instituto nacional de pesquisas da amazônia - inpa...

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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA

Programa de Pós-Graduação em Entomologia

Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis

rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel &

Adler) (Diptera: Simuliidae)

Juciane Conceição da Silva

Manaus, Amazonas

Abril de 2014

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Juciane Conceição da Silva

Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em Ectemnaspis

rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis trombetense (Hamada, Py-Daniel &

Adler) (Diptera: Simuliidae)

Orientador: Dr. Jansen Fernandes de Medeiros

Coorientador: Dr. Felipe Arley Costa Pessoa

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Entomologia do Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Ciências Biológicas, área de

concentração em Entomologia.

Manaus, Amazonas

Abril de 2014

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Banca Examinadora da Defesa Pública Presencial

TITULARES:

Dr. Wanderli Pedro Tadei

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Dr. Cristovão Alves da Costa


Dra. Ormezinda Celeste Cristo Fernandes

Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazonas

SUPRENTES:

Dr. Wuelton Marcelo Monteiro

Fundação de Medicina Tropical

Dr. João Antonio Cyrino Zequi


Dissertação defendida e aprovada em: 28/04/2014

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Ficha Catalográfica

Sinopse:

Foram identificadas, caracterizadas e contabilizadas os tipos celulares do

sistema de defesa (hemócitos) nos diferentes estágios de vida, larva, pupa e adultos

das espécies Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis

trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle). Foram identificados quatro tipos

celulares: prohemócitos, granulócitos, oenocitóide e plasmatócitos.

Palavras-chave: Microscopia óptica, Microscopia eletrônica de transmissão, células.

S586 Silva, Juciane Conceição da

Identificação e caracterização morfológica de hemócitos em

Ectemnaspis rorotaense (Floch & Abonnenc) e Ectemnaspis

trombetense (Hamada, Py-Daniel & Adle) (Diptera: Simuliidae) /

Juciane Conceição da Silva. --- Manaus: [s.n], 2014

Xv, 66f.: il. Color.

Dissertação (mestrado) ---INPA, Manaus, 2014.

Orientador: Jansen Fernandes -Medeiros

Co-orientador: Felipe Arley Costa Pessoa,

Área de concentração: Entomologia

1. Microscopia óptica. 2. Simulídeos, 3. Hemócitos. I. Título

CDD 595.77

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Dedico

Aos meus pais, Terezinha e Francisco (in

Memoriam) e a meus irmãos, Janaina, Neto, Joene,

Joelma, Jarlene e Jaeliton.

A meu esposo Flávio por estar sempre ao meu

lado em todos os momentos e a minha filha Sarah

Leticia, minha fonte de inspiração.

vi

Agradecimentos

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao Programa de Pós-

Graduação em Entomologia, e aos professores do curso de mestrado que contribuíram para

a minha formação profissional durante essa jornada.

Ao Instituto Leônidas e Maria Deane pela estrutura laboratorial e logística

disponibilizada na realização desse trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal em Nível Superior, CAPES, pela

concessão da bolsa de mestrado.

Ao Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, pela estrutura laboratorial para

realização de uma parte desse trabalho.

Aos meus orientadores Dr. Jansen Fernandes Medeiros e Dr. Felipe Arley Costa

Pessoa pela orientação, pelos ensinamentos científicos, companheirismo, paciência e

principalmente por não medirem esforços para que fosse possível a realização desse

trabalho.

Aos Doutores Fábio Brayner e Luiz Alves que foram essenciais para obtenção dos

resultados desse trabalho, obrigada pela oportunidade de fazer estágio no laboratório de

Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE, pelos ensinamentos e a também pela

amizade. Serei eternamente grata por tudo.

À Dra. Claudia Maria Rios Velásquez pelos ensinamentos, disponibilidade de

tempo e valiosas sugestões durante a execução desse trabalho.

A meu esposo Flávio, pelo companheirismo, atenção, paciência e principalmente

por entender minha ausência em alguns momentos.

À minha filha Sarah Letícia, minha fonte de inspiração e de incentivo.

À minha família, minha mãe Terezinha e meus irmãos Janaina, Neto, Joene,

Joelma, Jarlene e Jaeliton, pelo amor e apoio em todos os momentos da minha vida.

vii

À Dra. Helena Araújo, pelo treinamento inicial que possibilitou a execução da

metodologia desse trabalho.

À Dra. Giselle Almeida Oliveira, pelas contribuições e valiosas sugestões durante

minha preparação para aula de qualificação.

Aos amigos mestrandos do laboratório EDTA, Antônio e Emanuelle, pela ajuda

nas coletas, pelo companheirismo, discussões científicas, é muito bom saber que sempre

posso contar com vocês.

À doutoranda Ana Paula Sampaio, pela ajuda no processamento de material e

por ter mim acolhido durante meu estágio no Laboratório de Biologia Celular e Molecular

da FIOCRUZ-PE. Obrigada amiga.

Ao amigo Rafael Padilha do laboratório de Microscopia eletrônica do LIKA, pelo

auxilio no processamento de material e na obtenção de imagens.

A toda equipe do laboratório de Biologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-PE,

em especial aos colegas Gabriel e Cássia pelo treinamento durante meu estágio.

Aos bolsistas de iniciação cientifica do Laboratório de Ecologia de Doenças

Transmissíveis na Amazônia, Jéssica, Eric, Jordan e Maria, pelo companheirismo e ajuda

nas coletas de campo e em especial a Jeane pelo auxilio e companhia no processamento de

material.

Aos técnicos do ILMD Patrícia Mello amizade e Diego Leite e Ricardo Motta,

pelo auxilio nas coletas de campo, pelos momentos de descontração e principalmente pela

amizade.

Aos amigos e companheiros de café, Vagner Bastos e Tatiane Becker, pela

companhia e ajuda na etapa de finalização do trabalho.

Aos colegas do ILMD, Mary, Katiane, Valdinete, Tatiane, George e Victor, pelas

palavras de incentivo e pela amizade.

viii

A toda turma de Entomologia 2012, pelos momentos de alegria e de

companheirismo durante essa jornada em especial ao amigo Leandro Leal, pelas discursões

cientifica e por sempre estar disposto a ajudar.

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“O sucesso nasce do querer, da determinação e

persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo

não atingindo o alvo, quem busca e vence

obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”.

José de Alencar

x

Resumo

Os simulídeos são insetos de interesse médico-veterinário por veicularem diferentes

organismos patogênicos aos homens e animais, entretanto pouco se conhece sobre o sistema

de defesa contra ação de patógenos nesses insetos. Os hemócitos são células do sistema imune

dos insetos e entre as principais funções desenvolvidas por essas células estão à fagocitose, a

encapsulação e a coagulação. Esse trabalho foi realizado com duas espécies de Simuliidae do

estado do Amazonas e teve como objetivos identificar e caracterizar os tipos de hemócitos

encontrados na hemolinfa de Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense. Os

simulídeos (larvas e pupas) foram coletados no município de Presidente Figueiredo, estado do

Amazonas. As células foram caracterizadas através da microscopia óptica e microscopia

eletrônica de transmissão. A contagem diferencial das células foi realizada através do

microscópio de luz em campo claro e para diferenciação celular foram consideradas

características morfológicas. Foram identificadas quatro tipos de células na hemolinfa de

larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense: prohemócitos, plasmatócitos,

granulócitos e oenocitóides. Os prohemócitos foram as menores células observadas, sendo

caracterizadas pela presença de um núcleo volumoso em relação ao citoplasma. Os

granulócitos são caracterizados pela presença grânulos, apresentando variação no tamanho e

na forma. Nessas células também foi observado um núcleo grande e excêntrico. Os

oenocitóides possuem núcleo pouco desenvolvido que geralmente está localizado na região

central. Os plasmatócitos observados apresentaram grandes projeções da membrana

citoplasmática e foi o tipo celular que apresentou maior variação morfológica. Em E.

rorotaense foi encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos

em pupa e prohemócitos no adulto. Enquanto em E. trombetense os prohemócitos foi mais

abundantes no estágio de larva, os plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em

adultos. Esse estudo de caracterização celular pode ser utilizado como modelo para futuros

estudos em espécies de simulídeos vetoras.

xi

Abstract

The black flies are insects of medical and veterinary importance due to transmit different

pathogens to humans and animals however, little is known about the action of defense system

of these insects against infection of these pathogens. The hemocytes are cells of

immunological system of insects and their functions are to realize phagocytosis, and participte

of coagulation process and encapsulation. The aims of this work were to identify and

characterize hemocyte types found in Ectemnaspis rorotaense and E. trombetense. The black

flies (larvae and pupae) were collected in Presidente Figueiredo municipality, Amazonas

state, Brazil. The cells were characterized by optical and transmission electron microscopy.

