2013/2014

Joana Margarida Moreira Esteves

Diagnóstico Rápido de Malária

agosto, 2014

Mestrado Integrado em Medicina

Área: Microbiologia

Trabalho efetuado sob a Orientação de:

Doutor Acácio Gonçalves Rodrigues

Trabalho organizado de acordo com as normas da revista:

Cadernos de Saúde Pública

Joana Margarida Moreira Esteves

Diagnóstico Rápido de Malária

agosto, 2014

À família e amigos

Diagnóstico Rápido de Malária

INTRODUÇÃO

Procuramos transmitir uma visão integrada da metodologia e papel do diagnóstico

rápido de malária, um sério problema de saúde pública e uma ameaça global. Neste

trabalho abordamos os métodos recomendados: microscopia, RDT e LAMP.

MÉTODOS

Análise da literatura através da base de dados Pubmed e publicações da WHO, FIND e

CDC.

RESULTADOS

A microscopia exibe uma excelente performance, com custos e manutenção reduzidos

mas exige experiência, supervisão e uma considerável estrutura de apoio. Os RDTs são

uma boa alternativa, com performance semelhante; contudo não permitem medição da

parasitémia nem o diagnóstico de outras doenças. O LAMP apresenta-se muito

promissor.

DISCUSSÃO

O diagnóstico rápido e fiável é essencial para o sucesso clínico e sustentabilidade dos

programas de erradicação da malária. É ainda necessário maior investimento na

investigação nesta área, mas também a promoção do acesso aos métodos disponíveis.

CONCLUSÃO

Apenas um planeamento cuidado e multidisciplinar permitirá alcançar os objectivos de

controlo e erradicação da malária, mesmo com os métodos disponíveis.

INTRODUCCIÓN

Procuramos proporcionar una visión integrada de la metodologia y papel del

diagnóstico rápido de malaria, un sério problema de salud pública y amenaza global. En

este trabajo abordamos los métodos recomendados: microscopía, RDT y LAMP.

MÉTODOS

Se revisó la base de datos Pubmed y publicaciones de WHO, FIND y CDC.

RESULTADOS

La microscopía tiene un excelente rendimiento, con costo y mantenimiento reducidos,

pero requiere experiencia, vigilância y importante estrutura de soporte. Los RDTs son

una buena alternativa, con rendimiento similar, aún que no permitan la medición de

parasitémia o diagnosticar otras enfermedades. LAMP se presenta prometedor.

DISCUSIÓN

El diagnóstico rápido y fiable es essencial para la clínica y sostenibilidad de los

programas de erradicación de malaria. Se necessita aumentar la inversión en

investigación en este âmbito, sino también la promoción del accesso a los métodos

disponibles.

CONCLUSIÓN

Soló una planificación cuidadosa y multidisciplinaria, permitirá alcanzar los objetivos

de controlo y erradicación de malaria, mismo con los métodos disponibles.

INTRODUCTION

We aim to provide an insightful outlook on the methodology and role of rapid diagnosis

of malaria, a serious public health threat and a global challenge. In this work we review

the recommended methods: microscopy, RDTs and LAMP.

METHODS

Review of the literature was based on Pubmed database and publications from WHO,

FIND and CDC.

RESULTS

Microscopy displays an excellent performance, with low cost and maintenance.

However, demands expertise, supervision and a substantial support structure. RDTs are

a good alternative, showing similar performance, however they don’t allow assessment

of parasite density or the diagnosis of other diseases. LAMP is a very promising

method.

DISCUSSION

Rapid and reliable diagnosis is essential to the success of clinical approach and

sustainability of malaria eradication programs. While further research is needed, strong

efforts should be dedicated in providing access to available methods.

CONCLUSION

Only a careful and multidisciplinary planning, will allow to reach the objectives, of

malaria control and eradication, even with the methods available.

INTRODUÇÃO

A malária é uma doença causada pela infeção por parasitas protozoários do género

Plasmodium. Estão descritas 5 espécies que causam doença em humanos: P. falciparum

(Pf), P. vivax (Pv), P. malariæ (Pm), P. ovale (Po) e P. knowlesi (Pk)1.

P. falciparum é a espécie predominante na África Subsariana, sendo responsável pela

grande maioria dos casos a nível global1. P. vivax é responsável por apenas 9% das

infeções mundiais, mas apresenta mais ampla distribuição geográfica, pois é capaz de

resistir a temperaturas mais baixas, e tolerar altitudes mais elevadas. P. malariæ é

menos comum, sendo encontrado na maioria das áreas endémicas, especialmente na

África Subsariana. P. ovale é ainda menos comum (<1%), havendo escassa

probabilidade de ser encontrado fora de África. P. knowlesi, foi identificado

recentemente como agente de malária humana em doentes no Sudeste Asiático

(Malásia, Filipinas, Tailândia e Birmânia)1, 2. P. vivax e P. ovale são capazes de

produzir hipnozoítos, tornando possível a recidiva de malária meses ou anos depois da

infeção inicial3, 4.

Dadas as características peculiares do P. vivax, este apresenta uma resposta mais lenta

aos programas de controlo; com a diminuição da incidência do P. falciparum, torna-se a

espécie predominante nas áreas que se encontram em fase de pré-eliminação e

eliminação da doença1.

A transmissão ocorre principalmente através da picada de mosquitos-fêmea do género

Anopheles3. A transmissão não-vetorial também é possível através de transfusões

sanguíneas5, 6, transplantação de órgãos7, transmissão vertical8 ou mesmo exposição

ocupacional9.

Embora se trate de uma doença completamente evitável e curável, segundo a World

Health Organization (WHO), 3400 milhões de pessoas estiveram em risco de contrair

malária em 2012, estimando-se a ocorrência de 207 milhões de casos e de 627000

mortes (90% na África Subsariana e 77% em crianças com idade inferior a 5 anos)1.

Apresenta um vasto espectro de manifestações clínicas decorrentes de hemólise e da

ativação de uma resposta inflamatória, provocadas pelos parasitas na fase eritrocítica do

ciclo de vida. A sua presença depende de vários fatores, nomeadamente: espécie

envolvida; características do doente; epidemiologia; acesso a cuidados de saúde

adequados; programas de controlo em vigor3. Assim, a infeção pode cursar com anemia,

febre, arrepios, mau estar geral, mialgias, artralgias, hipersudorese, astenia, cefaleias,

náuseas, alterações do trânsito gastrointestinal ou esplenomegalia10, ou então o

individuo pode permanecer assintomático. Contudo, com a replicação persistente dos

parasitas, um quadro de malária não-complicada pode evoluir rapidamente para malária

grave11. Os principais grupos de risco são crianças, grávidas e indivíduos não imunes3.

O grau de parasitémia e o modo como é estabelecido o diagnóstico e abordagem clínica

do doente são os principais fatores determinantes do prognóstico11.

No passado recente, em zonas endémicas de malária, os métodos de diagnóstico eram

pouco acessíveis, e a medicação relativamente barata e eficiente; um doente com febre e

arrepios teria um diagnóstico presuntivo de malária, e seria alvo de tratamento empírico.

No entanto, como consequência da distribuição indiscriminada de antimaláricos,

surgiram resistências aos fármacos tradicionais. Com a sua disseminação houve

necessidade de implementar novas terapias, baseadas em derivados da artemisina (ACT)

– mais dispendiosas e já com casos de resistência descritos12, 13.

Atualmente verificamos um paradigma diferente do que se vivenciava no início do

milénio – o crescente investimento por parte da comunidade internacional no controlo

da doença, a par da promoção da melhoria da qualidade de vida das populações,

permitiu que, entre 2000 e 2012, fossem evitadas cerca de 3,3 milhões de mortes por

malária; (90% em crianças com idade inferior a 5 anos)1.

