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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

KARINA HELENA MORAIS CARDOZO

Estudos de compostos fotoprotetores da radiação

ultravioleta em algas:

aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)

São Paulo

Data do Depósito na SPG:

05/11/2007

KARINA HELENA MORAIS CARDOZO

Estudos de compostos fotoprotetores da radiação

ultravioleta em algas:

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)

Tese apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Doutor em Ciências

(Bioquímica)

Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo

São Paulo

2007

Karina Helena Morais Cardozo

Estudos de compostos fotoprotetores da radiação ultravioleta em algas:

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências (Bioquímica).

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora

Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________

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Prof. Dr. _______________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Ao David pelo amor, paciência, dedicação e incentivo.

A minha avó, meus pais e irmãos pelo amor, compreensão

e apoio de sempre. Sem vocês eu não teria chegado aqui.

AGRADECIMENTOS

Ao meu querido orientador Dr. Pio Colepicolo, cuja confiança, estímulo e carinho foram essenciais nestes anos para o meu amadurecimento científico.

Ao meu querido amigo Ernani por toda ajuda, suporte, carinho e apoio

incondicional. Obrigada por ter estado ao meu lado em todos os momentos que precisei, sempre torcendo por mim. Seu incentivo durante minha carreira científica fez com que eu chegasse aqui.

Ao Betão pela colaboração, amizade e ajuda constante. Obrigada por ter me

ensinado muito além da técnica de espectrometria de massas. Sua participação e dedicação foram importantíssimas para que este trabalho fosse concluído.

Ao Dr. Donat P. Häder, do Institut für Botanik und Pharmazeutische Biologie,

Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen, Alemanha pela colaboração científica e incentivo ao meu aprimoramento profissional.

A Profa. Dra. Eliane Marinho Soriano, da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte por ter coletado e identificado as macroalgas utilizadas neste trabalho. A minha querida e grande amiga Thais pela amizade, estímulo e suporte. O

mais legal de todo este trabalho foi ter colaborado com você. Nunca esqueça que sem você eu não teria conseguido.

A Van pela amizade, carinho e preciosos conselhos. Todos estes anos de

convivência mostraram que poucas pessoas podem ser como você: sincera, amiga, bem humorada e com um coração enorme.

Ao Val por sua amizade e valiosa contribuição nos experimentos por

espectrometria de massas. As minhas amigas do coração Van, Tha, Angelita e Drica. Sinto-me lisonjeada

em ter amigas como vocês. Obrigada por todos os momentos, felizes e tristes, em que passamos juntas.

Aos companheiros de laboratório de diferentes épocas: Paty Lopes, Tona,

Teresa, Jac, Helô, Alcely, Keith, Marcelo, Sara, Maísa, Lígia, Ana Maria, Anderson, João, Diogo, Patrícia, Douglas, Paula, Faby, Vânia, Felipe, Meron, Sidney e Humberto pela convivência e amizade. Em especial a Faby que me ajudou muito na realização de vários experimentos.

Aos meus queridos amigos que fiz durante meu estágio na Alemanha que me

acolheram tão bem e me ajudaram em tudo que fosse possível: Sebb, Jenny, Manfred, Martin e Peter. Obrigada também as minhas amigas Cyn, Julia, Birgit e aos amigos Sebb e Achim que tornaram minha vida na Alemanha muito mais fácil e inesquecível.

Aos iniciações científicas Dani, Vitor, Luiza e Evandro pela ajuda e discussões

nos experimentos.

Ao Ed, pelo carinho e ajuda valiosa em todos os momentos. Ao Diogo e Felipe pela amizade e discussões científicas que foram muito

produtivas e importantes para o desenvolvimento desta tese. Ao Marconi pela grande ajuda na parte estatística. A Bruna Mohovic pela discussão e valiosos comentários nos experimentos de

exposição ao UV; A Lu do Instituto de Biologia pela colaboração e disposição para responder

várias questões minhas sobre algas. Ao meu mais recente colaborador Mario Carignan do Instituto Nacional de

Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP), Mar de Plata, Argentina, que em poucos dias tornou-se um amigo muito especial. Obrigada por toda ajuda e sugestões preciosas na etapa final deste trabalho.

Ao pessoal da pós-graduação pela disposição em atender bem e excelente

trabalho; A Tati pela revisão deste trabalho. A minha avó, meus pais, meus irmãos e familiares pelo amor, compreensão e

apoio de sempre. Obrigada por entenderem minha ausência. Ao meu querido sogro Edmur pelo carinho, incentivo e por acreditar em mim. Ao David pelo amor, incentivo e compreensão. Sem sua ajuda eu não teria

conseguido. A sua presença faz com que minha vida seja plena Ao DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst) pelo auxílio financeiro

que possibilitou o estágio na Alemanha. À Fapesp pelo apoio financeiro essencial para o desenvolvimento deste

trabalho.

“Cada qual cuide de seu enterro, impossível não há”

Jorge Amado

RESUMO

Cardozo, K.H.M. Estudos de compostos fotoprotetores da radiação ultravioleta em

algas: Aminoácidos tipo Micosporinas (MAAs). 2007. 168p. Tese (Doutorado) -

Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química,

Universidade de São Paulo, São Paulo.

Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) são compostos responsáveis pela

fotoproteção no ultravioleta de diversos organismos aquáticos. São sintetizados pela

via do ácido chiquímico por algas, bactérias e fungos, de maneira similar à síntese

de flavonóides em plantas superiores.

Neste trabalho foram conduzidos estudos relacionados a estes compostos em

algas. Protocolos de extração de diferentes algas foram testados alterando-se

parâmetros como solventes, temperatura e condições de incubação. Os resultados

mostraram que dependendo da alga estudada, diferentes condições podem mudar a

concentração de MAAs extraída, ressaltando a importância de se testar diversos

parâmetros na extração, evitando assim valores sub- ou superestimados de

concentrações. O desenvolvimento de um método por HPLC permitiu a separação

de 6 MAAs com boa resolução. A caracterização estrutural foi realizada

majoritariamente por espectrometria de massas utilizando diferentes tipos de

analisadores. Estas análises permitiram a proposição de mecanismos de

fragmentação descritos pela primeira vez para esta classe de compostos e

possibilitaram a identificação de diferentes MAAs em algumas micro e macroalgas.

Ensaios in vitro foram realizados com o extrato obtido da macroalga Gracilaria

domingensis no intuito de avaliar seu potencial uso em formulações cosméticas

direcionadas à fotoproteção. Os testes de estabilidade quanto ao pH, temperatura e

exposição à radiação ultravioleta bem como os ensaios de citotoxicidade,

fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar sugeriram que este extrato

pode ser promissor quando incorporado em formulações direcionadas para a

fotoproteção. Este extrato não apresentou atividade antioxidante significativa.

Os estudos com o dinoflagelado Prorocentrum minimum isolado de duas

regiões diferentes, quando exposto às radiações ultravioleta, mostraram que houve

uma indução das MAAs em ambas linhagens em todos os tratamentos realizados no

período de 72 h. A indução foi mais rápida e pronunciada na linhagem oriunda de

Lisboa, em Portugal do que na linhagem proveniente de Kattegat, na Dinamarca.

Estes dados estão de acordo com as características do local de origem das

linhagens, uma vez que os dinoflagelados originários de Portugal em seu meio

natural estavam sujeitos a maiores irradiações. Medidas do rendimento quântico do

fotossistema II indicaram que a síntese e acúmulo de MAAs em P. minimum isolada

de Lisboa ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético e na supressão

de espécies reativas de oxigênio desta microalga quando comparada aos indivíduos

da mesma espécie de regiões com menores irradiações.

Palavras-chave: Aminoácidos tipo micosporinas, MAAs, Compostos Fotoprotetores,

Algas, Radiação Ultravioleta, Espectrometria de Massas.

ABSTRACT

Cardozo, K.H.M. Studies of ultraviolet sunscreen compounds in algae: Mycosporine-

like amino acids (MAAs). 2007. 168p. PhD Thesis - Graduate Program in

Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Mycosporine-like amino acids (MAAs) are chemically related water soluble

compounds responsible for UV photoprotection in many aquatic organisms. They are

biosynthesized via the shikimate pathway by algae, bacteria and fungi in a similar

manner to the biosynthesis of UV-screening flavonoids in terrestrial plants.

In this work, studies related to this class of compounds were performed with

algae. Extraction protocols of some algae were tested using diverse solvents at

different temperature. The results showed that depending on the organism examined,

both solvent concentration and temperature affected extraction efficiency and final

MAA concentration. The improvement of a HPLC method separated a mix of 6 MAAs

with good resolution. The structural characterization was made by mass

spectrometry using different analyzers. The analysis by mass spectrometry allowed

the proposition of new mechanisms of fragmentation and identification of different

MAAs in some micro and macroalgae.

In vitro preliminary assays were performed to evaluate the potential use of

Gracilaria domingensis extract in suncare products. The extract showed no

antioxidant activity, however the pH, temperature and UV exposure stability, as well

the citotoxicity, phototoxicity and sun protection factor showed a potential commercial

utilization for the extracts.

The UV exposure experiments with the dinoflagellate Prorocentrum minimum

isolated from Lisbon, Portugal and Kattegat, Denmark, showed that MAAs were

induced in all treatments during 72 h. The induction was faster in the species from

Lisbon than the ones from Kattegat. These data are in agreement with local isolation

place, since the dinoflagellates from Portugal are submitted to high irradiance regime

in their natural environment. The quantum yield of photosystem II suggested that the

over production of MAAs by P. minimum from Lisbon protects the photosynthetic

apparatus, indicating that MAAs act as spectrally specific UV sunscreens in

phytoplankton.

Keywords: Mycosporine-like amino acids, MAAs, Sunscreen Compounds, Algae

Ultraviolet Radiation, Mass Spectrometry.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Espectro da radiação ultravioleta. ..............................................................22 Figura 2. Vias de interconversão de diferentes MAAs propostas por Carreto e colaboradores (2005). Os retângulos tracejados indicam compostos ainda não caracterizados. Adaptado de Carreto et al., 2005. ....................................................27 Figura 3. Conversão por bactérias de chinorina em micosporina-glicina (moderado antioxidante) e deoxigadusol (forte antioxidante) por bactérias (Dunlap & Shick, 1998). ........................................................................................................................29 Figura 4. Intermediários e enzimas da via do ácido chiquímico. DAHP: 3-deoxi-arabino-heptulosonato-7-fosfato; EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato. Enzimas: (1) DAHP sintase; (2) DHQ sintase; (3) DHQ dehidratase; (4) chiquimato desidrogenase; (5) chiquimato quinase; (6) EPCP sintase; (7) corismato sintase. R2: aminoácidos e aminoálcools caracterizando diferentes MAAs (adaptado de Shick & Dunlap, 2002)............................................................................................................33 Figura 5. Esquema simplificado da absorção de luz por um fotoprotetor mostrando vias de dissipação por calor (indicada por ∆) e pela formação de espécies reativas. SOD: superóxido dismutase; LH: lipídio poliinsaturado (modificado de Dunlap et al., 1998b). ......................................................................................................................39 Figura 6. Análogos sintéticos de MAAs para uso em fotoprotetores e respectivos comprimentos de onda máximos de absorção (λmax). ...............................................41 Figura 7. Esquema simplificado dos componentes principais de um espectrômetro de massas que indicam os modos de introdução da amostra, ionização e analisadores utilizados neste trabalho............................................................................................44 Figura 8. Esquema simplificado de uma fonte de ionização por electrospray. O analito é inserido no sistema por meio de um capilar (à esquerda). A diferença de potencial entre o capilar e o cone leva à formação de gotículas carregadas que sofrem evaporação. Adaptado de Gates et al., 2006. ...............................................46 Figura 9. Esquema simplificado do analisador do tipo quadrupolo (adaptado de Gates, 2007)..............................................................................................................47 Figura 10. Esquema de um analisador Ion trap (adpatado de Gates, 2007). ............49 Figura 11. Esquema de um analisador TOF (adaptado de Gates, 2007). .................51 Figura 12. Esquema simplificado de um analisador FT-ICR. ....................................52 Figura 13. Organismos escolhidos para os estudos das MAAs: Gracilaria tenuistipitata, Gracilaria domingensis (foto: Eliane Marinho-Soriano), Gracilaria birdiae (foto: Eliane Marinho-Soriano) e o dinoflagelado Prorocentrum minimum.....56 Figura 14. A) Espectro da radiação solar simulada e B) detalhe do espectro entre 250 e 400 nm. ...........................................................................................................63 Figura 15. Passos gerais utilizados na extração das MAAs. .....................................64 Figura 16. Protocolo de extração das MAAs presentes em Gracilaria tenuistipitata. 66 Figura 17. Reação de DPPH com uma molécula antioxidante doadora de próton (LH). ..........................................................................................................................77 Figura 18. Medidas da fluorescência da clorofila utilizando o método do pulso de saturação. Detalhes das equações estão mostrados no texto. Extraído de Mohovic, 2005. .........................................................................................................................84 Figura 19. Formação de DCF altamente fluorescente a partir da oxidação de DCFH-DA por espécies reativas geradas intracelularmente pela exposição à UVR. Adaptado de He & Hader, 2002. ...............................................................................86 Figura 20. Perfil cromatográfico do extrato GT-2 com monitoramento em 330 nm e

espectros de absorção no UV das frações coletadas. TR (min) / λmax (nm): F1: 3,7 / 320; F2: 4,2 / 330; F3: 6,9 / 334; F4: 9,6 / 332; F5: 17,0 / 360. .................................91 Figura 21. Análise da fração F1 por LC-UV-MS. A) Cromatograma com detecção no UV; B) Cromatograma obtido pela somatória dos íons totais (TIC); C) Espectro de massas para o pico com tempo de retenção igual a 4,4 min e D) Espectro de massa para o pico com tempo de retenção igual a 3,8 min. Energia de colisão: 20 eV. ......93 Figura 22. ESI-MS2 das MAAs (a) palitina, (b) palitina deuterada, (c) asterina, (d) asterina deuterada, (e) palitinol, (f) palitinol deuterado, (g) chinorina e (h) chinorina deuterada. A abundância relativa foi de 3 x 107 a 3 x 108. Energia de colisão: 20eV...................................................................................................................................94 Figura 23. Mecanismo proposto de fragmentação para as MAAs identificadas como palitina, chinorina, asterina e palitinol. A-M: principais íons produtos para as moléculas não marcadas (quando X=H) e para as moléculas marcadas (quando X=D). Y= H ou D dependendo da fragmentação inicial (ver detalhes no texto). .......97 Figura 24. A) espectro MS2 da fração F5 não deuterada e B) espectro MS2 do análogo deuterado. .................................................................................................100 Figura 25. Mecanismo proposto de fragmentação para a fração F5 identificada como paliteno e/ou usujireno (PM = 284,3 g.mol-1). A) Molécula não deuterada com m/z 285 e B) molécula deuterada com m/z 290. ............................................................101 Figura 26. Espectros de MS2 da nova MAA isolada de corais A) composto não deuterado e B) análogo deuterado..........................................................................104 Figura 27. Estrutura provável da nova MAA identicada como palitina-treonina. .....104 Figura 28. Perfil cromatográfico das frações coletadas por Sephadex LH-20 contendo MAAs. A) frações 30-35; B) 36-39, pico 5 (TR=17min); C) 40-45, pico 5 (TR=17 min); D) 46-47, pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min), pico 4 (TR=9,6 min); E) 48-50, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min); F) 51-54, igual fração E; G) 55-62, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min); H) 63-65; e I) 66-76 igual fração G; J) 77-85.................................................................................106 Figura 29. Espectros MS2 e MS3 de alta resolução obtidos para o palitinol em FT-ICR-MSn. A) Espectro MS2 de m/z 303; B) espectro MS3 de m/z 288 proveniente de (A); C) espectro MS3 de m/z 244 proveniente de (A); D) espectro MS3 de m/z 230 proveniente de (A); e E) espectro MS3 de m/z 186 proveniente de (A). ..................107 Figura 30. Mecanismo de fragmentação proposto para três MAAs analisadas por alta resolução mostrando a quebra homolítica que gera a perda inicial do radical metil. A ordem da rota A pode mudar dependendo da energia utilizada..............................108 Figura 31. A: Perfil cromatográfico das MAAs presentes no extrato GT-1 monitorado em 330 nm e espectros no UV. TR (min) / m/z [M+H]+ – pico 1 – chinorina: 6,9 / 333; pico 2 –: palitina: 7,8 / 245; pico 3 – asterina: 8,8 / 289; pico 4 – porphyra-334: 9,2 / 347; pico 5 – palitinol: 11,4 / 303; pico 6 – paliteno e/ou usujireno: 25,9 / 285. B: Detalhe da separação entre 6 e 13 min. .................................................................110 Figura 32. Perfil cromatográfico em 330 nm dos extratos de G. tenuistipitata, G. domingensis, G. birdiae, P. minimum e da matéria-prima Helioguard 365® e espectros de absorção no UV. TR (min): pico 1: 8,1; pico 2: 9,3; pico 3: 10,6; pico 4: 10,9; pico 5: 12,1; pico 6: 14,1; pico 7: 15,0; pico 8: 17,5; pico 9: 19,7; pico 10: 21,1; pico 11: 24,4; pico 12: 24,5; pico 13: 25,6. O espectro no UV do pico 10 (não identificado) não foi apresentado (λmax= 325 nm). ...................................................115 Figura 33. Espectros MS2 obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 333 (TR= 8,2 min); B: m/z 245 (TR= 9,4 min); C: m/z 347 (TR= 11,1 min) e D: m/z 285 (TR= 24,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada. ................................................................................................116

Figura 34. Espectros MS2 obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 246 (TR= 12,5 min); B: m/z 329 (TR= 15,2 min); C: m/z 347 (TR= 17,8 min), D: m/z 303 (TR= 21,7 min) e E: m/z 299 (TR= 25,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada. .......................................................117 Figura 35. Perfil cromatográfico do extrato obtido a partir do produto Helioguard 365 e espectros no UV. TR (min): pico 1- chinorina: 5,8; pico 2 - palitina: 6,0 e pico 3 – porphyra-334: 13,1. Detalhes das condições experimentais ver itens 3.4.1 e 3.5 ( 120 Figura 36. Espectros de MS2 por nanospray no modo negativo em analisador Q-TOF das MAAs A) chinorina (m/z 333) e B) Porphyra-334 (m/z 245)..............................121 Figura 37. Mecanismo de fragmentação proposto para a MAAs di-ácidas chinorina (m/z 332) e porphyra-334 (m/z 346). .......................................................................123 Figura 38. Estruturas analisadas por RMN 1H. R=H, chinorina e R=CH3, porphyra-334. .........................................................................................................................124 Figura 39. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata. Os retângulos superiores em branco e preto indicam os períodos de claro e escuro, respectivamente. Os experimentos foram feitos em triplicatas e as barras indicam os desvios padrões. Os asteriscos indicam diferenças signficativas entre as últimas horas de claro e as primeiras de escuro (ANOVA p<0,01)......................................125 Figura 40. Perfil de absorção no UV das amostras GD-1, GD-2 e Helioguard 365.................................................................................................................................127 Figura 41. Dados de porcentagem de inibição da formação do radical DPPH A) pelos extratos contendo MAAs de G. tenuistipitata, G.domingensis e Helioguard 365® e B) pelos flavonóides rutina e a mistura quercetina e isoquercetrina. ...........................129 Figura 42. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1 de G.domingensis em soluções de diferentes pHs a temperatura ambiente. .............................................131 Figura 43. Monitoramento da absorção no UV em 327 nm ao longo do tempo e em diferentes temperaturas do extrato aquoso de G. domingensis. .............................133 Figura 44. Espectros de absorção no UV do extrato aquoso (pH= 6,8) de G.domingensis. A: 20 °C e B: 70 °C........................................................................135 Figura 45. A) Citoxicidade do extrato GD-1 em função da concentração e B) Fotoxicidade. ...........................................................................................................137 Figura 46. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1, Helioguard 365 e dos filtros sintéticos MCX e ASB obtidas em espectrofotômetro com monitoramento entre 200-400 nm. As soluções do extrato GD-1 e do Helioguard 365 foram diluídas 10x, enquanto que dos filtros sintéticos MCX e ASB 1000x. ..........................................140 Figura 47. Medidas do rendimento efetivo do PSII em Prorocentum minimum isolada de duas regiões diferentes e expostas às radiações PAR e PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01). ...142 Figura 48. Medidas de fluorescência do DCF em culturas de Prorocentum minimum (Liss) e P. minimum (Katt) após exposição às radiações PAR e PAR+UVR durante 72 h. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01). .......................................................................................................................142 Figura 49. Espectros de absorção no VIS-UV das espécies expostas a PAR+UVR. A) Prorocentrum minimum isolado de Lisboa e B) P. minimum isolada de Kattegat.................................................................................................................................144 Figura 50. Perfil cromatográfico em λ igual a 330 nm das MAAs presentes em P. minimum (Liss) após 48 h de experimento no tratamento com PAR+UVR. TR (min): pico 1: 2,1; pico 2: 2,6; pico 3: 3,1; pico 4: 4,0; pico 5: 5,2; pico 6: 12,1; pico 7: 16,0;

pico 8: 16,4..............................................................................................................145 Figura 51. Espectros de absorção no UV dos picos obtidos por separação em HPLC. λmax (nm): A) pico 1: 332, pico 3: 310, pico 5: 337, pico 6: 333 e B) pico 2:334, pico 4: 320, pico 7: 357, pico 8: 360. ..................................................................................145 Figura 52. Perfil da variação do conteúdo total das MAAs (pmol.célula-1) em culturas do dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01). ...146 Figura 53. Concentração das diferentes MAAs (pmol.célula-1) em culturas do dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro......................................................................................................................150

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição de MAAs* em algumas cianobactérias, microalgas e macroalgas................................................................................................................31 Tabela 2 – Diferentes métodos de ionização para análises por espectrometria de massas. .....................................................................................................................45 Tabela 3 – Comprimento de onda máximo (λmax), coeficiente de extinção molar (ε),massa molecular (MM) e principais fragmentos obtidos por ESI-MS2 de diferentes MAAs.........................................................................................................................53 Tabela 4 – Protocolos testados para a extração das MAAs. .....................................65 Tabela 5 – Métodos testados por HPLC para as análises das MAAs. Detalhes das colunas encontram-se descritos acima. ....................................................................72 Tabela 6 – Porcentagens relativas dos diferentes protocolos de extração para G. tenuistipitata. .............................................................................................................89 Tabela 7 – Rendimentos das diversas etapas de isolamento das MAAs em Gracilaria tenuitipitata. ...............................................................................................................91 Tabela 8 – Íons precursores e principais íons produtos das frações F1 a F3 isoladas de G. tenuistipitata. As razões m/z correspondem às MAAs não deuteradas e m/z D2O aos análogos deuterados. Detalhes de cada produto íon (A-M) serão discutidos adiante.......................................................................................................................95 Tabela 9 – Dados de alta resolução para as moléculas não marcadas obtidos em Q-TOF. Condições experimentais estão descritas no item 3.6. ..................................102 Tabela 10 – Dados de alta resolução de MS2 e MS3 da fragmentação do palitinol obtido por ESI-FTICR-MSn. As fórmulas moleculares, massas teóricas e massas experimentais foram listadas para os íons produtos majoritários............................109 Tabela 11 – Íon precursor e principais fragmentos das MAAs identificadas em G. tenuistipitata utilizando três espectrômetros diferentes. ..........................................111 Tabela 12 – Identificação dos picos separados pelo método D (Tabela 5), valores calculados de resolução (Rs) entre dois picos adjacentes e de concentração (ng.mg extrato-1). .................................................................................................................112 Tabela 13 - MAAs identificadas pelo método E, Tabela 5 em espectrômetro com analisador Ion trap nas diferentes algas estudadas:. Gt: G. tenuistipitata, Gd: G. domingensis, Gb: G. birdiae, Pu: Porphyra umbilicalis e Pm: Prorocentrum minimum................................................................................................................................119 Tabela 14 – Valores de citotoxicidade obtidos para o extrato GD-1, cloreto de sódio e dodecil sulfato de sódio sendo os dois últimos para comparação...........................136 Tabela 15 - Valores de FPS calculados para as diferentes amostras. ....................138 Tabela 16 – MAAs identificadas em P. minimum pelos tempos de retenção em HPLC, espectros no UV e por espectrometria de massas. .....................................146

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABAP: 2,2’-azobis (2-amidinopropano) ACN: acetonitrila ANOVA: análise de variância CFCs: clorofluorcarbonos CHCl3: clorofórmio CID: dissociação induzida por colisão (collision-induced dissociation) COLIPA: The European Cosmetic Toiletry and Perfumary Association D2O: água deuterada Da: daltons DAD: detector de arranjo de diodos DAHP: 3-deoxi-arabino-heptulosonato-7-fosfato DC: corrente direta DCF: diclorofluoresceína DCFA: 2,7,-diclorodihidrofluoresceína diacetato DCFH: 2,7-diclorodihidrofluoresceína DCFH-DA: 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato 3-DHQ: 3-dehidroquinato DME: dose mínima de eritema DMEM: Dulbecco´s Modified Eagles Medium DNA: ácido desoribunucléico DPPH: 1,1-difenil-2-picril-hidrazil λmax : comprimento de onda máximo ε: coeficiente de extinção molar EtOH: etanol EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato. EROs: espécies reativas de oxigênio ESI : ionização por electrospray F: fluorescência mínima da clorofila-a medidas em amostras iluminadas Fm: fluorescência máxima da clorofila-a em amostras adaptadas no escuro após a incidência de um pulso saturante de luz branca Fm’: fluorescência máxima da clorofila-a obtida após a incidência de um pulso saturante de luz branca em amostras iluminadas Fo: fluorescência mínima da clorofila-a em amostras adaptadas no escuro FDA: Food and Drugs Administration FEP: fosfoenol piruvato FPS: Fator de proteção Solar FT-ICR: ressonância ciclotrônica de íons (Fourier Transform/Ion Cyclotron Resonance) h: hora HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid chromatography) LC-MS: cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas m/z: razão massa-carga M: mol.L-1

MAAs: Aminoácidos tipo micosporinas (mycosporine-like amino acids) MALDI: Ionização e dessorção por laser assistida por matriz MeOH: metanol

MHz: megahertz min: minuto MM: massa molecular MRM: monitoramento de reações múltiplas MS2: tandem MS nanoESI: ionização por nanospray PAM: fluorescência de pulso de amplitude modulada PAR: radiação fotossinteticamente ativa PF: peso fresco pH: potencial hidrogeniônico PIF: Fator de Foto-Irritação ppm: partes por milhão PS II: fotossistema II Q: quadrupolo Q1: primeiro quadrupolo q2: câmara de colisão Q3: terceiro quadrupolo QA: plastoquinona A QP: extinção fotoquímica da fluorescência da clorofila qN: extinção não-fotoquímica da fluorescência da clorofila Q-TOF: analisador quadruplo-tempo de vôo ΦPSII: rendimento quântico efetivo do PS II ΦP0: máximo rendimento quântico fotoquímico do PS II RF: radiofreqüência RMN 1H: ressonância nuclear magnética de próton RNA: ácido ribonucléico rpm: rotações por minuto SDS: dodecil sulfato de sódio TFA: ácido trifluoracético TIC:Cromatograma dos íons totais TMS: tetrametilsilano TOF: tempo de vôo TR: tempo de retenção u.m.a: unidade de massa atômica UV: ultravioleta UVA: radiação ultravioleta A UVB: radiação ultravioleta B UVC: radiação ultravioleta C UVR: radiação ultravioleta UVRs: radiações ultravioleta UV-Vísivel: ultravioleta-visível

SUMÁRIO

RESUMO.....................................................................................................................7

ABSTRACT.................................................................................................................9

SUMÁRIO .................................................................................................................18

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................21

1.1. A radiação ultravioleta e seus efeitos em organismos aquáticos ............22

1.2. Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs).....................................................24

1.2.1. Contexto histórico .................................................................................24

1.2.2. Estrutura e propriedades ......................................................................26

1.2.3. Ocorrência e Distribuição .....................................................................28

1.2.4. Modulação da Biossíntese....................................................................32

1.2.5. Funções................................................................................................37

1.2.6. Aplicação comercial ..............................................................................38

1.2.7. Métodos de análises de MAAs .............................................................41

1.2.7.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)...........................41

1.2.7.2. Espectrometria de massas ...........................................................43

1.3. Algas versus estresse ambiental .................................................................54

2. OBJETIVOS..........................................................................................................57

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................59

3.1. Reagentes e materiais...................................................................................60

3.2. Cultivo e coleta das micro e macroalgas ....................................................61

3.3. Condições experimentais .............................................................................62

3.3.1. Gracilaria tenuistipitata .........................................................................62

3.3.2. Prorocentrum minimum ........................................................................62

3.4. Extração das MAAs.......................................................................................64


3.4.2. Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae ..........................................67


3.4.4. Isolamento das MAAs chinorina e porphyra-334 ..................................69

3.4.5. Experimentos de variação diária das MAAs em G. tenuistipitata..........70

3.5. Análises das MAAs por HPLC......................................................................70

3.5.1. Gracilarias.............................................................................................70


3.6. Análises das MAAs por espectrometria de massas...................................73

3.7. Ensaios in vitro..............................................................................................76

3.7.1. Testes antioxidantes.............................................................................76

3.7.2. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade ...........................................78

3.7.3. Testes de estabilidade..........................................................................80

3.7.4. Fator de Proteção Solar (FPS) .............................................................80

3.8. Medidas de fotossíntese...............................................................................81

3.9. Medidas in vivo de EROs..............................................................................85

3.10. Análises estatísticas ...................................................................................86

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................87

4.1. Extração e Análises das MAAs ....................................................................88


4.1.1.1. Experimentos em Triplo Quadrupolo............................................92

4.1.1.2. Experimentos em FT-ICR...........................................................105

4.1.1.3. Experimentos em Ion Trap .........................................................110

4.1.2. Gracilaria domingensis, Gracilaria birdiae e Prorocentrum minimum .113

4.2. Isolamento de chinorina e porphyra-334...................................................120

4.3. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata.......................125

4.4. Ensaios in vitro............................................................................................127

4.4.1. Estimativa da concentração total das MAAs de G. domingensis ........127

4.4.3. Testes de estabilidade........................................................................130

4.4.4. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade .........................................135

4.4.5. Fator de proteção solar.......................................................................137

4.5. Experimentos de exposição à UVR de Prorocentrum minimum .............141

4.5.1. Medidas de fotossíntese.....................................................................141

4.5.2. Medidas in vivo de EROs....................................................................142

4.5.4. Análises das MAAs.............................................................................143

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................152

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................157

LISTA DE ANEXOS................................................................................................168

1. INTRODUÇÃO

1. Introdução

Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007

22

1.1. A radiação ultravioleta e seus efeitos em organismos aquáticos

A radiação solar que chega à superfície terrestre é constituída de radiações

do tipo infravermelho (>800 nm), visível (radiação fotossinteticamente ativa, PAR,

400-750 nm), ultravioleta A (UVA, 320-400 nm) e ultravioleta B (UVB, 280-320 nm).

A radiação ultravioleta C (UVC, 200-280 nm) é a mais energética entre as radiações

ultravioleta (UVRs) emitidas pelo sol, porém é completamente absorvida pelo ozônio

e o oxigênio, não atingindo a superfície terrestre (Figura 1). A UVR representa cerca

de 6% da energia solar total que chega à superfície terrestre, sendo que

aproximadamente 90% correspondem a UVA e o restante a UVB (Neale, 2005).

Figura 1. Espectro da radiação ultravioleta.

Os ambientes terrestre e marinho sempre estiveram sujeitos às radiações UV.

Entretanto, a diminuição da camada de ozônio por origem antropogênica, pela

emissão de poluentes atmosféricos como clorofluorcarbonos (CFCs), organo-

clorados e organo-bromados, trouxe como conseqüência um aumento no fluxo das

UVRs para a superfície da Terra (Kerr & McElroy, 1993; Lubin & Jensen 1995,

Tabazadeh et al., 2000). Este aumento é extremamente maléfico para os

organismos, em especial os fotossintetizantes. Danos em biomoléculas como ácidos

Radiação ultravioletaRaios X

UVC UVB UVA

100 150 200 250 300 350 400Comprimento

deonda(nm)

Luzvisível

Absorção de ozônio

Produzozônio

Germicida Eritema

Radiação ultravioletaRaios X

UVC UVB UVA

100 150 200 250 300 350 400Comprimento

deonda(nm)

Luzvisível

Absorção de ozônio

Produzozônio

Germicida Eritema

1. Introdução


23

nucléicos, lipídios e proteínas, alterações na mobilidade e na pigmentação celular,

inibições da fotossíntese e de crescimento são alguns exemplos dos efeitos deste

excesso de UVR que podem levar o organismo à morte (Franklin & Forster, 1997).

Estes danos celulares podem ocorrer por reações fotoquímicas (efeitos diretos) ou

via fotodinâmica (efeitos indiretos) pela formação de espécies reativas de oxigênio

(EROs) (Vincent & Neali, 2005).

