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LILIANE ALMEIDA CARNEIRO

Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e

imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania)

infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no

estado do Pará

São Paulo

2016

LILIANE ALMEIDA CARNEIRO

Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da

infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área

endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Departamento:

Patologia

Área de Concentração:

Patologia Experimental e Comparada

Orientadora:

Profª. Drª. Marcia Dalastra Laurentti

São Paulo

2016

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.3351 Carneiro, Liliane Almeida FMVZ Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da infecção

canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará / Liliane Almeida Carneiro. -- 2016.

93 f. : il. Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e

Zootecnia. Departamento de Patologia, São Paulo, 2016.

Programa de Pós-Graduação: Patologia Experimental e Comparada. Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada. Orientador: Profª. Drª. Marcia Dalastra Laurentti.

1. Leishmaniose visceral canina. 2. Imunidade celular. 3. Imunidade humoral. 4. Evolução clínica. I. Título.

ERRATA CARNEIRO, L. A. Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clí nica e imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará. 2016. 93 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.

Página Onde se lê Leia-se

Ficha catalográfica

Resumo

93 f.

93 f.

91 f.

91 f.

Abstract 93 f. 91 f.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: CARNEIRO, Liliane Almeida

Título: Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Aprovado em:__/__/__

Banca Examinadora

Prof.Dr._________________________________________________________

Instituição:______________________Julgamento:_______________________

Prof.Dr._________________________________________________________


Prof.Dr._________________________________________________________


Prof.Dr._________________________________________________________


Prof.Dr._________________________________________________________


DEDICATÓRIA

À minha filha, Amanda, razão da minha vida.

À minha mãe, Ney, pelo constante apoio e amor.

AGRADECIMENTOS

Aos meus avós, Nazaré e Belúcio, por terem me dado à oportunidade de

estudar e me ensinarem o valor de uma boa educação.

Ao João Carlos, por existir e me fazer experimentar um grande amor.

Ao Dr. Fernando Tobias Silveira, pelos constantes ensinamentos, pela

oportunidade de trabalhar sob a sua orientação e por ter acreditado em mim.

À Dra. Marcia Dalastra Laurenti, que me aceitou como aluna, mesmo eu

estando longe, e acreditou que seria possível fazer um bom trabalho.

Às amigas, pesquisadoras do laboratório de Leishmanioses “Dr. Ralph

Lainson” do Instituto Evandro Chagas, Marliane Campos e Luciana Lima, pela

colaboração, constante apoio, confiança e inesquecíveis momentos compartilhados.

À Rosely de Jesus e Raimundo Nonato, técnicos do laboratório de

Leishmanioses, colegas, amigos e colaboradores na nossa eterna “Equipe cão”, pelo

constante e irrestrito apoio em todas as atividades.

Às colegas, amigas e parceiras de muito trabalho, Aline Imbeloni, Manoella

Vaz e Mika Aihara, do Centro Nacional de Primatas, pelos incansáveis momentos de

trabalho e também de descontração.

À amiga, pesquisadora do Instituto Evandro Chagas, Livia Casseb, pela

importante colaboração com as análises estatísticas.

A toda equipe do laboratório de Leishmanioses “Dr. Ralph Lainson”, que

sempre me recebeu bem e me ajudou quando necessário.

Ao diretor do Instituto Evandro Chagas, Dr. Pedro Fernando da Costa

Vasconcelos, por todo o apoio logístico, estruturação física e financeira, além da

confiança depositada no meu trabalho, me dando oportunidade de crescer.

Ao Laboratório de Patologia e Moléstias Infecciosas (LIM-50) do

Departamento de Patologia da FMUSP, pela oportunidade de desenvolver minha

tese junto à eles.

Finalmente, ao Senhor meu Deus, por mais uma conquista alcançada, muito

obrigada.

RESUMO

CARNEIRO, L. A. Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará. [Prospective study on the dynamics of clinical and immunological evolution of canine infection by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi in an endemic area of visceral leishmaniasis in the state of Pará]. 2016. 93 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Leishmaniose visceral canina (LVC) é um dos problemas de saúde pública mais

importantes da América Latina, pois geralmente precede a doença humana, a

leishmaniose visceral americana (LVA), causada pela Leishmania (L.) infantum

chagasi. No presente estudo prospectivo analisou-se durante período de dois anos a

prevalência, incidência e dinâmica da evolução clínico-imunológica da infecção

canina pela L. (L.) i. chagasi em uma coorte de 316 cães mestiços que vivem em

área endêmica de LVA no município de Barcarena, Pará, Amazônia Brasil, pelo uso

combinado do teste de imunofluorescência indireta (RIFI-IgG) e de

hipersensibilidade tardia (RIM), bem como a pesquisa do parasita pela aspiração do

linfonodo poplíteo para o diagnóstico da infecção. A reatividade para RIFI e RIM

reconheceu três diferentes perfis de resposta imunológica: (I) RIFI (+) / RIM (-) (81

cães), (II) RIFI (-) / RIM (+) (17 cães), e (III) RIFI (+) / RIM (+) (13 cães),

proporcionando uma prevalência global da infecção de 35,1% (111/316). Desta

forma, a prevalência específica do perfil I (25,6%) foi superior as dos perfis II e III,

5,4% e 4,1%, respectivamente. Além disso, a frequência destes perfis entre 111

cães infectados mostrou que a taxa de 73% do perfil I também foi maior do que os

dos perfis II (15,3%) e III (11,7%). A prevalência da infecção de acordo com as

faixas etárias revelou que a taxa de 27,5% do grupo ≥1ano <7 anos foi maior do que

as de <1 ano (5,3%) e ≥7anos (2,2%), respectivamente. Por outro lado, a incidência

global da infecção foi de 5,7% cães / mês (5,4% perfil I, 0,3% perfil II e 0,0% perfil

III). No entanto, observou-se uma progressiva diminuição nas taxas de incidência

nos seguintes pontos de tempo: seis (3,6% cães / mês), doze (1,7% cães / mês) e

vinte e quatro (0,4% cães / mês) meses do estudo. Além disso, a incidência da

infecção de acordo com os grupos etários demonstraram que a taxa de 6,6% cães /

mês no grupo <1 ano foi maior em comparação com as de 5,3% e 3,3% cães / mês

nos grupos ≥1ano e <7 anos, e <1 ano, respectivamente. O diagnóstico

parasitológico da infecção foi confirmado em 19% (21/111) no estudo da

prevalência, sendo a maioria dos cães (85,7%) do perfil I, onde 61,1% eram

sintomáticos e 38,9% assintomáticos. Entre o restante (14,3%), o diagnóstico foi

associado ao perfil III, sendo 66,6% assintomáticos e 33,3% sintomáticos. No

levantamento da incidência, o diagnóstico foi confirmado em 11% dos cães, todos

pertencentes ao perfil I, sendo 60% assintomáticos e 40% sintomáticos. Com

relação ao estado clínico de todos os 179 cães diagnosticados infectados durante o

período de dois anos, observou-se que entre 145 (81%) cães do perfil I, 82% eram

assintomáticos e 18% sintomáticos; entre os 21 (11,7%) cães do perfil II, todos

(100%) eram assintomáticos; e entre 13 (7,3%) cães do perfil III, 84,6% eram

assintomáticos e 15,4% sintomáticos. Além disso, observou-se que a conversão do

estado clínico assintomático ao sintomática foi registado principalmente em cães do

perfil I (40,2%) do que aqueles dos perfis II (5,8%) e III (9%). Por outro lado, apenas

3,2% dos cães do perfil I [RIFI (+) / RIM (-)] converteu resposta RIM (+), enquanto

80% de cães do perfil II [RIFI (-) / RIM (+)] converteu resposta RIFI (+). Por fim,

demonstrou-se que 100% dos óbitos por LVC ocorreu entre os cães do perfil I,

sendo 85,7% na prevalência e 14,3% na incidência. Considerando todos esses

resultados, parece razoável que a interação entre parasita e resposta imune canina

é suportada principalmente pelo perfil imunológico claramente vulnerável, o perfil I

[RIFI (+) / RIM (-)], o qual não oferece qualquer resistência ao parasita, tornando o

cão altamente susceptível à infecção.

Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina. Imunidade celular. Imunidade

humoral. Evolução clínica.

ABSTRACT

CARNEIRO, L. A. Prospective study on the dynamics of clinical and immunological evolution of canine infection by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi in an endemic area of visceral leishmaniasis in the state of Pará. [Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará]. 2016. 93 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is one of the most important public health

problems in Latin America because it usually precedes human disease, American

visceral leishmaniais (AVL), being caused by Leishmania (L.) infantum chagasi. In

the present prospective study it was analyzed during two years period the

prevalence, incidence and dynamics of the clinical-immunological evolution of canine

L. (L.) i. chagasi-infection in a cohort of 316 mongrel dogs living in endemic area of

AVL in Barcarena municipality, Pará State, Amazonian Brazil, by the combined use

of the indirect fluorescence antibody test (IFAT-IgG) and delayed-type

hypersensitivity (DTH), as well as the parasite research by the popliteal lymph node

aspiration for the diagnosis of infection. The IFAT and DTH reactivity recognized

three different immune response profiles: (I) IFAT(+)/DTH(−) (81 dogs), (II)

IFAT(−)/DTH(+) (17 dogs), and (III) IFAT(+)/DTH(+) (13 dogs), providing an overall

infection prevalence of 35,1% (111/316). In this way, the specific prevalence of

profile I 25,6% was higher than those of profiles II 5,4% and III 4,1%. Moreover, the

frequency of these profiles among 111 infected dogs showed that the rate 73% of

profile I was also higher than those of profiles II 15,3% and III 11,7%. The infection

prevalence according to the age groups revealed that the rate 27,5% of ≥1year

<7years was higher than those of <1year 5,3% and ≥7years 2,2%, respectively. On

the other hand, the overall incidence of infection was 5,7% dogs/month (5,4% profile

I, 0,3% profile II and 0,0% profile III). However, it was noted a progressive decreasing

in the incidence rates at the following time-points: six (3,6% dogs/month), twelve

(1,7% dogs/month) and twenty four (0,4% dogs/month) months of the study. In

addition, the infection incidence according to the age groups demonstrated that the

rate 6,6% dogs/month of <1year was higher compared to those of 5,3% and 3,3%

dogs/month of ≥1year and <7years, and <1year, respectively. The parasitological

diagnosis of infection was confirmed in 19% (21/111) at the prevalence survey, being

most dogs (85,7%) of the profile I, 61,1% symptomatic and 38,9% asymptomatic

ones. Among the remainder 14,3%, the diagnosis was associated to the profile III,

66,6% in asymptomatic and 33,3% in symptomatic dogs. At the incidence survey, the

diagnosis was confirmed in 11% of dogs, all from the profile I, 60% asymptomatic

and 40% symptomatic ones. With regards to clinical status of all 179 infected dogs

diagnosed during two years period, it was observed that among 145 (81%) dogs from

the profile I, 82% were asymptomatic and 18% symptomatic ones; among 21 (11,7%)

from the profile II, all (100%) were asymptomatic; and among 13 (7,3%) from the

profile III, 84,6% were asymptomatic and 15,4 % symptomatic ones. Besides this, it

was noted that the clinical conversion from asymptomatic to symptomatic status was

principally recorded in dogs from the profile I (40,2%) than those from the profiles II

(5,8%) and III (9%). By the other side, only 3,2% dogs from the profile I

[IFAT(+)/DTH(−)] converted DTH(+) response, while 80% dogs from the profile II

[IFAT(−)/DTH(+)] converted IFAT(+) response. At last, it was demonstrated that 100% of

death by CVL occurred amongst dogs from the profile I, being 85,7% from the

prevalence and 14,3% from the incidence. Taking together all these results, it seems

reasonable that interaction between parasite and canine immune response is

principally supported by immunologic profile clearly vulnerable, the profile I

[IFAT(+)/DTH(−)], which does not offer any resistance to parasite, became the dog

highly susceptible to infection.

Keywords: Canine visceral leishmaniasis. Cellular immunity. Humoral immunity.

Clinical course.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará .......................................... 35

Figura 2 - Coleta de sangue através de punção da veia safena lateral do cão

............................................................................................................. 39

Figura 3 - Aspiração do linfonodo poplíteo do cão ............................................... 39

Figura 4 - Teste intradérmico de Montenegro ...................................................... 41

Figura 5 - Prevalência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila

Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ...................................... 44

Figura 6 - Distribuição dos perfis imunológicos da infecção canina por L. (L.)

i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, por

ocasião da prevalência ........................................................................ 45

Figura 7 - Prevalência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila

Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a

faixa etária ........................................................................................... 46

Figura 8 - Incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana

do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil .................................................... 47

Figura 9 - Incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana

do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a faixa etária ..... 49

Figura 10 - Distribuição dos perfis imunológicos da infecção canina por L. (L.)

i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de

acordo com a faixa etária ..................................................................... 50

Figura 11 - Diagnóstico parasitológico da infecção canina por L. (L.) i.

chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ............. 51

Figura 12 - Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila

Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o

perfil imunológico, por ocasião da prevalência .................................... 52

Figura 13 - Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


perfil imunológico, por ocasião da incidência ...................................... 53

Figura 14 - Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


perfil imunológico, por ocasião da prevalência .................................... 55

Figura 15 - Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


perfil imunológico, por ocasião da incidência ...................................... 55

Figura 16 - Taxas totais da conversão clínica dos cães assintomáticos em

sintomáticos dos perfis imunológicos .................................................. 56

Figura 17 - Conversão sorológica (RIFI-IgG) e da reação intradérmica de

Montenegro (RIM) na infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


perfil imunológico, por ocasião da prevalência e incidência ................ 57

Figura 18 - Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i.

chagasi, outros agravos e perdas, por ocasião da prevalência, na

vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ................................ 60

Figura 19 - Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i.

chagasi, outros agravos e perdas, por ocasião da incidência, na

vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ................................ 60

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 18

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 22

2.1 LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA .......................................................... 22

2.1.1 Aspectos gerais .......................................................................................... 22

2.1.2 Ciclo biológico ............................................................................................ 22

2.1.3 Patogênese ................................................................................................. 24

2.1.3.1 Aspectos imunológicos ................................................................................. 24

2.1.3.2 Formas clínicas............................................................................................. 26

2.1.4 Métodos de Diagnóstico ............................................................................ 26

2.1.4.1 Diagnóstico parasitológico ............................................................................ 27

2.1.4.2 Diagnóstico Sorológico ................................................................................. 28

2.1.4.3 Teste Intradérmico de Montenegro ............................................................... 29

2.1.5 Estratégias de controle de leishmaniose visceral ................................... 29

2.1.6 Tratamento da leishmaniose visceral canina ........................................... 31

3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 35

3.1 Área .............................................................................................................. 35

