ministério da saúde instituto nacional de câncer ... · • aos pacientes e seus familiares, por...

PRISCILA PEREIRA SENA

Diagnóstico Molecular de Mutações no Gene RB1 em Pacientes com Retinoblastoma e

seus Familiares: Implicações para o Aconselhamento Genético.

Orientadores: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino

RIO DE JANEIRO 2013

Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu

i

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-graduação em oncologia

PRISCILA PEREIRA SENA Diagnóstico Molecular de Mutações no Gene RB1 em Pacientes com Retinoblastoma e seus Familiares: Implicações para o Aconselhamento Genético.

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Oncologia

Orientadores: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino

RIO DE JANEIRO 2013


S474d Sena, Priscila Pereira.

Diagnóstico molecular de mutações no gene RB1 em pacientes

com retinoblastoma e seus familiares : implicações para o

aconselhamento genético. / Priscila pereira Sena. – Rio de Janeiro, 2013.

xii, 62 f.: il.

Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de

Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2013.

Orientadores: Fernando Regla Vargas e Cibele Rodrigues

Bonvicino.

1. Retinoblastoma - genética. 2. Genes do Retinoblastoma.

3. Mutação. 4. Deleção Cromossômica. Cromossomos Humanos Par 13 -

genética. 5. Técnicas de Amplificação de Ácido Nucleico. 6.

Aconselhamento Genético. I. Regla Vargas, Fernando (orient.). II. Bonvicino,

Cibele Rodrigues (orient.). III. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes

da Silva. III. Título.

CDD 616.994042

ii

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-graduação em oncologia

AUTOR: PRISCILA PEREIRA SENA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MUTAÇÕES NO GENE RB1 EM PACIENTES COM RETINOBLASTOMA E SEUS FAMILIARES: IMPLICAÇÕES P ARA O

ACONSELHAMENTO GENÉTICO.

ORIENTADORES: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas

Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino

Aprovada em:__/__/___

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Fernando Regla Vargas (Presidente) Profa. Dra. Iêda Maria Orioli Profa. Dra. Beatriz de Camargo Profa. Dra. Esther Alicia Rocio Hassan Prof. Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Prof. Dr. Juan Clinton Llerena Junior

RIO DE JANEIRO 2013


iii

Dedico este trabalho ao Kássio Lago Melo (in memorian), como um pedido de desculpas por não ter trabalhado a tempo na descoberta da cura para sua calvície precoce.

iv

Agradecimentos:

• Aos pacientes e seus familiares, por me permitirem a realização deste

trabalho;

• Aos meus professores da pós-graduação, pela transmissão de seus

conhecimentos;

• Ao Dr. Hector, chefe do Laboratório de Genética do Instituto Nacional de

Câncer, pelo espaço cedido e pela disponibilidade de reagentes, materiais e

equipamentos;

• Aos meus orientadores, Fernando Regla Vargas e Cibele Rodrigues

Bonvicino, por terem confiado a mim o projeto e acreditado na minha

capacidade de execução da tarefa;

• A Leila Cabral e Leila Monnerat, por não hesitarem em ajudar sempre que

precisei;

• Aos funcionários do laboratório de genética, pela manutenção da ordem;

• Ao Ministério da Saúde/INCA, pelo suporte financeiro;

• A Shay, Mirela, Raquel, Morgana, Hanna, Marionzinha e Raissa, por todas as

risadas e também pelos momentos de seriedade. Amo vocês;

• A Carol e Livinha, pelas gordices, fashionices e divagações sobre os

acontecimentos da vida;

• A todos os meus amigos da genética, em especial o Régis (meu pupilo!), por

tudo que passamos juntos diariamente;

• Ao William e ao Marcelo (Doca), por me transmitirem paz e tranquilidade;

• Aos meus amigos em geral, por compreenderem minha ausência nos eventos

sociais;

• A minha família, por estar comigo em tudo, para tudo, para sempre.

v

Sumário

LISTA DE FIGURAS...................................................................................................vi

LISTA DE TABELAS..................................................................................................vii

LISTA DE ANEXOS...................................................................................................viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.......................................................................ix

RESUMO.....................................................................................................................xi

ABSTRACT.................................................................................................................xii

INTRODUÇÃO.............................................................................................................1

OBJETIVOS...............................................................................................................14

MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................15

RESULTADOS...........................................................................................................22

DISCUSSÃO..............................................................................................................33

CONCLUSÕES..........................................................................................................46

REFERÊNCIAS..........................................................................................................47

vi

Lista de figuras

Figura 1.1. Estrutura do olho humano..........................................................................2

Figura 1.2. Teoria dos dois eventos mutacionais.........................................................5

Figura 1.3. Representação da interação entre p16INK4a, CDK4/6 e pRB..................8

Figura 1.4. Estimativa de riscos em retinoblastoma...................................................12

Figura 3.1. Ilustração do funcionamento da técnica de MLPA...................................16

Figura 3.2. Região do cromossomo 13 abrangida pelo FISH....................................20

Figura 4.1. Porcentagem de amostras avaliadas no estudo pelo método de MLPA, segundo a lateralidade do tumor................................................................................22

Figura 4.2. Fluxograma da condução do estudo........................................................22

Figura 4.3. Distribuição do número de pacientes analisados por MLPA e a presença ou não de mutação em relação à lateralidade do tumor............................................23

Figura 4.4. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1................................................................................................23

Figura 4.5. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 22 do gene RB1 da amostra INCA – T2................................................................................................24

Figura 4.6. Figura representativa da deleção evidenciada nos éxons 10 e 11 do gene RB1 da amostra INCA – B6........................................................................................24

Figura 4.7. Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus RCBTB2 evidenciada na amostra HCPA – NI1..........................................................25

Figura 4.8: Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus ITM2B evidenciada na amostra HSM – B3............................................................................25

Figura 4.9. Figura representativa da deleção do lócus ITM2B e das regiões do promotor e éxon 1 do gene RB1, evidenciada na amostra INCA – B8......................26

Figura 4.10. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – B7, abrangendo os loci ITM2B, CHC1L e DLEU1, além do gene RB1.............................................................................................................................26

vii

Figura 4.11. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U26, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................27

Figura 4.12. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................27

Figura 4.13. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B4, abrangendo o locus ITM2B e o gene RB1.................................28

Figura 4.14. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B6, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................28

Figura 4.15. Eletroferograma da amostra INCA – T1.................................................29

Figura 4.16. Resultado do bandeamento GTG da amostra INCA – U28...................29

Figura 4.17. Resultado do FISH da amostra INCA – B7............................................30

Figura 4.18. Resultado do bandeamento GTG da amostra INCA – B7.....................30

Figura 4.19. Sobrevida em 60 meses de acompanhamento em relação ao tipo de mutação observada....................................................................................................32

Figura 5.1. Estrutura do RB1 e correspondência éxon/proteína................................34

Lista de tabelas

Tabela 1.1. Classificação Internacional para o Retinoblastoma intraocular.................3

Tabela 1.2. Resumo das modificações pós-traducionais que podem ocorrer na proteína pRb.................................................................................................................9

Tabela 3.1. Caracterização das amostras obtidas para o estudo..............................15

Tabela 4.1. Resultados das análises moleculares e citogenéticas de 11 pacientes do estudo.........................................................................................................................31

Tabela 4.2. Estimativa de sobrevida dos pacientes em 60 meses............................32

Tabela 5.1. Distribuição das mutações germinativas e somáticas no gene RB1 em relação ao fenótipo dos pacientes..............................................................................43

viii

Lista de anexos

Anexo I: Cópias da aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Instituto Nacional de Câncer para o projeto intitulado “Estudos Citomoleculares em Retinoblastoma” e os Modelos de Consentimento Livre e Esclarecido....................................................55

Anexo II. Quadros das sondas presentes nos kits para MLPA..................................60

Anexo III. Instruções para montagem da placa e parâmetros do sequenciador para análise da reação de MLPA.......................................................................................62

ix

Lista de siglas e abreviaturas

ηg nanograma

°C graus Celsius

b base

BRI2 ≡ITM2B

CDKN2A gene cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CHC1L ≡ RCBTB2

COLS colaboradores

DLEU1 gene deleted in lymphocytic leukemia 1

DNA ácido desoxirribonucléico

dNTP trifosfato de desoxirribonucleotídeo

E2F elongation factor 2

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

EtOH etanol

Fig figura

g grama

GOD globo ocular direito

GOE globo ocular esquerdo

Graf figura

h hora

HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre

HSM Hospital Santa Marcelina

INCA Instituto Nacional de Câncer

ITM2B gene integral membrane protein 2B

Kb quilobase

KHCO3 hidrogenocarbonato de potássio

M molar

Mb megabase

MgCl2 cloreto de magnésio

min minuto

x

mL mililitro

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

mM milimolar

NaCl cloreto de sódio

NaOH hidróxido de sódio

NH4Cl cloreto de amônio

p16INK4a ≡CDKN2A

pb pares de base

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

pH potencial hidrogeniônico

pRB proteína retinoblastoma

RAN gene member RAS oncogene family

RB1 gene retinoblastoma 1

RCBTB2 gene regulator of chromosome condensation and BTB domain containing protein 2

RefSeq sequência referência depositada no GeneBank

RNA ácido ribonucléico

RNAm ARN mensageiro

rpm rotação por minuto

SDS dodecil sulfato de sódio

seg segundo

SNP single-nucleotide polymorphism

T.E. tris-EDTA

Tab tabela

TDF tetralogia de Fallot

Tris tris(hidroximetil)aminometano

ZHX2 gene zinc fingers and homeoboxes 2

µg micrograma

µL microlitro

xi

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MUTAÇÕES NO GENE RB1 EM PACIENTES COM RETINOBLASTOMA E SEUS FAMILIARES: IMPLICAÇÕES PARA O

ACONSELHAMENTO GENÉTICO.

Priscila Pereira Sena

O retinoblastoma (RB) é um tumor pediátrico com incidência anual de 12-27 casos por milhão no Brasil. O supressor tumoral RB1, principal gene relacionado à sua ocorrência, localiza-se em 13q14.2 e apresenta 27 éxons. A proteína RB atua na suspensão do ciclo celular através da ligação a fatores de transcrição da família E2F, prevenindo a entrada da célula na fase S. Portadores de mutações patogênicas constitutivas, germinativas ou embrionárias, tendem a desenvolver tumores bilaterais, e 15% dos portadores de RB unilateral também revelam mutações constitutivas. Em 5-15% dos casos ocorrem deleções citogenéticas em 13q14, envolvendo total ou parcialmente o gene RB1, resultando em uma desordem rara, denominada síndrome de deleção 13q, com presença ou não de RB, retardo do crescimento, microcefalia, dismorfia facial e defeitos congênitos no coração, fígado e rins. Para um paciente sem mutação germinativa, o risco de recorrência tumoral em seus irmãos e gerações subsequentes, bem como de tumores secundários é menor. Já em casos de pacientes que revelam mutações germinativas, é necessário investigar seus pais e irmãos, visto que aproximadamente 10% dos portadores de mutações são assintomáticos. O sequenciamento, apesar de ser o método de rastreamento de alterações mais utilizado, não é eficiente em detectar todos os eventos mutacionais. Com base em tais informações, nosso estudo objetivou investigar a presença de anormalidades constitutivas em RB1 e em 13q14, utilizando um método complementar, em amostras de pacientes com RB, a fim de reunir dados relevantes ao aconselhamento genético dessas famílias. Após a análise por sequenciamento direto dos 27 éxons de RB1, as amostras de DNA que não revelaram variantes genéticas foram submetidas à análise pelo método de MLPA. Amostras de pacientes recém-diagnosticados também foram analisadas por esse método. Foram empregadas 98 amostras de DNA; dessas, obtivemos resultados de 66. O MLPA revelou a presença de deleções totais ou parciais em sete pacientes, envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos. Em três casos, um único éxon ou éxons consecutivos de RB1 foram deletados e, em apenas um probando, a deleção ocorreu na região promotora e éxon 1. Os pacientes com alterações detectadas tiveram seus familiares estudados para as respectivas alterações. Em apenas uma família a mesma mutação foi observada em dois irmãos. Um deles desenvolveu retinoblastoma durante o estudo e o outro se encontra sob monitoramento clínico. A correlação genótipo-fenótipo confirmou, em dois casos, a suspeita clínica de síndrome da deleção 13q. Em outros três casos não houve relato clínico da de sinais sindrômicos,apesar da presença de uma grande deleção em 13q14 mostrada por MLPA, significando uma possível manifestação fenotípica branda da condição. Esses resultados sinalizam a importância de avaliar o probando e seus familiares utilizando um método complementar ao sequenciamento, visto que alterações constitutivas podem representar um risco de ocorrência tumoral em outros membros da família, bem como de tumores secundários ao RB. O MLPA mostrou-se eficiente no rastreamento de mutações e na identificação de alterações no número de cópias no lócus RB1, complementando a caracterização molecular dos pacientes e seus familiares envolvidos.