The differential count of cells was performed by light microscopy and to cell differentiation

was used morphological characters. The types of cells found in hemolymph were

prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The prohemocytes were smallest

cells observed and characterized by the presence of a large nuclei compared to the cytoplasm.

The granulocytes are characterized by the presence of granules with variation in size and

shape. This cells were observed large and eccentric nucleus. The oenocytoids have less

developed nucleus and located in the central region. The plasmatocytes showed many

morphological variations and large projections in cytoplasmatic membrane. In E. rorotaense

was found a large number of plasmatocytes, granulocytes and prohemocytes respectively in

stages of larvae, pupae, and adults. While in E. trombetense was found was found a large

number of prohemocytes, plasmatocytes respectively in larvae and pupae, and the same

amount of plasmatocytes and granulocytes in adults. This study cell characterization can be

used as a model for future studies on species of blackfly vectors.

xii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... XIV

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ XVII

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 18

FAMÍLIA SIMULIIDAE ............................................................................................................. 18

1.1. Características gerais e distribuição ........................................................................... 18

1.2. Biologia e ecologia ..................................................................................................... 18

1.3. Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae ................................... 20

1.4. Estudos com Simuliidae na Amazônia ....................................................................... 21

1.5. Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense................................................... 22

1.6. Mecanismo de defesa dos insetos............................................................................... 24

1. 6. 1. Hemolinfa .............................................................................................................. 25

1. 6. 2. Hemócitos.............................................................................................................. 25

1. 6. 3. Estudos com hemócitos de insetos ........................................................................ 27

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 29

2. 1. Objetivo Geral ........................................................................................................... 29

2. 2. Objetivos específicos................................................................................................. 29

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 30

3. 1. Coleta de simulídeos ................................................................................................. 30

3. 2. Coleta de hemolinfa .................................................................................................. 32

3. 3. Microscopia de Luz ................................................................................................... 33

3. 4. Contagem diferencial de hemócitos .......................................................................... 34

3. 5. Microscopia Eletrônica de Transmissão ................................................................... 35

4. RESULTADOS .................................................................................................................... 37

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS HEMÓCITOS DE ECTEMNASPIS ROROTAENSE E

ECTEMNASPIS TROMBETENSE. .................................................................................................. 37

Prohemócitos ..................................................................................................................... 37

Granulócitos ...................................................................................................................... 37

Oenocitóides ...................................................................................................................... 38

Plasmatócitos ..................................................................................................................... 38

xiii

CONTAGEM DIFERENCIAL DOS HEMÓCITOS EM LARVAS, PUPAS E ADULTOS DE ECTEMNASPIS

ROROTAENSE E DE ECTEMNASPIS TROMBETENSE. ...................................................................... 46

5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 49

6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 55

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 56

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis

trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de

Presidente Figueiredo . (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta..30

Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e

Ectemnaspis trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da

Pantera no Km 20, Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil. .......................... 31

Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e

transporte de substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual

das pupas das espécies das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis.

rorotaense e Ectemnaspis trombetense. ................................................................................... 32

Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) -

Sistema utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de

vidro, 3- Suporte para capilar); (c) – Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de

simulídeo ( 1- Capilar inoculando anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ). .................... 33

Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia

òptica. (a) - Kit Panótico® para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) -

Microscópio òptico .................................................................................................................. 34

Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em

resina; (b) - Ultramicrometro, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em

resina; (c) - Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células

.................................................................................................................................................. 36

Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis. rorotaense em microscopia óptica.

(A) Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma; (B)

Granulócito apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina

vermelha); (C) Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina); (D)

Plasmatócito com visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo

centralizado (seta fina).............................................................................................................. 39

xv

Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica.

(A) - Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma,

(B) – Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo

grande localizado centralmente (seta fina); (C) Oenocitóide com um núcleo pouco

desenvolvido (seta fina); (D) - Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana

citoplasmatica (seta grossa). . ................................................................................................... 40

Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia

eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V),

citoplasma com algumas mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito

com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da

membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (ve). (C)

Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m),

vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo forma alongada e

projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias

(m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re). .................................................................. 41

Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia

eletrônica de transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V),

citoplasma com pequena projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e

reticulo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo

(N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo endoplasmático

(Re), grânulos (G) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no

citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D)

Plasmatócito exibindo forma alongada, no citoplasma apresenta mitocôndrias (m), vesícula

(Ve) e retículo endoplasmático (Re). ........................................................................................ 42

Figura 11: Diferenças morfológicas observadas em hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e

Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando

diferentes padrões de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a

presença de pequenas projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos

apresentando membrana plasmática irregular e com presença de visíveis grânulos. . ............. 43

xvi


Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações

morfológicas, células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou

deslocado. (C-F) Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com

longas projeções da membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas

células foi observado um núcleo deslocado. ........................................................................... 44

Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense

e E. trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma

irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais

arredondada apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito

com pequenas projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande

número de vacúolos no citoplasma ........................................................................................... 45

Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na

cachoeira Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente

Figueiredo, estado do Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que

houve uma diferença significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de Student-

Newman-Keuls. ........................................................................................................................ 47

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos

encontrados em larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na

Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente

Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil. ................................................................................. 46


encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da

Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do

Amazonas, Brasil. ..................................................................................................................... 47


encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos na espécie Ectemnaspis trombetense,

coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da Pantera, Km 20 no município de

Presidente Figueiredo, estado do Amazonas. ........................................................................... 48


encontrados na hemolinfa de adultos de Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da


Amazonas, Brasil. ..................................................................................................................... 48

18

1. INTRODUÇÃO

Família Simuliidae

1.1. Características gerais e distribuição

Os simulídeos são conhecidos popularmente no Brasil, como borrachudos ou

piuns. Pertencem à ordem Diptera, subordem Nematocera, infraordem Culicomorpha,

superfamília Simulioidea e família Simuliidae (Borkent 2012). Essa família está subdividida

nas subfamílias Parasimuliinae que tem distribuição no Neártico, e Simuliinae que é

cosmopolita (Adler e Crosskey 2014).

Dentre os dípteros, a família Simuliidae é uma das mais estudadas, com 2.163

espécies listadas no mundo, sendo 330 registradas para a região Neotropical. No Brasil são

conhecidas 90 espécies, das quais 25 são registradas para o estado do Amazonas (Adler e

Crosskey 2014).

1.2. Biologia e ecologia

Os simulídeos são insetos holometábolos passando durante seu ciclo de vida pelos

estágios de ovo, larva, pupa, que se desenvolvem em ambiente aquático, e adulto em ambiente

terreste (Crosskey 1990).

As fêmeas ovipositam sobre substratos submersos (pedras e vegetações) em rios,

igarapés, cachoeiras e corredeiras. Em cada postura são colocados em média de 100 a 600

ovos (Crosskey 1990). Esses são muito pequenos com cerca 100 a 400µm, forma ovóide e são

revestidos por uma massa gelatinosa, esse estágio dura em média cerca de quatro a cinco dias

em espécies neotropicais (Petry et al. 2006).

19

As larvas vivem fixas a diferentes substratos, como folhas, raízes, galhos, pedras e

objetos presos à correnteza, podendo ocupar ambientes antropizados ou preservados (Hamada

1989; Hamada e Adler 2001). Durante essa fase se alimentam de matéria orgânica, bactérias,

algas e zooplancton (Crosskey 1990; Shelley et al. 2010). As larvas passam por sete a nove

estádios dependendo da espécie e das condições ambientais (Crosskey 1990). A espécie

Psaroniocompsa incrustata (Lutz) passa por oito estádios larvais no nordeste brasileiro (Silva

et al. 2008).

