Marcadores de DNA são derivados de pequenas regiões do DNA que apresentam polimorfismo

entre indivíduo dentro de uma espécie.

Categoria de marcadores (Andersen e Lubberstedt, 2003 apud

Marcadores aleatórios (RDM –Radon DNA marckers): são gerados aleatoriamente, de sítios

polimórficos do genoma;

Marcadores gene-alvo ( GTM-gene tarfeted marker): são derivados de polimorfismos dentro

de genes;

PCR- específicos ou PCR de sequência específica;

Marcadores funcioanais (FM- Functional markers): são derivados de sítios polimórficos dentro

de genes envolvidos em determinada variação fenotípica;

Colocar o quadro comparação dos tipos de marcadores

AVALIAÇÃO DO POLIMORFIMO DIRETAMENTE DO DNA

RFLP (1980)- fragmentos de DNA de comprimento polomórfico;

PCR (1985) reação polimerase em cadeia

MINI E MICROSSATÉLITES (1985)- Sequências adjacentes que se repetem em número variado;

RAPD (1990)- polimorfismo de DNA amplificado ao acaso

AFLP (1994)- polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados;

SNP (1998) Polimorfismo de nucleotídeos únicos;

Marcadores de DNA

Hibridização: RFLP E MINISSATÉLITES;

AMPLIFICAÇÃO DO DNA (PCR): RAPD, SCAR, STS, SSR (MICROSSATÉLITE), AFLP, SNP

SEQUÊNCIAS EXPRESSAS: ESTP, ASP, SNP

RAPD – fragmentos de DNA amplificados ao acaso (williams et al., 1990 apud

Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo genoma.

Utilizad primers curtos e de sequencias arbitrárias, com sequencia alvo desconhecida;

Utiliza um primer único;

Detecta polimorfismo em apenas um par de bases;

Baseia-se na amplificação de DNA;

Não permite distinguir heterozigotos;

RAPD-POLIMORFIMSO AMPLIFICADO AO ACASO

Oligonucleotídeo (primer)+DNA GENÔMICO

Taq polimerase

Mistura: condições cíclicas

94grau- desnaturação do DNA

36 – anelamento

72- extensão (DNA polimerase)

Geração de fragmentos DNA polimórficos em grande quantidade;

Aplicação identificação de cultivares, diversidade genética, diagnóstico,

Vantagens:

Simplicidade, rapidez, e baixo custo,

Não requer biblioteca de sondas,

LIMITAÇÕES

Expressão dominante, baixo conteúdo de informação por bloco, padronização de condições de

amplificação e competição entre sítio de amplificação

Escolher outro marcador para explicar

Marcador molecular:

Construção de mapa genéticos, análise da diversidade genética, mapeamento de

características de interesse agronômico, avaliação de polimorfismos de sequencia de DNA,

Acesso de regiões intergênicas, regiões que não codificam sequencia gênicas.

Interesse: marcadores para identificação de alelos específicos PCR-específicos,

Automatização do sequenciamento de DNA.

Marcadores PCR-espcíficos (conversão de marcadores)

Obtidos a partir de marcadores já existentes ou sequência expressas de banco de dados

Uso de primers específicos =sequencia já mapeadas ou caracterizadas= obtido da conversão de

marcadores RAPD (SCAR), RFLP(STS), AFLP , SSR

Conversão:

Clonagem do DNA amplificado pelo marcador

Sequenciamento,

Desenho de primers específicos (superior a 20 pares de bases),

Útil na seleção assistida: resistência a doenças, cor de flor

Se o primers estiverem disponíveis as técnicas apresentam custo baixo.

O grupo botânico .... é de extremo interesse em virtude de ser constituído por plantas em

extinção e por apresentar um grande potencial de exploração econômica. Dentro deste grupo

está o mouriri pusa que FALAR DAS CARACTERÍSTICAS..o Gênero...possuem quantas espécies

distribuídas...

O avanço na agricultura e a falta de interesse pelas frutas nativas, até pouco tempo atrás,

foram os principais motivos da diminuição do número de plantas de...em seu habitat.

O estímulo para o uso de espécies nativas como alimentos e fonte de vitaminas é uma

alternativa viável para reduzir o processo de extinção, promovendo a manutenção e o

replantio de espécies, como na caso...

O conhecimento sobre a genética das populações de puçá, existentes na Estado do Tocantins,

é a base para a amplificação do conhecimento da espécie, visto que a maioria se encontra

ameaçado de extinção. Desta forma, a caracterização molecular é de interesse para futuros

trabalhos de melhoramento genético, bem com para outros trabalhos que visem a reduzir a

ameaça de extinção desta espécie.