xii

MOLECULAR DIAGNOSIS OF MUTATIONS IN RB1 GENE IN RETINOBLASTOMA PATIENTS AND THEIR RELATIVES: IMPLICATIONS FOR GENETIC

COUNSELING. Priscila Pereira Sena

Retinoblastoma (RB) is a childhood tumor with an annual incidence of 12-27 cases per million in Brazil. The tumor suppressor RB1 is the major gene related to tumor occurrence is located at 13q14.2 and has 27 exons. The RB protein acts in cell cycle arrest by binding to E2F family of transcription factors, preventing S phase entry of the cell cycle. Carriers of germline or embryonic constitutional pathogenic mutations tend to develop bilateral tumors, and 15% of patients with unilateral RB also reveal constitutional mutations. Cytogenetic deletions in 13q14 chromosomal region occur in 5-15% of cases, involving the whole or part of RB1 gene, resulting in a rare disorder called 13q deletion syndrome, with RB development or not, growth retardation, microcephaly, facial dysmorphia, and birth defects in the heart, liver and kidneys. For a patient without a germline mutation, the risk of tumor recurrence in subsequent generations and their siblings, is lower, as well as the risk of secondary tumors. But for patients who reveal germline mutations, it is necessary to investigate their parents and siblings, as approximately 10% of mutation carriers are asymptomatic. Sequencing, besides being the most used method for mutational screening, is not efficient in detecting all the events. Based on this, our study aimed to investigate the presence of constitutional abnormalities in RB1 and 13q14, using a complementary method, in samples from patients with RB, in order to gather relevant data to genetic counseling. After analysis by direct sequencing of the 27 exons of RB1, DNA samples showing no variants were analyzed by MLPA method. Samples from newly diagnosed patients were also investigated by this method. We used 98 DNA samples; from these, we obtained results of 66. MLPA revealed the presence of complete or partial deletions in seven patients, involving the entire RB1 and contiguous genes. In three cases, a single exon or consecutive exons of RB1 were deleted, and in one proband, a deletion occurred involving the promoter region and exon 1. The families of affected patients were investigated for the variants identified in the probands. In only one family the same constitutive mutation was observed in two siblings. One of them developed retinoblastoma during this study and the other is under clinical monitoring. The genotype-phenotype correlation has confirmed, in two cases, clinical suspicion of 13q deletion syndrome. In other three cases there was no clinical report of suspected syndrome, despite the presence of a large deletion at 13q14 shown by MLPA, which could mean a mild phenotypic manifestation of the condition. These results indicate the importance of assessing the proband and their families using a complementary method of analysis, since constitutional changes may present a risk of tumor occurrence in other family members, as well as secondary tumors in RB patients. MLPA was an effective method for mutation and copy number variation screening, complementing the molecular characterization of patients and their relatives.

1

1. Introdução

O retinoblastoma é um tumor infantil que, apesar de raro, apresenta-se como

a malignidade intraocular mais comum da infância (SUCKLING E COLS., 1982). No

processo de desenvolvimento tumoral são acometidas células imaturas da retina e o

tumor pode ser diagnosticado desde o nascimento até, em geral, os cinco anos de

idade. Alguns casos esparsos de retinoblastoma em adultos jovens já foram

relatados (ZHANG E COLS., 2012). Nesses, o tumor pode se originar de uma lesão

benigna da retina (LOHMANN E GALLIE, 2004), denominada retinoma.

Clinicamente, essa lesão pode apresentar diferentes características: em alguns

casos, observa-se uma massa homogênea, acinzentada e translúcida, desde a

superfície da retina até a cavidade do humor vítreo (Fig. 1.1), com desvio da

irrigação sanguínea para a mesma; em outros, pode apresentar-se opaca e com

nódulos brancos (aparentemente calcificados). Pode-se ainda observar, em cerca de

61% dos casos de lesão, a migração e proliferação de pigmentos do epitélio da

retina em áreas ao redor dos nódulos (GALLIE E COLS., 1982). O desenvolvimento

tumoral pode acometer apenas um dos olhos (retinoblastoma unilateral, cerca de

60% do total de casos) ou ambos os olhos (retinoblastoma bilateral). Pacientes com

desenvolvimento tumoral em ambos os olhos, em geral, manifestam os sintomas

mais precocemente (14-16 meses) quando comparados aos pacientes com tumor

em apenas um dos olhos (29-30 meses) (DRAPER E COLS., 1992). Em alguns

casos de tumores unilaterais ou bilaterais o retinoblastoma encontra-se associado a

tumores neuroblásticos intracranianos, mais frequentemente ao pinealoblastoma,

tumor primário na glândula pineal de semelhanças histológicas com o retinoblastoma

(SINGH E COLS., 1999). Esses casos são denominados retinoblastoma trilateral,

porque a glândula pineal é considerada fotossensível em vertebrados inferiores

(ANTONELI E COLS., 2007).

2

Figura 1.1. Estrutura do olho humano. Retirada de http://www.klimanaturali.org/2011/03/olho-humano-estrutura-do-olho-humano.html. (Acessado em 11/03/2013).

O sintoma clínico comumente observado é o reflexo branco pupilar

(LOHMANN E GALLIE, 2004), mas outros sintomas menos indicativos do

desenvolvimento tumoral podem estar presentes, tais como estrabismo,

vascularização anormal da íris, inflamação e aumento da quantidade de fluido

intraocular (com conseqüente expansão do globo ocular), presença de sangue entre

a córnea e a íris, celulite orbital e exoftalmia. Existem ainda crianças que não

apresentam sintomas clínicos, apesar da presença de uma massa tumoral em

desenvolvimento (AERTS E COLS., 2006).

Estima-se que sejam diagnosticados 5000 novos casos de retinoblastoma no

mundo a cada ano (BASAVARAJAPPA E CORSON, 2012); no Brasil, as taxas de

incidência do tumor, ajustadas para a idade de zero a quatro anos, variam de 14.6

por milhão (em Salvador) a 27 por milhão, em Natal (DE CAMARGO, 2010).

O tratamento do retinoblastoma em países desenvolvidos é multimodal e

inclui a enucleação (retirada do globo ocular), radioterapia, quimioterapia,

braquiterapia e termoterapia, o que os permite atingir uma taxa de sobrevivência de

95% dos pacientes; nos países desenvolvidos da América Latina essas taxas

encontram-se entre 80 e 89% (HOUSTON E COLS., 2011). A estratégia de

tratamento a ser seguida depende de fatores como o comprometimento de um ou

3

ambos os olhos, o tamanho e a localização do tumor, o estágio da doença segundo

a classificação Reese-Ellsworth e a presença de doença extraocular (HOLLAND-

FREI E COLS., 2010).

A classificação Reese-Ellsworth para tumores oculares foi criada em 1960 e,

apesar de ainda ser muito utilizada, é falha em relação à presença de sementes

vítreas e subretinianas. Essa constatação promoveu o desenvolvimento de uma

nova classificação internacional, que abrange apenas tumores intraoculares,

conforme pode ser vista na tabela 1.1.

Tabela 1.1. Classificação Internacional para o Retinoblastoma (Rb) intraocular.

(Adaptada de Holland-Frei e colaboradores, 2010, e Houston e colaboradores, 2011).

Grupo Subgrupo Referências Características específicas

A - Tumor pequeno Rb ≤ 3mm

Tumor grande com uma ou mais

das características abaixo:

Rb > 3mm ou com uma ou mais das

características abaixo:

Localização macular ≤ 3mm da fovéola

Localização justapapilar ≤ 1.5mm do nervo óptico

B -

Fluido subretiniano adicional ≤ 3mm da margem tumoral

Sementes focais Rb com uma das características abaixo:

C1 Sementes subretinianas ≤ 3mm

C2 Sementes vítreas ≤ 3mm C

C3 Sementes subretinianas e vítreas ≤ 3mm

Sementes difusas Rb com uma das características abaixo:

D1 Sementes subretinianas > 3mm

D2 Sementes vítreas > 3mm D

D3 Sementes subretinianas e vítreas > 3mm

Rb extenso ocupando > 50% do globo

ocular ou com qualquer das características

abaixo:

Opacidade por hemorragia na câmara

anterior, vítreo ou espaço subretiniano E

-

Retinoblastoma extenso

Invasão do nervo óptico pós laminar, > 2mm

da coroide, esclera, órbita ou câmara

anterior

4

1.1. Genética, epigenética e citogenética do retino blastoma

O desenvolvimento tumoral está relacionado, primariamente, à ocorrência de

dois eventos mutacionais em ambos os alelos do gene supressor tumoral

“retinoblastoma 1” (RB1) de uma mesma célula. Na ausência da atividade normal do

gene RB1, há um acúmulo de instabilidade genômica e aberrações cromossômicas,

o que permite a iniciação, promoção e metástase tumorais (DI FIORE E COLS.,

2013). O gene recebe esse nome por ter sido identificado com alta frequência de

mutações em uma família com casos recorrentes de retinoblastoma, mas alterações

em sua função são associadas também a outros tipos de câncer (senão todos), tais

como osteossarcoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores de próstata e

mama, (HARBOUR, 2001), cérebro e cavidade oral, doença de Hodgkin e melanoma

(DI FIORE E COLS., 2013).

A teoria dos dois eventos mutacionais no gene RB1 foi proposta por Knudson

em 1971 e nos diz que pacientes com predisposição ao desenvolvimento tumoral

receberam a primeira mutação via células germinativas e, portanto, bastaria a

ocorrência de um segundo evento, agora somático, em uma célula retiniana para

que ela se transformasse. Nos casos não hereditários, ambos os eventos

mutacionais ocorrem em uma mesma célula somática da retina em desenvolvimento,

como pode ser visto na figura 1.2 (KNUDSON, 1971).

5

Figura 1.2. Teoria dos dois eventos mutacionais proposta por Knudson. Adaptada de

Holland-Frei (2010).

A maioria das mutações constitutivas encontradas no gene RB1 é a

substituição de um ou alguns poucos pares de bases (LOHMANN E COLS., 1996);

muitas dessas substituições são transições de citosina para timina (C>T). Porém,

cerca de 15% dos casos hereditários revelam grandes deleções no gene RB1

(LOHMANN, 1999) e deleções citogenéticas na banda 13q14 correspondem a 3% -

5% dos mesmos (HARBOUR, 1998). Análises citogenéticas de linfócitos

demonstram a ocorrência de deleções submicroscópicas e rearranjos envolvendo a

região 13q14 em 7,5-8% dos pacientes com retinoblastoma bilateral e 1-4,9% dos

pacientes com retinoblastoma unilateral esporádico (um caso esporádico é a

primeira – e até então única - ocorrência daquele tumor observada na família).

Pequenas deleções também são observadas em cerca de 10% dos pacientes com

retinoblastoma bilateral (LOHMANN, 1999).