Todavia, em 2013, a malária ainda era endémica em 104 países; estima-se que em 2015,

56 países conseguirão diminuir a incidência de malária em mais de 75%. Pese embora

este avanço reflita apenas 4% dos casos de malária em 2012 – 80% dos casos de malária

a nível mundial ocorrem em apenas 18 países, a maioria na África Subsariana – é

demonstrativo do que se pode conseguir com uma gestão eficaz da doença1.

A sustentabilidade da progressão dos programas de controlo para programas de

erradicação da doença exige que tais sejam acompanhados pela promoção de métodos

de diagnóstico eficientes, rápidos e fiáveis. A identificação laboratorial pode ser feita

através da investigação direta do parasita, de deteção de antigénios e/ou de material

genético do Plasmodium; no entanto alguns dos métodos disponíveis que se mostram

mais sensíveis, podem tornar-se impraticáveis no contexto do diagnóstico de rotina ou

de implementação em situações de recursos limitados14.

As guidelines atuais determinam que nos casos de suspeita de malária, a presença do

parasita seja confirmada antes da instituição da terapêutica, limitando o tratamento

empírico apenas para casos cujo diagnóstico laboratorial não possa ser efetuado num

período inferior a duas horas desde a observação inicial do doente1, 4.

Consideramos como métodos rápidos de diagnóstico os procedimentos que produzem

resultados dentro do período de duas horas preconizado; coincidindo com as técnicas

recomendadas atualmente para o diagnóstico de rotina – microscopia e testes de

diagnóstico rápido (RDTs)15. Adicionalmente, abordamos o Loop-Mediated Isothermal

Amplification (LAMP), um método molecular recente, baseado em Polymerase Chain

Reaction (PCR), que se apresenta bastante promissor.

É nosso principal objetivo fornecer uma visão integrada da metodologia e do papel do

diagnóstico rápido no controlo e erradicação da malária, o impacto das iniciativas

implementadas, os desafios e desenvolvimentos em curso, e algumas perspetivas

futuras.

MÉTODOS

Para a realização desta revisão, a análise da literatura foi efetuada através da base de

dados Pubmed, e ainda de publicações e informações existentes nos websites de

entidades cuja contribuição para o estudo desta doença é reconhecida mundialmente - a

World Health Organization (WHO), a Foundation for Innovative New Diagnosis

(FIND) e o Center for Diseases Control and Prevention (CDC).

Foi feita uma pesquisa bibliográfica na Pubmed combinando os termos “Malaria”

[MESH], “Rapid” e “Diagnosis”[MESH]. Os critérios de inclusão permitiam aceder a

artigos de revisão, revisão sistemática, meta-análise, escritos em inglês, português e

espanhol, cujo texto completo fosse acessível. Incluímos os artigos referentes a

estratégias e métodos de diagnóstico de malária, considerando também a epidemiologia

da doença e novos desenvolvimentos na sua abordagem. Excluímos todos os artigos

que, apesar dos termos utilizados, se referiam a outras patologias ou não se debruçavam

sobre o diagnóstico de malária. Após a leitura do título, abstract e texto integral,

consideramos inicialmente relevantes 43 artigos para esta revisão.

O material bibliográfico das instituições mencionadas é disponibilizado em secções

destinadas ao tópico Malária. De entre os vários documentos disponíveis (entre

guidelines, ferramentas on-line, recomendações e estudos efetuados), 65 foram

considerados relevantes, por proporcionarem uma visão integrada desta temática.

As referências bibliográficas de todos os documentos escolhidos foram revistas, e por

algumas se mostrarem pertinentes no âmbito deste trabalho, foram também incluídas.

DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE MALÁRIA

Apesar de pertinente para a investigação e orientação inicial do doente, o diagnóstico

clínico isolado é muito falível – 50-75% dos doentes tratados empiricamente, não

apresentam malária confirmada laboratorialmente16.

A ausência de confirmação parasitológica da doença leva à administração indevida de

antimaláricos e consequentemente, desenvolvimento de efeitos secundários, perceção

errada de falência terapêutica, e desenvolvimento de resistências. O diagnóstico

diferencial com outras patologias fica comprometido; bem como a vigilância e o estudo

epidemiológico da doença, sobrestimando valores de incidência, morbimortalidade e

custos associados17. Assim, na impossibilidade de confirmação parasitológica, o

panorama epidemiológico deve ser tido em conta: nas áreas onde o risco de contrair

malária é reduzido, o diagnóstico presuntivo deve ser baseado na probabilidade de

exposição ao parasita e na presença de febre nos 3 dias prévios, não apresentando

sintomas sugestivos de outras patologias graves; nas áreas onde o risco é elevado, o

diagnóstico é baseado na história de febre nas últimas 24 horas e/ou presença de

anemia18.

MICROSCOPIA

O exame microscópico é tradicionalmente considerado como o procedimento standard

para o diagnóstico de rotina de malária e comparação com outros métodos de

diagnóstico4, 13, 16, 19. Possibilita a quantificação e monitorização do grau de parasitémia

e a diferenciação entre as principais espécies do Plasmodium. Permite ainda armazenar

as diferentes lâminas usadas, servindo para posterior avaliação e controlo da qualidade.

Os custos são reduzidos (0,12–0,40$US20) e a manutenção do equipamento é

equiparável à de um laboratório comum4, 13, 21.

MÉTODO

O sangue capilar periférico é analisado, usando-se dois tipos de preparação, o esfregaço

de sangue e a técnica da gota espessa, geralmente corados com a coloração de Giemsa

ou Wright. Como alternativa poderão ser utilizadas a coloração de Field ou Laranja-

Acridina.

No caso da técnica do esfregaço de sangue, é criada uma camada fixa de eritrócitos

sobre a lâmina, facilitando a visualização e a identificação dos parasitas. Permite

estimar de um modo preciso o grau de parasitémia de um indivíduo (quando os valores

são superiores a 500 parasitas por µL de sangue22), apresentando, portanto, maior

especificidade que o método da gota espessa, sendo o preferido para avaliar e

monitorizar a resposta ao tratamento14.

A técnica da gota espessa concentra várias camadas de eritrócitos numa pequena área de

superfície, proporcionando uma maior sensibilidade para valores mais baixos de

parasitémia e casos de recidiva ou falência terapêutica14.

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

Em condições ótimas, combinando ambas as técnicas, um microscopista experiente

consegue detetar um valor de parasitémia de 50 parasitas por µL de sangue e identificar

a espécie em 98% dos casos observados14, 16, 20. Contudo, em situações de rotina, locais

remotos ou onde não existam microscopistas experientes, raramente se consegue a

mesma sensibilidade, podendo esta variar entre 75% a 90%13, 14, 23. Na maioria das

zonas endémicas, a doença é sintomática quando existem mais de 100 parasitas por µL,

sendo que um técnico competente consegue detetar valores entre 100-200 parasitas por

µL; sugerindo que à partida, é possível confirmar corretamente todos os casos com

clínica sugestiva6, 21.

A probabilidade de um falso negativo aumenta com a diminuição da parasitémia, que

pode ser causada pela melhoria do doente, ou pela sequestração dos parasitas em órgãos

como o baço, fígado, medula ou placenta14. É recomendada a análise das lâminas por

técnicos experientes, e o aumento do tempo despendido e do número de campos

pesquisados para cada amostra – mais de 100 antes de declarar um resultado negativa24,

25. Quanto à estimativa do valor de parasitémia, não encontramos consenso entre as

várias metodologias propostas25-27 – sendo que a WHO recomenda que o cálculo seja

feito através da contagem de pelo menos 200 leucócitos24. Métodos usando técnicas de

fluorescência conseguem melhorar a sensibilidade mas não a especificidade14,

aumentando os encargos logísticos e económicos.

Os falsos positivos decorrem essencialmente da má preparação das amostras, criando

artefactos que são confundidos com parasitas 13 e da análise após instituição da

terapêutica (evidenciando parasitas circulantes já mortos, mas que ainda não foram

eliminados pelo doente), prolongando o tratamento14.

