a um ponto onde ocorreu a
inversão de fases, ocasionando um decréscimo brusco da mesma. As curvas obtidas
encontram-se de acordo com o perfil descrito para emulsões na literatura
(FERNANDEZ et al., 2004; KLASSEN et al., 2014).
Figura 25: Condutividade elétrica das nanoemulsões em função da temperatura
Nas formulações contendo ativos, foi observado um aumento um pouco mais
aparente da condutividade em função da temperatura, quando comparadas à NB. Essa
diferença pode ser consequência da composição mais complexa das nanoemulsões com
EEB e/ou cloridrato de pilocarpina. Pois, a elevação, que ocorre inicialmente, é
decorrente da maior mobilidade dos íons presentes na fase contínua, causada pelo
aquecimento. Além do aumento na taxa de dissociação dos sais presentes no meio
(SPERNATH e MAGDASSI, 2007; CARNEIRO, 2013).
A TIF determinada, para cada nanoemulsão, pode ser observada na tabela 16.
Todas as formulações apresentaram TIF na faixa entre 79 e 82 ºC. Esses valores foram
próximos aos utilizados para o preparo das mesmas.
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Co
nd
uti
vid
ad
e (μ
S.c
m-1
)
Temperatura (ºC)
NB NE NP NEP
Resultados e Discussão
69
O ideal, no método de inversão de fases, é preparar as nanoemulsões em uma
temperatura em torno da TIF, seguido de um arrefecimento rápido (MAALI e
MOSAVIAN, 2013; OLIVEIRA et al., 2014).
Tabela 16: Temperatura de inversão de fases (TIF) obtida para caracterização das
nanoemulsões, 24 horas após o preparo
Amostra TIF (ºC)
NB 81,5
NE 79,2
NP 81,7
NEP 80,5
Legenda: TIF = temperatura de inversão de fases; NB = nanoemulsão base; NE =
nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com
EEB e pilocarpina
Segundo Tadros (2013), quando utilizada temperatura um pouco abaixo da TIF,
são formados glóbulos de tamanhos menores. Isso porque, a mínima tensão interfacial,
necessária para a inversão de fases, é alcançada próximo à TIF e, aumenta novamente,
logo em seguida.
As TIFs encontradas foram adequadas para emulsões armazenadas à temperatura
ambiente, por volta de 20 a 25 ºC. De acordo com Shinoda e Saito (1969) e com Tadros
(2013) sistemas estáveis são obtidos quando as temperaturas de inversão são cerca de 20
a 65 ºC superiores à temperatura de estocagem.
5.9.6. Determinação do potencial zeta
O potencial zeta fornece uma medida da força elétrica repulsiva entre as
partículas. A determinação desse potencial pode ser utilizada como um parâmetro de
caracterização e de monitoramento da estabilidade de sistemas coloidais. Quanto maior
o potencial zeta, maior a repulsão eletrostática entre as nanopartículas, havendo menor
probabilidade de agregação (GUPTA e GHOSH, 2014; KADAM et al., 2014;
TAMJIDI et al., 2014).
A velocidade de migração dos glóbulos, com potencial zeta, em direção a um
eletrodo de carga oposta, foi medida via M3-PALS. Esse método é decorrente da
combinação de duas técnicas, laser Doppler com análise de fase por espalhamento de
luz (PALS) (ARZENŠEK et al., 2012; FELIX et al., 2013). Com isso, foi possível obter
Resultados e Discussão
70
uma distribuição completa do potencial de cada nanoemulsão e um valor médio do
mesmo (Tabela 17).
Todas as quatro nanoemulsões apresentaram valor de potencial zeta adequado,
indicando estabilidade das mesmas. De acordo com a literatura, para alcançar um
sistema eletrostaticamente estável, é necessário um potencial zeta igual ou maior a 30
mV, em módulo (LAKSHMI e KUMAR, 2010; ABLA e BANGA, 2014; TAMJIDI et
al., 2014; TRAN et al., 2014).
Tabela 17: Potencial zeta obtido para caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o
preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
Amostra Potencial Zeta (mV)
NB -46,0 ± 0,79
NE -30,3 ± 3,07
NP -43,1 ± 0,71
NEP -43,3 ± 3,00
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão
com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Nanoemulsões produzidas a partir de misturas de tensoativos não-iônicos
apresentam potencial zeta negativo. A carga superficial negativa tem sido atribuída à
adsorção de íons hidroxila na interface O/A. Esse mecanismo pode ser decorrente da
formação de pontes de hidrogênio com os grupos etóxi da cadeia polietilênica,
originando íons oxônio (HO e AHMAD, 1999; LIU et al., 2006; SANTOS et al., 2011).