3.2 População do estudo ................................................................................. 36

3.3 Desenho do estudo .................................................................................... 36

3.4 Critérios de identificação da infecção canina .......................................... 37

3.5 Critérios de avaliação clínica da infecção ................................................ 37

3.6 Coleta de amostras de tecido .................................................................... 38

3.7 Critérios para definição de óbito por LVC ................................................ 39

3.8 Procedimento dos testes imunológicos ................................................... 40

3.9 Procedimento do exame parasitológico ................................................... 41

3.10 Análise dos dados ...................................................................................... 41

3.11 Aprovação do Comitê de Ética no Uso Animal ........................................ 42

4 RESULTADOS ............................................................................................. 44

4.1 Prevalência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do

Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ................................................................ 44

4.2 Distribuição dos perfis imunológicos da infecção ca nina por L. (L.) i.

chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasi l, por ocasião

da prevalência ............................................................................................. 45


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a f aixa etária .............. 45

4.4 Incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do

Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ................................................................ 46


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a f aixa etária .............. 47

4.6 Distribuição dos perfis imunológicos da infecção ca nina por L. (L.) i.

chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasi l, de acordo

com a faixa etária ........................................................................................ 49

4.7 Diagnóstico parasitológico da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na

vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil ..................................... 50

4.8 Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila

Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de aco rdo com o perfil

imunológico ................................................................................................ 51

4.9 Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


imunológico ................................................................................................ 53

4.10 Conversão sorológica (RIFI-IgG) e da reação intradé rmica de

Montenegro (RIM) na infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila


imunológico ................................................................................................ 56

4.11 Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi,

outros agravos e perdas na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará,

Brasil ............................................................................................................ 58

5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 62

6 CONCLUSÃO ............................................................................................... 76

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 78

ANEXO ......................................................................................................... 91

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

18

1 INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose que atinge populações dos cinco

continentes, sendo conhecida, na América Latina, como Leishmaniose Visceral

Americana ou Calazar Neotropical. De acordo com a Organização Mundial de Saúde

(OMS) a leishmaniose é uma das seis endemias mundiais que afetam cerca de dois

milhões de pessoas a cada ano. Estima-se que a prevalência das diferentes formas

clínicas da enfermidade no mundo ultrapassa 12 milhões de casos, e que cerca de

360 milhões de pessoas vivem em área de risco, sendo uma das doenças

emergentes mais relevantes em todo o mundo, chegando a 98 % de mortalidade em

casos humanos não tratados (ALVAR et al., 2006; WHO, 2008).

A LV é causada por protozoário pertencente à ordem Kinetoplastida, família

Trypanossomatidae, gênero Leishmania (ROSS, 1903). A principal forma de

transmissão do parasito para o homem e outros hospedeiros mamíferos é pela

picada e inoculação de formas parasitárias por fêmeas de dípteros da família

Psychodidae, subfamilia Phebotominae, conhecidos genericamente por

flebotomíneos (GONTIJO; MELO, 2004), cuja espécie de maior importância

epidemiológica no Brasil é Lutzomyia longipalpis (LAINSON, 2010).

Em relação ao protozoário, Lainson e Rangel (2003, 2005) baseados em

diferenças observadas por meio de técnicas moleculares têm usado a nomenclatura

Leishmania (L.) infantum infantum e Leishmania (L.) infantum chagasi, sugerindo

que a separação taxonômica dos parasitos poderia ser ao nível de subespécie. Por

outro lado, Dantas-Torres (2006), acredita que Leishmania chagasi e Leishmania

infantum devem ser consideradas espécies sinônimas, sem que haja mudança no

nome ao nível de subespécie, pois isso implicaria em toda uma re-classificação do

gênero Leishmania. Contudo, segundo Shaw (2006), de acordo com o códico da

Comissão Internacional de Nomenclatura Zoológica, o nome Leishmania

(Leishmania) infantum chagasi é absolutamente correto, razão pelo qual será

adotado neste trabalho.

19

No cão doméstico (“Canis familiaris”), a infecção por L. (L.) i. chagasi causa a

leishmaniose visceral canina (LVC), uma zoonose parasitária amplamente difundida

em países da América Latina (SILVEIRA; CORBETT, 2010). Do ponto de vista

epidemiológico, a LVC é considerada mais importante que a doença humana, devido

a sua maior prevalência e pelo fato de que tanto os cães assintomáticos como os

sintomáticos são igualmente infecciosos para o flebotomíneo vetor (LAURENTI et

al., 2013).

Até recentemente, a doença era considerada rural, típica de ambientes

silvestres, mas hoje pode ser também contraída em zonas suburbanas e urbanas.

Atualmente, surtos e epidemias de LVC têm sido observados em grandes centros

urbanos no Brasil, tais como: Recife (PE), Natal (RN), Brasília (DF), Belo Horizonte

(MG), Rio de Janeiro (RJ), Três Lagoas (MS), Baurú (SP) e Araçatuba (SP) (SILVA

et al., 2001; FRANÇA-SILVA et al., 2003; SÃO PAULO, 2003; BRASIL, 2006;

DANTAS-TORRES, 2006; RIBEIRO, 2007).

Neste contexto, o cão apresenta grande importância na manutenção do ciclo

do parasito, por representar o principal reservatório doméstico de L.(L.)i. chagasi,

estando a ocorrência da infecção humana, fortemente associada à LVC. A infecção

canina geralmente precede o aparecimento de casos humanos, sendo ainda, mais

prevalente que a doença humana (CAMPINO, 2003).

A alta prevalência da LVC em áreas endêmicas para LVA, o intenso

parasitismo cutâneo nos cães, bem como, a precedência da LVC em relação à

doença humana, destacam o importante papel do cão na epidemiologia da LVA

(BADARÓ et al., 1996; COURTENAY et al., 2002; MORENO; ALVAR, 2002;

GIUNCHETTI et al., 2006).

No Brasil, o programa de controle da leishmaniose visceral (PCLV), da

Fundação Nacional de Saúde (FNS, MS), consiste em três tipos de ações:

diagnóstico e eliminação dos cães infectados, assintomáticos ou sintomáticos,

visando reduzir a fonte de infecção para o flebótomo vetor; diagnóstico e tratamento

precoce dos indivíduos doentes; e combate ao vetor em área onde há casos

humanos. Porém, diversos estudos tem questionado a efetividade destas ações,

pois o impacto na transmissão humana é limitado e possui alto custo (TESH, 1995;

PARANHOS-SILVA et al., 1996). A produção de uma vacina contra a LVC constitui

20

consenso, entre os pesquisadores, para o controle da doença humana (MORENO;

ALVAR, 2002; REITHINGER; DAVIES, 2012). No momento, já existe uma vacina

sendo comercializada no Brasil, porém, há dúvidas sobre sua eficácia no controle da

transmissão da infecção. Neste sentido, o cão vacinado pode apresentar resistência

ao desenvolvimento da doença, porém, pode também permanecer como fonte de

infecção para o vetor, do mesmo modo que o cão infectado assintomático. Por esta

razão, são necessários estudos visando aperfeiçoar o conhecimento da resposta

imune do cão infectado para o controle desta zoonose (ALVAR et al., 1994;

GUARGA et al., 2002).

Considerando a exposição acima, não há duvida quanto à importância da

identificação de marcadores de resistência e susceptibilidade na LVC, com base no

perfil da resposta imune contra a infecção por L. (L.) i. chagasi, em combinação com

dados clínicos e parasitológicos, o que já foi alvo de trabalho prévio do nosso grupo

de pesquisa (SILVEIRA et al., 2012). Neste sentido, o presente trabalho objetivou

ampliar nosso entendimento sobre esses parâmetros em cães infectados por L. (L.)

i. chagasi na Amazônia brasileira, focando não só na prevalência e incidência, mas,

principalmente, na evolução clínico-imunológica da infecção, buscando respostas

para questões pontuais na interação do parasito com a resposta imune do cão, tais

como, conversão clínica, sorológica, imune celular (hipersensibilidade tardia; reação

intradérmica de Montenegro), e evolução para o óbito, na expectativa de contribuir

com novas estratégias de controle, terapias e candidatos a vacinas contra a doença.

21

REVISÃO DEREVISÃO DEREVISÃO DEREVISÃO DE LITERATURALITERATURALITERATURALITERATURA

22

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

2.1.1 Aspectos Gerais

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença sistêmica severa cujas

manifestações clínicas são intrinsecamente dependentes do tipo de resposta

imunológica expressa pelo animal infectado. O quadro clínico dos cães infectados

apresenta um espectro de características clínicas que varia do aparente estado

sadio a um severo estágio final (BRASIL. 2006).

Desde 1908, quando relataram pela primeira vez na Tunísia a presença de

formas amastigotas em canídeos domésticos (NICOLLE, 1908) e no Brasil quando

observaram intenso parasitismo cutâneo em cães e raposas do Ceará (DEANE;

DEANE, 1955) os cães têm sido considerados como importantes reservatórios no

ciclo doméstico da leishmaniose visceral (LV).

Fatos como a alta prevalência da doença canina em áreas endêmicas para

leishmaniose visceral, o intenso parasitismo cutâneo apresentado por esses

animais, bem como, por preceder a ocorrência da doença em humanos, destacam o

importante papel do cão na epidemiologia da LV (BADARÓ et al., 1996;

COURTENAY et al., 2002; MORENO; ALVAR, 2002; GIUNCHETTI et al., 2006).

2.1.2 Ciclo Biológico

Durante o repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado infectado, o

flebotomídeo ingere macrófagos parasitados por formas amastigotas de Leishmania

sp. Estas sofrem divisão binária, multiplicação e diferenciação em formas

23

paramastigotas, as quais colonizam o esôfago e a faringe do vetor, onde

permanecem aderidas ao epitélio pelo flagelo. Diferenciam-se em formas

promastigotas metacíclicas, que são as formas infectantes. O ciclo biológico

completa-se com a picada do flebótomo infectado e subsequente inoculação de

formas promastigotas do parasita na pele e⁄ou corrente sanguínea de um novo

hospedeiro vertebrado. As formas infectantes são liberadas na epiderme do

hospedeiro e fagocitadas por células do sistema mononuclear fagocitário. No interior

dos macrófagos diferenciam-se em formas amastigotas, que se multiplicam

intensamente por divisão binária. Os macrófagos, repletos de amastigotas, tornam-

se desvitalizados e rompem-se liberando essas formas, que serão fagocitadas por

novos macrófagos em um processo contínuo. Ocorre então a disseminação

hematogênica e linfática para outros tecidos ricos em células do sistema

mononuclear fagocitário (IKEDA-GARCIA; MARCONDES, 2007). Após os

acontecimentos citados acima, a infecção dissemina-se para os linfonodos, o baço e

a medula óssea dentro das primeiras horas.

Peters et al. (2008) realizaram um experimento onde colocaram fêmeas do

inseto Phlebotomus duboscqi portadoras de Leishmania major, capaz de infectar

animais de laboratório, para se alimentarem na orelha de camundongos. Com o uso

de um microscópio, os autores acompanharam o combate aos parasitas e

observaram que tão logo o sistema imunológico dos roedores identificou a invasão,

os neutrófilos se deslocaram até a região da picada. Em pouco mais de meia hora,

os neutrófilos já haviam internalizado a maior parte dos parasitas e tentavam destruí-

los com um banho de enzimas digestivas. Como vivem por apenas umas poucas

horas, os neutrófilos são digeridos pelos macrófagos. Esses pesquisadores

verificaram que após a morte dos neutrófilos, parasitas vivos se aproximavam dos

macrófagos, nos quais se alojavam e se reproduziam. Esta equipe de estudiosos

chamou esta estratégia de cavalo-de-Tróia. Para esses autores, é provável que esse

mesmo mecanismo permita a Leishmania (L.) i. chagasi penetrar nos macrófagos,

gerando danos no fígado, no baço e na medula óssea e, debilitando o sistema de

defesa.

24

2.1.3 Patogênese

2.1.3.1 Aspectos Imunológicos

A resposta imunológica desencadeada por um agente infeccioso é

dependente de vários fatores, como sua antigenicidade, carga parasitária e sistema

imunológico do hospedeiro, sendo, portanto, a apresentação clínica da doença uma

consequência dessas interações (SANTOS-GOMES et al., 2002).

Leishmania sp. são protozoários que se multiplicam inicialmente em

macrófagos na porta de entrada das formas parasitárias. Se o hospedeiro não gera

uma resposta imune protetora eficaz, os parasitos podem disseminar-se da pele em

fagócitos mononucleares atingindo a medula óssea, o baço, linfonodo e fígado,

causando uma doença crônica (STRAUSS-AYALI; BANETH, 2001).

A infecção por Leishmania pode ter evolução diferente em indivíduos

geneticamente distintos, e o curso da infecção é determinado pela natureza da

resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro (DAY, 2007; SOLANO-GALLEGO

et al., 2000).

Com relação ao perfil imunológico do cão, existem alguns registros dos

mecanismos de proteção e susceptibilidade à doença (MORENO; ALVAR, 2002).

Evidências experimentais e clínicas indicam que a resolução das infecções por

Leishmania é dependente de células T, e mediada por macrófagos ativados

(BARBIÉRI, 2006). Os macrófagos e as células dendríticas infectadas atuam como

células apresentadoras de antígenos ativando linfócitos (CD4+) Th1 e Th2. Havendo

a ativação das células Th1 ocorrerá a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais

como interleucina-2 (IL-2), inferferon-gama (IFN-y) e fator de necrose tumoral (TNF),

as quais aumentaria a eficiência das células fagocíticas e de linfócitos citotóxicos,

desencadeando resposta imune protetora e baixos títulos de anticorpos anti-

Leishmania (PINELLI et al., 1994; RODRIGUÉZ-CORTES et al., 2007). Dessa forma,

cães que apresentam resposta imune protetora mediada por células são capazes de

controlar a infecção e permanecem assintomáticos.

