Trigo

Risco identificadoUma nova espécie de vírus, denominada Wheat stripe mosaic virus

(WhSMV), associada ao mosaico do trigo, foi identifica da através do usode técnicas avançadas de sequenciamento genético. A identificação correta

é essencial para apoiar os programas de melhoramento genético e arecomendação de medidas eficazes de manejo

Mosaico em trigo causado por vírus, cuja transmissãoestá ligada ao solo, ocorre em várias regiões produ-toras do mundo. No Brasil, se dá principalmente no

Rio Grande do Sul, em Santa Cat~rina e no Sul do Paraná. Estudosde caracterização de cultivares de trigo, indicadas para a regiãoonde predomina essa virose, revelam que, em áreas afetadas, aredução do potencial produtivo das cultivares suscetíveis está aoredor de 50%. Embora não devidamente quantificada, há uma

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percepção de aumento de áreas com mosaico e, consequente-mente, de seu impacto no rendimento do trigo. Além da vulne-rabilidade das cultivares, tem sido questionado se as práticasatuais nos sistemas de produção com uso de cereais de invernotêm levado ao aumento da incidência de mosaico-comum. Épossível que a compactação do solo, associada ao plantio diretoem sistema de sucessão trigo-soja, contribua para a expansão deáreas com danos à produtividade devido a essa virose.

No Brasil, a observação de sintomas de mosaico em trigotem mais de 40 anos. Conforme relatado por Caetano e colabo-radores em 1978, em estudo pioneiro que descreve a etiologiada doença no Brasil: "A preocupação dos triticultores com umadoença representada por sintomas de mosaico nas folhas e cujadisseminação estaria associada ao solo, data dos fins dos anos60". No final da década de 1970, a distribuição da doença já eraconsiderada generalizada nos trigais do Rio Grande do Sul. Àquelaépoca, os pesquisadores, utilizando as tecnologias disponíveis,concluíram que a disseminação natural pelo solo, associada ao"fungo não verdadeiro" Po/ymyxa graminis Led, à transmissãomecânica, às propriedades físicas in vitro do agente etiológico,bem como à morfologia de partículas virais em forma de bastone-tes associadas à infecção e à ultraestrutura dos tecidos afetados,sugeria que esta anomalia era causada pelo vírus do mosaico dotrigo, transmitido pelo solo (Soi/-borne wheat mosaic virus - Fu-rovirus) e descrito em IIlinois e Indiana nos Estados Unidos em1923 por McKinney. Além desse vírus, também se citou, poste-riormente, o Wheat Spind/e Streak Mosaic Virus (WSSMV), outrovírus transmitido por P.graminis e, possivelmente, associado aossintomas de mosaico em trigo no Brasil.

Ao longo destes 40 anos de história, com o surgimento detecnologias mais precisas para a identificação de vírus, como ostestes sorológicos e moleculares, foram realizadas várias tenta-tivas de implementá-Ias para melhorar o diagnóstico da doençano Brasil e para desenvolver conhecimento sobre o vírus e suainteração com a planta. Porém, de forma intrigante, todas as ten-tativas de detecção baseadas na pressuposição de que SBWMVou WSSMV seriam os agentes causais da doença em trigo noBrasil se mostraram sem sucesso.

A interação vírus-planta também alimentava o enigma. Em-bora no Brasil seja feita caracterização de cultivares, seleção degenótipos resistentes em campos com mosaico e estudos gené-