Alterações no potencial zeta, devido a mudanças de condições e/ou de
constituintes das emulsões, podem alterar a carga dos glóbulos e interferir na
estabilidade dos sistemas. A influência da adição de eletrólitos ou outros aditivos
depende das quantidades empregadas (JEONG et al., 2001; MORAIS et al., 2006).
Avaliando as diferenças de potencial zeta entre as nanoemulsões, apenas NE
apresentou variação estatisticamente significativa (p < 0,05). A adição de cloridrato de
pilocarpina, um sal ionizável, na quantidade avaliada, não exerceu influência na carga
superficial dos glóbulos.
A presença de EEB só alterou o potencial zeta em NE, provavelmente, por estar
em maior concentração nessa formulação que em NEP. Uma possibilidade, para a
redução de potencial observada, é que compostos presentes no extrato, como as
hidroxilas dos compostos fenólicos, estejam interagindo com os grupos etóxi da cadeia
polietilênica dos tensoativos, reduzindo a adsorção de íons hidroxila da interface.
Resultados e Discussão
71
Vale ressaltar que nenhum sinal de instabilidade foi observado,
macroscopicamente, em NE. Além disso, o potencial zeta determinado, mesmo inferior
aos das demais, parece ser suficiente para garantir estabilidade eletrostática ao sistema.
5.10. Testes de estabilidade
Nas nanoemulsões, a energia livre das fases, oleosa e aquosa, separadas é menor
do que a da própria formulação. Por essa razão, são sistemas termodinamicamente
instáveis. No entanto, quando adicionados estabilizadores apropriados, como os
tensoativos, suas características podem ser mantidas por um período considerável
(ZEEB et al., 2014).
Durante os 60 dias de armazenamento, nenhuma alteração macroscópica foi
observada em NB, NE, NP e NEP. As emulsões permaneceram sem separação de fases,
cremeação ou floculação e mantiveram suas características organolépticas.
5.10.1. Estresse térmico
Com o aquecimento, os tensoativos não-iônicos tendem a se desidratar, podendo
alterar a solubilidade O/A e a tensão interfacial. Além disso, o aumento da temperatura
eleva a energia cinética, incrementando o movimento Browniano do sistema. Esses
processos permitem que as partículas superem a barreira energética e aproximem-se
umas das outras. Fenômenos como floculação e coalescência tornam-se mais prováveis.
Pode ocorrer um aumento no tamanho dos glóbulos ou, ainda, separação de fases
(MORAIS et al., 2006; RAO e MCCLEMENTS, 2011).
Tabela 18: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos testes de
estresse térmico realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média ±desvio
padrão, n = 3)
AM Tamanho Tamanho após estresse térmico
1 dia 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias
NB
NE
NP
NEP
76,7 ±0,96 78,5 ±2,80 76,8 ±0,20 81,6 ±4,56 76,9 ±2,11 77,7 ±0,93
74,7 ±0,55 74,1 ±0,11 73,9 ±1,03 73,9 ±0,65 75,9 ±2,56 76,5 ±1,41
78,8 ±2,69 77,8 ±0,53 79,7 ±1,40 76,8 ±0,79 80,3 ±0,74 80,5 ±0,43
77,4 ±3,48 79,5 ±0,42 83,7 ±3,81 80,0 ±1,51 79,5 ±7,81 82,4 ±3,79
Legenda: AM = amostra; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP =
nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Resultados e Discussão
72
Ao final dos ensaios de estresse térmico realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após o
preparo, as nanoemulsões permaneceram estáveis. Macroscopicamente, não foram
observadas alterações, mesmo quando submetidas à temperatura de 80 ± 2 ºC. A
distribuição granulométrica também não sofreu variações significativas em nenhuma
das amostras, a um nível de significância de 0,05 por ANOVA (Tabela 18).
5.10.2. Centrifugação
Agregação, cremeação e separação de fases, que ocorreriam com o tempo,
podem ser antecipados com o ensaio de centrifugação. No entanto, esses fenômenos de
instabilidade são incomuns em nanoemulsões com tamanho de partícula reduzido.
Nessas formulações, o movimento Browniano é maior que a força gravitacional e
assegura que os glóbulos permaneçam separados. Especialmente nas que apresentam
diâmetro inferior a cerca de 70 nm (BADOLATO et al., 2008; MCCLEMENTS e RAO,
2011) .