As pupas dos simulídeos são coniformes, possuem um par de filamentos

brânquias projetadas na área do tórax, vivem aderidas aos substratos. Esse estágio dura entre

quatro a cinco dias em espécies na região neotropical. Após este período o adulto emerge

dentro de uma bolha que estoura ao entrar em contato com o ar (Coscarón e Coscarón - Arias

2007). Os estágios imaturos (larva e pupa) são importantes para determinação taxonômica do

grupo (Hamada e Adler 2001).

Os adultos possuem aproximadamente entre 2 a 4 mm de comprimento, antenas

curtas geralmente com 11 segmentos, aparelho bucal tipo sugador cortador de pele com uma

probóscide curta e robusta, tórax arqueado, asas largas e hialinas, pernas curtas, corpo

geralmente escuro ou negro e algumas vezes castanho - avermelhado ou amarelado (Coscarón

e Coscarón - Arias 2007; Shelley et al. 2010). São facilmente reconhecidos pelo tipo de

antenas, padrão de coloração do tórax e venação das asas (Adler e Currie 2009). Possuem

hábito diurno, em algumas espécies ambos os sexos utilizam néctar das flores, seiva de

plantas e sucos de frutas como fonte de alimento (Crosskey 1990; Medeiros et al. 2008). As

fêmeas de algumas espécies são hematófagas, podendo ser transmissoras de agentes

patogênicos para o homem e outros animais (Crosskey 1990).

20

1.3. Importância médica, veterinária e econômica dos Simuliidae

As fêmeas hematófagas de algumas espécies são vetores de diversos patógenos

como vírus, bactérias, protozoários e helmintos para humanos e outros animais (Crosskey

1990; Coscarón e Coscarón- Arias 2007).

Dentre os patógenos transmitidos ao homem destaca-se a filária Onchocerca

volvulus (Leuckart), causadora da oncocercose (cegueira dos rios), doença caracterizada pela

formação de nódulos subcutâneos, prurido, alterações na pele e, na forma mais grave, pode

levar a cegueira (Moraes et al. 1972; Moraes 1991). No Brasil é encontrada na área indígena

Yanomami, localizada ao norte do estado do Amazonas e Roraima (Moraes et al. 1974;

Moraes e Chaves 1974).

Também são transmissores da Mansonella ozzardi (Manson), agente etiológico da

mansonelose, que tem distribuição restrita em alguns países da América do Sul (Tavares

1981). No Brasil já foi encontrada nos estados do Amazonas, Mato Grosso, Roraima, Acre e

Rôndonia (Deane 1949; Oliveira 1963; D’Andretta et al. 1969; Adami et al. 2014; Velasques

2013).

Os simulídeos são considerados como possíveis agentes do Pênfigo Foliáceo ou

Fogo Selvagem, uma doença autoimune e endêmica caracterizada pela formação de bolha na

pele e lesões cutâneas (Zaitz et al. 2000). Acredita-se que essa doença seja desencadeada por

alergias a substâncias encontradas na saliva desses insetos (Diaz et al. 1989). Na região Norte

do Brasil esses insetos também foram apontados como causadores da Síndrome Hemorrágica

de Altamira (SHA), uma púrpura trombocitopênica caracterizada por hemorragias cutâneas, e,

em alguns casos, sangramento das mucosas. Essa síndrome é possivelmente causada pela

21

hipersensibilidade à secreção salivar, após a exposição a um grande número de picadas de

algumas espécies de simulídeos (Pinheiro et al. 1974; Costa-júnior et al. 1997).

Esses insetos também são causadores em alguns locais de sérios danos

econômicos no setor veterinário, uma vez que são transmissores de diversos patógenos aos

animais. Na América do Norte são apontados como transmissores do protozoário

Leucocytozoon Berestneff, que causa leucocitozoonose ou malária das aves, presente

principalmente em perus, frangos, patos e gansos. Também são vetores da oncocercose

bovina, uma infecção não patogênica causada por várias espécies de nematódeos do gênero

Onchocerca. Além disso, as picadas desses insetos podem causar reações alérgicas em alguns

animais, além do stress que consequentemente provoca a redução na produção de leite, da

carne bovina e de ovos em aves (Crosskey 1990). Na América Latina foram apontados como

prováveis vetores da Encefalite Equina, doença que pode afetar o homem de forma

circunstancial (Homan et al. 1985).

As picadas desses insetos muitas vezes além de incômodo podem causar reações

alérgicas no homem e consequentemente influenciar de forma negativa na economia e no

turismo dessas áreas afetadas (Crosskey 1990). Um exemplo é a espécie Chirostibia pertinax

(Kollar) que, no estado de São Paulo, causa prejuízos econômicos nos setores da pecuária e

turismo devido à sua abundância e voracidade (Araújo-Coutinho et al. 1988).

1.4. Estudos com Simuliidae na Amazônia

Devido a importância dos simulídeos e a sua participação no ciclo de transmissão

de diferentes agentes patogênicos para o homem, no estado do Amazonas vários estudos

foram realizados com esses insetos.

22

Até o presente seis espécie de simulídeos tem sido incriminada como vetoras de

filárias para o homem: Thyrsopelma guianense (Wilse), Notolepria exiguua (Roubaud),

Psaroniocompsa incrustata (Lutz), Cerqueirellum oyapockense (Floch e Abonnenc),

Cerqueirellum amazonicum (Goeldi) e Cerqueirellum argentiscutum (Cerqueira 1959;

Shelley e Shelley 1976; Shelley et al. 1980; Moraes et al. 1985; Shelley et al. 1997; Py-

Daniel et al. 2000).

Além dessas espécies, relativamente bem conhecidas, existem vários estudos com

outras espécies de simulídeos no estado do Amazonas, referentes à biologia (Hamada 1998),

ecologia (Hamada 1998; Medeiros et al. 2008), taxonomia clássica e molecular (Hamada e

Adler 1998; Hamada e Adler 2001; Velásquez et al. 2002; Scarpassa e Hamada 2003; Py-

Daniel et al. 2005; Alvan-Aguilar et al. 2005; Pessoa et al. 2008; Hamada et al. 2008;

Hamada et al. 2010; Crainey et al. 2014).

Estudos realizados por Hamada e Adler (2001) relataram abundância dos

simulídeos nos municípios de Presidente Figueiredo, Manacapuru, Careiro da Várzea, Novo

Airão e Itacoatiara, no estado do Amazonas, onde foram registradas onze espécies de

simulídeos. Ectemnaspis rorotaense (Floch e Abonnenc) e E. trombetense (Hamada, Py-

Daniel e Adler) fazem parte dessas espécies coletadas na região.

1.5. Espécies Ectemnaspis rorotaense e E. trombetense

As espécies E. rorotaense e E. trombetense pertencem ao grupo de espécies

Perflavum (Adler e Crosskey 2013). A primeira espécie é encontrada na Guiana Francesa,

Guiana, Colômbia, Venezuela e o Brasil, onde é encontrada nos estados do Amapá,

Amazonas, Mato Grosso, Pará e Rondônia (Adler e Crosskey 2014).

23

Os adultos de E. rorotaense, possuem cerca de 2-2,5mm de comprimento,

apresentam um padrão de coloração amarelada. Em um estudo realizado na Serra das

Andorinhas no estado do Pará, foram registradas fêmeas de E. rorotaense atacando humanos

(Monteiro-Santos 2008). Nesse estágio são morfologicamente muito semelhantes às espécies

E. maroniense (Floch e Abonnenc) e E. suarezi (Ramírez Pérez, Rassi e Ramírez), nesse caso

sendo necessários os estágios imaturos (larva de ultimo estádio e pupa) para diferenciação das

espécies. As larvas de último instádio podem ser identificadas através da morfologia do

histoblasto blaquial. As pupas de E. rorotaense possuem entre 17 e 23 filamentos brânquias,

longos, finos e levemente pigmentados (Hamada e Adler 1998). As formas imaturas (larvas e

pupas) dessa espécie são encontradas em ambientes mais conservados como em áreas de

floresta, substratos tipo troncos, folhas secas e em decomposição. (Hamada e Adler 2001).

