UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARAN

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARAN

CENTRO DE ENGENHARIAS E CINCIAS EXATAS

CURSO DE ENGENHARIA QUMICA

DENISE APARECIDA ZEMPULSKI

JSSI CAUANA HECK

MAYARA CEREJA PASTORIZA

VANESSA LIZRIA ALFLEN

MEIOS DE CULTURATOLEDO

2008

DENISE APARECIDA ZEMPULSKI

JSSI CAUANA HECK

MAYARA CEREJA PASTORIZA

VANESSA LIZERIA ALFLEN

MEIOS DE CULTURARelatrio apresentado como requisito parcial de avaliao da disciplina de Laboratrio de Engenharia Qumica I, do curso de Engenharia Qumica, da UNIOESTE Campus Toledo.

Professor: Srgio Luiz de Lucena.

TOLEDO

2008

SUMRIO

LISTA DE FIGURASiiiLISTA DE TABELASivRESUMOv1 NUTRIO E METABOLISMO BACTERIANOS1

1.1 FONTES DE ENERGIA1

1.2 FONTES DE MATERIAL PLSTICO2

1.2.1 Fontes de carbono2

1.2.2 Fontes de nitrognio2

1.2.3 ons Inorgnicos Essenciais3

1.2.4 Fatores de crescimento4

1.3 GUA4

1.4 OXIGNIO ATMOSFRICO4

2 MEIOS DE CULTURA5

2.1 COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA5

2.2 ESTADOS FSICOS DOS MEIOS DE CULTURA8

2.2.1 Aplicaes de acordo com os estados fsicos 92.2.1.1 Meios slidos9

2.2.1.1.1 Gelose Simples (Columbia)92.2.1.1.2 Gelose Sangue9

2.2.1.1.3 Gelose Chocolate92.2.1.1.4 Gelose Tripcase Soja9

2.2.1.1.5 Isolamento seletivo e diferenciao de Salmonella e Shigella2.2.1.1.6 Gelose Sabouraud10

2.2.1.1.7 Portagerm10

2.2.1.2 Meios Lquidos11

2.2.1.2.1 Meio de Todd-Hewitt11

2.2.1.2.2 Meio de Tioglicolato11

2.2.1.2.3 Meio de Carne11

2.2.1.2.4 Meio de Tetrationato (meio de Muller-Kauffmann)11

2.2.1.2.5 gua de Peptona Alcalina11

2.3 TIPOS DE MEIOS12

2.3.1 Meios para o cultivo de bactrias12

2.3.2 Meios para o cultivo de Fungos16

2.3.3 Meios de Cultura de Protozorios172.3.4 Meios para Cultivo de Algas182.4 MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS19

2.4.1 Meios Com Finalidades Especiais Meios Especiais19

2.4.1.1 Meios para Anaerbios19

2.4.1.2 Meios Seletivos

2.4.1.3 Meios Diferenciais

2.4.1.4 Meios Seletivos/Diferenciais

2.4.1.5 Meios de Enriquecimento

2.5 CONSERVAO DE MEIOS DE CULTURA

2.5.1 Tcnicas de Assepsia

2.5.2 Manuteno e Conservao de microrganismos viveis no laboratrio2.5.2.1 Manuteno em Meio Slido2.5.2.2 Congelao ou Criogenia

2.5.2.3 Recobrimento Com Camada de leo Mineral Estril

2.5.2.4 Liofilizao3 QUESTES

CONCLUSO

12REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS13LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Bactria Thiobacillus2

Figura 2 (a) Bactrias Azotobacter, (b) Rhizobium3

Figura 3 - No meio de MacConkey em: (a) Escherichia coli, (b) Pseudomonas aeruginosa6Figura 4 Sistema de microcpsulas API 20E7Figura 5 - Escherichia coli.13

Figura 6 - Lactobacillus acidophilus.14

Figura 7 - Treponema pallidum.15Figura 8 - Fungos na Laranja16Figura 9 - Fungos na carne17Figura 10 - Tetrahymena pyriformis17Figura 13 - Ansa de inoculao.

Figura 14 Tubos de ensaio rolhados contendo uma determinada cultura em meio slido.

Figura 15 Tubos de ensaio rolhados.

Figura 16 Incubadora (espcie de geladeira) para conservao de microrganismos em meios de cultura.

Figura 17- Frasco com substrato areno-orgnico, contendo microesclerdios de Macrophomina phaseolina, e pronto para ser armazenado em temperatura de geladeira (5 2C).

Figura 18 Botijes criognicos para armazenar culturas a baixas temperaturas.

Figura 19 Equipamento de liofilizao.