Posteriormente aos ciclos de centrifugação, realizados após 1, 7, 15, 30 e 60 dias
do preparo, não ocorreram alterações macroscópicas. Também não foram determinadas
variações significativas no tamanho das partículas (ANOVA, p > 0,05) (Tabela 19).
Tabela 19: Distribuição granulométrica das nanoemulsões posteriormente aos testes de
centrifugação realizados 1, 7, 15, 30 e 60 dias após seu preparo (média ±desvio padrão,
n = 3)
AM Tamanho Tamanho após centrifugação
1 dia 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias
NB
NE
NP
NEP
76,7 ±0,96 77,5 ±0,66 75,0 ±1,13 77,9 ±1,01 77,7 ±0,37 78,0 ±2,46
74,7 ±0,55 75,5 ±1,57 75,4 ±0,62 75,9 ±1,99 75,1 ±0,20 77,0 ±0,17
78,8 ±2,69 80,4 ±3,80 78,9 ±1,23 81,7 ±1,86 83,2 ±3,04 81,5 ±1,24
77,4 ±3,48 76,7 ±1,72 77,8 ±2,13 80,4 ±2,98 78,9 ±1,28 80,6 ±0,51
Legenda: AM = amostra; NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP =
nanoemulsão com pilocarpina e NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
Assumindo que a estabilidade é diretamente proporcional à força gravitacional, o
comportamento das emulsões, em longo prazo, pode ser estimado pela centrifugação em
velocidades moderadas. Portanto, de acordo com os resultados, NB, NE, NP e NEP
apresentaram-se fisicamente estáveis (LATREILLE e PAQUIN, 1990; ANDRADE et
al., 2007).
Resultados e Discussão
73
Quanto mais rápido ocorre o aumento das partículas menor a estabilidade de um
sistema. Sendo assim, a manutenção do tamanho, observada após o armazenamento e os
ensaios de estresse térmico e centrifugação, confirma a durabilidade das emulsões
(MCCLEMENTS e RAO, 2011; GUPTA e GHOSH, 2014).
Esses fatos reafirmam a eficiência do método e dos componentes utilizados para
a obtenção das formulações. Pois foram capazes de conferir propriedades físico-
químicas que caracterizaram sistemas estáveis.
5.11. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT
Formulações para aplicações cosméticas e farmacêuticas, além de características
adequadas de estabilidade, precisam apresentar baixa toxicidade. É necessário
determinar as concentrações em que os princípios ativos podem ser utilizados sem
causar danos. Consequentemente, antes de realizar estudos de atividade, especialmente
in vivo, é interessante realizar estudos de toxicidade in vitro (WEYENBERG et al.,
2007; ROTHEN-RUTISHAUSER et al., 2008; SCHERLIEß, 2011).
A citotoxicidade avaliada pelo método MTT tem sido muito utilizada, por
apresentar elevada sensibilidade. Esse ensaio tem como alvo a função catalítica das
desidrogenases, que é facilmente influenciada por efeitos tóxicos. Além disso, pode ser
utilizado em vários tipos de culturas de células (WAN et al., 2009; SCHERLIEß, 2011;
NIKZAD et al., 2014).
A nanoemulsão sem ativos não apresentou efeito citotóxico. A viabilidade
celular, determinada para NB, foi de 98,39 ±0,56 %. Pode-se sugerir que o óleo de
girassol e o sistema tensoativo apresentaram características toleráveis aos macrófagos
murinos. Janjic et al. (2014) também analisaram a citotoxicidade de nanoemulsões com
tensoativos não-iônicos. Utilizaram uma metodologia diferente e, ainda assim, não
observaram efeitos tóxicos.
Hung et al. (2005) avaliaram, por MTT, a toxicidade de emulsões lipídicas frente
a fibroblastos. Compararam diferentes tensoativos e relataram que os não-iônicos são
capazes de manter elevada e tolerável viabilidade celular.
As nanoemulsões E1 a E7 e P1 a P7 apresentaram efeito citotóxico dependente
da concentração dos ativos, como pode ser observado na Figura 26. Apesar da
influência na viabilidade celular, com as quantidades avaliadas, não foi possível calcular
a concentração tóxica a 50 % das células (CT50).