A espécie E. trombetense é registrada no Brasil e na Guiana Francesa. No Brasil a

espécie ocorre nos estados de Amazonas, Amapá, Pará e Roraima (Adler e Crosskey 2014).

Os adultos de E. trombetense possuem o corpo amarelado e medem cerca de 2-4,6mm de

comprimento. Na fase larval essa espécie pode ser diferenciada das demais espécies do grupo

Perflavum pela forma do histoblasto branquial das larvas maduras. Os estágios imaturos são

encontrados em ambientes de floresta, córregos e em locais com presença de cachoeiras

(Hamada e Adler 1998).

As pupas de E. trombetense possuem forma de bota ou sapatiformes, e

apresentam coloração castanho escuro. Nessa fase podem ser reconhecidas pelo característico

padrão de seus filamentos branquiais que varia entre 160 e 250 filamentos (Hamada e Adler

1998).

Essas espécies são relativamente pouco estudadas, com apenas alguns trabalhos

realizados no estado do Amazonas, que abordaram a biologia e taxonomia. Ambas as espécies

24

são abundantes nos municípios próximos de Manaus (Hamada e Adler 1998; Hamada e Adler

2001; Scarpassa e Hamada 2003).

1.6. Mecanismo de defesa dos insetos

Os insetos desenvolveram um eficiente sistema de defesa contra ação de

patógenos. A cutícula externa, o revestimento quitinoso da traquéia, a armadura cibarial e a

matriz peritrófica no intestino médio constituem as primeiras barreiras físicas de defesa dos

insetos contra organismos invasores (Dunn 1986; Lemaitre e Hoffman 2007).

A armadura cibarial presente em algumas espécies de insetos constitui também

uma barreira física contra infecções, além de ser um fator indicativo da competência vetorial

(Mcgreevy et al. 1978; Shelley et al. 1997). Espécies de simulídeos com armadura cibarial

apresentam baixo índice de infecção por microfilarias (ex. C. oyapockense). Por outro lado,

foi observado que fêmeas de T. guianense que não possuem dentes grandes nessa estrutura

apresentaram maiores cargas de microfilarias, sugerindo que essa configuração morfológica

do cibário seja uma característica importante para as espécies vetoras da oncocercose (Shelley

et al. 1997).

Quando as barreiras físicas de defesa são rompidas pelos invasores, eles penetram

no interior dos insetos e entram em contato com a hemolinfa, ativando o sistema imune inato,

que por sua vez é composto por uma resposta imune humoral e outra celular. A imunidade

humoral é ativada por moléculas específicas do inseto que interagem com moléculas padrão

do patógeno e ativam receptores de membrana nas células do corpo gorduroso,

desencadeando cascatas de reações químicas que terminam na produção de moléculas efetoras

para combater o invasor. A imunidade celular é mediada por células que, uma vez ativadas,

25

participam dos processos de fagocitose, encapsulação e melanização (Lemaitre e Hoffman

2007).

1. 6. 1. Hemolinfa

A hemolinfa é um fluido aquoso que circula na hemocele e contém íons,

moléculas e células (hemócitos). Pode apresentar coloração clara ou mesmo incolor, podendo

também ser amarelada ou esverdeada, raramente vermelha. O volume pode variar de acordo

com o estágio da vida e com as condições fisiológicas do inseto, com cerca de 20 a 40% do

peso total nas larvas e entre 5 e 40 % do peso corporal das pupas e adultos de alguns insetos.

O plasma constitui a parte líquida da hemolinfa, onde também são encontradas muitas

substâncias dissolvidas, tais como sais, açúcares, proteínas e hormônios. Estas substâncias

podem variar entre insetos e entre diferentes fases da vida do mesmo inseto. A hemolinfa tem

a função de mediar todas as trocas químicas entre os tecidos dos insetos (Chapman 1998;

Triplehorn e Jonnson 2011; Gullan e Cranston 2007).

1. 6. 2. Hemócitos

Os hemócitos são as células do sistema imune dos insetos, alguns circulam

livremente na hemolinfa e outros podem ser encontrados aderidos aos tecidos. Variam em

quantidade de 1.000 a 100.000 por mm3

de hemolinfa, dependendo do estágio de vida do

inseto (Triplehorn e Jonnson 2011). Em estudos realizados com Drosophila Fállen, modelo

utilizado para estudos do sistema imune, foi mostrado que uma primeira população de

hemócitos é formada durante o estágio embrionário na mesoderma procefálica e uma segunda

população durante o estágio larval, no gânglio linfático, o órgão hematopoiético (Wood e

Jacinto 2007).

26

Os hemócitos podem apresentar formas diferentes quando expostos a diferentes

condições, o que tem tornado difícil uma classificação universal dessas células (Chapman

1998). São classificados em sete tipos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos,

oenocitóides, coagulócitos, adipohemócitos e esferulócitos (Gupta 1985). No entanto em uma

das classificações mais utilizadas para estas células, além dos tipos citados acima, são

adicionados mais dois tipos: podócitos e vermiformes, que são encontradas em poucos insetos

(Jones 1962).

Essas células desempenham importantes funções de defesa como fagocitose,

encapsulação e nodulação (Dunn 1986). A fagocitose é uma forma defesa contra vírus,

bactérias, fungos ou protozoários. Esse processo ocorre através do reconhecimento,

englobamento e destruição intracelular desses invasores. Os plasmatócitos e os granulócitos

são os principais tipos de hemócitos envolvidos nesse mecanismo de defesa na maioria dos

insetos (Ratcliffe et al. 1979). Em larvas de Drosophila os lamelócitos (= oenocitóides) são as

células responsáveis pela fagocitose de microorganismos e de células apoptóticas (Lemaitre e

Hoffaman 2007).

A encapsulação ocorre quando o agente invasor é muito grande para ser

fagocitado. Em larvas de Drosophila quando os lamelócitos circulantes na hemolinfa

reconhecem um invasor emitem sinais para que no gânglio linfático ocorra a diferenciação de

prohemócitos em lamelócitos. Essas células formam um revestimento (capsula) em torno do

invasor, desencadeando uma cascata de melanização e consequentemente a morte do invasor

(Lemaitre e Hoffman 2007).

A nodulação é muito semelhante ao processo de encapsulação, que é ativada

quando ocorre uma grande concentração de agentes invasores na hemolinfa, não sendo

possível eliminá-los por fagocitose (Ratcliffe et al. 1979). Além das funções mencionadas

27

acima, os hemócitos também auxiliam na coagulação da hemolinfa e no armazenamento e

distribuição de nutrientes (Gullan e Cranston 2007).

1. 6. 3. Estudos com hemócitos de insetos

O primeiro estudo que relata sobre hemócitos em invertebrados, segundo Jones

(1962) foi realizado por Swammerdam (1669). Posteriormente Cuenot (1896), fez uma prévia

observação sobre e função dessas células em diferentes espécies. No entanto foi Millara

(1947), quem classificou pela primeira vez essas células em quatro tipos. Desde então a

classificação dessas células vem sendo revista em vários estudos (Yeager 1945; Wigglesworth

1956; Jones 1962; Cunha et al. 1976; Gupta 1985; Lello et al. 1987; Berger e Slavícková

2008; Ghasemi et al. 2013).

Estudo da hemolinfa de gafanhotos adultos machos Tropidacris collaris (Stoll)

(Orthoptera, Romaleidae), através de microscopia de luz, mostraram os seguintes tipos de

células: prohemócitos, plasmatócitos, coagulócitos e granulócitos, com maior abundância de

plasmatócitos, que são importantes na fagocitose (Correia et al. 2005). Em larvas de Papilio

demoleus (Linnaeus) (Lepidoptera: Papilionidae), usando microscopia eletrônica de varredura

(MEV), foram identificados seis tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos,

adiphoemócitos, granulócitos, enocitóides e esferulócitos, vermiformes e podócitos (Jalali e

Salehi 2008).

Brayner et al. (2005) caracterizaram, através de microscopia ótica e microscopia

eletrônica de transmissão, seis tipos de hemócitos em Culex quinquefasciatus: prohemócitos,

esferulócitos, adipohemócitos, oenocitóides, plasmatócitos e granulócitos. Em um estudo de

caracterização de hemócitos de fêmeas de Aedes aegypti (Linnaeus) e Aedes albopictus

(Skuse), utilizando microscópia de luz e MET, foram identificados seis tipos de hemócitos:

28

prohemócitos, adipohemócitos, granulócitos, plasmatócitos, oenocitóides e trombocitóides

(Araújo 2011).

