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SAMANTHA SEARA DA CUNHA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO LASER
INFRAVERMELHO DE 780 nm NO TECIDO ÓSSEO
SUBMETIDO À RADIOTERAPIA- ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS
UFPB - UFBA
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
Área de Concentração:
Laser em Odontologia
SALVADOR
2006
SAMANTHA SEARA DA CUNHA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PROGRAMA INTEGRADO DE DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: LASER
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO LASER
INFRAVERMELHO DE 780 nm NO TECIDO ÓSSEO
SUBMETIDO À RADIOTERAPIA- ESTUDO
EXPERIMENTAL EM RATOS
Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia em cumprimento às exigências para obtenção do título de Doutor em Odontologia. Área de concentração: Laser em Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. André Carlos de Freitas
Co-orientadora: Profª. Drª. Viviane Almeida Sarmento
SAMANTHA SEARA DA CUNHA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO LASER INFRAVERMELHO
DE 780 nm NO TECIDO ÓSSEO SUBMETIDO À
RADIOTERAPIA- ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS
APROVADA PELA BANCA EXAMINADORA CONSTITUÍDA PELOS SEGUINTES
PROFESSORES:
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________________________ Prof. Dr. André Carlos de Freitas – Orientador – UFBA
______________________________________________________ Prof. Dr. André Alberto Câmara Puppin- Professor Adjunto UFES
____________________________________________________ Prof. Dr. Arlei Cerqueira- Professor Adjunto FBDC
__________________________________________________________
Profª. Drª. Aparecida Maria Cordeiro Marques- Membro UFBA
____________________________________________________ Profª. Drª Viviane de Almeida Sarmento- Membro UFBA
Salvador, 17 de fevereiro de 2006
DEDICATÓRIA
DEDICO ESTE TRABALHO
Ao meu marido: Rafael Procaci da Cunha, quem me deu tanto suporte nessa etapa tão difícil da minha vida. Agradeço pelo seu amor, dedicação e confiança. Muito obrigada por ser companheiro, me escutar nos momentos difíceis e a me ajudar a ultrapassar todos os obstáculos dessa fase. À minha filha:
Mariana Seara Da Cunha, que deu um sentido fundamental na minha vida. Eu aprendi que ser mãe vai muito além do que eu imaginava. Aprendi o que é ter e sentir um amor “incondicional”, um amor verdadeiro e eterno. Pude presenciar de corpo e alma a melhor sensação do mundo. Meu coração bate mais forte só de pensar em seu nome. Sua presença foi vital na inspiração e término desse trabalho. À minha mãe: Lucia Helena França, que foi a pessoa quem mais acreditou em mim, por muitas vezes mais do que eu mesma. Saiba que sua garra e persistência foi um grande estímulo na minha vida. Muito obrigada pelo seu apoio e a dedicação que sempre me deu. E parabéns por ser uma excelente vovó! Ao meu pai:
José Carlos Seara, por quem eu amo muito e sinto saudades pela distância. Obrigada por todas as oportunidades oferecidas. Um dia ficaremos mais próximos e nos curtiremos mais! Déa de Moraes: Por quem tenho um profundo amor e que sempre fará parte da minha família. Você é muito importante para mim, hoje e sempre! Ao meu sogro: Luciano Procaci da Cunha, por quem eu tenho muita admiração. As minhas sogras: Iracelma Procaci da Cunha, agradeço por sua amizade e dedicação. Helena Procaci da Cunha, por quem eu tanto gostaria de ter conhecido.... A toda minha família À minha avó, meus cunhados, meus primos e tios que mesmo distantes sempre torceram pelo meu sucesso.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Deus, por ser o principal motivo da minha existência. Agradeço pela vida
que me deu, por todas as oportunidades e por sempre abrir as portas dos
meus caminhos.