Corson e colaboradores, em 2007, observaram que os dois eventos

mutacionais, apesar de necessários à iniciação do desenvolvimento tumoral, não

Retinoblastoma hereditário Retinoblastoma esporádico

6

são as únicas alterações genômicas no retinoblastoma. Algumas mudanças

subsequentes, como ganhos em 1q, 2p, 6p e 13q e perda em 16q, foram propostas

como cruciais para a progressão tumoral, não somente nos casos de retinoblastoma,

mas também em outros tipos de câncer (CORSON E COLS., 2007). Em 1999, Jones

e Laird propuseram um modelo expandido dos dois eventos mutacionais, para incluir

o silenciamento epigenético como um mecanismo de tumorigênese. Mais

recentemente outros estudos identificaram alterações epigenéticas que poderiam

contribuir para a progressão tumoral, tais como hipermetilação dos genes MGMT,

RB1, MSH6, PAX5, CD44, GATA5, TP53, VHL e GSTP1. Esses genes pertencem a

vias de reparo do DNA, senescência e apoptose, regulação transcricional,

degradação proteica, interação célula-célula, adesão e migração celulares (LIVIDE E

COLS., 2012).

Em 75% dos casos hereditários de retinoblastoma, a mutação no gene RB1 é

de novo, o que significa que ela ocorreu em algum período do desenvolvimento

embrionário do paciente (HOLLAND-FREI E COLS., 2010). Portanto o histórico

familiar do paciente não é suficiente para identificação de um caso hereditário,

sendo necessário o screening genético do mesmo, a fim de se identificar mutações

constitutivas.

Nas famílias que apresentam retinoblastoma recorrente, cerca de 90% dos

indivíduos que carregam a mutação desenvolvem o tumor, o que revela alta

penetrância da mesma, e os afetados podem desenvolver múltiplos tumores

bilaterais, significando uma alta expressividade. Entretanto, em algumas famílias,

portadores de mutação em RB1 não desenvolvem o tumor (penetrância reduzida) e

alguns indivíduos afetados têm apenas retinoblastoma unilateral ou retinocitomas

benignos. Muitos mecanismos foram propostos para explicar o retinoblastoma de

baixa penetrância, tais como fatores imunológicos, padrão de metilação do DNA,

mecanismos epigenéticos, eventos mutacionais tardios, fatores individuais de

resistência e atividade de genes moduladores (HARBOUR, 2001). Os mecanismos

moleculares recorrentes em famílias que apresentam retinoblastoma de baixa

penetrância foram divididos em classes 1 e 2. As mutações de classe 1 (que

ocorrem na região promotora e em sítios de splicing), não alteram estrutural ou

funcionalmente a proteína do retinoblastoma (pRB), mas causam uma redução dos

níveis de expressão da proteína normal. Já as mutações de classe 2 não

necessariamente reduzem os níveis de expressão da proteína mas, por afetarem a

7

região codificante do gene, podem originar uma proteína mutante, parcialmente

inativada (HARBOUR, 2001).

Se o primeiro evento mutacional em RB1 ocorrer durante a embriogênese, o

paciente pode apresentar mosaicismo para o mesmo e o grau de células afetadas

dependerá da época do desenvolvimento em que houve o defeito genético (SIPPEL

E COLS., 1998). O retinoblastoma familial corresponde a cerca de 10% do total de

casos (LOHMANN E GALLIE, 2004) e as famílias afetadas têm predisposição ao

desenvolvimento de outros tumores além de retinoblastoma, tais como sarcomas

ósseos e de tecidos moles, melanoma, tumores cerebrais, doença de Hodgkin,

câncer de pulmão, leiomiossarcoma uterino, câncer de mama e tumores de

glândulas salivares e mucosa oral (DI CIOMMO E COLS., 2000; FRANCIS E COLS.,

2012); o osteossarcoma é o tumor secundário mais comum, com uma incidência

1000 vezes maior nos casos hereditários (DI FIORE E COLS., 2013).

O gene RB1 é um supressor tumoral que consiste em 27 regiões

codificadoras de proteína, dispersas em 183 Kb de sequência genômica, localizado

no braço longo do cromossoma 13, na região 13q14.2 (LOHMANN E GALLIE, 2004).

Sua proteína correspondente (pRb) contém 928 resíduos de aminoácidos (SELLERS

E KAELIN, 1997) e é responsável por regular o ciclo celular, fato que explica a perda

de expressão da mesma em diferentes tipos de tumor (CARRIÈRE E COLS., 2011).

Existem diferentes mecanismos capazes de desregular a pRb, como por exemplo as

já citadas mutações no gene RB1, hiperfosforilação e ligação da pRb a

oncoproteínas virais (REED E COLS., 2009). Nas células quiescentes ou no início

da fase G1 do ciclo celular, a pRb encontra-se hipofosforilada e associa-se a fatores

de transcrição da família “elongation factor 2”, (E2F - responsáveis pela regulação

da transição G1-S do ciclo), afim de reprimir a expressão de genes responsivos a

E2F, envolvidos na progressão do ciclo celular (HURFORD E COLS., 1997). Além

disso, também pode se ligar à região promotora de genes chave para a regulação da

proliferação celular e recrutar fatores remodeladores de cromatina, impedindo a

transcrição dos mesmos (LONGWORTH E DYSON, 2010).

Conforme a célula progride para a fase S, a pRb é fosforilada por enzimas

quinases dependentes de ciclina (Cdks), o fator E2F é liberado e a elevação desses

fatores de transcrição abre a origem de replicação do DNA, induzindo a transcrição

de genes da fase S (LOHMANN, 1999). Em caso de perda ou inativação da pRb, a

origem de replicação do DNA torna-se prontamente acessível, resultando em uma

8

transcrição descontrolada de genes da fase S e, consequentemente, em uma

progressão prematura do ciclo celular (LIAO E COLS., 2010).

Quando estudamos a proteína pRB, podemos perceber que sua

fosforilação/inativação é mediada pelas quinases dependentes de ciclina CDK4/6,

cuja superexpressão representa uma via de indução ao câncer (DI FIORE, 2013).

Diferentes estudos sugerem o envolvimento do gene CDK4 na tumorigênese;

dois deles são:

- Xiong e colaboradores, 1993 - demonstraram que a superexpressão de CDK4 pode

induzir o crescimento celular descontrolado e a transformação maligna;

- Wölfel e colaboradores, 1995 - identificaram, em casos de melanoma, uma

mutação somática no gene CDK4, cuja consequência para a proteína era impedir a

ligação da proteína CDKN2A (p16INK4a), inibidora de CDK4.

Além disso, a hipermetilação da região promotora do gene CDKN2A

(p16INK4a) promove uma diminuição do seu produto proteico, o que tem por

consequência a hiperfosforilação e inativação da pRB (INDOVINA E COLS., 2010).

Portanto, a alteração dos níveis de CDKN2A pode significar um novo marcador

hereditário de susceptibilidade ao desenvolvimento de retinoblastoma, sem alteração

constitutiva em RB1.

A figura 1.3 resume a rede de interações estabelecida entre as proteínas

pRB, CDKs e p16INK4a.

Figura 1.3. Representação esquemática da interação entre as proteínas p16INK4a, CDK4/6 e pRB. (Adaptada de Henley e Dick, 2012).

9

A proteína pRb sofre diversas modificações pós-traducionais e, algumas delas

(como a fosforilação por enzimas Cdks e p38 e a SUMOilação), por si só são

favoráveis à proliferação celular (conforme destacadas na tabela 1.2); outras, se

perturbadas, podem inviabilizar a regulação do ciclo celular pela via pRb.

Tabela 1.2. Resumo das modificações pós-traducionais que podem ocorrer na proteína pRb. (Retirada de Munro e colaboradores, 2012).

Sítio Modificação Enzima

responsável

Consequência funcional

S249 Fosforilação Cdk Transcrição

T356 Fosforilação Cdk Transcrição


p38 Degradação de pRb S567 Fosforilação

Cdk Transcrição

Chk1/Chk2 Aumento de ligação a E2F-1 S612 Fosforilação

Cdk Transcrição

K720 SUMOilação Ubc9 Impede a interação pRb/E2F-1



K810 Metilação Set7/9 Antagoniza a fosforilação de pRb




K860 Metilação Smyd2 Aumenta a repressão de pRb

K873 Acetilação P300, P/CAF Previne a fosforilação da pRb; promove a

diferenciação celular

Metilação Set7/9 Aumenta a repressão de pRb

K874 Acetilação P300, P/CAF Previne a fosforilação da pRb; promove a

diferenciação celular

1.2. Síndrome da Deleção 13q

A síndrome da deleção 13q é uma anomalia cromossômica rara, causada

pela perda parcial do cromossomo 13 e teve seus sinais clínicos primeiramente

estabelecidos em 1969, por Allderdice e colaboradores. Tais características clínicas

incluem retardo do crescimento, microcefalia, dismorfia facial e defeitos congênitos

10

no coração, fígado e rins, podendo ou não estar associados ao retinoblastoma

(QUÉLIN E COLS., 2009).

A síndrome de deleção 13q é dividida em três grupos, baseados no tamanho

e na localização da deleção: o grupo 1 engloba as deleções da região cromossômica

proximal à banda 13q32, cujos portadores apresentam retardo mental leve a

moderado, dismorfias variadas e retardo no crescimento; o grupo 2 é referente a

deleções na banda cromossômica 13q32 e seus portadores desenvolvem uma ou

mais malformações, incluindo microcefalia severa e malformações do cérebro e

tratos gastrointestinal e genitourinário (MITTER E COLS., 2011); já o grupo 3

engloba deleções distais às bandas 13q33-34, cujos pacientes apresentam apenas

baixo desenvolvimento intelectual, raramente associado a outras malformações

(BROWN E COLS., 1995; HUANG E COLS., 2012).

1.3. Aconselhamento Genético em Retinoblastoma

O aconselhamento genético é o processo de comunicação que lida com os

problemas associados à ocorrência ou ao risco de ocorrência de determinada

desordem genética em uma família. Esse processo visa ajudar o indivíduo e a

família a entender: 1) os fatos médicos (incluindo o diagnóstico, o provável curso da

doença e os métodos de tratamento disponíveis); 2) a importância da

hereditariedade e de que forma ela contribui para o risco de recorrência da doença

na família; 3) as alternativas disponíveis mediante esse risco e 4) a escolha do que é

mais apropriado, de forma não diretiva, mas em vista de um risco real e da posição

ética e religiosa da família (EPSTEIN E COLS., 1975).

As ferramentas utilizadas pelo conselheiro genético vão desde o exame físico

e conhecimento do histórico familiar do paciente, passando por análises genéticas e

citogenéticas laboratoriais, até a divulgação dos resultados e a ajuda à família para o

entendimento da situação, o que exige o envolvimento de uma equipe

multiprofissional, composta não somente por médicos especializados na clínica e na

genética da doença, mas também de profissionais da área biomédica com

experiência em laboratório, enfermeiros e psicólogos para lidar com as implicações

emocionais e o estresse social advindos do processo de aconselhamento

(NUSSBAUM E COLS., 2007).

11

O Programa de Aconselhamento Genético em Retinoblastoma do Instituto

Nacional de Câncer foi criado em 2002, tendo em vista o risco real de casos

hereditários da doença e a evidência de casos de retinoblastoma familial,

representados por algumas famílias em tratamento na instituição. Inicialmente, a

consulta é feita ao paciente e seus familiares de primeiro grau (pais e irmãos), para

a coleta de informações do histórico familiar de câncer e outras doenças genéticas.

Na primeira consulta é coletado sangue periférico do paciente, para que seu material

genético seja analisado quanto a presença de alterações hereditárias que possam

estar relacionadas à ocorrência do retinoblastoma; caso alguma alteração seja

observada, os pais e irmãos são novamente chamados à consulta, para coleta de

material para análise. Então a alteração genética observada no paciente é

pesquisada no DNA dos seus progenitores e irmãos menores de cinco anos de

idade.

Considerando a história natural da doença, o aconselhamento genético em

retinoblastoma atua na prevenção secundária, visto que o objetivo é detectar

precocemente novos casos da doença na família, bem como de outros tumores no

paciente, além de orientá-los mediante a possibilidade de uma alteração genética

ser passada à geração seguinte.

Para a estimativa de risco sem o resultado genético, são levados em

consideração o histórico familiar do paciente e a literatura do retinoblastoma.