Em Simuliidae Rubtsov (1959) foi o primeiro a descrever os tipos celulares

encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de simulídeos paleártico, que ultilizando

um sistema de classificação antiga, identificou os seguintes tipos celulares: oenocitos,

oenocitóides, hemócitos granulares, proleucócitos, macronucleócitos, micronucleócito,

hemócitos fusiformes, fagócitos, adipócitos. Luckhart (1992), utilizando microscopia ótica e

MEV identificou quatro tipos de hemócitos em Simulium vittatum [=Psilozia vittata]

(Zetterstedt): prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos. Posteriormente Cupp

et al. (1997), descreveu alterações no número e na morfologia em hemócitos de Simulium

vittatum [=Psilozia vittata] após infecção em laboratório com Onchocerca linealis.

Estudos sobre resposta imune em Simuliidae são escassos. A região amazônica é

área endêmica de filarioses transmitidas por simulídeos. Nenhum trabalho até o momento foi

desenvolvido sobre o tema na região Neotropical.

O presente trabalho caracterizou as células do sistema de defesa das espécies E.

rorotaense e E. trombetense, que apesar de não serem espécies reconhecidas como vetoras,

constituem, devido às facilidades de acesso aos criadouros, modelos para estudo de

hemócitos. Esse passo é importante para compreender a dinâmica de interação parasita-

hospedeiro e de conhecimento da biologia e fisiologia desses insetos.

29

2. OBJETIVOS

2. 1. Objetivo Geral

Realizar o estudo de caracterização e proporção de tipos celulares da hemolinfa de

Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis trombetense.

2. 2. Objetivos específicos

- Identificar os tipos de hemócitos em larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E.

trombetense.

- Descrever morfologicamente e ultra-estruturalmente os hemócitos presentes na hemolinfa

E. rorotaense e E. trombetense.

- Realizar a contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de E.

rorotaense e E. trombetense.

30

3. MATERIAL E MÉTODOS

3. 1. Coleta de simulídeos

As coletas dos simulídeos (larvas e pupas) foram realizadas no município de

Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil, localizado a aproximadamente 107 Km

da cidade de Manaus, com uma área territorial de 25.422 Km² e uma temperatura média de

28,5ºC (Figura 1a) (IBGE, 2013). As larvas e pupas foram coletadas no período de junho a

dezembro de 2013, em duas corredeiras na rodovia AM 240: Cachoeira da Naza no Km 6

(Figuras 1b, 2a) e Sossego da Pantera no Km 20 (Figuras 1b, 2b).

Figura 1: Locais de coleta de simulídeos das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis

trombetense. (A) Mapa do estado do Amazonas mostrando a localização do município de Presidente

Figueiredo (Fonte: IBGE). (B) Imagem de satélite mostrando a localização das áreas de coleta

(Fonte: GOOGLE MAPS).

B

A

31

Figura 2: Locais de coleta de larvas e pupas das espécies Ectemnaspis rorotaense e Ectemnaspis

trombetense. (a) Cachoeira da Naza no Km 6 e (b) Cachoeira do Sossego da Pantera no Km 20,

Município de Presidente Figueiredo, Amazonas, Brasil (Fonte: J. C. Silva).

As larvas e pupas de E. rorotaense e de E. trombetense foram coletadas de forma

manual através da remoção de substratos como, folhas verdes ou em decomposição, galhos e

raízes submersas. Posteriormente, os substratos foram colocados em sacos plásticos contendo

água do igarapé e acondicionados em caixas térmicas para manter a temperatura (Figura 3a),

em seguida, foram transportadas para o Laboratório de Ecologia de Doenças Transmissíveis

na Amazônia (EDTA) do Instituto Leônidas e Maria Deane Fiocruz – Amazônia – (ILMD),

localizados na cidade de Manaus, Amazonas.

As pupas maduras, caracterizadas por apresentarem aspecto geral mais escuro, foram

separadas individualmente em frascos e mantidas a 27oC para emergência dos adultos, que

variou entre um e quatro dias (Figuras 3b e 3c). Posteriormente os adultos recém-emergidos

foram identificados a nível específico segundo as chaves propostas por Hamada e Adler

(2001) e Coscaron e Coscaron-Arias (2007). Para identificação das espécies foram utilizados

caracteres morfológicos de larvas e pupas tais como: forma do histoblasto branquial, número

e forma dos filamentos branquiais, forma do casulo e tubérculos cefálicos. A nomenclatura

taxonômica utilizada seguiu a proposta de Py-Daniel e Sampaio (1994).

32

Figura 3: Transporte e tratamento do material coletado em campo. (a) Armazenamento e transporte de

substratos com imaturos de simulídeos. (b) Frascos para separação individual das pupas das espécies

das duas espécies do estudo. (c) Adultos emergidos de Ectemnaspis. rorotaense e Ectemnaspis

trombetense (Fonte: J. C. Silva).

3. 2. Coleta de hemolinfa

Para a coleta de hemolinfa de larvas, pupas e adultos recém-emergidos (um dia de

vida), os indivíduos foram adormecidos no gelo por cerca de 1 a 2 minutos (Figura 4a), e em

seguida foi realizado, com auxílio de um micro capilar de vidro acoplado a uma seringa

Hamilton, uma perfusão na região torácica do inseto, onde foram inoculados 4μl de

anticoagulante tampão de citrato (98 mM ClOH, 145 mM NaCl, 1,7 mM e EDTA e 41 mM de

Ácido Cítrico) (Figuras 4b e 4c), imediatamente a hemolinfa foi coletada com auxilio de uma

pipeta (Araújo et al. 2008). Após a coleta da hemolinfa, o material testemunho foi conservado

em álcool a 70% e devidamente etiquetado.

33

Figura 4: Procedimento para coleta de hemolinfa. (a) - Simulídeos adormecidos no gelo; (b) - Sistema

utilizado para perfusão da hemolinfa (1- Lupa estériomicroscopio, 2- Capilar de vidro, 3- Suporte para

capilar); (c) – Procedimento de coleta da hemolinfa em adulto de simulídeo (1- Capilar inoculando

anticoagulante, 2- Liberação de hemolinfa ). (Fonte: J. C. Silva).

3. 3. Microscopia de Luz

Após a coleta 10µl de hemolinfa foram colocadas individualmente em lâminas e

deixadas para secar por um período de 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida as

células foram coradas com o Kit Panótico Rápido® (Laborclin), de acordo com o seguinte

protocolo: inicialmente as células foram fixadas com o Metanol por 10 minutos,

posteriormente foram imersas por um minuto na solução de xanteno 0,1% e por último imerso

por um minuto na substância na solução de tiazina 0,1%. Em seguida as lâminas foram

lavadas com água ultra pura e colocadas para secar à temperatura ambiente. Por fim, para

montagem permanente das células foram adicionados meio Entellan® (Merck) e lamínulas

(Figuras 5a e 5b). No total foram montadas 100 lâminas de E. rorotaense e 50 lâminas de E.

trombetense. Da primeira espécie foram selecionadas as 27 melhores lâminas e 19 lâminas

para a segunda espécie.

As lâminas foram analisadas em microscópio óptico em campo claro, modelo AX10

da ZEISS (Mager M2M) (Figura 5c). As células observadas foram fotografadas no aumento

de 100X, com câmera acoplada ao microscópio utilizando os programas: Auto Montage do

34

EDTA do ILMD – Fiocruz Amazônia e o programa ZEN pro 2012, do LIKA da Universidade

Federal de Pernambuco e editadas usando o programa Adobe Photoshop. Para caracterização

morfológica das células foram considerados: morfologia e o tamanho.

Figura 5: Procedimento para coloração das células e montagem das lâminas para microscopia óptica.

(a) - Kit Panótico® para coloração das lâminas. (b) - Lâminas de vidro coradas; (c) - Microscópio

óptico (Fonte: J. C. Silva).