À minha co-orientadora Profa Dra.Viviane Sarmento, por acreditar em
mim e na pesquisa. Agradeço pelos seus conselhos e eternas horas extras
disponibilizadas na leitura do trabalho e de e-mails. Sua ajuda e gentileza
foram muito bem-vindas durante todo esse período. Seu carinho e
ensinamentos foram muito além do que uma co-orientação. Admiro sua
competência, seu profissionalismo, seu conhecimento e acima de tudo sua
dedicação e amor pela pesquisa. Desejo muita saúde para você e esse
novo bebezinho que estar por vir, e que saberá a grande mãe que possui.
Ao meu orientador Prof. Dr. André Freitas, pela atenção, sugestões ajuda
e boa vontade na revisão desse trabalho. Agradeço muito por toda sua
disposição e pelas inúmeras conversas esclarecedoras que enriqueceram
este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Prof. Dra. Luciana Ramalho, pela paciência e por me ajudar na leitura das
lâminas de histologia. Sou grata pela sua atenção.
A Profa Dra. Aparecida Marques, por ser uma verdadeira mãe baiana. Agradeço
a Deus por ter tido a chance de ter te conhecido, nunca fui tão bem amparada e
acolhida. Obrigada por sua amizade.
À Profa Dra. Marleny Gerbi, por me ajudar e compartilhar seu conhecimento.
Aprendi muito com seus ensinamentos, sua bondade e generosidade.
Aos meus colegas de doutorado Ana Góis, Maria Amália Ribeiro, Daniel
Pozza, Darcy Almeida, Gyselle Meirelles, Nelson e Alessandra Mattos por
passarmos unidos pelos bons e maus momentos dessa longa caminhada.
As minhas amigas especiais Ana Góis e Amália Ribeiro pelos conselhos e
amparo nos momentos desesperadores. Obrigada pela tranquilidade passada e
pela amizade verdadeira.
Ao doutorando Daniel Pozza, pelos inúmeros favores prestados, pelo seu
companheirismo e sua alegria.
À doutoranda Darcy Almeida, pela ajuda com a manipulação de animais,
sessões de radioterapia, e pelo incentivo inicial na pesquisa.
À doutoranda Alessandra Mattos, por sua amizade e união durante nossas
apresentações em dupla nos seminários.
Ao Prof. Dr. Lino João da Costa, pela belíssima organização e programação das
aulas em João Pessoa. Suas aulas foram fundamentais para o meu aprendizado.
Ao Prof Dr. Jean Nunes, pelos seus ensinamentos e acesso ao laboratório.
À técnica Maria de Lourdes Santos, pela dedicação e tempo prestado para
confecção das lâminas de histologia.
As secretárias Tereza Costa, Adriana Felix e Suely, pela atenção, avisos e
gentilezas prestados durante o doutorado.
Ao Prof. Dr. Edmar Santana pela coordenação e organização desse curso, que
apesar de inúmeras dificuldades, foi possível concluí-lo.
Ao Prof Dr. Antônio Pinheiro, por iniciar a turma de doutorado, pelas aulas
recebidas e por sua dedicação à pesquisa.
À Dra. Maria Eulina Ramos Tavares, pelo acesso ao setor de radioterapia e por
acreditar na pesquisa.
Ao físico Jaílton Caetano de Souza, pelas suas eternas horas extras irradiando
os animais. Muito obrigada pela sua paciência. Sua ajuda foi fundamental para
realização desse projeto.
A Rita de Cássia, por sua experiência, ajuda e boa vontade na elaboração do
material para o procedimento radioterápico.
A MM Optics, pelo empréstimo do Laser.
A Capes, pela ajuda de custo durante todo o período do doutorado
A UNIME, em especial para Marcos Ribeiro e Ana Verena, pelo empréstimo das
dependências da Universidade e utilização do biotério.
Ao técnico Cristiano da Rosa, pela ajuda com a manipulação dos animais.
Ao Hospital Santa Izabel pelo empréstimo do aparelho e dependências do
hospital.