Portanto, como a quase totalidade dos casos bilaterais apresenta mutação

germinativa e cerca de 15% dos casos unilaterais também apresentam mutação

germinativa, levando-se em consideração que essa mutação apresenta uma

herança autossômica dominante e penetrância de 90% (VALVERDE E COLS.,

2005), a predição de risco sem o teste genético nos daria as proporções mostradas

na figura a seguir:

12

Figura 1.4. Estimativa de riscos em retinoblastoma com base na literatura e histórico

familiar. Adaptada de Abramson e Schefler (2010).

O problema de uma estimativa de risco sem o conhecimento da genética do

paciente reside no fato de que os pacientes unilaterais com mutações germinativas

não são clinicamente distinguíveis daqueles que não têm mutação, representando

um risco para seus descendentes de 45% de desenvolvimento do tumor. Além disso,

a mutação não diagnosticada pode ter sido herdada por esse paciente via células

germinativas dos pais e, portanto, não somente seus descendentes, mas também

seus irmãos subsequentes encontram-se sob risco de um desenvolvimento tumoral.

1.4. Amplificação multiplex de sondas dependentes de ligação:

a técnica de MLPA.

A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi

primeiramente descrita em 2002 (SCHOUTEN E COLS., 2002) e consiste na

amplificação de sondas, complementares às regiões do DNA que se deseja analisar,

a fim de se avaliar o número de cópias dessas regiões presentes no genoma. Com

essa metodologia, é possível ser feita a quantificação relativa de até 50 regiões de

interesse em apenas uma reação de PCR (Polymerase Chain Reaction), o que

facilita a análise do gene RB1, visto que o sequenciamento de seus 27 éxons é

bastante demorado e dispendioso.

Cada sonda do conjunto de reagentes é composta por duas partes. Uma das

partes contém um trecho complementar a uma região do DNA e uma seqüência de

reconhecimento do primer, e a outra parte de cada sonda é formada por: (1) um

13

trecho complementar a uma região do DNA adjacente à região que pareia com a

primeira parte da sonda, (2) uma sequência alongadora, diferente para cada sonda,

o que permite que as mesmas sejam identificadas pelo tamanho, e (3) uma região

de reconhecimento para o outro primer do par. Quando as duas partes de uma

mesma sonda hibridizam no DNA, uma enzima ligase une as duas pontas

adjacentes; em seguida, as sondas são separadas do DNA e amplificadas, para

posterior quantificação das cópias resultantes.

A quantificação das cópias é feita em sequenciador automático, que gera um

gráficode picos para cada amostra; cada pico corresponde à quantificação relativa

do número de cópias observado de cada sonda. Os dados numéricos de altura e

área do gráfico são extraídos do sequenciador e analisados em um software que,

por sua vez, fornece um gráfico de barras em que cada barra corresponde a uma

sonda do conjunto de reagentes. Se a barra se encontra entre os valores 0.7 e 1.3

do eixo das ordenadas, significa que a região do DNA em que aquela sonda

hibridiza encontra-se em um número normal de cópias (dois alelos presentes).

Valores acima de 1,35 indicam uma possível duplicação da região; valores abaixo de

0,65 indicam a provável perda daquela região em um dos alelos.

14

2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

Detectar, por MLPA, alterações no número de cópias de sequências alvo no gene

RB1 e na região 13q14 em pacientes com retinoblastoma e seus familiares de até 3º

grau (se possível), e comparar a sobrevida dos pacientes com grandes alterações a

dos pacientes com mutações de ponto.

2.2. Objetivos específicos

• Investigar, através da utilização de sondas (método de MLPA), a existência de

grandes deleções ou duplicações germinativas no gene RB1 e na região

13q14 em amostras de pacientes com retinoblastoma, cujos seqüenciamento

direto do gene RB1 e análise pela técnica de SSCP (Single-Strand

Conformation Polymorphism), já realizados por membros do nosso grupo,

tenham apresentado resultados negativos para alterações patogênicas;

• Para as novas amostras enviadas ao laboratório, fazer o rastreamento inicial

de alterações através da técnica de MLPA;

• Validar, quando possível, as alterações evidenciadas pelo método de MLPA,

através da utilização de outros recursos disponíveis no laboratório, tais como

técnicas de citogenética e sequenciamento direto;

• Investigar a presença dessas alterações em outros membros da família do

paciente, como portadores assintomáticos da alteração;

• Comparar a sobrevida em 60 meses de acompanhamento dos pacientes com

grandes alterações em 13q14 em relação aos pacientes com mutações

pontuais em RB1;

• Reunir dados relevantes para o aconselhamento genético dos pacientes e

seus familiares.

15

3. Material e métodos

Este trabalho é parte de um projeto maior, intitulado “Estudos Citomoleculares

em Retinoblastoma”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto

Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. A cópia da aprovação, bem como

o modelo de Consentimento Livre e Esclarecido, constam no anexo I, ao fim do

documento.

3.1. Descrição do grupo de estudo

Como critérios de inclusão, foram considerados pacientes portadores de

retinoblastoma encaminhados ao Programa de Aconselhamento Genético em

retinoblastoma do Instituto Nacional de Câncer (INCA) desde seu início, cuja análise

prévia dos 27 éxons do gene RB1, realizada em amostras de DNA extraídas a partir

de sangue periférico, foi negativa para alterações patogênicas. Além desses, foram

incluídos pacientes com RB recém-diagnosticado, provenientes de três instituições

diferentes: Hospital Santa Marcelina (HSM – São Paulo), Hospital de Clínicas de

Porto Alegre (HCPA – Porto Alegre) e INCA, Rio de Janeiro, admitidos no programa

durante o período de janeiro de 2011 a agosto de 2012. Dados clínicos dos

pacientes do INCA foram coletados de seus prontuários (idade ao diagnóstico,

lateralidade do tumor, estadiamento, histórico familiar, status do paciente – segundo

o último registro de consulta – e enucleação). Os prontuários médicos foram

revisados pela última vez em 30/11/12. Para os pacientes do HCPA e HSM, a

reunião de dados clínicos foi feita conforme informações enviadas pelos respectivos

hospitais. Os pais e irmãos do probando também foram analisados para os casos

em que foram encontradas alterações no gene RB1 e na região 13q14. Um total de

noventa e oito pacientes pôde ser reunido (Tab. 3.1).

Tabela 3.1. Caracterização das amostras obtidas para o estudo.

Lateralidade do tumor Instituição de Origem

Unilateral Bilateral Trilateral Desconhecida Total

INCA 45 21 2 - 68

HCPA 9 3 2 1 15

HSM 9 6 - - 15

Total 63 30 4 1 98

16

3.2. Análise de variação do número de cópias

Por não terem sido detectadas mutações no gene RB1 dos pacientes

previamente analisados pelo grupo de retinoblastoma e, concomitante ao

sequenciamento direto do gene RB1 feito para as amostras recém admitidas no

programa, utilizou-se o conjunto de reagentes “SALSA MLPA KIT P047 RB1” (MRC-

Holland), segundo o protocolo do fabricante, salvo modificações descritas em SENA,

2010. A figura 3.1 a seguir ilustra o funcionamento da técnica.

Figura 3.1. Ilustração do funcionamento da técnica de MLPA. Adaptada de Schouten e colaboradores (2002).

Foram utilizadas duas versões do conjunto de reagentes “SALSA MLPA KIT

P047 RB1” (Anders Nygren & Jan Schouten, MRC-Holland); o estudo começou com

o uso da versão B1, mas, durante o desenvolvimento do trabalho, os fabricantes

lançaram uma nova versão (C1) do conjunto de reagentes, que trouxe a substituição

17

de algumas sondas e o acréscimo de outras. Os quadros com as sondas presentes

em cada versão encontram-se no anexo II.

3.2.1. Reação de desnaturação (1º dia)

As amostras foram precipitadas em etanol e diluídas em T.E. (10mM de TRIS

pH8 + 0,1mM de EDTA pH8); o material obtido foi quantificado e diluído, de modo a

se obter a concentração de 20ηg/µL. Foram distribuídos 5 µL de amostra em tubos

de 0,2 µL, para a concentração final de 100 ηg de DNA; os tubos foram colocados

no termociclador e desnaturados a 98ºC por 25min.

3.2.2. Reação de hibridização (1º dia)

Foi preparada uma mistura contendo 1,5 µL do reagente SALSA MLPA buffer

+ 1,5 µL do reagente SALSA probemix para cada amostra e, quando o termociclador

atingiu a temperatura de 25ºC, foram adicionados 3,0 µL da mistura a cada amostra,

pipetando repetidas vezes; em seguida foi dada continuidade ao programa do

termociclador: as amostras foram incubadas a 95ºC por 1min, seguidos de 18h a

60ºC para hibridização das sondas.

3.2.3. Reação de ligação (2º dia)

Foi preparada a mistura da enzima Ligase-65, contendo os seguintes

reagentes para cada reação: 3 µL da Ligase-65 buffer A + 3,0 µL da Ligase-65 buffer

B + 25,0 µL de água milliQ + 1,0 µL da Ligase-65, sempre pipetando diversas vezes

para homogeneização da mistura. Após as 18h de hibridização, a temperatura do

termociclador foi reduzida a 54ºC e, a cada reação, foram adicionados 32,0 µL da

mistura da Ligase-65, pipetando lentamente. Dada continuidade ao programa do

termociclador, as amostras passaram por 15min de incubação a 54ºC (para ligação

das duas partes de cada sonda hibridizada), seguidos de 5min a 98ºC (para

inativação da Ligase-65) e redução final da temperatura a 4ºC.

3.2.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Foi preparada uma mistura contendo, para cada reação: 7,5 µL de água milliQ

+ 2,0 µL do SALSA PCR primer mix + 0,5 µL de SALSA polymerase. A mistura foi

pipetada vigorosamente para homogeneização e mantida no gelo; foram

adicionados 10 µL da mistura a cada amostra, à temperatura ambiente. A reação de

18

PCR foi iniciada imediatamente, seguindo o programa no termociclador: 35 ciclos de

30seg a 95ºC, 30seg a 60ºC, 60seg a 72ºC, incubação final de 20min a 72ºC e

redução da temperatura para 15ºC, indicando o final da reação. Após a retirada do

termociclador, as reações foram diluídas e distribuídas em uma placa para análise

no seqüenciador. A diluição foi de 1:10 (1 µL da reação de PCR em 9 µL de água

milliQ). Em seguida, uma placa contendo as amostras foi colocada no seqüenciador

automático ABI-3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As instruções de

montagem da placa e os parâmetros utilizados no seqüenciador constam no anexo

III.

Os dados foram extraídos do seqüenciador com auxílio do programa

GeneMapper; a seleção dos controles para comparação com os pacientes foi feita

no programa Peak Scanner Software V1.0 e a obtenção do resultado final ocorreu

com o uso do software Coffalyser, conforme recomendação do fabricante dos

conjuntos de reagentes utilizados neste trabalho.

3.3. Análise citogenética: bandeamento GTG e FISH

Alguns resultados positivos para alteração puderam ser confirmados por

metodologias já disponíveis no laboratório; então, além do MLPA, também foram

utilizados os métodos de análise citogenética de cariotipagem e FISH (Fluorescence

In Situ Hybridization).

Para que fossem possíveis as análises citogenéticas, os pacientes foram

novamente chamados ao hospital, para coleta de sangue periférico em tubo

contendo heparina. Os cromossomos metafásicos foram obtidos a partir de linfócitos

de sangue periférico, segundo recomendações de Moorhead e cols. (1960), com

modificações de Bender (1965). Os casos foram analisados via bandeamento GTG

(G = Giemsa, T = Tripsina, G = banda G) (SEABRIGHT E COLS. 1971) e

identificados segundo o International System for Human Cytogenetic Nomenclature

(ISCN) (SHAFFER E COLS., 2009).

