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KELLY SIVOCY SAMPAIO TEIXEIRA
USO DA QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DO TEOR
DOS FÁRMACOS EM COMPRIMIDO COM DOSE FIXA COMBINADA
EMPREGADO NO TRATAMENTO DE TUBERCULOSE.
NATAL – RN
2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO
TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS
KELLY SIVOCY SAMPAIO TEIXEIRA
USO DA QUIMIOMETRIA NA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DO TEOR
DOS FÁRMACOS EM COMPRIMIDO COM DOSE FIXA COMBINADA
EMPREGADO NO TRATAMENTO DE TUBERCULOSE.
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Desenvolvimento e
Inovação Tecnológica em Medicamentos
da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de
Doutora.
Orientador: PROF. Dr. Tulio Flavio
Accioly de Lima e Moura
Coorientador: PROF. Dr. Euzébio
Guimaraes Barbosa
NATAL – RN
2017
Dedico este trabalho
Aos meus pais, Sivocy e Evandro, por me ensinarem a buscar sempre alcançar meus
sonhos. Aos meus irmãos, Júnior, Keynne, Keylla e Kylza, as minhas
sobrinhas Letícia, Maria Vitória, Larissa, Louise e sobrinhos Luis Vinícius e
Leo Miguel que torcem pelo meu sucesso. Ao meu esposo, Artur, e meus
cachorrinhos Peteka e Biscoito que suportaram minha ausência e me
acompanharam diretamente nessa jornada. E a Bolacha (in memorian) minha
fiel “escudeira”, que pelo pouco tempo que passou entre a gente me deu
amor e companheirismo incondicional.
AGRADECIMENTOS
Concluída mais uma etapa de formação acadêmica e profissional é preciso expressar
minha gratidão a todos que fizeram parte deste trabalho e contribuíram para o sucesso
desta caminhada.
À Deus Todo Poderoso e Misericordioso, pelas bênçãos diárias e pela força que sempre
me acompanha e guia meus passos em todos os momentos.
Aos Prof. Dr. Tulio Flavio Accioly de Lima e Moura e Prof. Dr. Euzébio Guimaraes
Barbosa, pela orientação e ensinamentos.
Ao professor, amigo e incentivador Prof. Dr. Said Gonçalves da Cruz Fonseca, pela
presença e auxílio constantes, obrigada por seu carinho e por sua ajuda, sempre tão
importante e necessária.
Aos Profs. Luís Carlos Brigido de Moura e Mario Luís Ribeiro de Moura pela
contribuição a este trabalho e pelas conversas amigáveis.
As professoras Tereza, Janete, Romélia e Mirian, por fornecerem alguns materiais de
consumo utilizados no trabalho.
Aos técnicos, auxiliares técnicos e estagiários do CEDEFAR (Márcia, Igor, Tatiana e
Larissa), da FARMÁCIA ESCOLA (Salete, Janete, Adriana, Beto, Eliane, Luthiane,
Rafaela, Emidio), do LEFI (Ednaldo, Daiane, Maxciara e Lyghia) e da FAECE
(Cristiano) pelo apoio durante a realização dos experimentos, pela amizade e
compreensão no decorrer destes anos.
Aos meus colegas do programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação
Tecnológica em Medicamentos, por suas importantes contribuições tanto no campo
acadêmico como pessoal Luciana, Gabriel, Carol, Iris, Savana, Said, Daiane, Debora,
Paula, Regina.
Ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em
Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, especialmente ao corpo
técnico e administrativo pelos serviços prestado.
Às instituições financiadoras: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) e ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica
em Medicamentos, pelos auxílios concedidos para a realização desta pesquisa.
Aos meus alunos que indiretamente me apoiaram nesta jornada. Aprendi muito com
vocês. Em especial os alunos Lucicleide e Wagner que me ajudaram a conseguir uma
parte dos medicamentos utilizados nessa tese.
As professoras Rita e Adryana, por me concederem as liberações para que eu pudesse
fazer as disciplinas e os experimentos para a conclusão da tese, além de confiança no meu
trabalho.
Ao corpo docente do curso de farmácia da FAECE e aos coordenadores dos demais
cursos da faculdade obrigada por acompanharem essa jornada e me auxiliarem nos
momentos que não pude está presente.
A Erika, Eduardo, Renata, Narelle, Regina, Lygia, Adriana, Franzé, Teixeira Neto
e Savana que abriram as portas de suas casas para me hospedar em algum dos quatro
locais de disciplinas pelos quais passei. Muito obrigada!
A Claysiane, pela construção de uma amizade e apoio durante o tempo decorrido para a
realização deste trabalho.
Ao Tiago pela ajuda com o meu computador. Ele sempre quebrava nos momentos mais
cruciais.
As minhas queridas amigas Angélica, Elisângela, Erika, Fabíola, Idelceana e Jamili,
que sempre estão presentes na minha vida, incentivando e mostrando o real valor de uma
amizade mesmo depois de muitos anos.
Ao meu porto seguro, minha família: Meu pai Evandro, minha mãe Sivocy, meus irmãos
Júnior, Keynne, Keylla e Kylza, aos meus cunhados e cunhada Geraldo, Luis, Sidney
e Ednanda, as minhas sobrinhas Letícia, Vitória, Larissa, Louise e sobrinhos Vinícius
e Leo pelo carinho, apoio, por se fazer todos os dias presentes em minha vida,
compartilharem meus momentos de felicidade e ser fonte de apoio nos momentos difíceis.
Obrigada por me ajudarem a vencer mais esta etapa da minha vida.
Ao meu esposo, Artur, pela paciência nos momentos de aperreio, incentivo nos
momentos de desânimo e compreensão quando estive triste e principalmente por ser essa
pessoa amável que em todos os momentos soube me fazer sorrir. Amo muito você!
A Peteka e Biscoito que mesmo “abandonados” nunca deixaram de me fazer festa e
carinho quando voltava para casa.
A Bolacha (in memorian) minha “pequenininha” que chegou e partiu em um momento
muito delicado para me mostrar o quão forte eu era. Sentirei saudades sempre!
A toda a minha família: avó, tios, tias, primos e primas pelo carinho, amizade e orações.
“ Uma andorinha só não faz verão. ” Aristóteles (384-322 a.C.)
Obrigada!
“O que vale na vida não é o ponto de
partida e sim a caminhada.
Caminhando e semeando, no fim
terás o que colher. ”
Cora Coralina
RESUMO
A Organização Mundial de Saúde (OMS) sugere que o tratamento da tuberculose (TB)
seja realizado através da terapia que consiste na associação de quatro fármacos:
rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol. Com isso o tratamento é melhor aceito
tendo uma maior adesão do paciente à terapia prescrita. Levando-se em consideração que
a metodologia utilizada para o doseamento de um fármaco na presença de excipientes e
outros fármacos é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que é sabidamente
trabalhosa, de alto custo e destrutiva, foi proposta desse trabalho o desenvolvimento e
validação de um modelo de calibração multivariada em associação com a técnica de
espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) para determinação simultânea de
rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol que fosse mais simples, rápida, de
baixo custo, não destrutiva e que não utilizasse solventes orgânicos, contribuindo assim
com o meio ambiente. Sendo, portanto, ferramenta de otimização para o controle de
qualidade deste medicamento. Nesse trabalho foi utilizado o método por NIR – PLS
(regressão de mínimos quadrados parciais) onde as misturas dos quatro fármacos foram
realizadas com base no planejamento experimental do tipo composto central elaborado
pelo programa Statistica 13 (StatSoft Inc.). Essas misturas foram lidas na faixa de 10.000
a 4.000 cm-1 utilizando um espectrofotômetro Infravermelho (IRPrestige-21 - Shimadzu)
com resolução de 4 cm-1, 20 varreduras, temperatura e umidade controladas. As análises
envolvendo CLAE foram realizadas em um cromatógrafo (Hitachi – Elite Ultra),
equipado com coluna C18 (15 cm x 4,6 mm – ACE-5) e (25 cm x 4,6 mm – Luna -
Phenomenex) e detector UV (matriz de diodo), utilizando o método de referência descrito
na farmacopeia internacional 15ª edição. Ao final, todos os dados foram tratados por
ferramentas computacionais de análise multivariada, utilizando PLS através do programa
pirouette 3.11 (Infometrix, Inc.). As seleções de variáveis foram realizadas pelo programa
QSAR modeling. Foi realizada validação cruzada pelo método leave-one-out e estimativa
de figuras de mérito como linearidade, precisão e exatidão foram demonstradas nos quatro
modelos propostos. Na avaliação das amostras comerciais pelos modelos de calibração
multivariada em associação com a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR)
desenvolvidos foram capazes de determinar simultaneamente os quatro fármacos,
apresentando dados estatisticamente equivalentes aos obtidos por CLAE.
Palavras chave: Infravermelho próximo, controle de qualidade farmacêutico,
rifampicina, isoniazida, pirazinamida, etambutol, produtos DFC
ABSTRACT
The World Health Organization (WHO) suggests that treatment of tuberculosis (TB)
should be done through a combination of four drugs: rifampicin, isoniazid, pyrazinamide
and ethambutol. With this the treatment is better accepted having a greater adhesion of
the patient to the prescribed therapy. Taking into account that the methodology used for
the determination of a drug in the presence of excipients and other drugs is high-
performance liquid chromatography (HPLC), which is known to be laborious, expensive
and destructive. Validation of a multivariate calibration model in association with the near
infrared spectroscopy (NIR) technique for the simultaneous determination of rifampicin,
isoniazid, pyrazinamide and ethambutol that was simpler, faster, low cost, non destructive
and did not use organic solventes, thus contributing to the environment. Therefore, it is
an optimization tool for the quality control of this medicine. In this work, the NIR - PLS
(partial least squares regression) method was used where the mixtures of the four drugs
were performed based on the experimental design of the central composite type
elaborated by the program Statistica 13 (StatSoft Inc.). These mixtures were read in the
10,000 to 4,000 cm-1 range using an infrared (IRPrestige-21 - Shimadzu)
spectrophotometer with 4 cm-1 resolution, 20 sweeps, controlled temperature and
humidity. The analyzes involving HPLC were performed in a chromatograph (Hitachi -
Elite Ultra) equipped with a C18 column (15 cm x 4.6 mm - ACE - 5) and (25 cm x 4.6
mm - Luna - Phenomenex) and UV detector (Diode array) using the reference method
described in the International Pharmacopoeia 15th Edition. At the end, all data were
treated by computational tools of multivariate analysis, using PLS through the program
pirouette 3.11 (Infometrix, Inc.). The selections of variables were performed by the
QSAR modeling program. Cross-validation was performed by the leave-one-out method
and estimation of merit figures such as linearity, precision and accuracy were
demonstrated in the four proposed models. In the evaluation of the commercial samples
by the multivariate calibration models in association with the near infrared spectroscopy
(NIR), they were able to simultaneously determine the four drugs, presenting data
statistically equivalent to those obtained by HPLC.
Keywords: Near-infrared spectroscopy, pharmaceutical quality control, rifampicin,
isoniazida, pyrazinamide, etambutol, FDC products
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Esquema básico para o tratamento da tuberculose de adolescentes e adultos
25
Quadro 2 – Regiões espectrais do infravermelho 32
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química da isoniazida 27
Figura 2 – Estrutura química da pirazinamida 28
Figura 3 – Estrutura química do etambutol 28
Figura 4 – Estrutura química da rifampicina 29
Figura 5 – Representação da técnica de reflectância especular e difusa 33
Figura 6 - Representação gráfica do planejamento do tipo composto central dos ativos
rifampicina (rifa), isoniazida (iso), pirazinamida (pira), etambutol (eta) e excipientes
(excip), demonstrando o conjunto de calibração (c) e o conjunto de validação (v).
45
Figura 7 - Espectros de infravermelho médio (MID), sendo evidenciadas as bandas
características de grupos amina, amida, aromáticos, carbonila e álcool. 50
Figura 8 - Espectros de infravermelho próximo (NIR), sendo evidenciadas as regiões A,
B e C referentes a algumas bandas de combinações e sobretons. 51
Figura 9 - Espectros de MID (A) e NIR (B) da mistura quaternária e do medicamento. As
setas indicam as diferenças visuais detectadas. 52
Figura 10 – Espectros de MID dos IFA: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol.