IMPLEMENTAÇÃO

Mesmo tendo sofrido poucas alterações durante o último século, trata-se de um método

ainda extremamente pertinente28. O principal fator limitante para a sua implementação a

nível global é a disponibilidade de microscopistas especializados e competentes; além

disso, trata-se de um método fastidioso, que exige supervisão, formação e certificação

constantes, de modo a assegurar a qualidade. Fatores como o material, as condições de

trabalho, o número de amostras a analisar, o tempo disponível e a capacidade de

assegurar a conservação e gestão de todos os intervenientes no processo também são

relevantes, principalmente em locais com transmissão elevada, recursos limitados ou em

zonas com pouca experiência em casos de malária13, 14.

Os RDTs apresentam-se como uma boa alternativa nesses contextos, no entanto, não

substituem a necessidade de um diagnóstico microscópico paralelo, devendo este ser

promovido – trata-se do método existente mais rentável, com custos reduzidos e cuja

manutenção é sobreponível à do próprio laboratório, possuindo a capacidade de

diferenciar espécies, quantificar parasitas, acompanhar a evolução do doente, identificar

outras patologias, e de armazenar as diferentes amostras para posterior estudo e controlo

de qualidade4, 13. Ainda assim, a impossibilidade ou o atraso de o realizar não devem

condicionar o tratamento4.

TESTES RÁPIDOS DE DIAGNÓSTICO (RDTs)

Os RDTs são testes baseados na pesquisa de antigénios do Plasmodium na forma de

cassetes, tiras ou cartões, que através de processos de imunocromatografia, produzem

linhas visíveis quando são detetados antigénios do parasita. O tempo de produção de

resultados depende dos fabricantes, mas é por regra inferior a 20 minutos4, 13, 23.

MÉTODO

Uma gota de sangue capilar (entre 5μL a 20μL) é, consoante o formato do RDT,

colocada na extremidade de uma tira de nitrocelulose; são adicionados um agente lítico

e uma solução tampão, que vão promover a hemólise, a lise dos parasitas e a migração

da reação. A tira possui incorporados anticorpos monoclonais (MAbs) anti-antigénios

alvo (anticorpo sinal) e ainda anticorpos de captura fixos em linhas (por vezes, também

outros em fase móvel). Estes são dirigidos aos epítopos dos antigénios ou aos anticorpos

de captura. Com a progressão ao longo da tira e formação de complexos antigénio-

anticorpo ou anticorpo-anticorpo, estes são capturados pelos anticorpos fixos, criando

uma linha visível13, 14, 17, 23.

Um só teste pode detetar diferentes antigénios, produzindo várias linhas. É também

usada uma linha de controlo, que confirma a progressão da amostra na tira. Assim, um

teste positivo terá de ter, pelo menos, duas linhas visíveis.

ANTIGÉNIOS ALVO

Os antigénios atualmente detetados pelos RDTs comercialmente disponíveis são a

Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein 2 (pfHRD2), a enzima desidrogenase

lática específica do Plasmodium (pLDH) e a enzima aldolase.

Plasmodium Falciparum Histidine Rich Protein 2 (pfHRP2)

pfHRP2, codificada pelo pfHRP2, é uma proteína específica de P. falciparum que

intervém na degradação da hemoglobina, que é tóxica para os parasitas. Solúvel em

água, termicamente estável, e presente ao longo de todo o ciclo de vida do parasita no

hospedeiro, mesmo em baixos níveis de parasitémia; é identificada na superfície de

eritrócitos ou circulante no plasma de indivíduos infetados, permitindo a confirmação

da sua presença ainda que haja sequestração capilar dos eritrócitos. Graças a estas

características, apresenta-se como um bom alvo para a identificação da infeção por P.

falciparum17, 19, 29, 30.

Baker et al. e Lee et al. verificaram a existência de um elevado grau de polimorfismo do

pfHRP2, não apresentando contudo nenhuma correlação robusta entre a variação

genética e a taxa de deteção, para densidades superiores a 200 parasitas por µL de

sangue. Assim, estes RDTs apresentam seguros na sua aplicação, já que as

manifestações clínicas surgem mais frequentemente com valores de parasitémia

superiores29, 30.

Importa salientar que foram descritas variantes do P. falciparum na região Amazónica

do Peru, que não expressavam esta proteína, e consequentemente os RDTs dirigidos

apenas a este antigénio poderão ser negativos, ainda que os parasitas estejam

presentes31.

A concentração da pfHRP2 aumenta proporcionalmente com a biomassa do parasita no

hospedeiro, no entanto, dada a sua eliminação demorada19, não se apresenta fiável para

a avaliação do grau de parasitémia nem da resposta ao tratamento. Os testes que usam a

pfHRP2 são seguros para confirmar a ausência de parasitas, mas apenas após 3 a 5

semanas de seguimento4, 32.

Desidrogenase Lática específica do Plasmodium (pLDH)

A pLDH é a enzima terminal na glicólise anaeróbia do Plasmodium, apresentando mais

de 90% de semelhança entre as diferentes espécies, o que possibilita o desenvolvimento

de MAbs pan-específicos (ainda que com sensibilidade diminuída para P. ovale e P.

malariæ33), e conservação intra-específica, sendo a base para a produção de testes

específicos, atualmente dirigidos apenas para P. falciparum (pfLDH) e P. vivax

(pvLDH)17, 19.

A enzima é produzida ao longo de todo o ciclo de vida dos parasitas, apresentando uma

semivida curta (inferior a 10 dias19, 34), não persistindo após a eliminação dos

parasitas17, 19.

Dada a persistência de gametócitos após a ACT, que podem manter a produção de

pLDH, não se reconhece como apropriada para a avaliação da eficácia do tratamento

instituído17.

Importa referir que os RDTs dirigidos à pLDH são mais sensíveis a variações de

temperatura do que os dirigidos à pfHRP235.

Aldolase

A aldolase é uma enzima glicolítica do parasita, conservada e expressa por todas as

espécies do Plasmodium que causam doença humana, ao longo de todo o seu ciclo de

vida. A sua concentração aumenta proporcionalmente à biomassa parasitária, e, tal

como a pLDH, apresenta uma semivida no organismo inferior a 10 dias. No entanto,

dado também permanecer expressa nos gametócitos, não deve ser usada como método

de monitorização do tratamento17, 19, 34. São ainda necessários estudos que determinem a

sua resistência a temperaturas extremas33.

TESTES DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO EXISTENTES

A capacidade de identificar várias espécies num só RDT, reconhecendo antigénios-alvo

diferentes ou pan-específicos, reduz a probabilidade de falsos negativos17. Os RDTs

atualmente disponíveis costumam acoplar a deteção de diferentes antigénios. Em 2006,

Bell et al. agruparam os RDTs existentes em 7 tipos, consoante os antigénios que

detetavam (esquematizados na Tabela 1): tipo I – PfHRP-2; tipo II – pfHRP2 e aldolase;

tipo III – pfHRP2 e pLDH; tipo IV – pfLDH e pLDH; tipo V – pfLDH e pvLDH; tipo

VI – pfLDH e pLDH; tipo VII – Aldolase33. Desde que esta classificação foi

desenvolvida, 3 novos tipos de testes foram criados entretanto: um baseado apenas em

MAbs anti-pLDH, outro com MAbs dirigidos apenas à pvLDH, e um outro que

pesquisa simultaneamente pLDH específica de P. vivax, P. ovale e P. malariæ; a sua

utilização ainda é restrita36.

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

Em 2011, Abba et al. estudaram o uso de RDTs no diagnóstico de malária não-

complicada por P. falciparum, reportando valores de 95% de sensibilidade e 95,2% de

especificidade para testes anti-pfHRP236.

Embora raros, os falsos negativos em RDTs dirigidos à pfHRP2, surgem principalmente

no contexto de baixos valores de parasitémia4, 32, inexistência da proteína no

Plasmodium, e ainda graças a um efeito prozone-like37. Relativamente a falsos

positivos, estão descritos no contexto de infeções por Schistosoma mekongi38, em

doentes positivos para fator reumatoide19, 39, em episódios de febre recente (devido aos

níveis elevados de anticorpos policlonais em circulação)33, pelo uso de anticorpos

murinos33, e pela persistência de pfHRP2 detetável após a instituição de ACTs e

eliminação dos parasitas19.

