programa de pÓs-graduaÇÃo em genÉtica … · adriana braga de gÓes barbosa determinaÇÃo do...

PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO

CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA

DDEETTEERRMMIINNAAÇÇÃÃOO DDOO

PPOOLLIIMMOORRFFIISSMMOO DDAASS SSEEQQÜÜÊÊNNCCIIAASS

DDEE DDNNAA MMIITTOOCCOONNDDRRIIAALL HHUUMMAANNOO

NNAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE AALLAAGGOOAASS,, BBRRAASSIILL

AADDRRIIAANNAA BBRRAAGGAA DDEE GGÓÓEESS BBAARRBBOOSSAA

Recife, PE Março, 2006

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DDEE DDNNAA MMIITTOOCCOONNDDRRIIAALL HHUUMMAANNOO

NNAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE AALLAAGGOOAASS,, BBRRAASSIILL

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte dos

requisitos necessários para a obtenção do

grau de Mestre em Genética.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Maurício da

Silva, Depto. de Genética, Centro de Ciências

Biológicas, UFPE.

Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Antonio

Ferreira da Silva, Depto. de Biologia, Centro

de Ciências Biológicas, UFAL.

Recife, PE Março, 2006

Barbosa, Adriana Braga de Góes

Determinação do polimorfismo das seqüências de DNA mitocondrial humano na população de Alagoas, Brasil/ Adriana Braga de Góes Barbosa. – Recife: O Autor, 2006.

101 folhas : il.,fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas.Genética.

1. Genética – populações 2. MtDNA – população - Alagoas 3. Polimorfismo I.Título.

576.58 CDD (22.ed.) UFPE 575.17 CDU (2.ed.) CCB - 2006 -011

Aos meu pais,

SILVIA e LENILDO,

dedico.

AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS

− Ao meu orientador, Dr. Luiz Maurício da Silva, pela confiança, paciência, por ter me ensinado e ampliado meu interesse pela Genética Forense.

− Ao meu co-orientador, Dr. Luiz Antonio Ferreira da Silva, pela

confiança, exemplo de dedicação e momentos de aprendizagem, os quais foram determinantes para execução deste trabalho.

− Aos meus amigos e colegas de laboratório. Cada um contribuiu

significativamente na minha vida profissional e pessoal: Dalmo, Ana, Eliana, Fátima, André, Beatriz, Kelly, Laura, Djavan, Cássia, Iede, Henrique e Felipe.

− Aos colegas de mestrado pelos bons momentos vividos juntos e em

especial à amiga Jemima Eline, pelo companheirismo em situações boas e outras nem tanto.

− À Bianca Carvalho e Fábio Leite, do Instituto Geral de Perícias do Rio

Grande do Sul, e à Dra. Maria Cátira Bortolini, da UFRGS, pela orientação na análise filogenética e classificação de haplótipos.

− À Demétrio Mutzenberg, pelo amor, apoio e pela ajuda dada durante a

realização deste trabalho.

SSUUMMÁÁRRIIOO

Página

Lista de Figuras 6

Lista de Tabelas 7

Lista de abreviações 8

Resumo 10

1. Introdução 11

2. Revisão bibliográfica: 13

2.1. O DNA Mitocondrial 13

2.1.1. Caracterização do loco 13

2.1.2. Número de cópias e herança 16

2.1.3. Heteroplasmia 18

2.2. Variação genética populacional 22

2.2.1. As linhagens mitocondriais da África 23

2.2.2. As linhagens mitocondriais da Europa 24

2.2.3. As linhagens mitocondriais da Ásia 24

2.2.4. As linhagens mitocondriais das Américas 25

2.2.5. Linhagens mitocondriais brasileiras 26

2.3. O DNA mitocondrial no contexto forense 28

2.3.1. Nomenclatura 28

2.3.2. Interpretação dos dados 31

2.4. Qualidade dos dados 34

2.4.1. Seqüenciamento 34

2.4.2. Classificação dos erros 36

2.4.3. Análise filogenética para identificação de erros 38

2.4.4. Detecção de mutações fantasmas 39

4

3. Referências Bibliográficas 42

4. Manuscrito de Artigo Ciêntífico

Mitochondrial DNA control region polymorphism in the population of Alagoas, Northeastern of Brazil.

56

5. Informações complementares 71

6. Conclusões 86

7. Abstract 87

8. Anexos 88

8.1. Instruções para Autores - Genetics and Molecular Biology

89

8.2. Instruções para Autores - Journal of Forensic Sciences 92

5

LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS

Figura Página

Revisão da Literatura

Figura 1. Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama expandido da região controle não-codificante.

15

Figura 2. Heteroplasmia de ponto. 19

Figura 3. Heteroplasmia de comprimento. 20

Figura 4. Seqüências de três indivíduos diferentes mostrando a dificuldade na determinação da heteroplasmia de comprimento em HV2.

21

Figura 5. Distribuição dos haplogrupos refletindo o padrão das migrações humanas.

23

Figura 6. Nomenclatura das inserções no trecho poli-C em HV2.

30

Figura 7. Eletroferogramas com seus valores de qualidade.

35

Figura 8. Árvores geradas pelo programa Network. 41

Informações complementares

Figura 1. Mapa do Estado de Alagoas indicando os municípios de origem dos 123 indivíduos analisados.

72

Figura 2. Árvore filogenética gerada pelo programa Network com os dados da população de Alagoas.

81

6

LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS

Tabela Página

Revisão da Literatura

Tabela 1. Lista dos sítios característicos para os principais haplogrupos do mtDNA.

25

Tabela 2. Códigos da IUPAC. 31

Tabela 3. Valores de qualidade (QV) e suas respectivas probabilidades de erro (Pe).

36

Tabela 4: Lista de transições que ocorrem freqüentemente na região HV1.

40

Manuscrito

Tabela 1. mtDNA haplotypes and their frequency in the Alagoas population.

68

Tabela 2. Genetic diversity and statistical parameters in a sample of 123 individuals from Alagoas.

70

Informações complementares

Tabela 1. Seqüências dos primers para amplificação dos fragmentos da HV1 e HV2.

73

Tabela 2. Quantidades recomendadas de DNA para a reação de seqüenciamento.

75

Tabela 3. Diversidade genética de várias populações e grupos étnicos ao redor do mundo.

82

Tabela 4. Diversidade genética e parâmetros estatísticos de 123 indivíduos da população de Alagoas.

82

7

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAAÇÇÕÕEESS

A Adenina ATP Adenosina trifosfato BSA Bovine Serum Albumin Albumina Sérica Bovina C Citosina CRS Cambridge Reference Sequence Seqüência de Referência de Cambridge ddNTP didesoxirribonucleotídeo trifosfato DNA Desoxiribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico dNTP desorribonuleotídeo trifosfatado EDNAP European DNA profiling Grupo Europeu de Identificação Humana por DNA Fita H Fita Heavy Fita L Fita Light G Guanina g Gravidade HV1 Região hipervariável 1 HV2 Região hipervariável 2 HV3 Região hipervariável 3 IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry União Internacional de Química Pura e Aplicada kb Kilobase µg Micrograma min Minuto µl Microlitro µM Micromolar mM Milimolar mRNA RNA mensageiro mtDNA DNA mitocondrial ng Nanograma ºC Graus Celsius pb Pares de base PCR Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase Pe Probabilidade de Erro pH potencial hidrogeniônico QV Quality Value Valor de Qualidade RC Região Controle rCRS Revised Cambridge Reference Sequence Seqüência de Referência de Cambridge revisada

8

RNA Ribonucleic Acid Ácido Ribonucléico rRNA RNA ribossômico s Segundo STR Short Tanden Repeats Repetições Curtas em Tandem SWGDAM The Scientific Working Group on DNA Analysis Methods Grupo Científico de Trabalho em Métodos de Análise do DNA T Timina Taq Thermophylus aquaticus tRNA RNA transportador U Unidade UV Ultra Violeta Σ Somatório

9

Barbosa, A.B.G. Polimorfismo de mtDNA humano na população de Alagoas

RREESSUUMMOO

A análise das seqüências de DNA mitocondrial humano (mtDNA) tem sido

uma ferramenta muito útil na genética forense devido às características

especiais do mtDNA como herança materna, ausência de recombinação e

alto número de cópias por célula. O objetivo deste trabalho foi determinar

o polimorfismo das regiões hipervariáveis 1 e 2 do mtDNA humano na

população de Alagoas, Brasil. Para isso, foram seqüenciados 167 mtDNAs

de indivíduos não relacionados desta população para análise dos dois

segmentos hipervariáveis, HV1 e HV2, da região controle. A heteroplasmia

de comprimento, nas regiões de trechos de citosina repetidas em

HV1/HV2, foi observada em 22% (37/167) e 11% (19/167) da amostra,

respectivamente. Dos 123 segmentos de HV1 e HV2 restantes, um total

de 110 haplótipos diferentes foram encontrados, sendo determinados por

128 posições variáveis. O haplótipo mais freqüente (16111, 16223,

16290, 16319, 16362, 73, 146, 153, 235, 263, 309.1C, 315.1C -

haplogrupo A) foi econtrado em cinco indivíduos, seguido por um

haplótipo compartilhado por três indivíduos e um haplótipo compartilhado

por duas pessoas em sete ocorrências diferentes (frequência de 1,6%). A

diversidade genética foi estimada em 0,997 e a probabilidade de dois

indivíduos ao acaso possuírem mtDNAs idênticos foi de 0,011. Baseado

nos resultados dos perfis de mtDNA, 45% das sequências puderam ser

classificadas como haplogrupos africanos, 27% como nativo-americanos e

25% como europeus. Cerca de 3% dos haplótipos não puderam ser

classificados em nenhum haplogrupo. A diversidade genética das regiões

HV1 e HV2 indica a importância desses locos para a identificação humana

na população de Alagoas.

PPAALLAAVVRRAASS--CCHHAAVVEE:: mtDNA, polimorfismo, regiões hipervariávies, Alagoas.

10


11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

O mtDNA humano tem 16.569 bases de comprimento e possui duas

principais regiões: a região codificante e a não-codificante. A região

codificante é responsável pela produção de várias moléculas biológicas

envolvidas no processo de produção de energia da célula. A região

controle (não-codificante) é responsável pela regulação da replicação e

transcrição da molécula de mtDNA. Duas regiões do mtDNA localizadas na

região controle são altamente polimórficas na população humana em

geral. Essas regiões são conhecidas como regiões hipervariáveis 1 e 2

(HV1 e HV2) e os testes forenses usando mtDNA são realizados com essas

duas regiões devido a grande variabilidade encontrada entre indivíduos

(Isenberg e Moore 1999).

Comparado com a tipagem do DNA nuclear, o mtDNA apresenta

duas vantagens na investigação forense: primeiro, está presente em um

alto número de cópias e pode fornecer um resultado quando o DNA

genômico não pode, em particular, quando o material biológico contiver

pouco ou nenhum DNA nuclear (Wilson et al. 1995). Isso permite, por

exemplo, a análise de fios de cabelo, dentes, ossos antigos, tecidos

putrefados, etc. Segundo, o mtDNA é transmitido exclusivamente por

linhagem materna, para os filhos, sem recombinação (Hutchison et al.

1974). Assim, a probabilidade de um parentesco materno pode ser

calculada por comparação direta das seqüências de DNA.

Em testes forenses, quando duas seqüências de mtDNA são

idênticas, ou seja, quando não podem ser excluídas como originárias do

mesmo indivíduo ou da mesma linhagem materna, é necessário fazer uma

estimativa estatística da significância dessa coincidência (peso da

evidência). Para isso, conta-se o número de vezes que a seqüência em

particular é observada em um banco de dados. Então, baseado no

tamanho do banco de dados e no perfil observado, é possível estimar a

11


freqüência de um haplótipo de DNA mitocondrial em uma população

(Budowle et al. 1999a).

Até o presente momento não haviam dados sobre a freqüência dos

haplótipos de HV1 e HV2 na população de Alagoas. Tal fato impossibilitava

a aplicação desses marcadores em identificação humana, já que para isto

é necessário saber alguma informação sobre a raridade dos perfis de

mtDNA nesta população.

Neste trabalho esperou-se encontrar uma alta diversidade genética

nas regiões HV1 e HV2 da população em estudo, já que esta é resultado

de um processo de miscigenação que ocorreu no Nordeste do país.

Este trabalho teve como objetivo determinar o polimorfismo das

regiões hipervariáveis 1 e 2 do DNA mitocondrial humano na população de

Alagoas para a criação de um banco de dados referencial para a região

Nordeste, bem como comparar os dados obtidos com outras populações

em relação à variabilidade genética.

12


22.. RREEVVIISSÃÃOO BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAA

2.1. O DNA mitocondrial

2.1.1. Caracterização do loco

Além do genoma nuclear, as células eucariontes possuem DNA

dentro das mitocôndrias. Estas organelas apresentam membrana dupla e

estão presentes no citoplasma, sendo responsáveis por muitos processos

metabólicos crucias como a fosforilação oxidativa. Por essa razão, as

mitocôndrias são conhecidas como as usinas energéticas das células.

Acredita-se que as mitocôndrias são evolutivamente derivadas de uma

bactéria ancestral, a qual teria formado uma relação simbiótica

intracelular com as primeiras células eucarióticas (Gray, 1992). Com o

passar de centenas de milhões de anos, esse ancestral perdeu a

habilidade de funcionar como um organismo independente, de modo que

seu genoma tornou-se muito atenuado. De fato, a maioria das proteínas

funcionais da mitocôndria está codificada por genes do núcleo (Lang et al.

1997). O que restou na mitocôndria humana foi um genoma circular de

16.569 pares de bases (pb) que contém 37 genes (Fig. 1), dos quais 22

codificam RNAs transportadores, dois codificam RNAs ribossomais e 13

codificam proteínas/enzimas envolvidas na cadeia transportadora de

elétrons da fosforilação oxidativa e produção de ATP (Wallace 1992).

A primeira seqüência do genoma mitocondrial foi determinada em

1981 (Anderson et al. 1981). As duas fitas do mtDNA têm diferenças

significativas em relação as suas composições: a fita ou cadeia H (heavy)

é rica em guaninas e a cadeia L (light) é rica em citosinas. Além da região

codificante do mtDNA, existe uma seção não-coficante conhecida como

região controle (RC). A RC também é conhecida como alça-D (D-loop)

devido a estruturas visíveis pelo microscópio eletrônico que são formadas

durante a replicação (Upholt e Dawid 1977). A RC possui 1.125 pb de

comprimento e contém promotores para RNAs policistrônicos de genes

13


das fitas L e H, bem como a origem de replicação para a fita H. O sistema

de numeração da seqüência de referência, conhecida como seqüência de

referência de Cambridge (Anderson et al. 1981), começa arbitrariamente

próximo ao meio da região controle, assim a RC compreende as posições

16.024 a 16.569 e continua da posição 1 a 576 (Fig. 1).

O DNA mitocondrial evolui cerca de cinco vezes mais rápido que o

DNA nuclear (Cann e Wilson 1983). Essa variação se deve, em primeiro

lugar, ao fato da mitocôndria ser uma grande geradora de radicais livres,

proporcionando um ambiente favorável a mutações no DNA. Outra causa

seria a ausência de histonas, que exercem um papel protetor no DNA

nuclear (Yakes e Van Houten, 1997). Além disso, a enzima DNA

polimerase mitocondrial possui baixa atividade corretora quando

comparada à DNA polimerase nuclear (Kunkel e Loeb, 1981) e a

reparação do DNA dependente de excisão de nucleotídeos não está

presente em mitocôndrias (Croteau et al. 1999). Em relação à região

codificante, algumas porções da RC são altamente variáveis entre

indivíduos, evoluindo cinco vezes mais rápido que o resto da molécula

(Greenberg et al. 1983), presumidamente devido à fraca seleção exercida

sobre a região não-codificante do DNA. Também deve-se considerar que a

típica estrutura D-loop, onde há a formação momentânea de fita-simples,

pode influenciar o padrão de mutação pontual (Reyes et al. 1998), já que

a taxa de depurinação de DNA fita-simples é quatro vezes maior que do

DNA fita-dupla (Lindahl e Nyberg, 1972).

Por essas razões, os testes de identificação forense têm em foco a

variação de seqüências dentro das regiões hiperveriáveis da RC (Holland

et al. 1993; Wilson et al. 1993; Parson et al. 1998). A região hiperveriável

1 (HV1) compreende as posições 16024 a 16325, enquanto a região

hiperveriável 2 (HV2) estende-se da posição 73 até a 340. Um terceiro

segmento hipervariável, chamado HV3, foi descrito dentro da região

controle do mtDNA (Lutz et al. 1997), localizado entre as posições 438 e

574. Este terceiro segmento, no entanto, é menos polimórfico que HV1 e

14


HV2 e é usado apenas em alguns casos, quando uma discriminação

adicional torna-se necessária.

Figura 1. Mapa do genoma mitocondrial humano e diagrama expandido da região controle não-codificante. Estão listados os genes para os RNAs ribossomais 12S e 16S, subunidades do compelxo NADH-coenzima Q oxidoredutase (ND), complexo citocromo C oxidase (CO) , citocromo b (CIT B), ATPase, 22 tRNAs (representados pela letra do aminoácido que carregam) e origem de replicação das fitas Light (OL) e Heavy (OH). O diagrama da região controle mostra o flanqueamento dos genes de tRNAs e a localização da região hiperveriável 1 (HV1) e 2 (HV2); O sistema de numeração segue o da seqüência de referência padrão (Anderson et al. 1981). Adaptado de www.mitomap.org.

15


2.1.2. Número de cópias e herança

Uma característica do DNA mitocondrial que lhe confere grande

vantagem na análise forense é o alto número de cópias por célula.

Enquanto o DNA nuclear está presente em apenas duas cópias por célula

diplóide, estima-se que um óvulo maduro contenha milhares de

mitocôndrias e mais de 100.000 cópias de mtDNA (Piko e Matsumoto

1976; Michaels et al. 1982). No geral, existem entre duas a 10 cópias de

mtDNA por mitocôndria e entre 100 a 1.000 mitocôndrias por célula,

dependendo do tipo de tecido. Dessa maneira, o número de cópias por

célula somática varia de aproximadamente 200 a 10.000 (Bogenhagen e

Clayton 1974; Robin e Wong 1988; Ricoy-Campo and Cabello 2003).

