CAPITULO

Diversidade Genética Humana:Mutação e Polimorfismo

O estudo da variação genética e genômica é o pilar conceituai para a genética na medicina e para o campo maisamplo da genética humana. Durante o curso da evolução,o fluxo constante de nova variação dc nucleotídeos temassegurado um alto grau de diversidade genética e individualidade, e este tema se estende através de todos os camposda genética médica e humana. A diversidade genética podemanifestar-se como diferenças na organização do genoma,como alterações de nucleotídeos na seqüência do genoma,como variações no número de cópias de grandes segmentosde DNA genômico, como alterações na estrutura ou naquantidade de proteínas encontradas em vários tecidos, oucomo qualquer um destes no contexto de doenças clínicas.

Este capítulo é um dos vários em que exploraremos a naturezadas diferençasgeneticamentedeterminadas entre os indivíduos. A seqüência de DNA nuclear é aproximadamente 99,5%idêntica entre dois seres humanos não aparentados. Ainda, éprecisamente a diferença na pequena fração da seqüência deDNA entre indivíduos que é responsável pela variabilidadcgeneticamente determinada, a qual é evidente tanto na existência diária quanto na medicina clínica. Muitas diferenças nasseqüências de DNA têm pouco ou nenhum efeito na aparênciaexterna, ao passo que outras diferenças são diretamente responsáveis por causar doença. Entre esses dois extremos está avariação responsável pela variabilidadcgeneticamentedeterminada na anatomia, na fisiologia, nas intolerâncias alimentares,na suscetibilidade à infecção, na predisposição ao câncer, nasrespostas terapêuticasou nas reaçõesadversasa medicamentos,e talvez até mesmo a variabilidadc em vários traços de personalidade, aptidão atlética e talento artístico.

Um dos conceitos importantes da genética humana emédica é que doenças com um componente claramente hereditário são apenas a manifestação mais óbvia e muitas vezesmais extrema de diferenças genéticas, uma das extremidadesde um continuum de variação que se estende desde variantesdeletérias raras que causam doença, através de variantesmais comuns que podem aumentar a suscetibilidade àdoença, até a variação mais comum na população, a qualapresenta relevância incerta em relação à doença.

ANATUREZA DA VARIAÇÃO GENÉTICAConforme descrito no Capítulo 2, um segmento de DNAque ocupa uma posição ou localização particular no cromossomo é um locus (plural, loci). O locus pode ser grande.

como um segmento de DNA que contém muitos genes,tal qual o locus do complexo principal de histocompati-bilidade, envolvido na resposta do sistema imunológico asubstâncias estranhas; pode ser um gene único, tal como olocus da P-globina que introduzimos no Capítulo 3; ou podeainda ser apenas uma base única no genoma, como no casode um único nucleotídeo variante (Fig. 2-6 e mais adianteneste capítulo). Versões alternativas da seqüência de DNAno locus são chamadas de alelos. Para muitos genes, há umúnico alelo predominante, em geral presente em mais dametade dos indivíduos em uma população, que os gene-ticistas chamam de tipo selvagem ou alelo comum. (Emlinguagem leiga, isso é algumas vezes referido como o alelo"normal". No entanto, como a variação genética é por sisó muito "normal", a existência de alelos diferentes emindivíduos "normais" é trivial. Assim, deve-se evitar o uso"normal" para designar o alelo mais comum.) As outrasversões do gene são alelos variantes (ou mutantes) que diferem do alelo selvagem, devido à presença de uma mutação,uma alteração permanente na seqüência de nucleotídeosou na disposição do DNA. Note que os termos mutação emutantes referem-se ao DNA, mas não aos seres humanosportadores dos alelos mutantes. Os termos denotam umaalteração na seqüência, mas por outro lado não transmitemqualquer conotação com respeito à função ou à capacidadedessa alteração.

A freqüência de variantes diferentes pode variar amplamente em diferentes populações ao redor do mundo, comoexploraremos detalhadamente no Capítulo 9. Se houverdois ou mais alelos relativamente comuns (definidos porconvenção como tendo uma freqüência alélica >1%) emum locus na população, diz-se que esse locus apresentapolimorfismo (literalmente "muitas formas") nessa população. A maioria dos alelos variantes, no entanto, não ésuficientemente freqüente na população para ser consideradacomo polimorfismos;alguns são tão raros a ponto de seremencontrados em apenas uma única família e são conhecidoscomo alelos "particulares".

O Conceito de Mutação

Neste capítulo, começaremos a explorar a natureza damutação, variando desde a alteração de um nucleotídeoúnico a alterações em um cromossomo inteiro. Para sereconhecer uma mudança deve-se comparar aquilo que a

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variante mostra ser uma diferença com um "padrão-ouro".Como vimos no Capítulo 2, não há um único indivíduocuja seqüência do genoma poderia servircomo padrão paraa espécie humana, e assim a seqüência ou arranjo maiscomum na população em qualquer posição no genoma foiarbitrariamente designada como a seqüência de referência{Fig. 2-6). À medida que mais genomas de indivíduos aoredor do mundo são amostrados (e, portanto, mais variaçãoé detectada entre os atualmente sete bilhões de genomasque compõem nossa espécie), este genoma de referênciaestá sujeito a avaliação e mudanças constantes. De fato,uma série de colaborações internacionais compartilha eatualiza dados de ações sobre a natureza e a freqüência devariação no DNA em diferentes populações no contexto daseqüência de referência do genoma humano, e disponibilizaos dados através de bancos de dados públicos, que servemcomo recursos essenciais para cientistas, médicos e outrosprofissionais da saúde (Tabela 4-1).

As mutações são por vezesclassificadas pelo tamanho daseqüência de DNA alterada e, em outros momentos, peloefeito funcional da mutação na expressão gênica. Emboraa classificaçãopor tamanho seja um pouco arbitrária, podeser útil conceitualmente para distinguir as mutações em trêsníveis diferentes:

• Mutações que deixam cromossomos intactos, mas quealteram o número de cromossomos de uma célula (mutações cromossômicas).

• Mutações que mudam apenas uma parte do cromossomoe podem envolver uma alteração no número de cópias deum segmento subcromossômico ou um rearranjo estrutural que envolve partes de um ou mais cromossomos(mutações regionais ou subcromossômicas).

• Alterações na seqüência de DNA que envolvem a substituição, deleção ou inserção de DNA, variando de um nucleo-tídeo único até um limite definido de modo arbitrário de

aproximadamente 100 kb (mutações gênicas ou de DNA).

A base para e as conseqüências desse terceiro tipo demutação são o principal foco deste capítulo, enquantomutações cromossômicas e regionais serão apresentadasnos Capítulos 5 e 6.

Dependendo da localização precisa, da natureza e dotamanho da mutação no DNA, as suas conseqüênciasfuncionais, mesmo aquelas que alteram um único parde bases, podem ir desde conseqüências completamenteinócuas até causar sérias doenças. Por exemplo, umamutação dentro de um éxon codificante de um gene podenão ter nenhum efeito sobre a forma como esse gene é, sea alteração não afetar a seqüência primária de aminoáci-dos do produto polipeptídico; mesmo que isso aconteça,a modificação resultante na seqüência de aminoácidoscodificada pode não alterar as propriedades funcionais daproteína. Portanto, nem todas as mutações se manifestamem um indivíduo.

O Conceito de Polimorfismo Genético

A seqüência de DNA de uma determinada região dogenoma é notavelmente semelhante entre os cromossomostransportados por muitos indivíduos diferentes em todo omundo. De fato, qualquer segmento de DNA humano deaproximadamente 1.000 pb de comprimento, escolhido aoacaso, contém, em média, apenas um par de bases que édiferente entre os dois cromossomos homólogos herdadosdos pais (assumindo que os pais não tenham parentesco).No entanto, em todas as populações humanas, têm sidoidentificados e catalogados muitas dezenas de milhões dediferenças de um único nucleotídeo e mais de um milhão devariantes mais complexas. Devido à amostragem limitada,esses números provavelmente subestimam a verdadeiraextensão da diversidade genética em nossa espécie. Muitaspopulações ao redor do mundo ainda têm de ser estudadas, e mesmo naquelas que foram estudadas, o número

TABELA 4-1 Bancos de Dados Úteis sobreInformações da Diversidade Genética Humana

Descrição URL

O Projeto Genoma Humano, concluído em 2003, foi uma colaboração internacionalpara sequenciar e mapear o genoma da nossa espécie. O rascunho da seqüênciado genoma foi divulgado em 2001, e a montagem do genoma de referência"essencialmente completo" foi publicada em 2004.

O SingJe Nucleotide PolymorphismDatabase (dbSNP)e o Stnictural VariationDatabasc(dbVar) são bancos de dados de variações em pequena e larga escala, incluindovariantes de nucleotídeo único, microssatélites, indels e CNVs.