Como efeitos diretos das UVRs, moléculas que absorvem nesta região do

espectro, como proteínas e ácidos nucléicos, são fotoquimicamente transformadas

ou degradadas, resultando numa perda parcial ou mesmo total de suas funções

biológicas. Assim, danos em RNA e DNA (e.g., dímeros de timina) podem ser

observados pela grande sensibilidade destas biomoléculas à exposição ao UV

(Vincent & Neali, 2005).

Nos efeitos indiretos, as UVRs podem ser absorvidas por componentes

celulares dentro e fora da célula, produzindo assim as EROs tais como, oxigênio

singlete (1O2), ânion superóxido (O2•-), radical hidroxila (•OH) e peróxido de

hidrogênio (H2O2). Estas espécies reativas podem também ser resultantes da

incompleta transferência de elétrons para o oxigênio (e.g., cadeia de transporte de

elétrons) ou de reações de auto-oxidação que ocorrem normalmente na célula

(Cadenas, 1989).

As EROs reagem com lipídios, proteínas, pigmentos e DNA, inativando suas

funções biológicas. Estudos em mamíferos sugerem a participação das EROs como

agentes significativos no desenvolvimento de diversas patologias pulmonares,

hepáticas e cardíacas decorrentes de lipoperoxidação e alterações histopatológicas

(Halliwell & Gutteridge, 1999).

1. Introdução


24

Os efeitos da radiação solar no ambiente aquático vêm sendo bastante

estudados nos últimos anos (Hader & Worrest, 1997; Dunlap & Shick, 1998, Rozema

et al., 2002). Os diversos danos causados pela exposição excessiva ao UV, por

mecanismos diretos ou indiretos, podem levar a uma diminuição da biomassa

fotossintetizante que pode ser refletida em toda cadeia trófica. Isto poderia resultar

numa diminuição da biodiversidade aquática, na captação de dióxido de carbono da

atmosfera (Takahashi et al., 1997) e nos produtos de consumo para o homem

(Hader & Worrest, 1997; Hader et al., 1998), trazendo como conseqüência um

desequilíbrio na composição e integridade do ecossistema (Rezanka et al., 2004).

Os organismos aquáticos desenvolveram diversas estratégias adaptativas

para atenuar os efeitos maléficos das UVRs tais como movimentação vertical na

coluna de água (Smith et al., 1992), reparo no DNA por fotoreativação e excisão

(Britt, 1995) e acúmulo de antioxidantes (hidrossolúveis, lipossolúveis e sistema

enzimático) (Dunlap & Yamamoto, 1995). Além destas estratégias, outro importante

mecanismo de defesa desenvolvido por cianobactérias, micro e macroalgas é a

síntese e o acúmulo de compostos que absorvem a radiação ultravioleta, conhecidos

como “aminoácidos tipo micosporinas” (mycosporine-like amino acids, MAAs) (Shick

& Dunlap, 2002, Carreto et al., 2007).

1.2. Aminoácidos tipo micosporinas (MAAs)

1.2.1. Contexto histórico

Estudos envolvendo compostos que absorvem a radiação ultravioleta foram

publicados anteriormente a 1938 (Kalle, 1938 citado em Carreto et al., 2007). Em

1960, Wittenburg isolou pela primeira vez compostos com alta absorção no UV a

partir das glândulas de gás da caravela Physalia physalis (Wittenburg, 1960). Um

1. Introdução


25

ano mais tarde, Tsujino observou em algas vermelhas (rodófitas) compostos com a

mesma característica de forte absorção no UV (Tsujino, 1961). Já em 1969, Shibata

observou que diversos extratos aquosos de corais e cianobactérias obtidos na

Grande Barreira de Corais, na Austrália, possuíam forte absorção no UV (Shibata,

1969). Estas substâncias, denominadas S-320, mostraram uma banda larga de

absorção com comprimento de onda máximo de absorção (λmax) entre 315-323 nm,

sugerindo que S-320 era um grupo de compostos similares e não uma substância

pura. A primeira evidência do papel fotoprotetor de S-320 foi descoberta por

Maragos em 1972, e mostrava que em colônias do coral Porites lobata a

concentração de S-320 variava inversamente em relação à profundidade,

provavelmente compensando os diferentes níveis de UV do ambiente (Shick &

Dunlap, 2002). Uma década depois, foi demonstrado experimentalmente que S-320

diminuía em tecidos dos corais da espécie Pocillopora damicornis sem exposição ao

UV por longo tempo, evidenciando que S-320 era produzido em resposta à

exposição a UVR (Jokiel & York, 1982).

Em 1977, químicos de Nagoya, Japão, pesquisando a toxina palitoxina no

coral Palythoa tuberculosa, observaram um composto solúvel em água com λmax em

310 nm (Ito & Hirata, 1977). Este metabólito possuía a estrutura-base idêntica à

família de metabólitos primeiramente descritos em fungos terrestres (chamados de

micosporinas) e foi identificado como micosporina-glicina. Após esta descoberta,

Hirata e colaboradores isolaram diversos derivados iminos de micosporinas

(iminomicosporinas), que foram então denominados de “aminoácidos tipo

micosporinas” (MAAs), incluindo palitina, palitinol e paliteno isolados do coral

Palythoa tuberculosa (Hirata et al., 1979); asterina isolada da estrela-do-mar

Asterina pectinifera (Nakamura et al., 1981); porphyra-334, chinorina e usujireno

1. Introdução


26

isolados respectivamente das algas vermelhas Porphyra tenera, Chondrus yendoi e

Palmaria palmata (Takano et al., 1979; Tsujino et al., 1980; Sekikawa et al., 1980).

Desde então muitos outros compostos similares e com características de absorção

no UV foram identificados em diferentes organismos aquáticos e genericamente

classificados como MAAs (Carreto et al., 2007, Karentz, 2001).

1.2.2. Estrutura e propriedades

As MAAs, com duas exceções (micosporina-glicina e micosporina-taurina),

são iminomicosporinas, caracterizados por um anel aminociclohexenimina ligado a

um aminoácido, um aminoálcool ou grupo amino (Bandaranayake, 1998). São

altamente polares, de baixo peso molecular (< 400 g.mol-1) e apresentam absorção

máxima entre 310 e 360 nm com alto coeficiente de extinção molar (ε= 28100-50000

M-1 cm-1). As diferenças apresentadas nos espectros de absorção referem-se aos

diferentes grupos no C1, além de diferentes substituintes no átomo de nitrogênio

(Figura 2).

Alguns exemplos de MAAs e micosporinas marinhas encontradas em

organismos aquáticos, bem como as suas interconversões, estão apresentadas na

Figura 2 (Carreto et al., 2005).

1. Introdução


27

O

OHHOHO

OHOO

OHHOHO

OO

NHHOHO

O

SO3-

gadusol 4-deoxigadusol micosporinataurina

HOHO

ON

NHOHO

CO2-

O

CO2-

-O2C

+

N

NHHOHO

CO2-

O

CO2-

+ - valina

NH

CO2-

N

NHOHO

CO2-

O

CO2-

+

micosporinaglicina-ácido glutâmico

micosporinaglicina

micosporina2-glicina

NHHOHO

O+

NH

CO2-

HO

micosporinaglicina-valina

+ valina

+ ácido glutâmico

- ácido glutâmico

+ taurina

- taurina

O

+ glicina- glicina

chinorinaHO

HO

O+

NH

CO2-

HO

CO2-

NH

CO2-

porphyra-334

HOHO

O+

NH

CO2-

HO

NHmicosporina

metilamino-treonina

HOHO

O+

NH

CO2-

NHNHHOHO

O+

NH

CO2-

HO

micosporinametilamino-serina

NHHOHO

O+

NHHO

palitinolCO2

-

HOHO

O+

NH

CO2-

NH

CO2-

ácido palitênico Z/E

HOHO

O+

NH

CO2-

NH2

HO-O3SO

O+

NH

CO2-

NH2

HOHO

O+

NH

CO2-

HO

HO-O3SO

O+

NH

CO2-

HO

NH2palitina treonina-sulfato

HOHO

O+

NH

NH

CO2-usujireno (isômero cis)

paliteno (isômero trans)

NHHOHO

O+

NHHO

asterina-330CO2

-

NH2NH2HOHO

O+

NHHO

palitina serina

NH2HO-O3SO

O+

NH

CO2-

HO

palitina serina-sulfato

palitina

+ HOSO3- + HOSO3

- + HOSO3-

+ glicina- glicina

+ treonina- treonina+ s

erina- s

erina

- H2O+ H2

- CO2 - CO2 - CO2

- CO2- CH3

- CH3 - CH3 - CH3

+ H2O (H+)

CH

O-

- NH3+ NH3

1 23

456

Figura 2. Vias de interconversão de diferentes MAAs propostas por Carreto e colaboradores (2005). Os retângulos tracejados indicam compostos ainda não caracterizados. Adaptado de Carreto et al., 2005.

1. Introdução


28

Nas MAAs geralmente uma subunidade de glicina está presente no C3 do

anel (Figura 2), embora em alguns corais a glicina possa ser substituída por

metilamina (e.g., micosporina metilamino-serina) (Teai et al., 1997). Algumas MAAs

podem ainda conter ésteres sulfatados (e.g., palitina serina-sulfato, Figura 2) (Wu

Won et al., 1997), ligações covalentes com oligossacarídeos (Bohm et al., 1995) e

até mesmo ligações entre elas (Carreto et al., 2001). Recentemente, uma nova

MAA, euhalothece-362, contendo o aminoácido alanina, foi isolada da cianobactéria

Euhalothece sp. (Volkmann et al, 2006). Até hoje, aproximadamente 20 MAAs foram

caracterizadas, mas este número vem crescendo nos últimos anos em conseqüência

do aumento no número das espécies estudadas e do desenvolvimento de técnicas

de análises mais eficientes e sensíveis (Carreto et al., 2006, Whitehead & Hedges,

2002, 2003).

1.2.3. Ocorrência e Distribuição

Apesar de as MAAs estarem presentes numa variedade enorme de

organismos aquáticos, apenas bactérias, fungos e algas possuem a capacidade de

sintetizar estas substâncias, uma vez que a via pela qual elas são sintetizadas (via

do ácido chiquímico) está ausente em animais. Os demais organismos aquáticos

adquirem estes compostos por meio de simbioses (como é o caso de corais e

zooxanthelae), dieta ou associações com bactérias (Shick et al., 1992; Carrol &

Shick, 1996).

As MAAs já foram identificadas em bactérias heterotróficas (Arai et al., 1992),

cianobactérias (Garcia-Pinchel & Castenholz, 1993), microalgas (Carreto et al.,

1990; Shashar et al., 1997; Groniger et al., 2000), macroalgas (Dunlap & Shick,

1998), organismos simbiontes (algas e invertebrados) (Stochaj et al., 1994; Shick et

1. Introdução


29

al., 1991), invertebrados (Carroll & Shick, 1996) e vertebrados (Dunlap et al., 1989)

Em bactérias do gênero Micrococcus sp. foi identificada a MAA chinorina (Arai et al.,

1992), mas sabe-se que diversas espécies do gênero Pseudoalteromonas e Vibrio

são capazes de converter as MAAs chinorina e porphyra-334 em micoporina-glicina

e no intermediário 4-deoxigadusol, como apresentado na Figura 3 (Dunlap & Shick,

1998, Dunlap et al., 1998a).

Figura 3. Conversão por bactérias de chinorina em micosporina-glicina (moderado antioxidante) e deoxigadusol (forte antioxidante) por bactérias (Dunlap & Shick, 1998).

Na maioria das cianobactérias, as MAAs estão distribuídas de forma

homogênea no citoplasma, sem associação à parede celular ou às membranas

fotossintéticas (Garcia-Pinchel & Castenholz, 1993). Já nas microalgas, supõe-se

que estes compostos encontrem-se ao redor de organelas sensíveis a UVR,

aumentando a eficácia destas estruturas (Neale et al., 1998), embora outros fatores,

como forma e distribuição destas organelas no citoplasma, também estejam

envolvidos na proteção contra UV. Laurion e colaboradores mostraram que a

maneira como as MAAs estão distribuídas em dois dinoflagelados aumenta a

proteção de organelas específicas contra a radiação UV (Laurion et al., 2004).

Altos conteúdos de MAAs são encontrados em microalgas da divisão

Cryptophyta, Dinophyta, Prymnesiophyta e Raphidophyta. Entretanto, espécies das

divisões Bacillariophyta, Chlorophyta, Cyanophyta e Euglenophyta possuem baixos

Vibrio harveyi

95%

Vibrio sp

N

NH

CO2H

HOHO

CO2H

O

O

NH

CO2H

HO

O

O

OHHO

O

Chinorina Micosporinaglicina

Pseudoalteromonas haloplanktis ou P. atlantica

Deoxigadusol(antioxidante)

HO HO

OH

1. Introdução


30

conteúdos de MAAs (Jeffrey et al., 1999). Em macroalgas, a divisão Rhodophyta é a

mais rica nestes compostos (Karentz, 2001; Karsten et al., 1998a, 1998b). Nas

espécies da divisão Rhodophyta são encontradas diversas MAAs em altas

concentrações, diferentemente das dos gêneros Phaeophyta (algas pardas) e

Chlorophyta (algas verdes), que provavelmente dependem de outros compostos

absorvedores, como phlorotannins em algas pardas (Pavia et al., 1997). Fatores

como posição geográfica e condições do ambiente influenciam na concentração e

diversidade de MAAs em micro e macroalgas. Por esse motivo, em espécies

tropicais estes compostos ocorrem em maiores concentrações, provavelmente pela

exposição destes organismos a maiores quantidades de UVR (Shick & Dunlap,

2002).

Exemplos de MAAs identificadas em algumas cianobactérias, microalgas e

macroalgas são apresentados na Tabela 1 (Groniger et al., 2000). A identificação de

MAAs em diferentes organismos aquáticos encontra-se descrita na literatura (Sinha

et al., 1998; Karsten et al.,1998a; Groniger et al., 2000; Carreto et al., 2007).

1. Introdução


31

Tabela 1. Distribuição de MAAs* em algumas cianobactérias, microalgas e macroalgas.

Espécies Coleta MG PT AS PL PR CH PE

Cianobactérias Gloeocapsa sp. EUA + + Nostoc commune China + Microalgas Lingulodinium polyedrum Cultura + + + + Prorocentrum micans Portugal + + Thalassiosira sp. Antártida + + Macroalgas Ulva lactuca Alemanha + Sargassum oligocystum China + + + Gracilaria changii China + + + + + +

*MAAs: MG-Micosporina-glicina; PT-palitina; AS-asterina; PL-palitinol; PR-porphyra-334; CH-chinorina; PE-paliteno.

Invertebrados vivendo em simbiose com microalgas (cianobactérias,

dinoflagelados principalmente Symbiodinium spp.) possuem MAAs em diferentes

concentrações, dependendo da profundidade do ambiente onde estes organismos

se encontram (Dunlap & Shick, 1998; Shick et al., 1996). As microalgas simbiontes

transferem as MAAs para os organismos em simbiose dada a incapacidade da

síntese destes compostos por estes organismos. Em alguns recifes de corais que

contêm de duas a dez espécies diferentes de microalgas, pelo menos 13 MAAs

foram identificadas (Shick et al., 1999; Gleason & Wellington, 1995). As MAAs são

geralmente mais concentradas nos tecidos do hospedeiro do que no simbionte

isolado deles, provavelmente mostrando uma resposta adaptativa na proteção do

tecido mais exposto a UVR (Ishikura et al., 1997; Shick et al., 1995).

As MAAs ocorrem também em tecidos de diversos peixes tropicais,

equinodermas, moluscos, cordatas, entre outros (McCkintock & Karentz, 1997;

Dunlap et al., 1989). Não é claro o papel das MAAs identificadas nestes organismos;

porém, para as encontradas em tecidos dos olhos de peixes tropicais, têm sido

1. Introdução


32

discutidas as funções de agente filtrante de radiações de alta energia (como UV) e

de amplificadores de contraste óptico no ambiente aquático. Como já foi

mencionado, estes animais adquirem as MAAs por meio da dieta, possuindo a

capacidade de concentrá-las nos diferentes tecidos (Dunlap & Shick, 2002).

As MAAs não são encontradas em plantas superiores, nas quais a proteção

contra UVR é feita pelos flavonóides (Rozema et al., 1997; Pietta, 2000), nem em

vertebrados superiores, nos quais a função protetora é assumida pela melanina.

1.2.4. Biossíntese

Embora diversos passos ainda precisem ser elucidados na biossíntese das

MAAs, a hipótese de que estas substâncias são sintetizadas pela via do ácido

chiquímico foi mostrada por Favre-Bonvin e colaboradores (Favre-Bovin et al.,

1987). Os autores mostraram que o intermediário da via do ácido chiquímico, o 3-

dehidroquinato (3-DHQ), é o precursor do anel de seis carbonos comum em

micosporinas de fungos. A síntese de micosporinas fungais provavelmente ocorre a

partir do intermediário 3-DHQ, via gadusol ou deoxigadusol (Figura 4), sendo estes

dois últimos compostos os possíveis precursores da micosporina-glicina (Shick &

Dunlap, 2002; Bandaranayake, 1998).

Experimentos realizados com o coral Stylophora pistillata em simbiose com

microalgas, em que a síntese de MAAs foi bloqueada utilizando-se N-

fosfometilglicina (inibidor específico da via do ácido chiquímico), mostraram pela

primeira vez evidências diretas de que estas substâncias devem ser sintetizadas por

meio desta via (Shick et al., 1999). As enzimas DAHP sintase e DHQ sintase

catalisam respectivamente o primeiro e o segundo passos da via do ácido

chiquímico e necessitam como cofator o íon Co+2. A quelação deste íon pelo N-

1. Introdução


33

fosfometilglicina inibe a ação destas duas enzimas, além de inibir o sexto passo da

via por competição com fosfoenolpiruvato (FEP), que é um cofator para a enzima

EPCP sintase (Bentley, 1990). Com a inibição destas três enzimas, demonstrou-se

que a síntese ocorre via 3-DHQ, o que não seria comprovado se este inibidor

bloqueasse apenas o penúltimo passo, o qual não impediria a acumulação das

MAAs (Figura 4).

O

OH

OH

HO

OHO

H2O3POO

OH

OH

H2O3POOH

O

OH

OH

HO

OHO

O

OH

OHO

OH

O OH

OHOH

OH

OOH

OHOPO3H2

OH

O

OH

O

HO

O

HO

O

O

HO

OH

HO

O

OHOPO3H2

OH

O

O

OH

O

OH

OH

O

O

OH

NH

O

HO

O

HO

OH

O

NH

O

HO

N

HO

OH

O

R

1

DAHP

+

Fosfoenolpiruvato (FEP)

Eritrose-4-fosfato

3 4 5ATP ADP

3-Dehidroquinato 3-Dehidrochiquimato Chiquimato Chiquimato-3-fosfato

+FEP

EPSP

Corismato

glicina

FenilalaninaTirosina

TriptofanoFolato

Cofatores

IsopropanóidesQuinonas

RessonâniaTautômeros

Micosporina-glicina

Imino-MAAs

XNH2

H2O3PO

2

6

7Deoxygadusol

R

R = H , DeoxigadusolR = OH, Gadusol

Figura 4. Intermediários e enzimas da via do ácido chiquímico. DAHP: 3-deoxi-arabino-heptulosonato-7-fosfato; EPCP: 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato. Enzimas: (1) DAHP sintase; (2) DHQ sintase; (3) DHQ dehidratase; (4) chiquimato desidrogenase; (5) chiquimato quinase; (6) EPCP sintase; (7) corismato sintase. R2: aminoácidos e aminoálcools caracterizando diferentes MAAs (adaptado de Shick & Dunlap, 2002).

1. Introdução


34

Em outros experimentos, o uso de aminoácidos isotopicamente marcados

(14C-glicina e 14C-serina) foi incorporado nas cadeias das MAAs micosporina-glicina

e chinorina, demonstrando que estes aminoácidos livres são seus precursores

(Portwich & Garcia-Pichel, 2003). Estes mesmos autores mostraram que

micosporina-glicina é o precursor direto da MAA chinorina.

Embora muitos experimentos evidenciem a possível rota para a biossíntese

das MAAs, pouco ainda foi explorado quanto à biotransformação destes compostos

em algas e organismos simbiontes. A grande diversidade das MAAs presentes

nestes organismos provavelmente deriva da biotransformação de micosporina-

glicina, chinorina, porphyra-334 e outras MAAs bisubstituídas por aminoácidos

(Shick, 2004; Callone et al., 2006). Segundo uma classificação sugerida por Shick,

as MAAs podem ser divididas em primárias (micosporina-glicina, chinorina e

porphyra-334) e secundárias, as quais seriam sintetizadas a partir das primárias

(Shick, 2004). Estudos com o dinoflagelado Alexandrium excavatum exposto a altas

radiações fotossinteticamente ativa (PAR) mostraram que a síntese destes

compostos é acompanhada de mudanças seqüências no espectro de absorção,

indicando possíveis interconversões entre as diferentes MAAs (Carreto et al., 1990).

Recentemente, Callone e colaboradores observaram que a síntese destes

compostos no dinoflagelado Alexandrium tamarense ocorre em dois estágios após a

exposição a altas PAR: um primeiro estágio, em que há um aumento das MAAs

primárias, principalmente porphyra-334, e um segundo, em que há um aumento nos

conteúdos da MAA secundária paliteno, acompanhada do declínio nos níveis das

MAAs primárias (Callone et al., 2006). As interconversões possíveis entre as

diferentes MAAs identificadas em organismos aquáticos foram apresentadas na

Figura 2.

1. Introdução


35

Embora as MAAs possam ser induzidas e acumuladas em uma variedade

enorme de organismos aquáticos, tais processos não se aplicam para todas as

espécies (Jeffrey et al., 1999; Hannach & Sigleo, 1998). Mesmo dentro de uma

mesma espécie, diferenças nos conteúdos e até mesmo na variedade das MAAs

dependem do lugar de origem e do estágio de vida do organismo (Jeffrey et al.,

1999). Espécies da microalga marinha Phaeocystis pouchetii possuem MAAs

apenas nos seus estágios coloniais do ciclo de vida e a concentração destes

compostos parecem ser maiores nas espécies isoladas da Antártica quando

comparada a regiões de zonas temperadas (Riegger & Robinson, 1997).

A biossíntese pode ser influenciada por condições de irradiação como tempo

de exposição e intensidade da radiação. No dinoflagelado Alexandrium excavatum

observou-se uma mudança na composição das MAAs e um aumento no espectro de

absorção no UV em questão de horas, quando este organismo foi transferido de

uma condição de baixa intensidade de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) para

uma de alta (Carreto et al., 1990). No dinoflagelado Prorocentrum micans, as

concentrações de MAAs foram muito maiores nas culturas que cresceram durante

21 dias sob radiação UV quando comparadas às culturas que cresceram sem

exposição ao UV (Lesser, 1996a, 1996b). Experimentos in situ com a macroalga

Gracilaria chilensis mostraram que, por ser encontrada em regiões bentônicas, onde

a UVR é mais atenuada, a mesma apresentou baixas concentrações de MAAs que

não variaram durante seu crescimento (Gómez et al., 2005). Estudos com duas

espécies de Porphyra (uma crescida na superfície e outra em profundidade)

mostraram que as espécies de superfície apresentaram uma maior capacidade de

adaptação quando expostas as altas irradiações se comparadas às espécies de

profundidade (Figueroa et al., 2003). Por outro lado, na macroalga Gracilaria cornea

1. Introdução


36

não foi observada indução de MAAs por exposição à UV ou UV+PAR, ainda que as

MAAs presentes nesta alga tenham se mostrado bastante estáveis às UVRs e altas

temperaturas (Sinha et al., 2000).

A composição da radiação à qual estes organismos são expostos é um

importante fator a considerar, que também varia de espécie para espécie. Em geral,

luz azul é mais efetiva na indução de MAAs do que luz verde e vermelha, e

radiações UVA e UVB aumentam fortemente o acúmulo destes compostos (Carreto

et al., 1990). A indução da biossíntese na microalga Phaeocystis antarctica ocorre

predominantemente no UVB e em comprimentos curtos do UVA, enquanto

diatomáceas respondem principalmente a comprimentos de onda mais longos do

UVA e a PAR (Riegger & Robinson, 1997). No dinoflagelado marinho Gyrodinium

dorsum, a biossíntese ocorre sobre moderada irradiação induzida

predominantemente por UVB, sendo que tanto UVA como PAR mostraram poucos

efeitos biossintéticos (Klisch & Hader, 2002).

Além da quantidade e qualidade da irradiação, outros fatores de estresse,

como nutrientes, também podem estimular ou inibir a síntese destes compostos

(Korbee et al., 2005). Korbee e colaboradores mostraram que a síntese de MAAs foi

estimulada quando duas espécies de Porphyra foram cultivadas em meio

enriquecido de amônia (Korbee et al., 2005). Por outro lado, uma baixa

concentração de nitrogênio no meio diminuiu a síntese de MAAs em alguns

dinoflagelados, indicando que os níveis de nitrogênio nas células influenciam a

síntese destes compostos (Litchman et al., 2002).

Com esses exemplos é possível notar que, independentemente dos

mecanismos de indução, as respostas cinéticas variam substancialmente entre os

organismos. Em algumas espécies é possível observar a indução em questão de

1. Introdução


37

horas, como no caso do dinoflagelado Alexandrium tamarense (Callone et al., 2006)

enquanto para outras a resposta pode levar de dias a semanas (Karsten et al., 1999;

Hoyer et al., 2002).

1.2.5. Funções

A função mais importante e estudada das MAAs é a fotoprotetora contra a

UVR, análoga à exercida por flavonóides em plantas terrestres. Esta função pode

ser atribuída a estes compostos por possuírem eficientes propriedades de absorção,

tanto no UVA quanto no UVB, e freqüente observação que a exposição a UVR, no

ambiente natural ou em condições experimentais, induz a síntese e acúmulo destes

compostos (Bandanarayake, 1998; Shick & Dunlap, 2002; Rezanka et al., 2004).

Entretanto, somente nas últimas décadas evidências diretas do seu papel

fotoprotetor foram comprovadas, uma vez que altas quantidades destes compostos

presentes em dinoflagelados inibiram os efeitos da UVR na fotossíntese (Neale et.

al, 1998; Lesser, 1996a, 1996b) e na motilidade destes organismos (Klisch et al.,

2001).

A função protetora oferecida pelas MAAs não é necessariamente restrita aos

organismos que as produzem. As MAAs presentes no fitoplâncton podem oferecer

proteção a outros organismos, atenuando a radiação UV na coluna de água (Vernet

& Whitehead, 1996). Isto pode ser mais efetivo ainda se houver uma liberação de

MAAs no meio. Na literatura, foi demonstrado que em florações do dinoflagelado

Lingulodinium polyedrum houve liberação de MAAs no meio quando da exposição

ao UVB. Entretanto, não é claro se a detecção destes compostos na água foi por

processos ativos na célula ou por lise das mesmas (Vernet & Whitehead, 1996).

Além das MAAs, outros compostos devem agir como fotoprotetores no

1. Introdução


38

fitoplâncton. Em florações de dinoflagelados do gênero Gyrodinium, um pigmento

similar a citonemina foi relatado, embora não tenha sido caracterizado quimicamente

(Llewellyn & Mantoura, 1997). Analogamente, um biopolímero de composição

variada denominado esporopolemina, que também pode ter funções fotoprotetoras

contra UV, foi isolado de algas verdes (Xiong et al., 1997).

Além da função fotoprotetora, sugere-se que as MAAs também possuem

funções osmóticas, principalmente em cianobactérias que vivem em ambientes

hipersalinos (Oren, 1997), regulatórias da reprodução (Bandaranayake & Rocher,

1999) e antioxidantes (Dunlap & Yamamoto, 1995). Dunlap & Yamamoto

demonstraram que as micosporinas marinhas (micosporina-glicina e micosporina-

taurina, Figura 2) possuem moderada atividade antioxidante, podendo funcionar

como antioxidantes biológicos em organismos marinhos (Dunlap & Yamamoto,

1995). O suposto intermediário da biossíntese, 4-deoxigadusol (Figura 2), possui

atividade antioxidante comparada ao ascorbato, diferentemente das

iminomicosporinas como chinorina, porphyra-334, palitina, asterina e palitinol, que

não apresentaram atividade antioxidante (Dunlap & Yamamoto, 1995). Suh e

colaboradores demonstraram que micosporina-glicina suprime 1O2 com alta

eficiência (Suh et al., 2003).

1.2.6. Aplicação comercial

O uso de protetores solares aumentou significativamente nas últimas

décadas, principalmente em razão de os mesmos diminuírem de maneira drástica a

incidência de câncer de pele e os processos de foto-envelhecimento (Maier &

Korting, 2005). Desta maneira, o uso de MAAs como naturais protetores contra a

UVR é comercialmente atrativo.

1. Introdução


39

Para um composto ser um eficiente filtro solar, são necessárias duas

características básicas além da absorção na região do UV: (i) ter um alto coeficiente

de extinção molar na faixa de absorção do UV e (ii) dissipar a energia absorvida com

o mínimo impacto para os tecidos da epiderme e derme, impedindo a formação de

EROs como 1O2 e O2•-, conforme apresentado na Figura 5 (Torres et al., 2006,

Dunlap et al., 1998b). Além disso, fatores econômicos (baixo custo), estéticos

(inodoro, incolor) e antialergênicos são importantes para sua aceitação comercial.

RadicalSuperóxido

Peróxido deHidrogênio

RadicalHidroxila

RadicalAlquil

HidroperóxidoRadicalPeroxila

OxigênioSinglete

[Fotoprotetor]Fotoprotetor

Figura 5. Esquema simplificado da absorção de luz por um fotoprotetor mostrando vias de dissipação por calor (indicada por ∆) e pela formação de espécies reativas. SOD: superóxido dismutase; LH: lipídio poliinsaturado (modificado de Dunlap et al., 1998b).

Alguns trabalhos na literatura já demonstraram a alta fotoestabilidade das

MAAs, tanto in vivo quanto em in vitro (Shick et al., 2000; Conde et al., 2000;

Whitehead & Hedges, 2005). Trabalhos conduzidos com as iminomicosporinas

chinorina e porphyra-334 mostraram que estas, quando irradiadas, não geram

radicais e nem intermediários reativos, comprovando a eficiente forma de dissipar a

energia absorvida no UV pelo calor (Shick et al., 2000, Conde et al., 2000).

Experimentos de fotodegradação e fotosensitização com diversas MAAs

demonstraram a resistência de diferentes MAAs a fotodegradação (Whitehead &

Hedges, 2005). Recentemente, foi mostrado que a MAA palitina, muito comum em

1. Introdução


40

algas, cnidários e organismos planctônicos, é altamente fotoestável em soluções

aquosas e que o decaimento desta molécula irradiada ocorre majoritariamente por

formas não radiativas, conforme demonstrado anteriormente para a chinorina e

porphyra-334 (Conde et al., 2007).

Além de testes de fotoestabilização, ensaios verificando a estabilidade das

MAAs em diferentes pHs e temperaturas foram descritos (Zhang et al., 2005).

Soluções contendo porphyra-334 mostraram ser estáveis em diferentes pHs (entre 1

e 11) à temperatura ambiente. Em pHs mais alcalinos (13 e 14), a absorção

monitorada em 334 nm diminuiu drasticamente nas primeiras 4 horas. Com o

aumento da temperatura, a absorvância diminui rapidamente, principalmente a 80

°C. No entanto, mesmo a 60 °C, a absorvância das soluções de porphyra-334

diminuiu vagarosamente, demonstrando que estes compostos são estáveis a

temperaturas inferiores a 60 °C (Zhang et al., 2005). De fato, Sinha e colaboradores

mostraram que soluções de porphyra-334 e chinorina foram estáveis a temperaturas

de até 75 °C por cerca de 6 horas (Sinha et al., 2000).

As propriedades de absorção de extratos metanólicos da alga

Aphanizomenon flos-aquae na região do UV em comparação a dois filtros solares

comerciais demonstraram que o extrato apresentou uma alta proteção na região do

UVA e com valores significativos de proteção no UVB (FPS=4) (Torres et al., 2006).

O uso em protetores solares e fotoestabilizadores de aditivos em plásticos,

pinturas e vernizes vem sendo pesquisado (Bandaranayake, 1998), sendo objeto de

patentes requeridas (Schmid et al., 2004; Llewellyn & Galley, 2002; Gerald et al.,

2001). Além disto, diversos análogos sintéticos de MAAs estão sendo desenvolvidos

para fins comerciais (Dunlap et al., 1998b). Análogos da micosporina-glicina,

genericamente chamados de 3-alquilamino-2-metoxiciclohex-2-enonas (Figura 6),

1. Introdução


41

não foram suficientemente estáveis para aplicações comerciais em fotoprotetores

(Dunlap & Chalker, 1985). Entretanto, derivados de tetrahidropiridina (Figura 6)

mostraram baixa reatividade quando comparados a diversos fotoprotetores

comerciais (Dunlap et al.,1998b, 1998c). O produto chamado Helioguard 365, que

contém MAAs isoladas da macroalga vermelha Porphyra umbilicalis, encontra-se

disponível comercialmente.