25

Quando cães infectados por Leishmania (L.) i. chagasi desenvolvem

acentuada resposta imune humoral, esta não apresenta efeito protetor quanto a

progressão da doença (LOPEZ et al., 1996; MORENO; ALVAR, 2002; RODRIGUÉZ-

CORTES et al., 2007). Essa resposta é caracterizada pela produção aumentada de

citocinas anti-inflamatórias, tais como: Interleucina (IL) 4, 5, 6, 10 e 13, as quais

desencadeiam a proliferação de células B e produção de imunoglobulinas

(MORENO; ALVAR, 2002; RODRIGUÉZ-CORTES et al., 2007). Strauss-Ayali,

Baneth e Jaffe (2007) mostraram que uma resposta imune com perfil Th1 e Th2

ocorrem na infecção por Leishmania (L.) i. chagasi, e sugerem que a elevação inicial

dos níveis de IL-4 pode ter um papel na persistência do parasito, mesmo na

presença de níveis elevados de IFN-y. Assim, cães naturalmente infectados, que

apresentam um perfil não protetor, produzem citocinas do perfil Th1/Th2, altos títulos

de anticorpos e evoluem para a forma clínica sintomática. No caso dos cães que

desenvolvem a doença, ocorre uma depleção das regiões de células T dos seus

órgãos linfoides, enquanto as zonas de células B destes órgãos proliferam. A

excessiva proliferação de células B e macrófagos resulta em hepatomegalia,

linfadenomegalia generalizada e hipergamaglobulinemia (FEITOSA et al., 2000;

STRAUSS-AYALI; BANETH, 2001).

Um importante dano causado pela hipergamaglobulinemia é a produção de

grande quantidade de imunocomplexos circulantes que, uma vez depositados na

parede dos vasos sanguíneos, resulta em processos inflamatórios em diferentes

órgãos (LOPEZ et al., 1996; BANETH, 2006; RODRIGUÉZ-CORTES et al., 2007).

Os macrófagos, além de realizarem fagocitose, reparo e cicatrização tecidual,

agem como células apresentadoras de antígenos no início da resposta imune e

afetam o curso da doença secretando interleucina 1 (IL-1), 6 (IL-6),12 (IL-12) e fator

de necrose tumoral (TNF), os quais aumentam a eficiência das células fagocíticas e

de linfócitos citotóxicos (ROITT et al., 1993; ENGWERDA et al., 2004; BARBIÉRI,

2006).

Outras células também desempenham importante papel na infecção causada

pela Leishmania sp. As celulas de Langerhans são essenciais na indução da

resposta imune específica por serem responsáveis pelo transporte de parasitas aos

linfonodos regionais, local onde esta resposta se inicia. Os leucócitos

26

polimorfonucleares (PMN) participam da fagocitose dos parasitas e, em conjunto

com imunoglobulinas e sistema complemento, possuem ação leishmanicida

(LAURENTI et al., 1996).

2.1.3.2 Formas clínicas

A LVC pode evoluir a partir de casos assintomáticos a uma doença sistêmica,

que culmina na maior parte em morte. Os sinais clínicos iniciais são hipertrofia do

linfonodo, dermatite periorbital e dermatite nasal que podem difundir. Os pêlos se

tornam opacos e caem, juntamente com onicogrifose e edema das patas. Outros

sinais como febre, apatia, diarréia, hemorragia intestinal, perda de peso,

hepatoesplenomegalia, hiperqueratose, ulceração no nariz, ouvidos e cauda, e

ceratoconjuntivite são freqüentes (GENARO et al., 1988; DIAS et al., 1999).

Podem apresentar, ainda, alterações digestórias, renais, hepáticas, cardio-

respiratórias, locomotoras, neurológicas e oculares (NOLI, 1999; FEITOSA et al.,

2000; SCOTT et al., 2001; FERRER, 2002; ALVAR et al., 2004; BANETH, 2006;

MARCONDES, 2007; SILVA et al., 2007; SONODA, 2007; BANETH et al., 2009;

MARCONDES, 2009).

Problemas no sistema locomotor levam à claudicação, impotência funcional

ou paresia, em decorrência de quadros de poliartrite, polimiosite e até osteomielite.

Eventualmente ulcerações interdigitais e edema de membros também podem causar

dificuldade locomotora (WOLSKCHRIJN et al., 1996; BURACCO et al., 1997;

FEITOSA et al., 2000; MCCONKEY et al., 2002; AGUT et al., 2003; BANETH, 2006;

SILVA et al., 2007; FERRARO, 2009). Muitos autores relatam que cães com

leishmaniose visceral possuem mioatrofia, inicialmente nos músculos das fossas

temporais, seguida, sucessivamente, pelo resto da musculatura do corpo (KONTOS;

KOUTINAS, 1993; KOUTINAS et al., 1999; FEITOSA, et al., 2000).

2.1.4 Métodos de Diagnóstico

27

De um modo geral o diagnóstico da LVC ainda é considerado um problema

para os serviços de Saúde Pública, principalmente pela inexistência de testes com

alta sensibilidade e especificidade (ROSÁRIO et al., 2005), de baixo custo e de fácil

implantação e operacionalização na rotina dos serviços.

2.1.4.1 Diagnóstico Parasitológico

É um procedimento invasivo e inadequado para estudos epidemiológicos em

larga escala, mas comumente considerado padrão-ouro para resultados positivos na

comparação das demais técnicas de diagnóstico. Estes métodos podem apresentar

especificidades que chegam a 100%; entretanto, a sensibilidade é muito variável,

uma vez que a distribuição tecidual do parasita não é homogênea (GONTIJO et al.,

2004).

Formas amastigotas do parasito podem ser observadas em biópsia de pele,

aspirados de linfonodos, medula óssea, baço e biópsia hepática. O material obtido é

corado com corantes de rotina, tais como Giemsa, Wright e Panótico (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2006). Os aspirados de medula e linfonodos são os mais usados pelos

clínicos veterinários para diagnosticar a LVC (SILVA, 2007). Mas esses métodos

podem gerar resultados falso-negativos devido ao baixo número de parasitos

contidos nas amostras, especialmente em cães assintomáticos (GOMES et al.,

2008).

Outros métodos parasitológicos consistem na cultura in vitro de fragmentos de

tecidos ou aspirados e na inoculação em animais de laboratório, principalmente

hamsters. Esses testes não são normalmente empregados na rotina, uma vez que

são necessários alguns meses para se verificar a positividade de uma inoculação.

Juntamente com a análise histopatológica de tecidos infectados, esses métodos

carecem de sensibilidade e aplicabilidade em campo, além de serem bastante

invasivos (QUINNELL et al., 2009).

28

2.1.4.2 Diagnóstico Sorológico

No Brasil, a eliminação de cães infectados é recomendada pelo Ministério da

Saúde como medida de controle da LV, por isso um diagnóstico de baixo custo e

alta confiabilidade é necessário para a triagem desses reservatórios. Com a intenção

de se evitar o uso de métodos invasivos e considerando que a resposta humoral na

LVC é geralmente muito intensa, com altos níveis de imunoglobulinas, o diagnóstico

passou a ser focado em métodos sorológicos. (ALVAR et al., 2004; GOMES et al.,

2008).

Entretanto, os testes sorológicos devem ser interpretados com cautela, uma

vez que não são 100% sensíveis e específicos e falham em detectar cães infectados

no período pré-patente da doença (FERRER et al., 1995). Animais com menos de 3

meses de idade não devem ser avaliados por meio de métodos sorológicos, pois

podem apresentar resultados positivos pela presença de anticorpos maternos

(BRAGA et al., 1998).

Os testes sorológicos de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e

Ensaio Imunoenzimático (ELISA) representam os principais instrumentos usados no

sorodiagnóstico da LVA humana e canina, uma vez que são empregados nos

programas nacional e estadual de vigilância e controle da LVA (PVCLVA) para

identificação de reservatórios infectados (CAMARGO-NEVES et al., 2006;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Entretanto, apesar da doença estar associada,

habitualmente, a apenas uma espécie de parasito, L. (L.) i. chagasi – o que,

teoricamente, deveria facilitar a padronização de um antígeno específico para ser

usados nesses testes –, ainda hoje não existe um consenso na literatura

especializada quanto ao emprego de um antígeno para o uso no sorodiagnóstico da

LVA humana e canina (LAURENTI, 2009).

A comparação da reatividade entre as técnicas de RIFI e ELISA no

sorodiagnóstico da LVA canina no Estado do Pará, utilizando amastigotas de L. (L.)

i. chagasi preparadas no Instituto Evandro Chagas, por aposição de fragmentos de

baço de hamster infectado cronicamente, e os kits da Biomanguinhos® mostrou

soropositividade de 8,5% pela RIFI Biomanguinhos® e 0% pela RIFI com

29

amastigotas, diferença estatisticamente significante. O ELISA Biomanguinhos®

mostrou reação positiva em 4,2% das amostras (p<0,05). Considerando que na área

estudada não há relatos da ocorrência de LVA humana e canina, ao contrário da

situação da leishmaniose tegumentar americana, a qual tem elevada incidência,

concluiu-se que o teste da RIFI utilizando amastigotas de L. (L.)i. chagasi como

antígeno foi mais específico, pois não apresentou qualquer resultado falso positivo.

É possível que as taxas de 8,5% e 4,2% de soropositividade obtidas com a RIFI e

ELISA Biomanguinhos®, respectivamente, representem reações cruzadas de cães

infectados com leishmanias dermatrópicas (DE JESUS et al., 2003).

2.1.4.3 Teste Intradérmico de Montenegro

Os cães que têm uma infecção progressiva manifestada como doença têm

uma resposta celular deprimida para antígenos de Leishmania expressos por

nenhuma resposta celular aparente ou pouca resposta em ensaios de estimulação

celular, enquanto estiverem clinicamente saudáveis os cães infectados são

considerados "resistentes”, devido à presença de uma resposta celular demonstrável

(BANETH et al., 2008). O teste intradérmico, é o ensaio que avalia a resposta celular

anti-Leishmania e que pode ser utilizado para prever a susceptibilidade ou

resistência à infecção em um futuro próximo (DOS-SANTOS et al., 2008). No

entanto, este teste está disponível somente em pesquisa laboratorial e precisa de

uma maior padronização (MAIA; CAMPINO, 2008).

2.1.5 Estratégias de controle da leishmaniose visce ral

O controle da LV tem contado com a detecção e o tratamento de casos

humanos, pulverização de inseticida residual e remoção da fonte de infecção com a

eutanásia de cães infectados. O tratamento da infecção canina não é considerado

30

um método útil de controle, devido à elevada taxa de fracasso do tratamento,

embora o tratamento em massa ter sido associado com um declínio na incidência

em um estudo observacional (GRADONI et al., 1988).

Onde o número de casos tem sido alto, uma combinação de eutanásia dos

cães e pulverização de inseticida foi relatado por ter sido bem sucedida, por

exemplo, na China e em algumas regiões do Brasil (ZHI-BIAO, 1989). No entanto, o

aumento do número de casos humanos no Brasil, apesar da eutanásia de um

grande número de cães infectados e a pulverização de inseticida, tem levado a uma

reavaliação dos métodos de controle (COSTA; VIEIRA, 2001; OLIVEIRA et al.,

2008).

Costa (2011) afirma que, apesar de ser uma medida muito controversa, o

governo brasileiro abate cães soropositivos regularmente para controlar a LVC. Este

autor apresenta uma revisão crítica, analisando as ações para o controle do

reservatório canino, aventando que não foram encontradas evidências do risco

conferido por cães para os seres humanos, destacando a falta de apoio científico à

política de eliminação dos cães e chamando atenção para uma tendência para

distorção dos dados científicos para o suporte da política de eliminação dos animais.

Conclui ainda que, uma vez que não existem evidências de que o abate de cães

diminui a transmissão da leishmaniose visceral, o programa de eliminação dos cães

deve ser abandonado como estratégia de controle da LVC.

Em 2010, o Ministério da Saúde deu início a um estudo em vinte municípios,

sobre e efetividade da utilização em massa da coleira impregnada com o princípio

repelente e inseticida (deltrametrina a 4%) contra a LVC, o que representa a adoção

da política sugerida pela UIPA (União Internacional Protetora dos Animais) em

representação oferecida ao Ministério Público Federal, que solicitou providências

contra a matança de cães, como medida de controle da LVC. O encoleiramento em

grande escala produz o denominado efeito rebanho, que é a extensão de efeito

protetor também aos não encoleirados, reduzindo - se a força de infecção pela

barreira imposta pela coleira. Além disso, reduz a pulverização de inseticidas,

prejudiciais ao meio ambiente, além de representar gastos bem menores do que os

desprendidos com a eliminação da vida de animais (ORLANDI, 2011).

31

2.1.6 Tratamento da leishmaniose visceral canina

A leishmaniose canina é mais resistente ao tratamento do que a leishmaniose

humana; apenas alguns animais são considerados totalmente curados e as recidivas

são frequentes. Dentre as drogas indicadas, destacam-se o antimoniato de n-

metilglucamina, alopurinol, combinações dos dois, anfotericina B, pentamidina,

aminosidina e miltefosine (SALZO, 2008). Muitos protocolos apresentam significativa

porcentagem de sucesso em redução dos sinais clínicos, mas poucos são avaliados

quanto à cura dos animais tratados (BANETH, 2006). O antimoniato de n-

metilglucamina é o medicamento utilizado como primeira escolha na terapêutica da

leishmaniose humana. É eficaz no tratamento da leishmaniose cutânea,

mucocutânea e visceral, provocando uma regressão rápida das manifestações

clínicas e hematológicas da doença, bem como a esterilização do parasita (RATH et

al., 2003).

Segundo Ribeiro (2007), até a década de 1990 acreditava-se que o

tratamento da LVC não era viável, devido à sua elevada toxicidade. Os primeiros

relatos de sucesso no tratamento da LVC no Brasil registram a utilização de

antimoniato de n-metilglucamina pela via intra-venosa (RIBEIRO, 2007). Desde

então, novas drogas têm sido produzidas com vistas à obtenção de melhores índices

de cura. Entretanto, ainda não existe protocolo terapêutico altamente efetivo, que

permita a reintrodução segura dos animais no domicílio, sem riscos de infecção para

os proprietários e contactantes (RIBEIRO, 2007).

O mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes como o antimoniato de

n-metilglucamina, se baseia no bloqueio do metabolismo do parasita por meio da

inibição da enzima fosfofrutoquinase, enzima chave da gluconeogênese, o que leva

o parasita à morte (RIBEIRO, 2007). Este autor cita que no Brasil, a produção do

antimoniato de n-metilglucamina é distribuída exclusivamente para o Ministério da

Saúde (MS), não havendo, portanto, disponibilidade do produto para uso em cães.

Dessa forma, é proibido o uso desse produto para o tratamento da LVC, quando o

mesmo for de distribuição do MS; diferentemente da Europa, onde o mesmo é

32

distribuído para uso veterinário, como terapêutica da LVC. Na Espanha, o

antimoniato de n-metilglucamina é o medicamento de eleição para o tratamento da

LVC. Este é utilizado como solução injetável (Glucantime®). Não há indícios que o

uso deste medicamento veterinário venha a prejudicar o uso da versão humana do

medicamento, pois a sua longa utilização na Espanha não demonstrou isto

(BARRETTO, 2006).