O 1.000 Genomes Project está sequenciando os genomas de um grande númerode indivíduos para fornecer uma fonte abrangente sobre a variação genéticaem nossa espécie. Todos os dados estão disponíveis publicamente.

O Human Gene Mutation Databasc é uma coleção abrangente de mutaçõesgcrminativas associadas a ou causadoras de doenças hereditárias humanas(atualmente incluindo mais de 120.000 mutações em 4.400 genes).

O Database of Genomic Variants é um catálogo de curadoria de variações estruturaisno genoma humano. Desde 2012, o banco de dados contém mais de 400.000entradas, incluindo mais de 200.000 CNVs, 1.000 inversões e 34.000 indels.

O Japanese Singie Nucleotide Polymorphisras Database (JSNP Database) relataSNPs descobertos como parte do Millennium Genome Project.

http://www.genome.gOv/10001772http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewahttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar/

www.1000genomes.org

www.hgmd.org

http://dgv.tcag.ca

http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/

CNV, variação no número de cópias; SNP, polimorfismo de nucleocídeo único.Atiializ.ndo de WiliardHF: The hiiinangenome: a windowon human genecics, biology and medicine. In GinsburgGS,WillardHF,editors: Genomicand personalized

medicine, ed 2, New York, 2013, Elsevicr.

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICAHUMANA: MUTAÇÃOE POLIMORFISMO 45

de indivíduos examinados é demasiadamente pequenopara revelara maioria das variantes com freqüências alé-licas menores, abaixo de 1% a 2%. Assim, à medida quemais pessoas são incluídas nos projetos de descoberta devariantes, variantes adicionais (e raras) serão certamentedescobertas.

Se uma variante é considerada formalmente como umpolimorfismo ou não, depende inteiramente de se suafreqüência populacional é superior a 1% dos alelos napopulação, e não do tipo de mutação que o causou, dequão grande é o segmento do genoma envolvido, ou seele tem um efeito aparente sobre o indivíduo. A localização de uma variante em um gene também não determinase a variante é um polimorfismo. Embora a maioria dospolimorfismos de seqüência esteja localizada entre genesou dentro de íntrons e seja irrelevante para o funcionamento de qualquer gene, outros podem estar localizadosna seqüência codificante dos próprios genes e resultar emproteínas variantes diferentes que podem, por sua vez,levar a diferenças distintivas em populações humanas.Outros ainda estão em regiões reguladoras e tambémpodem ter efeitos importantes sobre a transcrição ou aestabilidade do RNA.

Pode-se esperar que mutações deletérias que causamdoenças monogênicas raras provavelmente sejam muitoraras para atingir a freqüência necessária para serem consideradas um polimorfismo. Embora seja verdade que osalelos responsáveis pela maioria das condições clínicasclaramente hereditárias sejam raros, alguns alelos que apresentam um efeito profundo sobre a saúde são relativamentecomuns, tais como os alelos de genes que codificam enzimasque metabolizam medicamentos (p. ex., sensibilidade aoabacavir em alguns indivíduos infectados com o vírus daimunodeficiência humana [HIV]) (Caso 1), ou uma mutação falciforme nas populações africanas e afro-americanas(Cap. 11} (Caso 42). No entanto, estas são exceções, e àmedida que mais variaçõesgenéticas são descobertas e catalogadas, fica evidente que a grande maioria das variantes nogenoma, comuns ou raras, reflete diferenças na seqüênciade DNA que não têm nenhum significado conhecido paraa saúde.

Os polimorfismos são elementos-chave para o estudoda genética humana e médica. A capacidade de distinguirdiferentes formas de herança de um gene ou diferentessegmentos do genoma fornece ferramentas essenciais parauma vasta gama de aplicações, tanto na pesquisa quanto naprática clínica (Quadro).

VARIAÇÃO HERDADA EPOLIMORFISMONO DNA

o Projeto Genoma Humano original e o estudo subsequente atual de milhares de indivíduos em todo o mundo têm

proporcionado uma grande quantidade de informaçõessobre a seqüência de DNA. Com essas informações emmãos, pode-se começar a caracterizar os tipos e as freqüências de variações polimórficas encontrados no genoma humano e gerar catálogos da diversidade de seqüência

POLIMORFISMOS EVARIAÇÃO HERDADA EM GENÉTICAHUMANA EMÉDICA

As variantes alélicas podem ser utilizadas como "marcadores" para rastrear a herança do segmento genômicocorrespondenteem famílias e em populações. Taisvariantespodem ser usadas:• Como ferramentas de pesquisa poderosas para mapear

um gene em uma determinada região de um cromossomo por análise de ligação ou por associação alélica(Cap. 10)

• Para diagnóstico pré-natal de doenças genéticas e paradetecção de portadores de alelos deletérios (Cap. 17),bem como em bancos de sangue e tipagem de tecidospara transfusões e transplantes de órgãos

• Emaplicações forenses, taiscomotestes de identificaçãopara determinar a paternidade, identificar restos mortais de vítimas de crimes, ou para comparar o DNA dosuspeito com o do agressor (neste capítulo)

• No esforço contínuo de fornecer medicinapersonalizada baseadaem genômica (Cap. 18), na qual o cuidadomédico individual é adaptado conforme o pacientecarregue ou não variantes que aumentam ou diminuemo risco para transtornos comuns em adultos (comodoenças cardíacas coronarianas, câncer e diabetes,Cap. 8) ou que influenciama eficácia ou segurança demedicamentos específicos

do DNA humano ao redor do mundo. Os polimorfismosde DNA podem ser classificados de acordo com a formacomo a seqüência de DNA varia entre os diferentes alelos(Tabela 4-2 e Figs. 4-1 e 4-2).

Polimorfismos de Nucleotídeo ÚnicoOs mais simples e comuns de todos os polimorfismos são ospolimorfismos de nucleotídeo único (SNPs, do inglês, singlenucleotide polymorphistns). Um locus caracterizado por umSNPgeralmente temapenasdoisalelos,quecorrespondem aduas bases diferentes que ocupamuma localização específicano genoma (Fig. 4-1). Como mencionado anteriormente,os SNPs são comuns e são observados em média uma veza cada 1.000 pb no genoma. Entretanto, a distribuição deSNPs é desigual em todo o genoma; muito mais SNPs sãoencontrados em regiões não codificantes do genoma, emíntrons e em seqüências que estão a alguma distância degenes conhecidos. No entanto, há ainda um número significativo de SNPsque ocorrem em genese em outros elementosfuncionaisconhecidos no genoma. Para o conjunto de genescodificantes de proteínas, mais de 100.000 SNPs exônicosforam documentados até o momento. Cerca de metade desses não alteram a seqüência de aminoácidos prevista para aproteína codificada e são assim denominados de sinônimos,enquanto a outra metade altera a seqüência de aminoácidose compreende os chamados não sinônimos. Outros SNPsintroduzem ou alteram um códon de parada (Tabela 3-1), eoutros ainda alteram um sítio de splicing conhecido; essesSNPssão candidatos a apresentar conseqüências funcionaissignificativas.

A importância da grande maioria dos SNPspara a saúdeé desconhecida e é objeto de pesquisas em andamento.

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TABELA 4-2 Variação Comum no Genoma Humano

Tipo de Variação Extensão do Tamanho (Aprox.) Base para o Polimorfismo Número de Alelos

Polimorfismos de

nucleotídeo único

Inserçâo/deleções(indeis)

Variantes no número

de cópias

Inversões

1 pb

1 pb a > 100 pb

10 Icb a > 1 Mb

Poucos pb a > 1 Mb

Substituição de um ou outro par de bases em uma Geralmente doislocalizaçãoespecífica no genoma

Simples: Presença ou ausência de umpequeno segmento Simples: 1de DNA de 100-1.000 pb dc comprimento Microssatélites:

Microssatélites: Geralmente, uma unidadede 2, 3 tipicamente 5 ouou 4 nucleotídeos repetida em tandem 5-25 vezes mais

Tipicamente a presença ou ausência de segmentos de DNA 2 ou maisde 200 pb a 1,5 Mb, embora a duplicaçãoem tandemde 2, 3, 4 ou maiscópias tambémpossaocorrer

Um segmento de DNA presente em qualquer uma das 2duas orientações com respeito ao DNA circundante

pb, par de bases;kb, par de quilobascs; Mb, par dc megabases

Seqüência de referência

SNPAlelo 1

Alelo 2

5 10 15 20I I I I

..GG ATTTCT AGGT AACTC AGTCG A...

..GG ATTTCT AGGT AACTC AGTCG A...

..GG ATTTG0AGGT AAGTC AGTCG A...

Indel AAlelo 1

Alelo 2

..GGATTTCTAGGTAACTCAGTCGA...