Relativamente aos testes que detetam pLDH, Abba et al. reportaram uma sensibilidade

para P. falciparum de 93,2%, e especificidade de 98,5%36. Mouatcho et al. referem

ainda que a sensibilidade descrita para P. vivax (para parasitémias superiores a 2000

parasitas por µL de sangue) varia de 78,9% a 98,8%19. Elevados níveis de parasitémia

por P. falciparum podem produzir reações cruzadas com anticorpos anti-pvLDH,

produzindo falsos-positivos para P. vivax23; por outro lado, baixos valores de

parasitémia foram apontados como justificação para os falsos negativos existentes e

consequente diminuição da sensibilidade19. Talman et al. verificaram ainda que apenas

no caso de infeções por P. ovale, a variabilidade antigénica poderia explicar uma menor

deteção pelos RDTs40.

Deste modo, no que respeita a RDTs dirigidos a P. falciparum, aqueles que pesquisam

pfHRP2 são ligeiramente mais sensíveis, embora menos específicos, do que os que

testam a presença de pLDH19, 36.

Quanto à pesquisa de aldolase (com parasitémias superiores a 2000 parasitas por µL de

sangue) a sensibilidade varia entre 48% e 80% para o P. falciparum, e entre 15% e 83%

para o P. vivax19.

A baixa sensibilidade descrita pode ser explicada pelos processos de produção dos

testes e/ou pela expressão diminuída no parasita, não se verificando correlação com a

expressão genética da enzima19, 33, 41.

AVALIAÇÃO E SELEÇÃO DE RDTs

A recente introdução dos ACTs, com o consequente aumento do custo do tratamento, o

declínio da malária a nível mundial, e a variabilidade da performance dos mais de 200

RDTs comercialmente disponíveis, exigem um grande cuidado na escolha dos RDTs a

utilizar numa determinada população ou país.

Determinantes da performance dos RDTs

Além das características inerentes a cada tipo de RDT como a sensibilidade e

especificidade, podemos apontar vários determinantes da precisão e exatidão dos

resultados obtidos: limitações inerentes aos próprios RDTs e respetivos kits (fruto dos

vários componentes e de processos de fabrico) esquematizados na Tabela 2;

condicionantes que decorrem do processo de implementação (nomeadamente questões

logísticas e da própria realização dos testes) esquematizados na Tabela 3.

Avaliação laboratorial dos RDTs comercialmente disponíveis e o programa da WHO -

Malaria rapid diagnostic test performace (MRDTP)

Apesar da existência de inúmeros estudos dedicados à avaliação da performance de um

ou vários RDTs, a sua aplicabilidade na seleção de um produto concreto como método

de diagnóstico acaba por ser limitada pela disparidade de métodos e condições usadas,

bem como pelas populações testadas e substratos utilizados17.

Por reconhecer a necessidade de comparar laboratorialmente a performance dos RDTs

sob um protocolo comum, a WHO juntamente outras entidades lançou, em 2006, o

programa WHO – Malaria rapid diagnostic tests performance42: O principal parâmetro

testado é a Panel Detection Score (PDS) – taxa de positividade do RDT que combina e

avalia a consistência da performance inter-testes e inter-lotes, não sendo por isso,

equivalente à sensibilidade ou ao valor preditivo positivo dos mesmos24 (o limiar

recomendado é de 75% para uma densidade de 200 parasitas por µL42). Os RDTs são

testados perante um painel de amostras de parasitémias de 200 e 2000 parasitas por µL

de sangue, quer para P. falciparum como P. vivax, que expressam os antigénios aos

quais os testes são dirigidos. Os falsos positivos e negativos são analisados, e a

estabilidade térmica e resistência à humidade são confirmadas armazenando os RDTs ao

longo de 2 meses em condições de temperatura (35˚ e 45˚C) e humidade (75%)

elevadas. A facilidade de utilização e o nível de formação necessária também são

avaliados43.

Atualmente já foram testados 164 RDTs diferentes. Vários mostraram uma deteção

consistente para baixas densidades, com poucos falsos-positivos, sendo estáveis em

condições de temperatura elevadas, e ainda fáceis de usar43. Com o decorrer do

programa verificou-se um maior cuidado por parte dos fabricantes, com o aumento do

número de produtos que asseguram o valor de PDS recomendado42. No fim da 4ª ronda

de avaliação, 73,9% dos RDTs para P. falciparum e 47,2% para P. vivax asseguravam

esse valor.

Confirmou-se ainda a existência de variação na performance entre diferentes lotes de

um mesmo produto, e notou-se que ao comparar os resultados de RDTs semelhantes, a

variação dos resultados era ainda maior, o que vem ressalvar a necessidade de produzir

ferramentas de avaliação, com métodos e amostras standard para o controlo de

qualidade ao longo da cadeia de distribuição43, 44.

Seleção de RDTS

Em 2012 foram atualizadas as recomendações para os critérios de seleção de RDTs:

para a deteção de P. falciparum, em qualquer zona de transmissão de malária, a PDS

para amostras com P. falciparum (parasitémia de 200 parasitas por µL), deve ser de

pelo menos 75%; para a deteção de P. vivax, em qualquer zona de transmissão de

malária, a PDS para amostras de P. vivax (200 parasitas por µL) deve ser de pelo menos

75%; a taxa de resultados falso positivos deve ser menor que 10% e a taxa de resultados

inválidos inferior a 5%42.

A escolha dos RDTs deve passar pelas seguintes etapas: estudo prévio da população, do

parasita e da performance dos RDTs; estimativa das necessidades; determinação dos

meios de financiamento; concretização das especificações técnicas para os RDTs a usar;

determinação da metodologia da seleção; avaliação dos orçamentos submetidos a

concurso e estabelecimento de contratos; controlo da qualidade (inter-lotes inclusive);

coordenação da logística de distribuição; monitorização da performance dos

fornecedores e variabilidade dos produtos; melhoria constante de todo o processo de

seleção34.

IMPLEMENTAÇÃO

Os RDTs são atualmente utilizados em praticamente todos os níveis do controlo e

erradicação da malária, tanto por profissionais de saúde como por prestadores

comunitários de cuidados de saúde (membros da comunidade escolhidos pela mesma ou

pelas organizações para providenciar cuidados de saúde no seio da mesma),

farmacêuticos/vendedores, e mesmo para autodiagnóstico ou diagnóstico de terceiros.

Em 2005, Msellem et al. estudaram os efeitos dos RDTs no tratamento e prognóstico de

1887 indivíduos febris em Zanzibar. A prescrição de ACTs foi menor no grupo cuja

abordagem consistiu na avaliação clinica e utilização de um RDT (36%) em

comparação com o grupo submetido apenas a avaliação clínica (85%). Em

contrapartida, no primeiro verificou-se uma maior prescrição de antibióticos (37%, para

27% no segundo grupo), com um menor retorno aos cuidados de saúde (2,5%, para

4,9%) e com custos semelhantes por doente tratado45. Um estudo semelhante no Uganda

revelou uma redução de 50% na prescrição de antimaláricos, e confirmou a adesão dos

prestadores de cuidados primários aos RDTs e à promoção de uma adequada

identificação e gestão dos casos de malária46. A introdução nacional de RDTs no

Senegal também revelou uma elevada adesão dos profissionais, com um aumento de

3,9% para 86% do diagnóstico parasitológico de malária, e uma redução de 72,9% para

31,5% das prescrições de ACTs47.

No entanto, a implementação de orientações semelhantes na Zâmbia, sofreu vários

contratempos – a introdução dos RDTs durante o período de baixa transmissão da

doença resultou na identificação de um número reduzido de testes positivos, e a

formação ministrada não orientava o seguimento dos doentes com resultados negativos,

abalando a confiança dos profissionais de saúde nas recomendações propostas.