A melhor via de aplicação é a subcutânea, que alcança o maior nível sérico

cinco horas após a administração, mantendo níveis terapêuticos durante doze horas.

Recomenda-se aplicação subcutânea em locais alternados, seguida por compressas

mornas, para minimizar o desconforto e a formação de edemas (RIBEIRO;

MICHALICK, 2001). É contra-indicado para animais com nefropatias, pois é

nefrotóxico e possui excreção renal. Seus efeitos secundários podem se manifestar

sob forma de febre, tosse, mialgia, artralgias, alterações gastrintestinais, apatia,

inapetência, alterações hepáticas e renais e, com menor frequência,

cardiotoxicidade, uveíte ou ceratoconjuntivite, consideradas reações alérgicas ao

parasita (RIBEIRO, 2007). Ribeiro e Michalick (2001) recomendam doses variando

entre 50 a 75 mg/kg, duas vezes ao dia (BID), pela via subcutânea, durante 21 a 30

dias.

O alopurinol tem mecanismo de ação que consiste na incorporação ao RNA

do parasita, alterando sua síntese protéica, inibindo sua multiplicação e,

posteriormente, levando-o à morte. Tem baixa toxicidade, é utilizado por via oral e

pode ser administrado isoladamente ou combinado a outros fármacos. Embora de

baixa toxicidade, tem sido relatados febre, leucopenia, distúrbios cutâneos e

elevações de enzimas de baixa intensidade. A dose recomendada é de 10 a 20

mg/kg BID, via oral, apresentando boa disponibilidade no cão (RIBEIRO;

MICHALICK, 2001). Barretto (2006) citou que pesquisas realizadas na Espanha,

obtiveram resultados negativos no xenodiagnóstico de 85% dos cães tratados com a

associação de antimoniais e o alopurinol.

As tentativas de tratamento da LVC, por meio de drogas tradicionalmente

empregadas, como o antimoniato de n-metilglucamina, o alopurinol, cetoconazol,

fluconazol, miconazol, itraconazol e anfotericina B, têm tido baixa eficácia. Com

relação ao antimoniato de n-metilglucamina, a dosagem recomendada para o

33

tratamento canino é aproximadamente dez vezes maior que o recomendado para o

tratamento humano. O uso rotineiro de drogas em cães induz à remissão temporária

dos sinais clínicos, não previne a ocorrência de recidivas, tem efeito limitado na

infectividade de flebotomíneos e leva ao risco de selecionar parasitas resistentes às

drogas utilizadas. Portanto, para este autor, o tratamento canino não tem

apresentado eficácia e nem diminuído a importância do cão como reservatório da

leishmania (LUNA, 2004).

Uma Portaria Interministerial baixada pelo Governo Federal, de número 1.426,

de 11 de julho de 2008, proíbia os médicos veterinários de realizarem tratamento da

LVC em cães infectados ou doentes, com produtos de uso humano ou não

registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Esta

conduta interministerial se opõe há alguns trabalhos científicos, que vem

demonstrando que os cães em tratamento apresentam, pela prova de

imunohistoquímica de pele, sucessivos resultados negativos, não oferecendo riscos

para a saúde pública. E é com base em conhecimentos como este que a

leishmaniose visceral canina é tratada em diversos países. Na Europa, por exemplo,

um laboratório comercializa o Glucantime® veterinário específico para uso em cães,

outro laboratório lançou, o Milteforan® (esta empresa aguarda resposta para o seu

pedido de registro deste medicamento no Brasil), e uma empresa de produtos

veterinários possui na sua linha de alimentos sob prescrição médico veterinária, uma

ração, específico para cães com LVC. Por estes motivos, esta portaria gerou uma

situação de conflito entre os respectivos ministérios e a Associação Nacional de

Clínicos Veterinários de Pequenos Animais (ANCLIVEPA) (BARRETTO, 2008b), o

que levou esta portaria a ser revogada em janeiro de 2013 pelo Tribunal Regional

Federal da 3ª Região.

A inexistência de tratamento efetivo para a cura total da doença canina, e a

polêmica sobre a eliminação indiscriminada dos cães infectados, tornam urgente a

adoção de novas estratégias, como por exemplo, a produção de uma vacina efetiva

contra a LVC (SCHIMMING; PINTO; SILVA, 2012).

34

MATERIAISMATERIAISMATERIAISMATERIAIS E MÉTODOSE MÉTODOSE MÉTODOSE MÉTODOS

35

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Área

Este estudo foi conduzido na vila Santana do Cafezal, localizada às margens do

rio Cafezal, município de Barcarena (01o30’21’’S 48o37’36’’W), no nordeste do

Estado do Pará, estando a uma altitude de 15 metros em relação ao nível do mar. O

município é um importante pólo industrial, onde é feita a industrialização,

beneficiamento e exportação de caulim, alumina e alumínio, e a economia tem base

na agricultura, mas também avança com as indústrias instaladas na cidade. O clima

é tipicamente equatorial, com temperatura média de 28oC e alta umidade. A estação

chuvosa nessa região é de cerca de 2.500 mm ou mais, cujo período vai de janeiro a

junho. A floresta primária da região já foi quase totalmente destruída, restando

apenas plantações em meio à floresta secundária. Aproximadamente, 70% dos

habitantes residem em área de terra firme e o restante em área de várzea, área de

vegetação baixa inundada duas vezes ao dia pelas águas do rio Cafezal (SILVEIRA

et al. 2009) (Figura 1).

Figura 1 - Vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará

Fonte: Google Maps, adaptado (https://www.google.com.br/maps/@-1.5406389,-48.7635587,11z)

36

3.2 População do estudo

A população do estudo consistiu de uma coorte de 316 cães de raça não

definida, sendo 172 (54,4%) machos e 144 (45,6%) fêmeas, com idades variando

entre 6 meses e 15 anos, com média de 2 anos e 3 meses, caracterizando uma

população relativamente jovem.

3.3 Desenho do estudo

Considerando que o presente estudo objetivou analisar a prevalência e a

incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi, assim como, a dinâmica da

evolução clínica e imunológica da infecção, foi necessário realizar um estudo

prospectivo com o propósito de acompanhar uma coorte de 316 cães em área

endêmica de LVA durante período de dois anos (agosto/2012-julho/2014). Desse

modo, visando o diagnóstico laboratorial da infecção, foram realizadas a reação

intradérmica de Montenegro (RIM), a reação de imunofluorescência indireta (RIFI-

IgG), e o exame parasitológico em todos os cães selecionados para avaliação da

prevalência, assim como, das três incidências subsequentes aos 6, 12 e 24 meses

do estudo. Assim sendo, para avaliação das três incidências, estes procedimentos

laboratoriais só foram realizados naqueles animais negativos na prevalência e nas

duas incidências (6 e 12 meses). Neste sentido, nos cães com reatividade para a

RIM, a qual está relacionada ao caráter imune-genético de resistência contra a

infecção (DOS SANTOS et al., 2008), este procedimento não foi realizado

novamente nos mesmos animais nas intervenções subsequentes, já que foi

assumido que este caráter imune-genético é permanente para toda a vida. Além

disso, nos cães com reatividade para ambos os testes, apenas a RIFI-IgG foi

realizada novamente, já que esta não necessita injetar nova carga antigênica como

na RIM. Finalmente, nos cães com reatividade somente pela RIFI-IgG, a qual, ao

contrário da RIM, representa um estado imune-genético de susceptibilidade à

37

infecção, foi necessário a realização dos dois testes nas avaliações subsequentes

objetivando analisar a evolução das duas respostas imunes, humoral (RIFI-IgG) e

celular (RIM). Com respeito ao exame parasitológico, este procedimento só foi

repetido enquanto o resultado era negativo.

Objetivando um melhor entendimento da dinâmica da evolução clínico-

imunológica nos cães infectados, sintomáticos e assintomáticos, a população foi

estratificada em três grupos etários: i) menores (<) de 1 ano, ii) maiores ou igual (≥)

a 1 ano e menores (<) de 7 anos, iii) maiores ou igual (≥) a 7 anos, consistindo de

70, 234 e 12 animais, respectivamente.

3.4 Critérios de identificação da infecção canina

Considerando que a RIFI-IgG evidencia resposta imune humoral

(susceptibilidade) e a RIM resposta imune celular (resistência) (PINELLI et al., 1994;

MAIA; CAMPINO, 2008), a definição de caso canino da infecção por L. (L.) i. chagasi

foi assumida com a presença de reatividade para um ou ambos os testes

imunológicos, associados ou não à positividade do exame parasitológico.

Desse modo, foi assumido que reações sorológicas (RIFI) a partir do título 80

(IgG) e reações intradérmicas (RIM) formando pápulas ou indurações ≥ 5 mm de

diâmetro foram consideradas positivas (“cut-off”) para RIFI-IgG e RIM,

respectivamente (DE JESUS et al., 2003; BALEEIRO et al., 2006; PINHEIRO et al.,

2009).

3.5 Critérios de avaliação clínica da infecção

Antes da realização dos procedimentos (RIM e RIFI-IgG) com vistas ao

diagnóstico laboratorial da infecção canina por L. (L.) i. chagasi, é importante

salientar que todos os cães passaram por avaliação clínica em todas as etapas

38

deste estudo, tanto no momento da prevalência, como também, das incidências aos

6, 12 e 24 meses, buscando-se identificar possíveis sinais que pudessem ser

relacionados à infecção. Desse modo, foram considerados assintomáticos os

animais que não apresentaram sinais suspeitos de LVC, e sintomáticos àqueles que

manifestaram sinais clínicos (MANCIANTI et al., 1988). Os principais sinais

considerados na avaliação foram os seguintes: alopecia e ulcerações na pele,

conjuntivite, onicogrifose, perda de peso, apatia, anorexia, caquexia, fraqueza, e

linfadenopatia (MOREIRA et al., 2007). A avaliação clínica de cada animal foi

registrada em ficha clínica elaborada para este fim (Anexo A) e executada por

profissional médico veterinário. Desse modo, embora esta abordagem clínica pareça

de valor limitado, o seu emprego tem sido frequentemente observado em

investigações de natureza clínico-imunológica para caracterizar o espectro clínico da

infecção canina por L. (L.) infantum ou L. (L.) i. chagasi nos continentes europeu e

americano, respectivamente (CARDOSO et al., 2007; ALVES et al., 2009; REIS et

al., 2009; MOREIRA et al., 2010; SANTARÉM et al., 2010).

3.6 Coleta de amostras de tecido

Antes da coleta dos tecidos, sangue venoso e aspiração do linfonodo poplíteo, os

cães eram contidos fisicamente, em seguida, eram feitas punção na veia cefálica ou

veia safena lateral para obtenção de sangue venoso (2,0 ml) e posterior separação

do soro para ser armazenado a -200C até a realização da RIFI-IgG, e a aspiração do

linfonodo poplíteo para ser feita a comprovação parasitológica da infecção por meio

da semeadura em meio de cultura Difco B45 (WALTON et al., 1977) (Figuras 2 e 3).

39

Figura 2 - Coleta de sangue através de punção da veia safena lateral do cão

. Fonte: Arquivo pessoal

Figura 3 - Aspiração do linfonodo poplíteo do cão

Fonte: Arquivo pessoal

3.7 Critérios para definição de óbito por LVC, outr os agravos e perdas

Para definição de óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi, foi

considerado cão preferencialmente sintomático, apresentando sinais clínicos

sugestivos da doença, com resultado sorológico (RIFI-IgG) fortemente positivo (≥

640), RIM negativo e, no caso de animais cujo estado clínico era assintomático, que

o óbito tenha ocorrido há, pelo menos, quatro meses após o diagnóstico

(CARNEIRO, observação pessoal). Nesse sentido, do total de 38 cães que foram ao

óbito durante o estudo, faz-se importante mencionar que 31 (81,5%) foram

40

resgatados pelos agentes comunitários de saúde (ACS) do programa saúde da

família (PSF) do município, submetidos à necropsia e posterior exame

imunohistoquímico das vísceras (baço e fígado) com anticorpo policlonal contra

Leishmania sp., cujo resultado confirmou a etiologia leishmaniótica em 28 (90,3%),

conforme trabalho prévio (LIMA et al., 2010). Entretanto, nos três cães cujo resultado

foi negativo pelo exame imunohistoquímico, assim como, pela RIFI (IgG) e RIM, foi

assumido que o óbito deva ter ocorrido por outro agravo. Além disso, nos casos em

que o animal não foi mais localizado, por mudança de endereço do proprietário ou

outro motivo, foi considerado como perda definitiva do estudo.

3.8 Procedimentos dos testes imunológicos

A realização da RIM seguiu os mesmos procedimentos técnicos descritos por

Baleeiro et al. (2006), porém, no presente projeto foi usado antígeno, espécie-

específico, de L. (L.) i. chagasi (MCAO/BR/2003/M22697/Barcarena, estado do

Pará) constituído de formas promastigotas de fase estacionária de cultivo

(RPMI1640), na concentração de 4 x 107/0.1 ml, ou seja, 40 vezes mais concentrado

do que o antígeno usado em humanos (SILVEIRA et al., 1991, 1998). As formas

promastigotas do parasito foram fixadas com solução de mertiolate (1/10.000), razão

pela qual foi usada como controle do antígeno uma dose igual de solução de

mertiolate (1/10.000) para ser injetada, intradermicamente, na face interna da coxa

oposta de cada animal. A leitura das reações intradérmicas nos animais foram feitas

após 48 horas da injeção, e as reações com eritema e/ou induração ≥ 5 mm de

diâmetro foram consideradas positivas (Figura 4).

A realização da RIFI se baseou em experiência prévia (DE JESUS et al.,

2003), a qual demonstrou que o antígeno de formas amastigotas de L. (L.) i. chagasi

apresentou maior sensibilidade e especificidade do que os antígenos de

promastigota de Leishmania sp. e antígeno de L. major dos kits comerciais para RIFI

e ELISA, respectivamente, utilizados atualmente como padrão. Em resumo, o

antígeno de forma amastigota foi impregnado na superfície da lâmina da RIFI

41

através da impressão de pequenos fragmentos de fígado e baço de “hamster”

(Mesocricetus auratus) infectado com o parasito (CRESCENTE et al., 2009;

SILVEIRA et al., 2009).