Elliot Watanabe Kitajima

Partkula vlral na forma de b••stonete rígido

l-eqlJenter1e'l'o encontrada em =mostras de t-igo

com s nto as de "1o~aICO comem do triqo

ticos de herança da resistência e herdabi-lidade, como o caso da cultivar brasileirade trigo Embrapa 16 (descrita como re-sistente ao SBWMV), afalta de ferramen-tas de diagnóstico preciso (antissoros esequências virais para detecção molecu-lar) dificultava o entendimento dos me-canismos de resistência. Testes recentesno Brasil, com a cultivar americana Karl92 (que contém um QTL de maior efei-to para resistência ao SBWMV, no braçolongo do cromossomo 50), demonstra-ram ser esta cultivar suscetível ao vírusdo mosaico-comum no Brasil. Reaçãocontraditória também foi observada paraoutras cultivares tidas como resistentesao SBWMV e/ou WSSMV Estesfatos, as-sociados a informações discrepantes dereação de cultivares entre locais e anosde cultivo, reforçavam a necessidade dese obter informações precisas sobre aidentidade e a variabilidade da popula-ção viral associada ao mosaico-comumno Brasil. Uma das hipóteses era de quemesmo pertencendo àsespéciesde vírusdescritas, a população viral no Brasil eratão divergente que interagia de formadistinta com as fontes de resistência, enão reagia com os antissoros e "primers"produzidos a partir de isolados virais deoutras regiões. Outra hipótese era de queoutra espécie de vírus estava associadaao mosaico do trigo. Entre o conjunto deespécies candidatadas estavam mais de20 espéciesde vírus pertencentes acinco

gêneros, Benyvirus, Furovirus, Pec/uvirus,Pomovirus e Bymovirus, que são conheci-das por serem transmitidas por plasmo-diophoromycetos, como P.graminis, paradiversas culturas.

A partir dos anos 2000, novas tecno-logiasde sequenciamento, denominadasde tecnologias de sequenciamento denova geração (Next Generation Sequen-cing ou NGS),começaram aser utilizadascomercialmente e evoluíram rapidamen-te. Todasessastecnologias promovem osequenciamento de ONA em platafor-mas capazes de gerar informação sobremilhões de pares de basesem um únicoprocedimento. Assim, genomas peque-nos, como os de bactérias e de algunseucariotos, podem ser montados comfacilidade. A caracterização molecular dediferentes espéciesvirais tem setornadomais acessívelcom o sequenciamento denova geração, permitindo o desenvolvi-mento de ferra mentas específicase segu-raspara o diagnóstico de tais vírus. O fatode realizar sequenciamento de maneiranão direcionada permite explorar toda agama de vírus que possa estar associadaa uma patologia.

Assim foi descoberto o Wheat Stripe

Mosaic Virus (WhSMV). Primeiramente, foramcoletadas amostras de oito cultivares de trigocom sintomas típicos de mosaico-comum. Aárea onde essas plantas foram coletadas temlongo histórico da doença. Nas raízesdas plan-tas com mosaico frequentemente se encontrao veto r P.graminis, e a análise ao microscópioeletrônico revelou a presença de partículas emforma de bastonete rígido. Até então, todos osdescritores estavam coerentes com a presençade um furovírus como o SBWMV Além disso,o extrato obtido dessas plantas quando ino-culado em Chenopodium amaranticolor (umaplanta indicadora de vírus) produz reações lo-cais,o que é esperado para um furovírus comoo SBWMV Na busca pelo material genéticoviral, das plantas coletadas, foi extraído o áci-do ribonucleico (RNA). O genoma da grandemaioria dos vírus de planta é constituído deRNA (diferentemente de bactérias e organis-mos eucariotos como o ser humano, cujo ge-noma é de ONA- ácido desoxirribonucleico).Na célula das plantas hospedeiras onde osvírus se multiplicam, existem vários tipos deRNA. Nessa pesquisa foi utilizado um métodopara extração de RNAtotal (todos os tipos deRNA)seguido de uma etapa que enriqueceu aamostra para RNAde dupla fita (double stran-ded RNA- dsRNA). Como os vírus em sua fase

Análises de bioinformática após sequenciamento de nova geração para obtenção de sequências virais

Sequenciamento • Reads • Qualidade FastQCde Nova geração

~

Mapeamento • •genoma do trigo Montagem Trinity Limpeza Trimmomatic

BWA

~

% Mapeada • Montagem • Montagem CAP 3% Não Mapeada Trinity/Velvet

~

• Blast X + •Espécies ViraisAlinhamento Contigs

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Representação diagramática do genoma e das estratégias de tradução das regiões codificadoras do WhSM\f.O círculo preto representa a estrutura de CAP na extremidade 5' e A(n) da cauda poliadenilada na extre-midade 3'. Replicase, CP e RTD estão associadas a replicação, formação da capa proteica e transmissão,respectivamente. A partir dos RNAssubgenômicos podem ser produzidas as três proteínas associadas aomovimento (TGB 1,2 e 3) e a proteína hipotética (sem função conhecida) (Adaptado de Valente et ai, 2019)

r--------.I I

6583~:o~nts 5' --.. __ ~ ~O~I.-_· ! __ ~ __ ...•.-Ao 3'Replicase - 231.7 Kda :.