Assim sendo, o mtDNA fornece à ciência forense um método para tipar

espécimes contendo mínimas quantidades de DNA nuclear tais como ossos

antigos, pêlos sem bulbo, tecidos carbonizados, partículas de pele, etc

(Holland et al. 1993; Wilson et al. 1995; Pfeiffer et al. 1999a; Wurmb-

Schwarka et al. 2003; Cerri et al. 2004; Edson et al. 2004).

Uma outra característica importante para a análise forense é a

herança materna do mtDNA (Hutchison et al. 1974). Esse tipo de herança

pode ser muito útil em testes de identificação porque permite uma

comparação direta de seqüências de DNA de parentes com a mesma

linhagem materna, sem a ambigüidade causada por recombinação

meiótica e mistura de genes nucleares. Assim, quando a seqüência de

uma amostra biológica é comparada com a de uma pessoa de referência,

a probabilidade de um parentesco materno pode ser calculada (Lutz et al.

2000).

Uma das explicações para a herança materna do mtDNA pode ser

simplesmente numérica: a cabeça dos espermatozóides contém apenas

poucas cópias de mtDNA comparado as milhares de cópias do óvulo (Chen

X et al. 1995). Além disso, também parece existir um mecanismo

específico de reconhecimento que consegue eliminar mesmo essas poucas

moléculas de mtDNA paterno que podem ser introduzidas no óvulo. Por

16


exemplo, no estudo de Manfredi et al. 1997, quando algumas

mitocôndrias das células espermáticas humanas foram introduzidas em

uma cultura de células somáticas destituídas de mtDNA, 10 a 20% das

células contendo mtDNA proveniente do espermatozóide morreram

imediatamente após a introdução, enquanto apenas uma fração muito

pequena das células (1/105) sobreviveu mais de 48 horas. No entanto,

quando mitocôndrias de células somáticas foram introduzidas em uma

cultura de células, uma rápida substituição do DNA endógeno foi

observada (King e Attardi 1988). Isso demonstra a existência de

mecanismos que eliminam especificamente mitocôndrias derivadas de

espermatozóides, mas não mitocôndrias derivadas de células somáticas.

Em 1999 foi sugerido que as mitocôndrias do espermatozóide são

marcadas com ubiquitina (proteína marcadora que se liga covalentemente

a lisinas de outras proteínas) para serem selecionadas e destruídas

(proteólise) no embrião (Sutovsky et al. 1999).

Recentemente um estudo realizado por Kraytsberg et al. (2004)

demonstrou que o mtDNA pode sofrer recombinação. O mtDNA foi obtido

a partir de uma amostra de músculo, contendo mtDNA materno e paterno,

de um paciente acometido por uma miopatia devido a uma mutação no

mtDNA paterno. Algumas das seqüências analisadas mostraram ser uma

mistura de ambos mtDNAs. Uma das possibilidades para a presença de

DNA paterno no paciente seria a introdução de uma pequena quantidade

desse DNA durante a fertilização, sofrendo em seguida uma vantagem

seletiva no músculo devido a essa determinada mutação ou polimorfismos

paterno-específicos. No entanto, os resultados não desafiam a idéia que o

mtDNA humano é herdado somente da mãe, já que o estudo não

demonstra claramente a herança paterna ou recombinação em células

germinativas (Holding 2004).

Mesmo que o mecanismo para eliminação de mtDNA paterno não

esteja totalmente elucidado, está claro que do ponto de vista prático do

teste forense, o mtDNA segue herança materna. Parsons et al. (1997)

realizaram uma comparação de 69 sequências de mtDNA de pais e filhos e

17


em nenhum dos casos foram observados traços de seqüências paternas

no mtDNA por seqüenciamento direto dos produtos amplificados da PCR

(seguindo a mesma metodologia utilizada para testes forenses).

Em muitas situações têm sido observadas misturas de mais de um

tipo (seqüência) de mtDNA no mesmo indivíduo. Essa condição é

conhecida como heteroplasmia, onde envolve a mistura de apenas poucas

bases (geralmente uma ou duas). Se tais misturas heteroplásmicas

fossem resultado de herança paterna, a expectativa para misturas seria

de muito mais bases, no mínimo, uma média de oito bases diferentes nas

seqüências da região controle para dois indivíduos caucasianos escolhidos

ao acaso (Holland et al. 1999).

2.1.3. Heteroplasmia

A ocorrência de heteroplasmia é um fator que se deve levar em

consideração ao se analisar o DNA mitocondrial. Esta se caracteriza pela

presença, em um mesmo indivíduo, de mais de um genótipo de DNA

mitocondrial (Butler e Levin 1998). O fenômeno pode decorrer da

mutação no genoma de uma ou mais mitocôndrias, gerando uma mistura

de moléculas mutantes e normais. Quando uma célula heteroplásmica se

divide, a herança mitocondrial nas células filhas ocorre ao acaso. Depois

de vários ciclos de divisão celular, é possível que prevaleça, dentro de

uma célula, somente uma das formas de DNA, o normal ou o mutante.

Este processo pode se desenvolver em uma célula somática ou durante a

proliferação de células germinais femininas. A heteroplasmia pode se

manifestar de várias maneiras:

1) indivíduos podem ter mais de um tipo de mtDNA em um único tecido;

2) indivíduos podem exibir um tipo de mtDNA em um tecido e um tipo

diferente em outro tecido e/ou

3) indivíduos podem ser heteroplásmicos em uma amostra de tecido e

homoplásmicos em outro tipo de tecido (Budowle et al. 1999a; Bär et al.

2000).

18


Existem dois tipos de heteroplasmia: Heteroplasmia de ponto e

heteroplasmia de comprimento. A primeira é caracterizada como a

ocorrência de mais de uma base em uma mesma posição ou posições nas

seqüências do mtDNA de um mesmo indivíduo (Fig. 2). Uma das

dificuldades de se detectar heteroplasmias de ponto com precisão se

relaciona com o elevado nível de ruído de algumas sequências, inerente à

técnica de sequenciamento, mascarando a presença de algumas delas

(Holland e Parsons 1999).

Figura 2: Heteroplasmia de ponto. A. seqüência apresentando duas bases na posição 16093. A letra Y representa a ambigüidade das bases de timina (T) e citosina (C); B. seqüência homoplásmica com apenas uma base na mesma posição. Modificado de Butler 2005.

Em contrapartida, a heteroplasmia de comprimento é

facilmente identificada devido ao acentuado decréscimo de qualidade na

seqüência que ocorre logo após uma região rica em citosinas conhecida

como trecho poli-C. Em HV1 quando uma timina é substituída por uma

citocina na posição 16.189 (uma condição presente em aproximadamente

19


20% da população em geral), é gerada uma série ininterrupta de 10 ou

mais Cs que aparentemente é replicada com baixa fidelidade pela

mitocôndria. O resultado é uma população de moléculas distintas,

diferindo no comprimento das porções de citosina repetidas, produzindo

uma quebra abrupta da qualidade dos dados devido ao desalinhamento

das moléculas durante o seqüenciamento (Parson et al. 1998) (Fig. 3).

Figura 3: Heteroplasmia de comprimento. A. presença de um T na posição 16189 numa seqüência normal; B. a substituição do T pelo C na mesma posição prejudicando a leitura da seqüência após o trecho de C; C. estratégias utilizadas para seqüenciar amostras com heteroplasmia de comprimento. Modificado de Butler 2005.

20


Para contornar este problema, torna-se necessário o uso de primers

que se pareiam imediatamente antes e depois da região de Cs repetidos.

Como conseqüência, são editadas simultaneamente quatro fitas

seqüenciadas, que apresentam regiões em sobreposição, de tal modo que

toda a região HVI esteja representada (Fig. 3C).

Em contraste com HV1, o grau de heteroplasmia de comprimento

em HV2 varia entre indivíduos, de modo que em alguns casos as bases

dessa região podem ser determinadas mesmo quando a heteroplasmia de

comprimento está presente (Marchington et al. 1997). Geralmente

indivíduos que apresentam apenas sete Cs nessa região não manifestam

heteroplasmia de comprimento, enquanto aqueles que apresentam oito ou

mais Cs tendem a ter misturas heteroplásmicas. Pelo fato do nível de

heteroplasmia variar muito entre indivíduos (indo de heteroplasmia não

detectável, a pouco discernível e predominante), é difícil estipular o

número total de seqüências com heteroplasmia de comprimento para HV2

(Fig. 4).

Figura 4: Seqüências de três indivíduos diferentes mostrando a dificuldade na determinação da heteroplasmia de comprimento em HV2. A. heteroplasmia não detectada; B. heteroplasmia pouco discernível; C. heteroplasmia pronunciada. Dados próprios.

21


Assim como para HV1, a seqüência correta fora do trecho de C de

HV2 pode ser determinada usando-se primers alternativos para

seqüenciamento.

2.2 Variação genética populacional

Durante o curso da tipagem do mtDNA de amostras provenientes de

várias populações, têm sido observado que os indivíduos geralmente se

encaixam em haplogrupos que podem ser definidos como um conjunto de

nucleotídeos específicos de cada região geográfica (Wallace et al. 1999,

Ruiz-Pesini et al. 2004). Esses haplogrupos foram originalmente definidos

no final das décadas de 80 e 90 pelo agrupamento de amostras contendo

padrões iguais ou similares quando submetidas a uma série de enzimas de

restrição que foram usadas para separar vários tipos de mtDNA oriundos

de populações ao redor do mundo. Os haplogrupos agora têm sidos

correlacionados com polimorfismos de HV1/HV2 bem como variações no

genoma inteiro. O genoma mitocondrial tem servido não só para

esclarecer a origem de nossa espécie (Cann et al. 1987), como também

tem sido utilizado conjuntamente com outros marcadores genéticos para

seguir o rastro das migrações de populações humanas.

Os grupos de humanos que originalmente saíram da África para

ocupar outras regiões geográficas tiveram que se adaptar à mudança na

disponibilidade calórica (alimentar) das novas regiões ambientais e as

condições climáticas diferentes, acumulando mutações de uma maneira

seqüencial nas linhagens de mtDNA (Wallace 2005). Assim, as linhagens

do mtDNA têm uma distribuição geográfica que corresponde a das

populações humanas (Fig. 5). Os haplogrupos A, B, C, D, E, F, G, M e N

estão tipicamente associados com asiáticos enquanto a maioria dos

nativos americanos caem dentro dos haplogrupos A, B, C, D e X.

Haplogrupos L0, L1, L2 e L3 são africanos e os haplogrupos H, I, J, K, T,

U, V, W e X estão tipicamente associados com populações européias

(Tabela 1).

22


A caracterização das linhagens mitocondriais permite entender a

variação genética entre populações e a diversidade genética dentro das

populações. A classificação em haplogrupos também tem sido usada no

contexto forense para maximizar o controle de qualidade dos bancos de

dados, já que mais de 95% das seqüências, livres de erros e artefatos,

devem se encaixar dentro de algum grupo populacional (Allard et al.

2002, Budowle et al. 2003, Allard et al. 2004; Yao et al. 2004).

Figura 5. Distribuição dos haplogrupos refletindo o padrão das migrações humanas. Baseado em http://www.mitomap.org.

2.2.1. As linhagens mitocondriais da África

Cerca de 76% de todos os mtDNAs africanos da região sub-saariana

caem dentro dos haplogrupos L0, L1 e L2 do macro-haplogrupo L (Chen

YS et al. 1995, Graven et al. 1995). O haplogrupo L0 é considerado a

linhagem mais antiga de mtDNA, existindo há no mínimo 150.000 anos

(Wallace 2005). O haplogrupo L3 representa só uma pequena

porcentagem dos mtDNAs africanos mas parece ser o progenitor dos

23


haplogrupos M e N, que apareceram no norte da África e expandiram-se

pela Europa e Ásia quando os indivíduos portadores desses haplogrupos

saíram da África para colonizar outros continentes (Wallace et al. 1999;

Quintana-Murci et al. 1999). Sendo assim, o haplogrupo L3 é considerado

a linhagem ancestral de metade de todos os mtDNAs europeus, asiáticos e

de nativo-americanos. No geral, os dados de mtDNA mostram que os

mtDNAs africanos apresentam uma grande heterogeneidade; sendo os

mais antigos e com uma diversidade genética maior do que dos outros

continentes (Wallace et al. 1999, Ingman et al. 2000).

2.2.2. As linhagens mitocondriais da Europa

A Europa se caracteriza por uma grande homogeneidade genética

(Simoni et al. 2000a, 2000b, Helgason et al. 2000, Richards et al. 2002),

já que cerca de 99% dos mtDNAs europeus podem ser encaixados dentro

de nove haplogrupos, designados como H, I, J, K, T, U, V, W e X (Torroni

et al. 1996) e são todos derivados do macrohaplogrupo N (Mishmar et al.

2003).

2.2.3. As linhagens mitocondriais da Ásia

Na Ásia, 77% de todos os mtDNAs derivam do macrohaplogrupo M

(Ballinger et al. 1992, Torroni et al. 1993, Chen YS et al. 1995, Wallace

1995). As linhagens mitocondriais asiáticas derivadas do macrohaplogrupo

M são os haplogrupos C, D, G e Z e o restante dos mtDNAs derivam do

macrohaplogrupo N, pertencendo aos haplogrupos A, B, F, Y (Torroni et

al. 1994). Devido à grandeza do seu território e a complexidade de sua

população, a Ásia apresenta grande diversidade de freqüências

haplotíticas.

24


2.2.4. As linhagens mitocondriais das Américas

Nas populações de nativo-americanos, os cinco haplogrupos A, B, C,

D e X englobam 100% da variação genética do mtDNA (Torroni e Wallace

1994). Os haplogrupos A, C, D representam 58% das linhagens do norte

da Sibéria e sua presença nas Américas seria conseqüência da travessia

pelo estreito de Bering dos indivíduos portadores desses haplogrupos. O

haplogrupo B está presente em toda a costa asiática do pacífico, mas

praticamente ausente na Sibéria e pouco freqüente na América do Norte.

O haplogrupo X está presente principalmente na América do Norte,

contudo sua distribuição ainda não está bem estabelecida (Brown et al.

1998).

Tabela 1. Lista dos sítios característicos para os principais haplogrupos do mtDNA. Baseado em Allard et al. 2005 (africanos), Allard et al. 2002 (europeus), Allard et al. 2004 (asiáticos) e Alves-Silva et al. 2000 (ameríndios).

Haplogrupos Polimorfismos

L1a 16129A 16148T 16172C 16187T 16188G 16189C 16223T 16230G 16311C 16320T 93G 185A 189G 236C 247A

L1b 16126C 16187T 16189C 16223T 16264T 16270T 16278T 16311C 152C 182T 185T 195C 247A 357G

L1c 16129A 16189C 16223T 16278T 16294T 16311C 16360T 151T 152C 182T 186A 189C 247A 316A

L2a 16223T 16278T 16294T 16390A 146C 152C 195C

L2b 16114A 16129A 16213A 16223T 16278T 16390A 150T 152C 182T 195C 198T 204C

L2c 16223T 16278T 16390A 93G 146C 150T 152C 182T 195C 198T 325T

L3b 16223T 16278T 16362C

L3d 16223T 152C

L3e1 16223T 16327T 189G 200G

L3e1a 16185T 16223T 16311C 16327T 189G 200G

L3e2 16223T 16320T 195C

L3e2a 16223T 16320T 195C 198T

L3e2b 16172C 16189C 16223T 16320T 195C

L3e3 16223T 16265T 195C

L3e4 16051G 16223T 16264T

L3f 16209C 16223T 16311C 189G 200G

AFR

ICAN

OS

L3f1 16209C 16223T 16292T 16311C 189G 200G

H 73A

T 16126C 16294T

J 16069T 16126C 295T

K 16224C 16311C

U5 16270T

I 16223T 199C 204C 250C

EU

RO

PEU

S

V 16298C 72C

25


Tabela 1. (continuação):

W 16223T 189G 195C 204C 207A

M 16223T 16298C

X 16189C 16223T 16278T 195C

A 16223T 16290T 16319A 235G

B4a 16183C 16189C 16217C 16261T

B4b 16136C 16183C 16189C 16217C 499A

B5a 16140C 16189C 16266A 210G

B5b 16140C 16183C 16189C 16243C

C 16223T 16298C 16327T 16519C 249D

D4a 16129A 16223T 16362C 152C

D4b 16223T 16319A 16362C

D5a 16182C 16183C 16189C 16223T 16266T 16362C 150T

F1a 16129A 16172C 16304C 249D

F1b 16183C 16189C 16304C 249D

F1c 16111T 16129A 16304C 152C 249D

F2a 16291T 16304C 249D

G2a 16223T 16227G 16278T 16362C

M7a1 16209C 16223T 16324C

M7b1 16129A 16192T 16223T 16297C 150T 199C

M7b2 16129A 16189C 16223T 16297C 16298C 150T 199C

M7c 16223T 16295T 146C 199C

M8a 16184T 16223T 16298C 16319A

M9 16223T 16234T 16316G 16362C

M10 16223T 16311C 16519C

N9a 16223T 16257A 16261T 150T

R9a 16298C 16355T 16362C 207A 249D

Y 16126C 16231C 16266T 146C

ASIÁ

TIC

OS

Z 16185T 16223T 16260T 16298C 152C 249D

A 16111T 16223T 16290T 16319A 16362C 73G 152C 235 263

B 16189C 16217C 73G 263G

C 16223T 16298C 16325C 16327T 73G 249D 263G

D 16223T 16325C 16362C

AM

ERÍN

IND

IOS

X 16213A 16278 143A 200G

2.2.5. Linhagens mitocondriais brasileiras

Os brasileiros formam uma das populações mais heterogêneas no

mundo, resultado de cinco séculos de cruzamentos étnicos entre

indivíduos de três continentes: os ameríndios autóctones, escravos

africanos e os colonizadores europeus, representados principalmente por

portugueses. Quando os portugueses chegaram, mais ou menos a 500

anos atrás, existiam cerca de 2.5 milhões de indígenas vivendo numa área

que hoje corresponde ao Brasil (Salzano e Freire-Maia 1970; Bethell

26


1997). A miscigenção entre portugueses e ameríndios começou logo após

a chegada dos primeiros colonizadores. A união entre homens europeus e

mulheres indígenas se tornou comum e mais tarde (depois de 1755) foi

encorajada como estratégia de crescimento populacional e ocupação

colonial do país (Mörner 1967).

