MICROBIOLOGIA DO TRATAMENTO BIOLÓGICO DE RSUF.J.M.Antunes PereiraProfessor Catedrático

Universidade de Aveiro, Aveiro, Portugalantunes@dao.ua.pt

As reacções microbiológicas ocorrem em muitos lugares da terra, no sol, no lodo, no fundo de tanques e lagos, somente estas reacções não são controladas. O que os engenheiros têm feito é usar os microorganismos que ocorrem na natureza e controlar o seu crescimento de modo a dirigir as reacções no sentido de obter os produtos finais desejados. As reacções microbianas de maior interesse em biotecnologia ambiental (tratamento de efluentes e resíduos) são as fermentações aeróbias e anaeróbias; elas estão na base dos processos de compostagem e biometanização (ou digestão anaeróbia), respectivamente.

1-MICROBIOLOGIA

Os principais responsáveis das reacções biológicas no tratamento de resíduos sólidos são micróbios (bactérias, fungos e actinomicetos) pertencentes ao reino Protista, de que fazem parte todos os organismos unicelulares, todos os organismos que possuem múltiplas células do mesmo tipo e os vírus (que não possuem estrutura celular), segundo o esquema da Figura1:

Figura 1- Subdivisões principais dos Protistas.

As bactérias e actinomicetes são seres procariotas, o que significa que não possuem núcleo diferenciado e só têm um cromossoma, sendo por isso talvez os organismos mais primitivos na escala evolutiva.

São seres tipicamente unicelulares, de tamanhos entre 0,5 e 5 m, existindo também em acumulação de bactérias unicelulares e em associações multicelulares. Existem numa grande variedade de formas morfológicas (Figura 2), reproduzem-se principalmente por divisão binária e as suas dimensões da ordem dos mícron confere-lhes uma elevada razão área/volume o que permite uma rápida transferência de substratos solúveis para a célula e

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elevadas taxas de actividade metabólica. Assim, as bactérias são geralmente predominantes sobre qualquer outro micróbio em soluções de substrato aquoso.

(a) Bactérias (b) actinomicetos ( c) Fungos

Figura 2- Bactérias, actinomicetes e fungos.

As acumulações de células geralmente ocorrem após a divisão celular e distinguem-se das associações porque: (1) não são característica regular na vida da célula, e (2) o metabolismo e desenvolvimento da célula individual não é afectado pela sua presença em tal associação.O mais elaborado arranjo multicelular ocorre nos actinomicetes quando uma célula reprodutiva dá origem a uma cadeira de células que se ramifica extensivamente, podendo formar até uma matriz tridimensional (micélio). Os actinomicetes possuem, assim, características intermédias entre as bactérias e os fungos, sendo por isso umas vezes classificadas como bactérias (filamentosas), fungos, ou até em separado.

Algumas bactérias são capazes de produzir formas esporuladas de células que são mais resistentes ao calor, radiação e desinfecção química, o que se torna significante quando se pretende uma inactivação através de calor.

Uma composição sumária das bactérias, indica que as células, membranas e revestimento são constituídas por 80% de água e 20% de matéria seca da qual 90% é matéria orgânica com uma fórmula entre C5H7O2N e C5H9O3N sem grandes variações.

Os fungos são seres eucariotas o que significa que possuem um núcleo bem diferenciado e com um número de cromossomas igual ou superior a dois, o que implica que a reprodução seja mais complexa do que nos procariotas. Os fungos geralmente reproduzem-se

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sexualmente ou assexualmente, com a formação de esporos. Durante a fase vegetativa dos fungos filamentosos os filamentos têm 10 a 50 m de diâmetro, tornando-se muito maiores que as bactérias. São classificados com base na morfologia e modo de reprodução, tendo já sido identificados mais de 80 000 espécies. (Fig. 2).