165.6 Kda

Códon de terminação"readthrough"

66.1 Kda

Bloco triplo de ganes - TGB

ORF 4 ORF 6--'--Ao 3'RNA24819 - 4901 nts

ORF25'-I::~mi~~EE~~~~:-~ORF3

CP 18.9 KDa 1 ORF 55'---------------------------- 3' RNAsubgenômicoli

5'----------- 3' RNAsubgenômico b

5'----.3' RHAsubgenômico c

'-- -:...._.•._...............• TGB 1- 54.6 KDa

...........• TGB 2-13.8 KDa

.. · ..• TGB 3-12.8 KDa

1·•.Proreina hIpotétIca - 2.8 KDa

replicativa na célula hospedeira utilizam seupróprio RNA como molde, ocorre a formaçãode RNAdupla fita, assim, o enriquecimento daamostra para dsRNA amplia as chances de seencontrar sequências gênicasvirais.Após análi-se de qualidade e quantidade do RNAextraído,o mesmo foi submetido ao sequenciamento.Primeiramente, o RNAfoi convertido em DNApara constituir uma "biblioteca" de fragmentosaserem sequenciados. Decada uma dasamos-tras que foram sequenciadas, foram geradasaproximadamente 30 milhões de pequenassequências de 100 pares de bases.A etapa se-guinte foi a análise de bioinformática. Análisesde bioinformática são usadas para juntar (porcomplementariedade) essesfragmentos, per-mitindo a montagem do genoma vira!

Ogenoma obtido foi então comparado comgenomas virais disponíveis em bancos interna-cionais de sequências (bancos que reúnem assequências nucleotídicas obtidas por laborató-rios de todo o mundo, ou seja, nesse caso quecontêm as sequências dos vírus atualmenteconhecidos pela comunidade científica). Essacomparação revelou que a identidade de sequ-ências de nucleotídeos com vírus relacionadosjá conhecidos é de, aproximadamente, 50%.Ou seja,o vírus encontrado nasamostras é umanova espécie até então desconhecida. Essevírus tem dois RNAsgenômicos e suas sequ-ências e organização genômica indicaram queo vírus se enquadra em um grupo distinto doque era hipotetizado originalmente. Ao invés

de um furovírus, o vírus do mosaico dotrigo se assemelha mais aos membros dafamília Benyviridae. Atualmente, apenaso gênero Benyvirus compõe essafamília,na qual, Beet Necrotic Yellow Vein Virus(BNYVV)é a espécie tipo. Nesse gênerotambém estão classificadosBeet Soil-Bor-ne Mosaic Virus (BSBMV),Burdock Mot-tle Virus (BdMV) eRice Stripe NecrosisVirus (RSNV).BNYVVe BSBMVsãoencon-trados naturalmente infectando espéciesde plantas da família Amaranthaceae,especialmente Beta Vulgaris. BNYVV éresponsável por causar a doença conhe-cida como rizomania, uma das doençasde maior importância econômica na cul-tura da beterraba açucareira no mundo,enquanto BSBMV causa o mosaico dabeterraba e é restrito a algumas regiõesdos Estados Unidos. O RSNVocorre naÁfrica e nas américas do Sule Central, in-fectando poáceas, originalmente o arroz.BdMV foi descrito no Japão, infectandouma espécie de bardana comestível. NoBrasil,os benyvírus BNYVVe RSNVforamreportados recentemente.