Resultados e Discussão
74
Figura 26: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB (E1 a E7) e das
nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina (P1 a P7), avaliada pelo método MTT,
frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3)
As nanoemulsões EP1 a EP4, contendo diferentes combinações de EEB e
cloridrato de pilocarpina, apresentaram comportamento semelhante. Foi observada
variação na citotoxicidade como consequência da concentração de ativos (Figura 27).
Figura 27: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina,
avaliada pelo método MTT, frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3). Nessas
formulações, as concentrações em %, de EEB e pilocarpina, respectivamente, são: EP1
= 0,01/0,01; EP2 = 0,02/0,01; EP3 = 0,02/0,02 e EP4 = 0,05/0,05
A redução na viabilidade celular, decorrente do aumento das substâncias ativas
nas nanoemulsões, tem sido descrita na literatura. Ding et al. (2013) avaliaram a
citotoxicidade de nanoemulsões contendo óleo iodado e constataram uma elevação da
toxicidade com o aumento das concentrações de iodo na formulação. Nesamony et al.
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Via
bil
ida
de
celu
lar
(%)
Concentração dos princípios ativos (%)
EEBPilocarpina
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
EP1 EP2 EP3 EP4
Via
bil
ida
de
celu
lar
(%)
Nanoemulsões com EEB e pilocarpina
Resultados e Discussão
75
(2013) também relataram um efeito dose-dependente, na viabilidade celular, quando
testaram nanoemulsões com carbamazepina.
Saarinem-Savolainen et al. (1998) avaliaram a toxicidade de soluções contendo
pilocarpina, por MTT. Encontraram que, na concentração de 4 % (192 mM), esse ativo
foi tóxico a 50 % das células. No presente estudo, uma maior toxicidade foi observada.
A formulação P7, que contém 1 % de cloridrato de pilocarpina, causou efeito tóxico à
quase metade das células (46,28 %).
Um aumento na toxicidade tem sido esperado, quando os ativos estão em
nanoemulsões. O pequeno tamanho das partículas aumenta a permeação das substâncias
às membranas celulares, potencializando seus efeitos nocivos. Porém, a eficiência
também é favorecida. Sendo assim, quantidades menores, eficazes e não tóxicas, podem
ser utilizadas (GOMES et al., 2013; SYED e VEERABRAHMA, 2013; CARBONE et
al., 2014).
Naveh et al. (1994) e HaBe e Keipert (1997) compararam a ação de emulsões
com glóbulos nanométricos e colírios padrão contendo pilocarpina. Em ambos os
estudos a maior eficiência das nanoformulações foi confirmada. Efeito mais intenso e
prolongado das nanopartículas com o ativo foi observado frente à formulação comum.
De acordo como Scherließ (2011) uma substância é considerada não tóxica, com
efeitos adversos aceitáveis sobre as células, quando apresenta viabilidade celular acima
de 80 %. Toxicidade abaixo de 20 % foi observada em concentrações inferiores a 0,05
% (500 µg/ mL) de EEB ou de cloridrato de pilocarpina. E também, de EP1 a EP3, onde
a concentração total de substâncias ativas foi de no máximo 0,04 % (400 µg/ mL). Esses
valores foram utilizados, como um parâmetro, para definir as concentrações testadas na
avaliação da atividade antioxidante in vitro.
5.12. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões
É importante confirmar se os ativos empregados mantêm a atividade após serem
incorporados a uma formulação. Também deve ser avaliado se a interação com os
demais componentes da fórmula exerce uma influência positiva ou negativa sobre a
ação dos mesmos (PEREIRA, 2008).
Para avaliar a capacidade antioxidante, inclusive de emulsões tópicas, um dos
métodos mais utilizados tem sido o DPPH. Apesar de apresentar desvantagens, como a
de não ser efetivo para todas as variações de antioxidantes existentes, esse método é
Resultados e Discussão
76
considerado eficiente, simples e econômico (MAHDI et al., 2011; CARMONA-
JIMÉNEZ et al., 2014; XIE e SCHAICH, 2014).
A capacidade de reduzir o radical DPPH, observada para NB, em que uma
concentração de 6 mg/ mL de óleo de girassol foi avaliada, foi de 28,12 %. Quando
avaliado isoladamente, numa concentração semelhante, o óleo foi capaz de inibir 50%
do radical DPPH. Esses resultados indicam que a nanoemulsão manteve o potencial
antioxidante do óleo, porém ele foi um pouco prejudicado.
As formulações com EEB mantiveram a elevada capacidade antioxidante
(Tabela 20). Após 60 minutos, ocorreu estabilidade da reação. Foi observada maior
atividade pelas menores concentrações, em comparação ao EEB livre. Porém, para as
concentrações de E3 a E6, o potencial antioxidante foi um pouco inferior ao do extrato
separadamente.