As tribos ameríndias sofreram um drástico declínio demográfico

devido aos conflitos com os colonizadores europeus e às doenças as quais

eles ainda não estavam adaptados (Salzano e Freire-Maia 1967, 1970;

Monteiro 1994; Ribeiro 1995). Atualmente existem cerca de 300.000

ameríndios no Brasil, vivendo em reservas protegidas pelo governo

Federal (IBGE- http://www.ibge.gov.br/brasil500/).

Os africanos começaram a ser introduzidos no Brasil em meados do

século XVI, trazidos ao Brasil como escravos para trabalhar nas fazendas

de cana-de-açúcar e mais tarde em minas de ouro e diamantes e

plantações de café. Registros históricos sugerem que entre 1.551 e 1.850

(quando o tráfico de escravos foi abolido), aproximadamente 3,5 milhões

de africanos chegaram ao Brasil (Salzano e Freire-Maia 1967; Curtin

1969; Ribeiro 1995).

Em relação a imigração européia, estima-se que cerca de 500.000

portugueses chegaram ao país entre 1.500 e 1.808 (Salzano e Freire-Maia

1967). As mulheres portuguesas vieram ao Brasil em menor número, mas

sua presença foi notada inicialmente no século XVI principalmente em

Pernambuco, Bahia, São Vicente e, mais tarde, em Minas Gerais, no

Maranhão, no Pará, em Santa Catarina, no Rio Grande do Sul (Pereira

1962). A partir da abertura dos portos brasileiros, o número de imigrantes

de várias partes do mundo cresceu no Brasil. Portugal permaneceu sendo

a fonte mais importante de imigrantes, seguido pela Itália, Espanha e

Alemanha. Já no século XX vieram imigrantes asiáticos, principalmente do

Japão, Síria e Líbano. De acordo com Callegari-Jacques e Salzano (1999),

58% dos imigrantes que chegaram ao Brazil entre 1500 e 1972 eram

europeus, 40% eram africanos e 2% eram asiáticos.

27


O estudo de marcadores mitocondriais, realizado por Alves-Silva

et al. (2000), para traçar matrilinhagens (linhagens maternas)

genealógicas mostrou que a população brasileira apresenta uma grande

diversidade de mtDNAs. De 247 indivíduos analisados, 171 apresentaram

seqüências distintas mostrando também uma distribuição de origens

geográficas para a região Nordeste do Brasil de 44% de linhagens

africanas, 22% de ameríndias e 34% de européias.

2.3. O DNA mitocondrial no contexto forense

2.3.1. Nomenclatura

A nomenclatura das seqüências de mtDNA deve ser de fácil

entendimento, contudo complicações podem surgir se algumas regras não

forem levadas em consideração. Analisar mais de 600 bases para

descrever resultados da HV1 e HV2 seria um processo lento, complicado

e, portanto, impraticável. Então, uma abordagem alternativa foi

desenvolvida para identificar apenas as diferenças em relação a uma

seqüência de referência.

O padrão universal para a nomenclatura de mtDNA é derivado da

primeira seqüência completa de mtDNA publicada por Anderson et al.

(1981). Cada uma das bases no genoma mitocondrial foi designada por

um número consecultivo começando a partir do número um, próximo à

origem de replicação da fita H, e terminando em 16.569. Esta seqüência é

conhecida como seqüência de Anderson ou pelo termo ‘Seqüência de

Referência de Cambridge’ (Cambridge Reference Sequence - CRS),

considerado mais adequado já que a seqüência não é originária do

trabalho de um único indivíduo, além de ter sido posteriormente revisada

e corrigida por Andrews (Andrews et al. 1999). A rCRS (CRS revisada)

padrão é proveniente do seqüenciamento da fita L do genoma

mitocondrial, sendo este filamento definido como o principal, já que

28


contém a seqüência codificante dos rRNAs e da maioria dos tRNAs e

mRNAs (Anderson et al. 1981).

A rCRS é comparada diretamente com as seqüências estudadas para

facilitar a nomenclatura dos tipos de mtDNA. Uma sequência analisada

pode ser apresentada como uma lista de diferenças da rCRS. Por exemplo,

no sítio 16.311 (em HV1), a rCRS tem um T; contudo, uma parte

significativa da população carrega um C nesse mesmo sítio. Esse

polimorfismo é designado como 16.311C. Se nenhuma outra base (ou

sítio) diferente for observada então não é necessário registrar essa

informação, ou seja, está implícito que a seqüência da amostra é igual a

da rCRS com exceção do sítio 16.311.

Inserções são descritas primeiramente anotando-se a posição

anterior à inserção seguida por um ponto e um número ‘1’ (para a

primeira inserção), um ‘2’ (se existir uma segunda inserção) e assim por

diante, e pelo nucleotídeo que foi inserido (ex: se uma base de guanina

for observada entre as posições 94 e 95 da HV2, ela deve ser designada

como 94.1G). No caso de trechos homopoliméricos (trechos de uma única

base repetida), onde a posição exata na qual a inserção ocorreu é

desconhecida, sempre se assume que a inserção ocorreu no final do

trecho, onde a numeração é mais alta. Por exemplo, a nomenclatura

usada para descrever uma inserção de C na região homopolimérica

conhecida como Poli-C, que ocorre nas posições entre os nucleotídeos 302

e 309 da HV2, é 309.1C. Duas inserções nesse trecho devem ser descritas

como 309.1C e 309.2C (Fig. 6).

Se deleções forem observadas em relação à rCRS, elas devem ser

registradas como o número da base ou bases faltando em relação à CRS

seguido por um ‘D’ (por exemplo, 249D).

29


Figura 6. Nomenclatura das inserções no trecho poli-C em HV2. Dados próprios.

Se uma ambigüidade for observada em algum sítio, ou seja, se

alguma base não pode ser determinada, o número da base para o sítio é

registrado sendo seguido pela letra ‘N’ (ex: 16.125N). Alternativamente,

os códigos da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry -

União Internacional de Química Pura e Aplicada) podem ser usados (tabela

2).

Nomear seqüências de mtDNA referindo-se a uma seqüência padrão

provê uma linguagem comum e uma ferramenta fácil para descrever a

variação observada em populações humanas. A nomenclatura acima, para

o registro das diferenças, foi descrita por Budowle et al. (1999a), Bär et

al. (2000), Carracedo et al. (2000) e Tully et al. (2001) e é usada pela

comunidade forense. No entanto, Salas et al. (2005) recomendam

destacar apenas as bases das transversões para facilitar uma inspeção

visual em busca de bases atribuídas incorretamente ou um excesso de

transversões nos dados (ex: 16.093, 16.223, 16.265T, 16.316 - nesse

haplótipo apenas o sítio 16.265 em que ocorreu a transversão é marcado

com a base diferente da rCRS enquanto presume-se que as outras

mutações são transições). Entende-se por transição uma mutação de uma

base púrica para outra púrica (A ↔ G) ou de pirimídica para pirimídica (C

30


↔ T) e transversão uma mutação de uma base púrica para pirimídica ou

vice-versa (A ou G ↔ C ou T).

Tabela 2. Códigos da IUPAC.

Código Tradução A Adenina C Citosina G Guanina T Timina B C, G ou T D A, G ou T H A, C ou T R A ou G (purina) Y C ou T (pirimidina) K G ou T M A ou C S G ou C W A ou T N Qualquer base V A, C ou G

2.3.2. Interpretação dos dados

A comparação de duas seqüências resultará numa perfeita

coincidência (match) ou não. As sequências são designadas concordantes

se elas são iguais em todos os sítios estudados. Porém, a interpretação

dos resultados nem sempre é fácil. Os resultados podem ser agrupados

em três categorias: exclusão, inconclusivo ou não exclusão. Os guias do

SWGDAM (The Scientific Working Group on DNA Analysis Methods - Grupo

Científico de Trabalho em Métodos de Análise do DNA) para a

interpretação das sequências de nucleotídeos do DNA mitocondrial fazem

as seguintes recomendações (SWGDAM 2003):

Exclusão: Se existem dois ou mais nucleotídeos diferentes entre a

seqüência questionada e a seqüência conhecida, elas devem ser

excluídas como originárias do mesmo indivíduo ou da mesma

linhagem materna.

31


Inconclusivo: Se existe apenas um nucleotídeo diferente entre a

seqüência questionada e a seqüência conhecida, o resultado deverá

ser inconclusivo.

Não exclusão: Se as seqüências questionada e conhecida

apresentarem as mesmas bases em todos os sítios estudados, elas

não podem ser excluídas como originárias do mesmo indivíduo ou

linhagem materna.

Quando o resultado de uma análise não exclui as amostras da

evidência e referência, é necessário fazer uma estimativa estatística da

significância dessa coincidência (peso da evidência). Presume-se que o

mtDNA é herdado inteiramente pela mãe, sem recombinação. Logo, as

posições nucleotídicas são herdadas em bloco e devem ser tratadas como

um único loco haplóide, como é o caso do cromossomo Y. Assim, a regra

do produto aplicada aos locos independentes das STRs (encontradas em

cromossomos diferentes) não pode ser usada com polimorfismos de

mtDNA. Atualmente, o procedimento consiste em contar o número de

vezes que determinada seqüência ou haplótipo é observada em um banco

de dados (Wilson et al. 1993; Budowle et al. 1999a). Essa prática é

comumente referida como ‘método da contagem’ e depende inteiramente

do número de haplótipos presentes no banco de dados que está sendo

usado. Por isso, quanto maior for o número de indivíduos não relacionados

dentro do banco de dados, mais precisa será a estatística para uma

estimativa de probabilidade de coincidência ao acaso. Vários bancos de

dados de seqüências HV1 e HV2 da região controle do mtDNA têm sido

publicados e expandidos para permitir a resolução de casos forenses em

diversos países e regiões geográficas (Lutz et al. 1998; Parson et al.

1998; Rousselet e Mangin 1998; Budowle et al. 1999b; Pfeiffer et al.

1999b; Crespillo et al. 2000; Dimo-Simonin et al. 2000; Cali et al. 2001;

Tagliabracci et al. 2001; Budowle et al. 2002; Imaizumi et al. 2002; Bini

et al. 2003; Poetsch et al. 2003; Rajkumar e Kashyap 2003; Pajnič et al.

2004; Vanecek et al. 2004; Jin et al. 2005). Outra alternativa para a

32


avaliação do peso da evidência é através da razão de probabilidades

(likelihood ratios) (Evett e Weir 1998; NRC 1996).

A interpretação estatística de perfis de DNA mitocondrial, assim

como a análise de casos forenses e nomenclaturas adotadas foi tema de

uma reunião da Comissão de DNA (EDNAP - ‘European DNA profiling’) da

Sociedade internacional de Genética Forense (Tully et al. 2001). Com o

surgimento de informações provenientes de estudos com diferentes

populações, foram observadas características comuns entre vários grupos

(Budowle et al. 1999b; Baasner et al. 1998). A substituição do tipo

transição é o polimorfismo predominante, e a troca entre as bases T e C

são as mais freqüentes. Em relação à seqüência padrão rCRS, grupos

africanos normalmente apresentam número médio de variações (entre 12

e 15) maior que grupos caucasianos (entre 6 e 9). A análise das regiões

HV1 e HV2 em indivíduos com haplótipo típico do grupo africano L1c na

população brasileira, proporcionou a detecção de 25 a 30 posições

variantes (Alves-Silva et al. 2000, Góes et al. 2002). Em um estudo sobre

o padrão de substituição de nucleotídeos nas regiões HV1 e HV2,

observou-se uma taxa de substituição em HV1 duas vezes maior que em

HV2. Esta diferença é devida, principalmente, à alta freqüência de

transições de bases pirimídicas em HV1 (Meyer et al. 1999).

Para fins forenses, a análise do DNA mitocondrial deve se restringir

a situações em que não é possível a análise do DNA nuclear, isto é,

quando não há material genético adequado e/ou suficiente para tipagem

de regiões STR do DNA genômico ou quando o material apresenta alto

grau de degradação. A primeira situação é exemplificada em perícias

forenses, nas quais fios de cabelo sem bulbo podem ser a evidência

disponível. Para a identificação da origem de traços de materiais

biológicos, como aqueles coletados em armas de fogo ou em instrumentos

utilizados em estrangulamentos, também é recomendada a análise de

DNA mitocondrial (Szibor et al. 2000). Na segunda situação, também se

encaixam amostras de ossos ou dentes antigos (Rickards et al. 2001;

33


Bender et al. 2000), ou mesmo, ossos coletados de restos mortais não

caracterizados como antigos.

2.4. Qualidade dos dados

2.4.1. Seqüenciamento

Vários cuidados devem ser tomados durante a preparação das

reações como a inclusão de controles negativo e positivos (fornecidos pelo

fabricante dos kits de seqüenciamento) pelo menos na etapa de PCR até o

final do seqüenciamento (Tully et al. 2001).

Para a redução de ambigüidades na determinação da seqüência é

necessário que as regiões em questão sejam seqüenciadas duas vezes

(seqüenciamento das fitas L e H). Os eletroferogramas devem ser

importados para um programa de alinhamento, onde a fita H é

transformada na complementar dela mesma para que as bases sejam

alinhadas na orientação da fita L. O pesquisador deve decidir se os

eletroferogramas estão adequados para o propósito da análise das

seqüências, baseando-se na qualidade de cada eletroferograma e de seus

picos. Os eletroferogramas que não possuem os requisitos de qualidade

não devem ser interpretados. Sendo assim, o DNA do material biológico

deve ser extraído, amplificado e/ou seqüenciado novamente para que não

restem dúvidas sobre a determinação de suas bases (Budowle et al.

1999a, Bär et al. 2000, Carracedo et al. 2000), contudo, a análise das

seqüências em um banco de dados de DNA forense deve se restringir às

bases 16.024-16.365 (HV1) e 73-340 (HV2). Os programas de qualidade

de seqüência (ex: PHRED) são usados para verificar a qualidade dos

eletroferogramas, atribuindo um valor para cada base, podendo variar de

4 a 60, com os valores altos correspondendo a uma ótima qualidade de

seqüenciamento (Fig. 7). O valor de qualidade é medido levando-se em

conta vários parâmetros como espaçamento entre bandas, largura e

altura dos picos, intensidade do sinal, ruído de fundo, etc) que estão

34


logarítimicamente ligados a probabilidades de erro. Assim, valor 10

corresponde a uma acurácia na determinação de base de 90% enquanto o

valor 50 corresponde a uma determinação de base 99,999% de certeza

(Ewing et al. 1998; Ewing e Green 1998) (Tabela 3). Geralmente

emprega-se como padrão aceitável de qualidade o valor QV = 20 que

corresponde aproximadamente 99% de certeza para uma base indicada

ou uma probabilidade de erro de 0,01 (Parson et al. 2004). No entanto,

tal valor não é recomendável para seqüências que requerem um alto

padrão de qualidade, como nos casos forenses.

Figura 7: Eletroferogramas com seus valores de qualidade (Software SeqScape - Applied Biosystems). A. Seqüência com excelente valor de qualidade, B. seqüência com baixo valor de qualidade. Dados próprios.

35


Tabela 3. Valores de qualidade (QV) e suas respectivas probabilidades de erro (Pe). Valores extraídos do programa SeqScape.

QV Pe QV Pe QV Pe 1 79% 21 0,790% 41 0,0079% 2 63% 22 0,630% 42 0,0063% 3 50% 23 0,500% 43 0,0050% 4 39% 24 0,390% 44 0,0039% 5 31% 25 0,310% 45 0,0031% 6 25% 26 0,250% 46 0,0025% 7 20% 27 0,200% 47 0,0020% 8 15% 28 0,150% 48 0,0015% 9 12% 29 0,120% 49 0,0012% 10 10% 30 0,100% 50 0,0010% 11 7,9% 31 0,079% 60 0,0001% 12 6,3% 32 0,063% 70 0,00001% 13 5,0% 33 0,050% 80 0,000001% 14 4,0% 34 0,040% 90 0,0000001% 15 3,2% 35 0,032% 99 0,000000012% 16 2,5% 36 0,025% 17 2,0% 37 0,020% 18 1,6% 38 0,016% 19 1,3% 39 0,013% 20 1,0% 40 0,010%

2.4.2. Classificação dos erros

Muitas seqüências, geradas pelo processo automático, têm sido

relatadas rapidamente na literatura e em bancos de dados. Assim, os

erros que ocorrem rotineiramente muitas vezes são incorporados nos

dados publicados e bancos de dados forenses. Esses erros podem ser

evitados se estratégias cuidadosas forem adotadas na análise e nas

condições de seqüenciamento de cada laboratório. Bandelt et al. (2001)

descreveram cinco categorias diferentes de erros de seqüenciamento:

Tipo I: Deslocamento de base

Ocorre por erro de alinhamento, erro de leitura ou mesmo pelo

deslocamento de uma variante de uma coluna para a coluna seguinte

durante a manipulação dos dados em uma tabela.

36


Tipo II: Erro de referência

Quando as diferenças são escritas por engano com as mesmas bases da

rCRS ou quando elas não são notadas em alguns trechos devido às

dificuldades de leitura.

Tipo III: Mutações fantasmas

Causado por variantes incomuns que aparecem simultaneamente em

diferentes linhagens num conjunto de dados. Essas mutações são

facilmente geradas durante o processo de seqüenciamento, sendo

incorporadas aos dados pelo uso incorreto dos softwares para leitura e

interpretação dos eletroferogramas.

Tipo IV: Base faltante

Ocorre quando a letra de um nucleotídeo é apagada por engano em uma

tabela de pontos ou quando uma transição é escrita como transversão ou

vice-versa.

Tipo V: Recombinação artificial

Gerada pela formação de um haplótipo mosaico constituído por

fragmentos de amostras diferentes. A principal causa desse tipo de erro é

o manejo de dois ou mais segmentos da região controle a partir da etapa

de PCR, facilitando a troca entre amostras. Outra causa importante é a

contaminação que pode ocorrer em qualquer etapa da preparação das

amostras.