54
Figura 11 - Espectros de MID dos materiais de revestimento: dióxido de titânio e óxido
de ferro. 54
Figura 12 - Espectros de MID dos diluentes, aglutinantes e desagregantes: celulose
microcristalina, amido de milho, lactose, polivinilpirrolidona (k30 e k90), gelatina
em pó, methocel, hipromelose, croscarmelose, aminoglicolato de sódio e alginato de
sódio. 55
Figura 13 - Espectros de MID dos deslizantes, lubrificantes e antioxidante: talco, dióxido
de silício coloidal (aerosil), estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, macrogol
6000 e ácido ascórbico. 55
Figura 14 – Análise do componente principal: (A) gráfico dos scores das misturas
desenvolvidas; (B) destaque das misturas mais próximas ao medicamento. 56
Figura 15 – Espectros de MID do comprimido e da mistura desenvolvida. 57
Figura 16 – Cromatogramas obtidos por CLAE de acordo com a farmacopeia internacional:
A: isoniazida, pirazinamida e etambutol e B: rifampicina. 60
Figura 17 - Espectros da região do infravermelho próximo das amostras dos conjuntos de
calibração, validação e os comprimidos DFC. 61
Figura 18 - Validação interna cruzada utilizando o método leave-one-out para o modelo
de quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida. 64
Figura 19 - Detecção de outliers para o modelo de quantificação da pirazinamida,
etambutol, rifampicina e isoniazida. 66
Figura 20 – Correlação entre os valores de concentração determinados por CLAE e os
valores previsto por NIR para cada IFA empregando os modelos desenvolvidos. 67
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Informações adicionais dos comprimidos DFC 38
Tabela 2 – Condições analíticas empregadas para o doseamento dos insumos
farmacêuticos ativos 40
Tabela 3 – Variações dos valores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos utilizados no
preparo das misturas para o desenvolvimento dos modelos 44
Tabela 4 – Quantidade utilizada dos insumos farmacêuticos ativos (mg) e a mistura dos
excipientes (mg) na composição das amostras para o conjunto de calibração (1 - 31)
e conjunto de validação (32 – 49). 46
Tabela 5 - Teores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos obtidos pelo método de
referência para as amostras utilizadas na construção do modelo de calibração
multivariada: conjuntos de calibração:1 a 31; validação: 32 a 49. 58
Tabela 6 – Resumo dos parâmetros analisados para os modelos desenvolvido para
quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida. 65
Tabela 7 – Valores encontrados no teste de precisão e exatidão do modelo de calibração
desenvolvido por NIR. 68
Tabela 8 – Resultados da quantificação de isoniazida (iso), rifampicina (rifa),
pirazinamida (pira) e etambutol (eta) em amostras de medicamentos pelo método
desenvolvido (NIR) e método farmacopeico (CLAE). 70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2RHZ/4RH Dois meses rifampicina (R), isoniazida (H), pirazinamida (Z) / 4 meses
rifampicina e isoniazida
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASTM American Society For Testing And Materials
BAAR Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BPF Boas Práticas de Fabricação
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLUE Cromatografia líquida de ultra eficiência
CMD Concentração Média Determinada
DAD Detector de arranjo de fotodiodos
DFC Doses Fixas Combinadas
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DP Desvio Padrão
DPR Desvio Padrão Relativo
FDA Food and Drug Administration
FIR Espectroscopia de Infravermelho Distante
ICS International Chemometrics Society
IFA Insumos Farmacêuticos Ativos
IV Infravermelho
MID Espectroscopia de Infravermelho Médio
MSC Correção Multiplicativa de Sinal
NIR Espectroscopia de Infravermelho Próximo
OMS Organização Mundial de Saúde
PAS Ácido p-aminossalicílico
PAT Tecnologia de Processo Analítico
PCA Análise de Componentes Principais
PLS Regressão de Mínimos Quadrados Parciais
PNCT Programa Nacional de Controle da Tuberculose
PRESS Soma dos Quadrados de Erro de Previsão
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RMSEC Erros Quadráticos de Calibração
RMSECV Soma dos Erros Quadráticos da Validação Cruzada
RMSEP Erro Padrão de Previsão
RNA Ácido Ribonucleico
smooth Alisamento
SQR Substância Química de Referência
SQRFB Substância Química de Referência da Farmacopeia Brasileira
TB Tuberculose
USP United States Pharmacopeia
UV-VIS Ultravioleta - Visível
VL Variáveis Latentes
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21
2.1.1.1. Considerações gerais sobre a tuberculose 21
2.1.1.2. Tratamento da tuberculose 22
2.1.1.3. Fármacos tuberculostáticos 26
2.1.1.4. Isoniazida 26
2.1.1.5. Pirazinamida 27
2.1.1.6. Etambutol 28
2.1.1.7. Rifampicina 28
2.1.1.8. Controle de qualidade de medicamentos na indústria farmacêutica 29
2.1.1.9. Espectroscopia no infravermelho (NIR e MID) para análise de fármacos
31
2.1.1.10. Quimiometria 34
2.1.1.11. Validação analítica 36
3. OBJETIVOS 37
3.1.1.1. Geral 37
3.1.1.2. Específicos 37
4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL 38
4.1.1.1. MATERIAIS: amostra, padrões, reagentes, solventes utilizados,
Equipamentos e softwares 38
4.1.1.2. MÉTODOS 40
4.1.1.3. Métodos de referência PARA DETERMINAÇÂO do teor de rifampicina,
isoniazida, pirazinamida e etambutol (método cromatográfico) 40
4.1.1.4. Método por Infravermelho médio e próximo (NIR e MID) 42
4.1.1.5. Análises Preliminares: Espectroscopia 42
4.1.1.6. Seleção dos excipientes 42
4.1.1.7. Planejamento experimental 43
4.1.1.8. Preparo das amostras para a construção do modelo multivariado 46
4.1.1.9. Aquisição dos espectros de infravermelho 47
4.1.1.10. Desenvolvimento do modelo multivariado de calibração 48
4.1.1.11. Validação do método 48
4.1.1.12. Quantificação dos IFA nas amostras comerciais 48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 49
5.1.1.1. Análises Preliminares: Espectroscopia 49
5.1.1.2. Engenharia reversa do comprimido 53
5.1.1.3. Métodos de referência (CLAE) 57
5.1.1.4. Modelos desenvolvidos por calibração multivariada 61
5.1.1.5. Validação do método 67
5.1.1.6. Quantificação dos IFA nas amostras comerciais 69
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 71
7. PERSPECTIVAS 71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72
19
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença contagiosa grave, considerada milenar, causada
por um dos agentes etiológicos: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis e
Mycobacterium africanum (MELO et al., 2009). Anualmente essa doença mata no mundo
aproximadamente 3,0 milhões de pessoas, mais que a síndrome da imunodeficiência
adquirida (AIDS), a malária e as doenças tropicais combinadas (OMS, 2015). Trata-se de
um dos principais problemas de saúde pública do mundo porque o contágio é facilitado
por aglomerações humanas onde o bacilo é transmitido pelas vias áreas. A doença pode
atingir todos os órgãos do corpo humano, porém se reproduz mais facilmente nos pulmões
devido à alta concentração de oxigênio (PEÑA, BAQUERO-ARTIGÃO, MORENO-
PEREZ, 2009).
Os primeiros tratamentos a que se tem referência no Brasil são datados do ano de
1907 e desde então muitas mudanças foram feitas. Vários tratamentos foram propostos e
esquemas terapêuticos foram padronizados (CAMPOS, H.S., 2007). Em 2009, por
recomendação da Organização Mundial de Saúde (OMS), uma nota técnica publicada
pelo Ministério da Saúde propôs mudanças no esquema básico para o tratamento de TB.
Foi introduzido a apresentação em comprimidos com dose fixa (reduzida) combinada dos
4 fármacos (4 em 1) para a fase intensiva do tratamento. A utilização de rifampicina (150
mg), isoniazida (75 mg), pirazinamida (400 mg) e etambutol (275 mg) na apresentação
de comprimidos tem apresentado excelentes resultados pelo mundo quanto à efetividade
devido principalmente à maior taxa de adesão ao tratamento (Ministério da Saúde, 2010).
Essa associação medicamentosa tem se tornado alvo de muitos estudos devido
principalmente a problemas com as doses fixas combinadas (DFC). Podendo, desta
forma, se tornar um obstáculo para o controle de qualidade do medicamento distribuído.
Medicamento com teores baixo dos insumos farmacêuticos ativos (IFAs) é um problema
de importância vital na prevenção de risco na formação de resistência aos
tuberculostáticos. Não se pode realizar programas efetivos de combate à tuberculose sem
a garantia de que os medicamentos usados no tratamento sejam eficazes na promoção da
cura. Para se garantir a eficácia, segurança, baixa toxicidade e melhor estabilidade destes
medicamentos é necessário um controle de qualidade abrangente onde fabricantes e
20
autoridades governamentais unam forças (SANTORO, 1988; BHUTANI, MARIAPPAN
e SINGH, 2004).
O padrão de qualidade é o ponto chave para o controle de medicamentos em uma
indústria farmacêutica. Ele deve garantir a conformidade do medicamento com os
parâmetros conhecidos, bem como sua inocuidade e eficácia do ponto de vista
farmacológico (PRISTA, et al., 2009). Devido à complexidade de metodologias que
quantifiquem fármacos associados de maneira simultânea, o controle de qualidade, que
muitas vezes é demorado, pode trazer incertezas devido à possibilidade de degradação do
produto e o alto custo. Assim, a busca de técnicas alternativas que minimizem as
desvantagens da metodologia de referência, no que se refere ao controle em processo e
ao produto final, são de grande valia.
Avanços nas tecnologias e ferramentas analíticas que possam ser aplicadas em
medidas de tempo real, análise de processo e produto final têm sido relatados na literatura,
dando ênfase à importância do acompanhamento em processo da qualidade do produto
final (WORKMAN, KOCK e VELTKAMP, 2007; WORKMAN, et al., 2011). Esse tipo
de pesquisa vem sendo direcionada para responder aos quesitos de um processo bem
compreendido que se encontra no guia de orientação para a indústria publicado pelo Food
and Drug Administration (FDA) (FDA, 2004).
No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) 17/2010 determina que as
boas práticas de fabricação de um medicamento devem garantir um produto que tenha
qualidade em sua produção e que seja controlado com padrões de qualidade apropriados
(BRASIL, 2010).
Visando aproximar a pesquisa à sua aplicação prática, e tentando seguir as
recomendações para garantir a qualidade do medicamento pelo órgão regulamentador, o
presente trabalho buscou, através da espectroscopia de infravermelho próximo e médio
(NIR e MID) e analise multivariada, desenvolver métodos que possam monitorar a
qualidade dos insumos farmacêuticos ativos (IFA) do comprimido DFC para o tratamento
da tuberculose, obtendo medidas objetivas com um custo mais baixo, de forma não
destrutiva, rápida e sem geração de resíduos químicos (TREVISAN E POPPI, 2006;
LUYPAERT, MASSART, VANDER HEYDEN, 2007; SWARBRICK, 2007;
MANTANUS et al., 2010).
21
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A TUBERCULOSE
A tuberculose é uma doença infecciosa grave sendo a principal causa de morte por
doença infectocontagiosa em adultos no mundo. A doença está associada à pobreza, às
más condições de vida e de habitação e à aglomeração humana (FERREIRA;
GLASENAPP; FLORES, 2011; BRASIL, 2016). Os principais sintomas da tuberculose
pulmonar são: tosse persistente, produtiva ou não (com muco e eventualmente sangue),
febre vespertina, sudorese noturna e emagrecimento (BRASIL, 2011).
A doença é causada pelo agente etiológico Micobacterium tuberculosis, que é um
parasita intracelular facultativo e possui a capacidade de sobreviver e se multiplicar no
interior de células fagocitárias, é resistente à ação de agentes químicos e sensível à ação
de agentes físicos como o calor e a radiação ultravioleta, mas não ao congelamento e à
dessecação (COELHO; MARQUES, 2006). Surgiu há cerca de 15.000 anos e por ter sido
detectado em múmias egípcias 3.400 anos antes de Cristo, acredita-se que a tuberculose
já comprometia a saúde do homem desde então (CAMPOS, 2006).
A tuberculose é considerada um dos principais problemas de saúde pública no
mundo, pois sua contaminação é favorecida em lugares aglomerados. A doença é causada
por um bacilo de crescimento lento, aeróbio, álcool-ácido resistente (BAAR), sua
transmissão se dá por vias áreas, a doença pode atingir todos os órgãos, mas ataca com
mais frequência os pulmões, por motivo da alta concentração de oxigênio (PEÑA,
BAQUERO-ARTIGÃO, MORENO-PEREZ, 2009; FERREIRA; GLASENAPP;
FLORES, 2011). A infecção acontece por meio da inalação de núcleos secos de partículas
contendo bacilos expelidos pela tosse, fala ou espirro do doente com tuberculose ativa de
vias respiratórias (pulmonar ou laríngea). Os doentes com baciloscopia de escarro
positiva, são a principal fonte de infecção (BRASIL, 2011).
A tuberculose é uma doença curável em praticamente 100% das novas
ocorrências, desde que a pessoa seja sensível aos medicamentos antituberculose e que
sejam obedecidos os princípios básicos da terapia (BRASIL, 2016). Mesmo sendo
considerada uma doença curável calcula-se que nos últimos 100 anos a tuberculose tenha
levado a óbito por volta de 100 milhões de indivíduos (FRIENDEN et al., 2003).
22
Em termos internacionais, a OMS aponta que 22 países concentram cerca de
80,0% das ocorrências de tuberculose. Nesse contexto, o Brasil faz parte desse grupo,
ocupando a 16ª posição em número absoluto de casos. A Índia, China e África do Sul são
os países com maior carga da doença. Considerado o coeficiente de incidência, o Brasil
ocupa a 22ª posição entre esses países. Em 2012, cerca de 8,6 milhões de pessoas tiveram
tuberculose no mundo, mas observa-se que ocorreu uma diminuição no número de
contaminados como também no número de mortes por tuberculose no mundo, pois em
1990, ocorreram 1,3 milhão de mortes causadas pela tuberculose, e em 2012, esse número
foi de 940 mil, obtendo uma redução de 45% (OMS, 2013).
No Brasil, a tuberculose ainda é considerada um sério problema da saúde pública,
com profundas raízes sociais. A cada ano, são notificados aproximadamente 70 mil casos
novos e ocorrem 4,6 mil mortes em decorrência da doença (BRASIL, 2016). Entretanto,
o Brasil vem apresentando uma queda na incidência de tuberculose, bem como em sua
taxa de mortalidade e número de novos casos (FIOCRUZ, 2016).
A tendência de queda em ambos os indicadores vem-se acelerando ano após ano
em um esforço nacional, o que pode determinar o efetivo controle da tuberculose em um
futuro próximo, quando a doença poderá deixar de ser um problema para a saúde pública
(BRASIL, 2016). O Brasil cumpriu os três objetivos para 2015 (diminuir pela metade a
incidência, prevalência e mortalidade). Outros oito países considerados de alta carga
também alcançaram as metas: Camboja, China, Etiópia, Índia, Myanmar, Filipinas,
Uganda e Vietnã (OMS,2015). Nos últimos 10 anos, a incidência de casos de tuberculose
no Brasil reduzida em 20,2%, passando de 38,7 casos/100 mil habitantes em 2006 para
30,9 casos/100 mil habitantes em 2015. Já a taxa de mortalidade passou de 2,2 óbitos para
cada 100 mil habitantes, em 2014, contra 2,6 registrados em 2004 (ROCHA, 2016).
Para o ano de 2016 o objetivo global estabelecido pela OMS é a eliminação da
epidemia da tuberculose, tendo como meta a redução da incidência da tuberculose em
80% e nas taxas de mortalidade uma redução de 90%, de forma a reduzir os custos
voltados para o tratamento da tuberculose até 2030 (OMS, 2015).
2.1.1.2. TRATAMENTO DA TUBERCULOSE
No Brasil, o Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT) é
responsável pelas normas de prevenção, diagnóstico, tratamento e pela distribuição dos
23
medicamentos, que são fornecidos, gratuitamente, a todos os doentes registrados e
acompanhados nas Unidades de Saúde (CAMPOS, 2007).
A primeira ação efetiva do poder público no Brasil contra a tuberculose foi em
1907 e proposta por Oswaldo Cruz. Em 1920, criou-se a Inspetoria de Profilaxia da
Tuberculose, que priorizou a descoberta e o tratamento adequado dos doentes. Em 1926,
o Departamento Nacional de Saúde Pública criou modelo centralizado de ações
profiláticas, hospitalares, laboratoriais, coordenadas pelo poder público. Até os anos de
1940, quando não tinha medicamento efetivo, o tratamento era hospitalar, com o uso de
técnicas cirúrgicas, mais precisamente pneumotórax (CAMPOS, 2007).
Na década de 40, a tuberculose foi considerada praticamente intratável e fatal,
responsável pela mortalidade de 50% na forma pulmonar (FOX; ELLARD;
MITCHISON, 1999). No entanto, ao longo dos anos 40 e 50 com o uso da quimioterapia
antibiótica especifica foi permitido alterar o perfil epidemiológico da doença, ocorrendo
uma queda dos índices de mortalidade ocasionados pela tuberculose, contudo propiciou
o surgimento de bacilos resistentes ao fármaco, sendo superada por sua vez por
aprofundamento dos estudos (FERNANDES; NASCIMENTO, ALMEIDA, 1993).
Em 1946, com o uso da estreptomicina para tratamento da tuberculose, iniciou-se
o desenvolvimento da moderna quimioterapia e foi quando houve a redução do número
de mortes. Em 1948, o uso de estreptomicina foi associado ao ácido p-amino-salicílico
(PAS) para obter-se a redução da resistência bacteriana ao uso desses fármacos isolados
(FERREIRA; GLASENAPP; FLORES, 2011). Desenvolveu-se assim, uma
quimioterapia inovadora contra a tuberculose, onde o foco era a redução da resistência
das bactérias para esses medicamentos quando usados de forma isolada e uma melhor
eficácia para o tratamento da doença.
Entre 1952 e 1967, foi explorado o uso da isoniazida isolada ou em associação
com o PAS ou estreptomicina. Nos anos 70, novos estudos direcionavam para o uso de
rifampicina ou pirazinamida em regime combinado com estreptomicina e isoniazida, com
a finalidade de diminuir o reaparecimento da doença, demonstrando, também, que a
inclusão de rifampicina e pirazinamida no esquema terapêutico poderia reduzir o curso
do tratamento para seis meses (FOX; ELLARD; MITCHISON, 1999). Com esse esquema
de tratamento foi possível verificar que a atividade esterilizante da pirazinamida limitou-
se aos primeiros dois meses de tratamento, durante a fase intensiva, enquanto que a da
24
rifampicina permaneceu em toda a fase de continuação (FOX; ELLARD; MITCHISON,
1999; OMS, 2003).