Tabela 20: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60 minutos,
apresentada pelas nanoemulsões com EEB, de E1 a E6
Amostra Concentração de
EEB
Inibição 30
minutos (%)
Inibição 60
minutos (%)
E1 6 µg/ mL 30,50 33,15
E2 12 µg/ mL 35,19 38,03
E3 30 µg/ mL 70,38 74,13
E4 60 µg/ mL 84,46 86,12
E5 120 µg/ mL 87,68 89,28
E6 300 µg/ mL 93,84 94,20
Utilizando a equação linear, obtida através da curva elaborada com as
concentrações de E1 a E3 (Figura 28), foi calculada a CE50. O valor de CE50 encontrado
foi 18,7 ±0,53 µg/ mL, um pouco maior que o observado para o EEB livre, com nível de
significância de 0,05 em Teste T de Student. Apesar de ter ocorrido essa redução na
capacidade do extrato, ela foi bastante discreta e ainda representou uma excelente
atividade.
Resultados e Discussão
77
Figura 28: Capacidade de inibição do radical DPPH em função da concentração de EEB
nas nanoemulsões após 30 e 60 minutos de reação (média ± desvio padrão, n = 3)
Associando os resultados observados para as nanoemulsões com EEB, pode-se
acreditar que o mesmo teve o seu potencial reduzido após ser incorporado à formulação.
No entanto, a discreta redução observada e o aumento da atividade nas pequenas
concentrações sugerem um sinergismo entre a atividade da formulação e esse extrato.
A redução observada na atividade in vitro do óleo de girassol e do EEB, quando
nanoemulsionados, pode estar relacionada a uma liberação incompleta dos mesmos.
Pode também, ser decorrente da alteração ou da perda de alguns dos componentes com
atividade, no processo de obtenção das emulsões. Entretanto, se fosse realizada uma
comparação in vivo, pode ser que as nanoemulsões com óleo e EEB fossem mais
eficazes que os ativos livres, pois, de acordo com Clares et al. (2014), partículas
nanoemulsionadas tendem a apresentar uma maior permeação nas camadas da pele.
Com a finalidade de avaliar apenas a atividade do extrato na emulsão, de uma
maneira mais fidedigna, uma opção seria fazer o teste DPPH associado a um ensaio de
liberação. Mahdi et al. (2011) realizaram o ensaio dessa forma. Utilizaram o meio
receptor, contendo o extrato liberado da formulação, para avaliar a capacidade
sequestradora de radicais livres.
Em contraste ao ativo isoladamente, as nanoemulsões com cloridrato de
pilocarpina apresentaram atividade antioxidante (Tabela 21). Foi observada estabilidade
da reação após 60 minutos. Com os resultados obtidos não foi possível calcular CE50.
Pode ser observado que o potencial encontrado não foi dependente da
concentração de ativo. Os valores foram todos próximos e semelhantes ao encontrado
y = 1.7294x + 17.687
R² = 0.9819
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 5 10 15 20 25 30 35
Inib
içã
o d
o D
PP
H (
%)
Concentração do extrato (µg/mL)
Inibição 30 min
Inibição 60 min
Linear 30 min
Resultados e Discussão
78
para NB. Esses fatos levam a acreditar que o cloridrato de pilocarpina realmente não
apresenta capacidade antioxidante e que a atividade encontrada de P1 a P7 foi
decorrente dos componentes da própria nanoemulsão.
Tabela 21: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60 minutos,
apresentada pelas nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina, de P1 a P6
Amostra Concentração de
pilocarpina
Inibição 30
minutos (%)
Inibição 60
minutos (%)
P1 6 µg/ mL 28,18 28,25
P2 12 µg/ mL 27,89 28,15
P3 30 µg/ mL 26,42 27,48
P4 60 µg/ mL 28,48 29,12
P5 120 µg/ mL 26,72 27,28
P6 300 µg/ mL 27,30 27,61
As nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina apresentaram atividade
antioxidante dependente da concentração de extrato na formulação (Tabela 22). Os
valores encontrados de EP1 a EP4 foram muito semelhantes aos encontrados para as
formulações que apresentavam as mesmas quantidades de EEB.