A Faculdade de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul, em nome das professoras doutoras Elaine Bauer Veeck e Nilza
Pereira da Costa, por disponibilizarem tempo, espaço e equipamento para
realização da parte imaginológica do experimento, além de extrema boa vontade,
paciência e conhecimentos dedicados ao presente trabalho.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
LISTA DE FIGURAS, GRÁFICOS E TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 26
2 REVISTA DA LITERATURA...................................................................... 29
2.1 ABORDAGEM GERAL SOBRE A RADIOTERAPIA................................ 30
2.2 EFEITOS ADVERSOS DA RADIOTERAPIA........................................... 32
2.3 EFEITOS DA RADIOTERAPIA SOBRE TECIDO ÓSSEO...................... 34
2.4 LASERTERAPIA...................................................................................... 43
2.5- IMAGENS RADIOGRÁFICAS DIGITAIS................................................. 51
3 PROPOSIÇÃO............................................................................................ 53
3.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................. 54
3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO........................................................................ 54
4 METODOLOGIA………….......................................................................... 55
4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA........................................................... 56
4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA.................................................................... 56
4.3 COLETA E PROCEDIMENTO DE DADOS............................................. 57
4.4 MATERIAIS.............................................................................................. 58
4.4.1 Equipamentos ………………………………………………………...........
4.4.2 Material para anestesia e sacrifício..............................................................
58
61
4.5 PESAGEM DOS ANIMAIS....................................................................... 61
4.6 PROCEDIMENTO DE DADOS................................................................ 61
4.6.1 Procedimento radioterápico...................................................................
4.6.2 Procedimento com o Laser....................................................................
61
64
4.7 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DA AMOSTRA TECIDUAL 66
4.8 PROCEDIMENTO RADIOGRÁFICO....................................................... 66
4.9 PROCEDIMENTO LABORATORIAL...................................................... 70
4.10 ANÁLISE HISTOLÓGICA....................................................................... 71
4.11 HIPÓTESES........................................................................................... 71
4.12 ANÁLISE DOS RESULTADOS.............................................................. 71
5 RESULTADOS........................................................................................... 73
5.1 INSPEÇÃO GERAL................................................................................. 74
5.2 ANÁLISE DO PESO DOS ANIMAIS........................................................ 75
5.3 RESULTADOS RADIOGRÁFICOS......................................................... 77
5.4 RESULTADOS DO EXAME MICROSCÓPICO....................................... 78
5.4.1 GRUPO I –CONTROLE – Somente radioterapia................................. 79
5.4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS................................................................ 82
5.4.2.1 Grupo II – Laser um dia antes da radioterapia...................................
5.4.2.2 Grupo III – Laser no mesmo dia da radioterapia................................
5.4.2.3 Grupo IV –Laser quatro semanas após a radioterapia.........................
83
87
90
6 DISCUSSÃO............................................................................................... 93
7 CONCLUSÕES........................................................................................... 107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................
ANEXOS.........................................................................................................
109
124
ANEXO A Aprovação da pesquisa pelo comitê de ética da Faculdade de
Odontologia da UFBA.....................................................................................
ANEXO B Aprovação da pesquisa pelo Hospital Santa Izabel......................
125
126
ANEXO C Solução Fixadora de Paraformaldeído tamponado a 4%............
ANEXO D Técnica de Coloração Picrosirius................................................