Os fungos e as bactérias servem-se de substratos semelhantes, fazendo com que os dois grupos sejam competitivos. Ambos conseguem usar substrato sólidos produzindo enzimas extracelulares hidrolizantes. Contudo, os fungos são menos afectados pelo teor em humidade do meio e podem mesmo crescer em substrato secos absorvendo a humidade da atmosfera. Conseguem suportar uma larga gama de pH e geralmente têm uma menor necessidade de azoto do que as bactérias, o que se pode confirmar pela fórmula empírica da fracção orgânica, C10H17O6N (caso do Aspergillus niger). Assim, os fungos estão em vantagem em

relação às bactérias, em meios de baixa humidade e em meios deficientes em azoto, o que pode ser importante, pois uma grande fracção dos resíduos sólidos é a celulose, tendo por isso pouco azoto.

Os fungos, que se dividem em leveduras e em bolores, são micróbios industrialmente importantes. As leveduras são os micróbios responsáveis pela produção de bebidas alcoólicas, também produzem álcool industrial e glicerol e são usados como fermento no fabrico de pão. Os bolores são usados industrialmente na síntese de uma grande variedade de substâncias valiosas que não podem ser facilmente produzidas por processos artificiais, tais como antibióticos (penicilina), ácidos orgânicos (cítrico, láctico, etc) e enzimas biológicas (amilases, proteases, pectinases, etc).

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…(2)

2-METABOLISMO

A distinção metabólica dos organismos permite compreender o seu efeito no meio e as necessidades do meio para um crescimento adequado. A distinção básica é entre metabolismo aeróbio, anaeróbio e anóxico. A análise que se segue utiliza a função termodinâmica energia livre (em rigor, antes, a sua variação Go) para distinguir a viabilidade absoluta e relativa dos vários mecanismos metabólicos possíveis. Recordar que Go quantifica estatística e termodinamicamente a possibilidade (viabilidade) de ocorrência espontânea duma dada transformação; esta é tanto mais provável de ocorrer (na ausência de outras limitações não termodinâmicas) quanto maior (e negativa) for Go.

AeróbioRefere-se à respiração na presença de oxigénio. Considere-se a oxidação da glicose na presença de oxigénio :

que é uma reacção de oxidação, porque são transferidos electrões da glicose para o oxigénio, ficando o oxigénio reduzido e o carbono oxidado. Neste caso o oxigénio é um aceitador de electrões (receptor). Por isso é que todos os organismos em que o oxigénio é o receptor de electrões, são aeróbios. Todos os organismos superiores, bem como muitos microorganismos são aeróbios, para os quais só o oxigénio funciona como receptor de electrões. Este tipo de fermentação designa-se por aeróbia, e é o mecanismo principal que está na base do processo de compostagem. Notar que esta reacção tem uma Go extremamente negativa, significando portanto estatisticamente e termodinamicamente ser o processo (via) mais favorável entre todas as possíveis, como se verá adiante; esta energia corresponde também à energia máxima possível de libertar (extrair) num processo oxidativo da glicose.

AnóxicoÉ o tipo de metabolismo dos organismos que usam outros compostos como receptores de electrões dos quais os mais importantes são os óxidos inorgânicos de azoto e enxofre tais

como nitrato (NO-3), nitrito (NO-

2) e sulfato (SO=4), assim, como o dióxido de carbono que

geralmente é convertido a metano. Muitos organismos conseguem funcionar com vários destes receptores de electrões, sendo denominados de facultativos. A oxidação da glicose usando o sulfato como receptor de electrões é:

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…(1)

De notar que neste caso a energia disponível é consideravelmente menor em relação ao processo aeróbio. Para uma melhor eficiência química, os microorganismos começam por usar os receptores de electrões disponíveis que permitem uma maior produção de energia,

assim a ordem porque são usados é: O2, NO-3 e SO=

4. Isto é um factor favorável pois

assim é possível evitar a formação de H2S (tóxico) desde que se mantenham condições aeróbicas.

O uso do nitrato como receptor de electrões é denominado desnitrificação e segue os seguintes passos.