3. 4. Contagem diferencial de hemócitos

Para a contagem diferencial dos hemócitos em E. rorotaense e E. trombetense, foi

realizada a coleta de hemolinfa como descrito anteriormente no item 3.2. A contagem das

células foi realizada através do microscópio de luz em campo claro, em aumento de 100X.

Foram utilizadas para diferenciação dos tipos celulares características morfológicas, como:

tamanho celular, tamanho do núcleo, projeções da membrana citoplasmática e presença de

grânulos (Brayner et al. 2005).

A contagem diferencial das células foi analisada por estatística descritiva (total,

média e desvio padrão) para todos os estágios (larva, pupa e adultos) e somente para os

adultos foi comparada através dos testes Kruskal-Wallis e a posteriori de Student-Newman-

35

Keuls, analisados ao nível de significância de 5% (Ayres et al. 2007). As análises foram feitas

no programa Bioestat.

3. 5. Microscopia Eletrônica de Transmissão

Foi coletada a hemolinfa de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis

rorotaense e de 200 adultos (machos e fêmeas) de Ectemnaspis trombetense, posteriormente

colocada em microtubos de 1,5ml tratados com Sigmacote® (Sigma) 24 horas antes do uso

para evitar a adesão dos hemócitos na superfície interna dos mesmos (totalizando 4 pools

contendo a hemolinfa de 60 indivíduos para cada espécie). A cada microtubo, contendo pool

da hemolinfa foi adicionado fixador Karnovsky (glutaraldeido 2,5%, formaldeído 4,0% e

tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7.2), numa proporção de três partes de fixador

Karnovsky e uma parte de hemolinfa. Em cada microtubo foi reunida a hemolinfa de 60 a 100

indivíduos dependendo da quantidade de adultos emergidos por dia. A hemolinfa foi

centrifugada a 6000 rpm por 5 minutos, em seguida foi removido o excesso de fixador e a

hemolinfa foi lavada três vezes consecutivas com tampão de cacodilato de sódio 0,1M pH 7,4.

Em seguida as amostras foram pós – fixadas, com tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato

0,1 M, pH 7,2, à temperatura ambiente e protegidos da luminosidade por 2 horas.

Posteriormente foi centrifugado e retirado o excesso de ósmio e lavada novamente por três

vezes consecutivas com tampão de cocodilato. Na etapa seguinte, a amostra foi desidratada

com banhos de etanol em concentrações diferentes de 50%, 70%, 90% e três banhos a 100%.

Cada banho durou 30 minutos a temperatura ambiente. Após a desidratação as amostras foram

submetidas ao procedimento de infiltração e emblocamento (formação de blocos em resina)

com séries crescentes de resina Epon 812 (Electron Microscopy Sciences) (Figura 6a).

Posteriormente, com o auxílio de ultramicrótomo foram realizados cortes ultrafinos, em

seguida as amostras foram contrastadas com citrato de chumbo, por 5 a 10 minutos, e acetato

36

de Uranila a 5%, por 20 a 30 minutos (Figura 6b) (Brayner et al.2005; Brayner et al. 2007;

Araújo et al.2008).

As análises dos cortes foram feitas em microscópio eletrônico de transmissão

modelo Tecnai Spirit G1 Bio Twin da Fei Company, e as imagens foram obtidas por meio dos

seguintes programas: Microscope User Interface (Fey Company) e TEM Imagine and

Analysis, do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - Fiocruz Recife (Figura 6c).

Figura 6: Procedimento para microscopia de transmissão. (a) - Emblocamento de material em resina;

(b) - Ultramicrótomo, utilizado para realizar os cortes ultrafinos do material em resina; (c) -

Microscópio eletrônico de transmissão utilizado para obter as imagens das células (Fonte: J. C. Silva).

37

4. RESULTADOS

Caracterização morfológica dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense e

Ectemnaspis trombetense.

Através da microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão foram

identificados quatro tipos morfológicos de células na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de

E. rorotaense: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides (Figuras 7 e 9). Os

mesmos tipos celulares foram encontrados na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E.

trombetense (Figuras 8 e 10).

Prohemócitos

Os prohemócitos encontrados apresentam forma arredondada ou oval (Figuras

11A-C). São os menores tipos celulares observados na hemolinfa de E. rorotaense e E.

trombetense variando de 5 a 10µm. Esse tipo celular é caracterizado pela presença de um

núcleo volumoso em relação ao citoplasma, e em algumas dessas células foram visualizadas

pequenas projeções da membrana citoplasmática (Figuras 7A e 8A). Em imagens de

ultraestruturas foi observado no citoplasma a presença de poucas organelas, algumas

mitocôndrias e reticulo endoplasmático (Figura 9A e 10A). Também foram encontrados

agrupamentos com duas, três e quatro células (Figura 7A e 8A).

Granulócitos

Os granulócitos possuem forma arredondada e oval (11D – F), variando de 20 a

25 µm, podem apresentar projeções da membrana plasmática. Mesmo em microscopia óptica

foi possível visualizar grânulos no citoplasma dessas células (Figuras 7B e 8B). Através das

imagens de ultraestrutura foi possível identificar no citoplasma o retículo endoplasmático

rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e algumas vesículas. Esse tipo celular é

38

caracterizado pela presença de grânulos com variação no tamanho e forma. Também foi

observado um núcleo grande e geralmente excêntrico com ilhas de heterocromatina no seu

interior (Figuras 9B e 10B).

Oenocitóides

Os oenocitóides apresentam formato arredondado ou oval (12A – B), e em

algumas ocasiões possuem projeções da membrana citoplasmática, o tamanho varia entre 10 e

15µm. São caracterizados por possuírem um núcleo pouco desenvolvido, que geralmente está

localizado na região central (Figuras 7C e 8C). Em microscopia eletrônica apresentaram um

citoplasma homogêneo com presença de mitocôndrias, vesículas, ribossomos e retículo

endoplasmático rugoso (Figuras 9C e 10C).

Plasmatócitos

Os plasmatócitos observados apresentaram formas variadas (12C-F, 13A-D), com

tamanho entre 45 e 55µm. Este tipo celular caracteriza-se pelas grandes projeções da

membrana citoplasmática (Figuras 7D, 8D, 9D e 10D). Em imagens de ultraestrutura foi

identificado no citoplasma o retículo endoplasmático rugoso, complexo de Golgi e vesículas

que podem estar preenchidas com substâncias amorfas ou vazias. O núcleo dessas células

geralmente é pequeno e excêntrico (Figuras 9D, 10D e 13A-D).

39

Figura 7: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia óptica. (A)

Prohemócitos, com núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) Granulócito

apresentando forma irregular e com presença de grânulos no citoplasma (seta fina vermelha). (C)

Oenocitóide com um pequeno núcleo localizado centralmente (seta fina). (D) Plasmatócito com

visíveis extensões da membrana citoplasmática (seta grossa) e um núcleo centralizado (seta fina).

Barra = 10µm.

40

Figura 8: Caracterização de hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A) -

Prohemócitos, exibindo um núcleo grande (seta fina) ocupando quase todo o citoplasma. (B) –

Granulócito, com muitos grânulos presentes no citoplasma (seta vermelha) e núcleo grande localizado

centralmente (seta fina). (C) Oenocitóide com um núcleo pouco desenvolvido (seta fina). (D) -

Plasmatócito apresentando uma grande projeção da membrana citoplasmatica (seta grossa). Barra = 10

µm.

41

Figura 9: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis rorotaense em microscopia eletrônica de

transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (N), citoplasma com algumas

mitocôndrias (m) e retículo endoplasmático (Re). (B) Granulócito com presença de heterocromatina

no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da membrana (seta grande), reticulo

endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C) Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo

(N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D)

Plasmatócito exibindo forma alongada e projeções da membrana citoplasmática (seta grande), no

citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e retículo endoplasmático (Re).