127
128
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SÍMBOLOS
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SÍMBOLOS
AsGa .............. Arseneto de Gálio ATA .............. Atmosfera absoluta ATP .............. Adenosina-trifosfato BGC .............. Bone Growth Chamber bit .............. Binary digit (elemento binário) bmp .............. Bit-mapped format BMPs .............. Bone Morphogenetics proteins = Proteínas Morfogenéticas do
osso Byte .............. Binary term (unidade de memória do computador) cm Centímetro (s) ºC .............. Grau centígrado cGy .............. Centigray = rad CH .............. Canais de Harvers cm2 .............. Centímetro quadrado CO2 .............. Dióxido de carbono CW .............. Emissão Contínua DE .............. Densidade de Energia DNA Ácido desoxirribonucléico DP .............. Densidade de Potência Dpi .............. Dots per inch (pontos por polegada – 1 polegada = 2,54 cm) f .............. Freqüência Fig. .............. Figura G .............. Grama(s) Ga .............. Gálio GaAlAs .............. Galium Aluminum Arsenide: Arseneto de Gálio e Alumínio Gy .............. Unidade de dose de radiação absorvida; Gray HBO .............. Hyperbaric Oxygen; Oxigênio Hiperbárico HeNe .............. Hélio Neônio H/E .............. Hematoxilina Eosina Hz .............. Hertz He Ne .............. Hélio Neônio J ………... Joule
J/cm2 .............. Joule por centímetro quadrado
Kg .............. Quilograma KrF .............. Fluoreto de Kriptônio LASER .............. Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
(Amplificação da luz pela emissão estimulada de radiação). LILT .............. Low Intensity Laser Treatment = Tratamento Laser com baixa
intensidade LLLT .............. Low Level Laser Therapy = Laserterapia de baixa potência ou
não-ablativa
kV .............. QuiloVolt M .............. Metro mA .............. MiliAmperagem Mev .............. Million electron volts mg .............. Miligrama min .............. Minutos ml .............. Mililitros mm .............. Milímetro mW .............. Miliwatts mW/cm2 .............. Miliwatts por centímetro quadrado µm .............. Micrômetro NCI .............. National Cancer Institute nm .............. Nanômetro O1 .............. Observação 1 O2 .............. Observação 2 P .............. Potência p .............. Probabilidade de erro pH .............. Potencial hidrogeniônico pixel .............. Picture element pl/mm .............. Pares de linha por milímetro R .............. Randomized, aleatório
.............. Marca registrada
rad .............. Unidade de radiação para medir a energia absorvida em um meio rhBMP 2 .............. Recombinant Human Bone morphogenetic protein 2 = Proteína
morfogenética do osso recombinante humana 2 RNA .............. Ácido ribonucléico S .............. segundo (s)
TGF- .............. Transforming Growth Factor beta = Fator de Crescimento e transformação beta
UFBA .............. Universidade Federal da Bahia UFPB .............. Universidade Federal da Paraíba X .............. Experimento W .............. Watt WHO .............. World Health Organization (Organização Mundial de Saúde) YAG .............. Ítrio Alumínio de Granada
.............. Comprimento de onda
º .............. Grau (s) % .............. Por cento
LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS
LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS
Quadro 01 Distribuição dos grupos.......................................................................57
Figura 01 Bomba de Cobalto...............................................................................59
Figura 02 Aparelho Laser GaAlAs.......................................................................60
Figura 03 Sistema digital DenOptix®...................................................................60
Figura 04 Casulos de acrílico utilizado no posicionamento dos animais.............62
Figura 05 Organização dos animais na sessão de radioterapia e
posicionamento do chumbo no dispositivo de acrílico........................62
Figura 06 Visão próxima dos animais durante a radioterapia..............................63
Figura 07 Pontos de irradiação com o Laser e área da radioterapia...................65
Figura 08 Aplicação do Laser..............................................................................65
Figura 09 Disposição das peças cirurgicas sobre a placa de imagem, seta
evidencia o penetrômetro de alumínio.................................................67
Figura 10 Imagem radiográfica digital exibindo as peças cirúrgicas…................67
Figura 11 Mensuração da média dos níveis de cinza de área selecionada no
fêmur através do Programa ImageTool®, utilizando-se a ferramenta
"histograma"........................................................................................69
Figura 12 Espécime óssea após o corte, esquerda grupo controle, direita
grupo IV...............................................................................................70
Figura 13 Aspecto clínico da lesão cutânea e alopécia, animal do
grupo IV..............................................................................................75
Figura 14 Lesão cutânea severa, animal do grupo II...........................................75
Quadro 02 Percentual de ganho de massa corporal dos animais........................76
Figura 15 Média da massa corporal inicial e final dos animais............................77
Figura 16 Média dos níveis de cinza, do tecido ósseo avaliado por grupo..........78
Figura 17 Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas
da radioterapia. Observar presença exuberante de tecido adiposo na
medula óssea. H/E, Aumento aprox. de 100x......................................80
Figura 18 Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas
da radioterapia. Observar osso cortical com a presença de poucos
osteócitos e canais de Harvers. H/E, Aumento aprox. de 100x...........80
Figura 19 Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas
da radioterapia. Observar osso cortical com a presença de poucos
osteócitos. H/E, Aumento aprox. de 200x...........................................81
Figura 20 Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas
da radioterapia. Observar áreas de reabsorção óssea na proximidade
da medula. H/E, Aumento aprox. de 200x............ ...............................81
Figura 21 Média do no osteócitos em dez campos, a depender do grupo
avaliado................................................................................................82
Figura 22 Média do no canais de Harvers em dez campos, a depender do
grupo avaliado.....................................................................................83
Figura 23 Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da
radioterapia. Medula óssea com menor proporção de tecido adiposo.