NO-3 ® NO-

2 ® N2O ® N2 Nitrato Nitrito Óxido nitroso Azoto

sendo as principais bactérias desnitrificantes as seguintes: Bacillus denitrificantes, Micrococcus denitrificans, Pseudomonas stutzeni e Achromobacter. Justifica-se assim a produção do gás de estufa N2O em fermentações. As fermentações anóxicas podem também ocorrer em processos de compostagem.

AnaeróbioSe já não houver mais receptores de electrões disponíveis num meio a oxidação dá-se na mesma. Assim considerar a seguinte reacção:

Aqui, os electrões removidos pelo CO2 são, em última análise, aceites pelo metano. A

reacção é do tipo oxidação-redução mas o receptor e o dador de electrões têm origem na mesma molécula. Este tipo de reacções na ausência de ar, denomina-se de fermentação anaeróbia, e está na base do processo de biometanização (ou digestão anaeróbia).

O metabolismo anaeróbio é bastante mais complexo do que a reacção de fermentação da glicose esquematizada. A digestão anaeróbia é um processo sequencial levado a cabo por vários organismos e com a formação de vários produtos intermediários.

Inicialmente pensou-se que as bactérias metanogénicas podiam formar metano directamente a partir de materiais orgânicos complexos - metanogénese directa. (Fig.3a).

Posteriormente foi suposto que o substrato em digestão anaeróbia passa através de uma fase acidogénica, antes de ser utilizado pelas bactérias metanogénicas. As bactérias acidogénicas utilizam os materiais orgânicos complexos, produzindo principalmente ácidos voláteis, dióxido de carbono e hidrogénio (primeiro passo), enquanto que as bactérias metanogénicas utilizam estes compostos mais simples, principalmente o ácido acético, para produzir os produtos finais, que são o metano e o CO2 (segundo passo). (Fig.3b).

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Para fins práticos a digestão anaeróbia continua a ser considerada como um processo em dois passos, fase não metanogénica (inclui a hidrólise e fase acidogénica) e fase metanogénica, sendo a primeira fase industrialmente importante devido aos produtos formados. Uma série de reacções possível é a da Tabela 1, que abrangem uma larga gama de valores de energia livre. Numa mistura de populações microbiológicas espera-se que predomine a reacção que envolva maior variação de energia livre. Em condições anaeróbias, no caso da glicose, a máxima libertação de energia (ou variação de Go) ocorre quando todo o substrato é transformado em CO2 e CH4 (-96 Kcal/mole, eq. 3), que é bastante menor que a oxidação da mesma glicose em condições aeróbias (-677 Kcal/mole, eq. 1), mesmo referindo ao mesmo número de electrões.

Tabela 1 - Possíveis fermentações anaeróbias da glicose

Produtosfinais

Reacções GO

(pH = 7)

(Kcal/mole

glucose)

Acetato C6H12O6 ® 3CH3COO- + 3H+ - 78,55

Propionato, Acetato, H2

C6H12O6 ® CH3CO2COO- + CH3COO- +2H+ + CO2 + H2- 70,84

Butírico C6H12O6 ® CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 - 61,7

Etanol C6H12O6 ® 2CH3CH2OH + 2CO2 - 51,14

Lactato C6H1206 ® 2CH3CH(OH)COO- + 2H+ - 49,5

Metanol C6H12O6 + 2H2O ® 4CH3OH + 2CO2 - 21,42

Actualmente está demonstrado que de todos os ácidos voláteis apenas o fórmico e o acético são substratos para as bactérias metanogénicas e uma vez que na digestão são produzidos outros substratos sem se observar a sua acumulação, admite-se a presença de uma população intermédia de microorganismos que converte os vários orgânicos em formato, acetato, hidrogénio e dióxido de carbono, que por sua vez constituem o substrato para as bactérias metanogénicas. Essa população intermédia de microorganismos compreende as bactérias produtoras de hidrogénio e as bactérias acetogénicas utilizadoras de hidrogénio, sendo estas últimas capazes de produzir acetato a partir de hidrogénio e dióxido de carbono. As bactérias metanogénicas poderão ser bactérias utilizadoras de hidrogénio segundo a reacção:

4H2 + CO2 = CH4 + 2H2O GRo = -32,4 Kcal/mole

ou bactérias utilizadoras de ácido acético segundo a reacção:

CH3COOH = CH4 + CO2 GRo = - 7,5 Kcal/mole

Assim, o metabolismo completo em condições estritamente anaeróbio é uma metanogénese em vários passos, sendo o acetato o principal intermediário e o hidrogénio um possível inibidor. (Fig.3c.). Outra representação possível e simplificada do processo está indicada na Fig. 4.

