Profa. Renata Faier Calegario

Profº Bruno Portela Brasileiro

Marcadores Moleculares

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

Marcadores genéticos

• Marcador: função de identificar ou etiquetar;

• Marcadores genéticos: marcar alelos cuja expressão seja de difícil identificação;

• Selecionar o alelo de interesse de forma indireta, por meio do marcador;

Marcadores genéticos

• Deve ser herdável e de fácil avaliação;

• Deve estar intimamente ligado ao alelo que deseja-se selecionar;

• Estudos de divergência genética, teste de paternidade, seleção etc.

• Marcadores genéticos:– Morfológicos;

– Moleculares.

Marcadores moleculares

• Década de 70: engenharia genética (biologia molecular);

• Marcadores moleculares:

– Proteínas (produtos diretos dos alelos);

– DNA (seqüências de DNA situadas próximas aos genes que queremos marcar).

Características que permitem a distinção de indivíduos

geneticamente diferentes

Marcadores

(BORÉM, 1997).

INTRODUÇÃO

Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares

Marcadores Genéticos

Melhoramento Genética

mendeliana

Genética de

populações

Genética

molecular Organização do

genoma

Sequenciamento

Transferência

gênica

Aplicações: diversas áreas do conhecimento

Constituição genética de um organismo

=> o conjunto de genes

Fenótipo

Características visíveis de um indivíduo

Sofre influência:

• Genótipo

• Fatores ambientais

Genótipo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

DiplóideHaplóide

Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos

Local ocupado pelo

gene no cromossomo

Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo

Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene

em ambos os cromossomos homólogos

Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene

em ambos os cromossomos homólogos

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Gene Recessivo (a)

• Só manifesta o fenótipo

quando em homozigose (aa)

• Presente em dose dupla

(dois alelos iguais)

Gene Dominante (A)

• Manifesta o mesmo

fenótipo em homozigose

(AA) e heterozigose (Aa)

DOMINÂNCIA

A1A1 A1A2 A2A2

Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ DOMINANTES”

=> exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

2 alelos recessivos no mesmo

loco: Ausência de banda – só

amplifica locus com alelos

dominantes

A1= alelo dominante

Presença de bandas

A1A1 A1A2 A2A2

Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ CO-DOMINANTES”

=> Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

Genes no mesmo

locus

Monomorfismo e Polimorfismo

✓ Marcadores MorfológicosCaracterísticas fenotípicas do organismo

Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala

✓ Marcadores BioquímicosPresença ou ausência de compostos

Ex. isoenzimas e proteínas

✓ Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA

Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

TIPOS DE MARCADORES

CONCEITO DE MARCADOR dominante e co-dominante

Dominante Co-Dominante

Tipos de Marcadores

✓Reprodutibilidade

✓Amplamente distribuído através do genoma

✓Poder de discriminação

✓Ausência de influências ambientais

✓Barato

✓Fácil de mensurar

CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR

✓ Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA

✓ Características polimórficas herdáveis que refletem

diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos

MARCADORES MOLECULARES

Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade

Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene

expresso ou de um segmento específico de DNA

APLICAÇÕES

✓ Diversidade genética de organismos

✓Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de

qualquer outra variedade da mesma espécie

✓ Análise da pureza genética de semente

✓Mapeamento de genes e características (associação do marcador

com os genes de interesse)

✓Seleção de genitores

✓ Retrocruzamento assistido...

MARCADORES MOLECULARES

• Não sofre influência do ambiente

• Neutros em relação a efeitos fenotípicos

• N° ilimitado de marcadores e de polimorfismo

• Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta

• Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis

Vantagens

• Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

Desvantagens

AFLP

Restrição e

Hibridização de

sequências DNA

PCR

PCR + restrição...

CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES

RFLP

RAPD, Microssatélites

=> Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo

A partir 1980...

Técnicas para obtenção de padrão polimórfico de DNA

• Marcadores baseados em PCR

– PCR (Reação da polimerase em cadeia).

– RAPD

– ISSR

– Microssatélites

– Minissatélites

– AFLP, etc.

Marcadores isoenzimáticos

• Marcadores de proteína mais utilizados são representados pelas isoenzimas (esterase, fosfatase, peroxidase etc);

• Como são produtos diretos dos alelos, basta identificá-los para selecionarmos os indivíduos com o fenótipo desejado;

• Possuem reduzida variabilidade (polimorfismos);

Marcadores isoenzimáticos

• Os alelos responsáveis pelas proteínas facilmente identificáveis não ocorrem em número suficiente para marcar um grande número de alelos de interesse.

• Ex. Em cevada– Isoenzima esterase para selecionar plantas

resistentes ao vírus do mosaico amarelo.

• Vantagem: menores custos.

Restriction Fragment Length Polymorphism

Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição

✓ Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição

✓ Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA

✓ Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção

✓ Requer conhecimento sequência

RFLP

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

5’...

...5’

...3’

3’...

5’...

3’... ...5’

...3’

Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência

das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’

RFLP

Southern

Blot

Hibridização

Planta, fungo, organismos...

1 . DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose)

3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda

4. Visualização dos fragmentos na membrana

▪ sondas marcadas (32P) ou Fluorescência

5. Análise dos resultados

▪ presença/ausência de bandas

▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

RFLP - METODOLOGIA

Southern blot

Sonda: sequência complementar de DNA alvo

SOUTHERN BLOTTING

Detecta fragmento do DNA específico no DNA genômico

COMO?