3.3.1. Obtenção dos cromossomos metafásicos

Em um tubo foram adicionados 6ml de meio RPMI-1640 (Vitrocell®) contendo

antibióticos; 1,2ml de soro fetal bovino (Vitrocell®); 0,2ml de fitohemaglutinina M

(Vitrocell®) e 0,5ml de sangue total. A cultura foi mantida a 37°C durante 72hs e

uma hora antes do término adicionou-se 0,05ml de colchicina (0,8µg/ml) (Vitrocell®).

19

Após as 72hs do implante da cultura de linfócitos, o tubo foi centrifugado a 1800rpm

por 10min e, em seguida, descartou-se o sobrenadante. Foram adicionados 6ml de

KCl (0,075M), feita homogeneização e a amostra foi mantida a 37°C por 30min.

Essa amostra foi novamente centrifugada a 1800rpm por 10min, o sobrenadante foi

descartado e o pellet foi homogeneizado. Acrescentou-se 6ml de fixador (3

metanol:1 ácido acético) à temperatura ambiente e a amostra foi centrifugada a

1800rpm por 10min. O sobrenadante foi descartado. O procedimento de lavagem

com fixador foi realizado até o sobrenadante ficar totalmente límpido.

3.3.2. Bandeamento GTG

Para se obter um padrão de bandeamento GTG, a lâmina, contendo material

fixado de cromossomos e preparada com seis dias de antecedência, foi tratada com

uma solução de tripsina (100mg/100ml Dulbeco) (136,87mM NaCl; 2,68mM KCl;

50,02mM KH2PO4; 5,37mM Na2HPO4) à temperatura ambiente por 12seg. Em

seguida, foi lavada em tampão fosfato (136,87mM KH2PO4; 15,09mM NaOH,

pH:6,8) à temperatura ambiente e, por fim, corada com Giemsa 5% por 5min, sendo

posteriormente lavada em água deionizada, secada ao ar e observada em um

microscópio Zeiss®, com câmera Axio Cam MRC®. As imagens foram capturadas

pelo sistema Axio Imager®.

3.3.3. Hibridização in situ (FISH)

A técnica de FISH seguiu o protocolo recomendado pela empresa VYSIS®,

salvo modificações. A sonda utilizada (cat#KBI-40001 PN 13 - 13q14, marcada em

verde com PlatinumBright 495), já disponível em nosso laboratório, foi desenvolvida

pela empresa Kreatech Diagnostics para fins diagnósticos da trissomia do

cromossomo 13 (Síndrome de Patau) e hibridiza na região 13q14.2, onde está

localizado o gene RB1, conforme pode ser visto na figura 3.2.

20

Figura 3.2. Representação esquemática da região do cromossomo 13 abrangida pela

sonda para FISH utilizada nesse estudo. Fonte: http://www.kreatech.com/products/repeat-

freetm-poseidontm-FISH-probes/pre-natal/pn-13-13q14-trisomy-13-patau-syndrome.html.

(Acessado em 02/01/13).

O material na lâmina, de cromossomos metafásicos previamente fixados, foi

desnaturado em uma solução de 70% formamida/2XSSC (NaCl 3M; citrato de sódio

3M, pH7,0) (pH 7,0) por 5min a 73°C. Em seguida foi feita uma desidratação gradual

em série crescente de alcoóis gelados (70%, 85% e 100%) durante 1min cada.

Posteriormente, a lâmina secou à temperatura ambiente. A sonda foi desnaturada a

73°C por 5min e aplicada sobre a lâmina, sendo esta montada com lamínula, selada

com cola apropriada e mantida no hibridizador de lâminas Hybrite (VYSIS®) a 37°C

por 18hs.

Após este período, retirou-se a lamínula da lâmina e a lâmina foi lavada três

vezes em solução de 50% formamida/2XSSC (pH 7,0) a 37°C, por 10min cada

lavagem. Depois, foi incubada numa solução de 2XSSC (pH 7,0) por 10min a 37°C.

Por fim, foi lavada numa solução de 2XSSC/0,1% Igepal (SIGMA®), pH 7,0, por

5min a 37°C. A lâmina foi coberta com lamínula de p lástico e incubada a 37°C por

5min. Após este tempo, foi lavada três vezes em solução 2XSSC/0,1% Igepal (pH

7,0), à temperatura ambiente, por 2min cada. O contraste foi feito com 10µl de DAPI

(125ng/ml) (Cytocell®). Os cromossomos foram analisados em um microscópio de

epi fluorescência Olympus DX-60® e as imagens capturadas pelo sistema QUIPS

Imaging Sofware – Path Vysion (VYSIS®).

21

3.4. Caracterização dos resultados obtidos

A caracterização dos resultados obtidos com o uso das técnicas de

citogenética (FISH e bandeamento GTG) foi feita de acordo com as normas de

nomenclatura estabelecidas no ISCN edição 2009 (SHAFFER E COLS. 2009). Para

a nomenclatura dos resultados obtidos com a técnica de MLPA foram utilizadas as

normas estabelecidas pelo ICSN edição 2009 e recomendações da Human Genome

Variation Society (HGVS), obtidas no sítio Nomenclature for the Description of

Sequence Variants (http://www.hgvs.org/mutnomen/), acessado em 01/10/2012.

3.5. Curvas de sobrevida

Dados moleculares de 49 pacientes (40 com mutações pontuais e nove com

grandes deleções) foram utilizados para estimar as taxas cumulativas de sobrevida

após 60 meses, pelo método não paramétrico de Kaplan-Meier. As comparações

entre as curvas de sobrevida foram realizadas pelo teste de log-rank com o software

R®. A sobrevida foi estimada considerando a data de matrícula no hospital, que

correspondeu ao início do tratamento, até a data da última visita ao hospital ou óbito.

Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para p<0,05.

22

4. Resultados

Do total de 98 pacientes reunidos para o estudo, 66 puderam ser avaliados

quanto à presença de alterações no gene RB1 e/ou na região 13q pela técnica de

MLPA. A porcentagem de amostras avaliadas, segundo a lateralidade do tumor, é

evidenciada na figura 4.1 a seguir:

Figura 4.1. Porcentagem de amostras avaliadas no estudo pelo método de MLPA,

segundo a lateralidade do tumor.

Mutações constitutivas foram observadas em onze amostras, o que equivale a

cerca de 16,7% do total de sessenta e seis que tiveram resultado. O fluxograma a

seguir representa a condução do estudo, o número absoluto de amostras

parcialmente e totalmente sequenciadas, bem como os resultados obtidos com o

método de análise utilizado (figura 4.2).

Figura 4.2. Fluxograma da condução do estudo.

23

A distribuição dos pacientes com alteração ou não em RB1/13q, pelo método

de MLPA, em relação à lateralidade do tumor, pode ser vista na figura 4.3 a seguir:

Figura 4.3. Figura representativa da distribuição do número de pacientes analisados por MLPA e a presença ou não de mutação em relação à lateralidade do tumor (segundo dados obtidos por esse método de análise).

As amostras INCA – T1 e INCA – T2 revelaram deleção de apenas um éxon

do gene RB1, conforme pode ser visto nas figuras 4.4 e 4.5 a seguir:

Figura 4.4. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1. Nomenclatura: MLPA g.157458-?_157603+?del. RefSeq: NG_009009.1.

DELETADO

24

Figura 4.5. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 22 do gene RB1 da amostra INCA – T2. Nomenclatura: MLPA g.166252-?_166365+?del. RefSeq: NG_009009.1.

A deleção evidenciada na amostra INCA – T1 pôde ser confirmada pelo

método de sequenciamento direto, realizado por outro membro do nosso grupo.

A análise da amostra INCA – B6 revelou a deleção de dois éxons

consecutivos (Fig. 4.6).

Figura 4.6. Figura representativa da deleção evidenciada nos éxons 10 e 11 do gene RB1 da amostra INCA – B6. Nomenclatura: MLPA g.68748-?_69858+?del. RefSeq: NG_009009.1.

O gene RB1 foi parcialmente deletado em duas amostras (Figs. 4.7 e 4.8).

DELETADOS

DELETADO

25

Figura 4.7. Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus RCBTB2 evidenciada na amostra HCPA – NI1. Nomenclatura: MLPA(49,027,069-?_49,107,316+?)del. RefSeq: NC_000013.10.

Figura 4.8: Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus ITM2B evidenciada na amostra HSM – B3. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_48,934,489+?)del. RefSeq: NC_000013.10.

A deleção do gene ITM2B e das regiões promotora e do éxon 1 do gene RB1

foi observada em uma amostra de paciente (Fig. 4.9).

DELETADOS

DELETADOS

26

Figura 4.9. Figura representativa da deleção do lócus ITM2B e das regiões do

promotor e éxon 1 do gene RB1, evidenciada na amostra INCA – B8. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_48,878,185+?)del. RefSeq: NC_000013.10.

Deleções cromossômicas foram observadas em cinco amostras, conforme

podem ser vistas nas figuras 4.10 a 4.14 a seguir.

Figura 4.10. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra

INCA – B7, abrangendo os loci ITM2B, CHC1L e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.

DELETADOS

27

Figura 4.11. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U26, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.

Figura 4.12. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.

28

Figura 4.13. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B4, abrangendo o locus ITM2B e o gene RB1. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_49,054,381+?)del. RefSeq: NC_000013.10.

Figura 4.14. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B6, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.

Alguns desses resultados puderam ser confirmados por outros métodos, para

os quais os reagentes e aparelhagem necessários à execução encontravam-se

disponíveis em nosso laboratório.

Dessa forma, a deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 na amostra

INCA – T1 (Fig. 4.4) e a deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28

29

(Fig. 4.12) puderam ser confirmadas por sequenciamento e citogenética,

respectivamente, realizados por outros membros do grupo de Aconselhamento

Genético em Retinoblastoma. A deleção no éxon 19 do gene RB1 na amostra INCA

– T1 tratava-se da variante g.157517delC (RefSeq.NG_009009.1), deleção de base

única, conforme pode ser visto na figura 4.15. A figura 4.16 mostra o resultado do

cariótipo correspondente à amostra INCA – U28, que corrobora a deleção observada

por MLPA. A deleção cromossômica observada na amostra HSM – B6 (Fig. 4.14) foi

confirmada por bandeamento GTG.

Figura 4.15. Eletroferograma evidenciando a variante g.157517delC (RefSeq. NG_009009.1) no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1.

Figura 4.16. Resultado do bandeamento GTG realizado para a amostra INCA – U28. A seta mostra o cromossomo 13 deletado. Nomenclatura: 46,XX,del(13q14).

A deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – B7 (Fig. 4.10)

também pôde ser confirmada por FISH e bandeamento GTG. Os resultados obtidos

podem ser observados, respectivamente, nas figuras 4.17 e 4.18 a seguir.

30

Figura 4.17. Resultado do FISH realizado para a amostra INCA – B7. A sonda KBI-40001 PN 13 - 13q14 (marcada em verde com PlatinumBright 495) complementar à região 13q14, marcou apenas um cromossomo 13 (ponta de seta). Nomenclatura: 46,XX.ish del(13)(q14.2q14.2)(PN 13X1).

Figura 4.18. Resultado do bandeamento GTG realizado para a amostra INCA – B7. Um dos cromossomos 13 do par encontra-se encurtado (seta). Nomenclatura: 46,XX,del(13q14).

A tabela 4.1 resume os resultados obtidos das análises genéticas e

citogenéticas para as onze amostras desse estudo com alteração em RB1/13q14.

31

Tabela 4.1. Resultados das análises moleculares e citogenéticas de 11 pacientes do estudo.