O

NHR

N

R3

O

R2R1

N

R3

O

R1

λmax=309-314 nm λmax=305-309 nm λmax=307-311 nm

3-alquilamino-2-metoxiciclohex-2-enonas

derivados de tetrahidropiridina

Figura 6. Análogos sintéticos de MAAs para uso em fotoprotetores e respectivos comprimentos de onda máximos de absorção (λmax).

Investigações têm sido conduzidas para a produção comercial do 4-

deoxigadusol utilizando a via de retro-síntese, com o objetivo do uso deste

antioxidante natural em indústria cosmética e alimentícia (Dunlap et al., 1998a).

1.2.7. Métodos de análises de MAAs

1.2.7.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

O método mais aplicado para a separação e isolamento das MAAs é a

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção no UV-Visível

(Nakamura et al., 1982; Dunlap & Chalker, 1986; Shick et al., 1999; Carreto et al.,

2005). A caracterização geralmente é feita comparando-se o perfil dos espectros de

absorção no UV e o tempo de retenção (TR) com padrões autênticos ou com

padrões de algas que contenham específicas MAAs.

O método clássico é baseado em fase reversa (coluna C18) eluindo

1. Introdução


42

isocraticamente com ácido acético 0,02% em água a 15 οC (Nakamura et al., 1982).

Este método separa entre 7 e 9 MAAs, possuindo a desvantagem de não eluir as

MAAs mais hidrofóbicas, como paliteno e usujireno, e não separar as mais

hidrofílicas recentemente isoladas de corais (Shick et al., 1999).

Dunlap & Chalker introduziram o uso de coluna C8 eluída isocraticamente

com ácido acético (0,1% em água) contendo 10% de metanol. Nesta condição, as

MAAs menos ácidas (micosporina-glicina, palitina, asterina, palitinol e paliteno) são

resolvidas cromatograficamente, enquanto as mais ácidas (chinorina e porphyra-

334) coeluem (Dunlap & Chalker , 1986). Entretanto, com o isolamento e a

caracterização das MAAs micosporina-2-glicina e micosporina-taurina (Stochaj et al.,

1994) houve a adição de um outro problema: separar micosporina-2-glicina de

porphyra-334 e micosporina-taurina de micosporina-glicina. Foi mostrado que

concentrações acima de 75% de metanol na fase móvel separam as MAAs

altamente polares, apesar de não separarem em uma mesma corrida as MAAs mais

ácidas das menos ácidas (Stochaj et al., 1994). Este tipo de separação foi alcançada

utilizando-se diferentes sistemas isocráticos para o grupo das mais ácidas e outro

para as menos ácidas (Adams & Shick, 2001; Shick & Dunlap, 2002).

Este último método descrito ainda não permitia a separação entre

micosporina-glicina e micosporina-taurina e entre os isômeros usujireno e paliteno

numa mesma corrida. Wu Won e colaboradores utilizaram cromatografia de troca

iônica em coluna amino e conseguiram separar micosporina-glicina de micosporina-

taurina, além de resolver algumas misturas de micosporinas sulfatadas (Wu Won et

al., 1997).

Carreto e colaboradores utilizaram gradientes com acetonitrila e água e

mostraram que uma mistura de MAAs ácidas e neutras pode ser separada numa

1. Introdução


43

única corrida (Carreto et al., 2001). Este método permite ainda a separação do

crítico par de isômeros usujireno e paliteno, além de ter revelado novas MAAs de

baixa polaridade. Por outro lado, não é possível separar algumas MAAs de alta

polaridade como chinorina de micosporina-2-glicina e palitina-serina. Recentemente,

um método em fase reversa (C18) e gradiente com ácido trifluoracético (TFA) e

hidróxido de amônio resolveu cromatograficamente uma mistura contendo 20 MAAs.

Este método emprega duas colunas C18 em série a 35 °C com gradiente utilizando

TFA (0.2% em água), metanol e acetonitrila. Com este método é possível separar as

MAAs mais polares (chinorina de micosporina-2-glicina e palitina-serina), as de

média polaridade e as de baixa polaridade, como os isômeros usujireno e paliteno.

O trabalho desenvolvido por este grupo possui a vantagem de separar uma mistura

de 20 MAAs e atualmente é o único método por HPLC que consegue resolver tantos

compostos numa única corrida (Carreto et al., 2005).

Um grande problema relacionado a este tipo de análise é que muitas MAAs

possuem espectros e tempos de retenção semelhantes, além de a técnica não

fornecer muitos dados estruturais, limitando a caracterização de novas MAAs. O

acoplamento desta técnica a espectrometria de massas vem ganhando espaço nos

últimos anos por ser uma ferramenta muito útil na identificação e caracterização

destes compostos.

1.2.7.2. Espectrometria de massas

A espectrometria de massas é uma técnica que teve seu nascimento no final

do século XIX, quando o físico britânico Joseph John Thomson estudava os efeitos

de descargas elétricas sobre gases utilizando o tubo de raios catódicos. Nos últimos

anos, esta técnica passou a ser bastante empregada com o advento de novos

1. Introdução


44

métodos de ionização, como eletrospray e MALDI, que permitiram a análise de

substâncias não-voláteis e termossensíveis como proteínas. Estas descobertas

renderam aos seus pesquisadores, Jonh Bennett Fenn e Koichi Tanaka o prêmio

Nobel de 2002 em Química.

A espectrometria de massas é uma técnica analítica muito poderosa na

caracterização estrutural de biomoléculas, sobretudo quando a quantidade de

material obtido é escassa, uma vez que este tipo de análise apresenta maior

sensibilidade que outros métodos de caracterização estrutural.

A análise por espectrometria de massas pode ser dividida em três principais

estágios. As análises iniciam com a introdução da amostra (sólida, líquida ou

gasosa), que pode ser feita diretamente (inserção direta) ou por meio de um sistema

cromatográfico. Os analitos são convertidos a íons na fonte de ionização, por meio

da perda ou do ganho de carga, da protonação ou desprotonação, da formação de

adutos ou da ejeção de elétrons. Estes íons gerados são então separados de acordo

com suas relações massa/carga (m/z) no analisador e suas intensidades relativas

medidas no detector. Por último, a aquisição e o processamento dos dados geram

os espectros de massas que são produzidos em função da intensidade de cada íon

versus sua razão m/z. Um esquema simplificado dos principais componentes de um

espectrômetro de massas é apresentado na Figura 7.

Figura 7. Esquema simplificado dos componentes principais de um espectrômetro de massas que indicam os modos de introdução da amostra, ionização e analisadores utilizados neste trabalho.

Introdução da amostra

Fonte de ionização Analisador Detector

Controle e tratamento de dados

HPLCInserção direta

ElectrosprayTriplo Quadrupolo

FT-ICRIon trapQ-TOF

Introdução da amostra

Fonte de ionização Analisador Detector

Controle e tratamento de dados

HPLCInserção direta

ElectrosprayTriplo Quadrupolo

FT-ICRIon trapQ-TOF

1. Introdução


45

A análise por espectrometria de massas é baseada na relação massa-carga

(m/z) e nas características físico-químicos das moléculas. Uma vez que este tipo de

técnica permite apenas a detecção de moléculas eletronicamente carregadas, é

necessária uma etapa de ionização dos analitos. Atualmente, existem diversos

métodos de ionização, alguns apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 – Diferentes métodos de ionização para análises por espectrometria de massas.

Métodos de ionização Sigla

Ionização por elétrons EI (electron ionization)

Ionização química CI (chemical ionization)

Ionização por electrospray ESI (electrospray ionization)

Ionização química à pressão atmosférica APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

Ionização e dessorção por laser assistida por matriz

MALDI (matrix-assisted laser (desorption Ionization)

Fotoionizacao à pressão atmosférica APPI (atmospheric pressure photoionization)

Ionização e dessorção por electrospray DESI (desorption electrospray ionization)

Plasma acoplado indutivamente ICP (inductively coupled plasma)

Nos experimentos com as MAAs foi utilizado ionização por electrospray (ESI).

A ionização por electrospray ocorre à pressão atmosférica e, embora seja

considerada uma fonte de ionização, na verdade é um processo de transferência de

íons já presentes na fase aquosa para a fase gasosa.

Na ESI, uma solução contendo um analito atravessa um capilar mantido em

alto potencial, que provoca a separação das cargas no solvente. Quando um

potencial positivo, por exemplo, é aplicado na solução, os íons negativos são

atraídos pela parede do capilar e os íons positivos tendem a se afastar para uma

região menos repulsiva, resultando na formação de uma gota enriquecida em íons

positivos. As diferenças de potenciais entre o capilar e o cone levam a uma

deformação cônica da gota carregada positivamente (cone de Taylor - Cole, 1997).

1. Introdução


46

A extremidade do capilar passa a desprender gotículas carregadas que

sofrem evaporação durante a trajetória até o analisador. O aumento da densidade

de carga na superfície leva a um aumento na repulsão entre os íons, que são então

ejetados para a fase gasosa. Os íons em fase gasosa são atraídos para o analisador

auxiliados pelos gradientes de potencial e de pressão. Neste processo são gerados

principalmente moléculas protonadas ou desprotonadas ([M+H]+ ou [M-H]-)

dependendo do sinal do potencial elétrico aplicado e ainda adutos por coordenação

com íons presentes na solução ([M+Na]+, [M+K]+, [M+Cl]- etc) (Crotti et al., 2006a). A

Figura 8 apresenta um esquema simplificado dos componentes presentes em uma

fonte de ESI.

Figura 8. Esquema simplificado de uma fonte de ionização por electrospray. O analito é inserido no sistema por meio de um capilar (à esquerda). A diferença de potencial entre o capilar e o cone leva à formação de gotículas carregadas que sofrem evaporação. Adaptado de Gates et al., 2006.

Os íons produzidos na fonte de ionização são acelerados em direção ao

analisador no qual uma combinação de campos magnéticos, campos elétricos e/ou

radiofreqüência (RF) operam para separar os íons de acordo com suas razões m/z

(Gates et al., 2006). Os analisadores podem ser de diversos tipos como setor

magnético, quadrupolo (Q), tempo de vôo (TOF), Ion Trap e ressonância ciclotrônica de

íons (FT-ICR). Análises em tandem MS são possíveis pela combinação destes

analisadores, como no caso do Q-TOF e triplo quadrupolo, e em equipamentos do tipo

fluxo de N2(g)

capilarcapilar de

transferência

PRESSÃO ATMOSFÉRICABombeamento

gotículasanalito/solvente

(spray)

Cone

para o analizador

introduçãoanalito/eluente

fluxo de N2(g)

capilarcapilar de

transferência



(spray)

Cone

para o analizador

fluxo de N2(g)

capilarcapilar de

transferência



(spray)

Cone

para o analizador

introduçãoanalito/eluente

1. Introdução


47

Ion trap e FT-ICR. Os analisadores podem ser de baixa e alta resolução, dependendo

da capacidade de separação das m/z. Os de baixa resolução, como quadrupolo e Ion

trap, conseguem detectar m/z com diferenças de 1 unidade de massa atômica (u.m.a),

enquanto os de alta resolução, TOF e FT-ICR, permitem obter massas moleculares

com exatidão.

O analisador do tipo quadrupolo consiste em quatro hastes paralelas nas

quais os íons produzidos na fonte passarão pelo seu centro (Figura 9). As hastes são

conectadas em pares opostos; em um dos pares é aplicada uma voltagem de RF, e no

outro, uma de corrente direta (DC). A movimentação dos íons dependerá do potencial

elétrico, sendo que, para cada combinação de RF e DC, apenas íons de determinada

m/z entrarão em ressonância e passarão para o detector. Os demais íons gerados

serão desviados da trajetória principal e eliminados durante o percurso até o detector.

Além disto, ao variar o potencial elétrico em um quadrupolo, pode-se variar a faixa da

relação m/z transmitida, possibilitando uma varredura espectral. A Figura 9 apresenta

um esquema simplificado de um analisador do tipo quadrupolo.

Figura 9. Esquema simplificado do analisador do tipo quadrupolo (adaptado de Gates, 2007).

hastes do quadrupólo

íon ressonante(detectado)

íon não-ressonante(não detectado)

fenda de saída

fenda de entrada

ÍONS

DETECTORhastes do quadrupólo

íon ressonante(detectado)

íon não-ressonante(não detectado)

fenda de saída

fenda de entrada

ÍONS

DETECTOR

1. Introdução


48

Alguns instrumentos comerciais são equipados com três quadrupolos (QqQ)

seqüenciais, permitindo análises em tandem MS, que geralmente são do tipo MS/MS

ou MS2. Nos triplos quadrupolos, o primeiro (Q1) e o terceiro quadrupolos (Q3) são

utilizados para selecionar um ou vários íons ou varrer um determinado intervalo de

m/z. O segundo quadrupolo (q2) na verdade é uma câmara de colisão preenchida

por um gás inerte, como hélio, argônio ou nitrogênio.

Existem diferentes modos de varredura que podem ser realizados num triplo

quadrupolo. O mais comum é a varredura dos produtos de dissociação. Neste

modo de aquisição, o íon de interesse é selecionado no Q1 e transferido para a

câmara de colisão. No q2 (câmara de colisão), interage com as moléculas de gás,

sofrendo fragmentação por meio de um processo denominado dissociação induzida

por colisão (collision-induced dissociation, CID). Os íons produtos gerados são

separados no Q3 e posteriormente detectados. Na aquisição por varredura do íon

precursor, o Q3 é ajustado para selecionar um único íon produto, sendo que o Q1

varre um intervalo de m/z que pode ter gerado este específico íon produto. Outro

modo de operação é a varredura de perda neutra. Nesta aquisição, tanto o Q1

como o Q3 varrem intervalos de m/z que permitem adquirir espectros de íons

precursores correspondentes à perda de massa de um fragmento neutro

considerado. Este tipo de análise é bastante empregada para compostos que

apresentam perdas característica de um mesmo grupamento químico, como as

MAAs.

Análises por MS2 apresentam duas grandes vantagens: o aumento de

sensibilidade e da seletividade quando comparado à espectrometria de massas

clássica. O aumento da sensibilidade está relacionado à diminuição do ruído químico

provocado por outros componentes da amostra analisada. A seleção dos íons e a

1. Introdução


49

possibilidade de seleção de um determinado íon levam a um ganho na relação

sinal/ruído. A seletividade acontece pelo fato de a probabilidade de duas moléculas

gerarem íons precursores e íons produtos idênticos por MS2 ser muito baixa

(Carvalho, 2001). Em análises quantitativas, um modo de aquisição bastante

sensível e seletivo é o monitoramento de reações múltiplas (MRM). Nesta

aquisição, os dois quadrupolos Q1 e Q3 são programados para selecionar a

passagem de massas fixas. Diferentemente da varredura dos produtos de

dissociação, o Q3 não efetua uma varredura dos íons produtos, mas seleciona m/z

específicos gerados na câmara de colisão otimizada para a produção do(s)

mesmo(s).

Os analisadores do tipo Ion Trap são instrumentos compactos e relativamente

baratos que possuem uma configuração tridimensional do analisador do tipo

quadrupolo. Um esquema do analisador Ion Trap é apresentado na Figura 10.

Figura 10. Esquema de um analisador Ion trap (adpatado de Gates, 2007).

Nestes analisadores, potenciais RF e DC são aplicados aos eletrodos para

criar um campo elétrico similar ao do analisador quadrupolar. Todavia, o modo de

operação é diferente, uma vez que no analisador linear do tipo quadrupolo os íons

passam pelos quadrupolos em direção ao detector, e no Ion Trap os íons são

aprisionados e focalizados em órbitas próximas ao centro do analisador. Os

ÍONS ÍONS

eletrodo de saídaeletrodo de saída

lente de saída

espaçadoreseletrodos

focalizador

contençãode íons

ÍONS ÍONS

eletrodo de saídaeletrodo de saída

lente de saída

espaçadoreseletrodos

focalizador

contençãode íons

1. Introdução


50

espectros de massas são adquiridos aplicando-se diferentes voltagens de RF e DC

que desestabilizam os íons e resultam na ejeção seqüencial de íons de valores

menores a maiores de m/z. Este analisador permite ainda aprisionar íons específicos

e realizar experimentos em tandem MS. Neste caso, a aplicação de um potencial

aumenta a energia cinética do íon selecionado, levando à sua fragmentação pela

colisão com os átomos de gás hélio presente na armadilha. Como estas etapas de

fragmentação são realizadas num mesmo espaço físico, é possível adquirir

espectros de MSn.

O analisador do tipo tempo de vôo (TOF) possui múltiplas vantagens, entre

elas a sensibilidade, a faixa de massas que podem ser detectadas e a rapidez na

aquisição dos dados, que possibilitam maior número de análises. Os íons

provenientes da fonte de ionização ou de um primeiro analisador (como no caso do

Q-TOF) são acelerados por um potencial elétrico, resultando numa mesma energia

cinética inicial para todos. Como suas velocidades são inversamente proporcionais

às raízes quadradas de suas massas, os íons mais leves de alta velocidade chegam

ao detector antes que os íons mais pesados de baixa velocidade. Com este

mecanismo de análise, o instrumento detecta todos os íons de acordo com suas

chegadas, conferindo a esta técnica alta sensibilidade (Van Bramer, 1998; Crotii et

al., 2006b). Um esquema simplificado do analisador TOF é apresentado na Figura

11.

1. Introdução


51

Figura 11. Esquema de um analisador TOF (adaptado de Gates, 2007).

A ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (Fourier

Transform/Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) é o mais complexo método de

análises por massas. Atualmente, é a técnica mais sensível e exata para detecção

de um íon, que permite analisar massas com alta precisão e realizar experimentos

em tandem MS. No FT-ICR, os íons gerados na fonte passam em seguida por

diversos estágios em que há um aumento gradativo de vácuo. A separação dos íons

depende do campo magnético dentro da célula, gerado por um imã supercondutor.

Quando os íons passam por este campo magnético, são direcionados para um

movimento circular perpendicular ao plano do campo que dependem de suas

relações m/z. A excitação de cada íon é alcançada por uma varredura de voltagens

RF por meio dos eletrodos transmissores. Com a aplicação da freqüência, o íon

absorve energia, mudando sua velocidade e seu raio de órbita. Esta oscilação é

detectada pelos eletrodos receptores, produzindo uma corrente de freqüência igual à

do íon. A tradução desses sinais pelo método da transformada de Fourier converte

as freqüências em valores de m/z (Van Bramer, 1998). Um esquema simplificado do

analisador FT-ICR é apresentado na Figura 12.

DetectorLinear

Reflectron

Íons

vácuo

Fonte

DetectorReflectron

DetectorLinear

Reflectron

Íons

vácuo

Fonte

DetectorReflectron

1. Introdução


52

Figura 12. Esquema simplificado de um analisador FT-ICR.

No estudo das MAAs, a espectrometria de massas vem sendo utilizada nos

últimos anos (Whitehead et al., 2001; Whitehead & Hedges, 2002, 2003; Volkmann &

Gorbushina, 2006, Volkmann et al., 2006). Whitehead e colaboradores foram os

primeiros pesquisadores a utilizar esta técnica acoplada a HPLC na caracterização e

quantificação de MAAs em fitoplâncton (Whitehead et al., 2001). Empregando ESI

no modo positivo e analisador do tipo quadrupolo eles desenvolveram um método de

quantificação para 7 MAAs utilizando o íon precursor [M+H]+ (Whitehead & Hedges,

2002). Outros trabalhos envolvendo caracterização destes compostos mostraram

que as MAAs apresentam perfis de fragmentação em comum que podem ser

utilizados para a varredura de novas MAAs em diferentes organismos aquáticos

(Whitehead & Hedges 2003). Na Tabela 3 são apresentados algumas parâmetros

físico-químicos de algumas MAAs identificadas em diferentes organismos aquáticos,

bem como os principais fragmentos gerados por análises por ESI-MS2.

Tabela 3 – Comprimento de onda máximo (λmax), coeficiente de extinção molar (ε),massa molecular (MM) e principais fragmentos obtidos por ESI-MS2 de diferentes MAAs.

MAAs λ max (nm) ε (M-1 cm-1) MM (g.mol-1) Íon precursor e principais fragmentos Referência

Z-ácido palitênico 337 29200 328 [M+H]+ 329, 314, 296, 283, 268, 251, 241, 237, 225, 197, 193, 182, 175, 150, 138 Whitehead et al, 2001

asterina 330 43800 288 [M+H]+ 289, 273, 243, 230, 213, 199, 197, 186, 168, 150, 137 289, 274, 230, 212, 197, 186,168, 150, 137

Whitehead et al., 2001

nesta tese

chinorina 333 44668 332 [M+H]+ 333, 255, 241, 230, 211, 197, 186, 185, 168, 137 333, 318, 274, 230, 212, 186


nesta tese dehidroxiusujireno 356 267 [M+H]+ 268, 224, 209 Zhang et al., 2007 euhalothece 362 362 330 [M+H]+ 331, 316, 272, 242, 228, 213 Volkmann et al., 2006

M-320 320 559 [M+H]+ 560 [M-H]- 558 Carreto et al., 2001

M-335/360 335 (360) 598 [M-H]- 597 Carreto et al., 2001

metil éster chinorina 333 346 [M+H]+ 347 [M+H]+ 347, 332, 317, 288, 270, 244, 229

Carreto et al., 2001 nesta tese

micosp. metilamino-serina 325 16600 288 [M+H]+ 289, 274 Teai et al., 1997 micosp. metilamino-treonina 330 33000 302 [M+H]+ 303 Wu Won et al., 1997 micosporina-2-glicina 332 302 [M+H]+ 303, 288, 244, 200, 185, 164, 151 Volkmann et al., 2006 micosporina-glicina 310 28800 245 [M+H]+ 246, 228, 210, 200, 182, 168, 146 nesta tese micosporina-taurina 309 295 [M+H]+ 296 Stochaj et al., 1994

palitene 360 50000 284 [M+H]+ 285, 241, 223, 205, 197, 195, 193, 179, 166, 149, 137 285, 270, 241, 226, 197


nesta tese

palitina 320 36200 244 [M+H]+ 245, 230, 209, 199, 186, 184, 162, 155, 150, 137 245, 230, 227, 209, 186, 150, 137


nesta tese palitina-serina 320 10500 274 [M+H]+ 275, 260 Teai et al., 1997 palitina-treonina 320 288 [M+H]+ 289, 274, 245, 230, 169, 151 nesta tese palitina-serina sulfato 321 353 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997 palitina-treonina sulfato 321 367 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997

palitinol 332 43500 302

[M+H]+ 303, 288, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 150, 137 303, 288, 244, 235, 230, 226, 197, 186,168, 151, 150, 138, 137


nesta tese

porphyra-334 334 42300 346 [M+H]+ 347, 303, 243, 200, 197, 186, 185, 168, 151, 137 [M+H]+ 347, 332, 303, 288, 227, 186


nesta tese

usujirene 357 284 [M+H]+ 285 285, 270, 241, 226, 197

Sekikawa et al., 1986 nesta tese

1. Introdução


54

1.3. Algas versus estresse ambiental

Os mecanismos de adaptação dos organismos às pressões ambientais, como

alta intensidade luminosa, raios UV, extremos de temperatura, radiações ionizantes,

poluentes e patógenos, originaram uma grande diversidade estrutural de metabólitos

secundários durante a sua evolução, com funções ecológicas diversas (Sze, 1998).

Os oceanos, responsáveis por 70% da superfície do globo terrestre, abrigam cerca

de 200.000 espécies marinhas, entre plantas, animais e microrganismos (Sze,

1998). A investigação de várias espécies deste habitat demonstra que o ambiente

marinho é uma fonte rica em compostos bioativos, com diversas ações biológicas

como fotoprotetores, antiinflamatórios, antioxidantes, entre outros (Asai et al., 2004;

Hay, 1996; Mundt et al., 2001; Okai et al., 1996; Vries & Beart, 1995; Yoon et al.,

2003).

Entre os organismos marinhos, uma classe bastante explorada

comercialmente são as macroalgas vermelhas (Rhodophyta). O uso intensivo destas

macroalgas está relacionado à produção de ficocolóides (ágar e carragenana), que

apresentam uma larga aplicação industrial e biotecnológica, sendo que desde o final

da década de 80 já eram produzidas em larga escala em “fazendas no mar” ou

diretamente extraídas de bancos naturais (Santelices & Doty 1989; Oliveira & Alveal,

1990). As espécies do gênero Gracilaria são bastante exploradas comercialmente

para este fim por serem uma das principais fontes de extração de agaranas

(Armisen, 1995; Critchley, 1993; Zemke-White & Ohno, 1999). Este gênero é

bastante distribuído geograficamente e a maioria das espécies descritas é

proveniente de regiões entre-marés de áreas tropicais e subtropicais (Critchley,

1993). Quanto às MAAs, sabe-se que as espécies da divisão Rhodophyta

apresentam uma grande variedade e altos conteúdos destes compostos quando

1. Introdução


55

comparadas a outras macroalgas das divisões Phaeophyta e Chlorophyta sendo

portanto organismos-modelo interessantes para estudos destes compostos (Shick &

Dunlap, 2002).

A macroalga da divisão Rhodophyta Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et

Xia (Figura 13) foi escolhida para os estudos desenvolvidos neste trabalho. Esta

linhagem é originária do sul da China e exibe uma grande tolerância a variações de

salinidade e temperatura (Haglund & Pédersen, 1993). Além disto, esta espécie é

bastante resistente ao ataque de epífitas e tem um ótimo crescimento em

laboratório. Duas espécies do mesmo gênero, Gracilaria domingensis (Kützing)

Sonder ex Dickie e Gracilaria birdiae Plastino et Oliveira (Figura 13), originárias do

litoral nordeste brasileiro também foram utilizadas neste trabalho. G. domingensis

vem sendo empregada na alimentação humana enquanto que G. birdiae é bastante

explorada para a extração de ágar, pois apresenta agaranas de alta qualidade

(Marinho-Soriano, 2005).

Entre as microalgas, uma classe de grande interesse ecológico é a dos

dinoflagelados. Os dinoflagelados marinhos são economicamente importantes por

produzirem neurotoxinas, cujos efeitos prejudiciais são potencializados durante

eventos de marés vermelhas (Landsberg, 2002). Esse fenômeno tem sido bastante

estudado em razão do aporte de nutrientes em corpos hídricos, provenientes de

efluentes domésticos e industriais, fertilizantes agrícolas e de outras fontes, que

podem propiciar condições ideais para a proliferação dessas microalgas. Como no

caso das algas da divisão Rhodophyta, os representantes desta divisão

normalmente são muito ricos em MAAs. Diversos estudos relacionados a indução,

acúmulo e biotransformação de MAAs foram realizados com dinoflagelados (Lesser,

1996a, 1996b; Neale et al., 1998; Klisch & Häder, 2000, 2001, 2002; Banaszak &

1. Introdução


56

Trench, 2001; Taira et al., 2004; Callone et al., 2006). A síntese de MAAs em

questão de horas e a facilidade de cultivo destes organismos em laboratório são

atrativos fortes para o emprego destas microalgas em estudos envolvendo as MAAs.

Para os estudos da função fotoprotetora das MAAs foi selecionado o dinoflagelado

marinho Prorocentrum minimum (Pavillard) Schiller (Figura 13) isolado de duas

regiões diferentes: Lisboa, em Portugal, e da baía de Kattegat, situada entre a

Dinamarca e a Suécia.

Figura 13. Organismos escolhidos para os estudos das MAAs: Gracilaria tenuistipitata, Gracilaria domingensis (foto: Eliane Marinho-Soriano), Gracilaria birdiae (foto: Eliane Marinho-Soriano) e o dinoflagelado Prorocentrum minimum.

Gracilaria domingensis

Gracilaria birdiae

Gracilaria tenusitipitata

5.0 µm

1 cm

Prorocentrum minimum

Gracilaria domingensis

Gracilaria birdiae

Gracilaria tenusitipitata

5.0 µm5.0 µm

1 cm1 cm

Prorocentrum minimum

2. OBJETIVOS

2. Objetivos


58

O objetivo geral deste trabalho foi o estudo da composição e das alterações

na biossíntese de compostos fotoprotetores da radiação UV conhecidos como

aminoácidos tipo micosporinas (MAAs) de algumas micro e macroalgas.

Para isso, foram realizadas as seguintes etapas:

(i) Desenvolvimento de métodos de extração e isolamento de MAAs de

Gracilaria tenuistipitata por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

com detecção no UV-Visível;

(ii) Otimização de métodos de análises por espectrometria de massas para a

elucidação estrutural de MAAs de G. tenuistipitata;

(iii) Investigação da biossíntese de MAAs nos dinoflagelados Prorocentrum

minimum isolados de duas regiões diferentes: Lisboa, em Portugal e baía

de Kattegat situada entre a Dinamarca e a Suécia;

(iv) Determinação da eficiência da fotossíntese para os dinoflagelados P.

minimum utilizando a técnica de fluorescência de pulso de amplitude

modulada (PAM) durante exposição à UVRs;

(v) Avaliação dos níveis de espécies reativas de oxigênio in vivo por

fluorescência para as espécies de P. minimum expostas à UVR;

(vi) Avaliação do potencial de aplicabilidade comercial do extrato de Gracilaria

domingensis contendo MAAs em produtos fotoprotetores por meio da:

Determinação da atividade antioxidante medida pela capacidade

de abstração de próton (ensaio com DPPH)

Medida da estabilidade quanto a diferentes temperaturas e pHs

para extratos

Avaliação da citotoxicidade e fototoxicidade;

Avaliação do Fator de Proteção Solar (FPS).

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3. Materiais e Métodos


60

3.1. Reagentes e materiais

Os solventes hexano, clorofórmio (CHCl3), acetonitrila (ACN), etanol (EtOH) e

metanol (MeOH) utilizados para as extrações das MAAs foram de grau analítico

(Neon, Vetec). Nas análises em HPLC, espectrômetro de massas e por coluna

Sephadex LH-20 (80 cm x 5,0 cm, Sigma-Aldrich) foram usados solventes de grau

cromatográfico (Tedia, J. Baker Fisher, Merck, Vetec). As soluções de trietilamina

(Sigma-Aldrich), formiato de amônio (Sigma-Aldrich) e dos ácidos acético (HAc)

(Sigma-Aldrich, Vetec, Merck), trifluoracético (Sigma-Aldrich), fórmico (Sigma-

Aldrich), heptafluorobutírico (Acros Organics), clorídrico (Merck) e fosfórico (Sigma-

Aldrich) foram preparadas com água deionizada tratada pelo sistema Milli-Q

(Millipore). Nas análises de ressonância nuclear magnética de próton (RMN 1H) e de

marcação com deutério foi empregada água deuterada (Sigma-Aldrich).

Nos ensaios antioxidantes os reagentes 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH),

ácido linolêico e 2,2’-azobis (2-amidinopropano) (ABAP) foram obtidos da Sigma-

Aldrich e dodecil sulfato de sódio (SDS) da Bio Rad. A matéria-prima Helioguard

365 foi gentilmente cedida pela Galena Química e Farmacêutica Ltda.

Nos ensaios de cito e fototoxicidade foram utilizados Células 3T3 (linhagem

estabelecida de fibroblasto de pele de camundongo neonato), Dulbecco´s Modified

Eagles Medium (DMEM), soro fetal bovino e o corante Neutral Red (corante) cedidos

pela Natura Indústria de Cosméticos.

A solução de lugol, utilizada para fixação das células para contagem, foi

obtida da Sigma-Aldrich. A sonda fluorescente 2,7,-diclorodihidrofluoresceina

diacetato (DCFA), utilizada nas medidas EROs in vivo, foi obtida da Molecular

Probes.

Os filtros utilizados nos experimentos de exposição ao UV foram: 395 nm



61

(Ultraphan UV Opak, Digefra, Alemanha) para a remoção de UVC, UVB e UVA, 320

nm (10155099, Folex, Alemanha) para a remoção de UVB e UVC e 295 nm

(Ultraphan, Digefra, Alemanha) para a remoção de UVC.

3.2. Cultivo e coleta das micro e macroalgas

A macroalga Gracilaria tenuistipitata, originária de Haikou, China, foi coletada

e isolada de contaminantes pelo Prof. Dr. Eurico Cabral de Oliveira (IB, USP) em

1993 e desde então cultivada em laboratório. As culturas foram mantidas em frascos

de 2 L em incubadoras com fotoperíodo de 12 h claro (luz branca fluorescente, 90

µmol fótons.m-2.s-1) por 12 h escuro, a 20°C e sob aeração constante. O meio de

cultura utilizado foi o von Stosch em água do mar estéril com salinidade de 21‰

(Edward, 1970).

As macroalgas Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae foram coletadas na

Praia do Cotovelo (05°56'S - 035°09'W), localizada no litoral sul do Estado do Rio

Grande do Norte, Brasil, com a colaboração do grupo da Profa. Dra. Eliane Marinho-

Soriano (DOL, UFRN). As amostras foram mantidas em freezer -80 °C até o início

das extrações das MAAs.

Os dinoflagelados Prorocentrum minimum (Katt), isolado da baía de Kattegat,

situada entre a Suécia e a Dinamarca, e Prorocentrum minimum (Liss), isolado de

Lisboa, em Portugal, foram cultivados em Guillard F/2 (Guillard & Ryther, 1962)

preparado com água artificial (Tropic Marine, Dr Bienle GmbH, Alemanha). As

culturas foram mantidas em frascos de 500 mL com aeração constante a 19 °C sob

luz constante (luz branca fluorescente, 50 µmol fótons.m-2.s-1).