Tabela 22: Capacidade de inibição do radical DPPH, observada após 30 e 60 minutos,
apresentada pelas nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina, de EP1 a EP4
Amostra Concentração
de EEB
Concentração
de pilocarpina
Inibição 30
minutos (%)
Inibição 60
minutos (%)
EP1 6 µg/ mL 6 µg/ mL 32,29 33,41
EP2 12 µg/ mL 6 µg/ mL 37,07 39,75
EP3 12 µg/ mL 12 µg/ mL 36,28 38,43
EP4 30 µg/ mL 30 µg/ mL 68,91 70,14
Esses resultados confirmam que a atividade antioxidante encontrada é relativa
apenas ao EEB e ao potencial da nanoemulsão com óleo de girassol. Sendo assim, caso
a pilocarpina apresente uma atividade radioprotetora, esse efeito deverá ser atribuído a
mecanismos não relacionados à atividade antioxidante.
A manutenção da elevada capacidade antioxidante do extrato e do potencial do
óleo de girassol, pelas formulações, contribui para que concentrações com baixa
toxicidade sejam eficazes. Esses resultados, associados às propriedades descritas para as
nanoemulsões, o EEB e o cloridrato de pilocarpina, permitem esperar que esses
sistemas sejam potenciais radioprotetores para uso tópico.
Resultados e Discussão
79
Além disso, a atividade encontrada e os dados de citotoxicidade permitem
sugerir que os ativos estão sendo liberados das nanoemulsões para exercerem suas
funções. Essas informações auxiliam na definição das concentrações a serem utilizadas
nos testes in vivo, desenvolvidos futuramente. Assim, torna-se possível uma melhor
seleção de doses que serão eficazes e não tóxicas, tanto para os testes em animais,
quanto para os ensaios realizados com humanos submetidos à radioterapia.
Conclusão
Conclusão
81
6. CONCLUSÃO
O EEB das folhas de Melaleuca leucadendron foi obtido com bom rendimento e
apresentou elevado teor de compostos fenólicos.
O óleo de girassol e o EEB apresentaram elevada capacidade antioxidante e
foram considerados bons componentes para formulações com esperada ação
radioprotetora.
O cloridrato de pilocarpina não possui atividade antioxidante. Caso apresente
potencial radioprotetor, como tem sido descrito, deve-se a outro mecanismo de ação.
Utilizando monoestearato de sorbitano e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado
associados ao óleo de girassol foram alcançadas emulsões estáveis, com tamanho e IP
característicos de sistemas nanoestruturados.
As formulações desenvolvidas com extrato e/ou pilocarpina apresentaram
propriedades características de nanoemulsões e se mantiveram estáveis por 60 dias,
mesmo após condições de estresse.
Toxicidade inferior a 20 % foi observada nas nanoemulsões com concentrações
totais dos ativos inferiores a 500 µg/ mL, podendo-se esperar que em concentrações
abaixo desse valor a utilização tópica não deverá causar irritação considerável à pele.
As nanoemulsões mantiveram a capacidade antioxidante do óleo de girassol e do
EEB livres. Porém, uma pequena redução de potencial foi observada.
As concentrações em que houve baixa toxicidade e boa eficácia poderão ser
utilizadas como base para definir as análises desenvolvidas futuramente.
As propriedades encontradas para as nanoemulsões obtidas com EEB e/ou
cloridrato de pilocarpina permitem pressupor que esses sistemas sejam potenciais
radioprotetores para uso tópico.
Perspectivas
Perspectivas
83
7. PERSPECTIVAS
Em estudos posteriores, pretende-se isolar e identificar as principais substâncias
do EEB de Melaleuca leucadendron, responsáveis pela atividade antioxidante e por
outras atividades biológicas relacionadas à radioproteção. Assim, contribuindo para
aumentar ainda mais o potencial radioprotetor tópico.
Espera-se desenvolver estudos mais detalhados de toxicidade, em linhagens de
células mais semelhantes às células da pele, com a finalidade de avaliar com clareza os
riscos do uso tópico das nanoemulsões contendo EEB e/ou cloridrato de pilocarpina.
Realizar ensaios de liberação e de permeação in vitro, para determinar quanto
dos princípios ativos está sendo liberado da formulação e sua capacidade de permeação
cutânea.
Com a finalidade de confirmar a capacidade radioprotetora tópica das
nanoemulsões desenvolvidas, assim como determinar outros possíveis mecanismos
envolvidos nessa ação, destaca-se a necessidade de efetuar novas análises in vitro e
também estudos in vivo. Sendo os ensaios in vivo inicialmente com animais e,
posteriormente, avaliando humanos em tratamento radioterápico.
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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