Identificação da amostra

Histórico familiar de RB

Idade ao diagnóstico (meses)

Lateralidade do tumor MLPA Sequenciamento ª Citogenética

Tamanho estimado da

deleção

Genes envolvidos

INCA – T1 Sim – pai 24 meses Trilateral MLPA g.157458-?_157603+?delª g.157517delC (Ex 19) n.a. 1b RB1

INCA – T2 Não 19 meses Trilateral MLPA g.166252-?_166365+?delª g.76721 G>C (In14) n.a. 113pb RB1

INCA – B6 Não 8 meses Bilateral MLPA g.68748-?_69858+?delª

g.44013C>T (In3) g.46476T>G (In4)

g.74587G>T (In11) g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25)

n.a. >1kb RB1

HCPA – NI1 Não informado Não informado Não informada MLPA(49,027,069-

?_49,107,316+?)delb

g.46476T>G (In4) g.74587G>T (In11)

g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25)

n.r. >80kb RB1 RCBTB2

HSM – B3 Não 5 meses Bilateral MLPA(48,807,274-

?_48,934,489+?)delb n.v.o. n.r. >127kb RB1

INCA – B8 Sim – irmã 4 meses Bilateral MLPA(48,807,274-

?_48,878,185+?)delb n.v.o. n.a. >70kb ITM2B

RB1

INCA – B7 Não 8 meses Bilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c

g.44013C>T (In3) g.46476T>G (In4)

g.74587G>T (In11) g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25) g.178599T>A (In25)

46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1

RCBTB2 DLEU1

INCA – U26 Não Não informado Unilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. n.r. >1Mbb ITM2B RB1

RCBTB2 DLEU1

INCA – U28 Não 20 meses Unilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. 46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1

RCBTB2 DLEU1

HSM – B4 Não 12 meses Bilateral MLPA(48,807,274-

?_49,054,381+?)delb n.v.o. n.r. >247kb ITM2B

RB1

HSM – B6 Não 17 meses Bilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. 46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1

RCBTB2 DLEU1

Abreviações: Ex, éxon; In, íntron; n.v.o., nenhuma variante observada; n.a., não se aplica; n.r., não realizada. aSequência referência NG_009009.1; bSequência referência: NC_000013.10; cDeleção de toda a região 13q14.2.

32

4.1. Curvas de sobrevida em 60 meses dos pacientes

Para avaliação do impacto dos achados moleculares descritos neste estudo,

foi calculada a probabilidade de sobrevida até 60 meses dos pacientes de acordo

com as variáveis “idade ao diagnóstico” e “tipo de mutação observada”. As curvas de

sobrevida foram obtidas pelo software Tinn R, utilizando o estimador de Kaplan-

Meier. As probabilidades estimadas de cada curva, os intervalos de confiança e os

valores de p encontram-se na tabela 4.2. A sobrevida global dos pacientes foi de

80% (IC 95%= 0,690 a 0,928).

Tabela 4.2. Estimativa de sobrevida dos pacientes em 60 meses, segundo a idade ao diagnóstico e o tipo de mutação observada.

Sobrevida em 60 meses de acompanhamento

Variáveis

P(St) IC95% p-valorLog-rank

Global 80,0% 0,690 0,928

Idade ao diagnóstico

Após 24 meses 80,0% 0,643 0,996

Até 24 meses 79,5% 0,647 0,977

0,802

Tipo de mutação

Mutação pontual 82,4% 0,713 0,951

Grandes deleções 55,6% 0,231 1

0,628

A figura gerada para análise de influência da variável “tipo de mutação” na

sobrevida dos pacientes pode ser visto a seguir (Fig. 4.19).

Figura 4.19. Sobrevida em 60 meses de acompanhamento em relação ao tipo de mutação observada (p=0,628).

33

5. Discussão

5.1. Histórico dos pacientes e correlação genótipo x fenótipo

Como pôde ser visto na figura 4.3, do total de 66 pacientes analisados, onze

revelaram alterações no gene RB1 ou na região 13q14, de localização do gene.

Desses, dois casos eram de tumores unilaterais (de um total de 42 unilaterais), seis

bilaterais (do total de 21 bilaterais), dois trilaterais (representando todos os casos

trilaterais) e um de lateralidade não-informada. Para uma maior acurácia no

processo de aconselhamento genético, cada caso em que houve a detecção de uma

alteração constitutiva foi analisado separadamente, o que nos permitiu obter os

históricos familiares e interpretações dos resultados descritos a seguir.

5.1.1. Amostra INCA – T1

A amostra INCA – T1 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma trilateral ocorreu aos 24 meses de idade. Ao exame

(cintilografia óssea), a paciente apresentava o globo ocular direito com tumor

ocupando quase a sua totalidade, e o nervo óptico direito espessado desde a origem

até o quiasma óptico. O globo ocular esquerdo revelava uma lesão menor, mas de

características semelhantes, ocupando parcialmente a câmara vítrea. Além disso,

havia uma grande formação expansiva e heterogênea, predominantemente sólida

(semelhante às encontradas nos globos oculares) e extra-axial, que se estendia e

invadia cranialmente o assoalho do 3º ventrículo e o corpo e prolongamento

anteriores do ventrículo lateral. A paciente foi a óbito nove meses após o

diagnóstico.

Quando investigado seu histórico familiar, soubemos que seu pai havia sido

enucleado aos 20 meses de idade, o que poderia ter sido um caso de

retinoblastoma. Infelizmente, o pai faleceu antes que pudéssemos conseguir

amostra de sangue para o rastreamento da alteração no gene RB1 encontrada na

amostra de DNA proveniente da filha. Essa paciente tinha dois irmãos menores de

cinco anos, sendo um apenas por parte de pai. Ambos tiveram o sangue coletado

para investigação da alteração encontrada na paciente; descobrimos que o irmão

34

por parte de pai tem a mesma alteração e, por isso, foi encaminhado para

acompanhamento clínico.

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção de base

única no éxon 19 do gene RB1 (g.157517delC , fig. 4.4 e fig. 4.15), constituindo uma

mutação do tipo frameshift, que altera o quadro de leitura da sequência de DNA.

Essa região do gene compõe o domínio pocket de ligação aos fatores de transcrição

da família E2F na proteína pRB, o que confere grande importância à manutenção de

sua sequência nucleotídica.

A figura 5.1 esclarece a importância de cada éxon do gene RB1 na formação

da proteína pRB.

Figura 5.1. Estrutura do gene RB1 e a correspondência éxon/domínio da proteína. Retirada de Harbour (1998).

Como mostrado na figura, o éxon 19 compõe a região espaçadora do domínio

pocket de ligação, região da proteína que se liga aos fatores de transcrição da

família E2F (HENLEY E DICK, 2012); dessa forma, um abalo nessa região pode

impedir a ligação da pRB a esses fatores de transcrição, o que justificaria a perda de

sua função como supressora tumoral.

5.1.2. Amostra INCA – T2

A amostra INCA – T2 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma trilateral ocorreu aos 19 meses de idade. Na

admissão, a paciente apresentava hemorragia e descolamento da retina no globo

ocular esquerdo (GOE), uma clínica pouco sugestiva de retinoblastoma. Os médicos

desconfiaram ser um caso de doença de Coat, condição rara, quase sempre

35

unilateral, em que há um desenvolvimento anormal dos vasos sanguíneos atrás da

retina. Sob essa condição, esses vasos rompem por excesso de fluxo sangüíneo e o

plasma liberado promove o descolamento total ou parcial da retina

(http://www.coatsdisease.org/index.html, acessado em 06/03/2013). Porém, o

exame de ressonância nuclear magnética (RNM) evidenciou massa tumoral no GOE

e na glândula pineal, levando ao diagnóstico clínico de retinoblastoma associado a

pinealoblastoma. A paciente passou por processo de enucleação do GOE e iniciou

tratamento.

Um ano após o diagnóstico e estando em tratamento, a paciente começou a

deambular curvada, queixar-se de dores abdominais e no pescoço, o que levou os

médicos a desconfiarem de ser um caso de meningite, inflamação das membranas

protetoras do cérebro e medula espinhal, confirmado pelo realce leptomeníngeo

observado ao exame de RNM; tratava-se de uma meningite carcinomatosa,

condição rara em casos de retinoblastoma, mas que acomete cerca de 5%-8% dos

pacientes com tumores sólidos (LIMA E COLS., 2003). Devido à disseminação

tumoral leptomeníngea, a paciente foi a óbito dois anos após o diagnóstico de RB.

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção no éxon

22 do gene RB1 (Fig. 4.5). Conforme mostra a figura 5.1, esse éxon também

compõe o domínio pocket da pRB, essencial para o exercício de sua função como

supressora tumoral.

Além disso, esse éxon compõe o domínio B de ligação da proteína ao

chamado “motivo LXCXE” presente em oncoproteínas virais e em diferentes

proteínas celulares envolvidas na atividade de regulação de cromatina. A

importância desse domínio para oncoproteínas virais é a supressão da pRB (visto

que o domínio conservado permite uma ligação estável dessas proteínas), levando à

proliferação celular (como é o caso das oncoproteínas E7 - do vírus HPV – e E1A,

de adenovírus); já para as proteínas celulares, a importância da integridade dessa

região reside no fato de que essas proteínas interagem diretamente com a pRB na

repressão da transcrição de genes responsivos a E2F (HENLEY E DICK, 2012).

Amostras de DNA dos pais da paciente foram investigadas para a presença

da alteração observada; não foi evidenciada a deleção do éxon 22 em nenhum dos

pais.

36

5.1.3. Amostra INCA – B6

A amostra INCA – B6 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular direito (GOD), classificação

internacional B (Tab. 1.1), ocorreu aos 7 meses de idade. Na admissão, a paciente

apresentava leucocoria e estrabismo no GOD, com múltiplos focos tumorais, pontos

de calcificação e sementes vítreas. Quatro meses após o diagnóstico, houve o

surgimento de um foco tumoral no globo ocular esquerdo. Após tratamento, a

paciente encontra-se viva, livre de doença.

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção dos

éxons 10 e 11 do gene RB1 (Fig. 4.6). De volta à figura 5.1, podemos ver que esses

éxons estão fora do domínio de ligação da pRB a fatores da família E2F; os éxons

10 e 11 compõem a região N-terminal da proteína, onde localizam-se os sítios de

fosforilação. Segundo a literatura, essa região não é importante para sua atividade

de supressão do crescimento celular, apesar de haver relatos de mutações

constitutivas em RB1 nessa região (HARBOUR, 1998).

Os pais da paciente foram investigados para a presença da alteração

observada; não houve evidência de deleção dos éxons 10 e 11 do gene RB1 nas

amostras de DNA dos pais.

37

5.1.4. Amostra HCPA – NI1

A amostra HCPA – NI1 é proveniente de um paciente do sexo masculino,

cujos dados de prontuário não puderam ser obtidos. A alteração evidenciada nesse

paciente foi uma deleção envolvendo os éxons 18 a 27 do gene RB1 e o lócus

RCBTB2 (Fig. 4.7).

O RCBTB2 é um gene contíguo a RB1 e regulador de cromatina; em 2002,

Latil e colaboradores observaram uma alta frequência de perda de heterozigosidade

nesse lócus em amostras de tumores de próstata, sustentando a ideia de que

RCBTB2 atua como supressor tumoral para essa neoplasia (LATIL E COLS., 2002).

Em 2004, foi proposto que a perda de RCBTB2, associada ao aumento de

expressão do gene RAN e perda do gene ZHX-2 resultaria em um fenótipo mais

agressivo em casos de mieloma múltiplo; porém, em um estudo envolvendo 52

cqasos de mieloma múltiplo, Armellini e colaboradores não encontraram nenhuma

relação entre a perda de RCBTB2 e um pior prognóstico da doença (ARMELLINI E

COLS., 2008).

5.1.5. Amostra HSM – B3

A amostra HSM – B3 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma bilateral ocorreu aos 5 meses de idade. Os sinais

clínicos apresentados pela paciente foram leucocoria e estrabismo; não puderam ser

obtidas informações quanto ao estadiamento dos tumores. A alteração evidenciada

na amostra dessa paciente foi uma deleção envolvendo o lócus ITM2B e os éxons 1

a 7 do gene RB1 (Fig. 4.8).

O gene ITM2B (BRI2) codifica uma proteína transmembrana e atua na

regulação do metabolismo de compostos β-amilóides. Devido à sua função,

mutações e deleções nesse gene são descritas na literatura da doença de Alzheimer

(que tem por característica a deposição de peptídeos β-amilóides, promovendo

amiloidose cerebrovascular e lesões pré amiloides) e nos casos de demência por

amiloidose (TOMIDOKORO E COLS., 2005; KILGER E COLS., 2011).