H/E, Aumento aprox. de 100x..............................................................85
Figura 24 Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da
radioterapia. Observar osso cortical com maior densidade de
osteócitos. H/E, Aumento aprox. de 100x............................................85
Figura 25 Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da
radioterapia. Observar osso cortical com a presença de canais de
Harvers. H/E, Aumento aprox. de 200x..............................................86
Figura 26 Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da
radioterapia. Observar presença de fibrilos de colágeno no interior
da medula óssea. Picrosírius, Aumento aprox. de 200x.....................86
Figura 27 Fotomicrografia da espécime do grupo III após seis semanas da
radioterapia. Observar proporção tecido medular / tecido adiposo.
H/E, Aumento aprox. de 100x..............................................................88
Figura 28 Fotomicrografia da espécime do grupo III após seis semanas da
radioterapia. Observar osso cortical com a presença moderada de
osteócitos. H/E, Aumento aprox. de 200x...........................................88
Figura 29 Fotomicrografia da espécime do grupo III. Observar áreas de
reabsorção óssea na proximidade da medula óssea. H/E, Aumento
aprox. de 100x....................................................................................89
Figura 30 Fotomicrografia da espécime do grupo III. Observar presença de
fibrilos de colágeno na superfície cortical interna. H/E, Aumento
aprox. de 100x.....................................................................................89
Figura 31 Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar menor
proporção de tecido adiposo. H/E, Aumento aprox. de 100x.............91
Figura 32 Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar osso cortical
com a presença de muitos osteócitos. H/E, Aumento aprox. de
100x.....................................................................................................91
Figura 33 Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar osso cortical
com a presença de canais de Harvers. H/E, Aumento aprox.
de 200x...............................................................................................92
Figura 34 Fotomicrografia da espécime do grupo IV após seis semanas da
radioterapia. Observar intensa atividade osteoblástica, com neo-
formação óssea. H/E, Aumento aprox. de 200x.................................92
RESUMO
RESUMO
O efeito biomodulador do Laser em tecido duro normalmente vascularizado já foi comprovado cientificamente, no entanto seu efeito sobre o tecido ósseo submetido à radioterapia ainda não foi estudado na literatura consultada. O presente estudo
teve como finalidade avaliar o efeito da Laserterapia (=780 nm) sobre o tecido ósseo de ratos submetidos à radioterapia. Vinte e dois ratos Wistar foram aleatoriamente divididos em quatro grupos: Grupo I -Controle (n=4), recebeu apenas radioterapia; Grupo II- Laser um dia antes da radioterapia (n=6); Grupo III- Laser logo após a radioterapia (n=6); Grupo IV- Laser quatro semanas após a radioterapia (n=6). A radiação ionizante utilizada teve como fonte o Cobalto 60 e foi aplicado em dose única de 3000 cGy no fêmur. Os grupos experimentais, que foram submetidos ao Laser, receberam sete irradiações com intervalos de 48 h. O Laser foi aplicado em todos os grupos experimentais em quatro pontos com densidade de energia de 100 J/cm2, potência de 40 mW, tempo de 100 segundos, área de spot de 0,04 cm², por sessão. Todos os animais foram sacrificados seis semanas após a radioterapia. Clinicamente foi possível observar erosões cutâneas, iniciadas na sexta semana após a radioterapia, nos animais que receberam Laser (grupos II, III e IV). Radiograficamente observou-se uma quantidade significativamente maior (p<0,05) de tecido ósseo nos grupos II e IV, quando comparado com o grupo controle; o mesmo fato não ocorreu com o grupo III. Histologicamente foi possível observar no tecido ósseo um aumento da celularidade medular, do número de osteócitos e canais de Harvers nos grupos II e IV (p<0,05). Ocorreu ainda um aumento estatisticamente significante da atividade osteoblástica nos grupos II, III e IV (p<0,05). Pode ser concluído com esse estudo que a Laserterapia determinou uma resposta positiva na biomodulação do tecido ósseo irradiado, principalmente quando iniciada antes da radioterapia ou após quatro semanas. A utilização do Laser nos parâmetros acima, no entanto deve ser utilizado com cautela, devido às lesões cutâneas evidenciadas.