62

3.3. Condições experimentais

Todas as microalgas e macroalgas utilizadas nos diferentes experimentos se

encontravam em fase exponencial de crescimento.

3.3.1. Gracilaria tenuistipitata

Para obtenção do melhor período de coleta, foi feita uma curva de

crescimento para G. tenuistipitata por meio de pesagens a cada 3 dias, sempre na 6a

hora de luz, por um período de 52 dias em condições-padrão de cultivo (item 3.2.).

Com os dados obtidos a partir da curva de crescimento, estabeleceu-se que as

culturas seriam renovadas entre 7 e 10 dias e as coletas, a cada 2 semanas. A

massa obtida era imediatamente congelada em nitrogênio líquido e armazenada em

freezer -80 °C até que uma biomassa razoável fosse obtida para o início das

extrações das MAAs. Para a verificação da existência de variação diária de algumas

MAAs presentes em G. tenuistipitata, culturas foram crescidas sob as condições-

padrão descritas no item 3.2. As amostras foram coletadas a cada três horas

durante 48 h, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer -80 °C

para análises posteriores.

3.3.2. Prorocentrum minimum

Os experimentos de exposição à UVR foram realizados no laboratório do Prof.

Dr. Donat-P Häder, da Universidade de Nurenberg-Erlangen, em Erlangen,

Alemanha. Os dinoflagelados P. minimum isolados de diferentes regiões foram

expostos durante 72 h com ciclos de 12 h claro e 12 h escuro sem nenhum

tratamento prévio. A escolha dos mesmos foi realizada pelo fato de os

dinoflagelados, conjuntamente com as cianobactérias e algas vermelhas, serem o

grupo que possui maiores quantidades destes compostos. Além disto, o cultivo dos



63

mesmos já era bem estabelecido no grupo de pesquisa em questão. Para obtenção

da radiação solar artificial (PAR+UVR), foi utilizada uma lâmpada solar (Dr Hönle

Martinsried, Alemanha). Os organismos foram expostos em recipientes de poliéster

abertos, cobertos externamente com adesivo plástico preto para evitar reflexões. Os

recipientes foram cobertos na parte superior com filtros UV 395 nm (exposição

somente à radiação PAR – controle) e 295 nm (exposição às radiações

PAR+UVA+UVB ou PAR+UVR – tratados). Os recipientes foram colocados a 118 cm

da lâmpada solar e a intensidade da irradiação foi medida com um radiômetro duplo

monocromador (QL 754, Optronic Laboratories, Orlando, EUA). As intensidades das

irradiações foram 51,2 ± 0,5 W.m-2, 12,1 ± 0,3 W.m-2 e 0,29 ± 0,03 W.m-2 para PAR,

UVA e UVB, respectivamente. O espectro obtido da lâmpada artificial solar está

apresentado na Figura 14.

Figura 14. A) Espectro da radiação solar simulada e B) detalhe do espectro entre 250 e 400 nm.

200 300 400 500 600 700 800

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Irrad

iânc

ia (W

. m

-2 n

m-1)

Comprimento de onda (nm)

240 270 300 330 360 390 420


AB

200 300 400 500 600 700 800

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Irrad

iânc

ia (W

. m

-2 n

m-1)


240 270 300 330 360 390 420


AB



64

As amostras foram coletadas a cada 12 h para análises de MAAs, EROs,

fotossíntese e contagem de células. Para as medidas de MAAs, as amostras foram

coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenados em

freezer -80 °C até o momento das análises. Já as medidas de EROs e de

fotossíntese foram realizadas no mesmo momento da coleta. Para a contagem de

células, 1 mL da suspensão foram coletados e fixados em lugol.

3.4. Extração das MAAs


Diversos protocolos foram testados para a extração das MAAs contidas em G.

tenuistipitata. Parâmetros como diferentes proporções de solventes, métodos de

rompimento celular, temperatura e tempo de extração foram avaliados quanto à

eficiência na extração destas substâncias. Os passos utilizados para cada protocolo

estão descritos Figura 15.

Figura 15. Passos gerais utilizados na extração das MAAs.

Adicionar solvente inicial(Concentração igual a 0,1 g.mL-1)

Filtrar em membranas de 0,45 µme injetar HPLC

Macerar a biomassa em nitrogênio líquido

Incubar o extrato (tempo e temperatura)

Evaporar o sobrenadante em Speed Vac

Resuspender em metanol


Resuspender em ácido acético (0,2%)ou TFA a 0,2%

10000 rpm/10 min

10000 rpm/10 min

Adicionar solvente inicial(Concentração igual a 0,1 g.mL-1)

Filtrar em membranas de 0,45 µme injetar HPLC

Macerar a biomassa em nitrogênio líquido

Incubar o extrato (tempo e temperatura)


Resuspender em metanol


Resuspender em ácido acético (0,2%)ou TFA a 0,2%

10000 rpm/10 min

10000 rpm/10 min10000 rpm/10 min



65

As condições utilizadas em cada protocolo testado estão resumidas na Tabela

4. Nos protocolos I a VI a massa de alga (peso fresco, PF), o volume de metanol

para resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 200 mg, 2 mL e HAc

a 0,2% (200 µL). O volume injetado em HPLC foi de 100 µL.

Tabela 4 – Protocolos testados para a extração das MAAs.

Protocolo Solvente Tempo (h) Temperatura (°C)

I MeOH: H2O (1:4, v/v) 2,5 45

II MeOH: H2O (1:4, v/v) 24 4

III MeOH: H2O (1:1, v/v) 2,5 45

IV MeOH: H2O (1:1, v/v) 24 4

V MeOH 2,5 45

VI MeOH 24 4

Os protocolos de extração foram avaliados de acordo com os perfis

cromatográficos obtidos. A extração mais eficiente, avaliada pelo protocolo I, foi

aquela que os picos de interesse apresentaram maior área (considerado 100%). As

porcentagens foram obtidas pela razão entre os demais picos e o pico de maior

área. As análises por HPLC foram realizadas segundo o método A (Tabela 5).

Para a extração em maior escala das MAAs foi utilizado o protocolo descrito

na Figura 16. As frações F1 a F5 coletadas em HPLC semipreparativo (método B,

Tabela 5) foram posteriormente analisadas por espectrometria de massas em

analisador triplo quadrupolo.



66

Figura 16. Protocolo de extração das MAAs presentes em Gracilaria tenuistipitata.

Nas análises por espectrometria de massas de alta-resolução (FT-ICR)

realizados em Bristol, Inglaterra, as amostras foram preparadas utilizando coluna

Sephadex LH-20 no laboratório do Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes (FCFRP,

USP). Aproximadamente 600 g de alga congelada foram trituradas em liquidificador

com 600 mL de MeOH/H2O (1:1, v/v). Após sonicação em banho ultrassom por 30

min a 10 oC e extração a 4 oC por 24 h, o extrato foi filtrado e ao precipitado foi

adicionado 600 mL de MeOH/H2O (1:1, v/v). Este procedimento foi efetuado mais 2

vezes e 1/3 do sobrenadante foi centrifugado (10000 rpm/ 20 min/ 4 oC) e liofilizado.

Resuspender em 3 mL de HAc (0,2%)Filtrar em membranas de 0,45 µmInjetar em HPLC semipreparativo

Reunir os sobrenadantes

10000 rpm/10min

180 g G. tenuistipitata

Extrato

Triturar com N2 (l) em liquidificador

24 h / 4°C

Precipitado (1)

Repetir passos (1) a (3)até extração total das MAAs

(1)

(2)

(3) Filtrar

Sobrenadante (1)

300 mL MeOH:H2O (1:1, v/v)

Sobrenadantes (2), (3), (n)

Sobrenadantes

Extração líquido-líquido CHCl3:MeOH:H2O (7:6:3, v/v/v)

Fração polar (~160 mL)

Precipitado GT-1 (2,5 mg)

Evaporar em Speed Vac



F1 F2 F3 F4 F5

Resuspender em 3 mL de HAc (0,2%)Filtrar em membranas de 0,45 µmInjetar em HPLC semipreparativo

Reunir os sobrenadantes

10000 rpm/10min

180 g G. tenuistipitata

Extrato

Triturar com N2 (l) em liquidificador

24 h / 4°C

Precipitado (1)

Repetir passos (1) a (3)até extração total das MAAs

(1)

(2)

(3) Filtrar

Sobrenadante (1)

300 mL MeOH:H2O (1:1, v/v)

Sobrenadantes (2), (3), (n)

Sobrenadantes

Extração líquido-líquido CHCl3:MeOH:H2O (7:6:3, v/v/v)

Fração polar (~160 mL)





F1 F2 F3 F4 F5



67

O extrato liofilizado (14,5 g) foi resuspendido em 30 mL de MeOH (para precipitação

de sais e açúcares), centrifugado e o sobrenadante evaporado. O precipitado

resultante foi resuspendido novamente em 5 mL de MeOH e aplicado em coluna

Sephadex LH-20 (80 cm x 5 cm) utilizando metanol como eluente com fluxo de 2,4

mL.min-1. As frações coletadas (aproximadamente 250) foram monitoradas por

espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu). As amostras com absorção máxima

entre 310 e 360 nm foram evaporadas, resuspendidas em 0,2% TFA em água (5

mg.mL-1), filtradas em membrana de polietileno 0,45 µm e injetadas em HPLC

semipreparativo (método B, Tabela 5). As frações contendo palitina e seus derivados

foram coletadas e armazenas em freezer -80 oC para análises posteriores.

Para os experimentos de variação diária a extração foi feita seguindo o

protocolo IV mostrado na Tabela 4. A massa de alga, o volume de metanol para

resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,2 g (peso fresco), 1,0

mL e ácido trifluoracético a 0,2% em água (500 µL), respectivamente. O volume

injetado em HPLC foi de 20 µL. As amostras foram quantificadas pelo método C

(Tabela 5) utilizando a somatória das áreas integradas de cada pico em 330 nm por

mg de peso fresco de alga.

3.4.2. Gracilaria domingensis e Gracilaria birdiae

Os protocolos II e IV de extração foram testados para estas macroalgas

(Figura 15, Tabela 4). A massa de alga, o volume de metanol para resuspender a

amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,5 g, 2,5 mL e ácido trifluoracético a

0,2% em água (1 mL), respectivamente. O volume injetado em HPLC foi de 100 µL.

Outras duas misturas de solventes, EtOH:H2O (1:4, v/v) e EtOH:H2O (1:1, v/v)

também foram testadas.



68

Para extração das MAAs contidas em G. domingensis em larga escala,

aproximadamente 700 g de alga congelada foram trituradas em liquidificador com

800 mL de etanol:água (1:4, v/v). Após a extração durante 24 h a 4 oC, o extrato foi

filtrado e o precipitado resultante foi re-extraído algumas vezes até a extração total

das MAAs (monitoração em espectrofotômetro UV-Visível entre 300-400 nm). Os

sobrenadantes das extrações foram agrupados, centrifugados (10000 rpm/ 10 min) e

concentrados em rotoevaporador para retirada do etanol. O sobrenadante restante

foi evaporado em Spray Dry (Mini Spray Dryer Buchi B-290) na Natura Indústria de

Cosméticos utilizando os seguintes parâmetros: temperatura de entrada: 150 oC;

aspirador: 100%; bomba: 10%; vácuo: 25 – 30 psi). O extrato de coloração rosa

obtido (m = 2,36 g), denominado GD-1, foi analisado por LC-MS segundo o método

D (Tabela 5) e utilizado para os testes de estabilidade, atividade antioxidante,

citotoxicidade, fototoxicidade e de avaliação do fator de proteção solar (FPS).

Para uma estimativa em massa das MAAs presentes neste extrato foi utilizada

a matéria-prima Helioguard 365 como referência. Segundo os fabricantes, esta

amostra contém 1 mg.mL-1 de MAAs por solução. As medidas foram realizadas em

espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu) entre 200 e 450 nm. Além da estimativa

em massa do extrato GD-1, foi utilizado outro extrato preparado seguindo as etapas

acima descritas, sendo modificada, porém, a etapa de secagem em Spray Dry,

substituída por secagem em Speed Vac® (extrato denominado de GD-2). Os extratos

e o Helioguard 365 foram preparados em água numa concentração final de 0,1

mg.mL-1 para os extratos e de 0,005 mg.mL-1 para o Helioguard 365. O mesmo

procedimento de extração em larga escala foi realizado para a macroalga G. birdiae

(extrato final denominado de GB). Os extratos também foram quantificados pelo

método de Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).



69


Nos experimentos de exposição ao UV do dinoflagelado P. minimum as MAAs

foram extraídas segundo o protocolo descrito em Klisch & Häder (Klisch & Häder,

2002). Em resumo, ao precipitado armazenado em freezer -80 °C (item 3.3.2) foi

adicionado 1,5 mL de metanol e a extração foi deixada a 4 °C durante 16 h. Após

este período as amostras foram centrifugadas (10000 rpm/ 10 min) e os

sobrenadantes utilizados para leituras em espectrofotômetro (DU 70, Beckman,

EUA) entre 250 e 700 nm. Os sobrenadantes foram então evaporados em Speed

Vac® e resuspendidos em 200 µL de água. Para a extração de pigmentos e clorofilas

foram adicionados 100 µL de CHCl3 em cada amostra. As amostras foram agitadas e

logo em seguida centrifugadas por 15 min a 10000 rpm. As fases superiores foram

coletadas, filtradas em membranas de 0,45 µm e injetadas em HPLC (50 µL).

3.4.4. Isolamento das MAAs chinorina e porphyra-334

Para o isolamento em maior quantidade de chinorina e porphyra-334 foi

utilizada a matéria-prima Helioguard 365®. Inicialmente foram feitas extrações

líquido-líquido com hexano para retirada de compostos mais apolares. A fração polar

foi coletada, evaporada e injetada em HPLC semipreparativo (método C, Tabela 5,).

Os picos correspondentes a chinorina e porphyra-334 foram coletados e

concentrados em Speed Vac®. A identidade de cada pico foi realizada utilizando

espectrometria de massas de baixa e alta resolução. As amostras foram também

submetidas a análises por RMN de hidrogênio (1H). Para isso os precipitados obtidos

(~ 1 mg) foram resuspendidos em 600 µL de água deuterada e os espectros de RMN

de 1H foram adquiridos em espectrômetro BRUKER DPX 500, a 500 MHz em tubos



70

de 5 mm em D2O. Os deslocamentos estão relacionados ao tetrametilsilano (TMS).

A reprodutibilidade dos dados de deslocamento químico é estimada +/- 0,01 ppm.

A curva de calibração foi preparada com as soluções dos padrões em água

(1-500 µg.mL-1). A concentração foi calculada por meio da absorvância medida em

espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu), utilizando os valores do coeficiente de

extinção molar (ε=44700 M-1.cm-1 para chinorina e 42300 M-1.cm-1 para porphyra-

334). O gradiente utilizado foi o mesmo empregado para o isolamento (tabela 5,

método C) e o volume injetado foi de 20 µL para cada padrão.

3.4.5. Experimentos de variação diária das MAAs em G. tenuistipitata

As condições experimentais foram descritas no item 3.3.1. A extração foi feita

seguindo o protocolo IV mostrado na Tabela 4. A massa de alga, o volume de

metanol para resuspender a amostra, bem como o ácido utilizado, foram 0,2 g (peso

fresco), 1,0 mL e ácido trifluoracético a 0,2% em água (500 µL), respectivamente. O

volume injetado em HPLC foi de 20 µL. As amostras foram analisadas pelo método

C (Tabela 5) e as áreas integradas em 330 nm e normalizadas por peso fresco (PF)

de alga.

3.5. Análises das MAAs por HPLC

3.5.1. Gracilarias

As análises foram conduzidas em dois sistemas Shimadzu. O primeiro SCL-

10AVP era composto por duas bombas LC-6AD, detector de arranjo de diodos SPD-

M10AVP equipado com cela analítica e preparativa, injetor automático SIL-10AF,

coletor de frações FRC-10A e programa Class-VP 6.14. O segundo composto por

duas bombas LC-10AD, detector Diode Array SPD-M10AVP, detector eletroquímico



71

Coulochem III (ESA) e injetor automático SIL-10ADVP, todos controlados pelo

módulo SCL-10AVP e programa Class-VP 6.14. As colunas utilizadas foram: Luna

C18 (2) (Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, 5 µm), Synergi Fusion-RP (Phenomenex®,

250 x 4,6 mm, 4 µm), Synergi Polar RP (Phenomenex®, 250 x 4,6 mm, 4 µm),

LiCrospher RP 18 (Merck®, 250 x 4,6 mm, 5 µm) e como semipreparativa Luna C18

(2) (Phenomenex®, 250 x 10,0 mm, 5 µm) todas com pré-colunas. Os comprimentos

de onda para monitoração foram 330 nm e 360 nm, fluxo de 1,0 mL.min-1 para

coluna analítica e de 4,7 mL.min-1 para semipreparativa. O tempo de corrida variou

de 20 a 40 minutos, dependendo do método empregado. O volume injetado para as

análises em coluna analítica variou de 20 a 100 µL e para a coleta em coluna

semipreparativa de 500 µL. Os espectros no ultravioleta-visível (UV-VIS) dos picos

obtidos pelo detector de arranjo de diodos (DAD) foram monitorados (250 a 700 nm)

e comparados aos encontrados na literatura para algumas MAAs (Sinha et al.,

1998). Diversos gradientes e fases móveis foram testados. A Tabela 5 apresenta os

parâmetros empregados para cada método de análise por HPLC.



72

Tabela 5 – Métodos testados por HPLC para as análises das MAAs. Detalhes das colunas encontram-se descritos acima.

Método Fase móvel Gradiente Coluna A B

A Ácido Acético 0,2% (pH=3,0)

0-20min – 100%A Luna C18

B Ácido Acético 0,2% (pH=3,0)

Metanol 100% 0-10min – 0% B 10-30min – 0-100% B

Luna C18

C TFA 0,2% (pH=1,6)


Luna C18 (25 °C)

D Ácido fórmico 0,1% (pH=3,15)*


Synergi Fusion-RP+ Synergi

Polar-RP (30 °C) E Ácido fórmico

0,2% (pH=3,15)* Metanol 100% 0-10min – 0% B

10-30min – 0-100% B Synergi Fusion-

RP+ Synergi Polar-RP (30 °C)

F Ácido acético 0,02%


LiCrospher RP C18

* O pH destas soluções foram ajustados com NH4OH.


No caso das amostras dos dinoflagelados Prorocentrum minimum, as análises

por HPLC foram conduzidas num sistema Waters com detector de arranjo de diodos

(Waters 990; Waters, EUA) utilizando a faixa de comprimento de onda entre 250 e

400 nm para a monitoração. Para a separação foi utilizado o gradiente descrito no

método F (Tabela 5). As MAAs foram identificadas comparando os tempos de

retenção com padrões disponíveis no laboratório do Prof. Dr. Donat Häder e

quantificadas pela curva de calibração obtida para a porphyra-334 utilizando as

relações dos coeficientes de extinção molar. As integrações foram realizadas nos

comprimentos de onda máximos de cada MAA utilizando o programa Millenium. Os

resultados foram expressos em pmol.célula-1. Posteriormente, as MAAs presentes

nos extratos de ambos dinoflagelados foram identificadas por espectrometria de

massas (Ion trap).



73

3.6. Análises das MAAs por espectrometria de massas

As análises por espectrometria de massa foram realizadas em colaboração

com o Dr. Valdemir Melechco Carvalho, do Instituto Fleury de Pesquisa, com o Prof.

Dr. Norberto P. Lopes (FCFRP, USP) e com o Dr. Paul Gates, da Universidade de

Bristol, Inglaterra.

O método de ionização aplicado foi majoritariamente por electrospray (ESI) no

modo positivo. Alguns experimentos foram também realizados por nanospray

(nanoESI) no modo negativo. Diferentes espectrômetros de massas foram

empregados:

(i) Triplo-quadrupolo Quattro-LC (Micromass/Waters). As análises foram

realizadas por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao espectrômetro com

fluxo de 2-5 µL.min-1. O monitoramento dos íons mais abundantes foi compreendido

entre m/z 150-500. Os diversos parâmetros de análises (potencial capilar, voltagens

do cone, do extrator e das lentes RF) foram ajustados procurando maximizar a

intensidade dos íons mais abundantes. Os espectros MS2 dos íons produtos foram

adquiridos utilizando gás argônio como gás de colisão (4x10-3 mbar) com energia de

colisão de 20 eV. Outros parâmetros foram: voltagem capilar: 4 kV; voltagem do

cone: 35 V; temperatura capilar e de desolvatação: 80 e 250 °C, respectivamente.

Nos experimentos por LC-MS em espectrômetro de massas triplo quadrupolo

(Quattro-LC, Micromass/Waters) foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu

composto por duas bombas LC-10AT controladas pelo módulo SCL-10Avp e como

injetor o sistema 215 Liquid Handler (Gilson) equipado com uma válvula de injeção

819. Um detector DAD (SPD-10Avp) com comprimento de onda ajustado em 330 nm

foi utilizado em linha. A condição cromatográfica empregada foi: Coluna Luna C18(2)

(Phenomenex®, 5 x 2 mm, 3 µm) eluída isocraticamente com uma fase móvel



74

composta de 95% de uma solução de ácido fórmico a 0,1% e ácido

heptafluorobutírico a 0,05% mais 5% metanol a um fluxo de 0,3 mL.min-1. Nestas

análises foram utilizadas as frações F1 a F5 isoladas de G. tenuistipitata como

descrito no item 3.4.1. As frações foram resuspendidas em solução de

água:acetronitrila (1:1,v/v) com 0,1% de ácido fórmico nas análises por ESI no modo

positivo e em uma solução de ACN:H2O (1:1, v/v) com 0,1% de trietilamina nas

análises no modo negativo (concentraçao final de 10 µg.mL-1). Nos experimentos de

marcação isotópica com deutério as mesmas frações foram analisadas.

Aproximadamente 0,1 mg de cada fração foi incubada com 10 mL de D2O por 24 h.

As amostras foram evaporadas em Speed Vac®, resuspendidas em água deuterada

e analisadas por ESI-MS2. Este procedimento foi repetido até que houvesse a troca

total dos hidrogênios lábeis (hidroxila (-OH), amino (-NH ou -NH2) ou carboxila (-

CO2H)) por deutério. Para confirmação dos dados obtidos em baixa resolução as

frações não deuteradas foram analisadas por alta resolução utilizando um

espectrômetro quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF, Micromass/Waters). As voltagens

da agulha e do cone foram 3,3 kV e 35 V, respectivamente. Nitrogênio foi utizado

como gás nebulizador e argônio como gás de colisão com energia de colisão de 4

eV.

(ii) FT-ICR Apex 4e 7.0 Tesla (Bruker Daltonics). As amostras foram

injetadas na fonte ESI por infusão direta pela bomba de seringa integrada ao

espectrômetro com fluxo de 100 µL.h-1. Os espectros de MSn foram obtidos a partir

do isolamento da molécula protonada (íon precursor) usando CO2 como gás de

colisão. Em alguns casos foi necessário um duplo isolamento dos íons produtos. As

condições da célula foram ajustadas para obtenção de espectros da molécula

protonada com boa intensidade dentro da faixa de análise (m/z 100-500). Os



75

espectros de massas e os experimentos de isolamento foram obtidos com uma

resolução de aproximadamente 50.000 e os espectros de MSn com resolução de

80.000. Normalmente entre 8 e 16 varreduras eram combinadas para gerar um

espectro de massas com boa relação sinal/ruído e em alguns casos onde o sinal

obtido foi pouco intenso cerca de 40 varreduras foram necessárias. As relações m/z

obtidas quando comparadas aos dados teóricos ficaram na faixa de erro de ± 1 ppm.

Nestas análises foram utilizadas as amostras isoladas segundo item 3.4.1 que foram

resuspendidas em MeOH:H2O (1:1, v/v) com 0,05% de ácido fórmico numa

concentração final de 0,1 mg.mL-1.

iii) Ion trap Esquire HCT (Bruker Daltonics). Os experimentos foram

realizados por LC-MS e por inserção direta. Nos experimentos por LC-MS foi

utilizado um sistema Shimadzu composto por duas bombas LC-20AD controladas

pelo módulo CBM-20A com injetor automático SIL-20AC e detector DAD (SPD-

M20A). O programa para a aquisição dos dados foi o “LabSolutions – LCsolution

Version 1.21 SP1”. A condição cromatográfica empregada foi a descrita na Tabela 5

(método D). Para a aquisição e análise dos dados por espectrometria de massa foi

utilizado o programa “EsquireControl Version 5.3.” e o “DataAnalysis Version 3.3”.

Um divisor de fluxo foi colocado em série com o espectrômetro de massas e o fluxo

resultante no espectrômetro foi de 50 µL.min-1. O monitoramento foi feito entre m/z

150-400 Da utilizando os seguintes parâmetros: nebulizador: 10 psi; temperatura de

dessolvatação de 250 oC; fluxo de gás do dessolvatador de 4 L.min-1; trap drive:

110%. Nestas análises foram utilizados os extratos GT-1, GB-1 e GD preparados

segundo os itens 3.4.1 e 3.4.2 e os extratos de P. minimum obtidos segundo item

3.4.3. Nas análises de infusão direta as amostras foram resuspendidas em uma

solução de MeOH:H2O (1:1, v/v) com 0,1% de ácido fórmico e injetadas com fluxo de



76

10 µL.min-1 e nas análises por LC-MS as amostras foram resuspendidas em TFA a

0.2% em água sendo que o volume injetado foi entre 5 e 20 µL. A concentração das

amostras variou de 10 a 100 µg.mL-1.

(iv) Quadrupolo-tempo de vôo (Q-TOF) QStar-XL (Applied Biosystems). As

análises neste espectrômetro foram feitas por nanoESI no modo negativo utilizando

um sistema de nanospray automático (Advion Biosciences, UK). Para as análises, 5

µL da solução era aspirada e nebulizada por chip Nanomate 400 a 1,45 V com

pressão de nitrogênio de 0,4 psi. Parâmetros da fonte: 2700 V de voltagem no spray

de íons, 75 V de potencial de declustering, focalizador a 280 V, nitrogênio como gás

secante. As MAAs chinorina e porphyra-334 isoladas da matéria-prima Helioguard

365® foram resuspendidas em MeOH:H2O (1:1,v/v) numa concentração final de

0,1µg.mL-1.

3.7. Ensaios in vitro

Com o objetivo de avaliar o potencial da aplicabilidade dos extratos de algas

contendo MAAs em fotoprotetores comerciais, foram realizados alguns ensaios in

vitro. Alguns destes experimentos foram feitos em colaboração com a Natura

Indústria e Comércio de Cosméticos Ltda (projeto Fapesp / Natura Campus

03/08735-8).

3.7.1. Testes antioxidantes

O ensaio antioxidante utilizando DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) é baseado

na propriedade deste radical estável em extrair prótons de moléculas doadoras

conforme apresentado na Figura 17. Quando radical, o DPPH apresenta absorção

máxima no visível em torno de 517 nm. Após a reação com moléculas que possuem

atividade antioxidante, esta absorção é diminuída.



77

NN

NO2O2N

NO2

NNH

NO2O2N

NO2

+ LH + L

Figura 17. Reação de DPPH com uma molécula antioxidante doadora de próton (LH).

Para isso foram preparadas soluções de DPPH 1 mM em metanol e soluções

dos extratos (2,5 mg.mL-1) a serem testados em metanol:água (1:1, v/v). Em uma

microplaca foram adicionados 10 µL da solução de DPPH, diferentes volumes dos

extratos para obtenção de concentrações de 0,1; 0,5; 1; 1,5 e 2 mg.mL-1 para um

volume final de 100 µL completados com metanol. Para cada concentração do

extrato foram descontados os brancos. Após o preparo, as amostras foram levadas

ao espectrofotômetro Elisa (Molecular Devices-Versa Max) e incubadas por 30 min

em temperatura de 25 oC no escuro. As amostras foram feitas em triplicata e as

leituras monitoradas a 517 nm (Pellati et al., 2004; Yokozawa.et al., 1998; Ferreres

et al., 2006).

Com as leituras de absorvância obtidas, foram calculadas as porcentagens de

inibição, dada pela equação:

100(%) xAbs

AbsAbsInibição

DPPH

AmostraDPPH −= Equação 1

Nestes ensaios foram utilizados os extratos de G. tenuistipitata (GT-2) obtido

como descrito no item 3.4.1, G. domingensis (GD-1) e G. birdiae (GB) obtidos



78

segundo o item 3.4.2 e a matéria-prima Helioguard 365 disponível comercialmente.

Além dos extratos das algas e a título de comparação foram utilizados padrões dos

flavonóides rutina e a mistura de quercetina e isoquercetrina nas mesmas

condições.

3.7.2. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade

Os testes de citotoxicidade e fotoxicidade foram feitos em colaboração com

Natura Indústria de Cosméticos com o intuito de avaliar a viabilidade da aplicação

comercial dos extratos contendo MAAs obtidos das macroalgas.

Para os ensaios de citotoxicidade, células do tipo 3T3 foram plaqueadas em

meio de cultura DMEM em placas de 96 poços estéril, em uma densidade de 1x104

células.poço-1 por 24 h. Após este período, as células foram incubadas com os

extratos solubilizados em água nas seguintes concentrações: 3,16 mg.mL-1; 1

mg.mL-1; 0,316 mg.mL-1; 0,1 mg.mL-1; 0,0316 mg.mL-1; 0,01 mg/mL-1; 0,00316

mg.mL-1 e 0,001 mg.mL-1. As amostras foram resuspendidas em 100 µL de

dimetilsulfóxido (DMSO) e ao sistema foi adicionado meio de cultura com 5% de

soro fetal bovino (SFB). As células foram incubadas por 24 h na presença dos

extratos e posteriormente incubadas com o corante Neutral Red durante 3 h

(Borenfreund & Puerner, 1985). O excesso de corante foi retirado e os cristais

formados dissolvidos com uma mistura de etanol:ácido acético:água (50:1:49, v/v/v).

A leitura de absorvância foi realizada em espectrofotômetro em 540 nm e com estes

dados calculou-se a concentração em que 50% das células foram viáveis (IC50).

Este valor classifica a amostra como potencialmente citotóxica ou livre de potencial

citotóxico.

Nos testes de fototoxicidade, as células 3T3 foram plaqueadas exatamente



79

como descrito acima, porém neste caso foram preparadas duas placas idênticas

(controle e irradiada com UV). Após incubação por 1 h no escuro das duas placas

com os extratos das macroalgas nas mesmas concentrações descritas acima, uma

das placas foi irradiada com UVA (5 J.cm-2) por 50 min. As duas placas foram

lavadas com tampão fosfato contendo cálcio e magnésio e após a adição de meio de

cultura com 10 % de SFB foram deixadas para um período de recuperação de

aproximadamente 12 h. No segundo dia de ensaio, as células são incubadas com o

corante Neutral Red durante 3 h. Os procedimentos de lavagem do corante e de

leitura em espectrofotômetro são os mesmos dos ensaios de citotoxicidade acima

descritos. A razão entre o valor de IC50 sem exposição ao UV (IC50-UV) e de IC50

com exposição ao UV (IC50+UV) é igual ao Fator de Foto-Irritação (PIF), que

classifica a amostra como potencialmente fototóxica ou livre de potencial fototóxico:

UVICUVIC

PIF+−

=50

50 Equação 2

Quando PIF ≥ 5, a amostra é fototóxica. Caso não tenha sido obtido o valor

de IC50 para citotoxicidade até a concentração máxima testada e em presença de UV

observou-se ação fototóxica, calcula-se IC50 e determina-se >PIF segundo a

equação:

)()max(

50 UVICUVCPIF

+−

=> Equação 3

onde Cmax é a máxima concentração testada na curva de citotoxicidade e IC50 (+UV)

é IC50 com exposição ao UV. Quando >PIF é maior que 1 a amostra é fototóxica.



80

Estes ensaios são procedimentos de padrão internacional (National Institute

of Health, 2001).

3.7.3. Testes de estabilidade

Parâmetro: pH

As amostras foram preparadas na concentração de 0,1 mg. mL-1 em soluções

de diferentes pHs (1-12). Para o acerto dos respectivos pHs, soluções de ácido

clorídrico e hidróxido de sódio 0,1 mol.L-1 foram utilizadas. As leituras foram feitas

utilizando cubetas de quarto em espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu)

equipado com celas com controle de temperatura. A monitoração foi feita entre 200

e 400 nm a cada hora num período total de 6 h. Os experimentos foram feitos em

triplicata e os resultados apresentados em função da absorvância versus

comprimento de onda.

Parâmetro: Temperatura

Para estes ensaios os extratos foram preparadas diluindo 0,1 mg dos extratos

em 1 mL de água (pH= 6,7; 0,01% em massa). As amostras foram mantidas a 20 °C,

50 °C, 70 °C e 90 °C e a monitoração foi feita a cada hora num período total de 6 h.

Os parâmetros utilizados no espectrofotômetro foram os mesmos do citado

anteriormente. Os resultados foram apresentados em função da absorvância em 327

nm versus área entre 290 e 360 nm.