..GG ATTTGT AGG0T AAGTG AGTGG A...

Alelo 1 ...GG ATTTGT AGGT AAGTG AGTGG A...Indel B

Aieio2 ...GGATHHGT AGGT AAGTG AGTGG A...

Figura 4-1 Três polimorfismos no DNA genômico a partir de um segmento do conjunto de referênciado genomahumanosão demonstrados na parte superior{Fig. 2-6). O polimorfismo de nucleotídeo único(SNP) na posição 8 possui dois aielos, um com T (correspondente à seqüência referência)e um com C.Existem duas indeis nessa região. Na indel A,o alelo 2 apresenta uma inserção de umGentreas posições11 e 12 na seqüência de referência (alelo 1). Na indel B, o alelo 2 apresenta uma deleçãode 2 pb nasposições 5 e 6 na seqüência de referência.

O fato de os SNPs serem comuns, não significa que elesnão apresentem efeito na saúde e na longevidade. Isto querdizer que qualquer efeito de SNPs comuns está mais provavelmente envolvido na alteração relativamente sutil desuscetibilidade a doenças do que na causa direta de doençassérias.

Polimorfisníos de Inserção e DeleçãoUma segunda classe de polimorfismos resulta de variaçõescausadas por inserção ou deleção (in/dels ou simplesmenteindeis) em qualquer parte, variando de um único par debases até aproximadamente 1.000 pb, embora indeis maiores também tenham sido bem documentadas. Mais de um

milhão de indeis têm sido descritas, na casa de centenas demilhares em qualquer genoma individual. Aproximadamentemetade de todas as indeis é referidacomo "simples", porqueelas apresentam apenas dois alelos — ou seja, presença ouausência do segmento inserido ou deletado (Fig. 4-1).

Polimorfismos de MicrossatélitesOutras indeis, entretanto, são multialélicas, devido a números variáveis de um segmento de DNA que é inserido emtandem em um determinado local, constituindo assim o queé chamado de microssatélites. Eles consistem em trechosde DNA compostos por unidades de dois, três ou quatronucleotídeos, como TGTGTG, CAACAACAA ou AAA-TAAATAAAT, repetidos entre uma e algumas dúzias de vezesem um local específico no genoma (Fig. 4-2). Os diferentesalelos em um polimorfismo de microssatélite são resultadode diferentesnúmeros de unidades de nucleotídeos repetidas,contidas dentro de qualquer microssatélite, e são, portanto,por vezes também chamadas de polimorfismos de repetiçõescurtas em tandem (STR, do inglês, short tandem repeat).Um íocus de microssatélite freqüentemente possui muitosalelos (tamanhos de repetição) que podem ser avaliadosrapidamente por procedimentos laboratoriais padronizadospara distinguir indivíduos diferentes e para inferir relaçõesde parentesco (Fig. 4-3). Muitas dezenas de milhares de loci

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICA HUMANA: MUTAÇÃO E POLIMORFISMO

Polimorfismo de microssatélitePolimorfismo de inserção

de elemento móvelAlelo 1 ...GGATTTICAACAAICAACAAIGGTAACTCAGTCGA...

Alelo 2 ...GGATTT|gAA|CAACAAICAACAACA'Ã|GGTAACTCAGTCGA..

Alelo 3 ...GGATTTICAAjCAACAAjCAACAAlGGTAACTCAGTCGA...

Alelo 1

Alelo 2L NE

Polimorfismo de inversão

Variante de número de cópias

Alelo 1

Alelo 2

ABCDEFGH

ABCDEFGFGFGH

Fígurd 4-2 Exemplos de polimorfismos no gcnoma humano maiores que SNPs. No sentido horáriodadireita superior: O lociis de microssatcíire possui três alelos, com quatro, cinco ou seiscópias de umarepetição trinuclcotídica CAA. O polimorfismo de inversão possui dois alelos correspondentes às duasorientações (indicados pelas setas) do segmento genômico mostrado em verde-, tais inversões podemenvolver regiões de até muitasmegabases de DNA.Asvariantes de númerode cópiasenvolvem deleção ouduplicação decentenas de pares dequilobases até mais deuma megabase de DNA genômico. No exemplomostrado, o alelo 1 contém uma cópia única, enquanto o alelo 2 contém três cópias do segmento cromos-sômicoquecontém os genes Fe G; outros alelospossíveis com zero,duas, quatro ou maiscópiasde F e Gnão são mostrados. O polimorfirsmode inserção por elemento móvel possui dois alelos, um com e outroseminserção de um retroeiemento repetido LINE de aproximadamente 6 kb;a inserção do elemento móvelaltera o espaçamento entre os dois genes e pode alterar a expressão gênica na região.

Indivíduos não aparentados Membros da família

Mãe Pai Criança 1 Criança 2 Criança 3

Figura 4-3 Esquema de ummarcadorde microssatélite hipotético no DNA humano.Os alelos de tamanhodiferentes (numerados de 1 a 7)correspondem aos fragmentos de DNAgenômico comendodiferentes númerosde cópiasde uma repetição de microssatélites, e os seustamanhos relativos são determinados separando-ospor eletroforese em gel. O alelo maiscurto (alelo 1) migra em direçãoà parte inferiordo gel, enquanto oalelo mais longo (alelo 7)permanece mais próximo do topo. Àesquerda, Para este microssatélite multialélico,cadaumdosseis indivíduos nãoaparentados possui doisalelos diferentes. Ãdireita. Dentro de uma família,a herança dos alelos pode ser seguidaa partir de cada um dos pais para cada uma das três crianças.

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de microssatélites polimórficos são conhecidas ao longo dogenoma humano.

Os microssatélites são um grupo particularmente útilde indels. A determinação dos alelos nos múltiplos loci demicrossatélites é atualmente o método de escolha para aimpressão digital de DNA (DNA fingerprinting) utilizada para o teste de identificação. Por exemplo, o Federal

Bureau of Investigation (FBI) nos Estados Unidos utilizaatualmente uma coleção de alelos em 13 desses loci parao seu painel de impressão digital de DNA. E improvável que dois indivíduos (exceto gêmeos monozigóticos)tenham exatamente os mesmos alelos em todos os 13 loci

para os quais o painel determinará em definitivo se duasamostras vieram de um mesmo indivíduo. A informação

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é armazenada no FBI's Combined DNA Index System(CODIS), que vem crescendo desde dezembro de 2014 einclui mais de 11.548.700 perfis de criminosos, 1.300.000de perfisde presos, e 601.600 perfis forenses (material obtido em cenas de crimes). Muitos estados e o U.S. Depart-ment of Defense, assim como as unidades correspondentesem outros países, possuem bancos de dados similares deimpressões digitais de DNA.

Polimorfismos de Inserção de Elementos MóveisQuase a metade do genoma humano é composta por famílias de elementos repetitivos que estão dispersos ao longodo genoma (Cap. 2). Embora a maioria das cópias dessasrepetições seja fixa, algumas delas são móveis e contribuempara a diversidade genética humana através da retrotrans-posição, um processo que envolve a transcrição para umRNA, transcrição reversa em uma seqüência de DNA e inserção (i.e., transposição) em outra região do genoma, comointroduzimos no Capítulo 3, no contexto dos pseudogenesprocessados. As duas famílias mais comuns de elementosmóveis são a família Alu e a família de repetições LINE,sendo que cerca de 10.000 polimorfismos de inserção deelementos móveis foram descritos em diferentes populações.Cada locus polimórfico consiste em dois alelos, um com eoutro sem o elemento móvel inserido (Fig. 4-2). Os polimorfismos de elementos móveis são encontrados em todos oscromossomos humanos. Embora a maioria seja encontradaem regiões não gênicas do genoma, uma pequena parte delesé encontrada dentro dos genes. Pelo menos 5.000 desses loapolimórficos têm uma freqüência de inserçãosuperior a 10%em várias populações.

Variação no Número de CópiasOutro tipo importante de polimorfismo humano inclui avariação no número de cópias (CNVs, do inglês,copy num-ber variants). As CNVs são conceitualmente relacionadasàs indels e aos microssatélites, mas consistem em variaçõesno número de cópias de segmentos grandes do genoma,que variam em tamanho de 1.000 pb a muitas centenasde pares de quilobases. Variações maiores que 500 kb sãoencontradas em 5% a 10% dos indivíduos na populaçãoem geral, ao passo que as variações abrangendo mais que 1Mb são encontradas em 1% a 2%. As maiores CNVs sãoencontradas, às vezes, em regiõesdo genoma caracterizadaspor blocos repetidos de seqüências homólogas chamadas deduplicações segmentares (ou segdups). A sua imponância emmediar a duplicação e a deleção dos segmentos correspondentes é discutida mais adiante no Capítulo 6, no contextode várias síndromes cromossômicas.