38



diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD - classificação internacional C; GOE –

não classificável) ocorreu aos 4 meses de idade. Na admissão, a paciente

apresentava uma lesão que já havia invadido o nervo óptico no GOE e uma lesão

periférica ao nervo óptico no GOD; a enucleação ocorreu em dois anos após o

diagnóstico para o GOE e em três anos após o diagnóstico para o GOD.

Três anos após o diagnóstico e com a doença supostamente controlada, a

paciente evidenciou lesão na língua, afundamento da região retroauricular esquerda

e aumento da região submandibular; havia doença metastática, com tumorações nas

regiões mentoniana e mastoide. A paciente foi a óbito por progressão tumoral 4 anos

após o diagnóstico.

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi a deleção do lócus

ITM2B e das regiões do promotor e éxon 1 do gene RB1 (Fig. 4.9). Como dito

anteriormente, a importância do lócus ITM2B reside no fato de que este gene atua

no controle da degradação de compostos β-amilóides, relacionados à ocorrência de

doença de Alzheimer. A perda da região promotora do gene RB1, bem como do

éxon 1, implicam na não produção da proteína e, portanto, uma haploinsuficiência de

RB1, visto que essa região é essencial para início da transcrição (HENLEY E DICK,

2012).

A irmã da paciente também teve retinoblastoma bilateral, mas ainda não

obtivemos resultados na análise molecular dessa paciente; é provável que esta

tenha a mesma alteração evidenciada na paciente INCA – B8 e que tal alteração

tenha sido herdada via células germinativas de um dos pais, ainda não avaliados por

essa técnica e que não têm histórico de retinoblastoma ou retinoma.



diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD - classificação internacional B; GOE –

classificação internacional E) ocorreu aos 8 meses de idade. Na admissão, a

39

paciente apresentava leucocoria e estrabismo no olho esquerdo e, como

características fenotípicas, fronte olímpica, ponte nasal achatada e implantação

baixa da orelha. Não houve relato no prontuário sobre qualquer deficiência no

desenvolvimento mental. O olho esquerdo foi enucleado sete meses após o

diagnóstico, devido à grande quantidade de sementes vítreas e novo foco tumoral

supra nasal. O olho direito respondeu bem ao tratamento e o tumor atualmente

encontra-se calcificado.

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção

cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.10, fig. 4.17 e

fig. 4.18). As implicações de uma deleção citogenética de tamanho porte (>1Mb,

conforme discriminado na tabela 4.1) são o espectro de alterações fenotípicas

observadas na síndrome de deleção 13q, como dito anteriormente. Na classificação

de grupos estabelecida para essa síndrome, de acordo com a deleção evidenciada a

paciente encontra-se no grupo I (que abrange deleções proximais que não envolvem

a região 13q32), cujos pacientes têm como uma das características clínicas o

retardo mental leve a moderado (MITTER E COLS., 2011), não observado nessa

paciente. Como os dados clínicos foram obtidos dos relatos de prontuário realizados

pouco tempo após a admissão da paciente, é possível que uma deficiência no

desenvolvimento mental da mesma não tenha sido notada devido a sua pouca

idade.

5.1.8. Amostra INCA – U26

A amostra INCA – U26 foi obtida de um paciente do sexo feminino, cuja idade

ao diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular direito não pôde ser

obtida. A paciente foi admitida no INCA aos 11 anos de idade, já enucleada.

Segundo dados do prontuário, a paciente apresenta retardo mental leve.

A alteração observada na amostra dessa paciente foi uma deleção

cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.11). Segundo

a análise pelo método de MLPA, a deleção evidenciada é a mesma observada na

amostra discutida anteriormente (INCA – B7) e ambas podem ser alocadas no grupo

I de classificação da síndrome de deleção 13q (MITTER E COLS., 2011); porém, tais

pacientes apresentam características fenotípicas diferentes, visto que não há relato

40

de dismorfias faciais, porém há relato de atraso no desenvolvimento mental dessa

paciente correspondente a amostra INCA – U26. Portanto, é importante que seja

feita uma análise dessas alterações utilizando técnicas de microarranjo, a fim de se

esclarecer a abrangência de cada deleção e as contribuições dos genes envolvidos

para as manifestações fenotípicas observadas.

5.1.9. Amostra INCA – U28

A amostra INCA – U28 é proveniente de um paciente do sexo masculino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular esquerdo ocorreu aos 20

meses de idade. Na admissão, o paciente apresentava leucocoria, decorrente de um

tumor com sementes vítreas, acometimento da coróide e infiltração do nervo óptico e

lâmina crivosa. Como características fenotípicas, foram observadas face triangular,

palato rebaixado, dentes amontoados, mamilos supra-numerários, sindactilia 2/3 em

pododáctilos (2º e 3º dedos do pé unidos), testículos não-palpáveis em bolsa

escrotal e a cardiopatia denominada Tetralogia de Fallot (TDF). O paciente foi

submetido à enucleação do GOE 4 meses após o diagnóstico.

A tetralogia de Fallot é uma anomalia congênita rara, do coração, que provoca

baixos níveis de oxigenação sanguínea, decorrentes de defeitos no septo

interventricular, na artéria pulmonar, na artéria aorta e na parede do ventrículo direito

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0002534/, acessado em 11/03/13).

Essa anomalia já havia sido reportada em outros casos de pacientes com

retinoblastoma associado à síndrome da deleção 13q: Kondo e colaboradores

(1985) reportaram a TDF em um paciente com deleção 13q14-13q32; Brown e

colaboradores (1993) reportaram essa anomalia associada à deleção 13q21.2-

13q32; por fim, Quélin e colaboradores, em 2009, reportaram dois casos de TDF, um

associado à deleção 13q31.1-13q33.3 e outro com deleção 13q31.1-13qter.

A alteração evidenciada na amostra desse paciente foi uma deleção

cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.12 e fig.

4.16). Ao cariótipo (Fig. 4.16), foi possível perceber que a deleção em 13q14 vai

muito além da região cromossômica do gene RB1 e o fenótipo do paciente é

condizente com o observado por Brown e seu grupo (malformações e anormalidades

digitais), o que sugere que o paciente tenha perdido a região q32, proposta por esse

41

grupo como causadora dessas anormalidades fenotípicas (BROWN E COLS., 1993).

Além disso, o paciente apresenta algumas das malformações presentes no grupo 2

de classificação da síndrome de deleção 13q (MITTER E COLS., 2011), o que

corrobora essa informação. Porém, como o cariótipo do paciente não foi

esclarecedor quanto a isso, é necessário que seja feita uma análise com técnicas de

microarranjo para um maior detalhamento da região perdida.

O paciente tem um tio por parte de pai que utiliza prótese ocular, cuja

informação sobre o motivo da prótese não pôde ser obtida.


A amostra HSM – B4 é proveniente de um paciente do sexo masculino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD – classificação internacional E; GOE –

classificação internacional C) ocorreu aos 12 meses de idade. Na admissão, o

paciente apresentava estrabismo. Nos registros de prontuário não foram observadas

manifestações fenotípicas que pudessem ser relacionadas a alguma síndrome.

A alteração evidenciada na amostra desse paciente foi uma deleção

cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.13). Por não

constarem dados de malformações ou retardo no desenvolvimento no prontuário do

paciente, este será novamente chamado para avaliação clínica, a fim de se verificar

que nenhum dado clínico tenha sido negligenciado. Dessa forma, até o momento,

não foi possível uma correlação genótipo x fenótipo para esse paciente.

Os pais do paciente também foram investigados para alterações em 13q14.

Ambas as amostras de DNA apresentaram duas cópias não alteradas dessa região.


A amostra HSM – B6 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo

diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD – classificação internacional D; GOE –

classificação internacional E) ocorreu aos 17 meses de idade. Na admissão, a

paciente apresentava estrabismo e malformações condizentes com o diagnóstico

42

clínico de síndrome da deleção13q (não obtivemos detalhamentos das alterações

fenotípicas).

A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção

cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.14), o que

corroborou o diagnóstico clínico da síndrome. Por não terem sido obtidos dados

específicos sobre o fenótipo da paciente e a análise citogenética realizada, não

podemos classificá-la quanto ao grupo da síndrome (BROWN E COLS., 1995;

MITTER E COLS., 2011; HUANG E COLS., 2012) bem como não foi possível

estabelecer correlações genótipo x fenótipo para a mesma.

Os pais dessa paciente foram avaliados para alterações em 13q14; ambas as

amostras de DNA dos progenitores apresentaram duas cópias não alteradas dessa

região.

Conforme pode ser observado na figura 4.3, dos 21 pacientes bilaterais com

resultados de MLPA, apenas seis evidenciaram alterações em RB1/13q. Após

recorrermos novamente aos registros do grupo de aconselhamento genético em

retinoblastoma, observamos que, dos 15 pacientes com tumor bilateral que não

apresentaram alterações por MLPA, dois revelaram mutações no sequenciamento

do gene RB1 e seis revelaram variantes de significado incerto em regiões de íntron

do gene. Dessa forma existem, pelo menos, sete pacientes com tumores bilaterais

sem nenhuma variante constitutiva detectada no gene RB1 e que, portanto, ou não

teve um primeiro evento mutacional constitutivo ou tal evento mutacional não foi

detectável pelos métodos de análise utilizados.

Segundo Knudson, a teoria de que todo caso de tumor bilateral é hereditário

(mesmo nos casos clinicamente esporádicos – sem histórico familiar) é sustentada

pelos relatos de que a descendência direta dos sobreviventes ao tumor bilateral,

sem histórico familiar, apresenta um risco próximo de 50% de ser afetada

(KNUDSON, 1974).

Porém, conforme pode ser visto em Valverde e colaboradores (2005), cujo

estudo foi uma meta análise baseada em 932 relatos de mutação no gene RB1

(sendo 24 dessas relacionadas a outros tipos de câncer), uma proporção dos casos

bilaterais de retinoblastoma não revela mutações germinativas pelos métodos

convencionais de análise (Tab. 5.1), apresentando apenas eventos somáticos, em

DNA extraído de tecido tumoral.

43

Tabela 5.1. Distribuição das mutações germinativas e somáticas no gene RB1 em

relação ao fenótipo dos pacientes. (Adaptada de Valverde e colaboradores, 2005).

Fenótipo dos pacientes Germinativa Somática Total

Bilateral esporádico 424 24 448

Bilateral familiar 99 - 99

Baixa penetrância 27 - 27

Unilateral esporádico 52 131 183

Unilateral familiar 6 - 6

Não relatado 145 - 145

Total 753 155 908

Dessa forma, pode-se concluir que algum outro mecanismo de inativação da

proteína Rb possa estar envolvido no desenvolvimento do tumor bilateral, cuja

detecção não é possível a nível genético pelos métodos de análise utilizados no

presente estudo.

Alguns trabalhos sugerem que a metilação da região promotora do gene RB1

ocorra em 8 a 16% dos casos de retinoblastoma, sendo mais frequente entre os

unilaterais (OHTANI-FUJITA E COLS. 1997; CORSON E GALLIE 2007). A

hipermetilação das ilhas CpG desta região leva ao silenciamento da expressão

gênica, promovendo uma drástica diminuição dos níveis da pRB.

É ainda possível supor que alguns desses pacientes sejam casos de

mosaicismo somático (RUSHLOW E COLS., 2009), tendo o primeiro evento

mutacional no gene RB1 ocorrido em um momento tardio da embriogênese, o que

poderia impedir sua detecção em leucócitos.

Conforme mostrado na introdução do presente estudo, a proteína pRB é

inativada através de fosforilação mediada por quinases dependentes de ciclina

CDK4/6; essas podem se encontrar superexpressas, representando uma via de

indução ao câncer (DI FIORE, 2013) e, portanto, devem ser consideradas como um

44

possível fator indutor do desenvolvimento tumoral nesses pacientes sem alteração

detectável em RB1/13q14.