3.7.4. Fator de Proteção Solar (FPS)

Nestes testes em colaboração com a Natura Indústria e Comércio de

Cosméticos Ltda, o FPS foi medido em um espectrofotômetro com detecção via

esfera de integração (SPF-290, Optometrics). A monitoração foi feita entre 290 e 400

nm e os dados foram acumulados em intervalos de 5 nm. Com os dados de



81

transmitância, o programa calcula o valor de FPS da amostra. Embora estes dados

in vitro sejam uma estimativa das respostas in vivo, numa primeira etapa esta

ferramenta é importante para dar indícios do potencial de aplicabilidade do produto.

Os extratos testados foram dissolvidos em etanol:água (2:1, v/v) na

concentração de 6,6 mg.mL-1 (0,66% em massa) e aplicados em placas de

polimetilmetacrilato formando um filme de espessura igual 10 µm (1 mg.cm-2). Após

a secagem do filme (5 min), a placa foi posicionada no equipamento e as leituras de

transmitância no intervalo entre 290 e 400 nm foram realizadas em triplicata para

cada amostra. Antes de cada leitura foi lido um branco (placa+ etanol:água (2:1,v/v))

para o desconto dos valores de transmitância. Como parâmetro de comparação

utilizou-se dois filtros solares sintéticos comercialmente empregados,

metoxicinamato de 2-etil hexila (MCX, hidrofóbico, proteção UVB) e ácido sulfônico

fenileno benzimidazol (ASB, hidrofílico, proteção UVB) além do produto Helioguard

365®.

Além das medidas feitas em placas de polimetilmetacrilato, o perfil de

absorção no UV destas amostras foi monitorado em espectrofotômetro (UV-1650PC,

Shimadzu) entre 200 e 450 nm. Para as leituras, as amostras dos filtros sintéticos

foram diluídas 1000 vezes, enquanto as amostras do extrato de G. domingensis e do

Helioguard 365®, 10 vezes. Os resultados foram apresentados em função da

absorvância versus comprimento de onda.

3.8. Medidas de fotossíntese1

Foi utilizada a técnica da fluorescência de pulso de amplitude modulada

1 Grande parte das informações contidas neste texto foi baseada na tese da Dra. Bruna Mohovic intitulada “Proteção contra a

radiação UV no fitoplâncton marinho: um novo método de estimativa baseado na fluorescência in vivo e os efeitos do aumento

de UV-B em duas latitudes” (Mohovic, 2005).



82

(PAM) para as medidas do rendimento quântico do fotossistema II nos

dinoflagelados expostos a UVR (item 4.3.2).

A análise da fluorescência in vivo da clorofila permite medidas não-invasivas e

quase instantâneas de aspectos-chave do processo de captura de luz pela

fotossíntese e transporte de elétrons (Campbell et al., 1998). Estas medidas podem

ser feitas utilizando um fluorímetro PAM. Neste equipamento, medidas do

rendimento quântico do fotossistema II (PS II) utilizando o método do pulso de

saturação podem ser empregadas para o cálculo de diversos parâmetros

relacionados à fotossíntese.

O princípio básico do método do pulso de saturação é o de que, por meio da

aplicação de um pulso de luz suficientemente forte, o aceptor da cadeia de

transporte de elétrons, plastoquinona A (QA), é totalmente reduzido e, assim, a

extinção da fluorescência pela fotoquímica é suprimida. A extinção de energia

restante é não-fotoquímica (non-photochemical quenching, qN).

A análise da fluorescência depende do fenômeno no qual elétrons dos

átomos de uma molécula (neste caso, um pigmento) absorvem a energia de fótons e

vão para um estado eletrônico excitado. Para retornarem ao seu estado

fundamental, há essencialmente 4 rotas: (i) reações fotoquímicas nas quais o elétron

excitado deixa a molécula de pigmento e entra numa cadeia de transporte de

elétrons, como ocorre em clorofilas específicas dos centros de reação da

fotossíntese; (ii) dissipação de calor, na qual o elétron excitado retorna ao estado

fundamental por meio de perda de calor; (iii) transferência da energia de excitação

para um pigmento adjacente, como ocorre nos sistemas antena (LHC, Light

Harvesting Complexes) de organismos fotossintetizantes; e (iv) emissão de um fóton

por fluorescência, em um comprimento de onda mais longo do que aquele do fóton



83

inicialmente absorvido (Campbell et al., 1998).

O máximo rendimento quântico fotoquímico do PS II (Φpo) é o parâmetro

obtido a partir de amostras adaptadas ao escuro (com todos os centros de reação

abertos), no qual, com a aplicação de um pulso saturante de luz branca, a

fluorescência é elevada do seu valor de estado de repouso (Fo), induzida por uma

luz vermelha fraca, para um valor máximo (Fm) (Figura 18). Nesta situação, o

primeiro receptor de elétrons do PSII, QA, está totalmente reduzido. Seu valor

máximo, quando medido sob condições não-estressantes, é quase constante para

muitas espécies fotossintetizantes, sendo em torno de 0,6 a 0,8 em algas verdes

saudáveis. Esses valores podem ser diminuídos, por exemplo, pela fotoinibição,

poluição da água e vários outros fatores de estresse naturais e antrópicos. Desta

maneira, este parâmetro pode ser um indicador de fotoinibição ou de outro tipo de

dano causado aos complexos do PS II.

Para uma amostra adaptada ao escuro:

FmFo

FmFoFm

FmFv

po −=−

== 1φ 10 << poφ Equação 4

onde Fm é a fluorescência máxima obtida após a incidência de um pulso saturante

de luz branca em amostras adaptadas no escuro e Fo a fluorescência no estado de

repouso em amostras adaptadas no escuro.

Em células adaptadas no claro com luz constante actínica, a fluorescência do

estado de repouso (F) é maior que a fluorescência Fo medida em amostras

adaptadas no escuro (Figura 18). A aplicação de um pulso saturante de luz nesta

situação induz uma fluorescência Fm’, que é menor quando comparada a Fm obtida

com adaptação no escuro. Isto se deve ao estimulo de vias de dissipação da energia



84

por processos não radiativos (dissipação por calor, processos não fotoquímicos),

uma vez que nem todos os centros de reação estavam abertos no momento do

pulso. O rendimento quântico efetivo do PSII (ΦPSII) é obtido a partir destes dois

parâmetros F e Fm’, como mostrado na Equação 5.

''

' FmFFm

FmF

PSII−

=∆

=φ Equação 5

onde Fm’ é a fluorescência máxima obtida após a incidência de um pulso saturante

de luz branca e F a fluorescência no estado de repouso.

Outros parâmetros que podem ser calculados a partir destes valores são qP

(dissipação por processos fotoquímicos) e qN (dissipação por processo não

radiativos), como mostrado na Figura 18.

Figura 18. Medidas da fluorescência da clorofila utilizando o método do pulso de saturação. Detalhes das equações estão mostrados no texto. Extraído de Mohovic, 2005.



85

Para estas medidas, 1,0 mL de suspensão de células foram transferidas para

cubetas de plásticos e as leituras realizadas em fluorímetro PAM-101 (Walz,

Alemanha). Os parâmetros Fm’ e F foram utilizados nos cálculos segundo a

Equação 5.

3.9. Medidas in vivo de EROs

O ensaio utilizado para as medidas de EROs nas células dos dinoflagelados

P. minimum expostos a radiação UV foram feitos utilizando a sonda 2,7-

diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), segundo protocolo descrito em He

e colaboradores (He et al., 2002). A membrana celular é permeável a DCFH-DA não

fluorescente e pode diacetilar este composto por meio de esterases para gerar o

análogo hidrolizado 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH), quando este é absorvido

pelas células vivas. DCFH é rapidamente oxidado in vivo por EROs e outros

peróxidos a diclorofluoresceina (DCF), um composto altamente fluorescente. A

formação do DCF é apresentada na Figura 19.

As amostras foram preparadas adicionando 2,5 µL de DCFH-DA 2 mM a 1 mL

de suspensão de células imediatamente após a coleta (item 3.3.2) e incubadas por 1

h no escuro sob agitação. Como controle, amostras sem adição da sonda foram

incubadas seguindo o mesmo procedimento. As leituras de fluorescência foram

realizadas em fluorímetro (RF-5000, Shimadzu, Japão) utilizando com comprimento

de excitação 485 nm e emissão entre 500-600 nm. A fluorescência obtida em 520

nm foi utilizada para determinar a produção de EROs. Os resultados foram

corrigidos subtraindo a fluorescência obtida das amostras controle (suspensão de

células sem adição da sonda).



86

O

HCl

OOCCH3H3CCOO

Cl

O

HCl

OHHO

Cl

O

Cl

OHO

Cl

DCFH-DA

DCF

DCFH

Peroxidase/H2O2,RO2, RO , OH,HOCl, ONOO-,mas não O2 ou H2O2

esterase (intracelular)

COO-

COO-

Figura 19. Formação de DCF altamente fluorescente a partir da oxidação de DCFH-DA por espécies reativas geradas intracelularmente pela exposição à UVR. Adaptado de He & Hader, 2002.

3.10. Análises estatísticas

Os dados foram expressos como médias ± desvio-padrão e as análises

estatísticas foram realizadas por meio do programa SPSS 8.0 for Windows. Para a

verificação do pressusposto de normalidade foi empregado o teste de normalidade

(Shapiro-Wilk) com nível de significância de 95%. A igualdade de variância entre as

amostras foi verificada por meio do teste de Levene, pela combinação das n

amostras tomadas duas a duas. Foi empregada a análise de variância com um

critério de classificação (ANOVA-one way) para comparação entre as médias das

variáveis controles e tratados nos intervalos de tempo sob investigação com nível de

significância de 99%. Para comparações múltiplas entre as médias foi utilizado o

teste de Bonferroni.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4. Resultados e Discussão


88

4.1. Extração e Análises das MAAs


Para determinar o melhor período de coleta e manutenção da cultura de G.

tenuistipitata foi realizada uma curva de crescimento. Os dados mostraram que a

fase de crescimento exponencial estava entre o 7o e 20o dia. Porém, foi possível

observar a presença de epífitas (cianofíceas e dinoflagelados) a partir do 15o dia. A

partir destes resultados foi estabelecido que as coletas e a renovação do meio de

cultura ocorreriam entre 7 e 12 dias.

Na literatura existem diversos protocolos de extração descritos para as MAAs.

Parâmetros como temperatura e tempo de extração, bem como diferentes misturas

de solventes, são variados. Por exemplo, soluções de etanol e água (50% a 80%) e

metanol e água (20% a 100%) são empregadas, além de diferentes temperaturas de

incubação que podem variar de -20 a 50 °C (Tartarotti & Sommaruga, 2002). Os

valores obtidos das concentrações finais de MAAs de diferentes organismos podem

variar muito dependendo do protocolo empregado. Por este motivo é de suma

importância o estabelecimento de um protocolo de extração eficiente para o

organismo em estudo a fim de evitar-se valores subestimados ou superestimados.

As análises por HPLC segundo o método A (Tabela 5) dos diferentes extratos

obtidos a partir dos protocolos descritos na Tabela 4 apresentaram quatro picos

majoritários (dados não apresentados). Conforme descrito no item 3.4.1, as áreas

integradas dos picos foram utilizadas para avaliar a eficiência de cada um dos

protocolos de extração que foram calculadas em relação ao protocolo I (Tabela 4),

para esta macroalga o mais eficiente. Os resultados estão apresentados na Tabela

6.



89

Tabela 6 – Porcentagens relativas dos diferentes protocolos de extração para G. tenuistipitata. * valores significativamente diferentes (ANOVA, p<0.05).

Protocolo/Picos

1 (%) 2 (%) 3 (%) 4 (%) Total das MAAs (%)

I 100 100 100 100 100

II 75,4 95,6 65,2 68,9 81,3* III 95,1 94,6 99,3 99,3 96,5

IV 92,5 94,1 95,1 94,7 94,3

V 77,8 70,4 93,2 93,7 80,0* VI 82,2 84,8 98,9 90,7 87,4*

Os resultados mostraram que os protocolos utilizando altas temperaturas (45

°C) e com misturas de MeOH e H2O foram mais eficientes que aqueles realizados a

4 °C ou com MeOH 100%. O menos eficiente foi o protocolo II e não houve variação

significativa entre os protocolos I e III. O aumento da polaridade do solvente incial

diminuiu a extração dos picos 1 e 2 (com exceção do protocolo II). Embora o

protocolo IV tenha apresentado um rendimento menor que os protocolos I e III, este

foi escolhido para as extrações em larga escala. Na literatura alguns trabalhos

mostram que as iminomicosporinas porphyra-334 e chinorina são muito estáveis a

temperaturas maiores que 45 °C (Sinha et al., 2000). Entretanto, como neste

trabalho foram utilizadas algas que não haviam sido estudadas quanto à diversidade

das MAAs, optou-se pelo protocolo IV, pois as condições mais brandas de extração

poderiam manter a integridade das MAAs presentes nestas algas, caso existisse

moléculas diferentes das já descritas e menos estáveis. Além disto, o protocolo IV

em comparação ao protocolo I utiliza menos água na extração inicial (MeOH:H2O,

1:1, v:v), o que acarreta em duas vantagens: uma quantidade menor de agaranas no

extrato bruto uma vez que estes compostos são altamente polares e em um tempo

menor para concentração do extrato em Speed Vac®.

Na extração em larga escala algumas etapas foram adicionadas e outras



90

modificadas do protocolo IV (item 3.4.1 de materiais e métodos). A extração líquido-

líquido com a mistura de CHCl3:MeOH:H2O (7:6:3, v/v/v) foi realizada para extrair

pigmentos, como carotenóides e clorofilas e outros compostos mais hidrofóbicos.

Tentativas anteriores com outros solventes e misturas (e.g., hexano, clorofórmio)

não foram tão eficientes na extração de compostos de alta, média e baixa

hidrofobicidade quanto à mistura de CHCl3:MeOH:H2O empregada. Outro passo

adicionado foi a precipitação do ágar com etanol a baixas temperaturas. Embora

este procedimento seja usual para a precipitação deste polissacarídeo (Falcão et al.,

2006), ele não foi tão eficiente neste caso, uma vez que a macroalga em estudo

apresenta uma grande quantidade de ágar podendo chegar a aproximadamente

53% de seu peso seco (Macchiavello et al., 1999).

Para as análises por HPLC do extrato GT-2 obtido segundo o item 3.4.1,

diversos gradientes binários, fases móveis e colunas foram testados. O método

isocrático anteriormente utilizado na avaliação da eficiência dos protocolos de

extração (método A, Tabela 5) foi substituído por métodos binários, pois algumas

MAAs (e.g., paliteno e usujireno) possuem caráter menos hidrofílico pela presença

de uma cadeia alifática no substituinte R do grupamento imino (Figura 2).

Após diversas tentativas, o gradiente utilizado para separação em HPLC foi o

método B (Tabela 5). O perfil cromatográfico e os espectros de absorção no UV do

extrato GT-2 estão apresentados na Figura 20. Os rendimentos de cada etapa estão

listados na Tabela 7.



91

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

010

00

0

50

10

1

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

010

00

0

50

10

1

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

010

00

0

50

10

2

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

010

00

0

50

10

2

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

100

150

0

50

10

15

3

nm260 280 300 320 340 360 380 400

050

100

150

0

50

10

15

3

nm260 280 300 320 340 360 380 400

020

040

0

0

20

404

nm260 280 300 320 340 360 380 400

020

040

0

0

20

404

nm260 280 300 320 340 360 380 400

020

040

0

0

20

405

nm260 280 300 320 340 360 380 400

020

040

0

0

20

405

Figura 20. Perfil cromatográfico do extrato GT-2 com monitoramento em 330 nm e espectros de absorção no UV das frações coletadas. TR (min) / λmax (nm): F1: 3,7 / 320; F2: 4,2 / 330; F3: 6,9 / 334; F4: 9,6 / 332; F5: 17,0 / 360.

Tabela 7 – Rendimentos das diversas etapas de isolamento das MAAs em Gracilaria tenuitipitata.

Extratos/Frações GT-1 GT-2 F1 F2 F3 F4 F5

massa (g) 2,56 1,53 0,013 0,019 0,011 0,012 0,009

rendimento (%) 1,42 0,85 0,007 0,01 0,006 0,006 0,005



92

Utilizando um gradiente de eluição com MeOH foi possível observar outros

picos (F5 e outros minoritários entre 20 e 25 min, Figura 20) que provavelmente não

eram eluídos da coluna utilizando o método isocrático com ácido acético. Os

rendimentos obtidos foram satisfatórios e cada fração coletada foi analisada por

espectrometria de massas.

4.1.1.1. Experimentos em Triplo Quadrupolo

As frações F1 a F5 isoladas da macroalga G. tenuistipitata foram analisadas

por infusão direta no espectrômetro de massas por ESI no modo positivo, pois

tentativas anteriores no modo negativo não resultaram em espectros razoáveis para

interpretação.

Os espectros de massas adquiridos por infusão direta no intervalo m/z 150-

500 (full scan) das frações mostraram majoritariamente a presença dos íons m/z 245

e 333 (fração F1), m/z 289 (fração F2), m/z 347 (fração F3), m/z 303 (fração F4) e

m/z 285 (F5), além de outros íons (dados não apresentados). Análises por LC-MS

mostraram que as frações coletadas previamente por HPLC semipreparativo não

estavam puras. Na fração F1, por exemplo, foi possível observar a presença de mais

de um componente como mostrado na Figura 21.



93

Figura 21. Análise da fração F1 por LC-UV-MS. A) Cromatograma com detecção no UV em 330 nm; B) Cromatograma obtido pela somatória dos íons totais (TIC); C) Espectro de massas para o pico com tempo de retenção igual a 4,4 min e D) Espectro de massa para o pico com tempo de retenção igual a 3,8 min. Energia de colisão: 20 eV.

As análises por infusão direta das frações deuteradas e não deuteradas (F1 a

F5) para obtenção dos espectros de MS2 forneceram um perfil de fragmentação

muito rico em informação estrutural. Os espectros de MS2 das frações F1 a F3 estão

apresentados na Figura 22.

FA-6 0.3mg 1 - F

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00Time0

100

%

0

100

%

031226-09 UVAn1

2.44e43.72

2.66

031226-09 Scan ES+ TIC

5.38e73.81

3.79

2.842.671.751.270.810.452.98

3.84

4.00

4.104.42

4.564.63

12.117.076.29 11.84 12.29 17.64 19.89

150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 m/z 0

100

%

0

100

%

031226-09 441 (4.424) Cm (433:461-44:111) Scan ES+ 5.39e5 333.2

150.0 150.2 198.1

157.2 162.1 172.3 183.0 194.1

259.1258.8

236.0199.2 220.1 206.1 275.0

260.0 277.1319.1

334.2

355.3 371.3

031226-09 380 (3.812) Cm (365:412-57:166) Scan ES+ 3.78e6 245.0

333.2300.0277.0274.9

D

B

A

C

m/z180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100%

0

100 x4 186.2 245.1230.1209.1199.1197.2 227.1

x4 251.1192.1 236.1213.1203.1 232.1

x2 289.1230.1186.2

199.2197.0 212.1274.1

x2 295.1236.2191.2

217.2204.2201.1280.1

x6 303.1186.1 244.2230.1199.1 226.2

235.2

288.1

x6 309.1191.1 250.2235.2

204.3

294.1

x6 333.1230.1186.1

197.1 212.1199.1274.3 300.1

318.1

x6 340.1237.2191.2 306.2281.1 325.2

202.1

197.0

231.2201.1

217.2 218.2

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

Figura 22. ESI-MS2 das MAAs (a) palitina, (b) palitina deuterada, (c) asterina, (d) asterina deuterada, (e) palitinol, (f) palitinol deuterado, (g) chinorina e (h) chinorina deuterada. A abundância relativa foi de 3 x 107 a 3 x 108. Energia de colisão: 20eV.



95

Na Tabela 8, os m/z dos íons precursores e os principais íons produtos das

frações F1 a F3 e seus análogos deuterados estão mostrados. Os detalhes de cada

fragmentação serão discutidos a seguir.

Tabela 8 – Íons precursores e principais íons produtos das frações F1 a F3 isoladas de G. tenuistipitata. As razões m/z correspondem às MAAs não deuteradas e m/z D2O aos análogos deuterados. Detalhes de cada produto íon (A-M) serão discutidos adiante.

Palitina Asterina Palitinol Chinorina íon precursor/

íon produto m/z

m/z D2O

m/z

m/z D2O

m/z

m/z D2O

m/z

m/z D2O

Molécula protonada 1 245 251

Molécula protonada 2 289 295 303 309 333 340

A 230 236

B 186 192 186 191 186 191 186 191

C 227 232

D 227 232

E 209 213

F 274 280 288 294 318 325

G 230 236 244 250 274 281

H 212 217 212 217/218

I 212 217 212 218

J 230 235

K 226 231

L 226 231

M 230 237

Fração F1

O espectro full scan adquirido no intervalo m/z 150-500 da fração F1 confirma

a presença dos íons m/z 245 e 333 quando o solvente utilizado foi acetonitrila/ácido

fórmico (Figura 22) e os íons m/z 251 e 340 quando o solvente foi água deuterada

(dados não apresentados). As discussões que se seguem são feitas para o íon m/z

245 e seu análogo deuterado m/z 251. O outro íon (m/z 333) será discutido mais



96

adiante.

A diferença de 6 u.m.a. entre os íons m/z 245 e seu análogo deuterado m/z

251 está de acordo com a presença de 5 hidrogênios lábeis na estrutura da palitina

(Figura 23, molécula 1 onde X=H) sendo 1 u.m.a. atribuído à carga do átomo de

deutério (D+). O espectro de MS2 da palitina e seu análogo deuterado estão

mostrados na Figura 22 (a) e (b). Perdas iniciais de 15 e 44 u.m.a. resultando nos

íons A e B (Tabela 8 e Figura 23) são observadas nas duas amostras (não

deuterada e deuterada). Isso implica que estes passos não envolvem hidrogênios

lábeis. A perda de 15 u.m.a. foi atribuída ao radical metil ligado ao oxigênio do C2 da

molécula protonada [M+H]+. De acordo com Whitehead & Hedges esta perda para

palitina foi proposta sendo o grupamento NH (Whitehead & Hedges, 2003). Como

mostrado nestes experimentos, esta perda deve corresponder ao radical metil, uma

vez que nesta eliminação não há envolvimento de hidrogênios lábeis. Se este passo

de fragmentação envolvesse o grupamento NH, a perda deveria ser de 16 u.m.a. Já

a perda de 44 u.m.a. gerando o íon produto m/z 186 (não deuterado) e 192

(deuterado) pode se dar após descarboxilação dos íons m/z 230 e 236,

respectivamente.

Além dos mecanismos envolvendo a perda inicial do radical metil,

observaram-se vias em que houve eliminação neutra de água produzindo o íon

produto m/z 227 (Figura 23, íons produtos C e/ou D). Na molécula deuterada esta

perda foi de 19 u.m.a. indicando a presença de um átomo de deutério nesta

eliminação (Figura 23, íons produtos C e/ou D quando X=D). Provavelmente a

eliminação neutra de água ocorre em duas porções diferentes da molécula: (i) uma

envolvendo o grupamento OH do grupo aminoácido do C5 (Figura 23, íon produto C)

e (ii) uma que envolve o grupo OH do grupo aminoácido do C3 gerando um ceteno



97

(Figura 23, íon produto D). Ambos os íons produtos C e D podem perder outra

molécula de água gerando o íon produto E (Figura 23, m/z 209 quando X=H e m/z

213 quando X=D).

NX

NXXOXO

OCH3

H O

OX

NX

NX

O

CO

OX

H

X+

X+

NX

NX

CO2X

O

X+

OX

NX

NX

O

XOXO

CO

Molécula protonada (1)

C

A

E

D

NX

NXXOXO

O

O

O

X+X

- HXO

- HXO

N

NXXOXO

CO2X

OCH3

X+

Molécula protonada (2)

F

OX

N

NXXOXHO

CO2X

OX+

R

H

R R = H, CH3, CO2X

G

N

NXXOXO

OX+

R

OX

XO

M

N

NXXOXO

OX+

H

If R=CO2X

I

N

NX

OX+

OX

H

N

NXXOXO

OX+

H

XO

OX

K

N

NX

OX+

OH

J

NH

NXXOXO

CO2X

OX+

- CO2

B

NY

NXXOXO

OX+

L

N

NXXOXO

OX+

If R=CH3

OH

XOR

XOR

XO

H X

H X

H X

H X

H X H X

H XH H

H

H

H HH

X+

- CO2

- HXO

- CH3

HX

X

H

H Y HY

- CH3

- CO2

- HXO

- HXO

- CO2

- D2O - HXO

X = H or D

X = H or D

- HXO - HXO

- HXOor

- HXO

1 2345

6

Figura 23. Mecanismo proposto de fragmentação para as MAAs identificadas como palitina, chinorina, asterina e palitinol. A-M: principais íons produtos para as moléculas não marcadas (quando X=H) e para as moléculas marcadas (quando X=D). Y= H ou D dependendo da fragmentação inicial (ver detalhes no texto).

Fração F2

Os espectros MS2 da fração F2 estão mostrados na Figura 22 (c) e (d). O

composto deuterado e não deuterado mostraram picos-base em m/z 289 e 295,



98

respectivamente. A perda de 15 u.m.a. do íon precursor produzindo o íon produto F

(Figura 23) também sugere a eliminação de radical metil. O íon produto F, por sua

vez, pode perder 44 u.m.a. (CO2) gerando m/z 230 e 236 (Figura 23, íon produto G

onde X=H e X=D, respectivamente). Fragmentações de G podem dar origem ao íon

produto m/z 186 (X=H e Y=H) e 191 (X=D e Y=X), respectivamente pela perda da

cadeia lateral do C1 (Figura 23). As perdas neutras de água neste caso ocorrem

após a perda do radical metil. Essas perdas podem ocorrer a partir do grupo

hidroxila ligado na cadeia lateral (C1) ou do grupo hidroxila do C5. A eliminação de

19 u.m.a (HDO) está de acordo com os mecanismos propostos (Figura 23).

Fração F3

Como mostrado na Figura 22 (e) e (f) a fração F3 mostrou um pico-base m/z

303 (não deuterado) e 309 (deuterado). O perfil de fragmentação desta MAA seguiu

os mecanismos propostos para a palitina e asterina. Entretanto, a perda da cadeia

lateral do C1 é proveniente do íon [M+H-15]+ (Figura 23, íon produto J), enquanto na

asterina esta eliminação é derivada do íon [M+H-59]+. A descarboxilação deste

fragmento (J) resultaria no íon produto m/z 186 (não deuterado) e 191 (deuterado).

Os demais mecanismos de fragmentação são mostrados na Figura 23.

Fração F4

Os espectros MS2 desta fração mostram picos-base em m/z 347 para a

molécula não deuterada e m/z 354 no análogo deuterado (dados não apresentados).

Estes resultados estão condizentes com a estrutura da porphyra-334 que apresenta

seis hidrogênios lábeis. O perfil de fragmentação obtido para esta MAA foi

semelhante ao da chinorina que será discutido a seguir.



99

Fração F1

Os espectros MS2 da fração F1 confirmam a presença dos íons m/z 333 e m/z

340 na molécula não deuterada e deuterada, respectivamente (Figura 22 (g) e (h)).

Estes resultados, como no caso da porphyra-334, estão de acordo com a estrutura

da chinorina, que contém seis hidrogênios lábeis (1 u.m.a. é proveniente da carga do

átomo de deutério). A eliminação de 15 seguida de 44 u.m.a. também foi observada

para este composto, embora a abundância relativa dos íons [M+H-15]+ e [M+D-15]+

tenha sido bem menor quando comparada as demais MAAs analisadas (Figura 22).

Este dado também foi obtido para a porphyra-334 (dados não apresentados). Alguns

dados da literatura mostraram que muitas vezes não foi observado este fragmento

para estas MAAs. Isto sugere que, quanto maior o número de substituintes a

molécula apresentar (no grupo imino do C1), menor será a intensidade do pico

[M+H-15]+. O fragmento m/z 300 (não deuterada) ou m/z 306 (deuterada) pode ser

gerado a partir do íon produto F quando X=H e X=D, respectivamente, pela

eliminação neutra de água (Figura 23). O mesmo íon produto F pode sofrer duas

descarboxilações gerando M via íon produto G (Figura 23). Após a perda da cadeia

lateral de G o íon comum a todas as MAAs não marcadas m/z 186 (Figura 23, íon

produto B quando X=H e Y=H) pode ser observado. No análogo deuterado o íon foi

observado m/z 191 (Figura 23, B quando X=D e Y=H). Outros mecanismos

propostos de fragmentação (eliminação neutra de água) podem ser observados na

Figura 23 e estão de acordo como os dados experimentais obtidos.

Como esperado, em razão da semelhança nas suas estruturas, as MAAs até

agora mostradas geraram fragmentos característicos como os m/z 230 e 186. Além

disto, os íons m/z 191 (Tabela 8, íon produto B quando X=D e Y=H) para asterina,

palitinol e chinorina e m/z 192 (Tabela 8, íon produto B quando X=D e Y=D) para a



100

palitina nos análogos deuterados, correspondem ao mesmo íon m/z 186 (Tabela 8,

íon produto B quando X=H e Y=H) nos experimentos sem deuteração. Estes dados

confirmam os mecanismos propostos, pois na palitina deuterada a substituição do

hidrogênio do grupo imino no C1 por um átomo de deutério ocorre inicialmente,

elevando em 1 u.m.a. este íon quando comparado as demais MAAs deuteradas.

Fração F5

O espectro de massas por ESI obtido no intervalo de m/z 150-500 (full scan)

da fração F5 mostrou que esta fração separada por HPLC estava menos

contaminada que as demais (dados não apresentados). Os espectros MS2 da fração

F5 não deuterada e deuterada, respectivamente, estão mostrados na Figura 24.

Figura 24. A) espectro MS2 da fração F5 não deuterada e B) espectro MS2 do análogo deuterado.

Na Figura 25 os mecanismos de fragmentação propostos para a fração F5 e

seu análogo deuterado são apresentados.

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

%

0

100 1.02e8197.1

153.0152.0138.1

195.1

285.1

241.1

226.2

239.1

270.1

070509 PICO 5 DEUTERADO DAUGHTERS OF 290 20EV 1 (2.014) Sm (Mn, 1x0.60) Daughters of 290ES+ 5.95e7290.1

201.1

200.1156.0

231.2275.2

245.1

243.1

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

%

0

100 1.02e8197.1

153.0152.0138.1

195.1

285.1

241.1

226.2

239.1

270.1


201.1

200.1156.0

231.2275.2

245.1

243.1

A

B

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

%

0

100 1.02e8197.1

153.0152.0138.1

195.1

285.1

241.1

226.2

239.1

270.1


201.1

200.1156.0

231.2275.2

245.1

243.1

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

%

0

100 1.02e8197.1

153.0152.0138.1

195.1

285.1

241.1

226.2

239.1

270.1


201.1

200.1156.0

231.2275.2

245.1

243.1

A

B



101

m/z 285

H+

N

NHHOHO

CO2H

OCH3

N

NHHOHO

O

N

NHHOHO

O

Cm/z 270

m/z 226

- CO2

O

O

H

+

H+

- CH3•

H

m/z 290

D+

N

NDDODO

CO2D

OCH3

N

NDDODO

O

N

NDDODO

O

Cm/z 275

m/z 231

- CO2

O

O

D

+

D+

- CH3•

D

H HH

N

HOHO

OH+

HDH

N

DODO

OD+

D

N

DODO

OD+

Hm/z 197 m/z 200m/z 201

A B

ND NH

DHHH

ND

HH

- - -

Figura 25. Mecanismo proposto de fragmentação para a fração F5 identificada como paliteno e/ou usujireno (PM = 284,3 g.mol-1). A) Molécula não deuterada com m/z 285 e B) molécula deuterada com m/z 290.

Com estes dados foi proposto que esta fração corresponde ao(s) isômero(s)

paliteno e/ou usujireno. Os íons característicos m/z 230 e 186 observados nas

fragmentações das demais MAAs analisadas, não foram detectados para esta MAA.

Possivelmente, a quebra é dificultada pela presença da dupla ligação contida no

grupo R (C1) que torna a estrutura mais rígida. Na literatura também foi observada a

ausência destes fragmentos para o ácido palitênico (Figura 2), para o qual o

fragmento mais abundante, como no caso do paliteno, foi o íon m/z 197 (Whitehead

& Hedges, 2003).



102

O uso da espectrometria de massas, no caso da análise desta molécula, não

possibilitou diferenciar os isômeros trans e cis, pois os íons produtos gerados foram

idênticos e de mesma abundância nas análises por MS2 (Figura 33D). O espectro de

absorção no UV mostrou que este composto tem λmax em 360 nm . Estes dados

sugerem que a MAA presente em G. tenuistipitata é o paliteno e não usujireno (λmax

=357 nm). Além disto, dados da literatura mostraram a presença de paliteno e não

usujireno em macroalgas do gênero Gracilaria (Karsten et al., 1998b).