AsCNVs menores em particular podem apresentar apenasdois alelos (i.e., a presença ou ausência de um segmento), demodo semelhante às indels nesse contexto. As CNVs maiores

tendem a apresentar alelos múltiplos, devido à presença denúmeros diferentes de cópias em tandem de um segmentode DNA (Fig. 4-2). Em termos de diversidade genômicaentre os indivíduos, a quantidade de DNA envolvida emCNVs excede amplamente aquele conteúdo que difere por

causa dos SNPs. Nos loci com CNV, o conteúdo de quaisquer dos dois genomas humanos pode diferir em até SO a100 Mb por causa de diferenças no número de cópias.

Notavelmente, o segmento variável em muitos loci comCNV pode incluir uma a várias dúzias de genes, e assim asCNVs são freqüentemente associadas a características queenvolvem alteração da dosagem gênica. Quando uma CNVé freqüente o suficiente para ser polimórfica, ela representaum backgroundde variaçãocomumque deve sercompreendido caso as alterações no número de cópias observadas empacientes forem interpretadas adequadamente. Assimcomotodos os polimorfismos de DNA, o significadode diferentesalelos na CNV sobre a saúde e sobre a suscetibilidade adoenças é objeto de investigação intensa.

Polimorfismos de Inversão

Um grupo final de polimorfismos a ser discutido compreendeas inversões, que diferemem tamanho — desde poucos paresde bases a grandes regiões do genoma (até vários pares demegabase) —, podendo estar presentes em qualquer umadas duas orientações nos genomas de indivíduos diferentes(Fig. 4-2). A maioria das inversões é caracterizada porregiões de homologia de seqüência nas extremidades dosegmento invertido, implicando um processo de recombi-nação homóloga na origem das inversões. Na sua formabalanceada, as inversões, independentementeda orientação,não envolvem ganho ou perda de DNA, e os polimorfismosde inversão (com dois alelos correspondentes às duas orientações) podem atingir freqüências substanciais na populaçãoem geral. Entretanto, a recombinação anômala pode resultarna duplicação ou deleçãode DNA localizadoentre as regiõesde homologia, associada a distúrbiosclínicos que serão maisexplorados nos Capítulos 5 e 6.

A ORIGEM EA FREQÜÊNCIA DE DIFERENTESTIPOS DE MUTAÇÕESAo longo do espectro da diversidade desde variantes rarasaté os polimorfismos mais comuns, diferentes tipos de mutações surgem no contexto de processos fundamentais da divisão celular, tais como replicação, reparo e recombinação deDNA, e a segregação cromossômica na mitose ou meiose. Afreqüência de mutações por locus por divisão celular é umamedida básica de quão propensos a erros estes processosestão, o que é de fundamental importância para a biologiae evolução do genoma. No entanto, de maior importânciapara os médicos geneticistasé a freqüência de mutações porlocus da doença por geração, em vez da taxa de mutaçãototal em todo o genoma por divisão celular. Entretanto,quantificar as taxas de mutações causadoras de doençaspode ser difícil, porque muitas mutações causam letalidadeembrionária precoce antes de a mutação ser reconhecidaem um feto ou recém-nascido, ou porque algumas pessoascom uma mutação causadora de doença podem manifestara condição tardiamente na vida ou nunca manifestar sinaisda doença. Apesar dessas limitações, temos tido um ótimoprogresso na determinação da freqüência total — algumas

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICA HUMANA: MUTAÇÃO E POLIMORFISMO 49

vezes referida como carga genética — de todas as mutaçõesque afetam a espécie humana.

Os principais tipos de mutação apresentados de formabreve anteriormente ocorrem com freqüências consideráveis em muitas células diferentes do corpo. Na práticada genética, estamos preocupados principalmente com avariação genômica herdada; no entanto, toda essa variaçãoteria de se originar como uma alteração nova (de novo) nascélulas germinativas. Nesse ponto, tal variante seria bastante rara na população (ocorrendo apenas uma vez), e suafreqüência final na população ao longo do tempo dependeria do acaso e dos princípios de herança e de genéticade populações (Caps. 7 e 9). Embora a mutação originaltenha ocorrido apenas no DNA das células da linhagemgerminativa, qualquer pessoa que herdasse esta mutaçãoa carregaria como uma mutação constitucional em todasas células do corpo.

Ao contrário, as mutações somáticas ocorrem em todo ocorpo, mas não podem ser transmitidas à geração seguinte.Dada a taxa de mutação (veja mais adiante nesta seção),pode-se prever que, de fato, cada célula em um indivíduotem uma versão ligeiramente diferente do seu genoma,dependendo do número de divisões celulares que ocorremdesde a concepção até o tempo de aquisição das amostras.Em tecidos altamente proliferativos, tais como os epiteliaisintestinais ou células hematopoiéticas, tal heterogeneidadegenômica é particularmente suscetível de estar evidente.No entanto, a maioria de tais mutações não é tipicamentedetectada, porque em ensaios clínicos, o DNA é geralmente sequenciado a partir de coleções de muitos milhões decélulas; em tais coleções, a base mais prevalente em qualquer posição no genoma será a única presente no momentoda análise, e mutações somáticas raras serão amplamenteinvisíveis e indeterminadas. Tais mutações podem ser deimportância clínica, entretanto, em distúrbios provocadospor mutação em apenas um subtipo de células em tecidosespecíficos, levando ao mosaicismo somático (Cap. 7).

A principal exceção à expectativa de que mutaçõessomáticas sejam subdetectadas em qualquer amostra deDNA multicelular está no câncer. A base mutacional para asorigens do câncer e a natureza clonal da evolução tumoraldirecionam certas alterações somáticas a estar presentesessencialmente em todas as células de um tumor. De fato,de 1.000 a 10.000 mutações somáticas (e algumas vezesmuito mais) são encontradas nos genomas da maioria doscânceres de adultos, com freqüências e padrões mutacionaisespecíficos para diferentes tipos de câncer (Cap. 15).

Mutações CromossômicasMutações que produzem alteração no número de cromossomos devido a erros de segregação cromossômica estãoentre as mutações mais observadas em humanos, comuma taxa de uma mutação por 25 a 50 divisões celularesmeióticas. Essa estimativa é um valor mínimo, porque asconseqüências de muitos desses eventos no desenvolvimentosão provavelmente tão graves que os fetos resultantes sãoabortados de modo espontâneo logo após a concepção semserem detectados (Caps. 5 e 6).

Mutações RegionaisAs mutações que afetam a estrutura ou a organizaçãoregional dos cromossomos podem surgir por vários caminhos diferentes. As duplicações, deieções e inversões de umsegmento de um único cromossomo são predominantementeo resultado da recombinação homóloga entre segmentos deDNAcom alta homologia de seqüência situados em maisdeum local em uma região do cromossomo. No entanto, nemtodas as mutações estruturais são resultado de recombinaçãohomóloga. Algumas, como translocaçôes cromossômicase algumas inversões, podem ocorrer em locais de quebrasespontâneas do DNA de dupla-fita. Uma vez que a quebraocorra em dois locaisno genoma, as duas extremidades quebradas podemser unidasemconjunto, mesmo semqualquerhomologia óbvia na seqüência entre as duas extremidades(umprocesso denominado reparo por uniãode extremidadesnão homólogas). Exemplos de tais mutações serão discutidosem profundidade no Capítulo 6.

Mutações CênicasA mutações gênicas ou de DNA, incluindo a substituiçãode um par de bases, inserções e deieções (Fig. 4-4), podemoriginar-se por qualquer um de dois mecanismos básicos:erros introduzidos durante a replicação do DNA ou mutações decorrentes de uma falha no reparo correto do DNAapós lesão. Muitas dessas mutações são espontâneas e surgem durante os processos normais (mas imperfeitos) dereplicação e reparo do DNA, enquanto outras são induzidaspor agentes físicos ou químicos, chamados de mutagênicos.

Erros de Replicação do DNAO processo de replicação do DNA (Fig. 2-4) é altamentepreciso; a maioria dos erros de replicação (i.e., a inserção de uma base diferente da base complementar querestauraria o par de bases nessa posição da dupla-hélice) érapidamente removida do DNA e corrigida por uma sériede enzimas de reparo de DNA que primeiramente reconhecem qual fita na dupla-hélice recém-sintetizada contéma base incorreta e, em seguida, substituem-na com a basecomplementaradequada, um processodenominado revisãodo DNA (proofreading). A replicação do DNA precisa serum processo notavelmente exato; caso contrário, o ônus damutação nos organismos e nas espécies seria intolerável. Aenzima DNA polimerase duplica fielmente as duas fitas dadupla- hélice com base em regras rigorosas de pareamentode bases (A pareia com T, C pareia com G), mas introduzum erro a cada 10 milhõesde pb. Uma revisãoadicional, emseguida, corrige mais de 99,9% desses erros de replicaçãodo DNA. Assim, a taxa de mutação total por base, comoresultado de erros de replicação, é consideravelmente menorque 1 X 10 '" por divisãocelular— menor que uma mutaçãopor genoma por divisão celular.