Ademais, houve vários episódios de rutura de stocks por falhas de financiamento e

atrasos de encomendas, sendo que a seleção dos RDTs foi coordenada por entidades

governamentais e financiadores, baseando-se na procura dos testes mais baratos,

desconsiderando a possibilidade de não serem adequados para todas as regiões6. Mesmo

assim, durante esse período Yukich et al. verificaram a diminuição do número de

diagnósticos de malária e ACTs prescritos48.

Crianças

As antigas recomendações da WHO mencionavam que nos casos de febre em crianças

menores de 5 anos em zonas de elevada transmissão de malária, estas deveriam ser

tratadas de acordo com o diagnóstico clínico, dado o risco de não tratar os falsos

negativos49. Presentemente, existe evidência suficiente que assegura a segurança e

benefício em restringir o tratamento com ACTs apenas para os casos de positividade

dos RDTs50.

Comunidades remotas e domicílios

A introdução dos RDTs a par dos ACTs junto das comunidades mais remotas e nos

domicílios é segura, atenuando as limitações no acesso aos cuidados de saúde, evitando

o uso indevido de antimaláricos e promovendo a educação dos doentes e respetivas

comunidades51-53. Em 2012 Cohen et al., estudaram a viabilidade de distribuir para

revenda RDTs comparticipados junto de comerciantes locais, aos quais a população do

Uganda recorre primariamente como prestadores de cuidados de saúde. Os indivíduos

com resultado positivo tinham mais 23% de probabilidade de comprar ACTs que os

indivíduos com resultado negativo, e mais 5,6% de comprar ACTs que os não-testados.

Os comerciantes demostraram ainda desejo em manter a revenda dos RDTs54.

Autodiagnóstico por viajantes

Os RDTs apresentam-se relevantes para o autodiagnóstico de expatriados de áreas

endémicas, viajantes com estadias de longa duração, ou então de curta duração, mas

muito frequentes55.

Trachsler et al. e Jelinek et al verificaram que apenas 70,6% e 68%, (respetivamente)

dos viajantes interpretavam e aplicavam corretamente os RDTs usados 56, 57. Já Whitty et

al., em 2000, obtiveram resultados com sensibilidade de 95% e especificidade de 97%

58.

A adesão aos RDTs é, no entanto, elevada, ainda que o seu benefício também dependa

da condição dos produtos usados e da formação prévia55, 59. Importa realçar que com a

melhoria e desenvolvimento dos programas de controlo da doença nas áreas endémicas,

o diagnóstico dos viajantes nessas áreas acaba por ser melhorado.

Grávidas

Kattenberg et al. analisaram 49 estudos que avaliavam os diferentes tipos de métodos

disponíveis para o diagnóstico de malaria em grávidas. O uso de RDTs apresenta uma

maior sensibilidade (81%) quando comparado com a microscopia do sangue periférico

(72%) e menor quando comparado com o PCR (94%), em relação aos resultados

obtidos pela microscopia do sangue placentário. Quanto à especificidade, os RDTs

apresentam um valor de 94%, enquanto que a microscopia do sangue periférico 98% e o

PCR 77%, sendo que perante a evidencia revista, não foi possível determinar se os

falsos positivos detetados são causados pela identificação de parasitas sequestrados60.

LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP)

Atualmente, os métodos moleculares de diagnóstico baseados na deteção de DNA ou

RNA são os que apresentam a maior sensibilidade e especificidade. A amplificação

inicial por PCR de primers específicos para Plasmodium, e posteriormente de primers

específicos do género ou da espécie permite detetar parasitémias de 0,004 a 5 parasitas

por µL61. O Loop–Mediated Isothermal Amplification (LAMP) surge com o potencial

de combinar a elevada performance dos métodos moleculares com a possibilidade de o

utilizar em situações de rotina, em condições difíceis e com recursos técnicos,

monetários e humanos limitados62.

MÉTODO

O LAMP amplifica zonas altamente conservadas, normalmente o segmento 18S, de

modo semelhante ao reproduzido pelas técnicas de PCR, mas sem a necessidade de

alternar a temperatura da reação. A utilização de polimerases mais robustas no LAMP,

nomeadamente a Bacillus stearothermiphilus (Bst) DNA polimerase, permite uma

maior resistência a inibidores presentes no sangue, não exigindo uma preparação

complexa das amostras. As sequências amplificadas são dobradas em estruturas em

loop, o que torna a mistura turva. Uma reação positiva acaba ainda por criar um

precipitado branco de pirofosfato de magnésio. Assim, em menos de 1 hora, os

resultados podem ser avaliados através de eletroforese, pela medição da turvação,

através de um turbidímetro em tempo real (real-time) ou mesmo através da inspeção

visual62-64. Em 2010, Polley et al. descrevem ainda a amplificação de alvos

mitocondriais, aumentando a sensibilidade do método para parasitémias mais baixas65.

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

Em 2007, no Bangladesh, Paris et al. compararam a utilização deste método, em

relação aos resultados obtidos com o nested-PCR, obtendo resultados com 76,1% de

sensibilidade e 89,6% de especificidade62.

Em 2012, Polley et al. avaliaram um LAMP kit em amostras de viajantes febris

regressados ao Reino Unido, comparando-os com os resultados da microscopia e do

nested-PCR; obtiveram 98,4% de sensibilidade e 98,1% de especificidade com os

primers específicos para P. falciparum, e 97% de sensibilidade e 99,2% de

especificidade com os primers pan-específicos, verificando uma performance superior à

microscopia, e semelhante à do PCR, ainda que com um tempo de produção de

resultados muito mais reduzido63.

Em 2013, Hopkins et al. avaliaram o mesmo kit numa clinica rural no Uganda,

comparando o com os resultados obtidos usando um nested-PCR em 3 poços, um

nested-PCR em poço único e microscopia. Tanto o LAMP como o nested-PCR em poço

único apresentaram uma sensibilidade de 90%, versus 51% no caso da microscopia66.

IMPLEMENTAÇÃO

Segundo uma recente revisão pelo MPAC, o limite de deteção desta técnica é de 0,2 a 2

parasitas por µL de sangue, estimando um custo de 4-5$US por amostra testada, e 500-

5000$US pelo equipamento necessário67. São no entanto sugeridos mais estudos de

modo a obter primers mais adequados, reagentes liofilizados e desenvolvimento de

tecnologia que facilite a leitura dos resultados68.

O LAMP é especialmente adequado em situações que exigem elevada sensibilidade

diagnóstica, nomeadamente no diagnóstico pré-natal, estudos epidemiológicos e rastreio

de malária, especialmente no que se refere a infeções submicroscópicas63. Aonuma et al.

mostraram ainda que o LAMP também é útil na identificação de mosquitos portadores

no terreno, graças à robustez da reação (permitindo a utilização de todo o corpo do

inseto), elevada sensibilidade, e baixa logística necessária69.

DISCUSSÃO

O diagnóstico parasitológico promove uma melhor abordagem clínica dos doentes e o

diagnóstico diferencial com outras patologias, evitando a administração de

antimaláricos, e respetivos efeitos secundários, minimizando o desenvolvimento e

disseminação de resistências. Cria uma maior confiança e adesão à terapêutica,

permitindo a identificação da falência do tratamento. A vigilância e registo dos casos de

malária também é melhorada, permitindo o estudo de tendências e uma melhor gestão

de recursos24, 70.

A microscopia e os RDTs são os métodos mais adequados e atualmente recomendados

para a confirmação parasitológica em todos os casos de suspeita de malaria. Nos locais

onde existem serviços capazes de realizar diagnóstico microscópico, estes devem ser

assegurados e aperfeiçoados; nos casos onde a microscopia não é possível, a introdução

dos RDTs deve ser considerada.