Para confirmar os dados obtidos por espectrometria de massas de baixa

resolução foram realizados alguns experimentos em espectrômetro de massas de

alta resolução (Q-TOF). Os resultados estão mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 – Dados de alta resolução para as moléculas não marcadas obtidos em Q-TOF. Condições experimentais estão descritas no item 3.6.

molécula protonada m/z experimental

m/z calculado erro (ppm) fórmula

Palitina 245,1133 245,1138 -2,0 C10H17N2O5

Chinorina 333,1306 333,1298 2,4 C13H21N2O8

Asterina 289,1403 289,1400 1,0 C12H21N2O6

Palitinol 303,1582 303,1556 8.6 C13H23N2O6

Porphyra-334 347,1458 347,1454 1,2 C14H23N2O8

Paliteno/Usujireno 285,1459 285,1451 2,8 C13H21N2O5

Com a confirmação das massas moleculares em alta resolução foi proposto

que as frações F1, F2, F3, F4 e F5 isoladas de G. tenuistipitata correspondem às

MAAs chinorina/palitina, asterina, palitinol, porphyra-334 e paliteno e/ou usujireno,

respectivamente.

A detecção dos íons produtos [M+H-15]+ e [M+H-59]+ relacionados a

eliminação do radical metil e subseqüente eliminação de CO2 foi observada para



103

todas as MAAs estudadas, mesmo que em menor intensidade nas dicarboxílicas

(chinorina e porphyra-334). O monitoramento destes fragmentos usando ferramentas

disponíveis no espectrômetro de massas, como monitoramento de reações múltiplas

(MRM) e perda neutra, podem facilitar a identificação de novas MAAs em extratos de

diversos organismos aquáticos. Embora o fragmento m/z 186 formado a partir da

perda subseqüente de 15 u.m.a., 44 u.m.a. e da cadeia lateral substituinte no grupo

imino do C1 não tenha sido onipresente, ele ainda pode ser usado para monitorar a

presença de MAAs em diferentes amostras. Entretanto, deve se levar em conta se a

cadeia lateral ligada ao C1 pode ser eliminada, como é o caso das MAAs paliteno e

ácido palitênico (Figura 2) que não apresentam este fragmento, pois a presença de

duplas ligações na cadeia lateral não permitem a perda desta parte da molécula.

Além disto, outros derivados de MAAs (Figura 2) nos quais a glicina no C3 é

substituída por outros aminoácidos (serina, metilalanina ou treonina) ou alguns

derivados sulfatados no C5 também não devem apresentar o íon m/z 186. No

entanto, a eliminação de 15 u.m.a. e 44 u.m.a. ainda podem ser monitoradas.

Como exemplo do emprego desta estratégia, identificamos uma nova MAA

presente em corais em colaboração com o Dr. Mario Carignan do Instituto Nacional

de Investigación y Dessarollo Pesquero (INIDEP) em Mar de Plata, Argentina. A

nova MAA foi isolada do coral Pocillopora eydouxi por este grupo (Carreto et al.,

2005) que nos acompanhou nos experimentos por MSn em Ion trap. Análises por LC-

MS mostraram um pico-base com m/z 289 e λmax igual a 320 nm. Os dados por MS2

obtidos para o composto deuterado e não deuterado estão apresentados na Figura

26. Para confirmação dos dados de baixa resolução, análises em Q-TOF

confirmaram a massa exata de 289,1395 (0,346 ppm).



104

Figura 26. Espectros de MS2 da nova MAA isolada de corais A) composto não deuterado e B) análogo deuterado.

Foi possível observar que a via radicalar, pela perda inicial de 15 u.m.a., não

foi favorecida para a MAA analisada (Figura 26A e 25B). Como no caso das di-

ácidas, chinorina e porphyra-334, esta nova MAA deve apresentar grupamentos que

direcionam a via de fragmentação para uma perda inicial de 44 u.m.a. como a via

mais abundante. Após o estudo das vias de fragmentações obtidas por espectros de

MS2 e MS3, os dados de alta resolução que confirmaram a fórmula molecular, e

tendo em vista que esta nova MAA seja a possível precursora da já identificada

palitina treonina-sulfato (Figura 2), foi proposto à estrutura apresentada na Figura 27

nomeada de palitina-treonina.

NH

NHHOHO

O

OHHO2C

Figura 27. Estrutura provável da nova MAA identicada como palitina-treonina.

109.0 133.9151.0

169.0

184.0 230.0

245.0

274.0

289.0

+MS2(289.0), 1.1min #92

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

113.0 126.1 156.1175.0

252.0

281.0

296.1

+MS2(296.2), 1.3min #62

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 m/z

A

B



105

4.1.1.2. Experimentos em FT-ICR

Em todas as MAAs estudadas, mesmo que em menor intensidade nas di-

carboxílicas (chinorina, porphyra-334 e palitina-treonina), foi observado uma perda

inicial de 15 u.m.a. proposto como perda radicalar do grupo metil. A perda deste

radical não é usual em espectrometria de massas com ionização por electrospray,

devido à baixa energia utilizada neste processo. Entretanto, este mesmo fragmento

[M+H-15]+ já foi observado em outro trabalho e aferido como sendo perda do grupo

metil (Whitehead & Hedges, 2003). Para entender melhor os mecanismos que

envolvem esta quebra radicalar, confirmar e expandir as vias de fragmentação

propostas, alguns estudos em espectrômetro do tipo FT-ICR associados a cálculos

teóricos foram realizados. Os cálculos teóricos foram realizados pelo doutorando

Ricardo Vessecchi, do grupo do Prof. Dr. Sérgio E. Galembeck (FFCLRP, USP).

As amostras foram preparadas como descrito no item 3.4.1. As análises por

HPLC analítico (método B, Tabela 5) das frações previamente reunidas mostraram

que as MAAs eluíram entre as frações 36-76 (Figura 28B a 27I). A ordem de eluição

da coluna Sephadex LH-20 é oposta àquela obtida em coluna C18 uma vez que a

primeira tem caráter polar. Portanto, as primeiras frações em que se observa a

presença de compostos com absorção entre 310 e 360 referem-se à fração

nomeada de B (Figura 28B), que provavelmente trata-se da MAA paliteno e/ou

usujireno. Algumas frações foram selecionadas, isoladas por HPLC semipreparativo

(método B, Tabela 5) e as MAAs palitina, asterina e palitinol (pico 1, 2 e 3,

respectivamente na Figura 28) foram usadas para as análises em alta resolução.

Estes experimentos foram qualitativos e por este motivo não foram considerados os

rendimentos referentes a cada fração.



106

Figura 28. Perfil cromatográfico das frações coletadas por Sephadex LH-20 contendo MAAs monitorado em 330 nm. A) frações 30-35; B) 36-39, pico 5 (TR=17min); C) 40-45, pico 5 (TR=17 min); D) 46-47, pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min), pico 4 (TR=9,6 min); E) 48-50, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min), pico 3 (TR=6,9 min); F) 51-54, igual fração E; G) 55-62, pico 1 (TR=3,7 min), pico 2 (TR=4,2 min); H) 63-65; e I) 66-76 igual fração G; J) 77-85.

Os espectros de MS2 e MS3 obtidos para o palitinol estão apresentados na

Figura 29.

Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

3

mA

U

0

1

2

3

SPD-M10Avp-329 nmfração 77-90fração 77-90

mA

U

0

2

4

mA

U

0

2

4


mA

U

0

20

40

mAU

0

20

40


mA

U

0

200

400

600

800

mAU

0

200

400

600

800


mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30SPD-M10Avp-329 nmFraçao_51-54Fraçao_51-54

Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


mA

U

0

20

40

60

mAU

0

20

40

60SPD-M10Avp-329 nmfração 46-47fração 46-47

0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

0

1

2


mA

U

0

1

2


mA

U

0

2

4

6

8

mAU

0

2

4

6

8


A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

3

mA

U

0

1

2

3


mA

U

0

2

4

mA

U

0

2

4


mA

U

0

20

40

mAU

0

20

40


mA

U

0

200

400

600

800

mAU

0

200

400

600

800


mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20


Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


mA

U

0

20

40

60

mAU

0

20

40


0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

0

1

2


mA

U

0

1

2


mA

U

0

2

4

6

8

mAU

0

2

4

6

8


A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

5

5

4

3

3

2

2

1

1

3

1

2

1

2

2

1

2

Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

3

mA

U

0

1

2

3


mA

U

0

2

4

mA

U

0

2

4


mA

U

0

20

40

mAU

0

20

40


mA

U

0

200

400

600

800

mAU

0

200

400

600

800


mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20


Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


mA

U

0

20

40

60

mAU

0

20

40


0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

0

1

2


mA

U

0

1

2


mA

U

0

2

4

6

8

mAU

0

2

4

6

8


A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

3

mA

U

0

1

2

3


mA

U

0

2

4

mA

U

0

2

4


mA

U

0

20

40

mAU

0

20

40


mA

U

0

200

400

600

800

mAU

0

200

400

600

800


mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20


Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


Minutes0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

10

20

30

mAU

0

10

20

30


mA

U

0

20

40

60

mAU

0

20

40


0 5 10 15 20 25 30

mA

U

0

1

2

0

1

2


mA

U

0

1

2


mA

U

0

2

4

6

8

mAU

0

2

4

6

8


A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

5

5

4

3

3

2

2

1

1

3

1

2

1

2

2

1

2



107

Figura 29. Espectros MS2 e MS3 de alta resolução obtidos para o palitinol em FT-ICR-MSn. A) Espectro MS2 de m/z 303; B) espectro MS3 de m/z 288 proveniente de (A); C) espectro MS3 de m/z 244 proveniente de (A); D) espectro MS3 de m/z 230 proveniente de (A); e E) espectro MS3 de m/z 186 proveniente de (A).

Os resultados destes experimentos confirmaram os dados obtidos em baixa

resolução, mostrando que a perda inicial de 15 u.m.a. corresponde ao grupo metil

ligado ao oxigênio do C2 e que está relacionada ao enfraquecimento da ligação C-O

do C2. Os mecanismos de fragmentação para as três MAAs analisadas, bem como

150 200 250 300 m/z0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

intensity

303.15505

288.13151

244.14174

235.10770226.13122150.07870 197.09209

186.09989

137.07097230.08985

150 200 250 m/z 0

5.0e+05

1.0e+06

1.5e+06

2.0e+06

2.5e+06

intensity

137.07094

150.07870

186.09988

197.09208

230.08973

244.14177

288.13158

150 200 250 m/z0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

intensity

244.14176

226.13120197.09215

186.09986

150.07878

137.07093

110 130 150 170 190 210 230 m/z 0

2.0e+05

4.0e+05

6.0e+05

8.0e+05

1.0e+06

1.2e+06

1.4e+06

intensity

230.08971

186.09990

150.07861

137.07094

130 150 170 190 m/z0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

intensity

186.09988

168.08935

155.08148151.08662

150.07876

138.05478

137.07094

(a)

(b) (c)

(d) (e)

A

B C

D E

150 200 250 300 m/z0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

intensity

303.15505

288.13151

244.14174

235.10770226.13122150.07870 197.09209

186.09989

137.07097230.08985

150 200 250 m/z 0

5.0e+05

1.0e+06

1.5e+06

2.0e+06

2.5e+06

intensity

137.07094

150.07870

186.09988

197.09208

230.08973

244.14177

288.13158

150 200 250 m/z0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

intensity

244.14176

226.13120197.09215

186.09986

150.07878

137.07093

110 130 150 170 190 210 230 m/z 0

2.0e+05

4.0e+05

6.0e+05

8.0e+05

1.0e+06

1.2e+06

1.4e+06

intensity

230.08971

186.09990

150.07861

137.07094

130 150 170 190 m/z0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

intensity

186.09988

168.08935

155.08148151.08662

150.07876

138.05478

137.07094

(a)

(b) (c)

(d) (e)

A

B C

D E



108

os dados de alta resolução de MS2 e MS3 do palitinol, estão apresentados na Figura

30 e Tabela 10, respectivamente. Os dados de alta resolução (Tabela 10) confirmam

os mecanismos de fragmentação propostos. A parte contendo os cálculos teóricos é

um dos temas da tese de doutorado do aluno Ricardo Vessecchi (FFCLRP, USP).

NH

NHHOHO

O

m/z 186

NH

NHHOHO

CO2H

OCH3

N

NHHOHO

OH

m/z 288

NH

NHHOHO

O

CO

O

H

NH

NH

O

- H2O

H

m/z 168

N

NHHOHO

OOH

m/z 244

N

NH

OOH

m/z 226

- H2O

H

OHOH

m/z 230

N

NHHOHO

CO2H

OOHCH3

- CH3•

A

palitinol (2)m/z 303

palitina (1)m/z 245

- CH3•

O

OH

- CO2B

N

NHHOHO

CO2H

OOHCH3

asterina (3)m/z 289

- CH3•

N

NHHOHO

OH

m/z 274O

OH

N

NHHOHO

OOH

m/z 230H

N

NH

OOH

m/z 212

- H2O

OH

HOHO

OHH

H

A

H

B

AH

H

perda de

H

H

H

AOH

H

HH

B

A

- CO2 - CO2B

H

A

H H

H H H

perda de

Figura 30. Mecanismo de fragmentação proposto para três MAAs analisadas por alta resolução mostrando a quebra homolítica que gera a perda inicial do radical metil. A ordem da rota A pode mudar dependendo da energia utilizada.

Tabela 10 – Dados de alta resolução de MS2 e MS3 da fragmentação do palitinol obtido por ESI-FTICR-MSn. As fórmulas moleculares, massas teóricas e massas experimentais foram listadas para os íons produtos majoritários.

Massas experimentais (erro em ppm) Íon Fórmula

Molecular Massas teóricas MS2 MS3 288 MS3 244 MS3 230 MS3 186

[M+H]+ C13H23N2O6+ 303,15506 303,15505 (-0,03)

303 - CH3• C12H20N2O6

•+ 288,13159 288,13151 (-0,28) 288,13158 (-0,03)

288 - CO2 C11H20N2O4•+ 244,14176 244,14174 (-0,08) 244,14177 (+0,04) 244,14176 (0)

303 - CO3H8 C12H15N2O3+ 235,10772 235,10770 (-0,09) - -

288 - C3H6O C9H14N2O5٠+ 230,08972 230,08985 (+0,56) 230,08973 (+0,04) - 230,08971 (-0,04)

244 - H2O C11H18N2O3•+ 226,13119 226,13122 (+0,13) - 226,13120 (+0,04) -

303 - C4H10O3 C9H13N2O3+ 197,09207 197,09209 (+0,10) 197,09208 (+0,05) 197,09215 (+0,41) -

230 - CO2 C8H14N2O3•+ 186,09989 186,09989 (0) 186,09988 (-0,05) 186,09986 (-0,16) 186,09990 (+0,05) 186,09988 (-0,05)

186 - H2O C8H12N2O2•+ 168,08933 - - - - 168,08935 (+0,12)

186 - CH3O• C7H11N2O2•+ 155,08150 - - - - 155,08148 (-0,13)

168 - OH• C8H11N2O+ 151,08659 - 151,08661 (+0,13) - - 151,08662 (+0,20)

168 - H2O C8H10N2O•+ 150,07876 150,07870 (-0,40) 150,07876 (0) 150,07878 (+0,13) 150,07861 (-1,00) 150,07876 (0)

155 - NH3 C7H8NO2•+ 138,05495 - - - - 138,05478 (-1,23)

155 - H2O C7H9N2O+ 137,07094 137,07097 (+0,22) 137,07094 (0) 137,07093 (-0,07) 137,07094 (0) 137,07094 (0)



110

4.1.1.3. Experimentos em Ion Trap

Nestes experimentos foi utilizado o extrato GT-1 obtido segundo etapas

descritas no item 3.4.1 de materiais e métodos. As análises por LC-MS foram feitas

segundo o método E (Tabela 5) empregando duas colunas acopladas de caráter

menos hidrofóbico que as colunas C18, na tentativa de se obter uma separação

mais eficiente entre as MAAs mais polares, como a chinorina e palitina. Diversos

gradientes foram testados utilizando diferentes soluções e solventes como fase

móvel. A melhor separação alcançada foi utilizando ácido fórmico (0,2%) ao invés de

ácido acético (0,2%) ou TFA (0,2%) (métodos A, B, C; Tabela 5). O perfil

cromatográfico obtido nestas condições está apresentado na Figura 31.

Figura 31. A: Perfil cromatográfico das MAAs presentes no extrato GT-1 monitorado em 330 nm. λmax(nm) – pico 1 – chinorina: 6,9 / 333; pico 2 –: palitina: 7,8 / 320; pico 3 – asterina: 8,8 / 330; pico 4 – porphyra-334: 9,2 / 334; pico 5 – palitinol: 11,4 / 330; pico 6 – paliteno e/ou usujireno: 25,9 / 360. B: Detalhe da separação entre 6 e 13 min.

Utilizando a ferramenta de monitoramento de reações múltiplas (MRM)

descrita no item 1.2.8.2, alguns íons na faixa de massa de interesse foram

analisados. Os espectros de MS2 obtidos foram comparados com o perfil de

fragmentação propostos anteriormente utilizando triplo quadrupolo e FT-ICR e com

0 5 10 15 20 25 30

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

Abs

orvâ

ncia

(ua)

Tempo (min)

12

3

4

5

6

6 8 10 12

Tempo (min)

1 2

3

45

A B

0 5 10 15 20 25 30

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

Abs

orvâ

ncia

(ua)

Tempo (min)

12

3

4

5

6

0 5 10 15 20 25 30

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

Abs

orvâ

ncia

(ua)

Tempo (min)

12

3

4

5

6

6 8 10 12

Tempo (min)

1 2

3

45

A B



111

estes resultados foi possível identificar as mesmas MAAs diretamente no extrato

bruto de G. tenuistipitata. Os principais íons produtos obtidos das análises por MS2

em triplo quadruplo, Ion trap e FT-ICR do extrato de G. tenuistitipitata estão

apresentados na Tabela 11.

Tabela 11 – Íon precursor e principais fragmentos das MAAs identificadas em G. tenuistipitata utilizando três espectrômetros diferentes.

Composto [M+H]+ Triplo Quadrupolo m/z

Ion Trap m/z

FT-ICR m/z

Palitina 245 230, 227, 186, 209 230, 209, 186 230, 227, 215, 209, 197, 186, 150, 137

Asterina 289 274, 230, 212, 186 274, 230,186 274, 230, 226, 197, 186, 137

Palitinol 303 288, 244, 230, 226, 186

288, 244, 230, 186 288, 244, 235, 230, 226, 197, 186, 150, 137

Chinorina 333 318, 274, 230, 212, 186

318, 274, 230, 186 Não foi obtido espectro

Porphyra-334 347 332, 303, 288, 244, 230, 227, 186

332, 303, 288, 244, 227, 186

332, 303, 286

Paliteno/ Usujireno 285 270, 241, 226, 197 270, 241, 226, 197 Não foi obtido espectro

Após a confirmação da identidade de cada pico por espectrometria de

massas, a resolução (Rs) entre dois picos adjacentes foi calculada segundo a

Equação 6:

( )12

122LLttRs rr

+−

= Equação 6

onde tr1 e tr2 são os tempos de retenção de dois picos adjacentes e L2 e L1 são as

larguras dos respectivos picos medidas na base e nas mesmas unidades do tempo

de retenção.

Os valores calculados de Rs para o método E (Tabela 5), bem como os



112

conteúdos de cada MAA presente no extrato de G. tenuistipitata estão apresentados

na Tabela 12. A quantificação das MAAs foi realizada pelo Dr. Mario Carignan

utilizando o método desenvolvido por Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).

Não foi possível quantificar paliteno e/ou usujireno pela baixa concentração

encontrada no extrato. As concentrações de chinorina e porphyra-334 também foram

calculadas usando as curvas de calibração obtidas a partir do isolamento das duas

MAAs descrito no item 4.2. Os valores foram muito próximos aos obtidos pelo

método de Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).

Tabela 12 – Identificação dos picos separados pelo método E (Tabela 5), valores calculados de resolução (Rs) entre dois picos adjacentes e de concentração (ng.mg extrato-1).

Pico Composto TR (min)

Rs λmax (nm)

ng.mg extrato-1*

[M+H]+

1 Chinorina 6,9 1,9 (1/2) 332 26,4 333

2 Palitina 7,7 1,8 (2/3) 319 45,4 245

3 Asterina 8,5 0,9 (3/4) 330 72,8 289

4 Porphyra-334 9,2 4,6 (4/5) 333 27,8 347

5 Palitinol 11,4 332 19,7 303

6 Paliteno/Usujireno 25,8 360 - 285 *A quantificação das MAAs foi realizada pelo Dr. Mario Carignan utilizando o método desenvolvido por Carreto e colaboradores (Carreto et al., 2005).

Valores altos de resolução significam que os compostos estão bem separados

sendo que valores acima de 1,5 indicam que as duas substâncias possuem uma

separação até a linha base (Ciola, 1998). Como pode ser observado, a resolução

entre os picos 3 e 4 foi menor que 1,5, no entanto, o emprego deste gradiente

mostrou a melhor resolução entre todos testados. As MAAs mais polares, chinorina

e palitina, que coeluíam no método com ácido acético e MeOH como fase móvel e

coluna C18 como fase estacionária (método B, Tabela 5) foram separadas entre si

(picos 1 e 2). Gradientes contendo TFA como fase móvel e coluna polar como



113

estacionária, também não se mostraram satisfatórios, pois porphyra-334 e palitina

coeluíam (dados não apresentados). A substituição do TFA por ácido fórmico, além

de melhorar a resolução de alguns picos, oferece a vantagem de trabalho em modo

negativo no espectrômetro de massas, pois soluções de TFA suprimem a varredura

espectral dos íons em modo negativo.

4.1.2. Gracilaria domingensis, Gracilaria birdiae e Prorocentrum minimum

Os extratos de G. domingensis e G. birdiae preparados como descrito no item

3.4.2 foram analisados por HPLC segundo o método D (Tabela 5). Os rendimentos

foram calculados utilizando o mesmo procedimento que para os extratos obtidos de

G. tenuistipitata. Não houve variação significativa na extração das MAAs mais

polares entre os métodos. Em geral a extração mais eficiente foi aquela realizada

com MeOH:H2O (1:1, v/v) que extraiu cerca de 1,5 vezes mais MAAs, enquanto que

a extração com EtOH:H2O (1:1, v/v) foi a menos eficiente. Uma vez que os ensaios

com estas macroalgas brasileiras foram realizados no intuito de avaliar o potencial

de aplicabilidade dos extratos em fotoprotetores comerciais, a extração em larga

escala foi feita utilizando a mistura EtOH:H2O (1:4,v/v) ao invés de MeOH:H2O (1:1,

v/v). A substituição de solventes é vantajosa, pois o etanol é menos tóxico, menos

agressivo ao meio ambiente e de custo mais baixo quando comparado ao MeOH.

Os experimentos por LC-MS em Ion Trap do extrato GD-1 e GB seguiram os

parâmetro descritos no método D (Tabela 5). O extrato bruto GT-1 obtido de G.

tenuistipitata, o extrato de P. minimum e a matéria-prima Helioguard 365® (extrato de

Porphyra umbilicalis) também foram analisados nestas condições. Os perfis

cromatográficos com detecção no UV em 330 nm dos extratos e os espectros no UV

de cada pico estão apresentados na Figura 32.



114

Os extratos obtidos de G. domingensis e G. birdiae (GD-1 e GB,

respectivamente) apresentaram o mesmo perfil cromatográfico utilizando detecção

por UV (Figura 32). Como ambas as espécies são do gênero Gracilaria utilizamos a

ferramenta MRM para a extração das MAAs que já haviam sido identificadas

anteriormente em G. tenuistipitata. Os dados de MS2 confirmaram a presença de

chinorina (pico 1), palitina (pico 2), porphyra-334 (pico 4), asterina (pico 3), palitinol e

paliteno e/ou usujireno (pico 11 e/ou 12), sendo estes três últimos bem pouco

intensos (dados não apresentados). As MAAs identificadas nestas macroalgas estão

apresentadas na Tabela 13. A quantificação das MAAs presentes em G.

domingensis foi realizada pelo método de Carreto e colaboradores (Carreto et al.,

2005). Os valores encontrados foram: chinorina (7,2 µg.mg extrato-1), palitina (1,9

µg.mg extrato-1) e porphyra-334 (20 µg.mg extrato-1).

Já os dinoflagelados P. minimum isolados de Lisboa e de Kattegat mostraram

um perfil bastante complexo de MAAs (Figura 32). Outros picos estavam presentes

além dos já identificados nas espécies de Gracilaria anteriormente analisadas.

Análises em full scan mostraram a presença de íons m/z 246, 329, 299 e 560 além

dos íons m/z 245, 285, 303, 333 e 347 (dados não apresentados). Utilizando a

ferramenta MRM, os íons mais abundantes foram extraídos e os espectros de MS2

obtidos estão apresentados nas Figura 33 e Figura 34.



115

Figura 32. Perfil cromatográfico em 330 nm dos extratos de G. tenuistipitata, G. domingensis, G. birdiae, P. minimum e da matéria-prima Helioguard 365® e espectros de absorção no UV. TR (min): pico 1: 8,1; pico 2: 9,3; pico 3: 10,6; pico 4: 10,9; pico 5: 12,1; pico 6: 14,1; pico 7: 15,0; pico 8: 17,5; pico 9: 19,7; pico 10: 21,1; pico 11: 24,4; pico 12: 24,5; pico 13: 25,6. O espectro no UV do pico 10 (não identificado) não foi apresentado (λmax= 325 nm).

240 260 280 300 320 340 360 380 400 420-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

333 nmPico 1

Abs

orvâ

ncia

(ua)

comprimento de onda (nm) 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

320 nmPico 2

Abs

orvâ

ncia

(ua)


-3000

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

21000

24000

27000

330 nmPico 3

Abs

orvâ

ncia

(ua)


-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

333 nmPico 4

Abs

orvâ

ncia

(ua)

comprimento de onda (nm)

240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

0

3000

6000

9000

12000

15000

18000

309 nmPico 5

Abs

orvâ

ncia

(ua)


240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

330 nmPico 6

Abs

orvâ

ncia

(ua)


240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

-1500

0

1500

3000

4500

6000

335 nmPico 7

Abs

orvâ

ncia

(ua)


0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

331 nmPico 8

Abs

orvâ

ncia

(ua)


240 260 280 300 320 340 360 380 400 420-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

318 nmPico 9

Abs

orvâ

ncia

(ua)

comprimento de onda (nm)240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

0

10000

20000

30000

40000

50000

360 nmPico 11

Abs

orvâ

ncia

(ua)

comprimento de onda (nm)240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

0

10000

20000

30000

40000

50000

357 nmPico 12

Abs

orvâ

ncia

(ua)


-100000

100002000030000400005000060000700008000090000

100000110000120000130000140000150000

357 nmPico 13

Abs

orvâ

ncia

(ua)


0 6 12 18 24 30

Helioguard 365 P. minimum (Liss) G.birdiae G.domingenses G.tenuistipitata

Tempo (minutos)

106

1

2

3

5 7

8

11 12

4

9

13

G. tenuistipitata

G.birdiaeG.domingenses

P. minimumHelioguard 365®

0 6 12 18 24 30

Helioguard 365 P. minimum (Liss) G.birdiae G.domingenses G.tenuistipitata

Tempo (minutos)

106

1

2

3

5 7

8

11 12

4

9

13

G. tenuistipitata

G.birdiaeG.domingenses

P. minimumHelioguard 365®



116

Figura 33. Espectros MS2 obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 333 (TR= 8,2 min); B: m/z 245 (TR= 9,4 min); C: m/z 347 (TR= 11,1 min) e D: m/z 285 (TR= 24,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada.

118 137 151 168

186

197

212

230

241

255

265

274

287

303

318

333

+MS2(333), 8.2-8.8min #(703-748)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10Intens.

151

186

197

209

230

245

+MS2(245), 9.4-10.0min #(804-858)

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

134146 200209 227

244

288

303

347

+MS2(347), 10.9-11.5min #(929-983)

0

1000

2000

3000

4000

Intens.

197

226

241

270

285

+MS2(285), 24.7-25.3min #(2112-2166)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

A

B

C

D

118 137 151 168

186

197

212

230

241

255

265

274

287

303

318

333

+MS2(333), 8.2-8.8min #(703-748)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10Intens.

151

186

197

209

230

245

+MS2(245), 9.4-10.0min #(804-858)

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

134146 200209 227

244

288

303

347

+MS2(347), 10.9-11.5min #(929-983)

0

1000

2000

3000

4000

Intens.

197

226

241

270

285

+MS2(285), 24.7-25.3min #(2112-2166)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

A

B

C

D



117

Figura 34. Espectros MS2 obtidos das análises por LC-MS de P. minimum. A: m/z 246 (TR= 12,5 min); B: m/z 329 (TR= 15,2 min); C: m/z 347 (TR= 17,8 min), D: m/z 303 (TR= 21,7 min) e E: m/z 299 (TR= 25,9 min) presentes em P. minimum. Os losangos azuis indicam a molécula protonada.

A extração dos íons m/z 333, 347, 245, 303 e 285 identificou diversos picos

como possíveis MAAs, haja visto a grande possibilidade de isóbaros. No entanto, a

comparação do perfil de fragmentação com os obtido anteriormente para a G.

tenuistipitata em triplo quadrupolo e FT-ICR e alguns descritos na literatura

124136

146168 182

200

210 228

+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.04x10

Intens.

95 138 159182

197

220

235 270

283

296

314

329

+MS2(329), 15.2min #1305

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10Intens.

152 193 208229

244

257 269

288

296

317

332

347

+MS2(347), 17.8min #1514

0

2

4

6

85x10

Intens.

229

244

257 270

288

303

+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

211 225

255

263

284

299

+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)

0

2

4

6

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

A

B

C

D

E

124136

146168 182

200

210 228

+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.04x10

Intens.

95 138 159182

197

220

235 270

283

296

314

329

+MS2(329), 15.2min #1305

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10Intens.

152 193 208229

244

257 269

288

296

317

332

347

+MS2(347), 17.8min #1514

0

2

4

6

85x10

Intens.

229

244

257 270

288

303

+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

211 225

255

263

284

299

+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)

0

2

4

6

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

124136

146168 182

200

210 228

+MS2(246), 12.2-13.0min #(1043-1115)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.04x10

Intens.

95 138 159182

197

220

235 270

283

296

314

329

+MS2(329), 15.2min #1305

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10Intens.

152 193 208229

244

257 269

288

296

317

332

347

+MS2(347), 17.8min #1514

0

2

4

6

85x10

Intens.

229

244

257 270

288

303

+MS2(303), 21.5-22.2min #(1832-1895)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5x10Intens.

211 225

255

263

284

299

+MS2(299), 25.8-26.5min #(2203-2266)

0

2

4

6

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

A

B

C

D

E



118

confirmou a presença das MAAs chinorina, palitina, porphyra-334, paliteno e

usujireno. (Figura 33, Tabela 13) (Whitehead & Hedges, 2003). Um isóbaro do íon

m/z 347, bastante intenso e bem menos polar que a porphyra-334, em 17,9 min foi

detectado e provavelmente trata-se da MAA metil-éster chinorina (M-333) (Figura

34C). A identidade deste composto foi confirmada por meio de hidrólise controlada

com ácido clorídrico 0,1 M a 50 °C por 10 min que nestas condições produz

chinorina (Carreto et al., 2001). O íon com m/z 560 em 19,7 min também foi

identificado como uma provável MAA, embora a relação m/z seja alta (Tabela 13).

Carreto e colaboradores mostraram que dinoflagelados podem conter MAAs

complexas, resultantes da combinação de duas ou mais estruturas (Carreto et al.,

2001). Estes autores identificaram em dinoflagelados do gênero Alexandrium uma

estrutura que denominaram de M-320 de com m/z 560 e, embora esta molécula

ainda não tenha sido caracterizada quimicamente, sugeriram como sendo a

combinação de micosporina-glicina e chinorina menos uma molécula de água

(Carreto et al., 2001). O espectro de absorção no UV e a polaridade deste composto

são condizentes com esta proposição (Carreto et al., 2006). O íon m/z 303, isóbaro

do palitinol, identificado em 21,2 min também apresentou fragmentação

característica de uma MAA com λmax em 325 nm. Na literatura outras duas MAAs

apresentam este peso molecular: micosporina-2-glicina e micosporina-metilamino-

treonina (Figura 2, Tabela 3). Pela baixa polaridade relativa deste composto em

coluna de fase reversa, sugere-se que esta MAA seja a metil-amino-treonina

(Carreto et al., 2006). O íon com m/z 299 em 25,9 min possivelmente trata-se de

uma nova MAA, pois na literatura não há relatos sobre MAAs com este peso

molecular. Os perfis de fragmentação obtidos por MSn e os espectros de absorção

no UV sugerem que este composto possa ser uma MAA. Micosporina-glicina foi



119

identificada pelo comprimento de onda máximo (310 nm), pela polaridade relativa

em colunas de fase reversa e pela massa da molécula protonada m/z 246.