Outra hipótese para o desenvolvimento tumoral nos pacientes bilaterais sem

alteração constitutiva em RB1 reside no fato de que a proteína pRb sofre diversas

modificações pós-traducionais (conforme vistas na tabela 1.2) que favorecem a

proliferação celular e podem inviabilizar a regulação do ciclo celular pela via pRb.

5.2. Avaliação dos resultados das curvas de sobrevi da

Conforme visto na tabela 4.2, apesar de o grupo de pacientes portadores de

grandes deleções ter apresentado uma sobrevida diferente do grupo de pacientes

com mutações pontuais em RB1, essa diferença não foi estatisticamente significativa

(p=0,628). Como ambos os grupos amostrais são pequenos e o de pacientes com

grandes deleções é muito menor que o de pacientes com mutações pontuais em

RB1, é necessário que sejam avaliados grupos maiores sob essas condições para

que obtenhamos um reflexo real do impacto dessas alterações na sobrevida dos

pacientes.

Alguns dados observados nesse estudo corroboram a literatura, enquanto

outros confrontam. Em um estudo de 2011, Mitter e colaboradores observaram que

todos os pacientes com RB unilateral que apresentavam deleção em 13q14, essa

deleção foi maior que 1Mb (MITTER E COLS., 2011); o mesmo foi observado em

nosso estudo (dois pacientes unilaterais com deleção em 13q14, ambas maiores

que 1Mb). Porém, no mesmo estudo, aqueles autores observaram uma frequência

maior de tumores unilaterais associados à deleções em 13q, em detrimento dos

tumores bilaterais, o que é consistente com a literatura do retinoblastoma associado

à deleção 13q (BAUD E COLS., 1999), mas que não condiz com nossos achados;

em quatro casos que apresentaram deleções citogenéticas em 13q, dois eram de

amostras provenientes de pacientes com tumor unilateral e os outros dois, de

pacientes com tumor bilateral.

O grupo liderado por Mitter estabeleceu, no mesmo estudo de 2011, uma

relação direta entre haploinsuficiência de ITM2B e ocorrência de tumor bilateral, o

que também não condiz com nosso estudo (Tab. 4.1). Por fim, eles associaram a

perda dos genes ITM2B, RB1 e RCBTB2 à estatura acima do padrão, fator que não

foi avaliado em nosso estudo.

45

Como o nosso grupo amostral com deleção em 13q e manifestações

fenotípicas (relatadas em prontuário) é pequeno, é possível que esses dados que

confrontam a literatura sejam anulados quando avaliado um conjunto maior de

pacientes sob essas condições.

Os dados referentes às deleções observadas, tanto no gene RB1 quanto nos

genes contíguos (ITM2B, RCBTB2 e DLEU1) foram bastante relevantes ao

aconselhamento genético das famílias envolvidas, visto que mutações constitutivas

em RB1 são amplamente associadas a tumores secundários a retinoblastoma e

alterações genéticas nesses outros genes em 13q14 já foram relatados em casos de

Alzheimer (gene ITM2B) e outros tipos de câncer.

As amostras de pacientes com retinoblastoma bilateral que não revelaram

alteração cromossômica ou mutação no lócus 13q14.2 pelas técnicas de

sequenciamento, MLPA ou FISH estão sendo investigadas, por outro membro do

nosso grupo, quanto ao padrão de metilação em ilhas CpG da região promotora do

gene RB1.

46

6. Conclusões

A técnica de MLPA revelou-se uma boa opção para a detecção de grandes

alterações na região 13q14 e sua ampla utilização permitiu (e continua permitindo) o

esclarecimento do primeiro evento mutacional ocorrido e suas implicações para o

paciente e sua família, contribuindo positivamente para o programa de

aconselhamento genético em retinoblastoma do Instituto Nacional de Câncer.

Algumas das alterações evidenciadas pelo método de MLPA puderam ser

validadas com utilização de outros recursos disponíveis no laboratório, tais como

técnicas de citogenética e sequenciamento direto.

A alteração detectada em um dos pacientes foi evidenciada também e um dos

seus irmãos, determinando uma necessidade de acompanhamento clínico do

mesmo.

Com esse trabalho, foi possível reunirmos dados relevantes para o

aconselhamento genético dos pacientes com retinoblastoma e seus familiares.

47

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55

Anexos

Anexo I: Cópias da aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Instituto

Nacional de Câncer para o projeto intitulado “Estud os Citomoleculares em

Retinoblastoma” e os Modelos de Consentimento Livre e Esclarecido.

Carta de aprovação

56

Modelo de Termo de Consentimento Livre e Esclarecid o

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Estudos Cito-Moleculares em Retinoblastoma

Nome do Voluntário:_____________________________________Idade:_________

Gênero: ( )Masculino ( )Feminino

O retinoblastoma é um tumor maligno intra-ocular infantil, que tem freqüência

relativamente alta na população. O tumor pode se manifestar em um ou nos dois

olhos e diferentemente de outros tipos de câncer, uma parte significativa dos

retinoblastomas é hereditária. Alterações no gene RB1 são os principais fatores

genéticos que causam o retinoblastoma, mas recentemente tem sido sugerido que

outros genes possam estar envolvidos no desenvolvimento do tumor, tais como

MDM2, MDM4 e NMYC. A análise genética do gene RB1 possibilita a identificação

de indivíduos com maior risco para o desenvolvimento de retinoblastoma. Desta

forma, poderá ser realizado um acompanhamento das famílias visando a detecção

precoce de alterações oculares.

Você em breve será submetido(a) a uma cirurgia para retirada do tumor

ocular e a uma punção venosa. Por isso está sendo convidado (a) a participar, de

um estudo clínico que envolve a análise genética de parte do tumor retirado e de

parte do sangue coletado.

Para que você possa decidir se quer participar ou não deste estudo, precisa

conhecer seus benefícios, riscos e implicações.

OBJETIVO DO ESTUDO

Pesquisar alterações no gene RB1 ou na região onde este gene se localiza e

genes relacionados (tais como MDM2, MDM4 e NMYC) em amostras de tumor e

sangue de pacientes com retinoblastoma.

PROCEDIMENTOS DO ESTUDO

Se você concordar em participar deste estudo, será coletada uma amostra de

seu sangue (3 a 5 mL, ou menos, dependendo da idade do participante) utilizando

material estéril e descartável para ser analisado exclusivamente neste estudo.

57

Paralelamente, de acordo com a autorização do senhor (a), ou do seu responsável,

será utilizada uma pequena parte do tumor ocular que foi retirado na cirurgia. A

amostra tumoral a ser utilizada neste estudo não afetará o processamento rotineiro

do material a ser enviado a patologia para análise.

MÉTODOS ALTERNATIVOS

Não existe metodologia alternativa para o objetivo deste estudo.

RISCOS

O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste

estudo. A coleta de sangue e a utilização de uma pequena parte do tumor

coincidirão com a coleta de sangue para os exames rotineiros, de forma a não ser

prevista punção venosa adicional. O mesmo se aplica à amostra tumoral: será

utilizada uma parte do tumor retirado após o procedimento cirúrgico realizado como

parte do seu tratamento médico. Somente em raros casos, poderá ser necessária

uma nova coleta de sangue, que será avisada com antecedência e mediante

autorização e aceite do participante, será realizada no hospital do INCA com

profissional treinado e tendo os mesmos cuidados. A coleta de sangue, que é parte

de seu tratamento regular, não acarreta risco maior, exceto um pequeno desconforto

local durante a punção ou manchas rochas transitórias chamadas de equimoses. A

utilização do tumor também não oferece riscos uma vez que o material será retirado

após o procedimento cirúrgico de retirada do tumor.

BENEFÍCIOS

Os benefícios esperados são o acompanhamento das famílias visando à

detecção precoce de alterações oculares e o aconselhamento genético destas

famílias. Além disso, a análise genética será de grande importância para a

correlação com o desenvolvimento do tumor, possibilitando, no futuro, novas

estratégias de tratamento.

ACOMPANHAMENTO, ASSISTÊNCIA E RESPONSÁVEIS

Será oferecido suporte dos profissionais do grupo de aconselhamento

genético a todos os indivíduos estudados, que terão oportunidade de optar pelas

condutas preventivas. Caso não deseje participar desta pesquisa, os exames

58

solicitados por seu médico agora e no futuro serão realizados normalmente.

Quaisquer dúvidas podem ser esclarecidas com o pesquisador responsável pelo

aconselhamento genético, Dr., Fernando Vargas, através do telefone (21) 3207-6514

ou (21) 3207-6584.

CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS

Além da equipe de saúde que cuidará de você, seus registros médicos

poderão ser consultados pelo Comitê de Ética do Hospital do Câncer I / INCA e

equipe de pesquisadores envolvidos. Seu nome não será revelado ainda que

informações de seu registro médico sejam utilizadas para propósitos educativos ou

de publicação, que ocorrerão independentemente dos resultados obtidos.

TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS

Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de

pesquisa, e que necessite de atendimento médico, ficará a cargo da instituição. Seu

tratamento e acompanhamento médico independem de sua participação neste

estudo.

CUSTOS

Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o paciente pela sua

participação no estudo.

BASES DA PARTICIPAÇÃO

É importante que você saiba que a sua participação neste estudo é

completamente voluntária e que você pode recusar-se a participar ou interromper

sua participação a qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos

quais você tem direito. Em caso de você decidir interromper sua participação no

estudo, a equipe assistente deve ser comunicada e a coleta de amostras para os

exames relativos ao estudo será imediatamente interrompida.

GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS

Nós estimulamos a você ou seus familiares a fazer perguntas a qualquer

momento do estudo. Neste caso, por favor, ligue para o Dr. Fernando Regla Vargas

no telefone (21) 3207-6514 ou (21) 3207-6584. Se você tiver perguntas com relação

59

a seus direitos como participante do estudo clínico, também pode contar com uma

terceira pessoa imparcial, a Coordenadora do Comitê de Ética do Instituto Nacional

do Câncer Dra. Adriana Scheliga - Rua André Cavalcanti 37, telefone 21 – 3207-

6565.

DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO E ASSINATURA

Li as informações acima e entendi o propósito deste estudo assim como os

benefícios e riscos potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade de

fazer perguntas e todas foram respondidas. Eu, por intermédio deste, dou livremente

meu consentimento para participar neste estudo.

Entendo que poderei ser submetido a exames de sangue adicionais aos

necessários a meu tratamento e não receberei compensação monetária por minha

participação neste estudo.

Eu recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento.

__________________________________ ____ / _____ / _____

(Assinatura do Paciente ou responsável) dia mês ano

_______________________________________________________

(Nome do Paciente ou responsável – letra de forma )

__________________________________ ____ / ____ / _____

(Assinatura de Testemunha, se necessário) dia mês ano

Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste

estudo ao paciente indicado acima e/ou pessoa autorizada para consentir pelo

paciente.

_________________________________________ ____ / ____ / ____

(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano

60

Anexo II. Quadros das sondas presentes nos kits par a MLPA. Kit: P047 RB1-B1

61

Kit: P047 RB1-C1

62

Anexo III. Instruções para montagem da placa e parâ metros do sequenciador para análise da reação de MLPA.

Montagem da placa e parâmetros utilizados no seqüenciador ABI-3130XL Genetic

Analyzer, 16 capilares.

-Escrever a placa em uma planilha, referência de localização das amostras;

-Adicionar 0,8µL da PCR + 0,2µL do LIZ* + 9,0µL de formamida HiDiTM (referência

ABI nº 4311320)em cada poço da placa.

*LIZ internal size standard _ é utilizado como padrão de tamanho de fragmento; é

composto por 16 fragmentos fita única, marcados com um corante, que variam entre

35 e 500 pares de bases (35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350,

400, 450, 490 e 500 nucleotídeos). Uma descrição mais detalhada do produto pode

ser vista no site de produtos da Applied Biosystems

(https://products.appliedbiosystems.com).

Parâmetros utilizados no seqüenciador:

Voltagem inicial de injeção: 1,6kV;

Tempo inicial de injeção: 15seg.

Polímero: preferencialmente POP-4.

ministério da saúde instituto nacional de câncer ... · • aos pacientes e seus familiares, por...

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