Reparo da Lesão do DNAEm adição aos erros de replicação, estima-se que entre10.000 e um milhão de nucleotídeos sejam danificadospor célula humana por dia devido a processos químicos

50 THOMPSON & THOMPSON GENÉTICA MÉDICA

Seqüênciade referência

T 1 ^0 A T T

"T"

0—r'

A C C T G T—r'

A"l"

0 C-rl-

A;G T A

1 1 1A1

G T G G A C A T G G T!1 '

jbstltuição

1 1 1

C A T1

G C A 0 0 T G T A C 01 1

A;G T AJ^

C G T G G—L.

A C A-j_

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G G t:-j"

Deleçao

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0 A T G!_L|.

G T-j_

o 1 etc.

i

Inserção

T—I—m—I—n—1—I—n—I—i—n-i—i—rc A t:g t c:a c c:t g t:a c cG T AlC A GlT G GlA C AlT G G

U-J 1 LJ—i I ' ' • • • ' • • •

O

etc.

FígurS 4-4 Exempios demutações cm uma porção deum gene hipotético com cinco códons são demonstrados (deiimitados pelas linhas tracejadas). O primeiro par de bases do segundo códon na seqüência dereferência (sombreados emazul) estámutado por uma substituição de base, deieçào ou inserção. Asubstituição de base de um G para umT nesta posição leva a uma mudança de códon (sombreado em verde)e, supondoquea fita superior é a fita senso ou codificantc, a uma alteração nãosinônima predita de umaserina para uma aíanina na proteína codificada (código genético na Tabela 3-1); todos os outros códonspermanecem inalterados. Tanto a deleçâo quanto a inserção do par de bases linicolevam a uma mutaçãofranieshift, na qual o quadro de leitura da tradução e alterado para todosos códons subsequentes (sombreados em verde), até que um códon de término seja alcançado.

espontâneos, tais como a depurinação, a desmetilação oua desaminação; por reação com mutagênicos químicos(naturais ou não) no ambiente; e por exposição à radiaçãoultravioleta ou ionizante. Algumas dessas lesões, mas nemtodas, são reparadas. Mesmo que a lesão seja reconhecidae destruída, a maquinaria de reparo pode criar mutaçõesatravés da introdução de bases incorretas. Assim, em contraste com as alterações do DNA relacionadas à replicaçao,as quais são geralmente corrigidas por meio de mecanismosde revisão, as alterações de nucleotídeos introduzidos porlesão e reparo do DNA muitas vezes resultam em mutaçõespermanentes.

Uma mutação espontânea particularmente comum éa substituição de T por C (ou A por G na outra fita). Aexplicação para essa observação vem da principal formade modificação epigenética no genoma humano, a metila-ção do DNA, introduzida no Capítulo 3. A desaminaçãoespontânea da 5-metilcitosina para timidina (compare asestruturas de citosina e timina na Fig. 2-2) no par CpG dáorigem a mutações de C para T ou G para A (dependendoem qual fita a 5-metilcitosina é desaminada). Tais mutaçõesespontâneas podem não ser reconhecidas pela maquinaria

de reparo do DNAe, assim, estabelecer-se no genoma apósa rodada seguinte de replicação do DNA. Mais de 30% detodas as substituições de nucleotídeos únicos são destetipoc ocorrem em uma taxa 25 vezesmaior que quaisquer outrasmutações de um único nucleotídeo. Assim, os dupletos deCpG representam um verdadeiro hotspot ("ponto quente")de mutação no genoma humano.

Taxa Total de Mutações de DNAEmbora a taxa de mutações de DNA em loci específicostenha sido estimada utilizando-se uma variedade de abordagens ao longo dos últimos 50 anos, o impacto global deerros de replicação e reparo sobre a ocorrência de novasmutações ao longo do genoma atualmente pode ser determinado diretamente pelo sequenciamento de genoma completo de trios constituídos pela criança e seus pais, em buscade novas mutações na criança que não estão presentes naseqüência genômica de nenhum dos pais. A taxa total médiade novas mutações entre gametas maternos e paternos é deaproximadamente1,2 X 10"^ mutações por par de basesporgeração. Assim, cada pessoa provavelmevte recebe cercade 75 novas mutações em seu genoma de um ou do outro

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICA HUMANA: MUTAÇÃO E POLIMORFISMO 51

progenitor. Essa taxa, no entanto, varia de gene para geneao longo do genoma e, talvez, de população para populaçãoou mesmo de indivíduo para indivíduo. De forma geral, essataxa, combinada com considerações sobre o crescimento ea dinâmica populacional, prevê que deve haver um númeroenorme de mutações relativamente novas (e, portanto, muitoraras) na atual população mundial atual de sete bilhões deindivíduos.

É previsto quea grande maioria dessas mutações seja dealterações de nucleotídeo único em porções não codifican-tes do genoma e provavelmente tenha pouco ou nenhumsignificadofuncional. No entanto, em nível populacional, oimpacto coletivo potencial dessas novas mutações em genesde importância médica não deve ser negligenciado. NosEstados Unidos, por exemplo, com mais de quatro milhõesde nascidos vivos por ano, aproximadamente seis milhõesde novas mutações ocorrerão em seqüências codificantes.Assim, mesmo para um gene codificante de uma proteínaúnica de tamanho médio, podemos esperar várias centenasde recém-nascidos por ano com uma nova mutação naseqüência codificante deste gene.

Conceitualmente, estudos semelhantes têm determinadoa taxa de mutações em CNVs, nas quais a geração de umanova variante de tamanho depende de recombinação, emvez de erros na síntese de DNA para gerar um novo parde bases. A quantificação da taxa de formação de novasCNVs (-1,2 X 10'̂ por locus por geração)é de uma ordemde magnitude mais alta do que aquelas de substituições debases.

Taxa de Mutações Gênicas Causadoras deDoençaA maneira mais direta de estimar a taxa de mutaçõescausadoras de doença por locus por geração é medindoa incidência de novos casos de doença genética que nãoestá presente em nenhum dos progenitores e é causada poruma mutação única, que gera uma condição claramentereconhecível em todos os recém-nascidos que carregam essamutação. A acondroplasia, uma condição de crescimentoósseo reduzido que leva a uma baixa estatura (Caso 2), éuma condição que atende a esses requisitos. Em um estudo,sete crianças acondroplásicas nasceram em uma série de242.257 nascimentos consecutivos. Todas as sete nasceram

de pais de estatura normal, e como a acondroplasia semprese manifesta quando a mutação está presente, todas foram

consideradas por representarem novas mutações. A novataxa de mutação nesse locus pode ser calculada como sendode sete novas mutações em um total de 2 x 242.257 cópiasdo gene relevante, ou seja, aproximadamente 1,4 x 10'^mutações causadoras de doença por locus por geração. Essataxa de mutação elevada é particularmente notável, porquefoi verificado que virtualmente todos os casos de acondroplasia são devido a uma mutação idêntica, uma mutação deG para A, que altera um códon de glicina para uma argininana proteína codificada.

A taxa de mutações gênicas causadoras de doença foiestimada por vários outros distúrbios, nos quais a ocorrênciade uma nova mutação foi determinada pelo aparecimentode uma doença detectável (Tabela 4-3). A quantificação dastaxas para esses e outros distúrbios varia dentro de umafaixa de 1.000 vezes, de 10"' a 10'̂ mutações por locus porgeração. A base para essas diferenças pode estar relacionadacom alguns ou todos os seguintes pontos: o tamanho degenes diferentes; a porção de todas as mutações naquelesgenes que vão levar a doenças; a idade e o sexo do progenitor no qual a mutação ocorreu; o mecanismo mutacional; ea presença ou ausência de mutações nos hot spots no gene.Na verdade, a elevada taxa de mutação sítio-específica particular na acondroplasia pode ser parcialmente explicadapelo fato de que a mutação na outra fita é uma alteração deum C para T em uma posição sujeita à metilação de CpG,que é um hot spot para mutação por desaminaçao, comodiscutido anteriormente.

Mesmo com essa variedade de taxas entre os diferentes

genes, a taxa de mutação gênica média é de aproximadamente 1 x 10". Dado que há pelomenos 5.000 genes no genomahumano em que as mutações são atualmente conhecidas porcausar uma doença ou qualquer característica discernível(Cap. 7), é provável que aproximadamente uma em 200pessoas receba uma nova mutação em um gene associadoa uma doença conhecida a partir de um dos progenitores.