A caraterização de genótipos, eram realizada com base nas características morfológicas e

agronômica. Todavia, este tipo de análise não pode ser realizada em qualquer período do ano,

e normalmente não é possível ser completado até a produção das frutas, requerendo um custo

elevado e tempo prolongado de análise. Além disto, as características são avaliadas de forma

subjetiva, podendo sofrer influências ambientais, principalmente quando se estudam

cultivares com características muito similares (BIANCHI et al., 2002)

Atualmente, o suo de marcadores moleculares é uma ferramenta complementar para a

caracterização de germoplasma e consequentemente, para identificação de populações e

raças primitivas (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1996).

A técnica que envolve a detecção de polimorfismo do DNA amplificao ao acaso (RAPD) tem

sido eficiente na caracterização de genótipos em várias espécies, antes que as caracterícticas

fenotípica sejam expressam.

O potencial de RAPD na revelação de polimorfimos foi verificada em acerola (Malpighia

emarginata), observou alta variabilidade genética entre os acessos estudados (SALLA et al,

2002).

Técnica RAPD mostrou eficiente em pessegueiro e nectarina apesar da baixa variabilidade

genética existente nessas espécies, esta técnica foi eficiente para a caracterização molecular

(LIMA et al., 2003).

RAPD espécies ameixeira, o alto grau de polimorfismo detectado pelos marcadores

confirmaram o potencial da técnica na análise de fingerprinting e sua utilidade na estimativa

da variabilidade genética (BIANCHI et al., 2003).

Métodos

Folhas oriundas dos genótipos de mouriri pusa

Extração de DNA: as amostras serão coletadas em tubo de eppendorf e armazenada a -80C. O

DNA genômico será extraído conforme protocolo descrito por DOYLE; DOYLE (1987), com

algumas adaptações.

As amostras vão ser maceradas com nitrogênio líquido e sendo adicionados em cada tubo

(tampão de extração (2% CTAB; 1,4 M NaCl, 20mM EDTA; 100 mM Tris HCl ph 8,0; 1% PVP e

1% Mercaptoetanol).

Seguidas as amostraas serão incubadas em baho maria 65 C por 60 min. Depois, em

temperatura ambiente, adiciona volume de clorofórmico/álcool isoamílico agitando po 10 min,

posteriormente as amostras serão centrifugadas a 13000rpm, por 10 min retirar o

sobrenadante transferindo-o para um novo tubo. Em seguida, foi adicionado igual volume de

etanol (ver se irá precisar colocar o restante da técnica).

O DNA foi será quantificado em gel de agarose 0,8% . A estimativa da concetração de DNA foi

realizada com base na comparação da intensidade das bandas padrão de DNA Lambda

digerido com a enzima e diluído a uma concentração de para utilização em reação em cadeia

da polimerse (PCR)

NUNES, A. M.; et al. Caracterização molecular de Butizeiro por marcadores RAPD. Rev. Bras.

Frutic. Jaboticabal – SP, v. 30, n. 3, p. 702-707. 2008.

MARCADOR MOLECULAR INCIARAM O DESENVOLVIMENTO DE TECNOLOGIAS QUE PODEM

REVELAR VARIABILIDADES EM NÍVEL GENÔMICO DE UMA FORMA RÁPIDA, SIMPLES E EFICAZ.

ESTA TÉCNICA DE DETECÇÃO DE POLIMORFIMSOS NO DNA COMEÇOU A SER EXPLORADO

APÓS O SURGIMENTO DA TECNOLOGIA DNA RECOMBINANTE E AMPLIFICAÇÃO DA MOLÉCULA

DE DNA POR PCR. MACADOR MOLECULAR TORNOU-SE POTENCIALMENTE ILIMITADO.

DEVIDA A TAMANHA IMPORTÂNCIA DOS INUMEROS ESTUDOS DESENVOLVIDOS A RESPEITO

DE MARCADORES QUE EXISTEM DIVERSOS BANCOS DE DADOS ESPECÍFICOS PARA DIFERENTES

TIPOS DE MARCADORES (FACILITA O ANDAMENTO DE PESQUISA)

RAPD: O POLIMORFISMO RAPD É DETECTADO PELA AMPLIFICAÇÃO DE LOCOS

CROMOSSÔMICOS USANDO PRIMERS DE SEQUÊNCIA CURTAS (10 BASES DE SEQUENCIA

ARBITRÁRIA) E POSTERIORMENTE SEPARDOS EM GEL DE POLIACRILAMIDA OU AGAROESE,

SENDO A COLORAÇÃO FEITA COM NITRATO DE PRATA DE ETÍDEO SOB LUZ UV, SENDO A

DETECÇÃO FEITA POR MUTAÇÕES OU REARRANJOS QUE ACONTECEM NO PRÓPRIO SITIO OU

ENTRE OS SITIOS DE HIBRIDIZAÇÃO DOS PRIMERS, PÓREM VALE RESSALTAR QUE MUTAÇÕES

DE PONTO SÃO CAPAZES DE INIBIR COMPLETAMENTE A AMPLIFICAÇÃO. ESTES PRIMERS, POR

SUA VEZ, SÃO COMPOSTOS DE PELO MENOS 50% DE CG E TEM A CAPACIDADE DE REVELAR

VÁRIOS LOCOS, POIS SUA SEQUENCIA É DETERMINDA DE FORMA ALEATÓRIA E COMO JÁ

EVIDENCIADO EM DIFERENTES ESPÉCIES, OS LOCOS RAPD ESTÃO DISPERSOS PELO GENOMA

SCAR:

.