Graças ao melhor controlo da doença e da progressão para estratégias de eliminação e

erradicação da malária, os métodos moleculares assumem uma crescente importância. O

LAMP tem o potencial de garantir as características ideais para um método de

diagnóstico rápido68. Todavia, a sua implementação não deve fazer divergir recursos da

prevenção e controlo de malária, ou da melhoria dos cuidados de saúde e seu controlo e

qualidade71.

É ainda necessário investimento e estudo de modo a produzir-se um método de

diagnóstico que assegure as características ideais: portátil ou independente de

equipamentos especializados; dotado de alta sensibilidade e especificidade para

qualquer nível de parasitémia e espécie; de fácil fabrico, aprendizagem, execução e

interpretação, em qualquer terreno; capaz de discriminar entre espécies e avaliar a

resposta ao tratamento, distinguindo entre infeção recidivante e infeção de novo

(possibilitando a identificação de áreas onde a transmissão se mantenha);

economicamente viável; com tolerância ao calor e humidade; prazo de validade

suficientemente longo para minimizar os encargos de logística; de fácil distribuição;

adaptável às condições epidemio-socio-culturais da região; rápido (demorando menos

de 30 minutos) 17, 72, 73.

De modo a conseguir a cura radical (erradicação dos hipnozoítos nos hepatócitos) nas

infeções por P. vivax ou por P. ovale é necessário o tratamento com primaquina, o que,

em indivíduos com deficiência da desidrogenase da glicose-6-fosfato pode levar a

hemólise grave4. Um teste que conseguisse detetar adicionalmente este tipo de variação

previamente à instituição da terapia seria de grande mais-valia.

O atual desenvolvimento da tecnologia, nomeadamente das telecomunicações, pode

minorar algumas das falhas apontadas, e facilitar a comunicação, otimizando a produção

e implementação dos testes74.

Com a crescente diminuição de incidência de malária, o diagnóstico e tratamento de

patologias que não malária, que cursam com um quadro clínico idêntico, também deve

ser promovido.

Contudo, consideramos essencial realçar, relembrando a ampla distribuição e

morbimortalidade associadas à malária, que em relação ao impacto na saúde a nível

global, o benefício de atitudes que promovessem o aumento do acesso do diagnóstico e

tratamento já existentes excede largamente o da melhoria no desempenho desses

procedimentos ou o desenvolvimento de novos75.

Em 2005, tinham sido distribuídos 200000 RDTs, e sido feitos cerca de 160 milhões de

exames microscópicos1. Em 2012, 90 países endémicos tinham implementado medidas

de promoção de diagnóstico para todos os grupos etários, sendo que 85 desses países o

disponibilizavam sem qualquer tipo de custos para os indivíduos testados1. Só nesse

ano, 102 milhões de RDTs foram distribuídos e o número análises microscópicas ao

sangue atingiu o pico de 188 milhões (120 milhões na India). Estes valores

correspondem aproximadamente ao número de ACTs distribuídos, todavia, sabendo-se

que as taxas de positividade na maioria das zonas de África são menores que 50%, a

razão entre o número de testes e o número de prescrições feitas deveria ser de, pelo

menos, o dobro1.

Anualmente, o número de testes necessários calculado para garantir o diagnóstico

universal de malária num ano é de 1000 milhões; se tal valor fosse atingido, a

necessidade de ACTs diminuiria em mais de 60%1.

Dado o subfinanciamento que se verifica, a construção de estruturas que otimizem os

principais determinantes de sucesso apresentados bem como as condições

socioeconómicas das populações em causa, permitiriam um maior acesso ao diagnóstico

de qualidade, e a melhoria da saúde da população no geral.

CONCLUSÕES

A confirmação parasitológica da malária é um componente essencial quer na abordagem

correta do doente, quer no panorama geral de controlo e erradicação da doença a nível

global. Dada a rapidez com que a malária pode evoluir, além da sensibilidade e

especificidade, o tempo de produção de um resultado é prioritário.

Contudo, não encontramos na literatura nenhuma referência a um único procedimento

que satisfizesse todos os critérios de modo a ser considerado como o teste diagnóstico

ideal. É ainda necessária investimento e investigação de modo a avaliar, melhorar e

coordenar as estratégias existentes, bem como para o desenvolvimento de novas

técnicas e protocolos de suporte para a implementação dos mesmos.

Concluímos que o sucesso de qualquer iniciativa destinada ao controlo da malária

depende de um investimento e planeamento cuidado e multidisciplinar, tornando

possível alcançar resultados satisfatórios mesmo com métodos imperfeitos.

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77. Luchavez J, Lintag ME, Coll-Black M, Baik F, Bell D. An assessment of various

blood collection and transfer methods used for malaria rapid diagnostic tests. Malaria

journal. 2007;6:149.

78. PROJECT U-D, FIND, WHO-WPRO, Partnership RBM, UNICEF.

Transporting, storing and handling malaria rapid diagnostic tests in health clinics2009.

38 p.

79. WHO-WPRO UDP, FIND, Roll Back Malaria Partnership. PMI, UNICEF.

Transporting, Storing and Handling Malaria Rapid Diagnostic Tests in Health Clinics.

Arlington, Va2009.

Tabela 1 – Tipos de Testes de Diagnóstico Rápido existentes

Tipo Antigénios Alvo Resultados possíveis* Conclusão

I pfHRP2

Pf ou mista

Pf ausente

Sem linha de controlo Inválido‡

II pfHRP2 e aldolase

Negativo

Pf ou mista•

Pv, Po e/ou Pm

Sem linha de controlo Inválido‡

III pfHRP2 e pLDH

Negativo

Pf ou mista

Pv, Po e/ou Pm

Sem linha de controlo Inválido‡

IV pfLDH e pLDH

Negativo

Pf ou mista

Sem linha de controlo Inválido‡

V pfLDH e pvLDH

Negativo

Pf†

Pv

Pf e Pv

Sem linha de controlo Inválido‡

VI pfHRP2, pLDH e

pvLDH

Sem malária

Pf e Pv, e/ou Po e/ou Pm

Pf, e/ou Po e/ou Pm

Pv, e/ou Po e/ou Pm

Po e/ou Pm

Sem linha de controlo Inválido‡

VII Aldolase

Sem malária

Pf, Pv, Po e/ou Pm

Sem linha de controlo Inválido‡

* Todos os testes têm uma linha de controlo para além das linhas de teste; ‡ Ausência da linha de controlo; • Pode haver um teste

positivo para pfHRP2 não sendo positivo para a aldolase, já que o primeiro apresenta maior sensibilidade; × A ausência de

pfLDH não exclui infeção por Pf pois apresenta uma menor sensibilidade para valores mais baixos de parasitémia; † Pode estar

infetado por outras espécies que não Pf

A – janela para a amostra de sangue + tampão (em alguns RDTs existe uma janela para cada, sendo que a do tampão fica numa

localização mais extrema que a destinada ao sangue); C – linha controlo

Tabela 2 - Características dos dispositivos que condicionam a performance dos RDTs

DISPOSITIVOS DE TESTE

COMPONENTES

Tira de Nitrocelulose A porosidade e a distância a percorrer são determinantes da velocidade do fluxo do

antigénio ao longo da tira e consequentemente da sensibilidade, especificidade e do tempo

de obtenção de resultados 76.

Dispositivo de

transferência de sangue

Encontram-se disponíveis diferentes ferramentas para efetuar a transferência da gota de

sangue para a janela para a amostra do RDT. Embora não se revistam de dificuldade na

sua utilização, apresentam limitações e exigem treino de modo a garantir a produção de

amostras consistentes 77.

Anticorpos A estabilidade quer da ligação ao agente corante por parte do anticorpo de sinal, bem

como a da adesão do anticorpo de captura à tira, podem ser afetadas pelos processos de

fabrico 33. A quantidade de anticorpos presentes na tira determina a intensidade da linha

visível 37.

Solução tampão, agente

(hemo)lítico, aditivos

A eficiência da hemólise e da lise dos parasitas vai determinar a quantidade de antigénio

disponível, sendo que a composição da solução adicionada ao sangue pode promover a

estabilidade dos anticorpos ou neutralizar fatores que produzam falsos negativos ou

positivos. De notar que também influenciam a viscosidade da solução e consequentemente

a velocidade de migração ao longo da tira, e por isso, a sensibilidade, a especificidade e o

tempo de obtenção de resultados 33, 76.