Diferenças Sexuais e Efeitos da Idade nas Taxasde Mutação

Como o DNA no esperma é submetido a muito mais ciclosde replicação do que o DNA nos óvulos (Cap. 2), há maioroportunidade de ocorrerem erros; pode-se prever, portanto,que muitas mutações sejam mais freqüentemente de origempaterna que materna. Na verdade, quando estas foram

TABELA 4-3 Estimativas de Taxas de Mutação para Genes de Doenças Humanas Selecionados

Doença Locus (Proteína) Taxa de Mutação*

Acondroplasia (Caso 2) FCfR3 (receptor do fator de crescimento de fibroblasto 3) 1,4 X 10-'Aniridia PAX6 (Pax6) 2,9-5 x IQ-"Distrofia muscular de Duchenne (Caso 14) DMD (distrofina) 3,5-10,5 X 10-'Hemofilia A (Caso 21) F8 (fator VIII) 3,2-5,7 X 10-'Hemofilia B (Caso 21) F9 (fator IX) 2,3 X IO"Neiirofibromatose ripo 1 (Caso 34) NF1 (neurofibromina) 4-10 X 10 '

Doença renal policística, tipo 1 (Caso 37) PKD1 (policistina) 6,5-12 X 10 'Retinoblastoma (Caso 39) RBl (Rbl) 5-12 X 10-"

'Expresso como nnit.içòcs por locus por geraçãoBasc.ido nos dados de Vogcl F,MotulskyAG: Hunwngenetics, ed 3, Berlin, 1997,Springer-Verlag.

52 THOMPSON & THOMPSON GENÉTICA MÉDICA

exploradas, as novas mutações responsáveis por determinadas condições (p. ex., acondroplasia, como nós acabamosde discutir) são geralmente mutações de sentido trocado{missense) que surgem quase sempre na linhagem paterna.Além disso, quanto mais velho o homem for, mais ciclos dereplicação terão precedido as divisões meióticas, e, portanto,seria esperado que a freqüência de novas mutações paternasaumentasse com a idade do pai. De fato, foram observadascorrelações do aumento da idade do pai com a incidênciade mutações gênicas em uma série de distúrbios (incluindoa acondroplasia) e com a incidência de mutações regionaisenvolvendo CNVs em transtornos do espectro autista(Caso 5). Em outras doenças, entretanto, a origem parentale os efeitos da idade no espectro mutacional podem, porrazões desconhecidas, não ser tão surpreendentes.

TIPOS DE MUTAÇÕES ESUASCONSEQÜÊNCIASNesta seção, consideramos a natureza de diferentes mutações e seus efeitos sobre os genes envolvidos. Cada tipo demutação discutido aqui é ilustrado por um ou mais exemplosde doenças. Notavelmente, a mutação específica encontradaem quase todos os casos de acondroplasia é uma exceção enão a regra, e as mutações que estão na base de uma únicadoença genética são mais tipicamente heterogêneas entreum grupo de indivíduos afetados. Diferentes casos de umadoença em particular, portanto, serão freqüentemente causados por diferentes mutações subjacentes (Tabela 4-4). NosCapítulos lie 12, vamos nos voltar para a maneira pelasquais mutações em genes específicos causam tais doenças.

Substituições Nucleotídicas

Mutações de Sentido TrocadoUma única substituição de nucleotídeo (ou mutação pontual)em uma seqüência gênica, tal como a observada no exemplode acondroplasia que acabamos de descrever, pode alteraro código em uma trinca de bases e causar a substituiçãonão sinônima de um aminoácido por outro no produtogênico (veja código genético no Quadro 3-1 e o exemploda Fig. 4-4). Tais mutações são denominadas mutaçõesde sentido trocado (missense) porque alteram o "sentido"da codificação do gene ao especificar um aminoácido diferente. Embora nem todas as mutações de sentido trocadoconduzam a uma alteração observável na função proteica,a proteína resultante pode não funcionar adequadamente,pode tornar-se instável e degradar-se rapidamente, ou podefalhar em localizar a sua posição intracelular correta. Emmuitos distúrbios, tais como a P-talassemia (Caso 44), amaioria das mutações detectadas em diferentes pacientescompreende mutações de sentido trocado (Cap. 11).

Mutações sem SentidoAs mutações pontuais em uma seqüência de DNA quecausam a substituição de um códon normal para um aminoácido por um dos três códons de término (ou "parada")são chamadas de mutações sem sentido {nonsense). Como

TABELA 4-4 Tipos de Mutação em Doenças Genéticas Humanas

Porcentagemde MutaçõesCausadoras

Tipo de Mutação de Doença

Substituições de Nucleotídeos• Mutações de sentido trocado {missense) 50%

(substituições de aminoácidos)• Mutações sem sentido {nonsense) 10%

(códons de término prematuros)• Mutações no processamento de RNA 10%

(destroem sítios de splicing consensuais,sítios de capeamento e sítios depoiiadenilação ou criam sítios ocultos)

• Mutações de sítios de splicing, levando a 10%mutações de mudança de matriz de leitura{frameshift) e códons de término prematuros

• Mutações reguladoras de longo alcance Raras

Deleções e Inserções• Adição ou deleções de um pequeno número 25%

de bases

• Deleções gênicas grandes, inversões, fusões 5%e duplicações (podem ser mediadas pelahomologia de seqüência do DNA tantodentro quanto entre as fitas de DNA)

• Inserção do elemento LINE ou Alu Rara(perturbação da transcrição ou interrupçãoda seqüência codificante)

• Mutações dinâmicas (expansão de seqüências Rarasde repetição de tri ou tetranucleotídeos)

a tradução do RNA mensageiro (RNAm) cessa quando ocódon de término é atingido (Cap. 3), uma mutação queconverte um éxon codificante em um códon de término

promove a parada da tradução no meio da seqüênciacodificante do RNAm. As conseqüências das mutaçõesde término prematuras são duplas. Em primeiro lugar, oRNAm transportando uma mutação prematura é freqüentemente alvo de rápida degradação (através de um processocelular conhecido como decaimento do RNAm mediado

por mutações sem sentido), e a tradução não é possível. Emsegundo, mesmo que o RNAm seja suficientemente estávelpara ser traduzido, a proteína truncada é tão instável queé rapidamente degradada dentro da célula (veja o Cap. 12para exemplos). Enquanto algumas mutações pontuaiscriam um códon de término prematuro, outras podem destruir o códon de término normal e permitir, assim, quea tradução continue até que outro códon de término doRNAm seja alcançado a jusante. Tal mutação irá levar aum produto proteico anormal com aminoácidos adicionaisem sua extremidade carboxiterminal, e poderá tambémperturbar as funções reguladoras normalmente exercidaspela região 3' não traduzida a jusante do códon de términonormal.

Mutações que Afetam a Transcrição, oProcessamento e a Tradução do RNAo mecanismo normal pelo qual os transcritos iniciais deRNA são feitos e depois convertidos em RNAms maduros(ou versões finais de RNAs não codificantes) requer uma

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICA HUMANA: MUTAÇÃO EPOLIMORFISMO 53

série de modificações, incluindo a ligação de fatores detranscrição, o capeamento 5', a poliadenilação e o splicing(Cap. 3). Todos esses passos de maturação do RNA dependem de seqüências específicas dentro do RNA. No caso desplicing, duas classes gerais de mutações foram descritas.Para os íntrons serem excisados do RNA não processado eos éxons serem unidos para formar um RNA maduro sãorequeridas seqüências particulares de nucleotídeos localizados dentro ou próximos das junções éxon-íntron (sítiodoador 5') ou íntron-éxon (sítio aceptor 3') delas. As mutações que afetam essas bases necessárias, seja no sítio doadorou aceptor, interferem com (e em alguns casos anulam) osplicing normal de RNA naquele local. Uma segunda classede mutações de splicing envolve substituições de bases quenão afetam por si próprias as seqüências do sítio doador ouaceptor. Em vez disso, criam sítios doadores ou aceptoresalternativos que competem com os sítios normais durante oprocessamento do RNA. Assim, pelo menos uma proporçãodo RNAm maduro ou do RNA não codificante em tais casos

pode conter seqüências de íntron impropriamente excisadas.Exemplos de ambos os tipos de mutação são apresentadosno Capítulo 11.

Para genes codificantes de proteínas, mesmo se o RNAmfor produzido e for estável, as mutações pontuais em regiões5' e 3' não traduzidas também podem contribuir para doenças ao alterarem a estabilidade do RNAm ou a eficiênciade tradução, reduzindo, assim, as quantidades de produtosproteicos produzidos.