Em 1976, o período de tratamento moderno foi delimitado para seis a nove meses.
E em 1979, o esquema foi novamente modificado, passando a ser composto pela
rifampicina, pela isoniazida e pela pirazinamida, com 6 meses de duração (2RHZ / 4RH).
Esse esquema, por sua vez, foi considerado mais eficaz e com uma menor toxidade, assim
foi utilizado em todo o país, de forma pioneira em todo o mundo (CAMPOS, 2007).
No Brasil, até o ano de 2009, o esquema terapêutico disponível e utilizado para o
tratamento de primeira linha da tuberculose era composto por três fármacos (isoniazida,
pirazinamida e rifampicina) empregados na primeira fase (dois meses de tratamento),
seguido de isoniazida e rifampicina empregados na segunda fase (quatro meses de
tratamento). Nesse mesmo ano, o Programa Nacional de Controle da Tuberculose,
juntamente com o seu comitê técnico, reviu o sistema de tratamento e foi diagnosticado
um crescimento da resistência primária a isoniazida (de 4,4% para 6,0%), assim a partir
de 2010 houve a introdução do etambutol na primeira fase do tratamento (dois meses),
como quarto fármaco na fase intensiva do tratamento seguido dos dois fármacos
(isoniazida e rifampicina) na segunda fase (quatro meses de tratamento) com objetivo de
prevenir a resistência bacilar aos fármacos antituberculose (BRASIL, 2011; FERREIRA;
GLASENAPP; FLORES, 2011).
A introdução do etambutol objetivou aumentar o sucesso terapêutico e evitar o
aumento da multirresistência, pela maior adesão do paciente; todos os agentes são
facilmente absorvidos após a administração oral, com ampla distribuição para a maioria
dos tecidos e fluidos, incluindo o líquido cérebro-espinhal. (BRASIL, 2010; BRASIL
2016).
Assim, de acordo com recomendação da OMS, a formulação farmacológica desse
esquema passa a ser em comprimidos de doses fixas combinadas dos quatro fármacos nas
seguintes dosagens na etapa inicial (fase de ataque): rifampicina 150 mg, isoniazida 75
mg, pirazinamida 400 mg e etambutol 275 mg e etapa secundária (fase de manutenção ou
continuação) rifampicina 150 mg e isoniazida 75 mg. As dosagens especificadas por peso
e faixa etária para adolescentes e adultos podem ser consultadas no quadro 01 (BRASIL,
2011).
25
Quadro 1 - Esquema básico para o tratamento da tuberculose de adolescentes e adultos
Fase Fármacos Faixa de Peso Unidade/Dose
Intensiva
2 Meses
Comprimido em dose fixa e
combinada
Rifampicina 150 mg.
Isoniazida 75mg
Pirazinamida 400mg
Etambutol 257mg
20Kg a 35Kg
36Kg a 50Kg
>50Kg
2 Comprimidos
3 Comprimidos
4 Comprimidos
Manutenção
4 meses
Rifampicina e Isoniazida
comprimido ou cápsula de
300/200mg ou de 150/100mg
ou comprimidos de 150/75mg
20Kg a 35Kg
1 comprimido ou
uma cápsula de
300/200mg ou 2
comprimidos de
150/75mg
36Kg a 50Kg
1 comprimido ou
uma cápsula de
300/200mg + 1
comprimidos ou uma
cápsula de 150/75mg
ou 3 comprimidos de
150/75mg
>50Kg
2 comprimidos ou
uma cápsula de
300/200mg ou 4
comprimidos de
150/75mg Fonte: Brasil, 2011.
Além do aumento da resistência primária da isoniazida, já ressaltada
anteriormente, houve ainda o aumento da resistência dela quando associada à rifampicina
(de 1,1% para 1,4%), isso entra também como uma das justificativas para a mudança do
tratamento a terapia de comprimidos DFC, buscando, dessa forma, a redução da
resistência aos fármacos utilizados no tratamento contra a tuberculose, já que o etambutol
é um agente usado principalmente para impedir o aparecimento de multirresistência
(BRASIL, 2011; BRAGA; BARRETO; HIJJAR, 2002; NOLAN; GOLDBERG, 2002;
RABARIJAONA et al., 1999).
Uma das vantagens dessa nova formulação DFC é a redução do número de
comprimidos, o que favorece a uma melhor adesão do paciente ao tratamento e
consequentemente a redução das taxas de abandono ao tratamento, isso também diminui
as chances de o paciente ser seletivo na escolha dos fármacos administrados, evitando o
risco de monoterapia (BRASIL 2011; NOLAN; GOLDBERG, 2002; RABARIJAONA
et al., 1999).
26
Com a diminuição do tempo do tratamento para seis meses houve a diminuição
nas taxas de abandono conforme já ressaltado, mas, ainda assim, é comum o paciente
iniciar e interromper o tratamento por diversos motivos. É considerado abandono aquele
paciente que deixou de comparecer à unidade de saúde por mais de trinta dias
consecutivos, fato que normalmente ocorre no início do tratamento, quando o paciente
tem uma melhora significativa dos sintomas. Contudo, isso é um fator preocupante, tendo
em vista que o paciente que não finaliza o tratamento não obtém a cura, e isso leva ao não
rompimento da cadeia de transmissão, pois o paciente permanece sendo uma fonte de
contágio. Outro agravante é que o abandono leva à resistência medicamentosa e à recidiva
da doença, as quais impõem dificuldades ao processo de cura, aumentando o tempo e o
custo do tratamento (MENDES; FENSTERSEIFER, 2004).
Vários fatores podem estar ligados ao abandono do tratamento, sendo os principais
os efeitos colaterais, uso irregular da medicação, baixo nível socioeconômico, internações
por outras doenças, os hábitos de vida, falha dos profissionais na orientação ao paciente
(OLIVEIRA; MOREIRA FILHO, 2000).
Além do abando ao tratamento, que é um empecilho para a cura efetiva da doença,
outro aspecto importante a ser ressaltado é no tocante a negligência em relação a doença,
pois mesmo sendo uma doença antiga, descoberta há mais de 3.400 anos antes de Cristo,
ela continua a atingir pessoas em todo o mundo. Assim, tem-se que tuberculose contribui
para aumentar a desigualdade social e mesmo existindo investimento para pesquisas no
tratamento da doença, os resultados dos estudos não são suficientes para eliminar e/ou
controlar a enfermidade (BRASIL, 2010). Uma das justificativas para esse fato é que a
doença tem baixo interesse da indústria farmacêutica devido ao pouco lucro e pouco
potencial comercial, por isso a indústria farmacêutica tem relutado em investir nesse
mercado (BRASIL, 2010; HARPER, 2007). É importante ressaltar que a Tuberculose é
negligenciada tanto pelo poder público como também pela comunidade científica, por
acreditar que a doença estaria controlada, contudo a tuberculose continua a vitimar várias
pessoas em todo o mundo (NETTO, 2002).
2.1.1.3. FÁRMACOS TUBERCULOSTÁTICOS
2.1.1.4.ISONIAZIDA
27
A isoniazida também conhecida por hidrazida do ácido 4-piridinacarboxílico é um
pró-fármaco sintético com atividade tuberculostática. Depois de sua conversão a
metabólito ativo inibe a síntese do ácido micólico interferindo na síntese da parece celular
(MINNEMAN et al., 2006). Sua denominação comum internacional é isoniazidum,
apresenta fórmula molecular C6H7N3O e massa molecular em g/mol de 137,14 (figura 1).
Tem como características ser um pó cristalino de cor branca ou incolor, facilmente solúvel
em água, ligeiramente solúvel em etanol, pouco solúvel em clorofórmio, praticamente
insolúvel em benzeno e éter etílico. Contém no mínimo 98% e, no máximo, 102% de
C6H7N3O em relação a substância dessecada (BRASIL, 2010.). Para identificação pode-
se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de
isoniazida, substância química de referência (SQR). Pode-se também observar absorções
características em 212 e 265 nm no espectro ultravioleta e por cromatografia liquida de
alta eficiência apresenta pico de retenção igual ao da solução padrão preparada com
isoniazida SQR (BRASIL, 2010).
Figura 1 - Estrutura química da isoniazida
Fonte: Kelly Sivocy, 2017.
2.1.1.5.PIRAZINAMIDA
A pirazinamida, também conhecida por 2-pirazinacarboxamida, é um análogo
sintético da nicotinamida atuando na interferência do gene que codifica a síntese do ácido
graxo do bacilo interrompendo a síntese da parece celular bacteriana (MINNEMAN et
al., 2006). Sua denominação comum internacional é pyrazinamidum, apresenta fórmula
molecular C5H5N3O e massa molecular em g/ mol de 123,11 (figura 2). Tem como
características ser um pó cristalino, branco ou quase branco, ligeiramente solúvel em
água, pouco solúvel em etanol, éter etílico e clorofórmio. Contém no mínimo 99% e, no
máximo, 101% de C5H5N3O em relação a substância anidra (BRASIL, 2010.). Para
identificação pode-se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com
espectro de pirazinamida SQR, pode-se também observar máximo e mínimo idêntico a
28
solução similar de pirazinamida SQR entre 200 a 400 nm no espectro ultravioleta,
desenvolve coloração alaranjada quando em reação com sulfato ferroso e em presença de
hidróxido de sódio a solução adquire cor azul escura. E, por aquecimento com hidróxido
de sódio desprende-se odor característico de amônia (BRASIL, 2010).
Figura 2 – Estrutura química da pirazinamida
Fonte: Kelly Sivocy, 2017.
2.1.1.6.ETAMBUTOL
O Cloridrato de (2S,2'S)-2,2'-(1,2-etanodiildiimino) bis-1-butanol (2:1) é um
fármaco com efeito contra as micobactérias apresentando ação após 24 horas depois de
administrada. Não se sabe ao certo o mecanismo de ação, mas acredita-se que interfere
na síntese de polissacarídeos e síntese da parede celular (RANG et al., 2007). A
denominação comum internacional é ethambutoli hydrochloridum, que apresenta formula
molecular C10H24N2O2. HCl e massa molecular em g/mol de 277,23 (figura 3), tem como
características ser um pó branco, cristalino, inodoro, sabor amargo e higroscópico,
facilmente solúvel em água, solúvel em etanol e metanol, pouco solúvel em clorofórmio
e praticamente insolúvel em éter etílico. Contém no mínimo 97% e, no máximo, 101%
de C10H24N2O2. HCl em relação a substância dessecada (BRASIL, 2010). Para
identificação pode-se utilizar absorção no espectro de infravermelho comparando-se com
espectro de cloridrato de etambutol SQR. Desenvolve coloração azul quando em reação
com sulfato cúprico e por último pode responder a reação de íon cloreto quando em
solução aquosa a 10% (BRASIL, 2010).
Figura 3 – Estrutura química do etambutol
Fonte: Kelly Sivocy, 2017.
2.1.1.7.RIFAMPICINA
29
A rifampicina é um agente antibacteriano da classe dos macrocíclicos complexos
com atividade tuberculostática. Sua ação bacteriostática se dá devido à inibição da síntese
do RNA bacteriano, interferindo com a polimerase do DNA dependente (CAÑADA,
2002). Pela denominação comum internacional é conhecida como rifampicinum,
apresenta formula molecular C43H58N4O12 e massa molecular em g/mol de 822,94 (Figura
4). Tem como características ser um pó cristalino de cor castanho avermelhado a
vermelho acastanhado, pouco solúvel em água, solúvel em metanol, pouco solúvel em
acetona e etanol. Contém no mínimo 97% e, no máximo, 102% de C43H58N4O12
(BRASIL, 2010). É bastante sensível a luz sendo, portanto, necessário ambiente de
trabalho com baixa luminosidade (CAÑADA, 2002). Para identificação pode-se utilizar
absorção no espectro de infravermelho comparando-se com espectro de rifampicina SQR,
pode-se também observar absorções características em 237, 254, 334 e 475 nm no
espectro ultravioleta e por reação de coloração com persulfato de amônio a 10%
(BRASIL, 2010).
Figura 4 – Estrutura química da rifampicina
Fonte: Kelly Sivocy, 2017.
2.1.1.8. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS NA INDÚSTRIA
FARMACÊUTICA
As Boas Práticas de Fabricação (BPF) são um conjunto de ações voltadas ao
controle de qualidade na indústria farmacêutica que visam minimizar os riscos inerentes
ao processo produtivo. São divididas em duas etapas, o controle de qualidade durante o
processo e o controle de qualidade do produto final (BRASIL, 2010).
A tecnologia de processo analítico (PAT) foi implementada pela FDA para
estabelecer as BPF para o século XXI: “ Um sistema para projetar, analisar e controlar a
30
fabricação através de medidas críticas de qualidade (durante o processo), com objetivo de
certificar a qualidade do produto final (ICH, 2009) ”.
Para cumprir com as novas exigências dos órgãos regulamentadores, a indústria
farmacêutica precisa desenvolver metodologias que possam monitorar a qualidade in-
line/ on-line em um processo produtivo, principalmente em medicamentos em associação,
em que há a mistura de dois ou mais fármacos na mesma forma farmacêutica e que
demanda técnicas analíticas dispendiosas, como as descritas para o medicamento dose
fixa combinada da tuberculose.
Nas farmacopeias americana e internacional, os métodos analíticos para
doseamento dos ativos em medicamentos para o tratamento de tuberculose normalmente
são descritos para serem analisados individualmente ou associados apenas com três
fármacos (USP, 2014; THE INTERNATIONAL PHARMACOPOEIA, 2015). Já na
farmacopeia brasileira há poucas monografias que se referem ao doseamento simultâneo,
porém, nenhumas destas monografias são de medicamentos antituberculostáticos
(BRASIL, 2010).
Várias são as técnicas analíticas voltadas para o controle de qualidade da indústria
farmacêutica, sendo elas responsáveis tanto para o controle em processo como para o
controle do produto final. Dentre elas, podemos destacar a cromatografia líquida de alta
eficiência e a espectroscopia UV-VIS (ALCALÀ, et al., 2010).
Uma das técnicas analíticas mais utilizadas para separação é a cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE), pois possui alto poder de resolução, separação rápida,
monitoramento contínuo do eluente, fácil adaptação a determinadas análises
quantitativas, pode ser utilizada em produtos não voláteis ou termicamente instáveis e é
utilizada para uma ampla quantidade de substâncias (SKOOG; HOLLER; NIEMAN,
2002 e VOGEL, 2002).
Vários trabalhos reportam a utilização de CLAE em análises multivariadas:
Hassib, Farag e Elkady (2011) determinaram estearato de eritromicina e trimetoprim em
comprimidos; Gallego e Arroyo em 2003 analisaram prednisolona, sulfacetamida e
fenilefrena, e em 2002 analisaram dexametasona e trimetoprim; Carlucci et al., (2000)
determinaram losartam e hidroclorotiazida. Süzen, Akay e Cevheroglu (1999) analisaram
guaseifenesina e fosfato de codeína em comprimidos, dentre outros citados na literatura.
Entretanto, ao se verificar o uso de CLAE no processo produtivo dentro de uma indústria
farmacêutica, principalmente voltada para o PAT, essa metodologia passa a ser um
31
problema, pois é trabalhosa, consome grandes quantidades de reagentes, várias
manipulações analíticas são necessárias, geram resíduos químicos prejudiciais ao meio
ambiente, além de serem destrutivas e serem realizadas por pessoas capacitadas (USP,
2014; THE INTERNATIONAL PHARMACOPOEIA, 2015, BRASIL, 2010).