Figura 20 Modelo de ampolas utilizdas na liofilizao.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Meio quimicamente definido para uma bactria quimioautotrfica.12

Tabela 2 - Meio quimicamente definido para uma bactria heterotrfica.14

Tabela 3 - Composio do caldo nutriente, um meio complexo para o crescimento de uma bactria heterotrfica.15

RESUMO

1 NUTRIO E METABOLISMO BACTERIANOS

Todos os seres vivos possuem as mesmas necessidades nutritivas que, para renovarem seu protoplasma, que o conjunto de estruturas vivas presentes nas clulas; e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fontes de material plstico (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

H apenas dois tipos nutritivos para os seres superiores: os vegetais que so fotossintticos, ou seja, obtm energia da luz solar, e autotrficos, cuja nutrio exclusiva de substncias inorgnicas; e os animais que so quimiotrficos, obtm energia custa de reaes qumicas, e heterotrficos, necessitam de fontes orgnicas de carbono. Entre os microorganismos h uma variedade de tipos intermedirios (BORZANI, 2001).

1.1 FONTES DE ENERGIA

Nas algas o principal pigmento fotossinttico a clorofila, assim como nas plantas, durante o processo, a gua usada como doadora de eltrons com desprendimento de oxignio. Este processo muito importante e aproximadamente 50% do oxignio presente na atmosfera provm dele. Nas bactrias o pigmento fotossinttico a bacterioclorofila e no h produo de oxignio, pois a gua no utilizada como fonte de eltrons. As bactrias que utilizam compostos inorgnicos, como o H2S, so chamadas litotrficas; as que exigem doadores orgnicos de eltrons so chamadas de organotrficas (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

As litotrficas oxidam compostos inorgnicos e as organotrficas oxidam compostos orgnicos. No entanto, a maioria das bactrias quimiotrfica, as quais obtm energia custa das reaes qumicas onde substratos adequados so oxidados. Neste grupo so encontradas bactrias de grande importncia, como as do gnero Thiobacillus (Figura 1) que conseguem oxidar enxofre, produzindo cido sulfrico. Sendo ento, utilizadas na lixiviao de metais e minrios pobres, como o cobre e o urnio, pois o processo qumico usual de extrao no seria muito econmico (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

Figura 1 Bactria Thiobacillus

1.2 FONTES DE MATERIAL PLSTICO

Para que a matria viva seja renovada, os elementos mais importantes, quantitativamente, so o carbono, o hidrognio, o oxignio, o nitrognio, o enxofre e o fsforo.

1.2.1 Fontes de carbono

Para sintetizar todos os compostos orgnicos de que necessitam as autotrficas utilizam como nica fonte de carbono o CO2 ou o on bicarbonato. A maioria das bactrias so heterotrficas e as fontes de carbono mais comuns so os carboidratos, em particular D-glicose, aminocidos, cidos monocarboxlicos, lipdios, lcoois e polmeros como amido e celulose. O fato de que qualquer composto orgnico natural e muitos sintticos poderem ser usados por algum microorganismo, de grande importncia, pois permite o emprego destes microorganismos numa srie de transformaes para o homem (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

1.2.2 Fontes de nitrognio

Com relao s necessidades de nitrognio, algumas bactrias retiram o nitrognio diretamente da atmosfera e o convertem a nitrognio orgnico. Essa fixao de nitrognio exercida por bactrias dos gneros Azotobacter e Rhizobium (Figura 2), que executam esta atividade em simbiose com plantas leguminosas, contribuindo de maneira significativa na fertilidade e produtividade do solo. A grande maioria das bactrias utiliza compostos inorgnicos de nitrognio, em especial sais de amnio. Algumas exigem fontes orgnicas de nitrognio, como uma variedade de aminocidos. Em geral o crescimento das bactrias heterotrficas favorecido com a adio de aminocidos ou hidrolisados de protenas (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

(a)

(b)

Figura 2 (a) Bactrias Azotobacter, (b) Rhizobium

1.2.3 ons Inorgnicos Essenciais

As bactrias exigem uma srie de elementos sob a forma de compostos inorgnicos, alm do carbono e nitrognio. Alguns, os macronutrientes, so necessrios em quantidades considerveis, como o fsforo, sob a forma de fosfatos, que importante no metabolismo energtico e na sntese de cidos nuclicos: o enxofre, necessrio por fazer parte de aminocidos como cistina e cistena e para a sntese de vitaminas como biotina e tiamina; o potssio, um ativador de enzimas e regulador de presso osmtica; o magnsio, um ativador de enzimas extracelulares e fator de grande importncia na sntese de protenas e unio das fraes ribossmicas; o ferro, necessrio para sntese dos citocromos e de certos pigmentos. Tm-se tambm os micronutrientes que, pela dificuldade de estudo, eles no so to conhecidos. Em alguns casos especficos, h a necessidade de cobre, cobalto, zinco, mangans, milibidenio, sdio, entre outros (BORZANI, 2001).