Figura 4 - Teste intradérmico de Montenegro

Fonte: Arquivo pessoal

3.9 Procedimento do exame parasitológico

Para evidenciação do agente etiológico da infecção canina por Leishmania (L.) i.

chagasi, foi realizada punção aspirativa do linfonodo poplíteo de cada animal

examinado, cujo conteúdo foi utilizado para fins de isolamento do parasito em meio

de cultura Dfico B45 (WALTON, 1977).

3.10 Análise dos dados

Os dados obtidos foram analisados estatisticamente pelo percentual simples, a

fim de serem obtidas as taxas de prevalência e incidências (6, 12 e 24 meses). Os

resultados foram tabulados e confrontados pelo teste do Qui-quadrado (χ2), cujos

escores amostrais foram mensurados admitindo-se nível de significância (α) de 0,05

para rejeição da hipótese de nulidade (p≤ α) implementado pelo programa Bio-Estat

42

5.0 (AYRES et al. 2007); para valores menores que cinco foi implementado o teste

G. Em ambos os testes, quando as tabelas de contingência apresentavam somente

um grau de liberdade, foi aplicada a correção de Yates e Teste-G (Williams),

respectivamente.

Os dados da evolução clínica foram analisados também pelo teste Atuarial, que

consiste na observação do grupo de cães em períodos divididos de tempo

constante, o qual nos forneceu ao final um número que corresponde ao tempo

provável para que um cão assintomático pudesse desenvolver sintomas. Para isso,

utilizamos as três colunas de dados, onde número de doentes correspondeu ao

número de animais soropositivos nas incidências, a coluna ocorrências

correspondeu ao número de animais que converteram de assintomáticos para

sintomáticos, e os animais censurados foram aqueles excluídos do estudo ou que

foram a óbito, implementado pelo programa Bio-Estat 5.0 (AYRES et al., 2007).

Para as variáveis de evolução a óbito, foi aplicado o quociente do Risco Relativo

(RR) a fim de obter a proporção de incidência de óbitos nas populações caninas dos

diferentes perfis de resposta imunológica, admitindo para significância estatística p

valor <0,05 e intervalo de confiança 95% (IC95%) do RR não incluindo a unidade,

implementado pelo programa Bio-Estat 5.0 (AYRES et al., 2007).

Os gráficos foram elaborados pelo programa GraphPadPrism 6.0 para Windows

(GraphPad software, San Diego, CA, USA) e pelo Microsoft Office Excell 2007.

3.11 Aprovação do Comitê de Ética de Uso Animal (CE UA)

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e pela

Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Evandro Chagas.

43

RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS

44

4 RESULTADOS


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil

A prevalência total da infecção canina foi de 35,1% (111/316), porém,

considerando-se os casos diagnosticados somente pela RIFI-IgG (perfil imunológico

I: RIFI+/RIM-) foi de 25,6% (81/316), enquanto que somente pela RIM (perfil

imunológico II: RIFI-/RIM+) foi de 5,4 (17/316), e por ambos os testes (perfil

imunológico III: RIFI+/RIM+) foi de 4,1% (13/316) (Figura 5).

Figura 5 - Prevalência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil. *(p) = <0.0001

45

4.2 Distribuição dos perfis imunológicos da infecçã o canina por L. (L.) i.

chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasi l, por ocasião

da prevalência

A distribuição dos perfis imunológicos da infecção por ocasião da prevalência

(111 cães infectados em 316 examinados) revelou que o perfil I (RIFI+/RIM-) (73%)

foi mais frequente (P<0.05) que os perfis II (RIFI-/RIM+) (15,3%) e III (RIFI+/RIM+)

(11,7%) (Figura 6).

Figura 6 - Distribuição dos perfis imunológicos da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, por ocasião da prevalência. *(p) = <0.0001


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a f aixa etária

Considerando a faixa etária dos cães portadores da infecção por L. (L.) i.

chagasi, foi visto que a prevalência da infecção na faixa ≥1ano <7anos foi de 27,5%

46

(87/316), maior (P< 0,05) que aquelas observadas nas faixas <1ano de 5,3%

(17/316), e ≥7 anos de 2,2% (7/316) (Figura 7).

Figura 7- Prevalência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a faixa etária. *(p) = <0.0001


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil

A primeira incidência da infecção, estimada aos seis meses do estudo, foi de

3,6% cães/mês (45 casos novos/205 cães não infectados da prevalência), estando

representada por 3,4% cães/mês (42/205) somente pela RIFI-IgG (perfil I), sendo

maior (P< 0,05) que aquela de 0,2% cães/mês (3/205) somente pela RIM (perfil II),

não havendo nenhum caso diagnosticado por ambos os testes (perfil III). Por outro

lado, a distribuição desses perfis revelou, novamente, uma frequência maior

(P<0.05) do perfil I (93,3%-42/45) sobre o perfil II (6,7%-3/45) (Figura 8).

A segunda incidência da infecção, estimada aos 12 meses do estudo, foi de 1,7%

cães/mês (16 casos novos/158 cães não infectados resultantes da primeira

incidência), sendo representada por 1,6% cães/mês (15/158) diagnosticados

somente pela RIFI-IgG (perfil I), também maior (P< 0,05) que aquela de 0,1%

47

cães/mês (1-158) somente pela RIM (perfil II), não havendo nenhum caso

diagnosticado por ambos os testes (perfil III). A distribuição dos perfis mostrou,

igualmente, maior (P<0.05) frequência do perfil I (93,7%-15/16) sobre o perfil II

(6,3%-1/16) (Figura 8).

A terceira incidência da infecção, estimada aos 24 meses do estudo, foi de 0,4%

cães/mês (sete casos novos/136 cães não infectados resultantes da segunda

incidência), sendo também de 0,4% cães/mês (7/136) somente pela RIFI-IgG (perfil

I), confirmando ser o perfil com a maior frequência da infecção (Figura 8).

Assim sendo, a incidência geral da infecção canina por L. (L.) i. chagasi no

período foi de 5,7% cães/mês (5,4% cães/mês/perfil I, 0,3% cães/mês/perfil II e 0,0%

cães/mês/perfil III). Por outro lado, considerando-se as estimativas pontuais,

percebeu-se que houve um declínio progressivo (P<0.05) na incidência da infecção

observada aos seis (3,6% cães/mês), 12 (1,7% cães/mês) e 24 meses (0,4%

cães/mês) do estudo (Figura 8).

Figura 8 - Incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil. *(p) = <0.0001


Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a f aixa etária

48

Considerando a faixa etária dos cães portadores da infecção, notou-se que, por

ocasião dos seis primeiros meses do estudo, a incidência da infecção na faixa etária

<1ano, de 4,8% cães/mês (13 casos novos/45 cães não infectados), foi maior (P<

0.05) que aquelas obtidas nas faixas ≥ 7anos, de 3,3% cães/mês (um caso novo/5

cães não infectados), e ≥1ano <7anos, de 3,1% cães/mês (26 casos novos/141 cães

não infectados) (Figura 9).

No período seguinte, de seis a doze meses do estudo, a incidência maior (P<

0.05) da infecção foi observada na faixa ≥1ano <7anos, 1,9% cães/mês (13 casos

novos/115 cães não infectados), seguida da faixa <1ano, 1% cães/mês (dois novos

casos/32 cães não infectados), enquanto na faixa ≥7 anos, não registro de casos

novos da infecção (Figura 9).

No terceiro período do estudo, de 12 a 24 meses, a incidência da infecção na

faixa <1ano, de 0,8% cães/mês (3 novos casos/30 cães não infectados), foi maior

(P< 0.05) que aquela na faixa ≥1ano <7anos, de 0,3% cães/mês (4 casos novos/102

cães não infectados), enquanto não houve registro de casos da infecção na faixa de

≥7anos (Figura 9).

Desse modo, a incidência geral da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na faixa

de <1ano, 6,6% cães/mês, foi maior (P<0.05) que aquelas nas faixas de ≥1ano

<7anos, 5,3% cães/mês, e de ≥7anos, 3,3% cães/mês (Figura 9).

49

Figura 9 - Incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a faixa etária

4.6 Distribuição dos perfis imunológicos da infecçã o canina por L. (L.) i.

chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasi l, de acordo com

a faixa etária

A distribuição geral dos perfis imunológicos da infecção, segundo a faixa de

idade dos cães, mostrou que o perfil I apresentou frequência maior (P< 0.05) de

cães na faixa etária ≥1ano <7anos (79%), seguida da faixa <1ano (14,8%) e, da

faixa ≥7anos (6,2%). No caso do perfil II, mais uma vez a frequência maior (P< 0.05)

de cães foi detectada na faixa etária ≥1ano <7anos (64,8%), seguida da faixa <1ano

(23,5%) e, da faixa ≥7anos (11,7%). Finalmente, em se tratando do perfil III, a faixa

etária ≥1ano<7 anos somou também a frequência mais alta (P< 0.05) de cães com

este perfil (92,3%), seguida da faixa de <1ano (7,7%), não havendo registro de cães

na faixa ≥7anos (Figura 10).

50

Figura 10 - Distribuição dos perfis imunológicos da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com a faixa etária. *(p) = <0.0001

4.7 Diagnóstico parasitológico da infecção canina p or L. (L.) i. chagasi na vila

Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil

O diagnóstico parasitológico da infecção canina possibilitou a confirmação

etiológica da infecção em 19% (21/111) dos cães diagnosticados por ocasião da

prevalência, a maioria (85,7%) portadores do perfil I, dos quais 61,1% (11/18) eram

sintomáticos (P< 0.05) e 38,9% (7/18) assintomáticos. Nos 14,3% restantes, a

confirmação etiológica da infecção foi feita nos cães do perfil III, sendo 66,6% (2/3)

assintomáticos (P< 0.05) e 33,3% (1/3) sintomáticos. Por ocasião da incidência, o

diagnóstico parasitológico da infecção foi confirmado em 11% (5/45) dos casos

novos, sendo quatro na primeira incidência e um na segunda, todos (100%)

portadores do perfil I, 60% (3/5) assintomáticos (P< 0.05) e 40% (2/5) sintomáticos

(Figura 11).

51

Figura 11 - Diagnóstico parasitológico da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil. *(p) = <0.0001; + (p) = <0.05

4.8 Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do

Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o p erfil imunológico

Por ocasião da prevalência, foi observado que, dos 81 cães portadores do perfil I,

74% (60/81) eram assintomáticos (P< 0.05) e 26% (21/81) sintomáticos; dos 17 cães

portadores do perfil II, 100% (17/17) eram assintomáticos e, portanto, nenhum

sintomático; dos 13 cães portadores do perfil III, 84,6% (11/13) eram assintomáticos

(P< 0.05) e 15,4% (2/13) sintomáticos. Desse modo, os três perfis imunológicos da

infecção geraram, por ocasião da prevalência, uma taxa de 79,3% (88/111) de cães

assintomáticos, maior (P< 0.05) que aquela de 20,7% (23/111) de cães sintomáticos

(Figura 12).

No momento da primeira incidência, estimada aos seis meses do estudo, foi

observado que, dos 42 cães portadores do perfil I, 92,8% (39/42) eram

assintomáticos (P< 0.05) e 7,2% (3/42) sintomáticos; dos três cães portadores do

52

perfil II, 100% (3/3) eram assintomáticos e, consequentemente, nenhum sintomático;

não houve caso diagnosticado por ambos os testes (perfil III) (Figura 13).

Por ocasião da segunda incidência, observada aos 12 meses do estudo, notou-

se que, dos 15 cães portadores do perfil I, 86,7% (13/15) eram assintomáticos (P<

0.05) e 13,3% sintomáticos (2/15); enquanto 100% (1/1) dos cães portadores do

perfil II eram assintomáticos; além disso, não houve registro de caso do perfil III

(Figura 13).

Por último, durante a terceira incidência, determinada aos 24 meses do estudo,

percebeu-se que, dos sete cães portadores do perfil I, 100% (7/7) eram

assintomáticos, não havendo registro de casos dos perfis II e III da infecção (Figura

13).

Figura 12 - Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imunológico, por ocasião da prevalência. *(p) = <0.0001

53

Figura 13 - Avaliação clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imunológico, por ocasião da incidência. *(p) = <0.0001

4.9 Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do

Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o p erfil imunológico

Este parâmetro de avaliação considerou o tempo que um cão infectado

assintomático, com diagnóstico da infecção por ocasião da prevalência e da

incidência, portador de um dos três perfis imunológicos: I (RIFI+/RIM-), II (RIM+/RIFI-

) ou III (RIFI+/RIM+), levou para converter-se sintomático até o final do período de

dois anos do estudo. Evidentemente, os cães infectados sintomáticos e aqueles não

infectados, eventualmente sintomáticos por razão de outras patologias, não foram

incluídos nesta análise. Entretanto, antes de apresentarmos os resultados desta

avaliação, faz-se importante lembrar que o número de cães para esta análise variou

por razão da necessidade da eliminação dos animais com diagnóstico parasitológico

positivo da infecção, independentemente do estado clínico do animal.

Desse modo, considerando-se, inicialmente, os cães com diagnóstico da

infecção por ocasião da prevalência, faz-se importante salientar que, dos 60 animais

54

assintomáticos do perfil I, sete foram eliminados por conta do diagnóstico

parasitológico positivo, quatro na prevalência e três ao final dos seis primeiros

meses do estudo, restando, portanto, 53 cães para esta avaliação. Neste sentido, foi

observado que, dos 53 cães assintomáticos do perfil I, 5,7% (3/53) converteram-se

sintomáticos durante os seis primeiros meses que sucederam a prevalência, outros

11,3% (6/53) após 12 meses, e mais 3,8% (2/53) depois de 24 meses, totalizando

uma taxa de conversão clínica de 20,8%. Por outro lado, dos 17 cães assintomáticos

do perfil II, 5,8% (1/17) tornaram-se sintomáticos depois de 24 meses do estudo, e

dos 11 cães assintomáticos do perfil III, 9% (1/11) converteram-se sintomáticos após

12 meses (Figura 14). Assim sendo, foi possível observar uma taxa de conversão

maior (P< 0.05) nos cães do perfil I (20,8%) comparada com aquelas dos perfis II

(5,8%) e III (9%) durante os dois anos do estudo. Além disso, observou-se, também,

que os poucos cães assintomáticos dos perfis II (1) e III (1) levaram período maior

de tempo, 24 e 12 meses, para converterem-se sintomáticos do que aqueles do

perfil I, os quais apresentaram sinais da conversão clínica da infecção em todas as

avaliações, aos 6, 12 e 24 meses do estudo.