Palavras chaves: Radioterapia, Laser, Tecido ósseo.
ABSTRACT
ABSTRACT
The biostimulation effect of Laser in well vascularized bone tissue has already been demonstrated successfully; however its effect on bone tissue submitted to radiotherapy has not been studied yet on the literature reviewed. The aim of the
present study was to investigate the effect of Laser therapy (=780 nm) on bone tissue submitted to ionizing radiation. Twenty-two Wistar rats were randomly divided into four groups: Group I- control (n=4), submitted only to radiotherapy; Group II- Laser one day previously to radiotherapy (n=6); Group III- Laser immediately after radiotherapy (n=6); Group IV- Laser four weeks after radiotherapy (n=6). The source of ionizing radiation used was Cobalt 60, which was applied in a single dose of 3000 cGy on the femur. The Laser groups received seven applications with 48 hour interval in four points per session of DE=100 J/cm2, P=40 mW, t=100 s, beam diameter of 0.04 cm2. All animals were killed six weeks after radiotherapy. Clinical exam revealed cutaneous erosions on Laser groups (II, III and IV) that started at the 6th week after radiotherapy. The radiographic findings showed a higher bone density in groups II and IV (p<0.05) compared to control group; the same fact did not occurred to group III. Histological evidences corroborated with radiographic findings. The results showed an increase of bone marrow cells, number of osteocytes and Haversian canals in Laser groups II and IV (p<0.05). It was also found an increase of osteoblastic activity on groups II, III and IV (p<0,05). In this study Laser therapy presented a positive biostimulative effect on bone tissue; especially when applied before or four weeks after radiotherapy. However, the use of Laser in these parameters above should be used with caution due to epithelial erosions.
Key Words: Radiotherapy, Laser, Bone tissue.
26
INTRODUÇÃO
27
1- INTRODUÇÃO
O uso de altas doses de radiação é comumente observado no tratamento de
tumores malignos. No entanto, efeitos colaterais ocorrem com esse tipo de
tratamento, devendo-se ao fato que a radiação ionizante não é capaz de distinguir
células tumorais de células sadias (CALHOUN, SHAPIRO e STIERNBER, 1988;
KYOHARA, SAKURAI e KASHIMA, 2003). Conseqüentemente, a destruição do
tecido saudável limita a ampla capacidade da utilização da radioterapia.
Dentre esses efeitos colaterais, as complicações bucais mais importantes
incluem mucosite, xerostomia, cáries, perda do paladar, infecções secundárias,
osteorradionecrose e trismo (ALMEIDA et al, 2004). As cáries de radiação
aparecem, progridem rapidamente e são encontradas em todas as superfícies
dentárias, mesmo naquelas superfícies que são relativamente imunes ao seu
aparecimento. Localizações como dentes anteriores mandibulares, nos quais são
geralmente mais resistentes às cáries, são igualmente afetados (KARMIOL e
WALSH, 1975).