1.2.4 Fatores de crescimento

Os compostos orgnicos indispensveis para um determinado microorganismo, mas ele no consegue sintetizar, so chamados de fatores de crescimento. Esses fatores devem estar no meio para que o microorganismo possa crescer. Estes fatores podem ser as vitaminas, principalmente as do complexo B, ou aminocidos, nucleotdeos e cidos graxos (BORZANI, 2001).Um aspecto importante que quando um microrganismo exige um fator especfico, seu crescimento ser limitado quantidade deste fator presente no meio, ou seja, seu crescimento ser proporcional ao teor de composto limitante. Assim, permite que um mtodo de dosagem de certos compostos seja elaborada, como as vitaminas e aminocidos, baseado na medida do crescimento microbiano. Este fundamento chamado de dosagem microbiolgica (BORZANI, 2001).1.3 GUA

A gua no um nutriente, mas indispensvel para o crescimento microbiano. As bactrias tm sua nutrio pela passagem de substncias em soluo atravs da membrana citoplasmtica e a gua exerce a funo de regular a presso osmtica e presso trmica, por ter elevado calor especifico. Grande parte das bactrias quando no esporulada, morre rapidamente por dessecao (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).1.4 OXIGNIO ATMOSFRICO

O oxignio tambm no nutriente, mas receptor final de hidrognio nos processos de respirao aerbica. As bactrias aerbias exigem pequena quantidade de oxignio livre e no toleram as presses normais de oxignio presente na atmosfera, so as microaerfilas. As anaerbias estritas no toleram a presena de oxignio livre e morrem rapidamente nessas condies; as anaerbias no-estritas no utilizam o oxignio atmosfrico. E por fim as facultativas que podem crescer tanto na presena quanto na ausncia do oxignio atmosfrico (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

2 MEIOS DE CULTURA

Em laboratrio, com condies artificiais, o crescimento de bactrias conseguido atravs da semeadura das mesmas em meios de cultura, cuja composio deve atender as necessidades nutritivas dos microorganismos. Pela grande variedade de tipos nutritivos, no h um meio de cultura universal. Muitas vezes, o que exigido por uma determinada bactria inibe totalmente o crescimento das outras; e o que acontece com a matria orgnica necessria ao crescimento de heterotrficas, que na maioria das vezes inibe o crescimento das autotrficas. Ento para compor um meio adequado, se faz necessrio conhecer a fisiologia das bactrias em questo (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

2.3 COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura so divididos basicamente em dois grandes grupos: os meios sintticos e os meios complexos.

Os meios sintticos so aqueles cuja composio qualitativa e quantitativa. Tem-se como exemplo o seguinte meio: NH4Cl, 1,0g; K2HPO4, 1,0g; MgSO4.7H2O, 0,2g; FeSO4.7H2O, 0,01g; CaCl2, 0,02g; MnCl2.4H2O, 0,002g; NaMoO4.2H2O, 0,001g; gua em quantidade suficiente para 1,0 L.. Este meio tambm est de acordo com os princpios citados anteriormente, no que se refere fonte de nitrognio e ons inorgnicos, no entanto no contm uma fonte de carbono em de energia, mas isto acontece porque o meio foi planejado para a cultura de fotolitotrficas, que s contem material inorgnico, a fonte de carbono o CO2 que vem do ar e a fonte de energia a luz solar. Para o desenvolvimento das bactrias nesse meio elas devem ser incubadas em presena de luz e em condies de aerobiose (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).Se fosse adicionado 0,5g de glicose a esse meio, ele ainda seria considerado sinttico, mas contendo uma fonte de orgnica de energia e carbono (glicose), permitindo o crescimento de bactrias como a Escherichia coli (Figura 3), habitantes normal do intestino de mamferos. Essas bactrias tm excepcionais capacidades de sntese, pois a partir da glicose e dos sais minerais do meio consegue fabricar todos os componentes do protoplasma. Se forem acrescentados outros tipos de aminocidos, poder haver o crescimento de um numero cada vez maior de microorganismos, e o meio ainda ser considerado sinttico (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).

Para o cultivo de microorganismos mais exigentes, pode-se enriquecer o meio com substncias capazes de fornecer uma grande variedade de aminocidos e vitaminas. A partir desse momento o meio passou a ser complexo (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005).Os meios complexos so quimicamente indefinidos, pois so preparados a partir de produtos naturais, mas eles tm a funo de simular e at mesmo melhorar o ambiente natural dos microorganismos em questo. Os exemplos de produtos naturais adicionados ao meio so extratos de carne, peptonas, extrato de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido de rmen de bovino. Estes substratos so substncias qumicas complexas que contm acares, aminocidos, vitaminas e sais e sua composio exata indefinida. Os produtos naturais que so adicionados estimulam o crescimento de uma variedade grande de heterotrficos. Como exemplo, os extratos de leveduras contem vitaminas do complexo B que permitem o crescimento bacteriano (PELCZAR et al, 1996).