As técnicas espectrofotométricas no UV/VIS para identificação e quantificação de
medicamentos está fundamentada na absorção da energia eletromagnética por moléculas
que depende tanto da concentração quanto da estrutura da mesma (BRASIL, 2010).
Apresenta como vantagens: oferecer resultado satisfatório, custo baixo, menor trabalho
na preparação das amostras, menor tempo de análise e mínima geração de resíduos
(SKOOG, et al., 2000).
As regiões do espectro eletromagnético às quais pertencem a faixa de energia
ultravioleta e visível está compreendida entre aproximadamente 200 a 800 nm, em que se
pode verificar que muitos fármacos apresentam sinal intenso, sendo, portanto, sua
determinação viável mesmo em concentrações pequenas (MADAN; DWIVEDI; SINGH,
2005; HARRIS, 2001). Porém, para determinadas análises onde os grupos responsáveis
pela absorção da luz (cromóforos) apresentam semelhanças químicas há uma
sobreposição espectral interferindo na seletividade da técnica, assim, é necessário a
utilização de pré-processamento da amostra (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1997), que
normalmente adicionam etapas que poderiam interferir na validação do método.
2.1.1.9. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO (NIR E MID) PARA
ANÁLISE DE FÁRMACOS
A radiação no infravermelho (IV) só ocorre quando há interação da molécula com
o campo eletromagnético oscilando em frequência semelhante (SKOOG et al., 2000). Os
átomos dos compostos orgânicos vibram com elevada amplitude ao redor das ligações
covalentes, desta forma, os compostos absorvem energia IV nas regiões do espectro,
formando as bandas (SCHARDER, 1995; SKOOG et al.., 2000).
A região do IV corresponde a parte do espectro eletromagnético que vai da faixa
de 10000 a 100 cm-1, sendo dividida em três regiões conhecidas como: FIR –
infravermelho distante, MID – infravermelho médio e NIR – infravermelho próximo. No
quadro 2 são apresentados os limites para cada região, segundo Skoog et al., (2000). No
MID as bandas correspondem as transições fundamentais e no NIR as absorções
32
moleculares de sobretons e combinações do espectro estão correlacionadas às vibrações
de ligações C-H, N-H, O-H entre outras (BARBOSA, 2008).
Quadro 2 – Regiões espectrais do infravermelho
Região Intervalo em número de
ondas (cm-1)
Intervalo em comprimentos
de ondas (nm)
NIR (próximo) 12800 a 4000 780 - 2500
MID (médio) 4000 a 200 2500 - 5000
FIR (distante) 200 a 10 5000 - 100000 Fonte: SKOOG, et al., 2000.
A espectroscopia no infravermelho como ferramenta analítica já é utilizada há
bastante tempo dentro da área de controle de qualidade seja ela farmacêutica, alimento,
química ou têxtil, sendo a espectroscopia no infravermelho médio (MID) responsável pela
impressão digital de várias substâncias (SWARBRICK, 2007). Já a espectroscopia no
infravermelho próximo (NIR) só passou a ser utilizada a partir da década de setenta,
voltada para a área de agricultura (WILLIAMS; NORRIS, 1998).
O desenvolvimento desta técnica só foi possível graças a evolução dos
equipamentos mecânicos e ópticos como o espectrofotômetro com transformada de
Fourier que coleta os dados em todas as frequências do espectro, sendo adquirido
rapidamente e em melhor qualidade (STUART, 2004; COATES, 1999).
Os espetros de IV podem ser adquiridos de duas formas: métodos de transmitância
e de reflectância. Para a transmitância podem ser analisadas amostras líquidas, gasosas
ou sólidas, que tem como base a absorção da radiação IV em número de ondas específicos
enquanto passa através da amostra. Já o método de reflectância pode ser de duas formas:
A reflexão interna como a reflectância total atenuada (ATR) e a reflexão externa que pode
ser especular ou difusa (STUART, 2004; PARISOTTO et al., 2009). Na figura 5 é
possível observar um esquema de como ocorre o espalhamento da radiação, e como ela é
coletada pelos espelhos que direcionam para o detector na reflectância especular e difusa
(DAVIDSON; PARRY-HILL; SUTTER, 2005).
33
Figura 5 – Representação da técnica de reflectância especular e difusa
Fonte: DAVIDSON; PARRY-HILL; SUTTER, 2005
O método por reflectância difusa tem sido utilizado como processo de inovação
para análise e controle de qualidade dos IFA em função do baixo custo de análise, ser
uma técnica não destrutiva, simples e rápida além de não gerar resíduos químicos
(TREVISAN; POPPI, 2006; LUYPAERT, MASSART, VANDER HEYDEN, 2007;
SWARBRICK, 2007; MANTANUS et al., 2010). Por esses motivos, a literatura é farta
em descrever a utilização desse método tanto em NIR como em MID: Marson et al.
(2016) utilizaram MID para quantificação simultânea de artesunato e mefloquina em
comprimido DFC; no estudo de Chavez et al. (2015) foi realizado o desenvolvimento de
métodos por NIR para determinar o conteúdo ativo de comprimidos farmacêuticos não
revestidos associado a tecnologia PAT e ao conceito de quality by desing; uma abordagem
de tecnologia analítica de processo para a produção de comprimidos dose fixa combinada
de zidovudina e lamivudina usando NIR e imagens químicas foi desenvolvido por
Grangeiro Júnior et al. (2015); Martelo-Vidal e Vazquez (2014) usaram NIR e
ferramentas quimiométricas para determinar compostos polifenólicos em vinhos tintos;
Silva et al. (2012) desenvolveram e validaram um método de calibração multivariada com
NIR para determinação de amoxicilina em suspensões; Müller et al (2012) determinaram
súlfur total em resíduos de destilação de petróleo com MID e método de seleção variável;
Mazurek e Szostak (2011) avaliaram a influência da área de amostra na quantificação de
diclofenaco de sódio por MID; Cordeiro et al. (2011) usaram determinação
espectroscópica multivariada para doseamento da associação lamivudina/zidovudina; Em
Müller et al. (2011) foi determinado simultaneamente o ácido clavulânico e amoxicilina
em formulações farmacêuticas por espectroscopia no invravermelho; Rocha e Silva
Reflectância especular Reflectância difusa
34
(2010) determinaram glicerol livre em biodiesel por NIR; o controle de etapas no processo
de produção de comprimidos de paracetamol por NIR foi realizado por Blanco, Mestanza
e Peguero (2010).
Os avanços na utilização do NIR e MID dentro da área do medicamento só foram
possíveis devido à associação com métodos quimiométricos de análise e calibração
multivariada para superar os inconvenientes de sobreposição de bandas nas leituras dos
espectros, principalmente em amostras contendo mais de um IFA e seus excipientes
(ROGGO et al., 2007; POLLANEN et al., 2005).
2.1.1.10. QUIMIOMETRIA
A Sociedade Internacional de Quimiometria (International Chemometrics Society
– ICS) tem a seguinte definição para quimiometria: “É a ciência relacionada a medidas
realizadas em um sistema ou processo químico, obtendo informações sobre o estado do
sistema através da aplicação de métodos matemáticos ou estatísticos”
(WIKIPEDIA.ORG). Essa ciência nasceu da necessidade de se analisar as várias
respostas dadas pelos instrumentos analíticos (FERREIRA, et al., 1999; HOPKE, 2003).
A quimiometria começou a ser utilizada no Brasil há um pouco mais de 30 anos,
tendo nos cursos de química o seu maior aliado, porém, hoje em dia, sua utilização vai
muito além do que foi proposto no início. É muito utilizada nas áreas de controle de
qualidade da indústria farmacêutica, em psicometria (área da psicologia), em biometria
(área da biologia) e em econometria (área da economia) (NETO, et al., 2006).
Para o controle de qualidade na indústria farmacêutica, os métodos mais utilizados
são: PCA (análise de componentes principais) para a análise exploratória não
supervisionada e o PLS (quadrados mínimos parciais) para a construção dos modelos de
calibração multivariada.
A análise exploratória não supervisionada se baseia em métodos de
reconhecimento de padrões para verificar as igualdades e/ou diferenças entre amostras de
um determinado conjunto de dados (BEEBE, 1998). É utilizado como base principal a
PCA, pois este procedimento matemático transforma os dados iniciais em um novo
sistema de eixos, com um número reduzido de novas variáveis, chamadas de componentes
principais (REICH, 2005; NETO, et al., 2006).
35
A calibração multivariada tem como função estabelecer uma relação entre dois
blocos de dados, quando houver uma dependência entre as propriedades que descrevem
cada uma delas, como, por exemplo, as ligadas à lei de Lambert-Beer em que há uma
constante de proporcionalidade entre a concentração e a intensidade de absorção
(FERREIRA, et al., 1999). O método mais utilizado em análises farmacêuticas para a
calibração multivariada é o PLS, no qual duas matrizes (uma relacionada aos sinais
instrumentais - X e a outra às variáveis dependentes -y) são relacionadas e decompostas
para serem feitas as previsões dos modelos e posteriormente a calibração (BARTHUS;
MAZO; POPPI, 2005; MADAN; DWIVEDI; SINGH, 2005).
Uma etapa antes de se escolher o método de PLS adequado é a transformação
prévia dos dados, que serão utilizados na construção do modelo com o intuito de
minimizar problemas como o espalhamento de luz, ruídos, desvios na linha de base,
dentre outros. Os pré-processamentos mais utilizados são correção multiplicativa de sinal
(MSC), alisamento (smooth), derivadas, centrar na média e escalonamento (FERREIRA,
et al., 1999; REICH, 2005).
O PLS pode ser realizado de duas formas: o PLS1 e o PLS2. O PLS1 consiste em
utilizar na matriz de variáveis dependentes – y um único conjunto de dados, enquanto que
no PLS2 pode-se utilizar dois ou mais conjunto de dados (BRERETON, 2000; SENA et
al., 2004). Brereton (2000), demonstra que em alguns casos o desenvolvimento do modelo
PLS2 na tentativa de estimar dois ou mais fármacos pode ser falha, sendo preferível suas
estimativas de maneira individual pelo método do PLS1.
Outro passo importante no desenvolvimento de um modelo de calibração
multivariada é a escolha do número de variáveis latentes (VL). Essas VLs explicam uma
porção dos dados utilizados, chamado de variabilidade. A variabilidade é aumentada com
o aumento das VL e isso pode ser prejudicial devido a incluir no modelo a interpretação
dos ruídos presentes nos espectros (PASQUINI, 2003). Assim, é importante que a escolha
do número de VLs do modelo sejam feitas pelo software utilizado, mas, principalmente
seja definida pela avaliação final do analista, pois a utilização de um número de VLs
pequena pode fornecer resultados insatisfatórios uma vez que informações importantes
foram desconsideradas (underfitted – subajustado) e um número grande de VLs pode
demonstrar a introdução de informações em excesso, o overfitting (superajuste)
(MORGANO et al., 2005; CONZEN, 2006; ARAUJO, 2007; FERREIRA, 2015).
36
Uma forma de se determinar o número de VLs é através do método de validação
cruzada (leave-one-out), no qual uma amostra é retirada do modelo e o modelo é
construído, posteriormente essa amostra retirada é prevista, então calculada a soma dos
erros quadráticos da validação cruzada (RMSECV) (PASQUINI, 2003, CONZEN, 2006;
ARAÚJO, 2007, FERREIRA, 2015). Ao se encontrar o menor valor de RMSECV pode-
se concluir como o melhor número de VLs do modelo desenvolvido (FERREIRA et al.,
1999).
A presença de amostras anômalas ou outliers é tão importante quanto a
determinação das VLs, visto que esses outliers são elementos muito distintos do conjunto
de dados analisados ou por apresentarem erros grosseiros quando comparados a maioria
dos dados, e que na maioria das vezes torna o modelo não representativo, ou seja, levam
a resultados que indicam incapacidade de previsão das amostras (QUEJI, 2008; COZEN,
2006). Este tipo de análise é feito avaliando o gráfico de resíduos de Student versus
leverage. Os dados de resíduos de Student são correspondentes aos desvios entre os dados
de referência e os estimados pelo modelo, já os dados do leverage são as medidas de
influência de uma amostra no modelo de regressão (FERREIRA et al., 1999; COZEN,
2006; ARAUJO, 2007, ASTM, 2012).
Ao se avaliar os dados de leverage e resíduos de Student é necessário verificar a
real necessidade de eliminação da amostra do modelo quando ultrapassados os limites
individuais, porém, quando os dados são ultrapassados simultaneamente é imprescindível
a retirada da amostra do modelo, pois aí se caracteriza como uma amostra anômala por
completo (FERREIRA et al., 1999; PASQUINI, 2003).
2.1.1.11. VALIDAÇÃO ANALÍTICA
Segundo as BPF, a validação de novos métodos analíticos precisa demonstrar que
os resultados obtidos são confiáveis e adequados à finalidade pretendida (BRASIL,
2010). Assim, a validação irá demonstrar através de estudos estatísticos a garantia do
desempenho do método desenvolvido (BRASIL, 2003). Quando se fala em dados
univariados há uma harmonização pelos órgãos reguladores nacionais e internacionais.
Porém, o mesmo não ocorre quando se trata de dados multivariados nos quais poucos são
os documentos que auxiliam na validação (BRITO et al., 2003).
37
Os parâmetros que devem ser determinados pela validação de um processo
analítico por calibração multivariada são chamados de figuras de mérito, tendo que
atender a determinadas especificações impostas por órgãos reguladores ou pelas
indústrias de medicamentos (VALDERRAMA, BRAGA, POPPI, 2009).
Algumas das figuras de mérito multivariadas podem ser estimadas de maneira
similar aos métodos de calibração univariada: precisão e exatidão (VALDERRAMA,
BRAGA, POPPI, 2009).
A precisão avalia a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas
de uma amostragem múltipla. É expressa em desvio padrão relativo (DPR), que consiste
na razão do desvio padrão (DP) pela concentração média determinada (CMD) expressa
em porcentagem. O nível repetibilidade é a concordância dos resultados obtidos pelo
mesmo analista em um mesmo instrumento analisando concentrações baixas, médias e
altas em triplicata (BRASIL, 2003).
A exatidão é a proximidade dos resultados em comparação com um valor
verdadeiro, sendo avaliada pelo erro percentual em relação ao valor nominal, e é
satisfatória quando o erro percentual chega até ±2% do valor nominal (BRASIL, 2003).
Já a linearidade, por ser a capacidade de demonstrar que o método analítico
apresenta resultados diretamente proporcionais a concentração do analito, não tem como
ser calculada desta forma no método multivariado, sendo, portanto avaliada geralmente
com base no resultado previsto em relação ao resultado obtido pelo método de referência
(VALDERRAMA, BRAGA, POPPI, 2009).
3. OBJETIVOS
3.1.1.1. GERAL
Desenvolver e validar um modelo de calibração multivariada para determinação
simultânea de rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol em
comprimido DFC empregando a técnica de Espectroscopia no Infravermelho (NIR).