Por outro lado, com relação aos 45 cães diagnosticados durante a primeira

incidência, 42 eram do perfil I, sendo 39 assintomáticos e três sintomáticos,

entretanto, três dos assintomáticos foram eliminados por motivo do diagnóstico

parasitológico positivo, ficando somente 36 para esta avaliação, dos quais, 11,1 %

(4/36) tornaram-se sintomáticos depois de 18 meses. Ao contrário, dos três cães do

perfil II, todos (100%) permaneceram assintomáticos até o final do estudo (Figura

15).

Por último, considerando-se os 16 cães diagnosticados na segunda incidência,

notou-se que, dos 13 assintomáticos do perfil I, um foi eliminado com diagnóstico

parasitológico positivo, ficando 12 para esta avaliação, dos quais apenas 8,3%

(1/12) tornaram-se sintomáticos até o final do estudo. Com relação ao único cão

assintomático do perfil II, notou-se que esse animal conservou seu estado clínico até

o final do estudo (Figura 15).

Em resumo, comparando-se as taxas totais da conversão clínica dos cães

assintomáticos em sintomáticos dos perfis I, II e III, verificou-se que a taxa do perfil I

(40,2%) foi maior (P< 0.05) que aquelas dos perfis II (5,8%) e III (9%) (Figura 16). De

55

outro modo, significa dizer que um cão assintomático do perfil I possui chance de

desenvolver sintomas em um período de 1,4 semestres, enquanto um cão

assintomático do perfil II possui chance de desenvolver sintomas em um período de

4,5 semestres.

Figura 14 - Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imunológico, por ocasião da prevalência. *(p) = <0.0001

Figura 15 - Evolução clínica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imunológico, por ocasião da incidência. *(p) = <0.0001

56

Figura 16 - Taxas totais da conversão clínica dos cães assintomáticos em sintomáticos dos perfis imunológicos. *(p) = <0.0001

4.10 Conversão sorológica (RIFI-IgG) e da reação in tradérmica de Montenegro

(RIM) na infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal,

Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imu nológico

Dos 81 (73%) cães do perfil I (RIFI+/RIM-) diagnosticados na prevalência (111

casos da infecção), apenas 3,7% (3/81) converteram à RIM(+), sendo dois ao final

dos seis primeiros meses do estudo e um depois de 24 meses. Neste caso, todos os

animais faziam parte da faixa etária ≥1 ano <7 anos e, antes da conversão, dois

apresentavam títulos sorológicos (RIFI-IgG) de 320-640 (reator moderado) e um

≥1280 (reator forte) (Figura 17).

Dos 17 (15,3%) cães do perfil II (RIM+/RIFI-) diagnosticados na prevalência (111

casos da infecção), a maioria (82,3%-14) converteu a reação sorológica (RIFI-IgG),

sendo 11 ao final dos seis primeiros meses e três nos seis meses subsequentes (12

meses), com títulos sorológicos de diferentes amplitudes: 6 (42,8%) com título forte

(≥1280), 5 (35,7%) com título moderado (320-640), e 3 (21,5%) com título fraco (80-

160). Nesta situação, 64,3% dos cães eram na faixa etária ≥1 ano <7 anos, 28,5%

<1 ano, e 7,2% ≥7 anos (Figura 17).

57

Dos 42 (93,3%) cães do perfil I diagnosticados na primeira incidência (45 casos

da infecção), apenas 2,4% (1/42) converteram a RIM(+) após os seis primeiros meses

do estudo, sendo único cão da faixa etária ≥1 ano <7anos, com título sorológico

(IgG) ≥1280 (reator forte) (Figura 17).

Dos três (6,6%) cães do perfil II diagnosticados na primeira incidência (45 casos

da infecção), 66,6% (2/3) converteram a reação sorológica (RIFI-IgG) após os seis

primeiros meses do estudo, com títulos sorológicos (IgG) de 80-160 (reação fraca),

sendo os dois animais da faixa etária ≥1 ano <7 anos (Figura 17).

Dos 15 (93,8%) cães do perfil I diagnosticados na segunda incidência (16 casos

da infecção), nenhum converteu à RIM(+) até o final do estudo, assim como, o único

(6,2%) animal do perfil II não converteu a reação sorológica até o final do estudo

(Figura 17).

Figura 17 - Conversão sorológica (RIFI-IgG) e da reação intradérmica de Montenegro (RIM) na infecção canina por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil, de acordo com o perfil imunológico, por ocasião da prevalência e incidência. *(p) = <0.0001

58

4.11 Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi,

outros agravos e perdas na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará,

Brasil

Considerando-se, inicialmente, os 60 cães assintomáticos do perfil I na

prevalência, sete foram eliminados por conta do diagnóstico parasitológico positivo,

quatro na prevalência e três ao final dos seis primeiros meses, restando 53 para esta

análise. Assim sendo, observou-se que 15,1% (8/53) morreram durante os seis

primeiros meses; mais 15,1% (8/53) ao fim de 12 meses, enquanto nenhum óbito

ocorreu nos últimos 12 meses, restando, ao final de dois anos, 69,8% (37/53) dos

cães assintomáticos.

Por outro lado, dos 21 cães sintomáticos do perfil I na prevalência, 11 foram

eliminados com diagnóstico parasitológico positivo, dez após a prevalência e um

após os seis primeiros meses, sobrando 10 animais para esta avaliação. Assim

sendo, observou-se que 50% (5/10) morreram durante os seis primeiros meses,

mais 30% (3/10) ao fim de 12 meses, enquanto nenhum animal morreu nos últimos

12 meses, restando somente 20% (2/10) dos cães sintomáticos. Portanto, o óbito no

grupo sintomático (80%-8/10) foi maior (P<0.05) que no grupo assintomático (30,2%-

16/53) (Figura 18), assim como, a sobrevida de cães vivos foi maior (P<0.05) no

grupo assintomático (69,8%-37/53) do que no sintomático (20%-2/10).

Com relação aos 17 cães assintomáticos do perfil II na prevalência, não foi

observado nenhum óbito neste grupo associado à LVC, porém, 23,5% (4/17)

evoluíram para o óbito por causa desconhecida, restando 76,5% (13/17) ao final do

estudo. Desse modo, excluídas as mortes de causa desconhecida (4), 100% (13)

dos cães assintomáticos do perfil II permaneceram vivos até o final do estudo

(Figura 18).

Em se tratando dos 13 cães do perfil III na prevalência, 11 (84,6%) eram

assintomáticos e dois (15,4%) sintomáticos; dos 11 assintomáticos, dois foram

eliminados por conta do diagnóstico parasitológico positivo e um morreu de causa

desconhecida, todos aos 12 meses do estudo, restando oito (72,7%) animais ao final

de 24 meses. Por último, dentre os dois sintomáticos, um foi eliminado por conta do

59

diagnóstico parasitológico positivo e o outro morreu de causa desconhecida, não

havendo possibilidade de análise mais conclusiva deste grupo (Figura 18).

Portanto, o óbito canino devido à infecção por L. (L.) i. chagasi na prevalência

correspondeu a 38% (24/63) de cães exclusivamente do perfil I, sendo mais

frequente (P<0.05) nos cães sintomáticos (80%) do que nos assintomáticos (30,2%),

enquanto a sobrevida nos assintomáticos (69,8%) foi maior (P<0.05) que nos

sintomáticos (20%).

Com relação aos 42 cães portadores do perfil I na primeira incidência, 92,8%

(39/42) eram assintomáticos e 7,2% (3/42) sintomáticos; dentre os assintomáticos,

três foram eliminados com diagnóstico parasitológico positivo e um morreu de causa

desconhecida, ficando 35 para base de cálculo desta análise, dos quais 5,7% (2/35)

morreram após seis meses, permanecendo 94,3% dos animais. No caso dos três

cães sintomáticos, um foi eliminado com diagnóstico parasitológico positivo,

restando dois, dos quais um (50%) morreu após seis meses, e um (50%) continuou

vivo até o final do estudo. Por outro lado, dos três cães com perfil II, 100% (3/3)

eram assintomáticos e nenhum evoluiu para o óbito. Além destes, não houve

registro de caso do perfil III.

Com respeito aos 15 cães portadores do perfil I na segunda incidência, 86,6%

(13/15) eram assintomáticos e 13,4% (2/15) sintomáticos; dos 13 assintomáticos, um

foi eliminado com diagnóstico parasitológico positivo, restando 12 para esta

avaliação, dos quais nenhum morreu após 12 meses de acompanhamento.

Entretanto, dentre os dois cães sintomáticos, 50% (1/2) morreram ao final de 12

meses de evolução. Por outro lado, o único cão assintomático do perfil II

permaneceu vivo até o final do estudo, não havendo caso do perfil III na segunda

incidência (Figura 19).

Desse modo, o óbito canino na incidência ocorreu, mais uma vez, somente nos

cães do perfil imunológico I, principalmente no grupo sintomático, com frequência

(50%) superior (P<0.05) aquela (4,3%) do assintomático. Por outro lado, foi possível

concluir, ainda, que um cão do perfil I possui 34,2 vezes mais chance de morrer do

que um cão do perfil II, baseado na análise do quociente de Risco Relativo (RR).

Além disto, três dos 31 cães que foram resgatados e examinados eram negativos

para RIFI e RIM, assim como, para o exame imunohistoquímico, razão porque foi

60

excluída a possibilidade do óbito desses animais ser atribuído à LVC. Contudo, do

total (38) de cães que evoluíram ao óbito, sete não foram resgatados para exame,

embora todos apresentassem marcadores da infecção, com a seguinte casuística:

um cão do perfil I, quatro do perfil II, e dois do perfil III.

Figura 18 - Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi, outros agravos e perdas, por ocasião da prevalência, na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil. *(p) = <0.0001; ₓ = óbito por outras causas

Figura 19 - Evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi, outros agravos e perdas, por ocasião da incidência, na vila Santana do Cafezal, Barcarena, Pará, Brasil. *(p) = <0.0001

61

DISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃO

62

5 DISCUSSÃO

Este representa o primeiro estudo de natureza prospectiva que acompanhou uma

coorte de 316 cães (54,4% machos e 45,6% fêmeas, com média de idade de 2 anos

e 3 meses), de raça não definida, sob risco de infecção natural por L. (L.) i. chagasi

em área endêmica de LVA no Estado do Pará, Amazônia brasileira, mais

precisamente no município de Barcarena, por período de dois anos (março/2012-

fevereiro/2014), buscando não somente avaliar a prevalência e a incidência da

infecção, sintomática e assintomática, mas, principalmente, a dinâmica da evolução

clínico-imunológica, na tentativa de encontrar respostas para algumas questões

pontuais sobre a LVC que, até o presente, persistem incógnitas na interação do

parasito com a resposta imune do hospedeiro, o cão doméstico.

Entretanto, antes de adentrarmos propriamente na discussão dos resultados do

presente trabalho, faz-se importante salientar a importância que algumas variáveis

próprias da região amazônica do Brasil, como aquelas ligadas ao ambiente, ao clima

e às condições sócio-econômicas das populações humanas residentes na zona

rural, podem exercer na saúde dos animais domésticos que convivem com o

homem, especialmente o cão doméstico. A título de exemplo, cabe citar o moderado

(0,662) Índice de Desenvolvimento Humano (IDH) do município de Barcarena

(PNUD, 2010), no qual, embora exista um importante polo minerador de bauxita do

Brasil, ainda não conseguiu disponibilizar um serviço de saúde e de educação de

níveis satisfatórios, além da sua política econômica que não atende aos anseios de

renda da população, o que, muito possivelmente, se reflete também na qualidade de

vida dos animais domésticos que convivem com o homem nesse lugar. Assim

sendo, faz-se importante dizer que os resultados do presente estudo podem estar

refletindo uma situação clínico-patológica relativa à infecção canina por L. (L.) i.

chagasi diferente daquelas de outras regiões do país, em razão das características

ambientais, climáticas e sócio-econômicas próprias da região amazônica do Brasil.

No tocante aos resultados do presente estudo, deve-se destacar, inicialmente, a

importância da abordagem diagnóstica usada para aferir a questão essencial desta

avaliação, a infecção canina por L. (L.) i. chagasi, sintomática ou assintomática, por

63

meio do uso combinado de dois métodos de imunodiagnóstico específico, a RIFI

(IgG), para avaliação da resposta humoral, e a RIM, para avaliação da resposta de

hipersensibilidade tardia; a primeira, ligada à susceptibilidade à infecção (PINELLI et

al. 1994), enquanto a segunda, ligada à resistência (MAIA; CAMPINO, 2008).

Complementando essa abordagem, foi realizada também a avaliação parasitológica

da infecção por meio da punção aspirativa do linfonodo poplíteo de cada animal.

Desse modo, esta abordagem diagnóstica possibilitou ampliar ao máximo a

capacidade de detecção dos cães portadores da infecção, conforme trabalho prévio

(SILVEIRA et al., 2012), gerando uma prevalência global de 35,1%. Além disso,

possibilitou também gerar três prevalências específicas, de acordo com o perfil

imunológico da infecção canina, ou seja, a prevalência dos casos diagnosticados

somente pela RIFI (IgG), perfil imunológico I (RIFI+/RIM-), de 25,6% (81/316), a

qual, se mostrou maior (P<0.05) que as outras duas: somente pela RIM, perfil

imunológico II (RIFI-/RIM+), de 5,4% (17/316), e por ambos os testes, perfil

imunológico III (RIFI+/RIM+), de 4,1% (13/316).

Com base nos resultados acima, parece evidente a contribuição desta

abordagem diagnóstica no sentido de revelar prevalência de 35,1% superior a outras

duas, 23,5% e 24%, obtidas pelo uso isolado do diagnóstico sorológico (ELISA) de

cães em área endêmica de LVA no nordeste do Brasil, Estados da Bahia e Ceará,

respectivamente (PARANHOS-SILVA et al., 1996; RONDON et al., 2008). Da

mesma forma, a prevalência observada no presente estudo foi maior, também, que a

aquela (16%) estimada pelo uso isolado da RIFI (IgG), cut-off de 1:40, na zona

agreste do Estado de Pernambuco, também no nordeste do Brasil (SANTOS et al.,

2010). Entretanto, foi menor que a prevalência (40,3%) da infecção estimada

também pela RIFI (IgG), cut-off de 1:40, na costa norte do mesmo Estado de

Pernambuco (DANTAS-TORRES et al., 2006), sugerindo que a região costeira

desse Estado possa estar favorecendo uma transmissão mais intensa da infecção

canina do que no agreste. Por último, não caberia omitir a comparação da

prevalência da infecção canina do presente trabalho com a encontrada em outro

trabalho do nosso grupo de pesquisa (SILVEIRA et al., 2012), utilizando a mesma

abordagem diagnóstica e, no mesmo município de Barcarena, Estado do Pará,

porém, em outra área à distância de 20 km, denominada vila Santa Maria, onde foi

64

observada taxa de 43%, claramente superior a do presente trabalho (35,1%).