Deleções, Inserções e Rearranjos

As mutações também podem ser causadas por inserção, dele-ção ou rearranjo nas seqüências de DNA. Algumas deleçõese inserções envolvem apenas alguns nucleotídeos e são, emgeral, mais facilmente detectadas pelo sequenciamento diretodessa parte do genoma. Em outros casos, um segmento substancial de um gene ou um gene inteiro é deletado, duplicado,invertido, ou translocado para criar uma nova organizaçãode seqüências gênicas. Dependendo da natureza exata dadeleção, inserção ou rearranjo, uma variedade de diferentesabordagens laboratoriais pode ser usada para detectar aalteração genômica.

Algumas deleções afetam apenas um pequeno númerode pares de bases. Quando tal mutação ocorre em umaseqüência codificante e o número de bases envolvidas nãoé um múltiplo de três (i.e., não é um número completo decódons), o quadro de leitura será alterado começando noponto de inserção ou deleção. O resultado das mutaçõesé chamado de mutações de mudança de matriz de leitura(franteshift) (Fig. 4-4). A partir do ponto de inserção ou dedeleção, uma seqüência diferente de códons é, portanto,gerada, codificando aminoácidos incorretos seguidos porum códon de término na matriz alterada, o que levará a umproduto proteico funcionalmente alterado. Em contraste, seo número de pares bases inserido ou deletado for um múltiplo de três, não ocorrerão mudanças na matriz de leiturae haverá uma simples inserção ou deleção de aminoácidoscorrespondentes no produto gênico normalmente traduzido. Inserções ou deleções maiores, que variam de cerca de

100 a mais de 1.000 pb, são tipicamente referidas como"indels", como vimos no caso de polimorfismos anteriores.Elas podem afetar múltiplos éxons de um gene e causar distúrbios maiores na seqüência codificante.

Um tipo de mutação de inserção envolve a inserção deum elemento móvel, como aqueles pertencentes à famíliade DNA repetitivo LINE. Estima-se que, em qualquerindivíduo, aproximadamente 100 cópias de uma subclas-se particular da família LINE no genoma sejam capazesde se movimentar por retrotransposiçao, como abordadoanteriormente. Tal movimento não só gera diversidadegenética em nossa espécie (Fig. 4-2), como também podecausar doenças por mutagênese insercional. Por exemplo, em alguns pacientes com a hemorragia grave do tipohemofilia A (Caso 21) são encontradas seqüências LINEcom vários pares de quilobases de tamanho inseridas emum éxon do gene do fator VIII, que interrompem a seqüência de codificação e inativam o gene. Inserções LINE aolongo do genoma também são comuns em câncer decolo, refletindo a retrotransposiçao em células somáticas(Cap. 15).

Como discutido anteriormente no contexto de polimorfismos neste capítulo, duplicações, deleções e inversões de um segmento maior de um único cromossomosão predominantemente o resultado de recombinaçãohomóloga entre segmentos de DNA com alta homologiade seqüência (Fig. 4-5). Os distúrbios que surgem comoresultado de tais trocas podem ser devido a outra formade alteração na dosagem de produtos gênicos selvagens,quando os segmentos homólogos estão fora dos própriosgenes (Cap. 6). Alternativamente, tais mutações podem,por si sós, levar a uma alteração da natureza da proteínacodificada quando a recombinação ocorre entre genes diferentes dentro de uma família gênica (Cap. 11) ou entregenes em diferentes cromossomos (Cap. 15). O pareamentoe recombinação anormais entre duas seqüências similaresem orientação oposta em uma única fita de DNA levam àinversão. Por exemplo, quase metade de todos os casos dehemofilia A se deve à recombinação que inverte uma sériede éxons, interrompendo assim a estrutura gênica e tornando o gene incapaz de codificar um produto gênico normal(Fig. 4-5).

Mutações DinâmicasAs mutações em alguns distúrbios envolvem a amplificaçãode uma seqüência de repetição de nucleotídeos simples. Porexemplo, repetições simples, tais como (CCG)n, (CAG)n ou(CCTG)n localizadas na porção codificante de um éxon,em uma região não traduzida de um éxon, ou mesmo emum íntron, podem expandir-se durante a gametogênese, oque é denominado mutação dinâmica, interferindo com aexpressão gênica normal ou com a função proteica. Umarepetição expandida na região codificante irá gerar umproduto proteico anormal, enquanto a expansão da repetição em regiões não traduzidas ou íntrons de um gene podeinterferir com a transcrição, o processamento de RNA oua tradução. Não se sabe plenamente como as mutaçõesdinâmicas ocorrem; elas são conceitualmente semelhantesaos polimorfismos de microssatélites, mas expandem-se a

54 THOMPSON ÔC THOMPSON GENÉTICA MÉDICA

Fígurd 4-5 Seqüências homólogas invertidas, marcadas como A e B, localizadas a 500 kb uma daoutra no cromossomo X, uma a montante do genedo fator VIII, e outra em um íntron entre os éxons22 e 23 do gene. O pareamento intracromossômicoincorreto e a recombinação resultam na inversãodos éxons 1 a 22 do gene, interrompendo dessemodo o gene e causando hemofilia grave.

A >-(1Região amontante do gene

íÃTB!Região amontante do gene

uma taxa muito maior que aquelas observadas para os locide microssatélites.

O envolvimento de expansões de repetição de nucleo-tídeos simples nas doenças é discutido nos Capítulos 7e 12. Em distúrbios causados por mutações dinâmicas,efeitos notáveis da origem parental são bem conhecidose parecem ser característicos de doenças específicas e/ouda repetição de nucleotídeos simples específica envolvida{Cap. 12). Tais diferenças podem ser devido a diferenças biológicas fundamentais entre a ovocitogênese e aespermatogênese, mas também podem resultar da seleçãocontra gametas que carregam determinadas expansões derepetição.

VARIAÇÃO EM GENOMAS INDIVIDUAISo inventário atual mais extenso da quantidade e do tipode variação que se espera em um dado genoma vem daanálise direta dos genomas humanos diploides individuais.A primeira dessas seqüências genômicas, em um indivíduodo sexo masculino, foi relatada em 2007. Agora, dezenasde milhares de genomas individuais foram sequenciadas,algumas como parte de um grande consórcio internacionalde pesquisa que exploram a diversidade genética humana nasaúde e nas doenças, e outras no contexto sequenciamentoclínico para determinar a base subjacente de um distúrbioem pacientes específicos.

Qual o grau de variação genômica detectado em tais estudos? Os genomas humanos individuais carregam tipicamentede cinco a 10 milhões de SNPs, dos quais — dependendoem parte da população — um quarto a um terço é novo(Quadro). Isso sugere que o número de SNPs descritos paranossa espécie ainda é incompleto, embora presumivelmentea fração desses novos SNPs diminua à medida que maisgenomas de mais populações forem sequenciados.

Gene do fator VIII

Pareamento incorretoe recombinação

Mutação na hemofilia A

Segmento invertido dentro do gene

Restantedo gene

Restantedo gene

Dentro dessa variação estão as variantes com impacto clínico conhecido, provável ou suspeito. Com base emestudos realizados até o momento, cada genoma carregade 50 a 100 variantes previamente implicadas em doençashereditárias conhecidas. Além disso, cada genoma carregamilhares de SNPs não sinônimos nos genes codificantes deproteína ao longo do genoma, alguns dos quais previstospara alterar a função proteica. Cada genoma também transporta aproximadamente 200 a 300 prováveis mutaçõesde perda de função, algumas das quais estão presentes emambos os alelos dos genes daquele indivíduo. No cenárioclínico, essa percepção tem implicações importantes para ainterpretação dos dados da seqüência genômica dos pacientes, particularmente quando se tenta prever o impacto demutações em genes cuja função atualmente é desconhecida(Cap. 16).

Um aspecto interessante e inesperado do sequenciamentogenômico individual é que a montagem do genoma humanode referência ainda carece de conteúdos consideráveis de

DNA não documentados e não anotados que são descobertos em literalmente todos os genomas individuais sequenciados. Essas "novas" seqüências são reveladas apenas àmedida que genomas adicionais são sequenciados. Estima-seque a coleção completa de todas as seqüências genômicashumanas encontradas em nossa população atual de setebilhões de indivíduos seja 20 a 40 Mb maior que o conjunto de referência existente, e ainda precisa ser totalmenteelucidada.

E impressionante o inventário atual da diversidade genética humana, e é claro que ainda estamos em um modo dedescoberta. Não há dúvida de que milhões de SNPs adicionais e outras variantes permanecem por serem descobertos,assim como o grau em que qualquer um deles pode afetaro estado clínico de um indivíduo no contexto dos cuidados

de bem-estar e saúde.