3.1.1.2. ESPECÍFICOS
38
✓ Desenvolver modelos de calibração multivariada empregando a Espectroscopia no
Infravermelho (NIR) para quantificação simultânea de rifampicina, isoniazida,
pirazinamida e cloridrato de etambutol em comprimido DFC;
✓ Aplicar as técnicas de referência para análise dos quatro insumos farmacêuticos
ativos: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol associados em
uma única forma farmacêutica;
✓ Utilizar a quimiometria para o tratamento dos espectros obtidos, fazendo uso dos
métodos PCA (análise de componentes principais) para a análise exploratória não
supervisionada e o PLS (quadrados mínimos parciais) para a construção dos modelos
de calibração multivariada;
✓ Validar o modelo multivariado de melhor desempenho na quantificação dos IFA e
comparar os resultados com a técnica de referência (CLAE);
✓ Aplicar o modelo multivariado (NIR e MID) desenvolvido em amostras DFC
distribuídas pelo SUS, para o tratamento da tuberculose, e comparar os resultados
obtidos com metodologia de referência.
4. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
4.1.1.1. MATERIAIS: AMOSTRA, PADRÕES, REAGENTES, SOLVENTES
UTILIZADOS, EQUIPAMENTOS E SOFTWARES
Os comprimidos dose fixa combinada para o tratamento da tuberculose são
compostos por rifampicina (150mg), isoniazida (75mg), pirazinamida (400mg) e
etambutol (275mg). Os lotes utilizados durante essa pesquisa foram doados pela
Secretaria Municipal de Saúde (Fortaleza - Ce), a data de fabricação e data de validade
destes comprimidos estão apresentadas na tabela 1, vale salientar que todos são de um
mesmo fabricante.
Tabela 1 – Informações adicionais dos comprimidos DFC
Lote Data de fabricação Data de validade
2589 12/2014 11/2017
2651 02/2015 01/2018
2688 03/2015 02/2018 FONTE: Kelly Sivocy, 2017
39
Como não é declarado na bula do medicamento e nem há informações do
fabricante em relação a composição dos comprimidos foi necessário a realização de
deformulação, a engenharia reversa do comprimido para se definir o perfil quali/
quantitativo dos excipientes presente no medicamento. Para que isso fosse possível,
alguns excipientes foram escolhidos de acordo com um levantamento farmacotécnico,
segundo as funções necessárias para a composição do comprimido: alginato de sódio
(Ativos Magistrais), amido de milho (Corn Product), celulose microcristalina 101
(Mingtal Chemical), dióxido de silício coloidal (Ativos Magistrais), lactote (Henrifarma),
estearato de magnésio (ACM do Brasil Ltda), gelatina em pó (Synth), lauril sulfato de
sódio (Primacom), methocel A15 (Colorcon), polivinilpirrolidona K30 (Viafarma),
polivinilpirrolidona K90 (Viafarma), macrogol 6000 (Vetec), talco (Magnesita), dióxido
de titânio (dinâmica), hipromelose (Colorcon), óxido de ferro (dinâmica), ácido ascórbico
(Viafarma), amido glicolato de sódio e croscarmelose (Blanver Farmoquímica Ltda). Os
IFA utilizados foram a rifampicina – 99,30% (Sanofi-aventis), etambutol – 99,80%
(Lupin Limited), isoniazida – 99,67% (Amsal Chem Private Limited), pirazinamida –
99,36% (Calyx Chemicals & Pharmaceuticals Limited).
Após definição da formulação, misturas foram preparadas para compor o conjunto
de calibração (nomeadas de 1 a 31) e conjunto de validação (nomeadas de 32 a 49) de
acordo com o planejamento experimental.
As substâncias químicas de referência utilizadas foram rifampicina e etambutol
da United States Pharmacopeia (USP) e a isoniazida e pirazinamida da farmacopeia
brasileira (SQRFB). Estes padrões foram utilizados para as análises em cromatografia
liquida de alta eficiência (CLAE).
Para as análises do método padrão de doseamento dos 4 ativos foi necessário a
utilização dos seguintes reagentes e solventes: acetato de amônio (Dinâmica), acetato de
cobre II (Dinâmica), ácido acético glacial P.A. (Vetec), metanol grau CLAE (J.T. Baker),
água ultrapura Milli-Q (Millipore, Milford, EUA), fosfato monopotássico (Nuclear),
hidróxido de sódio (Dinâmica).
Nas pesagens foi utilizada balança analítica (Sartorius – Ba-06). E as soluções
tampões foram preparadas e o pH ajustado em um medidor de pH com eletrodo de vidro
(Gehaka – PG2000).
As análises envolvendo cromatografia líquida de alta eficiência foram realizadas
em um cromatógrafo (Hitachi – Elite Ultra), equipado com coluna C18 (15 cm x 4,6 mm
40
– ACE-5) e (25 cm x 4,6 mm – Luna - Phenomenex) e detector UV (matriz de diodo),
utilizando o método de referência descrito na farmacopeia internacional 15ª edição
(FARMACOPEIA INTERNACIONAL, 2015).
Os espectros de todas as amostras foram lidos na faixa de 10.000 a 4.000 cm-1 e
4.000 a 700 cm-1 utilizando um espectrofotômetro Infravermelho (IRPrestige-21 -
Shimadzu) com resolução de 4 cm-1 e 20 varreduras. Os dados crus foram compilados em
formato ASCII.
Na elaboração do planejamento experimental foi utilizado o programa Statistica
13 (StatSoft Inc.). Todos os espectros foram tratados por ferramentas computacionais de
análise multivariada, utilizando a análise por componente principal (PCA), e regressão de
mínimos quadrados parciais (PLS) através do programa pirouette 3.11 (Infometrix, Inc.).
As seleções de variáveis foram realizadas pelo programa QSAR modeling (MARTINS &
FERREIRA, 2013).
4.1.1.2. MÉTODOS
4.1.1.3.MÉTODOS DE REFERÊNCIA PARA DETERMINAÇÂO DO TEOR DE
RIFAMPICINA, ISONIAZIDA, PIRAZINAMIDA E ETAMBUTOL
(MÉTODO CROMATOGRÁFICO)
As análises cromatográficas foram realizadas de acordo com a farmacopeia
internacional 15ª edição (FARMACOPEIA INTERNACIONAL, 2015), onde há uma
divisão do método para análise dos quatro ativos, sendo um método para rifampicina e
outro para isoniazida, pirazinamida e etambutol. As condições descritas na farmacopeia
estão resumidas na tabela 2.
Tabela 2 – Condições analíticas empregadas para o doseamento dos insumos farmacêuticos ativos
Rifampicina Isoniazida, pirazinamida e etambutol
Coluna RP C18, 25 cm x 4,6mm
e porosidade 5 µm
RP C18, 15 cm x 4,6mm e porosidade 5
µm
Detecção 254 nm 270 nm
Fluxo 1,0 mL/min 2,0 mL/min
Fase móvel Fosfato de potássio
monobásico
Hidróxido de sódio
Metanol
Acetato de amônio
Acetato de cobre II
Ácido acético glacial
Metanol
41
Proporção da
fase móvel
Metanol: tampão fosfato
(70:30)
Tampão acetato: metanol (94:6)
pH da fase
móvel
7,0 5,0
Volume de
injeção
20 µL 20 µL
Fonte: FARMACOPEIA INTERNACIONAL, 2015
Para o preparo da fase móvel de rifampicina foi preparado previamente o tampão
fosfato onde foi pesado 1,36g de fosfato de potássio monobásico para um litro de água
Milli-Q e o pH ajustado para 7,0 com solução volumétrica de hidróxido de sódio 0,1
mol/L, anteriormente preparada. A fase móvel consistiu da mistura de metanol e tampão
fosfato pH 7,0 na proporção 70:30. Essa mistura foi filtrada em membrana filtrante de
acetato de celulose 0,45 µm e 47 mm de diâmetro e desgaseificada antes de ser colocada
no cromatógrafo.
No preparo das amostras de comprimido foram pesados 20 comprimidos de cada
lote, posteriormente triturados e uma quantidade de pó contendo cerca de 10 mg de
rifampicina foi pesada e transferida para um balão volumétrico de 50 mL. Esse pó foi
dissolvido em uma solução de tampão fosfato pH 7,0 e metanol (60:40). E completado o
volume com o mesmo solvente. Essa solução foi filtrada em filtro de seringa nylon de
0,45 µm e imediatamente injetada no cromatógrafo.
Para as misturas dos IFA numeradas de 1 a 49, uma quantidade de pó contendo
cerca de 10 mg de rifampicina foi pesada e transferida para um balão volumétrico de 50
mL. Esse pó foi dissolvido uma solução de tampão fosfato pH 7,0 e metanol (60:40). E
completado o volume com o mesmo solvente. Essa solução foi filtrada em filtro de seringa
nylon de 0,45 µm e imediatamente injetada no cromatógrafo.
No preparo da solução padrão de rifampicina, 10mg de rifampicina SQR foi
dissolvida em balão volumétrico de 50 mL com metanol.
Para a análise de isoniazida, pirazinamida e etambutol foi preparado o tampão
acetato pH 5,0 pesando 50 g de acetato de amônio R e 0,2 g de acetato de cobre (II) R em
um litro de água Milli-Q e pH ajustado com ácido acético glacial R. A fase móvel foi
fabricada com a mistura desse tampão com metanol na proporção de 94:6, filtrada em
membrana filtrante de acetato de celulose 0,45 μm e 47 mm de diâmetro e desgaseificada
antes de ser colocada no cromatógrafo.
42
Para a preparação dos comprimidos foram pesados 20 comprimidos de cada lote,
posteriormente triturados e uma quantidade de pó contendo cerca de 10 mg de etambutol
foi pesada e transferida para um balão volumétrico de 50 mL. Esse pó foi dissolvido em
água Milli-Q e deixado em agitação por 15 minutos. O volume foi completado com o
mesmo solvente. Essa solução foi filtrada em filtro de seringa nylon de 0,45 µm e
imediatamente injetada no cromatógrafo.
Nas misturas de 1 a 49 uma quantidade de pó contendo cerca de 10 mg de
etambutol foi pesada e transferida para um balão volumétrico de 50 mL. Esse pó foi
dissolvido em água Milli-Q e deixado em agitação por 15 minutos. O volume foi
completado com o mesmo solvente. Essa solução foi filtrada em filtro de seringa nylon
de 0,45 µm e imediatamente injetada no cromatógrafo.
Já a solução padrão foi preparada dissolvendo 2,73 mg de isoniazida SQR, 14,55
mg de pirazinamida SQR e 10,0 mg de etambutol SQR em balão volumétrico de 50 mL
com água Milli-Q.
4.1.1.4.MÉTODO POR INFRAVERMELHO MÉDIO E PRÓXIMO (NIR E MID)
4.1.1.5. ANÁLISES PRELIMINARES: ESPECTROSCOPIA
Algumas etapas preliminares foram necessárias para se chegar ao objetivo
proposto por esse trabalho, dentre elas a obtenção dos espectros dos insumos
farmacêuticos ativos por MID e NIR, as análises das misturas somente dos ativos dois a
dois, três a três e dos quatro. Foram estudadas as regiões que são responsáveis por bandas
características de grupamentos e ligações químicas para cada IFA, além de verificado as
sobreposições dos espectros e possíveis regiões a serem utilizadas no desenvolvimento
dos modelos. Posteriormente, foram comparados os espectros da mistura quaternária com
o do medicamento, para verificar as semelhanças entre eles, e estudar se a presença de
sinais que caracterizam os IFA estão presentes no espectro do medicamento, indicando a
possibilidade de uma calibração multivariada.
4.1.1.6. SELEÇÃO DOS EXCIPIENTES
Observando as análises preliminares foi necessário a inclusão dos excipientes na
construção do modelo, para isso, foi realizado o desenvolvimento da deformulação, a
43
engenharia reversa, na qual primeiro foi feito um levantamento dos excipientes presentes
no comprimido com base na função farmacotécnica. Esses excipientes foram analisados
individualmente por espectroscopia de infravermelho médio (MID) para caracterização e
a seleção foi baseada nas bandas presente no comprimido.
Em seguida, foram realizadas misturas com os excipientes escolhidos
individualmente para tentar chegar a uma formulação cujo espectro de MID fosse o mais
próximo possível dos medicamentos analisados isso foi feito utilizando a análise do
componente principal (PCA) que consiste em encontrar as tendências e os agrupamentos
em um conjunto de amostras. Após essa fase, foi realizado o planejamento experimental
para a construção do modelo de calibração multivariada.
4.1.1.7. PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
Para a construção de um modelo de calibração multivariada é importante fazer a
seleção de um número significativo para as amostras de calibração e validação, garantindo
assim, a capacidade para representação do sistema em estudo. Desta forma, foram
consideradas as informações da American Society for testing and Materials (ASTM)
E1655-05 (2012) que determina que o número de amostras para calibração deverá ser 6
vezes o número de variáveis latentes mais um e o número de amostras de validação como
4 vezes o número de variáveis latentes. Pensando nisto, foi determinado que seriam
utilizados 4 fatores para o delineamento experimental, levando em consideração a
quantidade de ativos presentes na amostra que necessitava ser dosado.
Outra informação que deve ser considerada no planejamento experimental é o
intervalo do teor de medicamento que se pretende avaliar. Sendo assim, a faixa escolhida
para a variação do teor dos ativos foi de 90 a 110%, visto que esses são os limites
aceitáveis estabelecidos pela farmacopeia (FARMACOPEIA INTERNACIONAL,
2015). Na tabela 3 são apresentadas as variações dos valores utilizados de cada IFA no
preparo das misturas para o desenvolvimento dos modelos. E desta forma há possibilidade
de se manter pesos iguais nas misturas preparadas, não sendo necessário, portanto o ajuste
de peso.
44
Tabela 3 – Variações dos valores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos utilizados no preparo das misturas
para o desenvolvimento dos modelos
Insumo Farmacêutico
Ativo
Mínimo Central Máximo
Rifampicina 135,00 150,00 165,00
Isoniazida 67,00 75,00 82,00
Pirazinamida 360,00 400,00 440,00
Etambutol 247,00 275,00 302,00
FONTE: Kelly Sivocy, 2017
Para a construção do modelo, o planejamento experimental escolhido foi do tipo
composto central. Com a ajuda do programa statistica 13, no qual as amostras de
calibração (31 misturas) foram divididas por 4 fatores, com replica de 1 ponto central por
bloco, 3 blocos, com pontos axiais. Já as amostras de validação (18 misturas) foram
divididas por 4 fatores, sem réplica de ponto central, 2 blocos, com pontos axiais. Estes
dados podem ser vistos na figura 6.
45
Figura 6 - Representação gráfica do planejamento do tipo composto central dos ativos rifampicina (Rifa), isoniazida (Iso), pirazinamida (Pira), etambutol (Eta) e excipientes
(excip), demonstrando o conjunto de calibração (C) e o conjunto de validação (V).
Fonte: Kelly Sivocy, 2017.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C V V V V V V V V V V V V V V V V V V
Rifa Iso Pira Eta Excip
46
4.1.1.8. PREPARO DAS AMOSTRAS PARA A CONSTRUÇÃO DO MODELO
MULTIVARIADO
Cada mistura do planejamento tem uma massa média de 1030,00 mg (valor
originado do peso médio dos comprimidos) e foi preparada com a mistura dos quatro IFA
e dos excipientes de acordo com o planejamento fatorial, modelo composto central com
pontos axiais (tipo estrela). Para evitar fator de erro nas pesagens dos excipientes os
mesmos foram preparados em uma mistura única tendo como base as concentrações
determinadas pela engenharia reversa.