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Figura 3- Evolução dos conhecimentos sobre os mecanismos de fluxo de substrato na digestão anaeróbia (Duarte et al., 1983).

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Todo o processo resulta dum complexo equilíbrio, muito precário, entre pelo menos quatro tipos de bactérias. A microbiologia do processo foi estudada por Marty (1985) e Mosey (1983), e pôs em evidência o papel regulador do H2

naquele equilíbrio: um aumento excessivo da concentração de H2

provoca uma inibição na conversão de propiónico e butírico em acético, com abaixamento significativo de pH; como as bactérias metanogénicas não se desenvolvem a esse pH, o digestor pára. Daí a importância da monitorização do H2 de modo a evitar a sua acumulação.

O metabolismo aeróbio parece mais simples do que o anaeróbio, pois em condições aeróbias os produtos finais são quase sempre CO2 e água, ao

contrário da complexidade de produtos que se obtêm em condições anaeróbias. As reacções anaeróbias produzem menos calor e são mais lentas do que as reacções aeróbias, sendo geralmente necessário fornecer calor num processo anaeróbio e oxigénio num processo

aeróbio. Para concentrações de substrato semelhantes, a digestão anaeróbia pode produzir energia numa forma mais útil (metano) do que a digestão aeróbia (calor), visto que a energia armazenada na forma de CH4 tem maior flexibilidade na sua utilização. Notar que o total (máximo) de energia contida num substrato orgânico só é desbloqueada em fermentação aeróbia, quando os produtos finais são CO2 + H2O (mínimo de GR

o , eq. 1). Na fermentação anaeróbia apenas parte dessa energia é desbloqueada (menor GR

o, eq. 3) visto que o restante está virtualmente ainda na forma de CH4; só quando este for queimado se obtém o restante da energia inicial, conduzindo aos mesmos produtos finais (CO2 + H2O) que a fermentação aeróbia, como seria de esperar.

Metabolismo das bactérias e dos fungosAs bactérias na sua enorme diversidade de géneros e espécies, podem viver em condições aeróbias, anaeróbias ou anóxicas. No fungos, os bolores são aeróbios enquanto que as leveduras apresentam metabolismo aeróbio ou anaeróbio.

A classificação metabólica dos organismos considera as fontes de carbono e de energia usadas pelos organismos, do seguinte modo:

FONTE ORGANISMOS

Figura 4-Sequência de reacções em digestão anaeróbia.

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CarbonoMoléculas orgânicas HeterotróficosDióxido de carbono Autotróficos

EnergiaReacções redox (orgânicas) OrganotróficosReacções redox (inorgânicas) LitotróficosLuz Fototróficos

Com duas fontes de carbono e três fontes de energia poderiam imaginar-se seis categorias nutricionais. Contudo, são conhecidas algumas restrições: (a) só as bactérias são capazes de usar compostos inorgânicos como fonte de energia; (b) todos os organismos litotróficos são também autotróficos; (c) todos os organismos organotróficos são também heterotróficos. Assim, existem apenas quatro categorias das seis categorias nutricionais possíveis, como se mostra na Tabela 2 e que são: fotoautotróficas, fotoheterotróficas, litoautotróficas e organoheterotróficas.

A Tabela 3 mostra os vários tipos de respiração usados por vários grupos de microorganismos responsáveis pela degradação dos resíduos sólidos.