37


2.4.3. Análise filogenética para identificação de erros

Conceitualmente, o método para detecção de erros recomendado por

Bandelt et al. (2001), Yao et al. (2004) e Salas et al. (2005) é muito

simples: qualquer seqüência de mtDNA precisa necessariamente se

encaixar em uma parte da filogenia do mtDNA que é caracterizada por

mutações específicas. Geralmente os pedaços que não se encaixam no

padrão podem ser resultado de artefatos e não do processo biológico,

explicando assim o perfil. Por exemplo, a deleção 249D em HV2 está

quase sempre conectada com uma ou outra mutação de HV1, geralmente

o par mutacional 16.223T 16.298C ou o único sítio 16.304C relativo à

rCRS (Salas et al. 2005).

Com o estudo da sistemática filogenética foi possível perceber que as

diferenças em relação à rCRS 16.223T, 16.298C, 73G 249D 263G e

16.304C, 73G 249D, 263G constituem as seqüências ancestrais de HV1 e

HV2 correspondendo aos ramos basais da filogenia do mtDNA (Kong et al.

2003), sendo então herdadas em bloco como haplótipos e sofrendo novas

mutações durante o passar do tempo. Conseqüentemente, seria ao menos

incomum detectar um perfil que combina uma linhagem de HV1 típica do

oriente médio, como 16.069T, 16.126C, com 249D, especialmente quando

uma mutação esperada para essa linhagem (295T) não está presente.

Essas combinações de vários haplótipos incomuns apontam possíveis

falhas nas seqüências que devem ser re-examinadas com seus

eletroferogramas (Salas et al. 2005).

Decidir se uma mutação particular é incomum em um determinado

conjunto de seqüências depende do entendimento de quão freqüente é

aquela mutação em um determinado banco de dados e no contexto de

haplogrupo. Como regra geral, substituições freqüentes tendem a

aparecer em seqüências pertencentes a vários ramos da filogenia,

referidos como haplogrupos, enquanto que posições muito estáveis só

aparecem mutadas em poucos ou em um haplogrupo. Sendo mais

específico, um haplogrupo é um clado monofilético, isto é, compreende

38


todos os descendentes de uma única seqüência ancestral de mtDNA.

Consequentemente, as linhagens descendentes herdam todas as variantes

que distinguem a seqüência ancestral da rCRS. Para identificar uma

seqüência particular no status de haplogrupo é necessário que a

estimação filogenética seja baseada num amplo conjunto de genomas

mitocondriais inteiros (Kong et al. 2003; Achilli et al. 2004; Palanichamy

et al. 2004; Achilli et al. 2005).

Além da análise filogenética, existem alguns cuidados que devem ser

tomados para minimizar os erros de seqüenciamento como evitar

contaminação no laboratório, otimizar os reagentes e condições do

processo de seqüenciamento, procurar por incongruências na mesma

seqüência obtida por reações diferentes, suspeitar de um número grande

de transversões, inserções e deleções, adotar a leitura automática pelo

emprego de softwares com o acompanhamento de inspeção visual e

comparar os dados com outros publicados, da região controle, na

literatura (Bandelt et al. 2004a;b). O banco de dados Mitomap

(www.mitomap.org) pode servir como veículo de busca de variantes

mutacionais, embora não forneça informação sobre haplótipos.

2.4.4. Detecção de mutações fantasmas

Mutações fantasmas são caracterizadas como deleções artificiais

(quando a determinação de base de uma certa posição está quase

invisível no eletroferograma, embora o nucleotídeo exista na seqüência

real), bolhas de corantes (derivadas de ddNTPs fluorescentes não

incorporados) e outros problemas na química do seqüenciamento que leve

a introdução de artefatos, encobrindo bases originais da seqüência

(Brandstätter et al. 2005).

Já está bem estabelecido que a maioria das transições nas seqüências

de HV1 e HV2 ocorre em uma minoria de sítios (Hasegawa et al. 1993),

com outros tipos de mutações sendo considerados menos freqüentes.

Estima-se que 90% das transições de HV1 ocorrem em apenas 27% dos

39


sítios (Bandelt et al. 2002). Assim, uma transição artificial, gerada ao

acaso tem 7,5 mais chances de aparecer entre as mutações raras

comparada a uma transição real. Para avaliar se artefatos introduzidos no

curso do processo de seqüenciamento podem ter produzido mutações

fantasmas comprometendo a acurácia dos dados, aplica-se o processo de

filtração descrito por Bandelt et al. (2002). Nessa análise são filtradas

todas as mutações rápidas (transições que ocorrem freqüentemente em

relação à rCRS) (Tabela 4), deixando apenas as mutações de peso

(transversões, deleções e inserções).

Os dados são importados para um programa (Network ver. 4.1,

http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm) que gera árvores

estreladas quando os dados estão potencialmente livres de mutações

fantasmas. Reticulações aparecem na árvore quando padrões de

incompatibilidade existem nas seqüências, apontando possíveis mutações

artificiais (Fig. 8). Em um estudo recente, Brandstätter et al. 2005

identificaram hotspots de mutações fantasmas no mtDNA. Os sítios mais

acometidos por artefatos foram 16.085, 16.239 e 16.320 de HV1 e 317,

320, 330, 343 e 345 de HV2.

Tabela 4: Lista de transições que ocorrem freqüentemente na região HV1. Retirado de Bandelt et al. 2002.

Nº + 16.000

051, 078, 086, 092, 093, 111, 114, 124, 126, 129, 140, 145, 147, 148, 150, 163, 172, 173, 176, 186, 187, 189, 192, 193, 209, 212, 213, 214, 216, 217, 223, 227, 231, 232, 234, 235, 239, 240, 241, 242, 245, 249, 255, 256, 257, 258, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 270, 274, 278, 284, 287, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 304, 309, 311, 316, 319, 320, 325, 327, 335, 352, 354, 355, 356, 357, 360 e 362.

40


Figura 8: Árvores geradas pelo programa Network. A. Dados livres de mutações fantasmas; B. Reticulações indicando incompatibilidades de sítios nas seqüências devido a mutações incomuns. O nodo central (maior) indica a seqüência mais freqüente e os outros as seqüências derivadas. A letra t representa os sítios com transversões. Retirado de Bandelt et al 2002.

O impacto dos erros encontrados em seqüências no contexto forense

é potencialmente significativo. Em primeiro lugar, se esses erros

ocorrerem durante a análise do DNA proveniente da cena de crime ou de

suspeitos, isso poderá levar ao resultado de falsa exclusão. Segundo, no

caso de novos estudos populacionais para aumentar o tamanho de bancos

de dados de referência, esses erros tendem a gerar novos haplótipos que

na realidade não existem, fazendo com que a estimativa da freqüência

dos tipos verdadeiros seja reduzida (Bandelt et al. 2001; 2004a).

Devido a grande utilidade dos marcadores mitocondriais na ciência

forense, principalmente no caso de amostras degradadas onde não se

pode contar com o DNA nuclear, torna-se clara a importância da criação e

expansão de bancos de dados de mtDNA confiáveis.

41


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4. MMAANNUUSSCCRRIITTOO DDEE AARRTTIIGGOO CCIIEENNTTÍÍFFIICCOO

MMIITTOOCCHHOONNDDRRIIAALL DDNNAA CCOONNTTRROOLL RREEGGIIOONN

PPOOLLYYMMOORRPPHHIISSMM IINN TTHHEE PPOOPPUULLAATTIIOONN OOFF AALLAAGGOOAASS,, NNOORRTTHHEEAASSTTEERRNN OOFF BBRRAAZZIILL

Manuscrito a ser encaminhado à revista

JJoouurrnnaall ooff FFoorreennssiicc SScciieenncceess

ISSN 0022-1198

PA, U.S.A.

56


MMIITTOOCCHHOONNDDRRIIAALL DDNNAA CCOONNTTRROOLL RREEGGIIOONN PPOOLLYYMMOORRPPHHIISSMM IINN TTHHEE

PPOOPPUULLAATTIIOONN OOFF AALLAAGGOOAASS,, NNOORRTTHHEEAASSTTEERRNN OOFF BBRRAAZZIILL TO BE SUBMITTED TO JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES, USA.

Adriana B.G. Barbosa,1 M.Sc.; Luiz Antonio F. da Silva,2 Ph.D.; Dalmo A.

Azevedo,1 M.Sc.; Valdir Balbino,3 Ph.D.; Luiz Mauricio-da-Silva,4 Ph.D.

1 Programa de pós-graduação em genética, Departamento de Genética, Universidade Federal de

Pernambuco 2 Laboratório de DNA Forense, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Alagoas 3 Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco 4 Laboratório de Genética Molecular Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal de

Pernambuco

* This study was supported by Laboratório de DNA Forense of Universidade Federal de Alagoas and

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Corresponding author:

Luiz Antonio Ferreira da Silva

Museu de História Natural/UFAL

Av. Aristeu de Andrade, Nº 452 - Farol

Maceió – AL – Brazil

CEP: 57021-090

[email protected]

57


AABBSSTTRRAACCTT

The sequence of the two hypervariable segments of the mitochondrial

DNA (mtDNA) control region was generated for 167 unrelated individuals

living in Alagoas, northeastern of Brazil. Length heteroplasmy in the C-

stretch HV1/HV2 regions was observed in 22% and 11% of the samples,

respectively. Within 123 samples, a total of 110 different haplotypes were

found as determined by 128 variable positions. The most frequent

haplotype was found in five individuals. The genetic diversity was

estimated to be 0.997 and the probability of two random individuals

showing identical mitochondrial DNA (mtDNA) haplotypes is 0.011. More

than 95% of the mtDNA lineages were allocated to specific mtDNA

haplogroups according to their mutations motifs. The diversity in the

mitochondrial D-loop indicates the importance of this locus for casework

within Alagoas, Brazil.

KKEEYY WWOORRDDSS Forensic science, DNA typing, mitochondrial DNA, polymorphism,

hypervariable regions, haplotypes, haplogroups, Alagoas

58


Mitochondrial DNA is a 16,5 kb molecule which has been fully

sequenced (1) and contains two very polymorphic segments (HV1 and

HV2) located in the non-coding region (2,3). The analysis of mitochondrial

DNA is of great importance in forensic case work when only degraded DNA

is available, because unlike nuclear DNA, mtDNA is present in hundreds to

thousands of copies per cell (4). This quantitative consideration as well as

the strictly maternal inheritance, the lack of recombination and the high

mutation rate of mitochondrial DNA are the main reasons for the use of

mitochondrial sequences in forensic science (5), population studies (6),

molecular evolution (7), anthropology (8) and archaeology (9). The

statistical interpretation of the results depends on the population

frequency of a particular sequence, or haplotype, for estimating a chance

matching probability when two randomly selected individuals share an

identical sequence (10). For this reason, it is essential to determine the

haplotype frequency distribution of HV1 and HV2 in any population of

interest. mtDNA sequence databases of several populations have been

also widely used as a very informative system for inferring the

geographical origin of an mtDNA lineage (11).

mtDNA databases developed for forensic and population purposes need

to be subjected to stringent quality assurance and control procedures (11-

13). It has recently been demonstrated by Bandelt et al. (14-16) that

erroneous haplotypes can be detected by phylogenetic methods and

comparison with closely related sequences from other databases.

Brazilians form one of the most heterogeneous populations in the

world, the result of interethnic crosses between Europeans, Africans and

Amerindians. The majority of the inhabitants of northeastern region are of

mixed ancestry (17).

The aim of this study is to analyse the sequence data of the two

hypervariable HV1 and HV2 regions from 167 unrelated individuals living

in Alagoas, to form a referencial forensic database for the northeastern

region of Brazil and understand the extent of the matrilineal genetic

59


contribution of Europeans, Africans, Amerindians, and Asians to the gene

pool of this population in present-day.

MMAATTEERRIIAALL AANNDD MMEETTHHOODDSS

Blood samples were obtained from 167 maternally unrelated individuals

living in Alagoas, northeastern of Brazil. DNA was extracted from 30 µl

blood using the chelex extraction procedure (18).

PCR amplification of two hypervariable segments of mtDNA control

region was performed using the primers described by Imaizumi et al.

(19). Each HV1 and HV2 segment was amplified in a 25 µl reaction

containing 25 ng of genomic DNA, 0.6 µM of HVI primers or 0.48 µM of

HVII primers, 1 x PCR buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.4 and 50 mM KCl),

0.2 mM of dNTPs, 1.5 mM MgCl2, 1.0 U Platinum Taq DNA polymerase

(Invitrogen, Brazil) and 5 µg BSA. The PCR amplification was carried out

using a TC-412 thermal cycler (Techne, NJ, USA) under the following

conditions for both regions: 95 ºC for 2 min, and then 32 cycles of at 94

ºC for 20 s, 56 ºC for 15 s, 72 ºC for 30 s, followed by a final extension at

72 ºC for 5 min. After PCR, 4 µl of products were separated by

electrophoresis on a 2% agarose gel for 20 min and were visualized by

ethidium bromide staining followed by UV transillumination.

Prior to sequencing, PCR products were isopropanol precipitated and

loaded on a 2% agarose gel. Template concentration was adjusted by

comparison with a Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, CA, USA). 10 ng of

products were sequenced by cycle sequencing using an ABI PRISMTM 310

Genetic Analyzer with BigDyeTM Terminator ver. 3.1 (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA). DNA sequences of the PCR amplicons were

determined from both forward and reverse sequence data using the

original primers. The sequences from position 16024 to 16365 in HV1 and

from 73 to 340 in HV2 were determined, since ambiguous

electropherograms for 20–30 nucleotides near the primers were frequently

observed.

60


Sequences were aligned and compared with the revised Cambridge

Reference Sequence (rCRS) (20) using the SeqScape software ver. 2.5

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The mtDNAs were classified

into the haplogroups based on the HV1/2 motifs of haplogroup-specific

sequences previously described (17;21-23). The HV1 motif searching and

haplogroup-directed comparison with closely related sequences from other

databases led us to tentatively assign each mtDNA to a haplogroup. To

further characterize the mtDNA lineage tested, we compared its HV2 motif

as well.

To evaluate if systematic artifacts could have produced ‘phantom’

mutations compromising the accuracy of our data set, we applied the

filtering process described by Bandelt et al. (2002) (24) for HV1 data. This

analysis filters out all speedy transitions and thus scores weighty

mutations only. Weight networks showing perfect star tree patterns are

expected when the data are potentially free of phantom mutations.

Suspicious sequences were resenquenced, following the guidelines of

Bandelt et al. (2001) (14).

The genetic diversity was calculated using the formula h = (1-∑x2)n/(n-

1), where ∑x2 is the sum of squares of haplotype frequencies and n is the

sample size (25). Estimates of genetic diversity, haplotype frequencies,

nucleotide diversity and pairwise differences were computed using the

program ARLEQUIN Version 2.000 (26). The probability of a random

match was calculated simply as p = ∑x2 according Stoneking et al. (27)

using Microsoft Excel (Microsoft Corporation, CA, USA). Individuals

exhibiting length heteroplasmy were omitted from statistical calculations.

RREESSUULLTTSS AANNDD DDIISSCCUUSSSSIIOONN

Length heteroplasmy in C-stretch regions was observed in the mtDNA

HV1 in variants carrying the T16189C polymorphism and was easily

identified because of the dramatic decrease in sequence quality that

occurs beyond the heteroplasmic region, due to template molecules that

61


are out of register (28). Heteroplasmy of HV1 was observed in 22%

(37/167) of the individuals. In HV2, the degree of length heteroplasmy is

known to be variable between individuals, making it difficult to determine

the total number of samples heteroplasmic for HV2 (29). However, we

estimated that HV2 length heteroplasmy was noticeably observed in 11%

(19/167) of the sample.

The remain 123 individuals were compared with rCRS. A total of 110

different haplotypes were found as determined by 128 variable positions

between nucleotide positions 16024 - 16365 and 73 - 340. The results are

displayed in Table 1, arranged according to their haplogroups. The genetic

diversity was estimated to be 0.997 and the probability of two random

individuals showing identical mtDNA haplotypes was 1.0% (Table 2).

A total of 13 haplotypes (11%) occurred in at least two individuals. The

most frequent haplotype in this study defined by 16111, 16223, 16290,

16319, 16362, 73, 146, 153, 235, 263, 309.1C, 315.1C (haplogroup A)

could be found in 5 individuals (4%) followed by 263, 315.1C (haplogroup

H) found in 3 individuals (2%). The seven haplotypes shared by 2

individuals (frequency of 1.6%) studied here belong to haplogroups C,

L1c, L3e1, H and U (Table 1). Single nucleotide polymorphism at

nucleotide positions 263, 315.1, 73, 16223 and 309.1 was amongst the

five highest frequencies in the population sample. In general, more than

95% of mtDNA were allocated to specific mtDNA haplogroups using HV1/2

motifs without extra information from coding region sequences.

The weight network displayed little reticulation (data not shown). The

doubtful transversions 16188G (AL28) and 16318C (AL92) were

resequenced and showed high quality values QV = 47 and QV = 48,

respectively. The suspicious sequences AL100, 101 and AL22, 23 were

resequenced and confirmed the transitions 16219 and 16184 in both

strands with high quality values QV = 39 and 41, respectively. The HV2

sequences with the substitutions 265 (AL36) and 272 (AL72), not

described in the Mitomap database, were resequenced confirming these

sites. The HV1/HV2 positions hit most frequently by artifacts according

62


Brandstätter et al. (30) were not found in our data with exception the site

16320, which has been checked in the electropherograms without

indications of ambiguous or weak basecall.

A comparison of the distribution of haplogroups in our population

with data published for Northeastern of Brazil (17) revealed some

differences, mainly in relation the European lineages. The values

associated to African, Native American and European ancestries for the

general Alagoas sample are 45%, 27% and 25%, while Alves-Silva et al.

(17) found 44%, 22% and 34%, respectively, in a white sample from the

Northeastern region. Approximately 3% of the haplotypes in our data

could not have been classified in haplogroups.