Os pós dos IFA e a mistura dos excipientes após pesadas foram homogeneizadas
em gral e pistilo de vidro para uma distribuição uniforme dos IFA e excipientes na
formação final da mistura. Os valores pesados, em mg, podem ser vistos na tabela 4.
Tabela 4 – Quantidade utilizada dos insumos farmacêuticos ativos (mg) e a mistura dos excipientes (mg)
na composição das amostras para o conjunto de calibração (1 - 31) e conjunto de validação (32 – 49).
Nomes Bl RIFA ISO PIRA ETA EXCIP Total
1 1 165,07 67,67 360,00 247,58 190,20 1030,52
2 1 135,02 82,67 360,07 247,53 205,07 1030,36
3 1 135,06 67,52 440,02 247,55 140,09 1030,24
4 1 165,02 82,51 440,03 247,57 95,00 1030,13
5 1 150,08 75,00 400,09 275,06 130,06 1030,29
6 1 150,02 75,00 400,01 275,01 130,05 1030,09
7 1 135,08 67,53 360,05 302,58 165,06 1030,30
8 1 165,01 82,53 360,03 302,49 120,00 1030,06
9 1 165,09 67,54 440,06 302,58 55,04 1030,31
10 1 135,02 82,54 440,01 302,52 70,05 1030,14
11 2 135,30 67,60 360,01 247,54 220,09 1030,54
12 2 165,07 82,59 360,30 247,57 175,05 1030,58
13 2 165,31 67,49 440,00 247,51 110,11 1030,42
14 2 135,00 82,56 440,16 247,48 125,16 1030,36
15 2 150,05 75,14 400,16 275,06 130,01 1030,42
16 2 150,14 75,18 400,58 274,99 130,00 1030,89
17 2 165,16 67,57 360,30 302,58 135,17 1030,78
18 2 135,17 82,58 360,66 302,52 150,17 1031,10
19 2 135,22 67,61 440,07 302,53 85,27 1030,70
20 2 165,06 82,49 440,40 302,56 40,02 1030,53
21 3 150,12 75,08 400,24 220,03 185,09 1030,56
22 3 150,06 75,12 320,20 275,03 210,04 1030,45
23 3 150,12 74,98 320,06 275,18 210,00 1030,34
47
24 3 150,06 60,15 400,27 275,06 145,02 1030,56
25 3 120,04 75,13 400,08 275,04 160,08 1030,37
26 3 120,10 75,08 400,04 275,02 160,00 1030,24
27 3 150,22 75,01 400,07 275,00 130,13 1030,43
28 3 150,06 75,18 400,10 275,08 130,10 1030,52
29 3 180,00 75,06 400,22 275,02 100,00 1030,30
30 3 150,00 75,23 480,00 275,03 50,09 1030,35
31 3 150,04 75,19 400,19 330,04 75,05 1030,51
32 1 135,02 67,53 360,02 247,53 220,10 1030,2
33 1 165,07 82,57 360,09 247,59 175,03 1030,35
34 1 135,02 67,57 440,06 247,50 140,06 1030,21
35 1 165,04 82,54 440,09 247,51 95,04 1030,22
36 1 150,06 75,09 400,02 275,09 130,05 1030,31
37 1 165,04 67,55 360,42 302,48 135,04 1030,53
38 1 135,07 82,56 360,39 302,53 150,10 1030,65
39 1 165,05 67,65 440,31 302,56 55,02 1030,59
40 1 135,09 82,52 440,21 302,58 70,14 1030,54
41 2 150,08 75,09 400,26 220,08 185,08 1030,59
42 2 150,07 75,05 320,34 274,99 210,16 1030,61
43 2 150,03 60,12 400,11 275,03 145,05 1030,34
44 2 120,02 75,18 400,00 274,98 160,15 1030,33
45 2 149,96 75,16 400,24 275,03 130,19 1030,58
46 2 180,00 75,07 400,09 275,03 100,13 1030,32
47 2 150,13 90,08 399,98 275,17 115,03 1030,39
48 2 150,06 75,03 480,03 275,05 50,02 1030,19
49 2 150,08 75,08 399,98 330,09 75,07 1030,30
Bl = Blocos; RIFA = rifampicina; ISO = isoniazida; PIRA = pirazinamida; ETA = etambutol; EXCIP =
excipientes
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
4.1.1.9. AQUISIÇÃO DOS ESPECTROS DE INFRAVERMELHO
Os espectros de todas as amostras foram obtidos na faixa de 10.000 a 4.000 cm-1
e 4.000 a 700 cm-1 utilizando um espectrofotômetro Infravermelho (IRPrestige-21 -
Shimadzu) com resolução de 4 cm-1 e 20 varreduras. Para o registro do espectro branco,
no MID, foi feito leitura sem amostra e para o NIR foi utilizado um aparato de ouro. Não
houve tratamento prévio da amostra, sendo a mesma colocada diretamente no
equipamento e feita a leitura. Todos os espectros foram registrados em temperatura
ambiente (22 ± 2°C) e umidade relativa do ar de 48% controlada.
48
4.1.1.10. DESENVOLVIMENTO DO MODELO MULTIVARIADO DE
CALIBRAÇÃO
Os dados foram organizados em matrizes contendo os valores de absorbâncias
obtidas entre 10000 a 4000 cm-1 para cada mistura (X) e os valores determinados por
método de HPLC formaram um vetor como variável dependente. (y). Os espectros brutos
fazem parte do conjunto de calibração (31 x 1558), validação (18 x 1558) e os
comprimidos (3 x 1558) para previsão do modelo. As leituras foram feitas em triplicata e
a média dos três espectros foi utilizada para a modelagem, pois ao se subtrair um espectro
do outro o resultado foi uma curva contendo apenas ruído experimental, comprovando
desta forma que os espectros são reprodutíveis (FERREIRA, 2015).
Alguns modelos multivariados foram elaborados através da combinação de
diferentes pré-processamentos e das técnicas de validação cruzada e validação externa.
As escolhas dos melhores modelos foram realizadas com base nos valores das seguintes
figuras de mérito: erros quadráticos de calibração (RMSEC), de validação cruzada
(RMSECV), erro padrão de previsão (RMSEP) e soma dos quadrados de erro de previsão
(PRESS). Além disso, a seleção do número de variáveis latentes (VL) foi fundamental
para a correta aceitação do modelo. Um outro ponto avaliado foi a identificação e
eliminação das amostras consideradas outliers, visto que essas podem afetar de maneira
contrária a capacidade preditiva do modelo. Para essa avaliação foram levados em
consideração os valores dos resíduos de Student e Leverage.
4.1.1.11. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
O método analítico foi validado considerando as figuras de mérito utilizadas em
modelos de calibração multivariada e critérios estabelecidos por normas nacionais e
internacionais em modelos univariados: precisão, exatidão e linearidade (BRASIL, 2003;
INMETRO, 2011; ICH, 1996; ASTM, 2012).
4.1.1.12. QUANTIFICAÇÃO DOS IFA NAS AMOSTRAS COMERCIAIS
Para validação dos modelos desenvolvidos, três amostras do medicamento foram
analisadas. Essas amostras são pertencentes ao mesmo fabricante, porém de lotes
diferentes. Como foi descrito na sessão de materiais.
49
Os ativos dos medicamentos foram quantificados por CLAE, seguindo o método
descrito na farmacopeia internacional (FARMACOPEIA INTERNACIONAL, 2015).
O pó resultante do triturado dos 20 comprimidos foi lido diretamente em fase
sólida no espectrofotômetro Infravermelho (IRPrestige-21 - Shimadzu) com resolução de
4 cm-1 na faixa de 10.000 a 4.000 cm-1 (NIR) e 4.000 a 700 cm-1 (MID).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1.1.1. ANÁLISES PRELIMINARES: ESPECTROSCOPIA
Os espectros dos quatro ativos (rifampiciana, isoniazida, pirazinamida e
etambutol) no MID e NIR são apresentados nas figuras 7 e 8. Devido a semelhança
estrutural entre os ativos, há algumas regiões em que a atribuição das bandas são análogas.
No MID é possível observar bandas características de grupos amina, amida, aromáticos,
carbonila e álcool (figura 7).
50
Figura 7 - Espectros de Infravermelho Médio (MID), sendo evidenciadas as bandas características de grupos
amina, amida, aromáticos, carbonila e álcool.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
75
80
85
90
95
100
% Re
flectâ
ncia
Número de Onda (cm-1)
O-H Alcool
C-O Alcool
C=O Carbonilas
C=C Aromático
N-H Deformação Angular
C-N
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
% Re
flectâ
ncia
Número de Onda (cm-1)
N-H aminas
N-H Deformação Angular
C-O Alcool C-N
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
65
70
75
80
85
90
95
100
% Re
flectâ
ncia
Número de Onda (cm-1)
N-H Amida
NH2 Amina
C=O Amida
C=C Aromático
C-N Aromático
N-H Deformação Angular
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
100
% Re
flectâ
ncia
Número de Onda (cm-1)
NH2 Amida
C=O Amida
C=C Aromático
C-N Aromático
N-H Deformação Angular
Rifampicina
Etambutol
Pirazinamida
Isoniazida
51
Já no infravermelho próximo, os espectros são provenientes de absorções
moleculares resultantes de bandas de combinação e sobretons de bandas fundamentais de
vibração do MID. Observando a figura 8 a região A (9092 – 8031 cm-1) referente ao
segundo sobretom para deformação da ligação C-H, pode-se sugerir que nessa região
todos os ativos podem ser quantificados, visto que há ligações C-H em todas as moléculas.
No entanto, Jamrógiewicz (2016) demonstra que nessa região são identificados
principalmente alcanos, logo seriam descartados os ativos pirazinamida e isoniazida para
essa região. Na região B (7144 – 5601 cm-1) são atribuídas bandas para as amidas (N-H),
deformação da ligação C-H (alcanos, alcenos e alcinos) e estiramento O-H referente ao
primeiro sobretom. Assim, para essa região a isoniazida e pirazinamida podem ser
identificadas devido ao grupo funcional amida, o etambutol pelo grupamento O-H e a
rifampicina por ambos os grupamentos. Para a região C (5130 – 4000 cm-1) os números
de onda são atribuídos ao C=O (amidas) referente ao segundo sobretom e a combinações
de vibrações para N-H (aminas) e O-H (álcool) onde também é possível a identificação
dos quatro ativos.
Figura 8 - Espectros de Infravermelho Próximo (NIR), sendo evidenciadas as regiões A, B e C referentes a
algumas bandas de combinações e sobretons.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
10000 9000 8000 7000 6000 5000 40000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Abs
orbâ
ncia
Número de Onda (cm-1)
Rifampicina
Isoniazida
Pirazinamida
Etambutol
CBA
52
Pode-se verificar que devido à complexidade dos espectros e sobreposições das
bandas uma quantificação da mistura quaternária dos fármacos ficaria prejudicada por
espectroscopia no infravermelho no modo univariado, sendo, portanto, uma alternativa a
utilização da calibração multivariada por meio do método de regressão PLS.
Antes de elaborar as análises multivariadas foi realizado MID e NIR da mistura
quaternária dos IFA e do medicamento para verificar se, visualmente, haveria
interferência dos excipientes nas análises, como pode ser visto na figura 9. Analisando
esses espectros é possível constatar que possivelmente há interferência dos excipientes
utilizados na preparação dos medicamentos (indicado nas setas) em se tratando de
desenvolvimento de um modelo de calibração multivariada. Isso porque nas bandas
destacadas há maior ou menor intensidade quando se compara o comprimido com a
mistura dos quatro ativos sem a presença de excipientes. E devido a resultados
preliminares, não demonstrados aqui, onde não foi possível desenvolver modelos de
calibração que pudessem prever a quantificação no medicamento, sugere-se que para se
ter um modelo confiável seja necessário a utilização dos excipientes no planejamento do
modelo de calibração utilizando NIR. Vale ressaltar que não se sabe ao certo quais
excipientes estão presentes no medicamento, pois isso não é descrito na bula.
Figura 9 - Espectros de MID (A) e NIR (B) da mistura quaternária e do medicamento. As setas indicam as
diferenças visuais detectadas.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
M_quaternária
Comprimido
Ref
lect
ânci
a%
Número de Onda (cm-1)
A
10000 9000 8000 7000 6000 5000 40000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Abs
orbâ
ncia
Número de onda (cm-1)
M_quaternária
Comprimido
B
53
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
5.1.1.2.ENGENHARIA REVERSA DO COMPRIMIDO
O intuito da engenharia reversa neste trabalho foi de chegar o mais próximo
possível ao medicamento para que se pudesse minimizar os erros no modelo de
calibração, visto que em análises preliminares a utilização dos excipientes mostrou-se
necessária. Para a deformulação do comprimido, primeiramente, foi feita a análise por
espectroscopia no infravermelho médio, dos seus ativos e excipientes, tendo como base
um levantamento das funções farmacotécnicas.
Cada composto analisado apresentou um espectro característico como pode ser
observado nas figuras: 10 (IFA: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol), 11
(material de revestimento: dióxido de titânio e óxido de ferro), 12 (diluentes, aglutinantes
e desagregantes: celulose microcristalina, amido de milho, lactose, polivinilpirrolidona
(k30 e k90), gelatina em pó, methocel, hipromelose, croscarmelose, aminoglicolato de
sódio e alginato de sódio) e 13 (deslizantes, lubrificantes e antioxidante: talco, dióxido
de silício coloidal (aerosil), estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, macrogol 6000
e Ácido ascórbico).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
60
70
80
90
M_quaternária
Comprimido
Ref
lect
ânci
a%
Número de Onda (cm-1)
A
10000 9000 8000 7000 6000 5000 40000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Ab
sorb
ân
cia
Número de onda (cm-1)
M_quaternária
Comprimido
B
54
Figura 10 – Espectros de MID dos IFA: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Figura 11 - Espectros de MID dos materiais de revestimento: dióxido de titânio e óxido de ferro.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 100060
80
100
Reflectâ
ncia
%
Número de onda (cm-1)
Etambutol
Isoniazida
Pirazinamida
Rifampicina
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
60
80
100
Re
flect
ânci
a %
Número de onda (cm-1)
Dioxido_tit
Oxido_Fe
55
Figura 12 - Espectros de MID dos diluentes, aglutinantes e desagregantes: celulose microcristalina, amido
de milho, lactose, polivinilpirrolidona (k30 e k90), gelatina em pó, methocel, hipromelose, croscarmelose,
aminoglicolato de sódio e alginato de sódio.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Figura 13 - Espectros de MID dos deslizantes, lubrificantes e antioxidante: talco, dióxido de silício coloidal
(aerosil), estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio, macrogol 6000 e Ácido ascórbico.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 100060
80
100
Re
flect
ânci
a %
Número de onda (cm-1)
Alginato_Na
Amido_milho
CMC_101
Gelatina
Hipromelose
lactose
Methocel
PVP_K_30
PVP_K_90
A_Glico_Na
Croscar_sod
4000 3500 3000 2500 2000 1500 100020
40
60
80
100
Re
flect
ânci
a %
Número de onda (cm-1)
Aerosil
Estearato_mg
Lauril_sulfato_Na
Polietileno_glicol
Talco
Ac_Ascorbico
56
Após análises dos espectros visualmente, os mesmos foram analisados por PCA
sendo possível descartar a possibilidade da presença de alguns dos excipientes enquanto
outros, que se apresentaram muito próximos ao espectro dos comprimidos, foram
mantidos (dados não apresentados). Posteriormente, várias misturas foram preparadas
com variação de excipientes e de suas concentrações e da mesma forma analisadas por
PCA. Na figura 14 (A) pode-se verificar o gráfico dos scores das várias misturas
preparadas e como elas ficaram separadas por padrões e na figura 14 (B) está destacado
o grupamento das misturas que ficaram mais próximas ao medicamento, sugerindo desta
forma uma boa similaridade entre elas. Pode-se verificar pela figura 14 (B) que as
misturas mais próximas ao medicamento foram as nomeadas 2, 3 ,4 e 5.