FABRICO

Montagem A forma e colocação das janelas para a amostra + solução tampão, afetam o contacto do

sangue com os MAbs. A compressão da tira de nitrocelulose também pode afetar o fluxo

na mesma. 33, 76.

Buracos de evaporação Localizados na ponta oposta à janela de amostra, podem contribuir para a minimização do

fenómeno de back-flow 33.

Embalagem A proteção dos RDTs da humidade é essencial, já que esta acelera a degradação dos testes.

Tabela 3 – Elementos inerentes à implementação dos RDTs que condicionam a sua

performance

IMPLEMENTAÇÃO

LOGÍSTICA

Transporte,

armazenamento e

manutenção dos RDTs

A cadeia de distribuição dos RTDs desde o fabrico até ao doente implica a exposição a

diferentes condições ambientais, especialmente nas áreas endémicas e com climas

tropicais. Devem ser resguardados da humidade e mantidos em temperatura entre os 2˚ e

os 30˚C, já que a humidade e temperaturas muito elevadas ou muito baixas aceleram a

degradação dos testes, e por isso, o armazenamento por grandes períodos de tempo, apesar

de ainda dentro do prazo de validade, não é recomendado, tornando a eficiência da gestão

de stocks fundamental 78, 79.

Armazenamento das

amostras sangue

O sangue armazenado pode perder a capacidade antigénica, e a lise precoce ou a

coagulação proteica podem inibir a progressão na tira 33.

IMPLEMENTAÇÃO

Instruções e Rotulagem De modo a garantir o uso correto dos dispositivos, minimizar erros e a consistência de

resultados, é necessário garantir a rotulagem correta e a inclusão de instruções de

utilização 34, 52. A título de exemplo, o fenómeno de back-flow apresenta-se como a

principal causa de falsos positivos, resultando da leitura dos RDTs após o período de

tempo recomendado 15.

Erro Humano Apesar de os RDTs se apresentarem como testes seguros e simples de realizar, o fator

humano é determinante da sua performance, sendo que os principais erros apontados são:

O uso de quantidades insuficientes ou exageradas sangue;

O uso de tampão errado ou em quantidade errada;

Trocar as janelas onde colocar o sangue e a solução tampão;

O não cumprimento do tempo especificado pelo fabricante;

Acuidade visual diminuída e/ou más condições de luminosidade;

A interpretação de linhas débeis como não sendo sinais de positividade 44.

Formação e Supervisão A promoção do treino e supervisão são necessárias para assegurar o cumprimento das

instruções, minimizar o erros e detetar falhas, contribuindo para uma melhor performance 24, 52.

Controlo de Qualidade A existência de um mecanismo/protocolo que garanta a qualidade da implementação dos

RDTs, monitorizando e avaliando toda a cadeia necessária para a aplicação destes testes,

demarca a confiança e segurança dos resultados obtidos .

Doente e Parasita A densidade de antigénio presente determina o resultado dos testes efetuados, e para

qualquer parasitémia, vai depender da biomassa total dos parasitas no organismo, do

estádio de vida dos Plasmodium, da variabilidade da expressão do antigénio e da

persistência do antigénio ao longo e após a infeção.

A presença de fatores que promovam a produção de falsos positivos ou negativos também

varia entre os diferentes doentes.

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Scope and policyManuscripts' form and presentation

Scope and policy

Cadernos de Saúde Pública (CSP) publishes original articles ofsuperior scientific merit that contribute to the study of publichealth in general and related disciplines.

Manuscripts' form and presentation

We recommend that authors read the following instructionscarefully before submitting their manuscripts to CSP.

1. CSP accepts articles for the following sections:

1.1 Literature Reviews: critical reviews of the literature onthemes pertaining to public health (maximum 8,000 words and 5figures);1.2 Articles: results of empirical, experimental, or conceptualresearch (maximum 6,000 words and 5 figures);1.3 Brief Communications: reporting preliminary research results,or results of original studies that can be presented succinctly(maximum 1,700 words and 3 figures);1.4 Debate: theoretical articles accompanied by critical letterssigned by authors from other institutions and invited by the Editors,followed by a reply from the author of the main article (maximum6,000 words and 5 figures);1.5 Forum: section that publishes sets of 2 to 3 interrelatedarticles by different authors, on a theme of current interest(maximum 12,000 words for the combined articles). Authorsinterested in submitting work to this section should consult the CSPEditorial Board;1.6 Perspectives: analysis of conjunctural topics of immediateinterest, of importance to Public Health, usually at the invitation ofthe Editors (maximum 1,200 words);1.7 Methodological Issues: full article, which focuses ondiscussion, comparison and evaluation of methodological issuesrelevant to the field, either in the study design, data analysis orqualitative methods (maximum 6,000 words and 5 figures);1.8 Book Reviews: critical reviews of books related to thethematic scope of CSP, published in the previous two years(maximum 1,200 words);1.9 Letters: critiques of articles published in previous issues of CSP(maximum 1,200 words and 1 figure).

2. Presentation of manuscripts

2.1CSP only considers publishing original, previously unpublishedmanuscripts that are not being reviewed simultaneously forpublication by any other journal. Authors must state theseconditions in the submission process. In case previous publication

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or simultaneous submission to another journal is identified, the

article will be rejected. Duplicate submission of a scientificmanuscript constitutes a serious breach of ethics by the author(s).2.2 Submissions are accepted in Portuguese, Spanish, or English.2.3 Footnotes and attachments will not be accepted.

2.4 The word count includes only the body of the text andreferences (see item 12.13).

3. Publication of clinical trials

3.1 Manuscripts presenting partial or complete results of clinicaltrials must include the number and name of the agency ororganization where the clinical trial is registered.3.2 This requirement complies with recommendations byBIREME/PAHO/WHO on the Registration of Clinical Trials to bepublished based on the guidelines of the World Health Organization(WHO), the International Committee of Medical Journal Editors(ICMJE), and the ICTPR Workshop. 3.3 Agencies and organizations that register clinical trials accordingto ICMJE criteria include:

Australian New Zealand Clinical Trials Registry (ANZCTR)ClinicalTrials.govInternational Standard Randomised Controlled Trial Number(ISRCTN)Nederlands Trial Register (NTR)UMIN Clinical Trials Registry (UMIN-CTR)WHO International Clinical Trials Registry Platform (ICTRP)

4. Funding sources

4.1 Authors must disclose all sources of institutional or privatefunding or support for conducting the study.4.2 Suppliers of free or discount materials or equipment should bedisclosed as funding sources, including the origin (city, state, andcountry).4.3 If the study has been performed without institutional and/orprivate funding, the authors should state that the research did notreceive any funding.

5. Conflicts of interests

5.1 Authors must disclose any potential conflicts of interest,including political and/or financial interests associated with patentsor property and manufacturer's supply of materials and/or inputsand equipment used in the study.

6. Authors

6.1 The various authors' individual contributions to the elaborationof the article should be specified.6.2 We emphasize that the authorship criteria should be based onthe uniform requirements of the ICMJE, which establish thefollowing: recognition of authorship should be based on substantialcontributions to the following: 1. conception and design, acquisitionof data, or analysis and interpretation of data; 2. drafting thearticle or revising it critically for important intellectual content; 3.final approval of the version to be published. Authors should meetall three conditions.

7. Acknowledgements

7.1 Potential acknowledgments include institutions that in some

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way allowed or facilitated the research and/or persons thatcollaborated with the study but fail to meet the authorship criteria.