In conclusion, these results suggest that sequence polymorphism of

the mtDNA control region would be very useful in forensic practice to

confirm individual identification.

AACCKKNNOOWWLLEEDDGGEEMMEENNTTSS

We would like to thank Fábio Leite, Bianca Carvalho and Maria Cátira

Bortolini for providing haplogroup classification and phylogenetic analysis

information. We also would like to thank Luiz Henrique Caetano and

Beatriz Pimentel.

63


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Table 1. mtDNA haplotypes and their frequency in the Alagoas population.

Sample F Hp Variations in HV1 + 16000 Variations in HV2

AL01 1 A 111, 124, 223, 319 73, 146, 150, 152, 263, 315.1C

AL02 1 A 223, 290, 319, 362 73, 146, 152, 153, 235, 263, 315.1C

AL03 1 A 111, 172, 223, 290, 319, 362 73, 146, 153, 263, 309.1C, 315.1C

AL04 1 A 111, 126, 223, 259, 266, 290, 319, 327, 362 73, 146, 153, 235, 263, 315.1C

AL05 1 A 111, 126, 223, 259, 290, 319, 362 73, 146, 153, 235, 263, 315.1C

AL06 1 A 111, 209, 223, 290, 319, 362 73, 146, 153, 210, 235, 263, 309.1C, 315.1C

AL07 1 A 111, 192, 209, 223, 290, 319, 362 73, 143, 146, 152, 153, 235, 263, 309.1C, 315.1C

AL08 1 A 111, 223, 290, 319, 362 73, 146, 153, 185T, 235, 263, 315.1C

AL09 1 A 111, 223, 290, 291, 319, 362 73, 146, 153, 235, 236, 263, 309.1C, 309.2C, 315.1C

AL10 1 A 111, 223, 290, 291, 319, 362 73, 146, 153, 235, 236, 263, 309.1C, 315.1C

AL11 5 A 111, 223, 290, 319, 362 73, 146, 153, 235, 263, 309.1C, 315.1C

AL12 1 A 111, 188, 223, 290, 319, 362 73, 146, 153, 235, 263, 315.1C

AL13 1 B 182C, 183C, 186, 189, 217 73, 263, 315.1C

AL14 1 C 223, 292, 298, 325, 327, 362 73, 151, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL15 1 C 223, 292, 298, 325, 327, 362 73, 151, 152, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL16 1 C 223, 292, 298, 325, 327, 362 73, 249D, 263, 290D, 291D, 315.1C

AL17 2 C 126, 223, 270, 298, 325, 327 73, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL18 1 C 147, 223, 298, 325, 327 73, 249D, 263, 290D, 291D, 315.1C

AL19 1 C 051, 223, 298, 325, 327 73, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL20 1 C 051, 172, 223, 298, 325, 327 73, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL21 1 C 051, 223, 298, 311, 325, 327 73, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL22 2 C 051, 184, 223, 287, 298, 311, 325, 327 73, 146, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL23 1 C 051, 184, 223, 287, 298, 311, 325, 327 73, 146, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 315.1C

AL24 1 C 051, 184, 223, 287, 298, 311, 325, 327, 357 73, 146, 194, 249D, 263, 290D, 291D, 309.1C, 315.1C

AL25 1 D 223, 325, 362 73, 263, 315.1C

AL26 1 D 223, 278, 291, 325, 362 73, 195, 263, 315.1C

AL27 1 D 042, 145, 223, 325, 362 73, 195, 263, 315.1C

AL28 1 L1a 093, 129, 148, 168, 172, 187, 188G, 189, 223, 230, 278, 293, 311, 320

93, 95C, 152, 185, 189, 236, 247, 263, 315.1C

AL29 1 L1a 129, 148, 168, 172, 187, 188G, 189, 223, 230, 278, 293, 311, 320

93, 95C, 150, 185, 189, 236, 247, 263, 309.1C, 315.1C

AL30 1 L1b 126, 187, 189, 223, 264, 270, 278, 311 73, 152, 182, 185T, 195, 247, 263, 309.1C, 315.1C

AL31 1 L1b 126, 187, 189, 223, 264, 270, 278, 311 73, 152, 182, 185T, 195, 247, 263, 315.1C

AL32 1 L1b 126, 187, 189, 223, 264, 270, 278, 293, 311 73, 114, 152, 182, 185T, 189, 195, 247, 263, 315.1C

AL33 1 L1b 126, 187, 189, 223, 264, 270, 278, 293, 311 73, 152, 182, 185T, 195, 247, 263, 315.1C

AL34 2 L1c 093, 184, 187, 189, 223, 278, 294, 301, 311, 360

73, 94.1G, 152, 182, 186A, 189C, 195, 247 , 263, 297, 309.1C, 315.1C, 316

AL35 1 L1c 093, 129, 184, 187, 189, 223, 278, 294, 301, 311, 360

73, 94.1G, 152, 182, 186A, 189C, 195, 247, 263, 297, 309.1C, 315.1C, 316

AL36 1 L1c 129, 187, 189, 223, 278, 293, 294, 311, 360 73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 247, 263, 265, 315.1C, 316

AL37 1 L1c 129, 187, 189, 223, 278, 293, 294, 311, 360 73, 93, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 247, 248, 263, 309.1C, 315.1C, 316

AL38 1 L1c 093, 129, 187, 189, 223, 263, 278, 293, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 297, 315.1C 316

AL39 1 L1c 086, 129, 187, 189, 223, 241, 278, 293, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 297, 315.1C, 316

AL40 1 L1c 129, 187, 189, 270, 278, 293, 294, 311, 360 73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 247, 263, 297, 315.1C, 316

AL41 1 L1c 129, 187, 189, 223, 265C, 278, 286G, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 247, 263, 297, 315.1C, 316

AL42 1 L1c 129, 169, 187, 189, 223, 265C, 278, 286G, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 297, 309.1C, 315.1C, 316

68


Table 1. (continued) Sample F Hp Variations in HV1 + 16000 Variations in HV2

AL43 1 L1c 093, 129, 187, 189, 223, 265C, 278, 286G, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 264, 297, 315.1C, 316

AL44 1 L1c 129, 134, 145, 187, 189, 213, 223, 265T, 274, 278, 286G, 294, 311, 360

73, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 297, 315.1C, 316

AL45 1 L1c 071, 129, 145, 187, 189, 213, 223, 234, 265C, 278, 286G, 294, 304, 311, 360

73, 146, 151, 152, 182, 186A, 189C, 195, 198, 247, 263, 297, 309.1C, 315.1C, 316

AL46 1 L2a 037, 093, 223, 278, 294, 309, 357 73, 143, 146, 152, 195, 263, 315.1C

AL47 1 L2a 223, 278, 294, 309 73, 143, 146, 152, 195, 263, 315.1C

AL48 1 L2a 189, 192, 223, 245, 278, 294, 309 73, 143, 146, 152, 263, 309.1C, 315.1C

AL49 1 L2a 192, 223, 278, 294 73, 143, 146, 152, 195, 263, 309.1C, 315.1C

AL50 1 L2a 189, 192, 223, 278, 294, 309 73, 146, 152, 195, 263, 309.1C, 315.1C

AL51 1 L2a 071, 189, 192, 223, 278, 294, 309 73, 146, 152, 195, 263, 309.1C, 315.1C

AL52 1 L2a 126, 223, 278, 286, 294, 309 73, 146, 152, 195, 263, 315.1C

AL53 1 L2b 114A, 129, 213, 223, 278, 325, 355 73, 150, 152, 182, 195, 198, 204, 263, 309.1C, 315.1C

AL54 1 L2b 114A, 129, 213, 223, 278, 355, 362 73, 150, 152, 182, 195, 198, 204, 249D, 263, 315.1C

AL55 1 L2b 114A, 129, 213, 223, 278 73, 146, 150, 152, 182, 195, 198, 204, 207, 263, 309.1C, 309.2C, 315.1C

AL56 1 L2b 114A, 129, 213, 223, 278, 354 73, 146, 150, 152, 182, 195, 198, 204, 263, 309.1C, 315.1C

AL57 1 L2b 114A, 129, 213, 223, 274, 278 73, 146, 150, 152, 182, 183, 195, 198, 204, 263, 309.1C, 315.1C

AL58 1 L2c 223, 264, 278 73, 93, 146, 150, 152, 182, 195, 198, 263, 315.1C, 325

AL59 1 L2c 114, 223, 264, 278, 292, 362 73, 146, 150, 152, 182, 195, 198, 263, 309.1C, 315.1C, 325

AL60 1 L2c 223, 278 73, 89, 93, 146, 150, 182, 195, 198, 263, 315.1C, 325

AL61 2 L3e1 185, 223, 327 73, 150, 189, 200, 263, 309.1C, 315.1C

AL62 1 L3e1 185, 223, 311, 327 73, 150, 185, 189, 200, 263, 315.1C

AL63 1 L3e1 185, 189, 223, 311, 327 73, 150, 185, 189, 200, 263, 315.1C

AL64 1 L3e1 129, 185, 209, 223, 327 73, 150, 152, 189, 195, 200, 207, 263, 309.1C, 315.1C

AL65 1 L3e1 185, 209, 223, 327 73, 150, 152, 189, 195, 200, 207, 263, 309.1C, 315.1C

AL66 1 L3e1 223, 287, 311, 327 73, 150, 189, 200, 263, 309.1C, 315.1C

AL67 1 L3e1 186, 223, 327, 355 73, 150, 189, 200, 263, 309.1C, 315.1C

AL68 1 L3e1 223, 327 73, 150, 189, 200, 263, 315.1C

AL69 1 L3e1 223, 327 73, 150, 189, 200, 263, 309.1C, 315.1C

AL70 1 L3f 209, 223, 311 73, 150, 189, 200, 263, 315.1C

AL71 1 L3f 209, 218, 223, 256, 292, 311 73, 150, 189, 263, 315.1C

AL72 1 L3f 093, 129, 209, 223, 292, 295, 311 73, 189, 195, 200, 263, 272, 309.1C, 315.1C

AL73 1 L3f 129, 209, 223, 292, 295, 311 73, 189, 200, 263, 309.1C, 309.2C, 315.1C

AL74 1 L3f 129, 209, 223, 292, 295, 311 73, 189, 200, 263, 309.1C, 315.1C

AL75 1 L3e1 223, 325D, 327 73, 150, 185, 189, 263, 309.1C, 315.1C

AL76 1 L3e2 223, 258T, 320 73, 150, 189, 195, 263, 315.1C

AL77 1 L3e2 223, 320 73, 150, 195, 263, 315.1C

AL78 1 L3e2 223, 320 73, 150, 195, 198, 263, 309.1C, 315.1C

AL79 1 L3e2 223, 254, 320 73, 150, 195, 198, 263, 315.1C

AL80 1 L3e3 093, 223, 265T, 316 73, 150, 195, 263, 315.1C

AL81 1 H 362 239, 263, 309.1C, 315.1C

AL82 1 H 311, 362 239, 263, 309.1C, 315.1C

AL83 1 H 240 199, 263, 315.1C

AL84 2 H 152, 263, 315.1C

AL85 2 H 263, 309.1C, 315.1C

AL86 1 H 194, 263, 315.1C

AL87 3 H 263, 315.1C

69


Table 1. (continued) Sample F Hp Variations in HV1 + 16000 Variations in HV2

AL88 1 H 129 263, 315.1C

AL89 1 H 293 263, 309.1C, 315.1C

AL90 1 H 192 73, 263, 309.1C, 315.1C

AL91 1 T 126, 294, 296, 304 73, 195, 263, 309.1C, 315.1C

AL92 1 T 126, 294, 296, 304, 318C 263, 315.1C

AL93 1 T 126, 292, 294, 296 73, 146, 263, 309.1C, 315.1C

AL94 1 T 126, 163, 186, 189D, 294 73, 263, 309.1C, 315.1C

AL95 1 J 069, 126 73, 185, 188, 263, 295, 315.1C

AL96 1 J 069, 126, 193, 319, 360 73, 150, 152, 263, 295, 309.1C, 315.1C

AL97 2 U3 343, 356 73, 150, 263, 315.1C

AL98 1 U3 343 73, 150, 263, 309.1C, 315.1C

AL99 1 U5 167, 192, 270, 311, 318, 356 73, 150, 263, 309.1C, 315.1C

AL100 1 U6 172, 219, 235, 278, 355 73, 146, 263, 309.1C, 315.1C

AL101 1 U6 172, 184, 219, 234, 278 73, 199, 263, 309.1C, 315.1C

AL102 1 Pre V 187, 298, 311 150, 186, 263, 309.1C, 315.1C

AL103 1 V 124, 298, 319 263, 309.1C, 315.1C

AL104 1 V 298 263, 315.1C

AL105 1 W 223, 292 73, 189, 194, 199, 204, 207, 263, 315.1C

AL106 1 W 223, 292 73, 189, 194, 199, 204, 207, 263, 309.1C, 315.1C

AL107 1 ? 124, 223, 362 73, 152, 195, 263, 309.1C, 315.1C

AL108 1 ? 124, 223, 311 73, 152, 263, 309.1C, 315.1C

AL109 1 ? 124, 223, 256 73, 146, 152, 263, 309.1C, 315.1C

AL110 1 ? 129, 145, 176G, 223, 291 73, 152, 185, 188, 263, 315.1C

F: frequency; Hp: haplogroup; ?: haplotype not classified. Table 2. Genetic diversity and statistical parameters in a sample of 123

individuals from Alagoas.

HV1 HV2 HV1 + HV2

Nº of haplotypes 96 79 110

Nº of polymorphic sites 85 43 128

Transitions 77 37 114

Transversions 10 4 14

Insertions 0 4 4

Deletions 2 3 5

Genetic diversity 0.9920 ± 0.0032 0.9901 ± 0.0026 0.9973 ± 0.0017

Random Match Probability 0.016062 0.017913 0.010774

Nucleotide diversity 0.023806 ±

0.012313

0.025466 ±

0.013350

0.024617 ±

0.012267

Mean number of pairwise

differences

8.141810 ±

3.803394

6.926829 ±

3.279668

15.114754 ±

6.802707

70


55.. IINNFFOORRMMAAÇÇÕÕEESS CCOOMMPPLLEEMMEENNTTAARREESS

71


5.1. Detalhamento da metodologia utilizada

5.1.1. Amostra

A amostra foi composta de 167 indivíduos escolhidos ao acaso, não

aparentados e provenientes de várias localidades do Estado de Alagoas,

dos quais apenas 123 foram analisados devido à ausência de

heteroplasmia de comprimento (Fig. 1).

Figura 1. Mapa do Estado de Alagoas indicando os municípios de origem dos 123 indivíduos analisados.

Número de indivíduos correspondente de cada município:

Água Branca (2), Arapiraca (11), Atalaia (1), Boca da Mata (1), Campo

Alegre (1), Capela (1), Colônia de Leopoldina (2), Coruripe (4), Delmiro

Gouveia (7), Igreja Nova (3), Joaquim Gomes (1), Junqueiro (1), Lagoa

da Canoa (1), Maceió (34), Maragogi (1), Marechal Deodoro (5), Mata

Grande (1), Novo Lino (2), Palestina (1), Palmeira dos Índios (4), Pão de

Açúcar (1), Passo de Camaragibe (2), Penedo (7), Piaçabuçu (10), Pilar

72


(2), Piranhas (2), Pontal da Barra (1), Porto Calvo (1), Porto Real do

Colégio (2), Santa Luzia do Norte (1), São Brás (2), São José da Laje (2),

Satuba (1), Teotônio Vilela (3), Traipu (1) e Viçosa (1).

5.1.2. Extração e amplificação do DNA

Foram coletados 30 µl do sangue de cada indivíduo, por punção

digital, onde o DNA foi extraído pelo método que utiliza a resina Chelex

100 (Walsh et al. 1991).

O processo de amplificação foi realizado em reações de PCR com um

volume total de 25 µl. Os primers que foram utilizados nas reações são

apresentados na Tabela 1. A presença de produtos amplificados foi

verificada em gel de agarose 2%.

Tabela 1. Seqüências dos primers para amplificação dos fragmentos da HV1 e HV2 (Imaizumi et al. 2002).

HV1

1 - F15971: 5’ – TTA ACT CCA CCA TTA GCA CC –3’

2 - R16410: 5’ – GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC – 3’

HV2

5 - F15: 5’ – CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG – 3’

6 - R389: 5’ – CTG GTT AGG CTG GTG TTA GG – 3’

5.1.3. Purificação dos produtos de PCR

A reação de seqüenciamento foi precedida de purificação dos

produtos de PCR por precipitação com isopropanol a 65%. Neste protocolo

20 µl dos produtos da PCR são colocados em microtubo de 1,5 ml

contendo 72 µl de isopropanol a 65%. A mistura é agitada vigorosamente

e mantida à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida,

centrifuga-se o tubo por 20 minutos à 12000 g. O isopropanol é

73


descartado e o precipitado é ressuspenso em 250 µl de etanol a 60%.

Centrifuga-se o tubo por 5 minutos a 12000 g, descarta-se o álcool e

deixa-se o precipitado secar através de aquecimento em termobloco a

90°C por 1 minuto. O DNA é rehidratado com a adição de 25 µl de TE

(Tris-EDTA).

A purificação é necessária para retirar o excesso de primers e dNTPs

da reação. O excesso de primers da reação de amplificação compete por

sítios de ligação do DNA com primers e reagentes na reação de

seqüenciamento. Se mais de um primer estiver presente na reação,

múltiplas seqüências marcadas serão geradas, resultando em baixa

qualidade dos dados, já que os corantes fluorescentes (dye terminators)

são incorporados na extensão do produto depois do pareamento do primer

com o DNA. O excesso de dNTPs da reação de amplificação pode afetar o

balanço da reação de seqüenciamento (Applied Biosystems 2000).

5.1.4. Quantificação do DNA

A concentração do DNA foi ajustada em gel de agarose 2% por

comparação com o marcador de tamanho e peso molecular Low DNA Mass

Ladder (Invitrogen, CA, USA).