. Como ilustram as figuras 8 e 9, os fragmentos submetidos à técnica de RAPD são

clonados e sequenciados, e, então, são desenhados primers maiores (fig. 9A), os quais –

justamente por conterem sequências mais longas – serão provavelmente específicos para

o locus de interesse, e espera-se que não amplifiquem outros loci. Entretanto, pode ser

que esses primers amplifiquem os dois alelos (fig. 9B), e será possível detectar

polimorfismos internos e esses primers, os quais são polimorfismos entre os dois alelos

(fig. 9C). Caso esses polimorfismos possam ser identificados, então deve ser possível

sintetizar novos primers, os quais amplificarão uma região de apenas um dos alelos (fig.

9D). É esse novo marcador baseado em PCR que é denominado SCAR

Brasil tem uma enorme biodiversidade;

É um dos principais centros de diversidade genética de espécies frutíferos nativas e

naturalizados;

Porém, a sua quase totalidade continua pouco explorado;

A frutíferas representa um papel importante no cenário sócio-econômico do Brasil

Família Melastomatacea ;

Útil no tratamento de distúrbios gastrointestinais como as ulceras, gastrites (medicina

popular);

Mouriri elliptica Mart., conhecida popularmente como pusa-coroa;

Ocorre em vários Estados brasileiros;

MARIRI, F. S.; ANDREO, M.A. et al.

As frutas contêm, além dos nutrientes essenciais e de micronutrientes (como minerais

e fibras, agentes como vitaminas A, C e E e diversos compostos secundários de

natureza fenólica (antocianinas, flavonoides, flavonas, etc), carotenoides, clorofilcas,

ácidos graxos e folatos (HARBONE; WILLIAMS, 2000; BURNS et al., 2003);

Estados: MA, MT, MS, TO, PI, CE;

Vulgarmente conhecida por croadinha, croada, puçá e manipuça.;

Botanicamente é classificada pertencente à divisão Magnoliophyta (Angiospremae);

Classe Magnoliopsida (Dicotiledonae);

Subclasse Rosidae;

Famíla Melastomataceae, gênero Mouriri, espécie elliptica e nome científico Mouriri

elliptoca mart. (SILVA et al., 2001; ZICODEZOO, 2007);

Região norte: o clima tropical úmido permite o desenvolvimento de uma frutíferas

exóticas e peculiar, grande potencial de exploração;

ANTIOXIDANTES: substâncias capazes de restringir a propagação das reações em

cadeia e as lesões induzidas pelos radicais livres (RUFINO, 2006);

CONTRIBUEM : prevenção de doenças degenerativas tais como: cardiopatias,

aterosclerose, problemas pulmonares além de danos ao DNA, como mutagênese e

carcinogênese (BIANCHI, 1999);

TOCANTINS: Constituem uma preciosa fonte de riqueza e de alimentos, necessitando

serem estudadas e preservadas;

ROESLER, et al., 2007 Indicou o grande potencial de frações de frutas do bioma do

cerrado em sequestrar radicais livers, confirmando seu poder antioxidante;

Necessárias pesquisas com o puçá “coroa de frade” com a finalidade de gerar

conhecimento de sua atividade antioxidante e o benefício deste fruto;

Brasil é um dos principais centros de diversidade genética de espécies frutíferas

nativas e naturalizadas (VIEIRA NETO, 2002);

Aproveitamento sócio-econômico e demanda de pesquisas de frutíferas nativas

refletem na oferta de novas alternativas de frutas frescas para o consumo in natura e

matéria-prima para agroindústria;

Conservação de recursos genéticos desta espécies;

Três tipos de cor: carotenoides, clorofila e antocianinas;

Carotenoides e clorofila: cloroplastos e nos cromoplastos;

Pigmentos fenólicos (antocianinas, flavonoides e protoacianinas) presentes nos

vacúolos (SOUZA, 2007);

ANTIOXIDANTES: DEFINE A CAPACIDADE PARA CAPTURAR RADICAI LIVRES E

SEQUESTRANTES DE CARCINÓGENOS E DE SEUS METABÓLITOS, EXCERCENDO AÇÃO

PROTETORA CONTRA A EVOLUÇÃO DOS PROCESSOS DEGENERATIVOS QUE

CONDUZEM ÀS DOENÇAS E AO ENVELHECIMENTO PRECOCE (SLAGA, 1995);