Os fungos são eucariotas e organoheterotróficos, geralmente saprófitas, decompondo matéria orgânica no solo e ambiente aquático, por qualquer das suas subdivisões: bolores (aeróbios e de estrutura filamentosa) e leveduras (unicelulares facultativos). Os fungos assemelham-se às bactérias organotróficas no sentido em que usam essencialmente os mesmos substratos. Ambos podem alimentar-se de substratos sólidos pois têm a capacidade de segregar enzimas extracelulares. Os fungos são contudo menos afectados por ambientes com baixa humidade e podem existir em substratos secos, captando o vapor de água do ar atmosférico. São também menos sensíveis a valores extremos de pH e requerem menos azoto que as bactérias. Os fungos são assim mais resistentes em ambientes de fermentação mais adversos, encontrando-se por isso em praticamente todos os locais da massa em compostagem; as bactérias são mais selectivas nos ambientes em que se desenvolvem.

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TABELA 2 - Categorias metabólicas baseadas nas fontes de carbono e energia___________________________________________________________________________________________________________________

Tipo de nutrição Principal fonte de energia Principal fonte de carbono

Organismos

Fotoautotróficos Luz CO2 Algumas bactérias, maioria das algas, plantas superiores

Fotoheterotróficos Luz Orgânicos Algumas algas, algumas bactérias

Litoautotróficos Reacções redox de compostos inorgânicos CO2 Algumas bactérias

Organoheterotró-

ficos1Reacções redox de compostos orgânicos Orgânicos2 Animais superiores, protozoários, fungos e a maioria das bactérias

____________________________________________________________________________________________________________________

1 Na nutrição saprófita o material orgânico usado está morto. Na nutrição por predação ou parasitismo alguns ou todos os materiais usados estão vivos.

2 Classificam-se neste grupo algumas bactérias capazes de usar o CO2 como fonte de carbono embora esta não seja uma prática energeticamente favorável.

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TABELA 3 - Tipos gerais de metabolismo litoautotrófico e organoheterotrófico___________________________________________________________________________________________________________________

Redutor Oxidante Produtos Fonte de carbono

Respiração Categoria metabólica Tipo, organismo representativo

NH+4, NH3

O2 NO-2, H2O CO2 Aeróbia Litoautotrófico Bactérias nitrificantes

Nitrosomonas

NO-2

O2 NO-3

CO2 Aeróbia Litoautotrófico Bactérias nitrificantesNitrobacter

S2-, H2S O2 SO2-4

CO2 Aeróbia Litoautotrófico Bactérias oxidantes de enxofreThiobacillus, Thiothrix

Fe2+ O2 Fe3+, H2O CO2 Aeróbia Litoautotrófico Bactérias, oxidantes de ferroFerrobacillus

Fe2+ NO-3 Fe3+, N2, H2O CO2 Anóxica Litoautotrófico Bactérias, oxidantes de ferro

Ferrobacillus

H2 O2 H2O CO2 Aeróbia Litoautotrófico Bactérias do hidrogênio

H2 CO2 CH4, H2O CO2 Anaeróbia Litoautotrófico Bactérias redutoras de CO2,Methanobacterium

Orgânicos O2 CO2, H2O Orgânicos Aeróbia Organoheterotrófico Muitas bactérias

Orgânicos NO-3

CO2, H2O, N2 Orgânicos Anóxica Organoheterotrófico Bactérias desnitrificantes

Orgânicos SO2-4

CO2, H2O, H2S Orgânicos Anóxica Organoheterotrófico Bactérias redutoras de enxofreDesulfovibrio

Orgânicos Orgânicos Muitos intermediários, produtos finais CH4 mais CO2

Orgânicos Anaeróbia Organoheterotrófico Bactérias formadoras de ácido,bactérias formadoras de metano

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BIBLIOGRAFIA

Marty, B. (1985). “Microbiology of anaerobic digestion”. In: Anaerobic Digestion of Sewage Sludge and Organic Agricultural Wastes (Ed.s Bruce, A., Katsiris, A. and Newman, P.), Elsevier.

Mosey, F. (1983). “Mathematical modelling of the anaerobic digestion process: regulatory mechanisms for the formation of short-chain volatile fatty acids from glucose”. Water Sci. and Technology, 15, 209-232.

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