A quantificação do DNA é crítica para o sucesso das reações de

seqüenciamento, já que o excesso de DNA gera dados brutos com picos

fortes no começo da corrida que desaparecem rapidamente, enquanto que

pouca quantidade de DNA ou de primers reduz a intensidade do sinal e a

altura dos picos. Em alguns casos, o aumento do nível da perturbação

(ruído) não permite que os picos apareçam. A Tabela 2 mostra as

quantidades recomendadas de DNA para a reação de seqüenciamento

(Applied Biosystems 2000).

74


Tabela 2. Quantidades recomendadas de DNA para a reação de seqüenciamento.

Amostra Quantidade Produto de PCR – 100 a 200 pb 1 a 3 ng 200 a 500 pb 3 a 10 ng 500 a 1000 pb 5 a 20 ng 1000 a 2000 pb 10 a 40 ng > 2000 pb 40 a 100 ng

5.1.5. Reação de Seqüenciamento

A reação de seqüenciamento foi realizada com um volume total de

10 µl, utilizando-se 2 µl de BigDye™ Terminator v3.1 (Applied

Biosystems).

5.1.6. Purificação dos produtos da reação de seqüenciamento

A purificação dos produtos da reação de seqüenciamento foi

realizada através de precipitação com isopropanol a 65%, seguindo o

mesmo protocolo descrito anteriormente. Nesta purificação, o precipitado

é ressuspendido em 25 ul de formamida Hi-Di (Applied Biosystems). A

purificação deve ser realizada porque os corantes fluorescentes

não-incorporados podem afetar a qualidade do seqüenciamento,

particularmente em sistemas de capilares com injeção eletrocinética.

Quando os corantes fluorescentes não-incorporados não são removidos

completamente, os picos dos corantes podem obscurecer porções do

eletroferograma do seqüenciamento. Isto pode fazer com que o software

determine picos incorretos, particularmente afetando a habilidade de

determinar o pico nº 1 e o local do ponto inicial da análise (Applied

Biosystems 2002).

75


5.1.7. Análise dos Dados

A análise e o alinhamento dos dados foram feitos com a utilização

do software SeqScape (Applied Biosystems). Os cálculos estatísticos como

freqüência de haplótipos, diversidade genética, diversidade de

nucleotídeos e número de diferenças de pareamento foram realizados pelo

programa Arlequin ver 2.0 (Schneider et al. 2000). A probabilidade de

coincidência ao acaso foi calculada com o Microsoft Excel (Microsoft

Corporation, CA, USA).

Diversidade genética:

É definida como a probabilidade de dois indivíduos escolhidos ao acaso

apresentarem haplótipos diferentes. A diversidade genética é estimada

como

onde n é o tamanho amostral e pi é a freqüência haplotípica.

Número médio de diferenças de pareamento:

É o número médio de diferenças entre todos os pares de haplótipos na

amostra. É dado pela fórmula

onde

diverg

frequ

^
dij é uma estimativa do número de mutações que ocorreram desde a
ência dos haplótipos i e j; k é o número de haplótipos e pi é a

ência do haplótipo i.

76


Diversidade de nucleotídeos:

É a probabilidade de dois nucleotídeos escolhidos ao acaso serem

diferentes. É equivalente a diversidade genética ao nível de nucleotídeo. É

dada pela fórmula

onde L = locos.

Probabilidade de coincidência ao acaso:

É a probabilidade de dois indivíduos tomados ao acaso exibirem o mesmo

haplótipo. A probabilidade de coincidência ao acaso é estimada como

P = ∑Pi

2

onde pi é a freqüência haplotípica.

A classificação em haplogrupos foi feita através da comparação com

seqüências descritas na literatura contendo as mutações específicas de

cada haplogrupo (Allard et al. 2002; 2004; 2005; Alves-Silva et al. 2000).

A construção de árvores para detecção de mutações fantasmas foi

realizada pelo programa Network ver. 4.1 (http://www.fluxus-

engineering.com/sharenet.htm).

77


5.2. Resultados e discussão adicionais

A heteroplasmia de comprimento presente nas regiões de trechos

repetidos de Cs (Poli-C) foi observada na região HV1 do mtDNA em

variantes carregando o polimorfismo 16189C e foi facilmente identificada

pelo dramático decréscimo de qualidade que ocorre após a região de

heteroplasmia, devido às moléculas estarem desalinhadas entre si (Parson

et al. 1998). A Heteroplasmia em HV1 foi observada em 22% (37/167), o

que é consistente com os dados da literatura (Holland e Parsons 1999).

Em HV2 o grau da heteroplasmia de comprimento é conhecido como

sendo variável entre indivíduos, tornando difícil determinar o número total

de amostras heteroplásmicas para HV2 (Marchington et al. 1997). No

entanto, a heteroplasmia de comprimento em HV2 foi observada em 11%

(19/167) da amostra. No total, 44 amostras apresentaram heteroplasmia

de comprimento em HV1, HV2 ou em ambas. O presente estudo não levou

em consideração a heteroplasmia de ponto devido à dificuldade de

distingui-la entre o ruído de fundo das seqüências e artefatos do

seqüenciamento.

Das 123 seqüências analisadas, 96 seqüências foram únicas em HV1

e 79 em HV2. A região HV1 apresentou 87 substituições, sendo que

destas 77 são transições e 10 são transversões, além de duas deleções.

Na HV2 foi possível observar 41 substituições, constituídas de 37

transições e quatro transversões, em adição a três deleções e quatro

inserções. A maioria das mutações em ambas as regiões foram transições

(90%) o que está de acordo com os dados previamente publicados

(Aquadro 1983; Vigilant et al. 1991). A região HV1 apresentou uma

diversidade genética de 99,20%, mostrando-se mais polimórfica que a

região HV2, com diversidade de 99,01%. A diversidade genética de HV1 +

HV2 foi de 99,73%, sendo uma alta diversidade comparada a populações

de outros países e grupos étnicos (Tabela 3), provavelmente devido à

miscigenação de povos no Nordeste do Brasil (Salzano e Freire-Maia

1967; Mauricio-da-Silva et al. 2000). A probabilidade de dois indivíduos,

78


tomados ao acaso na população, apresentarem haplótipos de mtDNAs

idênticos é 0,01 (1%) para as duas regiões juntas, 0,016 (1,6%) para

HV1 e 0,018 (1,8%) para HV2.

A diversidade de nucleotídeos, que é equivalente a diversidade

genética ao nível de nucleotídeo, foi maior em HV2, cerca de 2,5%,

enquanto que em HV1 foi de 2,4%. Tal fato pode ser explicado pela

variabilidade de sítios na região poli-C de HV2. Ambas as regiões

mostraram uma diversidade de 2,5%, que é mais do que o dobro da

diversidade de nucleotídeos de Portugal, de 1,1% (Lima et al. 2004). O

número médio de diferenças entre as seqüências na população de Alagoas

foi de 15 (sendo 8,1 para HV1 e 6,9 para HV2) (tabela 4). Segundo

Budowle et al. (1999), o número médio de diferenças entre seqüências é

maior em banco de dados afro-americanos e em amostras africanas (14,1

e 13,1, respectivamente) e menos variável em grupos caucasianos, os

quais têm uma média de diferenças entre indivíduos que varia de 7,2 a

8,4.

O resultado da árvore filogenética gerada pelo programa Network

mostrou poucas reticulações (Fig. 2), indicando que os dados estão livres

de artefatos, os quais poderiam ser introduzidos na seqüência pelo

processo de seqüenciamento. O triângulo da esquerda aponta uma

ambigüidade no sítio 16188 aparecendo nas seqüências AL12 e AL28

como transição e transversão, respectivamente. O triângulo da direita

mostra incompatibilidade no sítio 16318, aparecendo como transição na

seqüência AL99 e transversão na seqüência AL92. O prisma abaixo aponta

incompatibilidade nas transições 16219 e 16184 nas seqüências AL22, 23,

100 e 101. As transversões apontadas como duvidosas, 16188G (AL28) e

16318C (AL92) foram reseqüenciadas e mostraram altos valores de

qualidade (QV = 47 e QV = 48, respectivamente). As seqüências tidas

como suspeitas AL100, 101 e AL22, 23 foram reseqüenciadas e

confirmaram as transições 16219 e 16184 em ambas as fitas com os

valores de qualidade QV = 39 e 41, respectivamente, considerados

excelentes. As seqüências de HV2 com as substituições 265 (AL36) e 272

79


(AL72), não descritas no banco de dados Mitomap, foram resequenciadas

confirmando esses sítios. As posições de HV1/HV2 que geralmente são as

mais afetadas por artefatos segundo Brandstätter et al. (2005) não foram

encontradas nos dados com exceção do sítio 16320, o qual foi verificado

nos eletroferogramas não apresentando indicações de ambigüidade ou de

sinal fraco na determinação da base.

A comparação da distribuição de haplogrupos na população de

Alagoas com dados publicados anteriormente para a região Nordeste do

Brasil revelou alguma diferenças, principalmente em relação às

matrilinhagens européias. Os valores associados às ancestralidades

africanas, nativo-americanas, e européias para a população de Alagoas

foram 45%, 27% e 25%, enquanto Alves-Silva et al. (2000) encontrou

44%, 22% e 34%, respectivamente. Tal diferença pode ser devida a uma

superestimação das linhagens caucasianas nos dados de Alves-Silva, já

que este trabalho foi realizado com uma amostra de apenas 50 indivíduos

classificados como brancos para toda a região Nordeste.

Aproximadamente 3% dos haplótipos do nosso trabalho não puderam ser

classificados em haplogrupos.

80


Figura 2. Árvore filogenética gerada pelo programa Network com os dados da população de Alagoas.

81


Tabela 3. Diversidade genética de várias populações e grupos étnicos ao redor do mundo.

População N Diversidade

genética (%) Referência

Alemanha 300 99 Poetsch et al. 2003

Rússia 103 96 Orekhov et al. 1999

Portugal 100 98 Lima et al. 2004

Bahia (Brasil) 100 99,8 Santos et al. 2004

Itália 83 99 Tagliabracci et al. 2001

Espanha 118 99 Crespillo et al. 2000

Afro-americanos 149 99,8

Hispânicos 99 99,3

Nativo-americanos 58 99,2

Japoneses 162 99,6

Budowle et al. 1999

Alagoas 123 99,7 Este estudo

Tabela 4. Diversidade genética e parâmetros estatísticos de 123 indivíduos da população de Alagoas.

HV1 HV2 HV1 + HV2

Nº de haplótipos 96 79 110

Nº de sítios polimórficos 85 43 128

Transições 77 37 114

Transversões 10 4 14

Inserções 0 4 4

Deleções 2 3 5

Diversidade genética 0,9920 ±

0,0032

0,9901 ±

0,0026

0,9973 ±

0,0017

Probabilidade de

coincidência ao acaso 0,016062 0,017913 0,010774

Diversidade de

nucleotídeos

0,023806 ±

0,012313

0,025466 ±

0,013350

0,024617 ±

0,012267

Número médio de

diferenças de pareamento

8,141810 ±

3,803394

6,926829 ±

3,279668

15,114754 ±

6,802707

82


5.3. Referências Citadas Allard MW, Polanskey D, Miller K, Wilson MR, Monson KL and Budowle B

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material. Biotechniques 10:506–513.

85


66.. CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS

Os segmentos HV1 e HV2 do DNA mitocondrial humano mostraram-se

muito variáveis na população de Alagoas, sendo a região HV1 mais

polimórfica que HV2.

A diversidade genética dos marcadores mitocondriais estudados na

população de Alagoas assemelha-se mais com a diversidade de

populações afro-americanas em geral do que com a de populações

européias.

O resultado da diversidade genética e dos parâmetros estatísticos

aplicados à análise dos haplótipos de mtDNA na amostra estudada

indicam que a região controle do mtDNA pode ser muito útil na prática

forense para identificação humana no Estado de Alagoas.

A distribuição das matrilinhagens mitocondriais em Alagoas mostrou

uma predominância de linhagens africanas, seguida de nativo-

americanas e européias, o que condiz com o modelo de formação do

povo brasileiro para a região Nordeste.

86


77.. AABBSSTTRRAACCTT

The analysis of human mitochondrial DNA (mtDNA) sequences has

become a useful tool in forensic genetics due to its special features like

haploid maternal inheritance, lack of recombination and high copy number

per cell. The objective of this work was to determine the polymorphism of

hypervariable regions 1 and 2 of the human mtDNA in the population of

Alagoas, Brazil. The sequence of the two hypervariable segments of the

mitochondrial DNA (mtDNA) control region was generated for 167

unrelated individuals from this population. Length heteroplasmy in the c-

stretch HV1/HV2 regions was observed in 22% (37/167) and 11%

(19/167) of the samples, respectively. Within the remain 123 samples, a

total of 110 different haplotypes were found as determined by 128

variable positions. The most frequent haplotype (16111, 16223, 16290,

16319, 16362, 73, 146, 153, 235, 263, 309.1C, 315.1C - haplogroup A)

was found in five individuals. One haplotype was shared by three

individuals and one haplotype was shared by two persons in seven

different times (frequency of 1.6%). The genetic diversity was estimated

to be 0.997 and the probability of two random individuals showing

identical mitochondrial DNA (mtDNA) haplotypes was 0.011. Based on the

results of mtDNA profiles, 45% of mtDNA sequences could be classified as

African, 27% as Native American and 25% as European haplogroups.

Approximately 3% of the haplotypes could not have been classified in

haplogroups. The genetic diversity in the HV1 and HV2 regions indicates

the importance of these loci for human identification within Alagoas.

KKEEYY WWOORRDDSS:: mtDNA, polymorphism, hypervariable regions, Alagoas.

87


88.. AANNEEXXOOSS

88


8.1. Anexo 1 IINNSSTTRRUUÇÇÕÕEESS PPAARRAA AAUUTTOORREESS

Revista GGEENNEETTIICCSS AANNDD MMOOLLEECCUULLAARR BBIIOOLLOOGGYY

ISSN 1415-4757 Ribeirão Preto, Brasil

89


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they have approved the submission of the manuscript and that the findings have not been published or are not under consideration for publication elsewhere;

b. Three copies of the manuscript and figures. c. Two copies of any unpublished or in-press

companion articles referred to in the submission.

d. A copy of the text, tables and figures on a disk. Be sure that the disk is adequately protected; if a disk arrives damaged, a new disk will be requested, causing delays in publication. Formats for text are Word or RTF, in Windows platform. Images in TIF or JPG formats should be sent in separate files (For Figures, see detailed instructions in 3.1.g). Disk must be labeled with the first author’s last name, platform and software. (See detailed instructions below). Failure to adhere to these guidelines can delay the handling of your contribution, and manuscripts may be returned before being reviewed.

3. Categories of Contribution:3.1.Research ArticlesManuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout, including the References Cited section, appendices, tables and legends; printed on one side only of A4 paper with 2.5 cm margins; marked with consecutive page numbers, beginning with the cover page. The following elements must start on a new page and be ordered as they are listed below:

a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors’ names (first name at full length); the authors’ institutional affiliation, including department, institution, and city, state or province, and country; different affiliations indicated with superscript numbers; a short running title of about 35 characters, including spaces; up to five key words; the corresponding author’s name, postal address, phone and fax numbers and email address. The corresponding author is the person responsible for checking the page proofs, and arranging for the payment of color illustrations and author alterations charges. b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and summarizes the main results and conclusions of the study. It should not contain references. c) The text: must be as succinct as possible. Text citations: articles should be referred to by authors’ surnames and date of publication; citations with two authors must include both names; in citations with three or more authors, name the first author and use “et al”. Only articles that are published or in press should be cited. In the case of personal communications or unpublished results, all contributors must be listed by initials and last name (“et al” should not be used). Numbers: In the text, numbers nine or less must be written out except as part of a date, a fraction or decimal, a percentage, or a unit of measurement. Use Arabic numerals for numbers larger than nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial Names: Latin names of genera, species and intraspecific taxa in the text must be printed in italics; names of orders and families should be in the Title. The text includes the following elements: Introduction – Description of the background that led to the study. Material (or Subjects) and Methods – Details relevant to the conduct of the study. Statistical methods should be explained at the end of this section. Results – Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on significance of results is appropriate but broader discussion should be part of the Discussion section. Discussion – The findings of the study should be placed in context of relevant published data. Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an exhaustive presentation. Some manuscripts may require different formats appropriate to their content. d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the discussion and includes references to grant support. e) The References Section: citations must be ordered alphabetically by the first author; only articles that are published or in press should be included; personal communications must be cited within the text; journal titles must be abbreviated according to Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi).

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Genetics and Molecular Biology Sample journal article citation: Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchosciara angelae at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386. Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic consideration on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Rev Bras Genet 1:103-120. Sample book citation Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações Brasileiras. Companhia Editora Nacional and EDUSP, São Paulo, 178 pp. Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of Species. 3rd edition. Columbia University Press, New York, 364 pp. Sample chapter-in-book citation: Carvalho A, Monaco LC and Krug CA (1966) Melhoramento genético das plantas e sua repercussão econômica. In: Pavan C and da Cunha AB (eds) Elementos de Genética. 2nd ed. EDUSP and Companhia Editora Nacional, São Paulo, pp 587-653. Sample abstracts in meeting citation: Basile R (1973) Cromossomos Politênicos em células nutritivas de ovócitos de ovário atrofiado de Rhyncosciara. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro, Brazil. Sample Thesis/Dissertation citation: Frota-Pessoa O (1953) Revision of the Tripunctata group of Drosophila with description of fifteen new species. PhD Thesis, Universidade do Brasil, Rio de Janeiro. f) Tables each table must start on a new page. A concise title should be provided above the table. Tables must be numbered consecutively in Arabic numerals. Each column must have a title in the box head. Footnotes, typed directly below the table, should be indicated in lowercase superscript numbers. g) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a separate sheet. Three sets of illustrations of the highest quality must be provided, one original and two copies in glossy paper. If you have created figures electronically, submit them also as hard copies. Scanned figures should not be submitted. Images should be in TIF or JPG format and provided in separate files. Figures in Word format cannot be published. Journal quality reproduction will require grayscale and color at resolution yielding 300 ppi. Authors should

submit bitmapped line art at resolution yielding 600–1200 ppi. These resolutions refer to the output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced, the resolutions should be adjusted accordingly. Identify each illustration by affixing on the back a label containing: the number of the figure, the name of the first author, and an arrow indicating top of illustration. Illustrations supplied on disks must follow instructions in item 2 (Submission package). Color illustration can be accepted, but authors are asked to defray the cost. For costs of color figures, check with the Editorial Office. h) Nomenclature: current standard international nomenclature should be adhered to. i) Sequences may appear in text or in figure. DNA must be sequenced on both strands. DNA, RNA , or protein sequences equal to or greater than 50 units must be entered into appropriate data bank and the accession number must be provided before publication of the article. Long sequences requiring more than two pages to reproduce will not be published unless the Editorial decision is that the publication is necessary. Complete mtDNA sequence will not be published. j) Data access: reference should be made to availability of detailed data and materials used for reported studies. k) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief statement that the work was approved by the institutional review board. For experiments involving human subjects, authors must also include a statement that informed consent was obtained from all subjects. If photos or any other identifiable data are included, a copy of the signed consent must accompany the manuscript. 3.2 Short Communications present brief observations that do not warrant full-length articles. They should not be considered preliminary communications. Their format is that of full-length article. The text must be kept to a minimum. 3.3 Letters to the Editor relate or respond to recent published items in the journal. Discussions of political, social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form. 3.4 Review Articles are welcome. 3.5 Book Reviews: publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related disciplines, for review in the journal. 3.6 History, Story and Memories: accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil. 4. Proofs: Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page proofs, apart from printer’s errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require Editorial approval.