Introdução de nucleotídeos marcados em sequências de DNA

✓ Sondas Radioativas = nt 32P

✓ Não-Radioativas = nt biotina/digoxigenina (colorimétrica

ou quimioluminescente)

Gel: Fragmentos DNA

TRANSFERÊNCIA

HIBRIDIZAÇÃO

SOUTHERN BLOTTING

REVELAÇÃO

Tratamentos:DepurinaçãoDesnaturaçãoNeutralização

-- --

--

-

-

--

-

-

--

-Lavagens

Retira excesso de

sonda

Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9

Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4

Eletroforese do DNA cortado

com enzima de restrição

Gel revelado com EtBr => UV

Visualização de arraste contínuo

de fragmentos de DNA

Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética

=> representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético

✓ Trabalhoso

✓ Caro

✓ Uso de sondas radioativas

RFLP

✓ Reprodutibilidade

✓ Marcadores co-dominantes

✓ Simples

Vantagens

Desvantagens

Random Amplification of Polymorphic DNA

Fragmentos de DNA amplificados por PCR

✓ Método mais rápido para detecção de polimorfismos

✓ DNA genômico amplificado por PCR

✓ Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F

✓ Não requer conhecimento da sequência

✓ Marcador dominante

RAPD

1 . DNA é amplificado via PCR com primer aleatório

=> Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos por eletroforese

5. Análise dos resultados

▪ presença/ausência de bandas

▪ diferenças em padrão de bandas reflete diferenças

genéticas

RAPD - METODOLOGIARAPD - METODOLOGIA

A

A B

B

RAPD - METODOLOGIA

DNA

✓ Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos)

✓ Quando se anela em direções opostas = Amplificação

✓ Anelamento em pequenas distâncias

PRIMERS ALEATÓRIOS

Vários Fragmentos

Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum

RAPD - Feijoeiro

marcador

ligado à Co-1

Resistentes à

raça 65

Fonte: Moura, 2005

550 pb

1000 pb

1200 pb

• Rápido e simples - não envolve hibridização

• Baixo custo

• Sem uso de radioisótopos

• Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA

Fonte: IPGRI

RAPD

Vantagens

Desvantagens

• Marcador dominante

• Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são

conhecidos

• Problemas de interpretação: co-migração

- mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro!

- uma banda: um fragmento? Pode ser dois!

• Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em

tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto

Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC

Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC

Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC

Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

MICROSSATÉLITES

• Amplificadas por PCR

• Marcador Co-dominante

• Classe de marcador com maior grau de polimorfismo

• Requer conhecimento prévio da sequência

Sinonímias

• SSR (Simple Sequence Repeats);

• STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

• SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???

• Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)

• Plantas: (AT)n

• Mitocôndrias

• Cloroplastos

MICROSSATÉLITES

MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA

1 . Digestão DNA – Enzimas de Restrição

2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor

3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por

hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas)

4. Sequenciamento dos clones

5. Desenho dos primers

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador Co-dominante

MICROSSATÉLITES

Gel de poliacrilamida

=> Perceber diferenças de nucleotídeos

CACACA

GTGTGT

CACACA

GTGTGT

(CA)3

(CA)3

Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

DETECÇÃO DE LOCUS SSR

Simple Sequence Repeats = Microssatélites

Homozigoto Heterozigoto Homozigoto

MICROSSATÉLITES

cada “ilha” microssatélite

constitui um locus,

multialélico

Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo

diferente do mesmo locus

Marcador multialélico

Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus)

MICROSSATÉLITES

Marcador Molecular com maior conteúdo de informação

de polimorfismo

MICROSSATÉLITES

Vantagens

• Reprodutibilidade

• Requer pequena quantidade de DNA

• Baixo custo

• Grande poder de resolução

• Alto nível polimorfismo – útil para germoplasmas aparentados e de

baixa variabilidade

Desvantagens

• Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers

aleatórios)

• Trabalhoso

• Porém: uma vez desenvolvido é fácil

• Caro

Distâncias e Dissimilaridades

DISSIMILARIDADE utiliza dadosbinários para o cálculo, ou seja,marcadores dominantes. É o complementoda similaridade (Dis= 1- Sim), é um índicede divergência.

DISTÂNCIA utiliza freqüências alélicaspara seu cálculo, ou seja, marcadorescodominantes. Utilizam-se de conceitosgenéticos e/ou geométricos.

Medidas de Dissimilaridades

Objetivo: representar o grau de divergência

entre diferentes populações ou indivíduos.

Os marcadores são interpretados como

dados binários (1 e 0) presença ou

ausência da banda.

Principais índices:

- Jaccard

- Simple Matching (Coincidência simples)

- Dice (Sorensen ou Nei-Li)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Arquivo marcador dominante

Medidas de Dissimilaridades

Medidas de Dissimilaridades

Medidas de Dissimilaridades

Matriz de Similaridade

Distância genética de Nei

Calculando a distância

Arquivo marcador codominante

Distância Nei: Loco 1

Distância Nei: Locos 1, 2 e 3

Análise de Agrupamento

Construção de dendrogramas;

Análise de Agrupamento

UPGMA (Unweighted Pair Grouping

Method with Aritimetical Means) – entre

populações e entre indivíduos/populações.

BIBLIOGRAFIA

1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores Moleculares

Viçosa, MG, 2006

2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicados

a programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPA

Cerrados, Planaltina , DF, 2007.

3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-

extras/marcadores-moleculares/