8. References

8.1 References should be numbered consecutively in the order inwhich they first appear in the text. They should be identified bysuperscript Arabic numerals (e.g.: Silva 1). References cited only intables and figures should be numbered starting after the lastreference cited in the text. Cited references should be listed at theend of article, in numerical order, following the UniformRequirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals.8.2 All references should be presented in correct and completeform. The veracity of the information contained in the list ofreferences is the responsibility of the author(s).8.3 In case any reference management software like EndNote isused, the author(s) should convert the references to text.8.3 If using a references management software (EndNote, forexample), the authors should convert the references to text.

9. Nomenclature

9.1 The manuscript should comply with the rules of zoological andbotanical nomenclature, as well as with the abbreviations andconventions adopted in the specialized fields.

10. Ethics in research involving human subjects

10.1 The publication of articles with results of research involvinghuman subjects is conditioned on compliance with the ethicalprinciples contained in the Helsinki Declaration (1964, revised in1975, 1983, 1989, 1996, and 2000), of the World MedicalAssociation.10.2 In addition, the research must comply with the specificlegislation (when existing) of the country in which the research wasperformed. 10.3 Articles that present the results of research involving humansubjects must contain a clear statement of this compliance (thisstatement should be the last paragraph of the manuscript'sMethodology section). 10.4 After the manuscript is accepted for publication, all theauthors must sign a specific form, to be provided by the EditorialSecretariat of CSP, stating their full compliance with the ethicalprinciples and specific legislations.10.5 The Editorial Board of CSP reserves the right to requestadditional information on the ethical principles adopted in theresearch.

11. On-line submission process

11.1 Articles should be submitted electronically through theSystem for Article Review and Management (SAGAS), available at:http://cadernos.ensp.fiocruz.br/csp/index.php.11.2 No other forms of submission will be accepted. The followingare complete instructions for submission. In case of doubt, kindlycontact the SAGAS support system at the following e-mail: csp-artigos@ensp.fiocruz.br.11.3 The author should begin by entering SAGAS. Next, key in theuser name and password to go to the restricted articlemanagement area. New users of SAGAS should register through the“Register” link on the homepage. In case you have forgotten yourpassword, request that it be sent automatically as follows: “Forget

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your password? Click here”.11.4 For new users of SAGAS. After clicking on “Register”, you willbe directed to the SAGAS registry. Key in your name, address, e-mail, telephone, and institution.

12. Sending the article

12.1 On-line submission is done in the restricted articlemanagement area. The author should access “Author Central” andselect the link “Submit a new article”.12.2 The first stage in the submission process consists of checkingthe CSP Instructions to Authors.The manuscript will only be considered by the CSP EditorialSecretariat if it meets all the uniform requirements for publication.12.3 During the second stage, all data referring to the article willbe keyed in: title, short title, field, key words, disclosure of fundingand conflicts of interest, abstracts, and acknowledgments whennecessary. If they wish, authors may suggest potential peerreviewers (name, e-mail, and institution) whom they considercapable of reviewing the manuscript. 12.4 The complete title (in Portuguese, English and Spanish) shouldbe concise and informative, with a maximum of 150 characters withspaces. 12.5 The short title (in the original language) may contain amaximum of 70 characters with spaces. 12.6 The key words (minimum of 3, maximum of 5, in the article'soriginal language) should appear in the Biblioteca Virtual emSaúde/Virtual Health Library (BVS).12.7 Abstract. With the exception of contributions submitted tothe Book Review, Letters, or Perspectives sections, all articlessubmitted should include an abstract in Portuguese, English andSpanish. The abstract should have a maximum of 1,100 characterswith spaces.12.8 Acknowledgements. The acknowledgements of institutionsand/or individuals may contain a maximum of 500 characters withspaces.12.9 The third stage includes the full name(s) of the article'sauthor(s) and respective institutions(s), with the completeaddress, telephone, and e-mail, as well as a specification of eachauthor's contribution. The author that registers the article willautomatically be included as an author. The order of the authors'names should be the same as in the publication.12.10 The fourth stage is the file transfer with the body of thetext and references.12.11 The file containing the manuscript text should be formattedin DOC (Microsoft Word), RTF (Rich Text Format), or ODT (OpenDocument Text), and may not exceed 1 MB.12.12 The text should be formatted with 1.5cm spacing, fontTimes New Roman, size 12.12.13 The text file should contain only the body of the articleand the bibliographic references. The following items should beinserted in separate fields during the submission process:abstracts; name(s) of the author(s), plus institutional affiliation orany other information that identifies the author(s);acknowledgments and contributions; illustrations (photographs,flowcharts, maps, graphs, and tables).12.14 The fifth stage includes transferring the files with thearticle's illustrations (photographs, flowcharts, maps, graphs, andtables), when necessary. Each illustration should be sent in aseparate file, clicking on "Transfer"12.15 Illustrations. Illustrations should be kept to a minimum, as

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specified in item 1 (photographs, flowcharts, maps, graphs, andtables).12.16 Authors will cover the costs of illustrations that exceeds this

limit, as well as any extra costs for publishing color figures.12.17 Authors should obtain written authorization from anyrespective copyright holders to reproduce previously published

illustrations.12.18 Tables. Tables may be 17cm wide, considering a size 9 font.They should be submitted in text file: DOC (Microsoft Word), RTF(Rich Text Format), or ODT (Open Document Text). Tables shouldbe numbered (Arabic numerals) according to the order in which

they appear in the text.12.19 Figures. The following types of figures will be allowed byCSP: Maps, Graphs, Satellite Images, Photographs, Flow Diagrams,

and Flowcharts.12.20 Maps should be submitted in vector format, and thefollowing types of files are allowed: WMF (Windows MetaFile), EPS(Encapsuled PostScript), or SVG (Scalable Vectorial Graphics).Note: maps originally generated in raster or image format and later

exported to vector format will not be accepted.12.21 Graphs should be submitted in vector format and will beallowed in the following types of files: XLS (Microsoft Excel), ODS(Open Document Spreadsheet), WMF (Windows MetaFile), EPS

(Encapsuled PostScript), or SVG (Scalable Vectorial Graphics).12.22 Satellite images and photographs should be submitted in thefollowing types of files: TIFF (Tagged Image File Format) or BMP(Bitmap). Minimum resolution should be 300dpi (dots per inch), with

a minimum width of 17.5cm.12.23 Flow diagrams and flowcharts should be submitted in text fileor in vector format and will be allowed in the following types offiles: DOC (Microsoft Word), RTF (Rich Text Format), ODT (OpenDocument Text), WMF (Windows MetaFile), EPS (Encapsuled

PostScript), or SVG (Scalable Vectorial Graphics).12.24 Figures should be numbered (Arabic numerals) according to

the order in which they appear in the text.12.25 Titles and legends of figures should be presented in a text

file separate from the figure files.12.26 Vector format. A vector drawing is generated based ongeometric descriptions of shapes and normally consists of curves,ellipses, polygons, text, and other elements, i.e., using

mathematical vectors for its description.12.27 Completion of Submission. Upon completing the entire file

transfer process, click on "Complete Submission"12.28 Confirmation of Submission. After completing thesubmission, the author will receive an e-mail message confirmingreceipt of the article by CSP. In case you do not receive the e-mailconfirmation within 24 hours, contact the CSP Editorial Secretariatby e-mail: csp-artigos@ensp.fiocruz.br.

13. Monitoring the article review process

13.1 Authors can monitor the article's editorial flow through theSAGAS system. Decisions on the article will be communicated by e-mail and made available in the SAGAS system.

14. Sending new versions of articles

14.1 New versions of the article may be submitted by using therestricted article management area(http://cadernos.ensp.fiocruz.br/csp/index.php) in the SAGASsystem, accessing the article and clicking on the “Submit New

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Version”.

15. Electronic page proof

15.1 Following acceptance of the article, an electronic page proofwill be sent to the corresponding author by e-mail. Adobe Reader isneeded to view the proof. This software can be downloaded free ofcost from:http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. 15.2 The revised proof and properly signed declarations should besent to the CSP Editorial Secretariat by e-mail(cadernos@ensp.fiocruz.br) or fax +55(21)2598-2737, within 72hours after receipt by the corresponding author.

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