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8.2. Anexo 2 IINNSSTTRRUUÇÇÕÕEESS PPAARRAA AAUUTTOORREESS

Revista JJOOUURRNNAALL OOFF FFOORREENNSSIICC SSCCIIEENNCCEESS

ISSN 0022-1198PA, U.S.A.

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INFORMATION FOR AUTHORS The Journal of Forensic Sciences publishes original material in the following categories: Paper --- full-length research report Technical Note --- description of a technical aspect of a field or issue, report on a procedure or method, or work on validation of techniques or methodologies. Usually shorter than papers. Brief Communication --- very brief technical communication, shorter than a typical Technical Note. Brief Communications should generally be no more than 4-5 manuscript pages, including references, figures and tables. Case Report --- usually brief description or analysis of an unusual case or a small series or cases Review --- full-length paper reviewing the state of the art or the published literature in a particular area of sufficiently broad interest to the readership Letter --- usually a discussion of a previously published item, or commentary on the Journal or an issue of interest to the Academy. Publication of letters is at the sole discretion of the Editor. Letters commenting on previously published items are ordinarily shared with the original authors to afford them an opportunity to respond to the commentary. Response to Letter --- usually author(s) response to a Letter commenting on their published work Editorial or Invited Commentary --- commentary, invited by the Editor Book Review --- review of a book or other publication of interest to the forensic sciences or closely related fields. Special Communication --- occasional communication of an editorial or newsworthy nature For the Record --- a summary of population genetic data published under the condition that the complete data set be available at a readily accessible world wide web site. Papers, technical notes, brief communications, case reports and reviews are subjected to full peer review. Previously published material is not acceptable. Material from previously published work must be quoted exactly and adequately referenced. Use of previously published figures, tables, etc., require the written permission of the copyright owner of the prior work. Manuscripts submitted as papers, technical notes, brief communications, case reports, or reviews, are accepted for consideration with the understanding that their essential contents, including text, tables and figures, have neither been previously published nor concurrently submitted to another journal. Work must not be submitted to another journal unless and until the Journal of Forensic Sciences formally declines to publish it. The above-discussed prohibitions do not apply to abstracts or summaries published in connection with professional meetings, or press reports resulting from formal or oral presentation. The Journal of Forensic Sciences reserves the right of first consideration for publication of any work accepted for presentation at an annual meeting of the American Academy of Forensic Sciences (AAFS), and authors must not submit their work elsewhere for a period of six months following the annual meeting at which the work was presented. If a manuscript has not been accepted for publication, or is not under active consideration by the Journal, at the end of the six-month period, the interest of the Journal in the manuscript automatically terminates. Upon acceptance for publication, manuscripts become the copyright property of the American Society for Testing and Materials (ASTM). Author(s) of manuscripts accepted for publication must complete a Paper Submittal Form that will be furnished by the Editor along with notification of full acceptance. This form must be signed by all authors, indicating complete understanding of the work and concurrence in it. Signature(s) of authors also serve to transfer copyright in the work to ASTM. It is understood that for certain work by employees of U.S. or foreign governments, whose manuscripts have been prepared as part of their official duties, copyright is not available in the United States. Acceptance of manuscripts submitted for publication is the responsibility of the Publications Committee of the AAFS, Editorial Board of the Journal of Forensic Sciences, and the editor, and occurs only after review of the manuscript in accordance with current operating rules. Review of submitted manuscripts may ordinarily be expected to be completed within 90 days. Authors, members of the Editorial Board, invited guest reviewers, the editor, and others involved in the publication process are expected to conform to established policies concerning confidentiality, conflicts of interest, release of accepted manuscripts prior to actual publication, and the protection of anonymity of patients and victims [J Forensic Sci 1995; 40 (3-6), 1996; 41(1-6), 1997; 42(1-6), 1998;43(1-6), and in selected issues thereafter; and see below]. The Journal requires that authors submitting manuscripts for peer review (papers, technical notes, case reports, brief communications) have obtained required approval(s) for submission from authorized principals and/or internal reviews in their laboratories and/or organizations. Submission of Manuscripts The Journal of Forensic Sciences requirements for manuscripts are generally in accordance with the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals. These requirements may be found published in

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one of the following: (1) J Forensic Sci 1995 Mar-Nov;40(2-6), 1996 41, 1997; 42, 1998;43 and selected issues thereafter; (2) JAMA 1993 May 5;269:2282-6; (3) N Engl J Med 1991 Feb 7;324(6):424-8; (4) Can Med Assoc J 1991;144(6):673-80; (5) BMJ 1991 Feb 9;302(6772):338-41; or (6) Med J Aust 1991;155(3):197-200. The following integrates the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals as they apply to the Journal of Forensic Sciences with the specific requirements of this journal. Manuscripts must be written in English. An original and three complete copies should be sent to: Dr. Michael A. Peat, Editor, Journal of Forensic Sciences, 6700 Woodlands Parkway, Suite 230-308, The Woodlands, TX 77381,USA. An original and three complete copies of all tables and figures (including photographs and line drawings) must be included. Type the manuscript double-spaced, including title page, abstract, text, acknowledgments, references, tables, and legends. Each manuscript component should begin on a new page, in the following sequence: title page, abstract and key words, text, acknowledgments, references, tables (each table complete with title and footnotes on a separate page), and legends for illustrations. Illustrations must be good-quality, unmounted glossy prints, usually 127 x 173 mm (5 x 7 in.), but no larger than 203 x 254 mm (8 x 10 in.). Submit an original and three complete copies of manuscripts and illustrations in a heavy-paper envelope. The submitted manuscript should be accompanied by a cover letter, as described below, and permissions to reproduce previously published material or to use illustrations that may identify human subjects. Authors should keep copies of everything submitted. Manuscript submissions should be accompanied by a cover letter specifying the name, full mailing address and telephone/fax numbers and e-mail of the person who will act as corresponding author, and the category (paper, technical note, etc.) under which the item is submitted. The editor reserves the right to publish the manuscript in a category different from the one specified by the author(s) at submission. The cover letter should also specify, if applicable, information about possible duplicate publication problems, financial or other relationships that could give rise to conflicts of interest, and any other information the editor may need to make an informed decision in accordance with established policies and practices. The manuscript must be accompanied by copies of any permissions to reproduce published material, to reproduce illustrations or report sensitive personal information about identifiable persons, or to name persons for their contributions. If color artwork is submitted, and if the authors believe color art is necessary to the presentation of their work, the cover letter should indicate that one or more authors or their institutions are prepared to pay the substantial costs associated with color art reproduction. Only the corresponding author need sign the cover letter. The corresponding author's signature on the submission cover letter signifies: a) that all required approvals and/or reviews have been obtained from authorized principals in the laboratory and/or organization in which the work was performed The cover letter can also explicitly state that such approvals have been obtained. The editor reserves the right to request explicit, written approval of authorized laboratory and/or organization principals before the work is accepted by the journal for peer review. and b) that all authors have read the manuscript, concur in its contents, are qualified for authorship by the criteria stated in these requirements, and believe the submission to represent honest work. The editor reserves the right to request explicit, written clarification of individual author’s roles, their concurrence in the manuscript content, or any other issue that must be resolved prior to accepting the manuscript for peer review. The Journal does not accept submissions of manuscripts from third parties without the explicit, written permission of the author(s). PRIOR AND DUPLICATE PUBLICATION As noted, this journal does not consider for publication a paper on work that has already been reported in a published paper or that is described in a paper submitted or accepted for publication elsewhere in print or in electronic media. This policy does not preclude consideration of a paper that has been rejected by another journal or of a complete report that follows publication of a preliminary report, usually in the form of an abstract. Nor does it prevent consideration of a paper that has been presented at a scientific meeting if not published in full in a proceedings or similar publication. Press reports of the meeting will not usually be considered as breaches of this rule, but such reports should not be amplified by additional data or copies of tables and illustrations. When submitting a paper, an author should always make a full statement to the editor about all submissions and previous reports might be regarded as prior or duplicate publication of the same or very similar work. Copies of such material should be included with the submitted paper to help the editor decide how to deal with the matter. Multiple publication-that is, the publication more than once of the same study, irrespective of whether the wording is the same-is rarely justified. Secondary publication in another language is one possible justification, providing the following conditions are met: (1) the editors of both journals concerned are fully informed; the editor concerned with secondary publication should have a photocopy, reprint, or manuscript of the primary version; (2) The priority of the primary publication is by a publication interval of at least 2 weeks; (3) The paper

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for secondary publication is written for a different group of readers and is not simply a translated version of the primary paper; an abbreviated version will often be sufficient; (4) The secondary version reflects faithfully the data and interpretations of the primary version; (5) A footnote on the title page of the secondary version informs readers, peers, and documenting agencies that the paper was edited, and is being published, for a national audience in parallel with a primary version based on the same data and interpretations. A suitable footnote might read as follows: "This article is based on a study first reported in the [title of journal, with full reference]." Multiple publication other than as defined above is unacceptable. If authors violate this rule, they may expect appropriate editorial action to be taken. PREPARATION OF MANUSCRIPT Type or print out the manuscript on white bond paper, 216 x 279 mm (8 1/2 X 11 in.), or ISO A4 (212 X 297 mm), with margins of at least 25 mm (1 in.). Type or print on only one side of the paper. Use double-spacing throughout, including title page, abstract, text, acknowledgments, references, individual tables, and legends. Number pages consecutively, beginning with the title page. Put the page number in the upper right-hand corner of each page. Title Page The title page should carry: (a) the title of the article, which should be concise but informative; (b) first name, middle initial, and last name of each author, with highest academic degree(s); (c) institutional affiliation, name of department(s) and/or institution(s) to which the work should be attributed; (d) official disclaimers, if any; (e) name and address of author responsible for correspondence about the manuscript; (f) source(s) of support in the form of grants, equipment, drugs, or all of these; (g) a statement of where the work has been presented orally or in poster form at professional meetings; and (h) a short running header of no more than 40 characters (count letters and spaces) placed near the bottom of the title page and identified. Institutional affiliations of authors should be numbered footnotes to the individual’s name and highest academic degree. If an author’s present address differs from the institution in which the work was done, and is attributed, indicate a “Present address” for that author. A footnote to the title of the manuscript (generally designated by a superscript *) should give statements about where the work has been presented at professional meetings, and should identify any sources of support. Authorship All persons designated as authors should qualify for authorship. The order of authorship should be a joint decision of the coauthors. Each author should have participated sufficiently in the work to take public responsibility for the content. Authorship credit should be based only on substantial contributions to a) conception and design, or analysis interpretation of data; and to b) drafting the article or revising it critically for important intellectual content; and on c) final approval of the version to be published. Conditions a), b), and c) must all be met. Participation solely in the acquisition of funding or the collection of data does not justify authorship. General supervision of the research group is not sufficient for authorship. Any part of an article critical to its main conclusions must be the responsibility of at least one author. Editors may require authors to justify the assignment of authorship. Increasingly, multi-center trials or work are attributed to a corporate author. All members of the group who are named as authors, either in the authorship position below the title or in a footnote, should fully meet the criteria for authorship as defined in the Uniform Requirements. Group members who do not meet these criteria should be listed, with their permission, under Acknowledgments or in an appendix (see Acknowledgments). Abstract and Key Words The second page should carry an abstract of no more than 150 words. This journal uses unstructured abstracts. The abstract should briefly state the purposes of the study or investigation, basic procedures (selection of study subjects or laboratory animals; observational and analytical methods), main findings (give specific data and their statistical significance, if possible), and the principal conclusions. Emphasize new and important aspects of the study or observations. Below the abstract provide, and identify as such, 3 to 10 key words or short phrases that will assist indexers in cross-indexing the article and may be published with the abstract. Use terms from the medical subject headings (MeSH) list of Index Medicus; if suitable MeSH terms are not yet available for recently introduced terms, present terms may be used. The first key word is forensic science; the second and subsequent words should assist abstracters in properly categorizing the work so that it will be found in journal article data bases by interested researchers. Frequently, the second key word represents a subfield of forensic science, e.g. forensic anthropology, forensic pathology, or DNA typing. In manuscripts on DNA typing, every locus involved in the study should be listed as a separate key word. Do not use abbreviations for key words, e.g., polymerase chain reaction, not PCR; gas chromatography-mass spectrometry, not GC-MS.

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Text The text of observational and experimental articles is usually-but not necessarily-divided into sections with headings. This journal does not use an “Introduction” heading. The introductory text begins on the first text page. Other typical headings include Methods (or Materials and Methods), Results, and Discussion. Long articles may need subheadings within the sections to clarify their content, especially the Results and Discussion sections. Other types of articles such as case reports or reviews are likely to need different headings and subheadings. Generally, avoid overuse of subheadings, especially in the Methods section. Introduction In this journal, the text component of the manuscript begins with an introduction, but we do not use the “Introduction” heading. State the purpose of the article. Summarize the rationale for the study or observation. Give only strictly pertinent references, and do not review referenced articles extensively. Do not include data or conclusions from the work being reported. Methods Describe your selection of the observational or experimental subjects (patients or laboratory animals, including controls) clearly. Identify the methods, apparatus (manufacturer's name and address in parentheses), and procedures in sufficient detail to allow other workers to reproduce the results. Give references to established methods, including statistical methods (see below); provide references and brief descriptions for methods, that have been published but are not well known; describe new or substantially modified methods, give reasons for using them, and evaluate their limitations. Identify precisely all drugs and chemicals used, including generic name(s), dose(s), and route(s) of administration. Generally avoid the overuse of subheadings in the Methods section. Describe the methods and materials in narrative style, not in the style of a laboratory procedure handout. Ethics When reporting experiments on human subjects, indicate whether the procedures followed were in accordance with the ethical standards of the responsible committee on human experimentation (institutional or regional) or with the Helsinki Declaration of 1975, as revised in 1983. Do not use patient's names, initials, or hospital numbers, especially in illustrative material. When reporting experiments on animals, indicate whether the institution's or the National Research Council's guide for, or any national law on, the care and use of laboratory animals was followed. Statistics Describe statistical methods with enough detail to enable a knowledgeable reader with access to the original data to verify the reported results. When possible, quantify findings and present them with appropriate indicators of measurement error or uncertainty (such as confidence intervals). Avoid sole reliance on statistical hypothesis testing, such as the use of P values, which fails to convey important quantitative information. Discuss eligibility of experimental subjects. Give details about randomization. Describe the methods for and success of any blinding of observations. Report treatment complications. Give numbers of observations. Report losses to observation (such as dropouts from a clinical trial). References for study design and statistical methods should be to standard works (with pages stated) when possible rather than to papers in which the designs or methods were originally reported. Specify any general-use computer programs used. Put a general description of methods in the Methods section. When data are summarized in the Results section, specify the statistical methods used to analyze them. Restrict tables and figures to those needed to explain the argument of the paper and to assess its support. Use graphs as an alternative to tables with many entries; do not duplicate data in graphs and tables. Avoid non-technical uses of technical terms in statistics, such as "random" (which implies a randomizing device), "normal," "significant," "correlations," and "sample." Define statistical terms, abbreviations, and most symbols. Results Present your results in logical sequence in the text, tables, and illustrations. Do not repeat in the text all the data in the tables or illustrations; emphasize or summarize only important observations. Discussion Emphasize the new and important aspects of the study and the conclusions that follow from them. Do not repeat in detail data or other material given in the Introduction or the Results section. Include in the Discussion section the implications of the findings and their limitations, including implications for future research. Relate the observations to other relevant studies. Link the conclusions with the goals of the study but avoid unqualified statements and conclusions not completely supported by your data. Avoid claiming priority and alluding to work that has not been completed. State new hypotheses when warranted, but clearly label them as such. Recommendations, when appropriate, may be included. In shorter manuscripts, such as those intended to be Technical Notes or Brief Communications, the Results and Discussion sections should be combined.