Contudo, embora a distância (20 km) não pareça significante, o que difere é a

característica ecológica das duas, já que a vila Santa Maria está localizada em área

de terra firme com cobertura vegetal que oferece excelentes condições para a

colonização do flebotomíneo vetor (Lutzomyia longipalpis), enquanto a vila Santana

do Cafezal fica situada às margens do rio Cafezal, onde grande parte da sua área

(~30%) é ocupada por várzea, inundada duas vezes por dia, não oferecendo

condições adequadas para a colonização do vetor e, consequentemente, interferindo

na transmissão da infecção. Desse modo, a diferença entre as taxas de prevalência

da infecção canina nessas áreas pode ser explicada por razão puramente ecológica,

fato que já havia sido observado antes por ocasião de estudo sobre a dinâmica de

transmissão da infecção humana por L. (L.) i. chagasi na vila Santana do Cafezal,

que revelou frequência significativamente maior de casos na área de terra firme do

que na várzea (SILVEIRA et al., 2009). De qualquer modo, faz-se importante

registrar o expressivo potencial desta abordagem diagnóstica na determinação da

prevalência da infecção, minimizando a possibilidade de subestimar a mesma, como

tem sido observado em trabalhos baseados no diagnóstico sorológico isolado

(PARANHOS-SILVA et al., 1996; RONDON et al., 2008; SANTOS et al., 2010).

A outra vantagem desta abordagem diagnóstica diz respeito à possibilidade de

ser contemplada a prevalência específica da infecção, baseada na identificação dos

três perfis imunológicos, a saber: perfil I (RIFI+/RIM-), perfil II (RIM+/RIFI-) e perfil III

(RIFI+/RIM+). Desse modo, comparando-se as taxas observadas entre esses perfis,

notou-se que a prevalência da infecção pelo perfil I (25,6%) foi maior que aquelas

dos perfis II (5,4%) e III (4,1%), respectivamente, fato também observado em

trabalho prévio (SILVEIRA et al. 2012), sugerindo, claramente, que o perfil I parece

representar a expressão mais prevalente da resposta imune do cão contra a

infecção natural por L. (L.) i. chagasi. Além disso, comparando-se também as taxas

de frequência desses perfis entre os 111 casos da infecção por ocasião da

prevalência, percebeu-se, igualmente, que o perfil I foi também mais frequente

(73%) que os perfis II (15,3%) e III (11,7%), confirmando a alta frequência do perfil I

na interação com o parasito sem, contudo, representar uma barreira efetiva contra a

infecção, já que a resposta de anticorpos não tem capacidade de conter a

65

multiplicação parasitária no interior dos macrófagos infectados (REIS et al. 2006;

BANETH et al., 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009).

Ao contrário, outro aspecto de interesse refere-se à baixa frequência dos perfis II

e III, caracterizados pela presença da resposta de hipersensibilidade tardia (RIM+),

os quais somaram juntos apenas 27% de frequência, evidenciando a fraca

habilidade do cão de desenvolver este tipo de resposta imune celular contra a

infecção. Desse modo, embora não seja clara a existência de dicotomia das

respostas imunes, celular e humoral, na infecção canina por L. (L.) i. chagasi

(BARBIERI, 2006), não há dúvida que a resposta de anticorpo IgG, que caracteriza o

perfil I (RIFI+/RIM-), está mais presente contra a infecção, sintomática ou

assintomática, do que a resposta imune celular.

Com base no pressuposto acima, relativo à inabilidade do perfil I de conferir

proteção contra a infecção canina por L. (L.) i. chagasi, hipótese que também é

sustentada em outros trabalhos relativos ao papel do cão doméstico como

reservatório da LVC (PINELLI et al., 1994; CABRAL et al., 1998; BANETH et al.,

2008), faz-se possível projetar que um número significativo de cães do perfil I sejam

incapazes de controlar a infecção e convertam, no período de um a dois anos, o

estado clínico assintomático em sintomático. Corroborando essa ideia, faz-se

importante registrar que, por ocasião da prevalência, a maioria (85,7%) dos cães

com diagnóstico parasitológico positivo apresentava perfil I, dos quais 61,1%

sintomáticos. Além disso, foi visto também que a taxa de conversão do estado

clínico, assintomático em sintomático, dos cães do perfil I diagnosticados na

prevalência (20,8%) foi maior (P<0.05) que aquelas dos perfis II (5,8%) e III 9%

durante os 24 meses do estudo, confirmando que o risco da conversão clínica é

maior entre os cães portadores da infecção com perfil I (RIFI+/RIM).

No tocante à faixa etária da infecção canina, notou-se que a taxa de prevalência

(27,5%) na faixa ≥1ano <7anos foi mais alta (P< 0,05) que aquelas nas faixas de

<1ano (5,3%) e de ≥7 anos (2,2%), sugerindo que a grande maioria das infecções

acontece após o primeiro ano de vida, quando uma possível proteção da resposta

de anticorpo materno já declinou. Por outro lado, não deve ser desprezada a baixa

prevalência (2,2%) na faixa ≥7 anos, já que esta pode estar sinalizando que a

maioria dos cães infectados na faixa ≥1ano <7anos sucumbe de LVC antes de

66

atingir 7 anos de idade, embora existam evidências sobre a infecção canina por L.

(L.) i. infantum na região do Mediterrâneo (Europa) mostrando que cães infectados

assintomáticos podem levar de três meses até 7 anos para converterem-se

sintomáticos (SOLANO-GALLEGO et al., 2001; OLIVA et al., 2006). Entretanto, faz-

se importante considerar que os fatores climático, ambiental e sócio-econômico nas

duas regiões, Amazônia brasileira e Mediterrânea na Europa, podem estar atuando

de maneira a acelerar o estado clínico-patológico dos cães infectados ou postergar o

declínio da resistência canina à infecção pelo parasito, respectivamente.

Com respeito à incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi nos três

momentos do estudo, aos seis (3,6% cães/mês), 12 (1,7% cães/mês) e 24 meses

(0,4% cães/mês), parece claro ter havido um declínio progressivo na incidência da

infecção ao longo do estudo, sugerindo, a princípio, que a fonte da infecção parece

ter sido reduzida no transcurso do estudo, o que poderia ser explicado não só pela

eliminação de 26 cães com diagnóstico parasitológico positivo, 21 durante a

prevalência, e cinco na incidência, como também, pela morte natural por LVC

observada em 24 cães durante os seis primeiros meses do estudo, assim como, em

mais três durante os seis meses subsequentes, e mais um durante o período final de

doze meses, totalizando 28 cães, todos pertencentes ao perfil I (RIFI+/RIM-). Desse

modo, somando-se os 26 cães eliminados com diagnóstico parasitológico positivo

com os 28 que evoluíram ao óbito por LVC, chega-se ao total de 54 cães que, sem

dúvida, considerando o seu elevado potencial infeccioso para o vetor (Lutzomyia

longipalpis), deixaram de atuar como fonte de infecção na área do estudo,

contribuindo, dessa maneira, para a redução progressiva na incidência da infecção.

Além disso, faz-se importante referir que, considerando-se as duas taxas de

incidência da infecção obtidas aos seis (3,6% cães/mês) e doze meses (1,7%

cães/mês), observou-se incidência no primeiro ano de 5,3% cães/mês, claramente

maior (P< 0,05) que aquela de 0,4% cães/mês observada no segundo ano do

estudo. Entretanto, duas situações podem explicar essa diferença; a primeira,

relacionada ao fato de que, muito provavelmente, a taxa de 3,6% cães/mês

estimada aos seis do estudo pode ter sido influenciada pela infecção pré-patente de

alguns cães não diagnosticados durante a prevalência que só foram diagnosticados

aos seis meses, durante a primeira incidência. A este respeito, cabe lembrar

67

algumas evidências prévias demonstrando o diagnóstico da infecção pré-patente

pela PCR (QUINNELL et al., 2001) e pela RIFI (IgM) (LIMA et al. dados não

publicados) em cães soronegativos (IgG) pelo ELISA e RIFI, respectivamente. A

segunda, diz respeito ao fato de que a taxa de 0,4% cães/mês observada ao final do

segundo ano do estudo parece estar sinalizando que a pronta redução da fonte de

infecção, assumida pela eliminação de 26 cães com diagnóstico parasitológico

positivo, 21 na prevalência e cinco durante a incidência, pode, sem dúvida, ter

refletido na redução da transmissão da infecção canina por L. (L.) i. chagasi, o que

também já foi evidenciado em estudo prévio (DIETZE et al., 1997).

Por outro lado, a comparação da incidência geral da infecção canina por L. (L.) i.

chagasi com dados da literatura torna-se tarefa difícil em razão não só das

diferenças metodológicas para o diagnóstico da infecção, como também, pela

necessidade do seguimento da coorte de cães por determinado período. A título de

exemplo, podemos citar o trabalho de Paranhos-Silva et al. (1998), que usaram o

sorodiagnóstico por ELISA para rastreamento da infecção canina durante período de

18 meses, tendo encontrado incidência geral de 0,5% cães/mês em área endêmica

de LVA no nordeste do Brasil (Jequié, Bahia), revelando-se inferior a encontrada

neste trabalho (5,7% cães/mês), estimada em área endêmica de LVA na Amazônia

brasileira, baseada na combinação do diagnóstico imunológico (RIFI/RIM) com o

parasitológico. Outro exemplo, diz respeito ao trabalho mais recente de Coura-Vital

et al. (2013), que utilizaram uma combinação do diagnóstico molecular (“PCR”) com

sorológico (ELISA) para reconhecimento da infecção canina por L. (L.) i. chagasi

durante 26 meses de estudo, tendo encontrado incidência geral de 5,8% cães/mês.

Desse modo, embora esses autores tenham empregado metodologia (PCR/ELISA)

mais sensível que a empregada no presente trabalho (RIFI/RIM/exame

parasitológico), percebe-se que não houve diferença entre as incidências da

infecção do trabalho citado (5,8% cães/mês) e do presente (5,7% cães/mês), fato

que vem valorizar, principalmente, a reação sorológica (RIFI) empregada neste

trabalho, a qual utiliza antígeno não só espécie-específico de L. (L.) i. chagasi, como

também, estágio específico (amastigotas provenientes da infecção visceral em

“hamster”), o que garante alta especificidade e sensibilidade da reação,

proporcionando um excelente desempenho do diagnóstico sorológico da LVC

68

(SILVEIRA et al., 2012). Em adição, cabe salientar, também, o efeito amplificador

desta abordagem diagnóstica pelo uso combinado da RIM, que, juntamente com a

RIFI, permitiu identificar amplo espectro da resposta imune do cão, representado

pelos três perfis: I (RIFI+/RIM-), II (RIM+/RIFI-) e III (RIFI+/RIM+). Portanto, com

base nos trabalhos consultados, que adotaram metodologia convencional

(PARANHOS-SILVA et al. 1998) e moderna (COURA-VITAL et al., 2013), visando a

incidência da infecção canina por L. (L.) i. chagasi, a impressão que fica é que a

incidência encontrada no presente trabalho (5,7% cães/mês) reflete um importante

estado infeccioso dos cães na área do estudo, sugerindo que o mesmo deve estar

contribuindo para a manutenção da transmissão da infecção na população canina.

De modo semelhante ao tratado na prevalência, não se pode deixar de valorizar,

também, a importância da incidência específica da infecção canina por L. (L.) i.

chagasi, baseada no número de casos novos da infecção em cada perfil

imunológico: I (RIFI+/RIM-), II (RIM+/RIFI-) e III (RIFI+/RIM+). Assim sendo, faz-se

importante registrar que a incidência do perfil I de 5,4% cães/mês mostrou-se

superior (P< 0,05) a do perfil II de 0,3% cães/mês, não havendo registro de casos do

perfil III, confirmando o que já havia sido discutido por ocasião da prevalência da

infecção sobre o papel do perfil I no sentido de representar a expressão mais

presente da resposta imune do cão contra a infecção por L. (L.) i. chagasi. Além

disso, foi possível confirmar, também, que a frequência do perfil I (95,6%) foi

também superior (P< 0,05) a do perfil II (4,4%) entre os casos novos da infecção

durante todo o período do estudo. Portanto, embora não seja correto assumir que a

RIM representa a melhor alternativa para avaliar a imunidade celular no cão,

também não se pode deixar de valorizar que a imunidade humoral, avaliada pela

RIFI (IgG), esteve sempre consideravelmente mais presente nos cães infectados,

sugerindo representar, sem dúvida, o mecanismo da imunidade do cão mais ativo

contra a infecção, embora seja consenso que a imunidade humoral não garante

proteção efetiva contra a infecção (BARBIERI, 2006; REIS et al., 2006; BANETH et

al., 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009).

Outro aspecto de interesse, diz respeito à incidência da infecção canina por L.

(L.) i. chagasi de acordo com a faixa etária dos animais, a qual revelou que a maioria

dos casos novos da infecção ocorreu na faixa etária <1ano (6,6% cães/mês),

69

seguida da faixa etária ≥1ano <7anos (5,3% cães/mês) e, por último, da faixa etária

≥7 anos (3,3% cães/mês), sugerindo, diferentemente da prevalência, que mostrou

um acumulo maior de casos na faixa etária de ≥1ano <7anos, que a transmissão da

infecção antes do primeiro ano representa um importante acontecimento na vida dos

cães e que deve ser priorizado diante da perspectiva de ser adotada uma estratégia

preventiva por meio de vacina contra a infecção.

Quanto à distribuição dos perfis imunológicos nas diferentes faixas etárias dos

cães infetados, percebeu-se que os três perfis apresentaram-se, de modo geral, com

maior frequência na faixa de ≥1ano <7anos de idade (I: 79%; II: 64,8%; III: 92,3%),

sugerindo ser a faixa que concentra o maior número de casos da infecção,

possibilitando o planejamento de ensaio sobre a evolução clínico-imunológica da

infecção, já que o número representativo de cada perfil será sempre maior que nas

outras faixas etárias.