42

Figura 10: Caracterização dos hemócitos de Ectemnaspis trombetense em microscopia eletrônica de

transmissão. (A) Prohemócito apresentando um núcleo volumoso (V), citoplasma com pequena

projeção da membrana (seta grande), algumas mitocôndrias (m) e reticulo endoplasmático (Re). (B)

Granulócito com presença de heterocromatina no núcleo (N), citoplasma apresentando projeções da

membrana (seta grande), reticulo endoplasmático (Re), grânulos (g) e vesículas (Ve). (C)

Oenocitóide exibindo um pequeno núcleo (N), no citoplasma presença de mitocôndrias (m),

vesículas (Ve) e reticulo endoplasmático (Re). (D) Plasmatócito exibindo longa projeção da

membrana plasmática (seta grande), no citoplasma presença de mitocôndrias (m), vesícula (Ve) e

retículo endoplasmático (Re).

43


Ectemnaspis trombetense em microscopia óptica. (A-C) Prohemócitos apresentando diferentes padrões

de morfologia e em alguns foram observados indícios de divisão celular e a presença de pequenas

projeções da membrana citoplasmática. (D-F) Granulócitos apresentando membrana plasmática

irregular e com presença de visíveis grânulos. Barra = 10 µm.

44


Ectemnaspis trombetense por microscopia óptica. (A-B) Oenocitóides com variações morfológicas,

células apresentando núcleo pouco desenvolvido, localizado centralmente ou deslocado. (C-F)

Plasmatócitos apresentaram maior variação morfológica, geralmente com longas projeções da

membrana citoplasmática, com núcleo localizado no centro, em algumas células foi observado um

núcleo deslocado. Barra = 10 µm.

45

Figura 13: Diferenças morfológicas observadas em plasmatócitos de Ectemnaspis rorotaense e

Ectemnaspis trombetense por microscopia eletrônica de transmissão. (A) plasmatócito com forma

irregular e com projeções da membrana citoplasmática. (B) plasmatócito com forma mais arredondada

apresentando uma longa extensão da membrana citoplasmática. (C) plasmatócito com pequenas

projeções da membrana. (D) célula com forma mais alongada e com um grande número de vacúolos

no citoplasma

46

Contagem diferencial dos hemócitos em larvas, pupas e adultos de Ectemnaspis

rorotaense e de Ectemnaspis trombetense.

Em relação à contagem diferencial dos hemócitos, para a espécie E. rorotaense foi

encontrado um maior número de plamatócitos no estágio de larva, granulócitos em pupa e

prohemócitos no adulto (Tabela 1). No estágio adulto observou-se que prohemócitos

apresentaram maior número em relação a outras células apresentando diferença estatística

significativa (H = 7,9, gl = 3 p = 0,04) (Tabela 2). Com a análise a posteriori utilizando o teste

de Student-Newman-Keuls foi observada diferença significativa entre os prohemócitos,

oenócitos e granulócitos (p < 0,05) (Figura 14).

Tabela 1: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados em

larvas, pupas e adultos da espécie Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e

Sossego da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.

Tipos de células Larva Pupa Adultos

Prohemócitos 23 16 190

4,0 ± 6,4 9,5 ± 12,1

Plasmatócitos 34 53 83

5,6 ± 8,7 4,1 ± 5,6

Oenocitóides 8 15 60

1,3 ± 1,7 3,0 ± 3,7

Granulócitos 24 72 89

4,0 ± 3,7 4,4 ± 5,5

n larva = 6 lâminas, n pupa = 1, n adultos = 20

47

Tabela 2: Número total de prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos encontrados na

hemolinfa de adultos de Ectemnaspis rorotaense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego da

Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.

Prohemócito Plasmatócito Oenocitóide Granulócito

Total 190 83 60 89

Média e DP 9,5 ± 12,1 4,1 ± 5,6 3,0 ± 3,7 4,4 ± 5,5

Min - Máx 0 - 53 0 - 25 0 - 14 0 - 23

n = 20 lâminas, DP = Desvio padrão, Min = Mínimo, Máx = Máximo.

Figura 14: Número de hemócitos encontrados em Ectemnaspis rorotaense, coletados na cachoeira da


Amazonas. As letras maiúsculas e minúsculas nas barras indicam que houve uma diferença

significativa após o teste de Kruskal-Wallis seguido de Student-Newman-Keuls.

Para a espécie E. trombetense foi observado um maior número de prohemócitos

no estágio de larva e de plasmatócitos em pupa, e plasmatócitos e granulócitos em adultos

48

(Tabela 3). Nos adultos embora o número de plasmátocitos e granulócitos tenham sido maior

em relação às outras células, não foi encontrado diferença significativa (H = 6,1, gl = 3 p =

0,10) (Tabela 4).


hemolinfa de larvas, pupas e adultos na espécie Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da


Amazonas.

Tipos de células Larva Pupa Adultos

Prohemócitos 79 40 36

19,7 ± 22,6 10,0 ± 18,0 3,2 ± 3,3

Plasmatócitos 7 170 110

1,7 ± 1,7 42,5 ± 72,3 10,0 ± 10,5

Oenocitóides 1 22 31

0,2 ± 0,5 5,5 ± 8,3 2,8 ± 4,1

Granulócitos 37 146 110

9,2 ± 9,5 36,5 ± 51,4 10,0 ± 10,3

n larva = 4 lâminas, n pupa = 4, n adultos= 11


hemolinfa de adultos de Ectemnaspis trombetense, coletados na Cachoeira da Naza, Km 6 e Sossego

da Pantera, Km 20 no município de Presidente Figueiredo, estado do Amazonas, Brasil.

Prohemócito Plasmatócito Oenócitóide Granulócito

Total 36 110 31 110

Média e DP 3,2 ± 3,3 10,0 ± 10,5 2,8 ± 4,1 10,0 ± 10,3

Min - Máx 0 - 12 0 - 28 0 - 13 0 - 33

n = 11 lâminas, DP = Desvio padrão, Min = Mínimo, Máx = Máximo.

49

5. DISCUSSÃO

Esse é o primeiro trabalho de caracterização celular de hemócitos para simulídeos

da região Neotropical. A terminologia utilizada para a nomenclatura de hemócitos ainda é

controversa. Existem diversas terminologias, que geram dúvidas, considerando que o mesmo

tipo celular pode assumir diferentes formas morfológicas (Joshi e Lambdin 1996). Nesse

trabalho foi utilizada a nomenclatura de Gupta (1991).

No presente estudo foram identificados e descritos quatro tipos morfológicos de

hemócitos na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense:

prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos. Esses tipos celulares foram

descritos em diferentes espécies de Diptera, ex. Anastrepha obliqua (Silva et al. 2002), Culex

quinquefasciatus (Brayner et al. 2005), Anopheles gambiae (Castillo et al. 2006), Aedes

aegypti (Castillo et al. 2006; Araújo et al. 2008; Koodalingam et al. 2014), Musca domestica

(Fernandes 2010) e Aedes albopictus (Araújo 2011). Segundo a revisão de Siddiqui e Al

Khalifa (2012) em Diptera são encontrados até sete tipos celulares, os prohemócitos,

granulócitos, oenocitóides, plasmatócitos, esferulócitos, coagulócitos e adipócitos. Esses

autores utilizaram a nomenclatura de Gupta (1985).

Nas duas espécies de Ectemnaspis estudadas nesse trabalho foram encontrados

tipos celulares similares. No que se refere à família Simuliidae, poucos trabalhos tem relatado

e descrito hemócitos. Rubtsov (1959) foi o primeiro a descrever os tipos celulares encontrados

na hemolinfa de larvas, pupas e adultos de simulídeos paleártico, propondo os seguintes tipos

celulares: oenocitos, oenocitóides, hemócitos granulares, proleucócitos, macronucleócitos,

micronucleócito, hemócitos fusiformes, fagócitos, adipócitos e células derivadas da camada

interna do corpo gorduroso, todos derivados então do hemocitoblasto.

50

Posteriormente Luckhart et al. (1992), descreveram quatro tipos morfológicos de

hemócitos encontrados na hemolinfa de fêmeas adultas de Simullium vittatum [=Psilozia

vittata], simulídeo do neártico, prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e esferulócitos.