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Acknowledgments The Acknowledgements section immediately precedes the Reference list. Here, specify contributions that need acknowledging but do not justify authorship, such as general support by a department chair or acknowledgments of technical help. Persons who have contributed intellectually to the paper but whose contributions do not justify authorship may be named and their function or contribution described---for example, "scientific adviser," "critical review of study proposal," "data collection," or "participation in clinical trial." Such persons must have given their permission to be named. Authors are responsible for obtaining written permission from persons acknowledged by name, because readers may infer their endorsement of the data and conclusions. Technical help should be acknowledged in a paragraph separate from those acknowledging other contributions. Acknowledgements of financial support should appear as footnotes to the title of the paper on the Title Page. References The heading of the reference list should be "References," and it should contain only published or in-press references cited by number in the test. Published abstracts (duly noted as being abstracts), printed manufacturers' protocols or instructions, and world wide web site URLs may be validly cited as references. Personal communications and submitted manuscripts are not valid references. Personal communications should be cited in the text, in parentheses, at the appropriate location. Number references consecutively in the order in which they are first mentioned in the text. Identify references in tables, and legends by Arabic numerals. References cited only in tables or legends should be numbered in accordance with a sequence established by the first identification in the text of the particular table or figure. Within the text, tables, or figures, cite references by Arabic numeral in parentheses. Within the reference list, number the references 1., 2., 3., etc. References in the reference list should be in accord with Uniform Requirements … style of the examples given below. This style is based with slight modifications on the formats used by the U.S. National Library of Medicine in Index Medicus. The titles of journals should be abbreviated according to the style used in Index Medicus. Consult List of Journals Indexed in Index Medicus, published annually as a separate publication by the library and as a list in the January issue of Index Medicus. The references must be verified by the author(s) against the original documents. Examples of correct forms of references are given below. Articles in Journals 1) Standard journal article (List all authors, but if the number exceeds six, give six followed by et al.) You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980 Aug;79(2):311-4. As an option, if a journal carries continuous pagination throughout a volume, the month and issue number may be omitted. You CH, Lee KY, Chey RY, Menguy R. Electrogastrographic study of patients with unexplained nausea, bloating and vomiting. Gastroenterology 1980;79:311-4. Goate AM, Haynes AR, Owen MJ, Farrall M, James LA, Lai LY et al. Predisposing locus for Alzheimer's disease on chromosome 21. Lancet 1989;1:352-5. 2) Organization as author The Royal Marsden Hospital Bone-Marrow Transplantation Team. Failure of syngeneic bone-marrow graft without preconditioning in post-hepatitis marrow aplasia. Lancet 1977;2:742-4. 3) No author given Coffee drinking and cancer of the pancreas [editorial]. BMJ 1981;283:628. 4) Article not in English Massone L, Borghi S, Pestarino A, Piccini R, Gambini G. Localisations palmaires purpuriques de la dermatite herpetiforme. Ann Dermatol Venereol 1987;114:1545-7. 5) Volume with supplement Magni F, Rossoni G, Berti F. BN-52021 protects guinea-pig from heart anaphylaxis. Pharmacol Res Commun 1988;20 Suppl 5:75-8. 6) Issue with supplement Gardos G, Cole JO, Haskell D, Marby D, Paine SS, Moore R. The natural history of tardive dyskinesia. J Clin Psychopharmacol 1988;8(4 Suppl):31S-37S. 7) Volume with part Hanly C. Metaphysics and innateness: a psychoanalytic perspective. Int J Psychoanal 1988;69(Pt 3):389-99. 8) Issue with part Edwards L, Meyskens F, Levine N. Effect of oral isotretinoin on dysplastic nevi. J Am Acad Dermatol 1989;20(2 Pt 1):257-60.

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9) Issue with no volume Baumeister AA. Origins and control of stereotyped movements. Monogr Am Assoc Ment Defic 1978;(3):353-84. 10) No issue or volume Danoek K. Skiing in and through the history of medicine. Nord Medicinhist Arsb 1982;86-100. 11) Pagination in roman numerals Ronne Y. Ansvarsfallen Blodtransfusion till fel patient. Vardfacket 1989;13:XXXVI-XXVII. 12) Type of article indicated as needed Spargo PM, Manners JM. DDAVP and open heart surgery [letter]. Anaesthesia 1989;44:363-4. 13) Article containing retraction Shishido A. Retraction notice. Effect of platinum compounds on murine lymphocyte mitogenesis [Retraction of Alsabti EA, Ghalib ON, Salem MN. In: Jpn J Med Sci Biol 1979;32:53-65]. Jpn J Med Sci Biol 1980;33:235-7. 14) Article retracted Alsabti EA, Ghalib ON, Sale MN. Effect of platinum compounds on murine lymphocyte mitogenesis [Retracted by Shishido A. In: Jpn J Med Sci Biol 1980;33:235-7]. Jpn J Med Sci Biol 1979;32:53-65. 15) Article containing comment Piccoli A, Bossatti A. Early steroid therapy in IgA neuropathy: still an open question [comment] Nephron 1989;51:289-91. Comment on: Nephron 1988;48:12-7. 16) Article commented on Kobayashi Y, Fujii K, Hiki Y, Tateno S, Kurokawa A, Kamiyama M. Steroid therapy in IgA neuropathy: a retrospective study in heavy proteinuric cases [see comments]. Nephron 1988;48:12-7. Comment in: Nephron 1989;51:289-91. 17) Article with published erratum Schofield A. The CAGE questionnaire and psychological health [published erratum appears in Br J Addict 1989;84:701]. Br J Addict 1988;83;761-4. Books and Other Monographs 18) Personal author(s) Colson JH, Armour WJ. Sports injuries and their treatment. 2nd rev. ed. London: S. Paul, 1986 19) Editor(s), compiler as author Diener HC, Wilkinson M, editors. Drug-induced headache. New York: Springer-Verlag, 1988 20) Organization as author and publisher Virginia Law Foundation. The medical and legal implications of AIDS. Charlottesville: The Foundation, 1987. 21) Chapters in a book Weinstein L, Swartz MN. Pathologic properties of invading microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA, editors. Pathologic physiology: mechanisms of disease. Philadelphia: Saunders, 1974;457-72. 22) Conference proceedings Vivian VL, editor. Child abuse and neglect: a medical community response. Proceedings of the First AMA National Conference on Child Abuse and Neglect; 1984 Mar 30-31; Chicago. Chicago: American Medical Association, 1985. 23) Conference paper Harley NH. Comparing radon daughter dosimetric and risk models. In: Gammage RB, Kaye SV, editors. Indoor air and human health. Proceedings of the Seventh Life Sciences Symposium; 1984 Oct 29-31; Knoxville (TN). Chelsea (Ml): Lewis, 1985;69-78. 24) Scientific or technical report Akutsu T. Total heart replacement device. Bethesda (MD): National Institutes of Health, National Heart and Lung Institute; 1974 Apr. Report No.: NIH-NHLI-691 218514. 25) Dissertation Youssef NM. School adjustment of children with congenital heart disease [dissertation]. Pittsburgh (PA): Univ. of Pittsburgh, 1988. 26) Patent Harred JF, Knight AR, McIntyre JS, inventors. Dow Chemical Company, assignee. Epoxidation process. US patent 3,654,317. 972 Apr 4. Other Published Material 27) Newspaper article Rensberger B, Specter B. CFCs may be destroyed by natural process. The Washington Post 1989 Aug 7; Sect. A:2 (col. 5). 28) Audiovisual AIDS epidemic: the physician's role [videorecording]. Cleveland (OH): Academy of Medicine of Cleveland, 1987.

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29) Computer file Renal system [computer program]. MS-DOS version. Edwardsville (KS): MediSim, 1988. 30) World Wide Web address or URL http://www.uocf.edu/pharmacy/depts/drugdose/barbitutuates/index.html 31) Legal material Toxic Substances Control Act: Hearing on S. 776 Before the Subcomm. on the Environment of the Senate Comm. on Commerce. 94th Cong., 1st Sess. 343 (1975). 32) Map Scotland [topographic map]. Washington: National Geographic Society (US), 1981. 33) Book of the Bible Ruth 3:1-18. The Holy Bible. Authorized King James version. New York: Oxford Univ. Press, 1972. 34) Dictionary and similar references Ectasia. Dorland's illustrated medical dictionary. 27th ed. Philadelphia: Saunders, 1988;527. 35) Classical material The Winter's Tale: act 5, scene 1, lines 13-16. The complete works of William Shakespeare. London: Rex, 1973. Unpublished Material 36) In press Lillywhite HD, Donald JA. Pulmonary blood flow regulation aquatic snake. Science. In press. Additional Information and Reprint Requests A section of the manuscript, immediately following the reference list, entitled Addition information and reprint requests:, should include the full name, title, and mailing address of the corresponding author. If reprints will not be available from the author(s), entitle this section: Additional Information - Reprints Not Available from Author. Tables Type or print out each table double-spaced on a separate sheet. Do not submit tables as photographs. Number tables with Arabic numerals consecutively in the order of their first citation in the text and supply a brief title for each. Give each column a short or abbreviated heading. Place explanatory matter in footnotes, not in the heading. Explain in footnotes all nonstandard abbreviations that are used in each table. For footnotes use the following symbols, in this sequence: *,†,‡,§,((,¶,**,††,‡‡. Identify statistical measures of variations such as standard deviation and standard error of the mean. Do not use internal horizontal and vertical rules. Be sure each table is cited in the text. If you use data from another published or unpublished source, obtain permission and acknowledge fully. The use of too many tables in relation to the length of the text may produce difficulties in the layout of pages. The editor, upon accepting a paper, may recommend or even require as a condition of acceptance, that additional tables containing important backup data too extensive to publish be deposited with an archival service, such as the National Auxiliary Publication Service in the United States, or be made available by the authors, or be available at a web site. In that event an appropriate statement will be added to the text. Submit such tables for consideration with the paper. Illustrations (Figures) Submit an original and three complete sets of figures. Figures should be professionally drawn and photographed; freehand or typewritten lettering is unacceptable. Instead of original drawings, roentgenograms, and other material, send sharp, glossy, black-and-white photographic prints, usually 127 x 173 mm (5 x 7 in.), but no larger than 203 x 254 mm (8 x 10 in.). Letters, numbers, and symbols should be clear and even throughout, and of sufficient size that when reduced for publication each item will still be legible. Xerox copies of photographs and dot-matrix printer generated figures (including spectra, chromatograms, etc.) are not acceptable. Titles and detailed explanations belong in the legends for illustrations, not on the illustrations themselves. Each figure should have a label pasted on its back indicating the number of the figure, author's name, and top of the figure. Do not write on the back of figures or scratch or mar them by using paper clips. Do not bend figures or mount them on cardboard. Photomicrographs must have internal scale markers. Symbols, arrows, or letters used in the photomicrographs should contrast with the background. If photographs of persons are used, either the subjects must not be identifiable or their pictures must be accompanied by written permission to use the photograph. Figures should be numbered consecutively (in Arabic numerals) according to the order in which they have been first cited in the text. If a figure has been published, acknowledge the original source and submit written permission from the copyright holder to reproduce the material. Permission is required irrespective of authorship or publisher, except for documents in the public domain. This journal does not routinely publish color photographs or other color artwork. If a color photograph (or other color artwork) is considered absolutely essential to the published presentation of the work, authors must be prepared to pay the substantial costs associated with color art reproduction and printing. The editor can provide authors with estimates of these costs in advance upon request.

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As a general rule, the editor will keep original figures and photographs in the manuscript file during revision(s). Artwork is typically sent back to authors only if it requires modification. If figures are added or deleted during the review / revision cycle(s), authors should clearly indicate to the editor what changes were made, and any changes to the figure numbering scheme. It is never a good idea to supply the editor with only one publication-quality set of figures and/or photographs. There is always a chance that these items can be lost in the mail. Legends for Illustrations Type or print out legends for illustrations double-spaced, starting on a separate page, with Arabic numerals corresponding to the illustrations. When symbols, arrows, numbers, or letters are used to identify parts of the illustrations, identify and explain each one clearly in the legend. Explain the internal scale and identify the method of staining in photomicrographs. UNITS OF MEASUREMENT Measurements of length, height, weight, and volume should be reported in metric units (meter, kilogram, or liter or their decimal multiples. Temperatures should be given in degrees Celsius. Blood pressures should be given in millimeters of mercury. All hematologic and clinical chemistry measurements should be reported in the metric system in terms of the International System of Units (SI). In some types of manuscripts (e.g. engineering), the use of non-metric units is permitted if they are the norm in that field or professional area. ABBREVIATIONS AND SYMBOLS Terms and nomenclature in all disciplines should be in accordance with the current standards and lists approved or adopted by appropriate national or international committees or organizations, such as the International Anatomical Nomenclature Committee, I.U.P.A.C., I.U.B., the Enzyme Commission, the Committee on International Standardization of Gene Nomenclature (ISGN), etc. Use only standard abbreviations. Generally, avoid abbreviations in the title, abstract and key words. The full term for which an abbreviation stands should precede its first use in text unless it is a standard unit of measurement. Liter(s) is abbreviated L, not l. Micro should be abbreviated with (, not u. LETTERS TO THE EDITOR Submit Letters to the Editor in three copies. Letters concerning a previously published item should be entitled "Commentary On ... full title of published item ... J Forensic Sci ... citation ..." The citation should follow Uniform Requirements … style. Letters concerning other matters should begin with a brief descriptive title. The salutation "Sir:" should follow the title and precede the body of the letter. Responses to Letters should be entitled “Author’s Response.” The salutation "Sir:" should follow the title and precede the body of the letter. The name(s) and affiliation(s) of the writer(s) should appear at the end of Letters and Replies. SUBMISSION OF MANUSCRIPT COPY ON DISKETTE Do not submit manuscripts on diskettes initially. At a subsequent stage of the editorial and peer-review process, or following final acceptance, corresponding authors will be instructed to supply a disk (at their option) to the journal editor or to the ASTM editor. Manuscripts on disk are helpful to the copy editors, and we encourage authors to submit them at the appropriate time. The electronic version of the manuscript must correspond exactly with the finally accepted version of the paper manuscript. Diskette versions of Letters, Replies, or other items that are unlikely to require changes, may be submitted with the initial hard copy. REPRINTS Authors will have the opportunity to order reprints of their published work directly from ASTM, the publisher, after notification of full acceptance. The order form is generally included with the final page proofs that are sent to authors for approval prior to actual publication. Corresponding authors should attend to this matter during the publication process if they want reprints. It is generally difficult to supply reprints at a later time. POLICIES OF THE JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES Confidentiality (adapted from the ICMJE Statement on Confidentiality) Manuscripts should be reviewed with due respect for authors' confidentiality. In submitting their manuscripts for review, authors entrust editors with the results of their scientific labor and creative effort, upon which their reputation and career may depend. Authors' rights may be violated by disclosure or by revelation of the confidential details of the review of their manuscript. Reviewers also have rights to confidentiality, which must be respected by the editor. Confidentiality may have to be breached if there are allegations of fraud or dishonesty but otherwise must be honored. The editor should not disclose information about manuscripts, including their receipt, their content, their status in the review process, their criticism by reviewers, or their ultimate fate. Such information should be provided only to authors themselves and reviewers. The editor makes clear to reviewers that manuscripts sent for review are privileged communications and are the private property of the authors. Therefore, reviewers and other people involved in the editorial process should respect the authors' rights by not publicly discussing the authors' work or appropriating their ideas before the manuscript is published. Reviewers are not allowed to make copies of the manuscript for their files and are

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prohibited from sharing it with others, except with the permission of the editor. The editor will not keep copies of rejected manuscripts. Reviewers’ identities are confidential, and will not be revealed to authors or to anyone else. Reviewers' comments may be shared with other reviewers of the same manuscript. Conflicts of Interest (adapted from the ICMJE Statement on Conflict of Interest) A conflict of interest for a given manuscript exists when a participant in the peer-review and publication process--author, reviewer, or editor--has ties to activities that could inappropriately influence his/her judgment, whether or not judgment is in fact affected. Financial relationships with industry (such as employment, consultancies, stock ownership, honoraria or expert testimony), either directly or through immediate family, are generally considered the most important conflicts of interest. However, conflicts can occur for other reasons, such as personal relationships, academic or research competition, and intellectual passion. Public trust in the peer-review process and the credibility of published work depend in part on how well conflict of interest is handled during writing, peer review, and editorial decision making. Bias can often be identified and eliminated by careful attention to the scientific methods and conclusions of the work. Financial relationships and their effects are less easily detected than other types of conflicts of interest. Participants in peer review should disclose their conflicting interests, and the information should be made available so that others can judge their effects for themselves. Authors are responsible for recognizing and disclosing financial or other conflicts of interest that might bias their work when they submit a manuscript or letter. They should acknowledge in the manuscript all financial support for the work and other financial or personal connections to the work. Submission of manuscripts or commentary primarily for the purpose of bolstering an author’s position as an expert witness in legal proceedings is not acceptable. Reviewers should disclose to the editor any conflicts of interest that could bias their opinions of the manuscript, and they should disqualify themselves from specific manuscripts if they believe it to appropriate. The editor must be made aware of conflicts of interest to interpret the reviews and judge whether the reviewer should be disqualified. Reviewers must not use knowledge of the work gained during the review process, before publication of the work, to further their own interests. The editor should have no personal financial involvement in any of the issues that he/she may be called upon to judge. Published manuscripts and letters should include a description of all financial support and any conflict of interest that, in the editor's judgment, readers should know about. Protection of the Anonymity of Patients / Victims Detailed descriptions or photographs of individual patients or victims are sometimes central to documentation in a published item. Every effort must be made to protect the anonymity of such patients or victims and their families. Masking of the eyes in photographs may not be adequate protection. Changing data about a patient or victim is never an acceptable method of protecting anonymity. It is recognized that cases or situations forming the basis of items submitted to the Journal may be matters of public record as a result of public court proceedings, news reports, etc. For purposes of publication in the journal, however, emphasis should be placed on medical and/or scientific aspects and information that should form the basis for publication. No information that might violate the privacy of people should be included unless it can be justified as absolutely necessary to the medical and/or scientific presentation. Release of Full Text of Accepted Manuscripts Prior to Publication Requests for the release of accepted papers, technical notes, brief communications, or case reports prior to their actual publication are occasionally made by the media or by attorneys involved in courtroom proceedings. The full release of accepted, but as yet unpublished, peer-reviewed items by authors is not permitted, except by permission of the editor and the publisher. "Full release" means a complete copy of the manuscript, or any other type of reproduction of the complete work including all data. This prohibition does not, and is not intended to, apply to short summaries (even in the form or brief news releases), or brief abstracts for or from meeting presentations. Requests for the pre-publication release of accepted items will be carefully considered, and generally honored for legitimate reasons in accordance with the procedure specified below. Authors must obtain the permission of the editor and of ASTM, and must provide the editor with a legitimate reason for early release. Requests should be made in writing to the editor, and provide the reasons for the request. If the approvals of the editor and of ASTM are forthcoming, ASTM will produce, for a one-time fee (approximately the same as the cost of reprints), the copies that are to be released. Because many manuscripts go through several iterations of modification, correction, and revision, this procedure helps insure that the actually accepted version of the work, as it will appear in print, is released.

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