Para confirmar que o mosaico dotrigo está associado ao WhSMV, foramdesenhados primers, pequenas sequ-ências de nucleotldeos que se ligamespecificamente a sequências comple-mentares. Por meio da reação em cadeiada polimerase (conhecida como PCR),é

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possível amplificar fragmentos que cor-respondem a regiões do genoma do alvopara os quais se desenharam os primers.Usando essa estratégia foi possível de-monstrar que o WhSMV está presenteem amostras de trigo com sintomas demosaico-comum coletadas em regiõesdo Rio Grande do Sul e Paraná. Estesre-sultados não excluem a possibilidade deque outros vírus estejam associados aossintomas de mosaico em trigo no Brasil.No entanto, WhSMVtem sido consisten-temente encontrado nas amostras comsintomas típicos dessa patologia.

Novos estudos ainda serão neces-sários para esclarecer dúvidas sobre aorigem do novo vírus, sua distribuiçãogeográfica, sua variabilidade genética ecomo afeta a resistência das plantas. Fatocurioso é que a história do vírus do mo-saico do trigo no Brasilse assemelha, emparte, à história do Rice Stripe NecrosisVirus (RSNV).Essevírus foi descrito emarroz (Oryzasativa) em 1977, na CostadoMarfim (Oeste da África). No continenteamericano foi relatado primeiramente naColômbia, depois no Equador, Panamá eBrasil e, mais recentemente, na Argenti-na. RSNVtambém é transmitido por P.graminis e tem partículas na forma debastonete rígido, e achava-seque era umFurovirus. Porém, o sequenciamento doseu genoma evidenciou que se trata deum Benyvirus. Teriam o WhSMV e RSNValguma história evolutiva em comum?

ETAPAS FUTU RASA identificação correta dos vírus é

essencial para apoiar os programas demelhoramento genético do trigo e arecomendação de medidas eficazes demanejo. Por ser uma doença de difícilcontrole, a resistênciagenética ao mosai-co do trigo tem sido a principal estratégiautilizada, desta forma esta doença é umdos principais focos dos programas demelhoramento de trigo no Brasil.Sem oconhecimento do agente causal, gasta-vam-se muito tempo e espaço tentandoachar locais apropriados para seleção demateriais através da fenotipagem das li-nhagens, uma vez que o uso de marca-dores moleculares definidos no exteriorapresenta resultados inconsistentes.Com a descoberta deste novo vírus serápossível mapear os genes de resistência

Matrizrepresentandoo percentualde identidadedos isoladosde WhSMVem relaçãoa outrosvírusda famíliaBenyviridaepara RNA1, RNA2 e todasas regiõescodificadoras(Open Reading Frames - ORFs),excetoa ORF6. Fonte:extraídode PlantPathology(Valenteet aI, 2019)

RNA1 RNA21. WlSM\I-' 1.'MlSW-1 1. 'MSMI·'

2. V\tISM\f-2 2. WlSW-2 2. WiSMI-2

3. V\otISMV-3 3.IMlSMl-3 3. WtSMJ-3

4. \M1SMV-4 4. W1SMJ-4 4. WlSMI-4

5. WlSW-5 5.'M1SW-S 5.'MSW-S

6. WlSW-6 6.KV 6. WlSMI-6

7.MLV " .. •• -e •• -e 7.RSMI -o ez 43 e .c .. 7. '"'-V

8. RSNV 49 .. 50 49 .. .. 52 8.BdMl .e es 45 45 45 " .. 8. RSMI

9. BdMV 49 .. 49 •• 49 49 52 " 9.8NYVV a " " " " " 50 " 9.BdW

10. BNYVV ec " " " 50 " 54 55 59 10. BSSMJ 46 46 st " " .. 50 52 70 10.BNYVV

11. BSBMV .. 50 50 50 50 50 53 55 59 (1( 12( (3( (4( (5( (6( (7( (8( (9( (10( 11.BSBMJ

(1( (2( (~ (4( (5( (6J (7J (8( (9J (101l11(

ORF2A

8.8dMJ 49494949494448 4846

9.8NYVV 51 51 51 51 51 46 54 55 75

10.BSBMJ 49 49 49 49 49 .45 53 52 7J

(1( (2( (3( (4( (5( (6J 17( (8( (9( (10(

1. WlSMI-'

2.WlSW-2 •

3. W1SMI-3

4. WlSW-4

5. WlSW-5

6.M..V

7.RSN\I

1. WlSMV-1

2. WlSMV-2 l!f1

3. WlSMV-3

4. WlSMV-4

5. WlSMV-5

6. RSNV

7. BdMV

8.8NYVV

9. BSBMV

(1( (2J (3( (4( (51 (6( (7J (BJ (9J

e desenvolver marcadores moleculares confiáveis para auxiliarna seleção de genótipos resistentes. Com isso, os programas demelhoramento genético ganham eficiência e agilidade, e os pro-dutores mais segurança para o cultivo do trigo nas regiões ondeesta doença ocorre.