Figura 14 – Análise do componente principal: (A) gráfico dos scores das misturas desenvolvidas; (B) destaque
das misturas mais próximas ao medicamento.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
B
CP2
CP1
CP2
CP2
CP1
A
57
Ao final a mistura 3 composta pelos IFA e os seguintes excipientes: aerosil, amido
de milho, celulose microcristalina, estearato de magnésio, hipromelose, polietilenoglicol,
talco, amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica foi a que apresentou espectro com
alto grau de similaridade ao do comprimido, como apresentado na figura 15. Com essas
informações consolidadas e as informações qualitativas dos excipientes presentes no
comprimido confirmadas através do laboratório fabricante, as combinações previstas no
planejamento experimental para calibração e validação foram preparadas.
Figura 15 – Espectros de MID do comprimido e da mistura desenvolvida.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
5.1.1.3.MÉTODOS DE REFERÊNCIA (CLAE)
Alguns relatos na literatura mostram a busca para otimizar a metodologia de
quantificação dos quatro IFA em uma única corrida analítica: Wang et al. (2012)
conseguiram quantificar os quatro IFA por CLAE ao utilizar uma pré coluna derivatizada
com isocianato de fenetilo; Amorim (2013) propôs a otimização e validação para
determinação simultânea do DFC por Cromatografia líquida de alta eficiência/ detector
de arranjo de fotodiodos (CLAE/DAD) e Cromatografia líquida de ultra eficiência/
detector de arranjo de fotodiodos (CLUE/DAD); Lima et al. (2015) desenvolveram um
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50070
80
90
100
Reflectâ
ncia
%
Número de onda (cm-1)
Comprimido
Mistura
58
método cromatográfico para quantificar os quatro ativos em uma única corrida utilizando
coluna cromatográfica C18 (250cm x 4,6mm) e 5 µm, comprimento de onda para
isoniazida, pirazinamida e etambutol de 265nn e para rifampicina de 335nm, a fase móvel
foi constituída de fase aquosa (85% tampão formiato de amônio 0,3 mol/L pH 5, 15%
metanol e 0,005 mol/L de Cu2+ ou 250 mg/L de CuSO4.5H2O) e fase orgânica (metanol,
0,1% de trietilamina e 0,2% de ácido fórmico). Entretanto, o método utilizado neste
trabalho foi o descrito pela farmacopeia internacional (Farmacopeia internacional, 2015)
visto que ele é um dos métodos de referência preconizados na literatura para o
doseamento dos quatro IFA: rifampicina em corrida isolada e isoniazida, pirazinamida e
etambutol em uma outra corrida única. Essa metodologia utiliza dois sistemas
cromatográficos, sendo, portanto, de alto custo. Além de requerer uma leitura imediata
da amostra preparada devido à instabilidade da solução, tornando, desta forma, a sua
utilização na rotina de uma indústria farmacêutica desfavorável.
Os valores encontrados nessa análise para as 49 amostras das misturas originadas do
planejamento experimental (conjuntos de calibração:1 a 31; validação: 32 a 49) foram
utilizados para o desenvolvimento dos modelos utilizando NIR e calibração multivariada.
Na tabela 5 são apresentados os valores obtidos para o teor de cada um dos IFA
contidos nas amostras utilizadas nos conjuntos de calibração (1 a 31) e validação (32 a
49). Os resultados dos comprimidos serão apresentados na seção: Quantificação dos IFA
nas amostras comerciais, como será visto na tabela 8.
Tabela 5 - Teores (mg) dos insumos farmacêuticos ativos obtidos pelo método de referência para as
amostras utilizadas na construção do modelo de calibração multivariada: conjuntos de calibração:1 a 31;
validação: 32 a 49.
RIFA DP ISO DP PIRA DP ETA DP
1 164,21 0,81% 65,08 0,24% 358,49 0,06% 244,60 0,42%
2 117,06 1,21% 84,88 1,36% 363,01 0,63% 236,47 1,86%
3 116,55 0,86% 77,74 0,50% 435,73 0,40% 240,40 0,36%
4 141,24 1,08% 87,52 0,43% 430,17 0,28% 232,32 1,38%
5 136,76 1,47% 81,02 0,58% 389,99 0,41% 255,76 0,56%
6 128,07 1,17% 77,41 0,20% 398,84 0,25% 274,97 0,59%
7 111,01 1,20% 67,08 0,18% 358,23 0,07% 293,88 0,17%
8 138,68 1,20% 86,91 0,38% 364,68 0,37% 289,64 1,09%
9 138,79 1,12% 71,62 0,47% 434,86 0,42% 296,66 0,29%
10 128,11 1,07% 79,44 0,82% 425,53 0,44% 297,44 0,91%
11 91,54 0,79% 72,92 0,59% 362,10 0,45% 235,19 1,44%
59
12 138,04 1,01% 83,45 0,61% 353,30 0,38% 231,62 0,65%
13 146,34 0,77% 71,93 0,83% 438,87 0,24% 239,82 0,12%
14 111,52 0,90% 83,92 0,73% 436,77 0,30% 238,69 0,73%
15 104,14 1,09% 79,78 0,65% 409,89 0,21% 254,58 2,27%
16 98,82 1,30% 72,63 0,86% 403,83 0,28% 259,53 0,88%
17 129,72 0,77% 71,66 0,77% 368,78 0,18% 292,04 0,28%
18 116,20 0,80% 82,78 0,63% 369,85 0,22% 289,95 0,15%
19 113,70 0,63% 68,09 0,77% 444,95 0,39% 299,80 0,77%
20 125,18 0,30% 83,44 0,05% 442,60 0,33% 295,24 0,69%
21 129,55 0,63% 76,93 0,79% 406,88 0,42% 197,24 0,09%
22 126,54 0,82% 84,83 0,68% 349,09 0,35% 278,54 0,38%
23 107,09 0,66% 70,97 0,23% 330,09 0,08% 274,56 0,55%
24 107,34 0,62% 61,88 0,19% 401,17 0,48% 263,06 0,17%
25 90,77 0,81% 79,62 0,42% 401,23 0,17% 267,79 0,32%
26 94,70 1,13% 77,26 1,09% 414,03 0,36% 268,88 0,87%
27 118,81 1,07% 78,25 0,39% 401,66 0,30% 260,02 0,91%
28 120,49 1,02% 78,83 0,11% 406,46 0,09% 272,23 0,53%
29 154,49 0,73% 75,61 0,07% 402,49 0,24% 274,58 0,69%
30 124,89 0,25% 76,52 0,05% 482,11 0,58% 279,30 0,57%
31 115,37 0,45% 76,79 0,21% 406,91 0,10% 335,33 0,59%
32 111,57 2,71% 67,46 1,07% 366,45 0,17% 234,56 0,49%
33 134,15 0,89% 80,44 1,37% 366,04 0,53% 240,26 0,53%
34 114,96 0,82% 66,43 0,20% 439,34 0,24% 239,22 0,42%
35 144,53 0,75% 86,35 0,97% 437,24 0,45% 234,42 0,95%
36 123,71 0,76% 69,39 0,70% 400,67 0,31% 287,15 0,50%
37 124,34 0,95% 66,72 0,26% 370,32 0,22% 293,93 0,52%
38 91,11 0,75% 82,64 0,55% 367,01 0,31% 291,67 0,46%
39 131,57 1,06% 68,60 0,37% 443,08 0,24% 301,71 0,63%
40 110,73 0,72% 86,86 0,56% 442,59 0,21% 284,17 0,21%
41 118,77 0,51% 79,16 0,46% 402,77 0,41% 209,41 0,90%
42 129,24 0,70% 74,43 0,21% 328,00 0,26% 272,95 0,66%
43 121,84 0,81% 52,63 0,54% 400,73 0,46% 274,67 0,93%
44 91,07 0,80% 77,24 0,24% 405,52 0,07% 270,92 0,16%
45 118,29 1,06% 75,29 0,37% 408,48 0,42% 271,82 0,49%
46 153,41 0,68% 75,89 0,62% 410,81 0,24% 267,45 0,47%
47 113,97 0,72% 91,39 0,08% 407,87 0,07% 271,93 0,83%
48 133,15 0,51% 78,53 0,80% 474,96 0,29% 279,30 0,32%
49 131,88 0,70% 80,80 0,10% 413,02 0,25% 327,26 1,10% RIFA = rifampicina; ISO = isoniazida; PIRA = pirazinamida; ETA = etambutol; DP = desvio padrão.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
60
De acordo com a figura 16 pode-se perceber que os tempos de análise foram: para
isoniazida, pirazinamida e etambutol 6 minutos e para rifampicina 7 minutos. A
assimetria apresentada por isoniazida, pirazinamida, etambutol e rifampicina foram 1,15;
1,16; 0,97 e 1,41 respectivamente. Um dos critérios de aceitabilidade da separação
cromatográfica descritos pela USP é de valores maiores que 2000 para os pratos teóricos,
neste trabalho os valores encontrados foram de isoniazida = 3525; pirazinamida = 4303;
etambutol = 3564; rifampicina = 3868. Demonstrando, assim, a eficiência das colunas
devido a medição dos pratos teóricos em um sistema cromatográfico ser uma importante
avaliação para controlar o desgaste da coluna cromatográfica, pois ele descreve a
dispersão do pico em relação ao centro do cromatograma sendo fácil o controle diário da
eficiência do sistema (CHUST, 1900).
Figura 16 – Cromatogramas obtidos por CLAE de acordo com a farmacopeia internacional: A: isoniazida,
pirazinamida e etambutol e B: rifampicina.
Condições experimentais: A – Mistura 1: isoniazida (Iso), pirazinamida (Pira) e etambutol (Etam),
cromatógrafo Hitachi com detector UV, fluxo de 2 mL/min., volume de injeção de 20 μL, comprimento de
onda de 270 nm, fase móvel solução de acetato de amônio e acetato de cobre pH=5,0: metanol (94:6), em
modo isocrático e coluna RP C18 (15 cm x 4,6 mm), 5 μm de porosidade. B - Mistura 1: Rifampicina (Rifa),
cromatógrafo Hitachi com detector UV, fluxo de 1mL/min., volume de injeção de 20 μL, comprimento de
onda de 254 nm, fase móvel metanol: solução tampão fosfato pH=7,0 (70:30), em modo isocrático e coluna
RP C18 (25 cm x 4,6 mm), 5 μm de porosidade.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
B
Rifa
EtamPiraIso
A
61
5.1.1.4.MODELOS DESENVOLVIDOS POR CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA
O registro dos espectros de NIR das 49 amostras preparadas e dos comprimidos
estão representados na figura 17. Os dados espectrais foram organizados em matrizes
contendo os valores de absorbâncias obtidas entre 10000 a 4000 cm-1 para cada mistura
(X) e os valores determinados por método de CLAE formaram um vetor como variável
dependente (y) para serem utilizados nos programas de calibração multivariada.
Figura 17 - Espectros da região do infravermelho próximo das amostras dos conjuntos de calibração, validação
e os comprimidos DFC.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Diversas possibilidades de modelos foram construídas e verificadas quanto a
capacidade de prever os teores de fármacos em um comprimido. Modelos utilizando
PLS1 e PLS2 e pré-processamentos das amostras foram desenvolvidos. O PLS1 requer
que cada composto seja modelado individualmente, enquanto que no PLS2 todos os
compostos conhecidos podem ser incluídos no conjunto de dados (BRERETON, 2000;
PASQUINI, 2003). Marson et al. (2016) conseguiram quantificar simultaneamente
artesunato e mefloquina na mesma forma farmacêutica. E Piantavini (2014) utilizando
PLS2 quantificou febantel, pamoato de pirantel e praziquantel em medicamento de uso
veterinário.
Na determinação simultânea dos fármacos por PLS as matrizes são decompostas
em componentes principais que expliquem da melhor maneira a variância para cada
10000 9000 8000 7000 6000 5000 40000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Abs
orbâ
ncia
Número de onda (cm-1)
62
fármaco, assim, ao se analisar os quatro em um único modelo (PLS2) a capacidade de
previsão pode se tornar insatisfatória para alguns dos ativos, por isso, foi realizado o PLS1
separadamente para cada fármaco, a fim de melhorar a previsão das amostras
(BRERETON, 2000; PASQUINI, 2003).
Neste trabalho foram utilizados os modelos em PLS1, pois os modelos em PLS2
mostraram estimativas piores de concentrações e os resultados para erros quadráticos de
calibração (RMSEC), de validação cruzada (RMSECV), erro padrão de previsão
(RMSEP) e soma dos quadrados de erro de previsão (PRESS) foram elevados,
demonstrando que nem sempre será o melhor modelo, como afirmou Brereton (2000).
O pré-processamento de dados é uma rotina importante em quaisquer análises
quimiométricas, visto que as grandes quantidades de informações geradas pelas técnicas
espectroscópicas não se encontram correlacionada diretamente ao analito, ocasionando
por vezes distorções ao modelo e, consequentemente, conclusões errôneas. Logo, visa
compensar possíveis variações nas condições experimentais e ajustar a relação
sinal/ruído, estabilizando o modelo (FERREIRA, 2015).
Esses pré-processamentos são aplicados às variáveis (colunas da matriz de dados):
centrados na média é a translação de eixos para o valor médio de cada um deles e o
autoescalar consiste na centrada da média dos dados escalada pelo desvio-padrão
calculado (BRERETON, 2000). O pré-processamento utilizado para o tratamento dos
dados para três dos quatro IFA foi o autoescalar e apenas um foi centrado na média.
Ferreira (2015) sugere que em dados espectrais se utilize apenas os dados
centrados na média, porém Souza e Ferrão (2006) utilizaram o pré-processamento
autoescalar na dosagem de medicamentos contendo diclofenaco de potássio; Ferrão et al.
(2010) utilizaram autoescalar na quantificação de biodiesel por espectroscopia no
infravermelho; Cordeiro et al. (2011), também utilizaram dados autoescalados na
determinação de lamivudina e zidovudina por espectroscopia UV; Chen et al. (2012)
usando dados de espectroscopia do infravermelho próximo, também utilizaram
autoescalar para verificar a capacidade antioxidante do chá verde e Martelo-Vidal e
Vazquez (2014) também utilizaram dados autoescalados na análise de compostos
fenólicos em vinhos tintos por UV/ VIS/ NIR. Portanto, é possível garantir que os
modelos podem ser elaborados com dados autoescalados.
As transformadas utilizadas no modelo desenvolvido para o etambutol e
rifampicina foram: MSC (correção multiplicativa de espalhamento), smooth com 7 pontos
63
e primeira derivada com 5 pontos. O MSC é muito utilizado na correção do efeito de
espalhamento aditivo e multiplicativo na absorbância (FERREIRA, 2015). As
transformadas por derivada e o smooth minimizam os efeitos de ruído espectral,
amplificando a razão sinal/ruído, suavizando o espectro para eliminar variações aleatórias
(FERREIRA, 2015).