Diversos meios diferentes esto disponveis comercialmente, como exemplo, a Figura 4, desde os que permitem de muitos microorganismos at aqueles que permitem o crescimento de apenas um tipo de microorganismo. Alguns at possuem indicadores qumicos para detectar mudanas de pH devido ao metabolismo da substratos (PELCZAR et al, 1996).

(a)

(b)

Figura 3 - No meio de MacConkey em: (a) Escherichia coli, (b) Pseudomonas aeruginosaNa Figura 3 em (a), no meio MacConkey, a Escherichia coli forma colnias vermelhas, esta colorao vermelha devida reao de um corante vermelho neutro com o cido formado a partir da fermentao da glicose pela E. coli. A Pseudomonas aeruginosa, no forma colnias coloridas(PELCZAR et al, 1996).Alguns fabricantes produziram microcpsulas de plstico, para uma rpida identificao dos microorganismos, cada uma delas contento um meio de cultura desidratado diferente, como mostra a Figura 4 (PELCZAR et al, 1996).

Figura 4 Sistema de microcpsulas API 20EEste sistema da Figura 4 serve para a identificao das bactrias Gram-negativas, sendo uma verso em miniatura dos procedimentos bioqumicos convencionais. um sistema de microtubos pronto para uso destinado realizao de testes bioqumicos padres nas colnias isoladas de bactrias retiradas do meio de uma placa (PELCZAR et al, 1996). Os microtubos contm os substratos das reaes bioqumicas na sua forma desidratada, sendo estes hidratados pela adio da suspenso bacteriana salina, para criar uma atmosfera de anaerobiose, que fundamental para a realizao de reaes fermentativas. As galerias so ento incubadas de 18 a 24 horas e de 35 a 37C. A leitura dos testes bioqumicos da galeria feita pela observao da modificao da cor, aps os vrios sistemas indicadores terem sido afetados pelos metablicos bacterianos ou pelos reagentes adicionados. A identificao de bactrias desconhecidas ento feita recorrendo a tabelas ou sistemas automatizados, fornecidos pela casa comercial [1].

Existem tambm instrumentos que permitem a semeadura de mltiplas amostras de uma suspenso bacteriana nos meios de uma nica etapa, em vez de semear uma a uma. Outros sistemas eficientes oferecem uma placa de Petri dividida em vrios compartimentos, e cada um contm um meio solidificado diferente, que pode ser semeado com uma gota de suspenso microbiana. Com um programa computacional pode-se comparar os resultados obtidos nestes meios com os resultados obtidos de um microorganismo conhecido. Os meios podem ser preparados a partir de matrias-primas ou ps desidratados. (PELCZAR et al, 1996).2.4 ESTADOS FSICOS DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura podem ser constitudos simplesmente por solues de nutrientes. Geralmente os microrganismos tm maior facilidade de iniciar o seu crescimento nesse tipo de meio, principalmente se o seu nmero de incio pequeno. Quando, todavia, existe mais de um tipo de microrganismo no material semeado, o crescimento final ser constitudo de uma mistura destes, o que impede que se tirem concluses a respeito da natureza e da atividade de cada um. Para que as caractersticas de um microrganismo possam ser reconhecidas ou para que sua atividade possa ser devidamente aproveitada, ele deve-se encontrar em cultura-pura, isto , no deve ser misturado a outros. (BORZANI et al, 2001)

Porm, quando existe mais de uma espcie de microrganismo se desenvolvendo no meio liquido no final teremos uma mistura deles. Para que possamos trabalhar com os mesmos separadamente necessrio fazer o isolamento, o que normalmente conseguido, semeando-os num meio slido, normalmente na superfcie. Assim, se a mistura de germes for convenientemente diluda e espalhada na superfcie do meio slido cada microorganismo estar separado de seu vizinho e se multiplicar formando colnias de indivduos da mesma espcie e assim essas colnias podem ser isoladas e cultivadas em separado, o que permite o estudo de cada espcie individualmente. (TRABULSI e ALTERTHUM, 2005)

Os meios slidos so preparados adicionando um agente solidificador s solues com nutrientes. O agente mais utilizado o Agar que um polissacardeo extrado de algas que funde a cerca de 100C e se solidifica a cerca de 40C. a adio de 1,5 a 2% de Agar suficiente para a solidificao dos meios (BORZANI et al, 2001).

Como o Agar um material orgnico, ele poder inibir o crescimento de alguns microrganismos autotrficos. Neste caso podemos utilizar slica gel como agente solidificante. Outra substncia que pode ser utilizada para solidificar meios a gelatina, no entanto tem o inconveniente de se fundir a temperatura relativamente baixa e assim s pode ser utilizada com microrganismos que se desenvolvem em temperaturas relativamente baixas (