REDE DE PESQUISAMOSAICO-COMUM DO TRIGOA identificação de uma nova espécie viral associada ao mosaico

do trigo é o primeiro resultado divulgado pelo projeto "Análise dapopulação viral e estratégias de manejo para o mosaico comumem trigo no Brasil". Além de identificar com maior precisão os di-ferentes vírus que causam o mosaico do trigo, o projeto tambémavalia a eficiência de estratégias genéticas, químicas e culturaisno controle da doença.

O projeto foi estruturado de forma multi-institucional, com-binando universidades e empresas de pesquisa públicas e pri-vadas. Etapas do sequenciamento e análise da variabilidade dapopulação viral estão sendo realizadas na Universidade do Estadode Santa Catarina (Udesc), com apoio da Embrapa Uva e Vinhoe da Embrapa Informática Agropecuária. A caracterização feno-típica, a análise da população viral e a avaliação das práticas demanejo estão sendo executadas em rede de ensaios de camponas regiões tritícolas do Sul do Brasil e conduzidas pela BiotrigoGenética, CCGL Tecnologia, Embrapa Trigo, Fundação ABC e ORMelhoramento de Sementes. No total, serão quatro anos de

eou.",..,c.,

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Õiii

l.WlSMJ-l '''.E.,',~2. WlSW-2

3.'MlSMI-3

4. WlSMI-4

5.W1SMI-5 •••••••••••••••.•

6.~V

7.RSMI

51 51 51 51 57 51 51 «45 44 B. BdM/

ss 55 55 ss 55 55 51 52 54 52 9. BHYVV 51 50 50 50 50 42 46 48 59

53 54 54 54 54 54 51 53 56 84 10. BSBMV 51 51 51 51 51 41 45 46 52

(1( 12( (31 (4( (5( (61 (7( (8( (91 (10(

(1( 12( (3( (4( (5( (61 (7J 18( (9( (101111

1. WlSMoI-1

2. WlSMoI-2

3. WlSW-3

4. WlSMV-4

5. W1SMJ-5 •••• _ •••••

8. RSNV

7. BdMV

8. BtNW

9.BSBMI

1. WlSMoI-1

2. WlSMI-2

3. WlSMI/-3

4. 'MISMI/-4

5. 'MISMI-5

6.~V7. RSNV

B.BdW 55$5555555454 5153

9.Btl'fW 51 51 51 51 51 51 51 51 12

10.BS8rYf.I st 57 57 57 57 51 51 58 10

(1( 12( (3( (4( (5( (8( 17( (BJ (9( (10(

••(1( 12( (3( (4( (51 (6( (7J (BJ (9J

pesquisa, com experimentos em sete municípios do Rio Grandedo Sul e do Paraná. Como resultados, objetiva-se determinar avariabilidade genética da população viral e a eficiência de estra-tégias genéticas, químicas e culturais para o adequado manejodo mosaico-comum do trigo. ~

Anderson SantiEmbrapa Trigo

Antônio Nhani JuniorEmbrapa Informática Agropecuária

Caroline Wesp GuterresCCGLTEC

Douglas LauEmbrapa Trigo

Fabio Nascimento da SilvaUDESC

Fernando Sartori PereiraUdesc

Genei DalmagoEmbrapa Trigo

Juliana Borba ValenteUdesc

Lucas Antônio StempkowskiUdesc

Osmar RodriguesEmbrapa TrigoPaulo Kuhnem

Biotrigo GenéticaRicardo Trezzi Casa

UdescSandra Maria Zoldan

OR SementesSenio José Napoli Prestes

Fundação ABCThor Vinícius Martins Fajardo

Embrapa Uva e Vinho

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