CAPÍTULO 4 — DIVERSIDADE GENÉTICA HUMANA: MUTAÇÃO EPOLIMORFISMO 55

VARIAÇÃO DETECTADA EM UM GENOMA HUMANO TÍPICO

Os indivíduosvariam extremamente em uma ampla gamade funções biológicas,determinadas, em parte, pela variação entre os seus genomas. Qualquer genoma individualirá conter:

• 5-10 milhões de SNPs {variáveis por população)• 25.000-50.000 mutações variantes raras (mutações

particulares ou vistas anteriormente em < 0,5% dosindivíduos testados)

• 75 mutações de pares de bases novas não detectadasnos genomas parentais

• 3-7 CNVs novas envolvendo » 500 kb de DNA• 200.000-500.000 indels (1-50 pb) (variáveis por popu

lação)• 500-1.000 deleçõesde 1-45 kb, sobrepondo = 200 genes• 150 indels sem mudanças de matriz de leitura• 200-250 mudanças na matriz de leitura• 10.000-12.000 SNPs sinônimos

• 8.000-11.000 SNPs não sinônimos em 4.000-5.000

genes

• 175-500 variantes raras não sinônimas

• 1 nova mutação não sinônima• 100 códons de término prematuros• 40-50 variantes em locais que alteram o spUcing• 250-300 genes com prováveis variantes de perda de

função• 25 genes previstos para serem completamente inativa-

dos

Estudos Clínicos de Sequenciamento

No contexto da medicina genômica, uma questão-chave éaté que ponto a variação na seqüência e/ou na expressão deum genoma influencia a probabilidade de início da doença,determina ou sinaliza a história natural da doença, e/oufornece pistas relevantes para o manejo da doença. Comoacabamos de discutir, a variação em um genoma constitucional pode apresentar uma série de diferentes efeitos diretosou indiretos na função gênica.

O sequenciamento de genomas completo (os chamadoswhole-genome seqiiencing) ou do subconjunto do genoma que inclui todos os éxons codificantes conhecidos (ochamado sequenciamento de exoma completo ou wholeexome sequenctng) foi introduzido em uma série de situações clínicas, que serão discutidas com mais detalhes noCapítulo 16. Ambos, o sequenciamento de genoma completoe o sequenciamento de exoma completo, têm sido utilizadospara detectar mutações de novo (tanto mutações pontuaiscomo CNVs) em uma variedade de condições de etiologiacomplexa e/ou desconhecida, incluindo, por exemplo, váriascondições neurológicas ou neuropsiquiátricas, como o autismo, a esquizofrenia, a epilepsia ou a deficiência intelectuale atraso no desenvolvimento.

Estudos de sequenciamento clínico podem ter como alvotanto a linhagem germinativa quanto as variantes somáticas.No câncer, especialmente, várias estratégias têm sido utilizadas para rastrear mutações somáticas no tecido tumoral eidentificar genes potencialmente relevantes para a progressãodo câncer (Cap. 15).

GENOMICA PESSOAL E 0 PAPEL DO CONSUMIDOR

A crescente capacidade de sequenciar genomas individuais não está somente beneficiando laboratórios deinvestigação e clínicos, mas também está gerando umarevolução informativa e social entre os consumidores nocontexto de genômica direta ao consumidor (DTC, doinglês, direct-to-consumer genomics), através da qual oteste de polimorfismos de genoma amplo e até mesmoo sequenciamento de genomas inteiros são oferecidosdiretamente a clientes potenciais, ignorando os profissionais de saúde.

Ainda não está amplamente claro qual o grau de vigilância do genoma será mais útil para a prática da rotinaclínica, e isto provavelmente vai evoluir de maneira rápida em caso de condições específicas, à medida que nossoconhecimento aumenta, que diretrizes de prática profissional são adotadas, e que companhias de seguros reagem.Alguns grupos têm levantado preocupações substanciaissobre a privacidade e sobre a necessidade de regulamentaro setor. Ao mesmo tempo, entretanto, outros indivíduosestão dispostos a produzir dados de seqüência do genoma(e até mesmo informação médica) disponível mais oumenos publicamente.

Atitudes nessa área variam amplamente entre osprofissionais e o público em geral de forma parecida,dependendo de se o conhecimento da seqüência dogenoma de alguém vai ser uma atividade fundamentalmente médica ou pessoal. Os críticos dos testes DTC eos formuladores de política, tanto na indústria da saúdequanto no governo, focam em questões de utilidadeclínica, normas regulamentares, supervisão médica, disponibilidade de aconselhamento genético e privacidade.Os proponentes do teste DTC e até mesmo os própriosconsumidores, por outro lado, se concentram mais naliberdade de informação, direitos individuais, consciência pessoal e social, educação pública e capacitação dosconsumidores.

A disponibilidade de informações do genoma individualé cada vez mais uma comodidade comercial e uma realida

de pessoal. Nesse sentido, e não obstante ou minimizandoas questões científicas, éticas e clínicas significativas quetemos pela frente, é certo que seqüências genômicas individuais serão uma parte ativa da prática médica para osestudantes de hoje.

IMPACTO DA MUTAÇÃOE DO POLIMORFISMO

Embora seja evidente para estudantes de genética humana que novas mutações deletérias ou variantes rarasna população podem ter conseqüências clínicas, podeparecer menos óbvio que variantes polimórficas comunspossam ser clinicamente relevantes. Para a proporção davariação polimórfica que ocorre nos próprios genes, taisloci podem ser estudados pela análise da variação nasproteínas codificadas por diferentes alelos. Estima-se queum indivíduo seja suscetível a transportar dois alelosdistintos, determinando polipeptídeos estruturalmentediferentes em cerca de 20% de todos os loci codificantes

de proteína; quando os indivíduos de diferentes grupos

56 THOMPSON & THOMPSON GENÉTICA MÉDICA

étnicos ou geográficos são comparados, uma fraçãoainda maior de proteínas exibindo polimorfismo detec-táveis tem sido encontrada. Além disso, mesmo quandoo produto gênico é idêntico, os níveis de expressão desseproduto podem ser muito distintos entre indivíduosdiferentes, o que é determinado por uma combinaçãoda variação genética e epigenética, como vimos noCapítulo 3.

Assim, existe um grau considerável de individualidadebioquímica dentro da espécie humana em sua composiçãode enzimas e outros produtos gênicos. Além disso, comoos produtos de muitas vias reguladoras e bioquímicasinteragem em redes funcionais e fisiológicas, pode-se concluir de forma plausível que cada indivíduo, independentemente do seu estado de saúde, possui uma composiçãoúnica e geneticamente determinada e, portanto, respondede uma maneira única às influências ambientais, alimen-tares e farmacológicas. Esse conceito de individualidadequímica, primeiramente apresentado há um século porGarrod, um médico britânico notavelmente visionário,e introduzido no Capítulo 1, continua verdadeiro atéhoje. A ampla questão do que é normal — um conceitoessencial na biologia humana e na medicina clínica —permanece muito em aberto quando se trata de genomahumano.

Os capítulos seguintes vão explorar esse conceito emdetalhes, primeiro no contexto de mutações genômicas ecromossômicas (Caps. 5 e 6), e depois, em termos de mutações gênicas e polimorfismos que determinam a herança dedoenças genéticas (Cap. 7) e influenciam sua probabilidadeem famílias e populações (Caps. 8 e 9).

PROBLEMAS

1. O polimorfismo pode resultarde limavariedadedemecanismos com diferentesconseqüências.Descrevae diferencieostipos de polimorfismoque podem ter os seguintesefeitos:a. Alteração na dosagem de um gene ou genesb. Alteração na seqüência dem^tiplos aminoácidos no

produto de um gene codificante de proteínac. Alteração na estrutura final de um RNA produzido a

partir de um gened. Alteração na ordem dos genes em uma região de um

cromossomo

e. Nenhum efeito óbvio

2. A aniridia é um distúrbio ocular caracterizado por umaausência completa ou parcial da íris e está sempre presentequando uma mutação ocorre no gene responsável. Emuma população, 41 crianças diagnosticadas com aniridíànasceram de pais de visão normal entre 4,5 milhões denascimentos durante um período de 40 anos. Assumindoque esses casos foram causados por mutações novas, qual

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é a taxa de mutação estimada no locus da aniridia? Emque hipóteses esta estimativa é baseada, e por que estaestimativa pode ser muito alta ou muito baixa?

Qual dos seguintestipos de polimorfismoseria mais efetivopara distinguir dois indivíduosda população em geral: umSNP, uma indel simples ou um microssátélite? Expliqueseus argumentos.

Considere duas linhagens celulares que diferem uma daoutra por uma série de 100 divisões celulares. Dada ataxa de mutação para diferentes tipos de variação, quãodiferenteseriam os genomas dessaslinhagens?

Compare o provável impacto, na taxa total de mutaçãodetectada eni um dado genoma, de cada um dos seiguintesaspectos: idade dos pais, hot spots de mutação, recombi-nação homóloga intracromossômica,variação genéticanosgenomas parentais.