No tocante ao diagnóstico parasitológico da infecção, faz-se importante registrar

19% de cães positivos na prevalência, sendo a maioria (85,7%) portadora do perfil I,

dos quais 61,1% eram sintomáticos, evidenciando, mais uma vez, o elevado

potencial de susceptibilidade do perfil I à infecção, o que também pode ser

corroborado pela fraca habilidade (3,7%) desses cães de converter a RIM(+) durante

o estudo. Os 14,3% de cães que também contribuíram com o diagnóstico

parasitológico da infecção eram do perfil III, sendo 66,7% assintomáticos e 33,3%

sintomáticos, o que sugere que, embora estes cães tenham conseguido converter a

RIM(+), a sua resposta celular não foi capaz de se sobrepor à ação dominante da

resposta humoral (RIFI+), conferindo certo grau de vulnerabilidade imunológica à

infecção, razão porque o parasito conseguiu, depois de algum período de tempo não

determinado - já que estes cães eram oriundos da prevalência -, escapar dos

mecanismos de proteção da resposta imune e multiplicar-se nos tecidos do cão,

propiciando a confirmação do diagnóstico parasitológico. De qualquer modo, o fato

de ter sido confirmado o diagnóstico parasitológico em cães do perfil III, ainda que

em proporção (14,3%) significativamente menor que no perfil I (85,7%), sugere que

a imunidade humoral do cão parece exercer forte dominância em relação à

imunidade celular, o que parece ter eco na forte expressão do perfil I em todos os

parâmetros de avaliação da infecção canina abordados neste estudo.

70

Por ocasião da incidência, o diagnóstico parasitológico da infecção foi confirmado

em 11% dos casos novos, sendo quatro na primeira incidência e um na segunda,

todos (100%) portadores do perfil I, 60% assintomáticos e 40% sintomáticos. Desse

modo, percebeu-se que, por ocasião da prevalência, quando não era possível

estimar o tempo de evolução da infecção nos animais, a confirmação parasitológica

da infecção esteve fortemente associada aos cães sintomáticos com perfil I,

enquanto que, por ocasião da incidência, quando foi possível confirmar o diagnóstico

parasitológico em cinco cães, 100% estavam associados ao perfil I, porém, ao

contrário da prevalência, a maioria (60%) era assintomática, sugerindo que, embora

a conversão do estado clínico assintomático em sintomático possa levar um tempo

indeterminado, a susceptibilidade à infecção, caracterizada pela confirmação

parasitológica, está fortemente associada ao perfil I, que representa o mecanismo da

imunidade do cão mais ativo contra a infecção.

Com respeito ao estado clínico da infecção canina por L. (L.) i. chagasi, foi visto

que, por ocasião da prevalência, 79,3% (88/111) dos cães infectados eram

assintomáticos e apenas 20,7% (23/111) sintomáticos, o que se mostrou compatível

com achados de outras áreas endêmicas no Brasil (MADEIRA et al., 2004; DANTAS-

TORRES et al., 2006; QUEIROZ et al., 2008), incluindo também os achados - 76%

assintomáticos e 24% sintomáticos - de trabalho recente do nosso grupo de

pesquisa na mesma região (SILVEIRA et al., 2012), e até no Velho Mundo, onde o

agente causal da infecção é a L. (L.) i. infantum (CABRAL et al., 1998; BANETH et

al., 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009). De outro modo, considerando-se o

número de cães infectados por perfil imunológico, foi visto, também, que a

frequência dos assintomáticos era maior que dos sintomáticos, estando

representada por 74% do perfil I (RIFI+/RIM-), 100% do perfil II (RIM+/RIFI-) e 84,6%

do perfil III (RIFI+/RIM+), sugerindo, a princípio, tratar-se de uma infecção de caráter

benigno, sem maiores complicações para a saúde dos animais. Entretanto, ao ser

examinada especificamente a situação dos cães assintomáticos, foi possível

observar que 68,2% (60/88) pertenciam ao perfil imunológico I, o qual, conforme

discutido anteriormente, está fortemente associado ao caráter de susceptibilidade à

infecção, em razão desse perfil ser sustentado, preferencialmente, pela resposta

humoral, que, sabidamente, não garante resistência contra a infecção (BARBIERI,

71

2006; REIS et al., 2006; PINELLI et al., 1994; CABRAL et al., 1998). Corroborando

esta afirmativa, faz-se importante adiantar que, ao ser examinado o parâmetro

relativo à evolução para o óbito devido à infecção canina por L. (L.) i. chagasi, foi

constatado que 100% dos óbitos na prevalência ocorreram nos animais do perfil

imunológico I, 30,2% dos quais eram assintomáticos. Desse modo, é possível

projetar que, no período de dois anos, pelo menos 30% dos cães assintomáticos do

perfil imunológico I devam evoluir para o óbito, tendo em vista as condições

ambientais, climáticas e sócio-econômicas da zona rural na região amazônica

brasileira.

Por outro lado, quando o estado clínico da infecção canina foi abordado por

ocasião da incidência, observou-se, novamente, que a maioria - 92,6% (63/68) - dos

casos novos da infecção era assintomática, enquanto a minoria - 7,4% (5/68) -

sintomática. Do mesmo modo, quando foi examinado o número de cães infectados

por perfil imunológico, percebeu-se, também, que a frequência dos assintomáticos

foi maior que dos sintomáticos, com 92,3% (59/64) do perfil I (RIFI+/RIM-) e 100%

(4/4) do perfil II (RIM+/RIFI-), enquanto não houve registro do perfil III (RIFI+/RIM+)

na incidência.

Portanto, independentemente do tipo de estudo, transversal ou prospectivo,

haverá sempre uma expectativa de que os cães infectados assintomáticos estejam

sempre em número maior do que os sintomáticos, em razão da conversão clínica

demandar um período de tempo indeterminado para ocorrer, o que pode estar sendo

influenciado pelo perfil imunológico do cão infectado no momento do diagnóstico

inicial. Neste sentido, quando foram avaliados os cães diagnosticados por ocasião

da prevalência, foi possível observar uma taxa de conversão maior (P< 0.05) entre

os cães do perfil I (20,8%) comparada com aquelas dos perfis II (5,8%) e III (9%),

durante os dois anos de seguimento dos animais. Além disso, observou-se, também,

que os poucos cães assintomáticos dos perfis II (1) e III (1) levaram período de

tempo maior, 24 e 12 meses, respectivamente, para tornarem-se sintomáticos do

que aqueles do perfil I, os quais manifestaram sinais clínicos da infecção nos

diferentes momentos da avaliação, aos 6, 12 e 24 meses do estudo, sugerindo que

esses cães haviam adquirido a infecção em diferentes momentos antes da

prevalência. Desse modo, com base nos dados da prevalência, dois pontos

72

precisam ser enfatizados: 1) os cães do perfil I apresentaram predisposição maior do

que os dos perfis II e III no sentido de adoecer, confirmando a impressão prévia de

que o perfil I está fortemente associado ao caráter de susceptibilidade à infecção; 2)

embora os cães dos perfis II e III não estejam totalmente protegidos contra a

infecção, foi demonstrado que o período de tempo para a conversão clínica levou 24

meses no caso do perfil II e 12 do perfil III, sugerindo que a imunidade celular (RIM+)

evidenciada nesses animais parece exercer, se não totalmente, pelo menos, na

grande maioria dos animais, papel protetor temporário contra a infecção.

Por outro lado, quando realizada a avaliação dos cães diagnosticados por

ocasião da incidência, observou-se que 18,2% dos cães assintomáticos do perfil I

tornaram-se sintomáticos, sendo 10,5% depois de 18 meses (após a primeira

incidência) e 7,7% depois de dez meses (após a segunda incidência), a qual não

diferiu daquela (20,8%) observada por ocasião da prevalência, evidenciando, mais

uma vez, o potencial patogênico do perfil I no curso da infecção canina por L. (L.) i.

chagasi. Ao contrário desse resultado, notou-se que, 100% dos cães do perfil II,

permaneceram assintomáticos até o final do estudo, confirmando que a imunidade

celular (RIM+) evidenciada nesses animais parece exercer papel protetor contra a

infecção.

Em resumo, comparando-se as taxas acumuladas (prevalência e incidência) da

conversão clínica dos cães assintomáticos em sintomáticos nos perfis I, II e III,

verificou-se que a taxa do perfil I (39%) foi maior (P< 0.05) que aquelas dos perfis II

(5,8%) e III (9%), sinalizando que os cães portadores do perfil imunológico I têm

33,2% mais chances de adoecer do que os cães portadores do perfil II, e 30% do

que os do perfil III, respectivamente. Além disso, foi possível concluir, também, que

um cão assintomático do perfil I possui chance de desenvolver sintomas em um

período de 1,4 semestres, enquanto um cão assintomático do perfil II possui chance

de desenvolver sintomas em um período de 4,5 semestres.

A conversão sorológica (RIFI+) ou da reação intradérmica de Montenegro (RIM+)

a partir do perfil imunológico do cão infectado, foi outro parâmetro que possibilitou

uma melhor compreensão da evolução clínico-imunológica da infecção canina.

Assim, considerando-se os resultados a partir da prevalência, foi visto que apenas

3,7% dos cães do perfil I (RIFI+/RIM-) converteram a RIM(+) (dois depois dos seis

73

primeiros meses e um após 24 meses), todos na faixa etária de ≥1 ano <7 anos,

com títulos sorológicos de 320-1280 (IgG), confirmando a fraca capacidade reativa

desses animais de responder, do ponto de vista da imunidade celular, efetivamente

contra a infecção. Entretanto, de certa forma inesperada, notou-se que 82,3% dos

cães do perfil II (RIM+/RIFI-) converteram a RIFI(+) (11 depois dos seis primeiros

meses e três após 12 meses), a maioria (11) não só com títulos sorológicos (IgG)

moderados ou elevados (320-1280), como também, na faixa de ≥1 ano <7 anos,

evidenciando uma forte predisposição da resposta humoral contra a infecção,

embora estes cães estivessem respaldados por um perfil (II) sustentado pela

resposta imune celular (RIM+/RIFI-), associado a parâmetros de resistência, como

diagnóstico parasitológico negativo, estado clínico assintomático, além de nenhum

ter evoluído para o óbito devido à LVC. Neste sentido, pode-se concluir que, embora

os cães do perfil II possam, em algum momento, converter a resposta sorológica

(RIFI+) assumindo o perfil III (RIM+/RIFI+), esta conversão foi quase desprezível do

ponto de vista do status clínico dos animais, já que apenas 5,8% (um animal)

converteram-se sintomáticos. Além disso, parece claro, também, o papel da

conversão sorológica (RIFI+) na fisiopatogenia da resposta imune do cão (perfil II)

contra a infecção, contribuindo, de forma significativa (mais que o perfil I) na

formação do perfil III (RIM+/RIFI+).

De modo semelhante, quando esta avaliação considerou os casos novos da

infecção por ocasião da incidência, notou-se, mais uma vez, que apenas 1,7% dos

cães do perfil I (RIFI+/RIM-) converteram a RIM(+) (após os seis primeiros meses),

sendo o único cão da faixa etária de ≥1 ano <7anos, com título sorológico elevado

1280 (IgG), reafirmando a inexpressiva capacidade dos cães do perfil I de converter

a resposta imune celular contra a infecção. Por outro lado, observou-se que 50%

dos cães do perfil II (RIM+/RIFI-) converteram a RIFI(+) (após os seis primeiros

meses), com títulos sorológicos (IgG) baixos (80-160), sendo os dois animais da

faixa de ≥1 ano <7 anos, destacando-se que ambos eram assintomáticos e que

mantiveram esse estado clínico até o final do estudo, ratificando o papel protetor da

hipersensibilidade tardia (RIM+) como mecanismo da imunidade celular contra a

infecção.

74

Objetivando avaliar o potencial patogênico da infecção canina por L. (L.) i.

chagasi na deterioração da saúde dos cães, decidiu-se analisar o quanto a infecção

contribuiu com o óbito. Assim sendo, dos 31 cães que evoluíram ao óbito e que

foram resgatados, foi confirmado, pelo exame imunohistoquímico, que 28 (90,3%)

tiveram associação com a infecção, sendo todos (100%) do perfil I, 24 (85,7%)

oriundos da prevalência (80% sintomáticos e 30,2% assintomáticos), e apenas

quatro (14,3%) da incidência (50% sintomáticos e 5,2% assintomáticos), fato que

veio reforçar, definitivamente, a forte associação do perfil I com a susceptibilidade

imunológica à infecção, sendo responsável por 100% dos óbitos comprovados pela

LVC. Em outras palavras, foi constatado que um cão do perfil I possui 34,2 vezes

mais chance de morrer do que um cão do perfil II, baseado na análise do quociente

de Risco Relativo (RR).

Além disto, embora as taxas de mortalidade tenham sido mais evidentes nos

cães sintomáticos do que nos assintomáticos, tanto na prevalência (80% e 30,2%)

como na incidência (50% e 5,2%), fato, de certa forma, já esperado, chamou

atenção também a elevada taxa de mortalidade dos cães assintomáticos na

prevalência (30,2%-16/53), o que evidenciou, de forma relativamente precoce, o

potencial patogênico do perfil I, já que 100% desses cães morreram durante o

primeiro ano do estudo, 50% (8/16) na primeira metade e outros 50% na segunda

metade do ano, assim como, os cães sintomáticos, com 62,5% (5/8) de óbitos na

primeira metade e 37,5% (3/8) na segunda metade do ano.

Além disto, fazendo-se uma correlação do número de óbitos com o número de

casos da infecção que, efetivamente, foram acompanhados, excluindo-se os cães

que foram eliminados com diagnóstico parasitológico positivo (26, sendo 21 na

prevalência e cinco na incidência) e os que morreram de etiologia desconhecida (10,

sendo seis na prevalência e quatro na incidência), verificou-se mortalidade de 32,1%

(27/84) na prevalência, superior àquela de 6,8% (4/59) na incidência, revelando que

a infecção canina por L. (L.) i. chagasi pode ser responsabilizada por significativo

número de perdas nas áreas endêmicas de LVA no Brasil e em muitos países da

América Latina.

75

CONCLUSÃOCONCLUSÃOCONCLUSÃOCONCLUSÃO

76

6 CONCLUSÃO

Com base nos diferentes parâmetros usados no presente trabalho para

avaliação da evolução clínico-imunológica da infecção canina por L. (L.) i. chagasi,

tais como, conversão clínica, sorológica, imune celular (hipersensibilidade tardia;

reação intradérmica de Montenegro), e evolução para o óbito, é factível dizer que a

interação do parasito com a resposta imune do cão está sustentada, principalmente,

por um perfil imunológico francamente vulnerável à infecção, aqui referenciado como

perfil I (RIFI+/RIM-), caracterizado pela presença da resposta sorológica (RIFI-IgG) e

ausência da resposta imune celular (RIM+), o que não oferece quase nenhuma

resistência ao parasito, tornando o cão altamente susceptível à infecção.

77

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liliane almeida carneiro - usp · leishmaniose visceral canina (lvc) é um dos problemas de saúde...

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