Experimentos de MSn foram conduzidos e os perfis de fragmentação estão sendo

discutidos para a proposição da estrutura química destes três últimos íons (m/z 303,

299 e 246). O perfil de fragmentação do íon m/z 329 foi comparado com o da

literatura e identificado como ácido palitênico (Whitehead & Hedges, 2003). O

mesmo extrato foi analisado pelo método publicado por Carreto e colaboradores que

confirmou a presença das MAAs identificadas por espectrometria de massas

(Carreto et al., 2006). Na Tabela 13 estão apresentadas as MAAs identificadas pelo

método D (Tabela 5) e os organismos em que elas estão presentes.

Tabela 13 - MAAs identificadas por LC-MS2 em diferentes algas: Gt: G. tenuistipitata, Gd: G. domingensis, Gb: G. birdiae, Pu: Porphyra umbilicalis e Pm: Prorocentrum minimum Pico Composto TR

(min) λmax (nm)

[M+H]+ Principais fragmentos

Organismos

1 Chinorina 8,1 332 333 186, 230, 274, 303 318

Gt, Gd, Gb, Pm, Pu

2 Palitina 9,3 319 245 186, 197, 209, 230 Gt, Gd, Gb, Pm, Pu

3 Asterina 10,6 333 289 186, 209, 230, 274 Gt, Gd, Gb

4 Porphyra-334 10,9 333 347 186, 227, 288, 303, 332

Gt, Gd, Gb, Pm, Pu

5 Micosporina-glicina

12,1 309 246 146, 168, 182, 200, 210, 228

Pm

6 Palitinol 14,1 331 303 186, 230, 244, 288 Gt, Gd, Gb

7 Ácido palitênico

15,0 335 329 197, 235, 270, 283, 296, 314

Pm

8 Metil-éster chinorina

17,5 331 347 229, 244, 270, 288, 317, 332

Pm

9 M-320 19,7 318 560 210, 333, 460, 474, 492, 524, 542

Pm

10 Não identificado

21,2 325 303 229, 244, 270, 288 Pm

11 paliteno 24,4 360* 285 270, 241, 226, 197 Pm, Gt**, Gd**, Gb**

12 usujireno 24,5 357* 285 270, 241, 226, 197 Pm, Gt**, Gd**, Gb**

13 Não identificado

25,6 357 299 225, 255, 263, 284 Pm

*a identidade destes dois isômeros foi aferida pelo λmax uma vez que o perfil de fragmentação foi o mesmo. **não foi possível identificar se apenas um dos isômeros está presente ou ambos.



120

4.2. Isolamento de chinorina e porphyra-334

O extrato Helioguard 365 obtido segundo o item 3.4.1 (Isolamento de

chinorina e porphyra-334) foi utilizado para o isolamento das MAAs chinorina e

porphyra-334. O perfil cromatográfico e os espectros de absorção no UV das

análises por HPLC em coluna semipreparativa empregando as condições descritas

no método C (Tabela 5), estão apresentados na Figura 35.

0 5 10 15 20

0

50000

100000

150000

200000 3

2

1

Abso

rvân

cia

(ua)

Tempo (minutos)

240 260 280 300 320 340 360 380 400-20000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

332 nmPico 1

Abs

orvâ

ncia

(ua)


240 260 280 300 320 340 360 380 400

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

320 nmPico 2

Abs

orvâ

ncia

(ua)


240 260 280 300 320 340 360 380 400

0

50000

100000

150000

200000333 nm

Pico 3

Abso

rvân

cia

(ua)


Figura 35. Perfil cromatográfico do extrato obtido a partir do produto Helioguard 365 e espectros no UV. TR (min): pico 1- chinorina: 5,8; pico 2 - palitina: 6,0 e pico 3 – porphyra-334: 13,1. Detalhes das condições experimentais ver itens 3.4.1 e 3.5 ( método C, Tabela 5).

Os resultados mostraram a presença de dois picos abundantes com λmax em

332 e 333 nm e um terceiro, em menor concentração, com λmax em 320 nm (Figura

35). Os picos isolados foram analisados por espectrometria de massas (Ion Trap) e

os perfis de fragmentação obtidos por ESI no modo positivo comparados aos obtidos



121

anteriormente. Os picos 1, 2 e 3 foram identificados como chinorina, palitina e

porphyra-334, respectivamente. As amostras foram também analisadas por

ionização por nanospray (nanoESI) no modo negativo segundo as condições

descritas no item 3.6 de materiais e métodos. Os espectros de MS2 bem como os

mecanismos de fragmentação propostos para chinorina e porphyra-334 estão

apresentados na Figura 36 e Figura 37, respectivamente.

Figura 36. Espectros de MS2 por nanospray no modo negativo em analisador Q-TOF das MAAs A) chinorina (m/z 332) e B) Porphyra-334 (m/z 346).

331.1911

313.1943

287.2136

269.2010

257.2004

225.2054

211.1881

181.1730193.1750

345.2250

327.2138

301.2313

283.2179

257.2146

225.2064

239.1912

181.1736

207.1926195.1911

243.2184

A

B

331.1911

313.1943

287.2136

269.2010

257.2004

225.2054

211.1881

181.1730193.1750

345.2250

327.2138

301.2313

283.2179

257.2146

225.2064

239.1912

181.1736

207.1926195.1911

243.2184

A

B



122

As análises no modo negativo (Figura 36) mostraram que não houve

eliminação radicalar de 15 u.m.a. Considerando que esta quebra não é dependente

do sítio de protonação no modo positivo, outra força deve direcionar este tipo de

fragmentação no modo negativo. Os resultados sugerem que o grupo carboxílico

deve perder o próton resultando num aumento da densidade eletrônica que,

entretanto é estabilizada por ressonância. As fragmentações em ambas as

moléculas iniciam com uma perda neutra de CO2 seguida de eliminações de H2O ou

CO2 ou de uma perda neutra de H2O seguida de CO2, respectivamente (Figura 37).

Após as eliminações neutras de H2O e CO2 das cadeias laterais, as cargas

negativas nos íons resultantes devem estar localizadas nas posições mais ácidas

das moléculas. Tendo em vista esta observação, espera-se que as cargas negativas

estejam situadas nos grupos alcoxi sendo que estas duas possibilidades de

localização devem gerar íon produtos diferentes: (i) os íons m/z 225 e 243 (quando

R=H) e m/z 239 e 257 (quando R=CH3) podem perder metanol e gerar m/z 193 e

211 (quando R=H), e m/z 207 e 225 (quando R=CH3), respectivamente e (ii) m/z 181

para ambas as estruturas se a carga estiver localizada no oxigênio vizinho (Figura

37).



123

N

NHHOHO

OCH3

C

O

OH

HO

O O

H

N

NHHOHO

OCH3R

CHO

O O

H

- CO2

- H2O

N

NHHOHO

OCH3R

C

O

OH

O O

N

NHHOHO

OCH3

CO O

- H2O

- CO2

N

NHOO

OCH3R

CHO

O OH

N

NHO

HO

OCH3

- CO2

N

NHOO

OCH3

CO O

H

- CO2

N

NHOHO

OCH3- H2O

OH

RH

H H

N

NHO

OCH3R

HOH

N

NHO

OCH3

- CH3OH

ou

H

N

NHHO

OCH3

C

O

OH

HO

O O

H

- CO2

N

NHHO

OCH3

CHO

O O

HN

NHO

OCH3

CHO

O OH

R

N

NHO

OCH3

H

CHO

O OH

m/z 181

R

R= H m/z 331 R= CH3 m/z 345

R

R R

H H

R

R

- H2O

R

CH3

-

R= H m/z 313 R= CH3 m/z 327

R= H m/z 313 R= CH3 m/z 327

R= H m/z 287 R= CH3 m/z 301

R= H m/z 287 R= CH3 m/z 301

R= H m/z 269 R= CH3 m/z 283

R= H m/z 269 R= CH3 m/z 283

R= H m/z 243 R= CH3 m/z 257

R= H m/z 225 R= CH3 m/z 239

R= H m/z 269 R= CH3 m/z 283

R= H m/z 269 R= CH3 m/z 283

R= H m/z 211 R= CH3 m/z 225

R= H m/z 193 R= CH3 m/z 207

R= H m/z 88 R= CH3 m/z 102

Figura 37. Mecanismo de fragmentação proposto para a MAAs di-ácidas chinorina (m/z 332) e porphyra-334 (m/z 346).

A técnica de RMN de hidrogênio (RMN de 1H) foi utilizada como ferramenta

complementar na identificação das MAAs isoladas. O solvente utilizado nas análises

foi água deuterada e, portanto grupamentos -NH, -OH, e -COOH não são verificados



124

devido à troca rápida com deutério. Analisando o espectro de RMN de 1H foi

possível identificar alguns sinais abundantes característicos de grupamentos

presentes em chinorina e porphyra-334 (Figura 38). Os dados obtidos foram

similares àqueles encontrados na literatura (Klisch et al., 2007). Os deslocamentos

químicos possíveis de serem identificados dentro dos espectros estão descritos

abaixo onde s=singleto e d=dubleto e J=constante de acoplamento: RMN de 1 H (500

MHz; δ em ppm, D2O): δ 3,71 (s, Me(11)); 3,59 (s, H-C(12)) e para a porphyra-334

(R=CH3, Figura 38), 1,27 (d, J= 6,4 hz; Me(1)).

N

NHHOHO

CO2H

OOH

R

CO2H

R=H chinorinaR=CH3 porphyra-334

7

1 2 3

4

56

89

10 1112

1314

Figura 38. Estruturas analisadas por RMN 1H. R=H, chinorina e R=CH3, porphyra-334.

As amostras estavam muito diluídas e a presença de impurezas podem ter

mascarado alguns sinais, sendo possível identificar apenas os grupos metilas e

metilenos nos espectros. Estas análises por si só não são conclusivas, porém como

técnica confirmatória complementar forneceu informações adicionais sobre possíves

grupamentos característicos presentes em ambas as estruturas.

A curva de calibração foi realizada para estes dois padrões utilizando medidas

em espectrofotômetro baseadas nos coeficientes de extinção molar de cada um

deles (Tabela 3). Após injeção em HPLC das soluções padrões as áreas foram

integradas e os resultados apresentados em função da área versus concentração

(µmol.L-1).



125

4.3. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata

Os resultados mostraram que o conteúdo total de MAAs foram maiores

durante a fase claro, apresentando seus máximos entre a 9a e a 12ª hora de luz, e

foram menores durante o período de escuro, com mínimos entre a 3ª e a 6ª hora de

escuro (Figura 39).

Figura 39. Variação diária das MAAs presentes em G. tenuistipitata. Os retângulos superiores em branco e preto indicam os períodos de claro e escuro, respectivamente. Os experimentos foram feitos em triplicatas e as barras indicam os desvios padrões. Os asteriscos indicam diferenças signficativas entre as últimas horas de claro e as primeiras de escuro (ANOVA p<0,01).

Já foram mostradas na literatura variações circadianas de MAAs em alguns

organismos aquáticos (Sinha et al., 2001, Taira et al., 2004, Yakovlev & Hidaka,

2004). Sinha e colaboradores observaram que cianobactérias cultivadas sob

condições naturais (PAR+UV) apresentaram um ritmo circadiano nos conteúdos de

MAAs com indução normalmente nos períodos claros (Sinha et al., 2001).

Experimentos in loco conduzidos com diferentes espécies de corais mostraram que

os níveis de MAAs estavam correlacionados com ciclo diurno da radiação solar tanto

no inverno como no verão, sendo os máximos conteúdos encontrados ao meio-dia

(Yakovlev &. Hidaka, 2004). Shick e colaboradores mostraram que concentrações

0 6 12 18 24 30 36 42 48

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

MAA

s to

tais

(Á

rea 33

0.mg

PF a

lga

-1)

Tempo (horas)

* * * *

0 6 12 18 24 30 36 42 48

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

MAA

s to

tais

(Á

rea 33

0.mg

PF a

lga

-1)

Tempo (horas)

* * * ** * * *



126

altas de MAAs presentes em invertebrados marinhos estavam associados a baixos

níveis de estresse oxidativo, sugerindo portanto que a presença em maior

quantidade destes compostos no período de maior irradiação solar (meio-dia) nos

tecidos dos corais podem proteger o aparato fotossintético contra danos causados

por UVR do organismo simbionte (Shick et al., 2000). Em espécies da alga

Scrippsiella sweeneyae, o perfil de variação diária das MAAs foi semelhante ao

obtido em G. tenuistipitata. Os conteúdos de MAAs começam a aumentar nas

primeiras horas de luz, atingindo seus máximos no meio do período de claro com

conseqüente diminuição (Yakovlev &. Hidaka, 2004).

Embora as condições experimentais sejam controladas e a irradiação emitida

seja majoritariamente PAR e constante, os conteúdos de MAAs foram

aproximadamente 1,5 vezes maiores nos períodos de claro quando comparados aos

períodos de escuro (Figura 39). Na macroalga Porphyra umbilicalis foi observado um

aumento nas concentrações de MAAs quando esta alga foi exposta tanto a radiação

solar como somente a radiações PAR (Groniger et al., 1999). O mesmo pode ser

observado em dinoflagelados expostos a altas radiações PAR (Callone et al., 2006,

Carreto et al., 2001). Estes resultados estão condizentes com a idéia de que a

síntese de MAAs é estimulada por exposição à luz, uma vez que estes compostos

são considerados fotoprotetores. Experimentos de variação diária em condição

padrão de cultivo são muito relevantes quando se trata do estudo de metabólitos

secundários que podem ser influenciados por condições externas. Com estes

resultados ficou estabelecido que as coletas para obtenção de biomassa para as

extrações seriam realizadas sempre na 6ª hora de luz.



127

4.4. Ensaios in vitro

4.4.1. Estimativa da concentração total das MAAs de G. domingensis

Nos testes de atividade antioxidante, de estabilidade, citotoxicidade,

fototoxicidade e de fator de proteção solar (FPS) foi selecionado o extrato GD-1, pois

o extrato da macroalga G. birdiae apresentou composição qualitativa e quantitativa

muito similar ao extrato de G. domingensis.

Para obtenção de uma estimativa em massa das MAAs totais presentes em

GD-1 e GD-2 preparados segundo o item 3.4.2, utilizamos a matéria-prima

Helioguard 365 como referência de massa. Na Figura 40 o perfil de absorção no

UV obtido para estas amostras é apresentado.

Figura 40. Perfil de absorção no UV das amostras GD-1, GD-2 e Helioguard 365.

Os comprimentos de onda máximos de absorção na região entre 310 e 360

nm foram muitos próximos. As leituras dos valores de absorvância foram obtidas em

330 nm e em sextuplicata para cada amostra. Os valores encontrados foram: GD-1

(0,251 ± 0,014), GD-2 (0,265 ± 0,017) e Helioguard 365 (0,604 ± 0,030). A

concentração de MAAs totais estimadas para GD-1 foi de (0,0208 ± 0,0014) mg.mg

extrato-1 e GD-2 (0,0225 ± 0,0019) mg.mg extrato-1. Os valores estimados indicam

que não houve alteração do extrato quando este foi seco em Spray Dryer (GD-1) em

200 250 300 350 400 450

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Abso

rvân

cia

(UA)


Helioguard 365 (0,005 mg.mL-1) Extrato GD-1 (0,1 mg.mL-1) Extrato GD-2 (0,1 mg.mL-1)



128

comparação ao concentrado em Speed Vac® (GD-2). Embora a secagem do extrato

de G. domingensis em Spray Dryer (GD-1) tenha oferecido à vantagem de ser mais

rápida que a em Speed Vac® e não tenha degradado as MAAs, o rendimento obtido

neste processo foi cerca de 4,5 vezes menor do obtido anteriormente para G.

tenuistipitata (GT-1) e G. domingensis (GD-2). Durante o processo de secagem em

Spray Dry, uma parte do extrato foi carregada para as bombas de vácuo. Isto

poderia ser evitado adicionando ao extrato algum composto inerte (e.g., amido) que

deixaria o material mais denso evitando perdas.

Os dados estimados sugerem que o extrato de G. domingensis (GD-1 ou GD-

2) tem aproximadamente 2,2% em massa de MAAs totais enquanto que os dados

calculados por HPLC, cerca de 2,9%. A quantificação por HPLC é muito mais

confiável uma vez que as concentrações de cada MAA são calculadas utilizando

curvas de calibração feitas com padrões autênticos.

Comparando os dados de massa do extrato GD-1 com os do extrato de G.

tenuistipitata (GT-1) foi possível observar que apesar do rendimento do extrato GD-1

ter sido muito menor, o primeiro é muito mais rico em MAAs que o segundo. O

extrato GD-1 contêm aproximadamente 0,1 mg.g PF alga-1 e o extrato GT-1 cerca de

0,003 mg.PF alga-1, ou seja, cerca de 37 vezes a menos conteúdos totais de MAAs

do que GD-1. G. domingensis, comparada a G. tenuistipitata, foi coletada em regiões

de altas irradiações naturais e provavelmente por isso altos conteúdos de MAAs

foram encontrados.



129

4.4.2. Testes antioxidantes

O ensaio utilizando-se de DPPH é bastante empregado para estudos

preliminares de atividade antioxidante de uma amostra, sendo muito utilizado para

varredura de diversos extratos.

Para verificar a capacidade antioxidante frente ao ensaio com DPPH foram

testados os extratos provenientes das algas G. tenuistipitata (GT-1), G. domingensis

(GD-1) e a matéria-prima Helioguard 365®. Os resultados, obtidos em porcentagem

de inibição estão mostrados na Figura 41A. O mesmo experimento foi realizado com

padrões de rutina e da mistura de quercetina e isoquercetrina, que são flavonóides

com atividade antioxidante reconhecida (Figura 41B).

Figura 41. Dados de porcentagem de inibição da formação do radical DPPH A) pelos extratos contendo MAAs de G. tenuistipitata, G.domingensis e Helioguard 365® e B) pelos flavonóides rutina e a mistura quercetina e isoquercetrina.

Assim como verificado em análises prévias de inibição da lipoperoxidação

(dados não apresentados), neste ensaio também foi obtida uma baixa atividade

antioxidante dos extratos testados. Apesar da atividade inibitória da formação do

radical DPPH exibida pelos extratos contendo MAAs ter sido baixa, pode-se

observar que o produto Helioguard 365® mostrou uma atividade antioxidante maior

0 500 1000 1500 20000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Helioguard 365®

Extrato GD-1 Extrato GT-1

Concentração (µg mL-1)

% d

e In

ibiç

ão

0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

e In

ibiç

ão

Concentração (µg.mL-1)

Rutina Quercetina e Isoquercetrina

A B

0 500 1000 1500 20000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Helioguard 365®

Extrato GD-1 Extrato GT-1

Concentração (µg mL-1)

% d

e In

ibiç

ão

0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

e In

ibiç

ão

Concentração (µg.mL-1)

Rutina Quercetina e Isoquercetrina

A B



130

em relação aos extratos. Provavelmente outros componentes presentes na

formulação possam ter contribuído para este aumento na inibição da formação de

DPPH, uma vez que a concentração final de MAAs desta solução foi estimada para

ser igual à concentração de MAAs presentes nos extratos. Por outro lado, as

análises dos flavonóides (biossintetizados por plantas exercendo função

fotoprotetora nesses organismos) mostraram uma atividade antioxidante muito alta,

sendo necessário inclusive diminuir a faixa de concentração de trabalho para que a

cinética da reação pudesse ser monitorada.

Normalmente é feita uma analogia entre as funções das MAAs presentes em

organismos aquáticos com as funções dos flavonóides exercidas em plantas

superiores (Shick & Dunlap, 2002; Bandaranayake, 1998). Apesar de ambos serem

biossintetizados para a fotoproteção dos organismos que os produzem, a alta

atividade antioxidante que é geralmente encontrada para os flavonóides e extratos

ricos nessa classe de compostos, aparentemente não é a propriedade marcante nas

MAAs. Com exceção das oximicosporinas, micosporina-glicina e micosporina-

taurina, que apresentam um papel antioxidante, as iminomicosporinas muito comum

em algas provavelmente mantêm o papel primordial de fotoprotetora da UVR

(Dunlap & Yamamoto, 1995; Suh et al., 2003).

4.4.3. Testes de estabilidade

O uso de diferentes solventes e pHs nas formulações cosméticas podem

influenciar profundamente a efetividade dos filtros químicos. As mudanças no

espectro de absorção no UV dependerão do grau de estabilidade da molécula no

seu estado fundamental ou excitado. A escolha correta do solvente e do pH pode

levar a um aumento da absorção no UV trazendo assim mais benefícios para a



131

aplicação do mesmo. Sendo assim, foram realizados alguns testes em relação a

diferentes pHs e temperaturas para verificar o perfil do espectro de absorção no UV

e a estabilidade destes extratos frente a estes parâmetros.

Parâmetro: pH

O perfil do espectro de absorção no UV do extrato GD-1 em pH entre 4 e 12

(temperatura ambiente) praticamente não apresentaram diferenças (Figura 42). Com

a acidificação (pHs 1-3) observa-se tanto uma diminuição da intensidade como um

deslocamento hipsocrômico do máximo de absorção de 327 para 325 nm em pH=3 e

para 324 nm em pHs= 1 e 2.

Figura 42. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1 de G.domingensis em soluções de diferentes pHs a temperatura ambiente.

Em soluções extremamente ácidas (pH < 3), a protonação do par de elétrons

dos átomos de nitrogênio presentes nas MAAs impedirá qualquer deslocamento de

elétrons, elevando portanto a quantidade de energia necessária para ocorrer a

transição eletrônica no UV. Isto causa um deslocamento hipsocrômico

(comprimentos de ondas menores, portanto mais energéticos) que também afetam a

200 250 300 350 400 450-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Abso

rbân

cia

(UA

)


pH 10,0 pH 6,0 pH 3,0 pH 2,0 pH 1,0



132

absorção e o coeficiente de extinção molar. De fato, houve uma ligeira diminuição na

absorvância em pHs 1-3, pela diminuição do grau do deslocamento dos elétrons. No

entanto estas mudanças são reversíveis, uma vez que esta protonação pode ser

reversível. Em condições básicas não houve uma variação no λmáx. Estes dados

estão de acordo com os resultados mostrados por Zhang e colaboradores com

soluções contendo porphyra-334 (Zhang et al., 2005). Este trabalho também

mostrou que a absorvância de soluções de porphyra-334 depende do tempo de

estocagem. Em pHs extremamente básicos (12 e 13), a absorvância caiu

drasticamente nas primeiras 4 h e totalmente no final de 8 h, mesmo à temperatura

ambiente (Zhang et al., 2005). Em pHs menos básicos e ácidos a absorvância

destas soluções se mostrou estável mesmo após 80 dias à temperatura ambiente.

Isto mostra a grande estabilidade e portanto o grande potencial de aplicação destes

compostos.

Parâmetro: Temperatura

A temperatura teve uma grande influência na estabilidade do extrato de

G.bdomingensis (Figura 43). À temperatura ambiente (20°C) a solução foi estável

durante o período de monitoramento (Figura 43 e Figura 44A). Com o aumento da

temperatura, houve um decréscimo na absorvância após 1 h de incubação,

especialmente a 70 e 90°C (Figura 43). Dados na literatura mostraram que as

propriedades de absorção no UV de soluções de porphyra-334 e chinorina não são

alteradas a temperaturas de 75°C, mesmo em períodos maiores que 6 h (Sinha et

al., 2000). Em outro trabalho, testes efetuados com porphyra-334 mostraram que a

absorvância a temperaturas de 60°C decai vagarosamente ao longo do tempo

(Zhang et al., 2005). O extrato de G. domingensis contém além de porphyra-334 e



133

chinorina, outras MAAs que podem não ser estáveis a altas temperaturas. Já foi

mostrado que o rendimento na extração de algumas MAAs são maiores quando a

extração é feita a altas temperaturas (item 4.1.1.1). No entanto, optou-se pela

extração a frio, pois a estabilidade de várias MAAs não foram estudadas até o

momento. Entretanto, vale ressaltar que mesmo a temperaturas de 50°C o extrato se

mostrou estável por 3 h, decaindo vagarosamente após este período (Figura 43).

Figura 43. Monitoramento da absorção no UV em 327 nm ao longo do tempo e em diferentes temperaturas do extrato aquoso de G. domingensis.

Além da banda das MAAs em 327 nm, observa-se outra banda com máximo

em 210 nm (Figura 44). Provavelmente esta banda é devido à presença de

polissacarídeos que são tão polares quanto as MAAs e são portanto extraídos

usando este protocolo. Sabe-se que o gênero Gracilaria produz elevada quantidade

de agarocolóides, podendo chegar a 53% do peso seco (Macchiavello et al., 1999).

A grande quantidade destes polissacarídeos dificulta a extração das MAAs e o

monitoramento do extrato espectrofotometricamente, uma vez que o surgimento de

uma banda, devido à degradação das MAAs, pode estar sendo suprimida pela

banda intensa dos polissacarídeos. Zhang e colaboradores mostraram que em meio

0 1 2 3 4 5 6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

(327

nm

)

Tempo (horas)

Temp. 20 oC Temp. 50 oC Temp. 70 oC Temp. 90 oC



134

básico e de baixa acidez, soluções de porphyra-334 apresentaram o aparecimento

de um pico em 225 nm com a simultânea diminuição da banda em 334 nm (λmax de

porphyra-334) (Zhang et al., 2005). Com a diminuição da absorvância foi observado

o aparecimento de um ponto isosbéstico em 292 nm que pode indicar a relação

entre a produção de um composto com máxima de absorção em 225 nm pela

decomposição de porphyra-334 (Zhang et al., 2005).

De uma outra forma, a degradação das MAAs pode levar à quebra do anel e

por conseqüência, resultar em produtos que apresentam cromóforos que absorvem

em comprimentos de onda menores que 200 nm. Nesta faixa, o monitoramento de

espectros de absorção se torna complexa pelo fato de várias transições eletrônicas

de isolados cromóforos ocorrerem nesta região (Pavia et al., 1996).



135

Figura 44. Espectros de absorção no UV do extrato aquoso (pH= 6,8) de G.domingensis. A: 20 °C e B: 70 °C.

Os resultados de estabilidade quanto ao pH e à temperatura sugerem que o

extrato de G. domingensis apresenta alta estabilidade em condições diversas,

sugerindo também um potencial de aplicabilidade complementar em fotoprotetores

comerciais.

4.4.4. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade

Nos ensaios de citotoxicidade, fibroblastos do tipo 3T3 foram incubados com

o extrato GD-1 por 24 h. A toxicidade foi então determinada em função da

viabilidade celular monitorada espectrofotometricamente após a incubação das

células com o corante Neutral Red que é incorporado pelas células vivas.

Nas concentrações testadas, o extrato GD-1 de G. domingensis não

apresentou citotoxidade (Figura 45A; Tabela 14). Para comparação, utilizou-se

200 250 300 350 400

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abo

rbân

cia

(UA

)

Tempo (horas)

0h 1h 2h 3h 4h 5h

200 250 300 350 400

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abo

rbân

cia

(UA)


0h 1h 2h 3h 4h 5h

A

B200 250 300 350 400

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abo

rbân

cia

(UA

)

Tempo (horas)

0h 1h 2h 3h 4h 5h

200 250 300 350 400

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abo

rbân

cia

(UA)


0h 1h 2h 3h 4h 5h

A

B

A

B



136

cloreto de sódio como controle negativo e dodecil sulfato de sódio como controle

positivo. Os resultados estão mostrados na Tabela 14.

Tabela 14 – Valores de citotoxicidade obtidos para o extrato GD-1, cloreto de sódio e dodecil sulfato de sódio sendo os dois últimos para comparação.

Amostras IC50 (mg.mL-1) Extrato GD-1 Valor não determinado

Cloreto de sódio 7,740

Dodecil sulfato de sódio 0,093

O ensaio de fototoxicidade foi baseado na comparação da citotoxicidade do

extrato GD-2 na presença e ausência de uma dose não citotóxica de radiação UVA.

A fototoxicidade foi medida pela captação do mesmo corante, Neutral Red, pelas

células que sobreviveram à incubação com o extrato em presença de radiação UVA

(Borenfreund & Puerner, 1985).

O extrato GD-2 não foi considerado fototóxico (Figura 45B). Estes resultados

corroboram com o papel fotoprotetor excercido por esta classe de composto que

absorvem radiação de alta energia dissipando sem causar danos às células e

tecidos. Como são altamente estáveis a altas temperaturas e a exposição à radiação

UV, sugere-se que o extrato GD-1 pode fazer parte de formulações de protetores

solares.



137

Figura 45. A) Citoxicidade do extrato GD-1 em função da concentração e B) Fotoxicidade.

4.4.5. Fator de proteção solar

O fator de proteção solar (FPS) foi instituído com o objetivo de fornecer um

índice para o grau de proteção à radiação UVB, de uma determinada preparação

com filtros. É calculado segundo a FDA (Food and Drugs Administration, EUA) ou

COLIPA (The European Cosmetic Toiletry and Perfumary Association) como sendo a

energia UV necessária para produzir uma dose mínima de eritema (DME) sobre uma

pele protegida, dividida pela energia UV necessária para produzir uma DME em uma

pele não protegida:

egidaDMEdesprot

daDMEprotegi

UVUV

FPS = Equação 7

A

B

A

B



138

O FPS está relacionado à formação do eritema, que é provocado por

exposição somente a radiação UVB e sendo assim, o método para o cálculo do FPS

é válido somente para proteção contra radiação UVB. Existem outros métodos que

avaliam o poder de proteção para os filtros que absorvem UVA, embora ainda não

exista um método padronizado e mundialmente aceito, como no caso do UVB.

O método in vitro para cálculo do FPS baseia-se em métodos

espectrofotométricos a partir de parâmetros de irradiação UVB e a formação de

eritema. A partir dos cálculos de transmitância das amostras, o equipamento fornece

os dados de FPS das amostras. Numa primeira etapa, este tipo de teste é realizado,

pois além de ser de baixo custo e rápido, a correlação com os valores reais de FPS

(medidos in vivo) com os valores in vitro é muito próxima.

As medidas foram feitas em triplicatas segundo o item 3.7.4. e os valores de

FPS obtidos para o extrato de GD-1, a matéria-prima Helioguard 365 e para dois

filtros sintéticos, MCX (hidrofóbico) e ASB (hidrofílico), normalmente empregados em

formulações cosméticas. Os resultados estão apresentados na Tabela 15.

Tabela 15 - Valores de FPS calculados para as diferentes amostras.

Amostras FPS calculado

Extrato GD-1 1,03 (±0,01)

Helioguard 365 1,04 (±0,03)

MCX 1,73 (±0,08)

ASB 1,28 (±0,05)

Os valores de FPS para o extrato GD-1 e a amostra Helioguard 365 não

apresentaram valores significativos quando comparado aos filtros sintéticos e como

esperado, o filtro de caráter hidrofóbico (MCX) é mais eficiente que o hidrofílico

(ASB). Os valores baixos de FPS do extrato GD-1 e da matéria-prima Helioguard



139

365 provavelmente deve-se ao fato que ambos continham 3% em massa de

compostos fotoprotetores nas soluções finais, ou seja, as amostras testadas

estavam 30 vezes mais diluídas que as dos filtros sintéticos. Como as

concentrações das amostras não estavam na mesma ordem de grandeza não foi

possível concluir se os valores de FPS do extrato GD-1 e do Helioguard 365 são

satisfatórios. Os dados presentes na literatura mostram que estes compostos são

muito eficientes como fotoprotetores quando incorporado em formulações

cosméticas. Schmid e colaboradores mostraram que um creme contendo 0,005% de

MAAs (mistura de porphyra-334 e chinorina) pode neutralizar os efeitos da radiação

UVA e UVB com a mesma eficiência que um creme contendo filtros sintéticos UVA

(1%) e UVB (4%) (Schmid et al., 2004). Em outro trabalho, os valores de FPS e a

capacidade de absorção no UVA foram mostrados para a MAA porphyra-334 isolada

da cianobactéria Aphanizomenon flos-aquae (Torres et al., 2006). O valor

encontrado de FPS foi igual a 4 e a proteção no UVA medida pela razão UVA/UVB

foi considerada máxima utilizando a classificação dada por Boots Chemists Ltd.

(Torres et al., 2006).

Os perfil de absorção no UV destas amostras também foi monitorado em

espectrofotômetro com caminho óptico de 1 cm. Os resultados estão mostrados na

Figura 46. Uma grande vantagem destes compostos no uso de formulações

cosméticas é a característica de absorção tanto no UVB quanto no UVA (Figura 46).

Geralmente os filtros de absorção no UVA apresentam custo mais elevado que os

filtros de absorção no UVB. Além disto, novas normas quanto ao “fator de proteção

solar” de formulações cosméticas comerciais para o UVA estão sendo padronizadas

e implementadas pelo FDA.



140

Figura 46. Espectros de absorção no UV do extrato GD-1, Helioguard 365 e dos filtros sintéticos MCX e ASB obtidas em espectrofotômetro com monitoramento entre 200-400 nm. As soluções do extrato GD-1 e do Helioguard 365 foram diluídas 10x, enquanto que dos filtros sintéticos MCX e ASB 1000x.

Os resultados em conjunto de citotoxicidade, fototoxicidade, estabilidade

quanto ao pH, temperatura e exposição à UVR bem como os dados preliminares de

FPS sugerem que o extrato obtido de Gracilaria domingensis é um candidato para

incorporações em fotoprotetores voltados para a proteção da pele, embora alguns

parâmetros relacionados às medidas de FPS devam ser otimizados. Ensaios de

incorporação do extrato em formulações cosméticas serão mais relevantes do que o

dado de FPS do extrato por si, uma vez que estes compostos associados a outros

filtros sintéticos podem aumentar o valor de FPS das formulações pela ação

sinergética entre os ativos, agindo como filtros complementares.