Comparando com resultados em Ectemnaspis, não foi encontrado o tipo denominado como

esferulócito, porém foi encontrado o tipo oenocitóide. Luckart e colaboradores utilizaram

microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura no seu trabalho, enquanto que para

esta dissertação foi utilizada a MET para identificação dos tipos celulares. A MET é

considerada o método mais adequado para caracterização de células (ex. Araújo et al. 2008;

Brayner et al. 2005). Posteriormente Cupp et al. (1997) observaram alterações em células

imaturas na hemolinfa de Simulium vittatum [=Psilozia vittata] após infecção em laboratório

com Onchocerca linealis, sendo verificado um aumento significativo da abundância das

células e dos tipos celulares em até 20 horas após a infecção, tendo uma queda geral da

abundância após esse período.

Os tipos mais comuns de hemócitos relatados na literatura foram os prohemócitos,

granulócitos, plasmatócitos, esferulócitos e oenocitóides. Esses tipos de hemócitos têm sido

descritos em insetos de várias ordens incluindo Lepidoptera, Diptera, Orthoptera, Blattaria,

Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera e Collembola (Jones 1962; Barraco at al. 1987; Ashida

et al. 1988; Lavine e Strand 2002; Correia at al. 2005; Ribeiro e Brehelin 2006). Também

foram encontrados no presente trabalho, exceto esferulócitos, e nos trabalhos de Luckhart et

al. (1992) e Cupp et al. (1997) com Simuliidae.

Araújo (2011) caracterizou os hemócitos de Aedes aegypti e Aedes albopictus

através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão e encontrou os mesmos

tipos celulares para as duas espécies: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos,

adipohemócitos, oenocitóides e trombocitóides. Dois tipos a mais do que os encontrados para

51

Ectemnaspis no presente estudo e Psilozia no trabalho de Luckhart et al. (1992). Segundo

Araújo (2011), não houve diferenças quanto aos tipos celulares entre as espécies estudadas,

apresentando apenas variações morfológicas. Castillo et al. (2009) também não encontraram

diferenças nos tipos de células de Anopheles gambiae e Aedes aegypti, registrando

prohemócitos, granulócitos e oenocitóides. Todos esses tipos celulares observados em Aedes e

Anopheles foram encontrados nas duas espécies de Ectemnaspis neste estudo. As famílias

Culicidae e Simuliidae pertencem à mesma infraordem, Culicomorpha, e portanto possuem

relações filogenéticas relativamente próximas (Borkent, 2012).

Os prohemócitos foram as células mais frequentemente encontradas na hemolinfa

de adultos de E. rorotaense. Entretanto, em outra espécie de simulídeo, P. vittata, os

plasmatócitos foram os tipos celulares mais representativos, seguidos por granulócitos

(Luckhart et al. 1992). Segundo Lemaitre e Hoffmann (2007), os prohemócitos são células –

troncas precursoras, que derivarão aos demais tipos de hemócitos. Alguns prohemócitos

observados neste trabalho mostraram indícios de que essas células estivessem em processo de

divisão celular (Figuras 7a e 8a). Provavelmente esse tipo celular foi encontrado em maior

número devido ao pouco tempo de emergência dos adultos, não desafiados ainda por

antígenos que desencadeassem o processo de diferenciação celular.

Plasmatócitos foram encontrados em ambas as espécies estudadas. Foram as

células que apresentaram maior variação morfológica, desde formas alongadas e

arredondadas, e com extensões citoplasmáticas (Figuras 13A-D). Características semelhantes

estas também foram descritas em outros estudos em diferentes espécies de insetos (ex. Joshi e

Lambdin, 1996; Silva et al. 2002; Han e Gupta 1988; Brayner et al. 2005). Os plasmatócitos e

os granulócitos foram os tipos celulares mais representativos em E. trombetense. Diversos

autores afirmaram que os plasmatócitos são as principais células envolvidas no processo de

52

fagocitose (ex. Falleiros et al. 1995; Falleiros et al. 2003; MacLaughlin e Allen, 1965; Joshi e

Lambdin, 1996). Araújo (2011) identificou em A. albopictus os hemócitos envolvidos no

processo de fagocitose, após a indução com partículas abióticas nesses insetos. Araújo

observou que os plasmatócitos junto com os granulócitos foram as células que responderam

ao estímulo.

Os oenocitóides identificados neste estudo são caracterizados por possuírem um

pequeno núcleo central. Quando visualizados em ultra-estrutura foi possível observar um

citoplasma com poucas organelas (Figura 9C e 10C). Descrições semelhantes dessas células

foram feitas em larvas de Cuterebridae (Lello et al. 1987), em larvas de Anastrepha obliqua

(Tephritidae), adultos de Culex quinquefasciatus (Brayner et al. 2005) e em adultos de A.

aegypti e A. albopictus (Araújo 2011). Tanto em E. rorotaense quanto em E. trombetense esse

tipo celular foi o menos representativo. Segundo Joshi e Lambdim 1996, os oenocitóides

também são conhecidos como células de cristal e foram caracterizados na hemolinfa de

Dactyolopius confusus (Cockerell), pela presença de muitos cristais no citoplasma. Em

lepidoptera da espécie Mythimna unipuncta, essas células foram registradas produzindo

enzimas fenoloxidase (Ribeiro et al. 1996).

Os granulócitos encontrados na hemolinfa das espécies em nosso estudo

apresentaram características que os tornam de fácil reconhecimento, tais como, expansões da

membrana plasmática e um citoplasma com presença de vários grânulos, que podem ser

visualizado mesmo em microscopia de luz. Esse tipo celular foi descrito em praticamente

todos os estudos de caracterização de hemócitos (Silva et al. 2002; Correia et al. 2005; Jalali e

Salehi 2008; Brayner et al. 2005; Negreiro et al. 2009; Fernandes 2010). Foi um dos tipos

celulares mais abundantes dentre as células de E. trombetense. Cupp et al. (1997) registraram

o aumento no número granulócitos nas primeiras 10 horas após infecção experimental de O.

53

linealis ou de perfusão sem microfilária em P. vittata, evidenciando intenso processo de

fagocitose. Araújo et al. (2008) e Hillyer et al. (2003) após desafiarem A. aegypti com

partículas de látex observaram que os granulócitos foram os principais tipos celulares

envolvidos na fagocitose.

Os resultados obtidos nesse trabalho indicaram que os mesmos tipos de hemócitos

foram encontrados em adultos, pupas e larvas em ambas as espécies. Castillo et al. (2006)

encontraram os mesmo tipos celulares em larvas, pupas e adultos tanto em A. aegypti como

em A. gambiae. Cunha et al. (1976) em estudos de caracterização celular de hemócitos em

vespas da espécie Polystes versicolor não encontraram diferenças significativas quanto ao

número de hemócitos nos diferentes estágios de vida, larva, pupas e adultos. Alguns autores

tem relacionado a presença de maior número desses tipos celulares em situações fisiológicas

diferentes (ex. Cunha et al. 1976, Ghasemi et al. 2013). Neste trabalho foram utilizadas larvas

de último estádio prestes a se transformarem em pupas e também pupas e adultos recém

emergidos. O processo de muda, assim como o deslocamento do igarapé para o laboratório,

pode estar fornecendo condições adversas para o inseto, estimulando o sistema imune para a

diferenciação e aumento das células de resposta imune. Por outro lado, as formas imaturas

desses insetos habitam em igarapés, onde estão em contato contínuo com grande quantidade

de microorganismos que podem infectá-los e, dessa forma, estimular a diferenciação e

aumento dos hemócitos como mecanismo de defesa. Em larvas de borboletas Ephestia

kuehniella Zell, quando expostas em condições de stress a elevadas temperaturas foi

observado um aumento significativo na população de plasmatócitos e de oenocitóides, em

contraste quando em baixas temperaturas ocorreu uma redução no numero total de hemócitos

Ghasemi et al.(2013). Cunha et al. (1976) em seu estudo associaram o aumento de

54

piasmatócitos (granulócitos) na hemolinfa de vespas com a presença de bactérias na

hemolinfa.

55

6. CONCLUSÕES

Os tipos celulares de larvas, pupas e adultos de E. rorotaense e E. trombetense são:

prohemócitos, plasmatócitos, oenocitóides e granulócitos.

Não existe variação nos tipos de hemócitos de E. rorotaense e E. trombetense.

Os hemócitos variam em número nos diferentes estágios de vida das espécies estudadas.

Esse estudo poderá servir como modelo para futuros estudos relacionado à interação

parasito-hospedeiro.

56

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