Outro importante passo foi a escolha das variáveis latentes (VLs) que foi realizada
através da validação cruzada, utilizando o método leave-one-out que consiste em tirar
amostras do conjunto de calibração uma a uma e realizar nova previsão do modelo (figura
18) (BRERETON, 2000). Ao se determinar essas VLs foi observado que o número
previsto inicialmente (4VLs) foi bem menor que o determinado pelos modelos ao final
do desenvolvimento, indo, portanto, de encontro ao preconizado pela ASTM (2012) em
relação ao número de amostras que compuseram o conjunto de calibração e validação.
Entretanto, esse normativo é utilizado visando uma orientação no que se refere a prática
com infravermelho e calibração multivariada, se não cumprida não impossibilita a
utilização do modelo.
64
Figura 18 - Validação interna cruzada utilizando o método leave-one-out para o modelo de quantificação
da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
180
230
280
330
380
180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
Etambutol
Pred Val Pred Cal Linear (Pred Val) Linear (Pred Cal)
300
350
400
450
500
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Pirazinamida
Pred Val Pred Cal Linear (Pred Val) Linear (Pred Cal)
80
130
180
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Rifampicina
Pred Val Pred Cal Linear (Pred Val) Linear (Pred Cal)
60
65
70
75
80
85
90
60 65 70 75 80 85 90
Isoniazida
Pred Val Pred Cal Linear (Pred Val) Linear (Pred Cal)
65
Além desses aspectos fundamentais (pré-tratamentos e suas combinações) e a
seleção de variáveis latentes foi utilizado o programa QSAR modeling para a seleção de
variáveis nos espectros. Com ele, foi possível melhorar consideravelmente todos os
valores dos parâmetros analisados e obter um resultado confiável na calibração externa,
visto que a seleção de variáveis ocorre por uma relação matemática que correlaciona as
propriedades dos compostos investigados e as atividades biológicas, com significância
estatística (MARTINS & FERREIRA, 2013). Desta forma, o melhor modelo para cada
IFA foi desenvolvido e os parâmetros analisados para essa escolha estão descrito na tabela
6, onde estão apresentados os valores de erros quadráticos de calibração (RMSEC), de
validação cruzada (RMSECV), erro padrão de previsão (RMSEP) e soma dos quadrados
de erro de previsão (PRESS).
Tabela 6 – Resumo dos parâmetros analisados para os modelos desenvolvido para quantificação da
pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.
Parâmetros Pirazinamida Etambutol Isoniazida Rifampicina
R2 0,9920 0,9987 0,9976 0,9962
RMSEC 2,9532 1,9668 0,5468 1,8461
RMSECV 6,0097 11,0539 2,039 7,3406
RMSEP 8,7369 13,1056 7,0386 17,5291
PRESS 1374 3091 891 5530
VL 8 14 10 9
Pré-tratamentos AE CM, MSC,
Smooth, 1der
AE AE, 1der
Nᵒ de variáveis 170 230 270 100 VL= variável latente; RMSEC= erros quadráticos de calibração; RMSEP= erro padrão de previsão;
RMSECV= erros quadráticos de validação cruzada; PRESS= soma dos quadrados de erro de previsão
AE=Autoescalar; CM=centrado na média; MSC= correção multiplicativa de espalhamento; Smooth =
alisamento; 1 der = primeira derivada.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
A importância em se analisar amostras anômalas ou outliers, é devido a esse tipo
de amostra afetar de maneira contrária a capacidade preditiva do modelo (FERREIRA,
2015). Para avaliação das misturas no conjunto de calibração foram levados em
consideração os valores dos resíduos de Student e Leverage. De acordo com a figura 19
não foram identificadas amostras anômalas, visto que não houveram valores de resíduos
de Student e Leverage simultaneamente elevados.
66
Figura 19 - Detecção de outliers para o modelo de quantificação da pirazinamida, etambutol, rifampicina e isoniazida.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Etambutol Pirazinamida
Isoniazida Rifampicina
Res
ídu
os
de
Stu
den
t
Res
ídu
os
de
Stu
den
t R
esíd
uos
de
Stu
den
t
Res
ídu
os
de
Stu
den
t
Leverage
Leverage
Leverage
Leverage
67
5.1.1.5. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
Além dos dados apresentados na tabela 6, que correspondem aos parâmetros
obtidos na fase da validação cruzada (RMSECV, RMSEP, PRESS), que são úteis em
garantir que o método desenvolvido é validado, foram realizados também análise de
linearidade, precisão e exatidão segundo os critérios estabelecidos pela RDC 899/ 2003
da Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA (BRASIL, 2003).
A linearidade do método foi determinada para cada componente usando uma
curva de calibração com 5 pontos em triplicata no intervalo de 80 - 120% da concentração
alvo. As amostras foram analisadas e os coeficientes de correlação entre resultados
previstos por NIR (quimiometria) e os obtidos via CLAE foram calculados (figura 20).
Todos os coeficientes de correlação encontrados, 0,9987; 0,9961; 0,9967; 0,9974 para
pirazinamida, isoniazida, rifampicina e etambutol, respectivamente, estão dentro do
critério de aceitação ≥0.990 conforme RDC 899/ 2003 da ANVISA, confirmando que o
método proposto é linear.
Figura 20 – Correlação entre os valores de concentração determinados por CLAE e os valores previsto por
NIR para cada IFA empregando os modelos desenvolvidos.
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
y = 1.0108x - 4.5714R² = 0.9987
300
350
400
450
500
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Val
ore
s p
revi
sto
s p
or
NIR
Valores determinados por CLAE
Pirazinamida
y = 0.9962x + 0.2905R² = 0.9961
60
65
70
75
80
85
90
60 65 70 75 80 85 90
Val
ore
s p
revi
sto
s p
or
NIR
Valores determinados por CLAE
Isoniazida
y = 0.9829x + 5.1301R² = 0.9974
180
230
280
330
380
180 230 280 330 380
Val
ore
s p
revi
sto
s p
or
NIR
Valores determinados por CLAE
Etambutol
y = 0.9843x + 1.7087R² = 0.9967
80
100
120
140
160
180
80 100 120 140 160 180
Val
ore
s p
revi
sto
s p
or
NIR
Valores determinados por CLAE
Rifampicina
68
Essas mesmas amostras foram utilizadas para calcular a precisão e exatidão dos
métodos propostos. Os resultados podem ser vistos na tabela 7 indicando uma excelente
exatidão (erro médio até 2,0%) e precisão (desvio padrão relativo médio inferior a 2,0%).
A exatidão do método foi determinada pelo método de comparação com método
referência (CLAE). Amostras preparadas em três concentrações diferentes em triplicata
de forma a obter concentração equivalente a 80%, 100% e 120% da concentração alvo.
Todas as recuperações individuais e a recuperação global foram calculadas. As
percentagens de recuperação encontradas estão dentro do critério de aceitação (98.0 a
102.0%) conforme RDC 899 da ANVISA.
Tabela 7 – Valores encontrados no teste de precisão e exatidão do modelo de calibração desenvolvido por
NIR.
Isoniazida (Iso), rifampicina (Rifa), pirazinamida (Pira) e etambutol (Etam)
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Concentração determinada por CLAE
(mg)
Concentração Prevista por NIR (mg)
Pira Etam Iso Rifa Pira Etam Iso Rifa
80%
330,09 197,24 65,08 90,77 328,74 199,08 65,34 90,59
349,09 209,41 61,88 94,70 346,28 215,23 62,47 95,73
353,30 231,62 61,88 91,54 352,86 231,85 62,47 92,65
Média 342,62 215,39 63,42 92,99
% recuperada 99,55 101,27 100,76 100,70
%DPR 0,34 1,36 0,32 0,78
% Erro médio 0,8 -0,5 -1,4 -0,5
100%
398,84 274,97 77,41 124,89 401,06 273,08 77,72 123,88
401,66 274,58 75,61 128,07 399,84 273,51 75,69 129,63
402,49 274,56 76,79 121,84 402,84 272,70 76,80 119,64
Média 401,25 273,10 76,74 124,40
% recuperada 100,06 99,41 100,17 99,54
%DPR 0,50 0,17 0,20 1,55
% Erro médio -0,1 2,0 -0,5 0,2
120%
442,60 299,80 84,88 164,21 442,59 299,88 84,32 163,16
444,95 296,66 87,52 146,34 445,40 295,88 87,76 146,18
482,11 335,33 86,91 154,49 483,02 336,76 86,67 153,22
Média 457,00 310,84 86,30 154,20
% recuperada 100,10 100,06 99,78 99,48
%DPR 0,10 0,35 0,48 0,37
% Erro médio -0,6 -0,1 0,3 0,8
69
5.1.1.6. QUANTIFICAÇÃO DOS IFA NAS AMOSTRAS COMERCIAIS
Após o desenvolvimento e validação do modelo de calibração multivariada três
lotes de amostras de comprimidos foram analisados. Os dados são apresentados na tabela
8, fazendo referência as concentrações determinadas por CLAE (método referência) e
concentração prevista (determinado pelo modelo proposto por NIR e calibração
multivariada). Os erros de previsão calculados foram entre -11,26 a 14,52%, segundo
Ferreira (2015), é possível obter modelos de calibração satisfatório quando os erros
médios das concentrações entre o método referência e o previsto estiver na faixa de ±5%
a ±10%, sendo o ideal valores menores que ±2%.
Alguns trabalhos demonstram uma variação de até 10% na predição do IFA em
medicamentos: Cordeiro et al. (2011) ao analisar medicamentos da associação de
lamivudina e zidovudina obtiveram erros de previsão 2 a 10% quando comparado com o
método por CLAE; Na determinação de amoxicilina em quatro formulações por
calibração multivariada por NIR, Silva et al. (2012) obtiveram previsões entre 4,1 a 8,6%;
Ao analisar comprimidos de hidroclorotiazida, Ferreira, Braga e Sena (2013),
apresentaram erros de predição variando entre 0,8 a 8,6%; Mendes (2015) ao quantificar
por espectroscopia Raman os quatro ativos em comprimido DFC: rifampicina, isoniazida,
pirazinamida e etambutol, apresentou erros de previsão entre 0,11 a 9,7% quando
comparado com CLAE; Marson et al. (2016) demonstraram erros de previsão variando
até 6,0% ao analisarem medicamentos dose fixa combinada de artesunato e mefloquina.
Os valores dos erros de predição para a isoniazida foram superiores a 10% e
também em dois dos comprimidos para o etambutol, esses erros poderiam ser diminuídos
ao se controlar algumas variáveis presentes no desenvolvimento das misturas, visto que
por serem muitos ativos e excipientes, o preparo requer um maior tempo de exposição às
condições ambientais. O tempo de análise também é crítico no processo. O tempo de
exposição dos IFAs ao ar, temperatura, umidade e, principalmente, a luz, leva a uma
instabilidade química dos IFAs, com variação de perda de concentração de até 15% dos
componentes (BHUTANI et al., 2004; BHUTANI et al., 2005; PRASAD, SINGH, 2010;
BHUTANI; SINGH; JINDAL, 2005; MARIAPPAN et al., 2005; SINGH; BHUTANI;
MARIAPPAN, 2006).
70
Tabela 8 – Resultados da quantificação de isoniazida (Iso), rifampicina (Rifa), pirazinamida (Pira) e
etambutol (Eta) em amostras de medicamentos pelo método desenvolvido (NIR) e método farmacopeico
(CLAE).
Amostras Concentração determinada - CLAE Concentração Prevista - NIR Erro%
Pira Etam Iso Rifa Pira Etam Iso Rifa Pira Eta Iso Rifa
S_2589 404,79 273,04 81,11 138,33 390,52 242,28 92,89 134,57 -3,52 -11,26 14,52 -2,72
S_2651 409,38 273,87 79,04 140,61 401,74 258,31 89,63 152,15 -1,87 -5,68 13,40 8,21
S_2688 409,97 275,70 80,27 136,45 396,39 247,04 89,56 137,90 -3,31 -10,40 11,57 1,06
Erro%= (|concentração prevista – concentração real|/ concentração real) x 100
FONTE: Kelly Sivocy, 2017.
Ao se analisar os valores da tabela (8), pode-se observar que não houve diferenças
estatísticas entre os teores de IFA nos comprimidos analisados pelo método clássico
(CLAE) em relação aos resultados obtidos com o método NIR, podendo inferir, deste
modo que os valores entre as técnicas são estatisticamente equivalentes para os IFAs.
Outro ponto que vale salientar é que os modelos foram desenvolvidos em uma
formulação proposta, que, por mais que apresente perfil semelhante no infravermelho
médio, as composições quantitativas dos excipientes presentes no comprimido podem ser
um pouco diferentes das que foram apresentadas nas misturas, e isso poderá ser uma das
causas dos erros observados na capacidade preditiva do modelo, ao se verificar que os
maiores erros encontrados foram na isoniazida e em duas amostra para o etambutol
(>10%). Em se tratando da isoniazida, da Silva (2008) confirma que a isoniazida é o
fármaco que tem a maior interferência e menor intensidade de sinal o que prejudica a
capacidade de previsão do modelo em referência às amostras de calibração e validação
avaliadas por NIR/MID. Em 2012, Neves et al. (2012) demonstraram um R2 de calibração
e validação menores que 0,95 em uma análise de dissolução para isoniazida e etambutol
de comprimidos produzidos pelo NUPLAM. Ma et al. (2014), relataram resultados falsos
negativos ao analisar produtos acabados por NIR/MID/RAMAN, de um fabricante com
modelos desenvolvidos com matrizes de outro fabricante, sugerindo que há forte
interferência dos excipientes no doseamento do etambutol.
Sendo assim, a utilização de NIR em conjunto com métodos quimiométricos
podem ser introduzidos na rotina da indústria farmacêutica utilizando o monitoramento
em tempo real, como prevê a tecnologia PAT. Além dessa facilidade para a rotina, na
indústria farmacêutica a utilização de técnicas simples, rápidas e de baixo custo que a
71
CLAE e a não utilização de solventes orgânicos, constituem-se em vantagens para a
utilização desse método.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Levando-se em consideração que a metodologia por CLAE é trabalhosa, alto custo
e destrutiva, mas é correntemente utilizada para o controle de qualidade do medicamento
em dose fixa combinada para o tratamento da tuberculose, foi proposta desse trabalho o
desenvolvimento de técnicas alternativas que fossem mais simples, rápidas, de baixo
custo, não destrutivas e que não utilizasse solventes orgânicos, contribuindo assim com o
meio ambiente.
Foi possível através da engenharia reversa em conjunto com análise de
componente principal (PCA) o desenvolvimento de uma mistura com alto grau de
similaridade ao do comprimido em dose fixa combinada, possibilitando assim o
desenvolvimento das misturas que foram necessárias para o planejamento experimental
dos modelos de calibração multivariada.
Deste modo, os modelos de calibração multivariada em associação com a
espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) desenvolvidos foram capazes de
determinar simultaneamente os IFAs: rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol.
A metodologia se mostrou útil ao apresentar resultados estatisticamente equivalentes aos
obtidos por CLAE, na determinação dos teores dos IFAs presentes no comprimido em
dose fixa combinada.
7. PERSPECTIVAS
As perspectivas de continuação do trabalho irão se dar através da utilização das
espectroscopias no infravermelho médio e no ultravioleta no desenvolvimento de
modelos que demonstrem o controle mais eficiente no que diz respeito a análise do
produto nas suas mais diferentes etapas de produção e de avaliação da qualidade.
E ao final desse trabalho pretende-se estudar a viabilidade de empregar uma ou
mais das três técnicas desenvolvidas no monitoramento in-line/on-line da qualidade do
medicamento em dose fixa combinada através da tecnologia PAT.
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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