200 240 280 320 360 400 440

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Abso

rvân

cia

(ua)


GD-1 (19 µg.mL-1 de MAAs) Helioguard 365® (19 µg.mL-1 de MAAs) MCX (6,6 µg.mL-1) ASB (6,6 µg.mL-1)

UVB UVAUVC

200 240 280 320 360 400 440

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Abso

rvân

cia

(ua)


GD-1 (19 µg.mL-1 de MAAs) Helioguard 365® (19 µg.mL-1 de MAAs) MCX (6,6 µg.mL-1) ASB (6,6 µg.mL-1)

UVB UVAUVC



141

4.5. Experimentos de exposição à UVR de Prorocentrum minimum

4.5.1. Medidas de fotossíntese

Os resultados das medidas do ΦPSII mostraram que as duas espécies

apresentaram inibição nas primeiras 24 h de exposição em todos os tratamentos

realizados e em ambos dinoflagelados avaliados, sendo que nas culturas expostas

às radiações PAR+UVR, os ΦPSII foram significativamente mais baixos quando

comparados às culturas expostas a PAR (Figura 47). O perfil de oscilação do ΦPSII

foi semelhante entre os tratamentos e as duas linhagens de microalgas, sendo que

os maiores valores foram encontrados durante os períodos de claro e os menores

nos períodos de escuro. Nas culturas controle a inibição da fotossíntese não foi

signficativa nas primeiras 12 h, embora seja possível observar uma tendência de

queda até 24 h. Provavelmente esta diminuição no ΦPSII observada nas culturas

expostas às radiações PAR no primeiro dia de experimento foi uma adaptação das

mesmas a radiações mais altas, pois as condições de irradiação da manutenção do

cultivo eram diferentes das utilizadas no experimento (cerca de 5 vezes maior). Já

nas culturas expostas a PAR+UVR foi possível observar uma fotoinibição já nas

primeiras 6 h, sendo que em P. minimum (Katt) estes valores foram

signficativamente menores que em P. minimum (Liss) após 60 h (Figura 47). Sabe-

se que as radiações UVA e UVB podem diminuir a taxa fotossintética (Banaszak &

Neale, 2001; Cullen et al., 1992; Neale et al., 1998). Em diversas diatomáceas, algas

verdes e outras microalgas, o transporte de elétrons no fotossistema II foi alterado

com exposição à UVR (Nilawati et al., 1997; Ghetti et al., 1999; Schofieldm et al.,

1999). A radiação UVB, por exemplo, pode afetar o aparato fotossintético através do

bleaching dos pigmentos fotossintéticos levando assim a uma diminuição da taxa

fotossintética (Gerber & Hader, 1995).



142

Figura 47. Medidas do rendimento efetivo do PSII em Prorocentum minimum isolada de duas regiões diferentes e expostas às radiações PAR e PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01).

4.5.2. Medidas in vivo de EROs

As medidas das EROs foram realizadas como descrito no item 3.9. Os

resultados estão apresentados Figura 48.

Figura 48. Medidas de fluorescência do DCF em culturas de Prorocentum minimum (Liss) e P. minimum (Katt) após exposição às radiações PAR e PAR+UVR durante 72 h. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01).

0 12 24 36 48 60 720.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

P.minimum (Liss) / PAR P.minimum (Liss) / PAR+UVR P.minimum (Katt) / PAR P.minimum (Katt) / PAR+UVR

Ren

dim

ento

efe

tivo

do P

SII

(Fm

'-Ft/F

m')

Tempo de exposição (h)0 12 24 36 48 60 72

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Ren

dim

ento

efe

tivo

do P

SII

(Fm

'-Ft/F

m')

Tempo de exposição (h)

** *

* **

** *

*

*

* **

0 12 24 36 48 60 720.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Ren

dim

ento

efe

tivo

do P

SII

(Fm

'-Ft/F

m')


0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Ren

dim

ento

efe

tivo

do P

SII

(Fm

'-Ft/F

m')


** *

* **

** *

*

*

* **

0 12 24 36 48 60 72

4

8

12

16

20


Fluo

resc

ênci

a D

CF

(UR

.cél

ula-1

.10-5

)


***

*

*

0 12 24 36 48 60 72

4

8

12

16

20


Fluo

resc

ênci

a D

CF

(UR

.cél

ula-1

.10-5

)


***

*

*

***

*

*



143

Os resultados obtidos mostraram que concentrações maiores de EROs foram

encontradas durante os períodos claro em todos os tratamentos (Figura 48). A

absorção de luz por diferentes componentes celulares pode produzir indiretamente

EROs pela transferência deste excesso de energia para o oxigênio (Neale, 2005).

Além disto, o sistema de transporte de elétrons na fotossíntese em uma atmosfera

rica em O2 é uma das principais fontes de EROs em tecidos de plantas (He & Hader,

2002). Em P. minimum (Liss), os conteúdos de EROs foram maiores nas culturas

expostas a PAR+UVR, que nas culturas controle após 36, 48 e 72 h de exposição

(Figura 48). Nas culturas de P. minimum (Katt) com exposição ao UVR, as

concentrações de EROs aumentaram após 12 h de exposição e permaneceram

constantes até 60 h, decaindo após este período. Entre as linhagens sob exposição

PAR+UVR, os conteúdos de EROs foram signficativamente maiores após 24, 48, e

60 h na espécie isolada de regiões frias.

Os resultados sugerem que o dinoflagelado isolado de Lisboa aparentemente

apresenta um sistema de reparo e/ou de prevenção mais eficiente que o

dinoflagelado de Kattegat, uma vez que sob exposição UV, os níveis de EROs foram

menores em P .minimum (Liss).

4.5.4. Análises das MAAs

As análises espectroscópicas dos extratos metanólicos preparados segundo o

item 3.4.3 mostraram um aumento de absorvância na região do UV nas amostras

expostas à radiação PAR+UVR como apresentado na Figura 49.



144

Figura 49. Espectros de absorção no VIS-UV das espécies expostas a PAR+UVR. A) Prorocentrum minimum isolado de Lisboa e B) P. minimum isolada de Kattegat.

As MAAs presentes nos extratos metanólicos foram separadas por HPLC

segundo o método F (Tabela 5). O perfil cromatográfico obtido está mostrado na

Figura 50.

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0 h 12 h 36 h 60 h

Abs

orbâ

ncia

(UA

)

200 300 400 500 600 700-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0 h 12 h 36 h 60 h

Abs

orbâ

ncia

(UA

)


A

B

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0 h 12 h 36 h 60 h

Abs

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ncia

(UA

)

200 300 400 500 600 700-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0 h 12 h 36 h 60 h

Abs

orbâ

ncia

(UA

)


A

B

200 300 400 500 600 700-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30 0 h 12 h 36 h 60 h

Abs

orbâ

ncia

(UA

)


A

B



145

Figura 50. Perfil cromatográfico em λ igual a 330 nm das MAAs presentes em P. minimum após 48 h de experimento no tratamento com PAR+UVR. TR (min): pico 1: 2,1; pico 2: 2,6; pico 3: 3,1; pico 4: 4,0; pico 5: 5,2; pico 6: 12,1; pico 7: 16,0; pico 8: 16,4.

A identificação de cada pico foi realizada com o uso de padrões previamente

isolados ou com padrões de diferentes algas, bem como pelos respectivos espectros

no UV (Figura 51). Os extratos foram também analisados por LC-MS. Os resultados

estão mostrados na Tabela 16.

Figura 51. Espectros de absorção no UV dos picos obtidos por separação em HPLC. λmax (nm): A) pico 1: 332, pico 3: 310, pico 5: 337, pico 6: 333 e B) pico 2:334, pico 4: 320, pico 7: 357, pico 8: 360.

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

3AU

-0.001

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

1

2 4

5

6

78

A B

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

3AU

-0.001

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

1

2 4

5

6

78

A B

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

3AU

-0.001

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

1

2 4

5

6

78

A B

AU

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

3AU

-0.001

0.000

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

Minutes2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00

1

2 4

5

6

78

A BA

U

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

nm250.00 300.00 350.00 400.00

Pico 1: 332Pico 3: 310

Pico 6: 333

Pico 5: 337

AU

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

nm250.00 300.00 350.00 400.00

Pico 8: 360

Pico 2: 334

Pico 7: 357

Pico 4: 320

A BA B

AU

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

nm250.00 300.00 350.00 400.00

Pico 1: 332Pico 3: 310

Pico 6: 333

Pico 5: 337

AU

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

nm250.00 300.00 350.00 400.00

Pico 8: 360

Pico 2: 334

Pico 7: 357

Pico 4: 320

A BA B



146

Tabela 16 – MAAs identificadas em P. minimum pelos tempos de retenção em HPLC, espectros no UV e por espectrometria de massas.

Pico Composto TR (min) λmáx (nm) [M+H]+ e principais fragmentos

1 Chinorina 2,1 332 333, 318, 303, 274, 230, 186

2 Porphyra-334 2,6 334 347, 303, 288, 244, 227, 209, 186

3 Micosporina-glicina 3,1 310 246, 228, 210, 200, 182, `168, 152

4 Palitina 4,0 320 245, 230, 209, 186,

5 Ácido palitênico 5,2 337 329, 314, 296, 283, 261, 233, 197

6 Metil-éster chinorina 12,1 333 347, 332, 317, 296, 288, 270, 244, 229

7 Usujirene 16,0 357 285, 270, 241, 226, 197

8 Paliteno 16,4 360 285, 270, 241, 226, 197

As MAAs foram quantificadas pela curva analítica feita para a porphyra-334,

previamente isolada no laboratório do Prof. Donat Häder, utilizando as razões dos

coeficentes de extinção molar entre elas. As amostras foram expressas em

pmol.célula-1. Os resultados dos conteúdos totais de MAAs nas culturas de P.

minimum expostos a PAR e PAR+UVR estão apresentados na Figura 52.

Figura 52. Perfil da variação do conteúdo total das MAAs (pmol.célula-1) em culturas do dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro:12h escuro. * Diferença signficativa entre os controles e tratados (ANOVA p< 0,01).

0 12 24 36 48 60 72

0.000

0.005

0.010

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**

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*

*

*

*



147

A indução da síntese das MAAs pode ser observada em todos os tratamentos

ao longo do tempo, sendo significativamente mais alta em P. minimum (Liss)

exposta a PAR+UVR (Figura 52). No ínicio do experimento a MAA presente era

majoritariamente chinorina em concentrações da ordem de 1,5 .10-4 pmol.cel-1 em

ambas linhagens. Os maiores valores foram obtidos após 60 h de exposição em

ambas as linhagens sob PAR+UVR e foram aproximadamente 150 e 44 vezes

maiores em P. minimum (Liss) e P. minimum (Katt) respectivamente, que os

conteúdos inicialmente observados. O perfil da indução foi similar nas duas

linhagens: indução da síntese nos períodos de exposição à luz (PAR ou PAR+UVR)

e diminuição ou constância dos conteúdos nos períodos de escuro (Figura 52). A

indução e acúmulo das MAAs sob exposição PAR (~80 e 23 vezes maiores em P.

minimum (Liss) e P. minimum (Katt) respectivamente, após 60 h de experimento)

provavelmente deve-se ao fato de que as condições de irradiação utilizada no

experimento foram cerca de 5 vezes maiores quando comparadas às irradiações

empregadas na manutenção do cultivo. Entre as microalgas, os dinoflagelados são

as espécies que apresentam maior capacidade de síntese de MAAs, mesmo sob

exposição PAR somente (Carreto et al., 2001). Carreto e colaboradores mostraram

que culturas de diferentes dinoflagelados apresentam alta capacidade de acúmulo

de MAAs. Estes organismos normalmente são encontrados em florações na

superfície dos oceanos, estando sujeitos a altas irradiações (Carreto et al., 2001).

Em outro trabalho foi mostrado que dinoflagelados da espécie Alexandrium

excavatum transferidos de uma condição de baixa intensidade de PAR para uma de

alta, aumentaram seus conteúdos de MAAs em questão de horas (Carreto et al.,

1990). Já é bem descrito na literatura que altas radiações de PAR, UVA e UVB

induzem a síntese e acúmulo destes compostos em dinoflagelados (Carreto et al.



148

1990, Lesser, 1996a, 1996b; Hannach & Sigleo 1998; Neale et al., 1998, Klisch &

Häder, 2000). Os maiores valores nos conteúdos e a maior rapidez na indução das

MAAs encontrados na espécie isolada em Lisboa está de acordo com o fato desta

espécie ser proveniente de regiões mais quentes, estando portanto mais adaptada a

condições ambientais de alta irradiação quando comparadas as espécies isoladas

de regiões com menores intensidades naturais de luz. Na literatura, alguns trabalhos

relatam que a síntese destes compostos pode reduzir diversos danos que poderiam

ser causados pela exposição à UVR, como inibição da fotossíntese, crescimento e

motilidade em algas (Neale et al., 1998; Karsten et al., 1999; Klisch et al., 2001). Os

resultados obtidos indicam que as culturas de P. minimum (Liss), adaptadas a

regiões de altas irradiações, apresentaram menores danos ao PSII e menores

concentrações de EROs após 48 h de exposição. As EROs podem ter sido

suprimidas pela indução da MAA micosporina-glicina reconhecida como um forte

antioxidante (Dunlap & Yamamoto, 1995), embora a síntese de outros antioxidantes

como os carotenóides diadinoxantina, diatoxantina e β-caroteno possam estar

envolvidos, pois a indução dos mesmos ocorre na presença de alta PAR e UVR

(Smith et al., 1992). Embora os valores do ΦPSII em P. minimum (Liss) sob exposição

ao UV não tenham atingido níveis controle (tempo de exposição igual 0 h), foi

possível observar após 60 h de experimento uma adaptação desta espécie, refletido

em um aumento do ΦPSII que alcançaram valores próximos aos obtidos para as

culturas de P. minimum (Katt) exposta a PAR somente. Em culturas do dinoflagelado

Gymnodinium sanguineum altos conteúdos de MAAs diminuiram os efeitos da

inibição da fotossíntese pela exposição ao UVR (Neale et al, 1998). Estes

experimentos conjuntamente com os que demonstraram que altos conteúdos de

MAAs também protegem a motilidade de dinoflagelados, apresentaram pela primeira



149

vez evidências concretas do papel fotoprotetor das MAAs em espécies do

fitoplâncton (Neale et al, 1998; Klisch et al., 2001). Por outro lado, espécies do

dinoflagelado Prorocentrum minimum pré-adaptadas a altas irradiações

suplementadas com UVR, apesar de induzirem a síntese das MAAs, não impediram

a inibição da fotossíntese (Lesser, 1996a, 1996b). Alguns modelos ópticos indicam

que as MAAs não devem oferecer uma fotoproteção eficiente comparado ao

pequeno caminho óptico característico das células presentes no fitoplâncton (Garcia-

Pichel, 1994). Algumas medidas relacionadas ao “fator de proteção” oferecido pelas

MAAs mostraram uma pequena atenuação espectral (~10%) (Lesser, 1996a,

1996b). Recentemente Laurion e colaboradores mostraram que as MAAs podem

proteger células do fitoplâncton contra os efeitos adversos da UVR dependendo da

concentração, tipo e distribuição intracelular (Laurion et al., 2004). Os autores

sugeriram que o alto grau de empacotamento das MAAs concentradas ao redor de

organelas sensíveis a UVR devem aumentar a eficiência na proteção de células alvo

específicas (Laurion et al., 2004).

Os conteúdos individuais de cada MAA presente nas culturas de P. minimum

estão apresentadas na Figura 53. Para possibilitar a comparação, as escalas de

concentração foram as mesmas para as MAAs identificadas em P. minimum. As

concentrações das MAAs paliteno e usujireno foram mostradas como soma das

duas, uma vez que o perfil individual de cada uma delas foi semelhante.



150

Figura 53. Concentração das diferentes MAAs (pmol.célula-1) em culturas do dinoflagelado P. minimum isolado de Lisboa (Liss) e de Kattegat (Katt) durante 72 h. As culturas foram expostas a radiação PAR e as radiações PAR+UVR. Os retângulos superiores em branco e preto mostram os períodos de 12h claro: 12h escuro.

Como é possível observar para P. minimum (Liss) sob PAR+UVR, as

principais MAAs que contribuíram para o total foram chinorina e metil-éster chinorina

(Figura 53). As MAAs ácido palitênico e palitina apresentaram o mesmo perfil de

oscilação, com máximos nos períodos de claro e mínimos nos períodos de escuro

(Figura 53). No entanto o acúmulo entre estas duas MAAs foi diferente: para ácido

palitênico não houve um acúmulo líquido de MAAs enquanto que para a palitina

houve um acúmulo após 36 e 60 h. O mesmo ocorreu para as MAAs paliteno e

usujireno que tiveram seus níveis aumentados após 24 h de exposição (Figura 53).

Micosporina-glicina teve seus níveis aumentados nas primeiras 12 h e permanceu

constante durante o experimento e porphyra-334 não contribuiu no total das MAAs.

0 12 24 36 48 60 2

0.000

0.002

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151

Na literatura foi sugerido a classificação das MAAs em primárias

(micosporina-glicina, chinorina e porphyra-334) e secundárias, que seriam derivadas

destas (Shick, 2004). Recentemente, Callone e colaboradores propuseram

interconversões entre diferentes MAAs presentes em dinoflagelados e os resultados

indicaram que micosporina-glicina deve ser precursora de chinorina e porphyra-334

(Callone et al., 2006). Estes autores sugeriram também que chinorina provavelmente

é precursora da metil-éster chinorina. Nossos resultados estariam de acordo com

esta hipótese uma vez que inicialmente os níveis de metil-éster chinorina foram

baixos e aumentaram após indução e acúmulo da MAA chinorina (Figura 53).

Porphyra-334 não foi acumulada provavelmente pela conversão nas MAAs ácido

palitênico e palitina. Como não houve um acúmulo líquido de ácido palitênico, este

pode ter sido convertido nas MAAs paliteno e usujireno. Esta estratégia de

bioconversão é muito interessante para a proteção fisiológica e celular da microalga,

pois a presença de outras MAAs com diferentes λmax pode aumentar a faixa de

absorção no UV. Um exemplo disto é a indução da MAA paliteno e usujireno que

absorvem em λ mais longos no UV (λmax= 357 e 360 nm para usujireno e paliteno,

respectivamente).

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

5. Considerações Finais


153

Os resultados mostraram que diferentes protocolos de extração influenciam

na concentração final das MAAs em diferentes algas. Para G. tenuistipitata,

MeOH:H2O (1:1, v,v) a 45 oC foi o mais eficiente. Além disso, concluímos que os

níveis de MAAs podem diminuir quando os extratos são preparados com

concentrações crescentes de metanol ou a baixas temperaturas nas macroalgas

testadas. Entretanto, mesmo que as extrações a baixas temperaturas não tenham

sido as mais eficientes e algumas MAAs como porphyra-334 e chinorina sejam

estáveis a 45°C (Conde et al., 2000, Sinha et al., 2000), optou-se em utilizar o

protocolo com MeOH:H2O (1:1, v,v) a 4 oC, uma vez que estas condições mais

brandas de extração poderiam evitar qualquer possíveis degradações de outras

MAAs. Além disto, o período de coleta também influencia no conteúdo de MAAs

nesta macroalga. Medidas da variação diária do conteúdo de MAAs em G.

tenuistipitata mostraram que a concentração total das MAAs foram maiores durante

a fase claro apresentado seus máximos entre a 9a e 12 a hora de luz e mínimos entre

a 3a e 6a hora de escuro, provavelmente variando seus conteúdos de acordo com a

irradiação sobre as quais estão sujeitas (Figura 39). Com estes dados ficou

estabelecido que as culturas seriam coletadas sempre na 6a hora de luz.

Para o isolamento das MAAs em coluna semipreparativa foi empregado

gradiente binário composto de soluções de TFA 0,2% e metanol em coluna C18. O

TFA possui a vantagem de ser mais volátil que o comumente utilizado ácido acético

e o emprego de um gradiente binário com metanol proporcionou a extração de

MAAs mais apolares que não foram eluídas utilizando sistemas isocráticos com

ácido acético. Com o emprego deste método por HPLC semipreparativo foi possível

o isolamento de duas MAAs, chinorina e porphyra-334, que foram caracterizadas por

espectrometria de massas e RMN de 1H. Foram ainda testados gradientes contendo



154

soluções de ácido fórmico ao invés de TFA uma vez que o emprego de soluções de

TFA em análise por espectrometria de massas (principalmente em analisador do tipo

Ion trap) não é indicado, pois não possibilita o uso da ionização em modo negativo

por suprimir o sinal. O método de separação otimizado com ácido fórmico (0,2%) e

metanol como fase móvel e duas colunas acopladas como fase estacionária

apresentou boa resolução para as 6 MAAs presentes em G. tenuistipitata (método E,

Tabela 5).

A espectrometria de massas foi uma ferramenta muito importante na análise

destes compostos neste trabalho. Esta técnica de análises é vantajosa em diversos

aspectos, sendo que um deles é a possibilidade de estudos de uma fração mesmo

esta não estando pura. Os experimentos de marcação com deutério em triplo

quadrupolo, embora não sejam sítio específico e, portanto não permitam atribuições

sempre corretas, forneceram diversos dados para a proposição de mecanismos de

fragmentação destes compostos. Marcações em sítios-específicos com 13C, 15N ou

18O poderiam ser mais conclusivas, entretanto esta estratégia não é tão simples

tornando-se inviável para produtos naturais como as MAAs. Mesmo que a estratégia

de marcação com deutério apresente certas limitações, as análises por ESI-MS2

forneceram informações importantes a respeito dos principais grupos contidos nas

estruturas básica das MAAs. A detecção dos íons produtos [M+H-15]+ e [M+H-59]+

relacionadas à eliminação do radical metil e subseqüente eliminação de CO2 foi

observada para todas as MAAs estudadas. O monitoramento destes fragmentos

usando ferramentas disponíveis no espectrômetro de massas (e.g., monitoramento

de perda neutra, monitoramento de reações múltiplas -MRM) podem facilitar a

identificação de novas MAAs em extratos de diversos organismos aquáticos. Através

desta técnica foi possível identicar seis MAAs (chinorina, palitina, asterina, porphyra-



155

334, palitinol, paliteno e/ou usujireno) na macroalga G. tenuistipitata. Devido à

simplicidade e praticidade desta técnica de marcação com deutério, ela

provavelmente será muito útil na identificação e caracterização de novas MAAs em

diferentes organismos aquáticos, principalmente pelo fato que na maioria das vezes

estes compostos encontram-se em baixas concentrações nestes organismos. O

emprego desta estratégia possibilitou a caracterização estrutural de uma nova MAA

isolada de corais identificada como palitina-treonina. As análises por espectrometria

de massas por alta resolução em analisador FT-ICR confirmaram e expandiram os

mecanismos de fragmentação propostos anteriormente e comprovaram a hipótese

da perda inicial de 15 u.m.a. envolver grupo metil ligado ao C2 no anel das MAAs

(Figura 2). Embora esta quebra radicalar observada experimentalmente por

espectrometria de massas não seja usual devido à baixa ionização utilizada no

processo de ESI, concluiu-se através de cálculos teóricos realizados pelo grupo do

Prof. Dr. Sérgio E. Galembeck, que esta quebra é possível e está ligada ao tamanho

da ligação O-C do C2. As análises de baixa resolução em analisador Ion trap das

macroalgas Gracilaria domingensis e G. birdiae mostraram que estas macroalgas

apresentam três MAAs majoritárias (chinorina, palitina e porphyra-334). A

quantificação das MAAs presentes nestas amostras mostrou que o extrato obtido da

macroalga G. domingensis isolada do litoral nordeste brasileiro, embora tenha

apresentado baixo rendimento, foi cerca de 37 vezes mais concentrado que o de G.

tenuistipitata. Já as análises por Ion trap do extrato obtido do dinoflagelado

Prorocentrum minimum mostraram uma mistura complexa de MAAs. Foi possível

identificar 11 MAAs, sendo que 1 delas possivelmente é uma nova MAA.

Os testes antioxidantes in vitro utilizando ensaios com DPPH de alguns

extratos mostraram que estes compostos não apresentaram atividade antioxidante.



156

Já foi demonstrado na literatura que as iminomicosporinas comumente presentes em

algas não possuem atividade antioxidante, provavelmente mantendo o principal

papel de fotoprotetora contra UVR. Já os testes in vitro de estabilidade quanto ao pH

e temperatura, citotoxicidade, fototoxicidade e avaliação do fator de proteção solar

realizados com o extrato de G. domingensis mostraram que este extrato pode ser

promissor no uso em formulações direcionadas para a fotoproteção.

Os estudos relacionados à exposição às UVR de dois dinoflagelados isolados

de regiões diferentes mostraram que houve indução das MAAs nas duas linhagens

em todos os tratamentos realizados no período de 72 h. A indução foi mais rápida e

pronunciada na linhagem proveniente de Lisboa, em Portugal do que na linhagem

proveniente de Kattegat, na Dinamarca. Estes dados estão de acordo com as

características do local de origem das linhagens uma vez que os dinoflagelados

originários de Portugal estavam sujeitos a maiores irradiações quando comparados

às linhagens originarias de regiões mais frias como Kattegat. Os resultados do

rendimento efetivo do PSII indicam que a síntese e acúmulo de MAAs em P.

minimum de Portugal ofereceu vantagens na proteção do sistema fotossintético

desta microalga quando comparada aos indivíduos da mesma espécie, isoladas de

regiões com menores irradiações. Os dados de espécies reativas de oxigênio

apresentaram um mesmo perfil para ambas as espécies. Observou-se um aumento

das EROs durante o período de claro, e mais pronunciado nas culturas expostas ao

UVR e nas linhagens isoladas de Kattegat. Os altos níveis de MAAs presentes em P.

minimum (Liss), dentre as quais estava presente a MAA micosporina-glicina, pode

ter auxiliado na supressão destas espécies reativas.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6. Referências Bibliográficas


158

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LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 – Súmula curricular


ANEXO 1

SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS

Karina Helena Morais Cardozo

Itapetininga, 08 de março de 1977

e-mail: [email protected]

FORMAÇÃO ACADÊMICA

2003 - 2007

Doutorado em Ciências – Bioquímica, Instituto de Química,

Universidade de São Paulo, USP, São Paulo. Bolsa: FAPESP

1998 - 2001

Graduação em Química – Bacharel

Universidade de São Paulo, USP, São Paulo

OCUPAÇÃO

2003 – 2007 Bolsista de Doutorado, FAPESP

IDIOMAS

Inglês

Espanhol

Fluente

Intermediário

ESTÁGIOS NO EXTERIOR

07/2005 - 08/2005

Departamento de Química, da Universidade de Bristol, Bristol,

Inglaterra, sob orientação do Dr. Paul J. Gates. Bolsa: FAPESP

10/2006 - 03/2007

Departamento de Ecofisiologia de Planta, da Universidade Friedrich-

Alexander, Erlangen, Alemanha, sob a orientação do Prof. Dr. Donat-P

Häder. Bolsa: FAPESP e DAAD


PUBLICAÇÕES

Artigos completos:

• Cardozo KHM, Guaratini T, Gates PJ, Pinto E, Colepicolo P, Lopes NP. Fragmentation Study of the of Di-Acidic Mycosporine-like Amino Acids in ESI and nanoESI. European Journal of Mass Spectrometry, em redação. • Vessecchic R, Cardozo KHM, , Carvalho VM, Galembecke SE, Pinto E, Gates PJ, Lopes NP, Colepicolo P. A Theoretical and Mass Spectrometry Based Study of the Fragmentation of Mycosporine-like Amino Acids. International Journal of Mass Spectrometry, aceito, 2007.

• Guaratini T, Cardozo KHM, Pinto E, Colepicolo, P. HPLC-DAD-ECD method for identification and quantification of pigments from algae. Journal of Chromatographic A, submetido, 2007.

• Cardozo KHM, Guaratini T, Barros MP, Falcão VR, Tonon AP, Lopes NP, Campos S, Torres MA, Souza AO, Colepicolo P, Pinto E. Metabolites from algae with economical impact. Comparative Biochemistry and Physiology C, 146: 60-78, 2007.

• Frias HV, Mendes MA, Cardozo KHM, Carvalho VM, Tomazela D, Colepicolo P, Pinto E. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (3): 741-746, 2006.

• Guaratini T, Gates PJ, Cardozo KHM, Campos PMBGM, Colepicolo P, Lopes NP Radical ion and protonated molecule formation with retinal in electrospray and nanospray. European Journal of Mass Spectrometry 12 (1): 71-74, 2006.

• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P. Fragmentation of mycosporine-like amino acids by hydrogen/deuterium exchange and electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 20 (2): 253-258, 2006.

• Barros MP, Pinto E, Sigaud-Kutner TCS, Cardozo KHM, Colepicolo P. Rhythmicity and oxidative/nitrosative stress in algae. Biological Rhythm Research 36 (1-2): 67-82, 2005.

• Bittencourt-Oliveira MD, Kujbida P, Cardozo KHM, Carvalho VM, Moura AD, Colepicolo P, Pinto E. A novel rhythm of microcystin biosynthesis is described in the cyanobacterium Microcystis panniformis Komarek et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 326 (3): 687-694, 2005.

• Carvalho AM; Neto AMP; Tonon AP; Pinto E; Cardozo KHM; Brigagão MRPL; Barros MP; Torres MA; Magalhães P; Campos SCG; Guaratini T; Sigaud-Kutner TCS; Falcão VR; Colepicolo P. Circadian protection against oxidative stress in marine algae. Hypnós (1): 142-157, 2004.

• Leitao MAD, Cardozo KHM, Pinto E, Colepicolo P. PCB-induced oxidative stress in the unicellular marine dinoflagellate Lingulodinium polyedrum. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 45 (1): 59-65, 2003.

• Cardozo KHM, de Oliveira MAL, Tavares MFM, Colepicolo P, Pinto E. Daily oscillation of fatty acids and malondialdehyde in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum. Biological Rhythm Research 33 (4): 371-381, 2002.

Capítulos de livros: • Guaratini T, Cardozo KHM, Pavanelli DD, Colepicolo P, Pinto E. Ecotoxicologia. In:

Fundamentos de Toxicologia, editor: Oga S. Atheneu Editora, 3 ed., 2007.


Resumos em Congressos (2004-2007): • Cardozo KHM, Guaratini T, Pinto E, Colepicolo P. Development of a new method to analyze antioxidants from algae. V Meeting of the SFRBM- South American Group ( Montevidéu, Uruguai, 2007). • Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P. Isolation and Identification of sunscreen compounds from algae. Apresentação oral no XI Congresso Brasileiro de Ficologia (Itajaí, Brasil, 2006).

• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P Identification of mycosporine-like amino acids by hydrogen/deuterium exchange and ESI-MS2 in the macroalgae Gracilaria tenuistipitata. Apresentação oral e de poster no congresso Gordon Research Conference on Marine Natural Products (Ventura, EUA, 2006). • Mastrorosa VO, Cardozo KHM; Pinto E, Colepicolo P. Effects of ultraviolet-B radiation on the accumulation of mycosporine-like amino acids in the red alga Gracilaria tenuistipitata. XXXX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (Águas de Lindóia, Brasil, 2006). • Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Gates P, Vessecchi R, Galembeck S, Lopes NP, Colepicolo P. Fragmentation patters of mycosporine-like amino acids from Gracilaria tenuistipitata by electrospray ionization tanden mass spectrometry. I Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas (Campinas, Brasil, 2005).

• Cardozo KHM, Carvalho VM, Pinto E, Colepicolo P. Micosporinas de Gracilaria tenuistipitata: Isolamento e elucidação estrutural por ESI-MS2. XXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (Poços de Calda, Brasil, 2005). • Cardozo KHM; Carvalho VM; Pinto E, Guaratini T, Cardozo DM; Colepicolo P Investigation of the antioxidant properties of mycosporine-like amino acids in the marine red algae Gracilaria tenuistipitata. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (Águas de Lindóia, Brasil, 2005). • Cardozo DM; Cardozo KHM, Carvalho VM; Pinto E, Colepicolo P. Determination and quantification of mycosporine-like amino acids during growth of the dinoflagellatte Lingulodinium polyedrum with nutrient limitation. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (Águas de Lindóia, Brasil, 2005). • Cardozo KHM; Carvalho VM; Pinto, E. ; Colepicolo, P. Isolation and characterization of mycosporine-like amino acids in the marine red algae Gracilaria tenuistipitata by HPLC and liquid chromatography / electrospray. XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (Caxambu, Brasil, 2004). • Cardozo KHM, Pinto E, Leitão AS, Colepicolo P Oscillation of pigments and mycosporine-like amino acids in the marine dinoflagellate Lingulodinium polyedrum growing in batch-cultures during starvation X Reunião da Sociedade Brasileira de Ficologia (Salvador, Brasil, 2004).

karina helena morais cardozo - teses.usp.br · várias questões minhas sobre algas. ao meu mais...

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