As lesões ósseas por sua vez são preocupantes, caso seja necessária à
extração de algum dente, resultando numa grande dificuldade na capacidade de
regeneração daquele tecido (BRAS, DE JONGE e VAN MERKESTEYN, 1990;
KYOHARA, SAKURAI e KASHIMA, 2003). Uma outra alteração causada pela
radiação ionizante é o distúrbio no equilíbrio de atividades osteoblásticas e
osteoclásticas, a favor de um processo destrutivo, podendo ser observado
28
também uma diminuição do número de osteócitos e de osteoblastos, levando a um
declínio na síntese de colágeno e na atividade da fosfatase alcalina. Com isso, o
processo de formação de matriz óssea é paralisado, impedindo o processo de
mineralização, o que pode levar a fraturas ósseas espontâneas (AITASALO, 1986;
WURZLER et al., 1998).
As células endoteliais também são fortemente afetadas e a fibrose vascular
resulta numa diminuição da vascularização, afetando a vitalidade do osso e das
células medulares, tornando a área susceptível à infecção e necrose mesmo após
um pequeno trauma (BRAS, DE JONGE e VAN MERKESTEYN, 1990; WURZLER
et al., 1998). Por esse motivo, as extrações dentárias são contra-indicadas num
período de um ano após a radioterapia (NÉMETH, 2000).
O reparo ósseo é um assunto de imenso interesse para a odontologia devido
ao grande número de cirurgias que são realizadas envolvendo esse tecido. Com o
objetivo de auxiliar no processo de regeneração óssea, a laserterapia vem sendo
estudada como uma alternativa viável. Acredita-se que a irradiação laser pode agir
na bio-modulação de células mesenquimais não diferenciadas, transformando-as
em osteoblastos e osteócitos (TUNÉR e HODE, 2004).
O presente estudo teve como finalidade avaliar o efeito do laser de baixa
potência no tecido ósseo de ratos submetidos à radioterapia. As sessões de
laserterapia foram iniciadas em três momentos distintos: um dia antes da
radioterapia, no mesmo dia da radioterapia e quatro semanas após a aplicação da
radiação ionizante.
29
REVISTA DA LITERATURA
30
2- REVISTA DA LITERATURA
2.1- ABORDAGEM GERAL SOBRE A RADIOTERAPIA
De acordo com os dados da Organização Mundial de Saúde (WHO), mais de
onze milhões de pessoas são diagnosticadas com câncer todos os anos, sendo
estimado que a partir de 2020 irão existir mais de dezesseis milhões de novos
casos por ano. Além disso, o câncer causa anualmente sete milhões de mortes,
ou seja, 12,5% das mortes do mundo. Dentre as modalidades terapêuticas, a
radioterapia representa um recurso bem estabelecido para o tratamento do câncer
de cabeça e pescoço. Aproximadamente metade dos pacientes com câncer utiliza
a radioterapia em alguma fase do tratamento da doença, seja de maneira isolada
ou associada a outras formas de terapia oncológica (HYDERLEY e MADDOCK,
1996).
A radioterapia pode ser aplicada a partir de fontes de radiação externa
(radioterapia externa), bem como através de implantes intersticiais, inseridos no
interior dos tecidos, ao que se denominada braquiterapia. A principal vantagem da
braquiterapia é que há uma alta dose de radiação para o tumor sem grandes
comprometimentos aos tecidos sadios circundantes (SANNOMIYA e FURUKAWA,
2000). A radioterapia com fontes radioativas externas localizadas a uma distância
de 1 a 2 centímetros (cm) da área irradiada, é denominada de plesioterapia e
distâncias maiores recebem o nome de teleterapia. Dentre as fontes externas de
irradiação estão às irradiações por Ortovoltagem, Cobaltoterapia, Irradiação de
31
Betatron, Acelerador Linear, Radio 226, Sementes de Radônio, Césio 137 e Ouro
198 (SANNOMIYA e FURUKAWA, 2000).
Na Cobaltoterapia a fonte radioativa do Cobalto 60 é acondicionada no
interior da máquina utilizada para radioterapia. Este material emite partículas de
alta energia a qual tem uma média de 1,2 meV (SANNOMIYA e FURUKAWA,
2000).
A dose de radiação dada em cabeça e pescoço é variada e expressa em
centiGrays (cGy), sendo que a unidade de padronização internacional gray (Gy)
equivale a 100 rad, portanto 1 cGy corresponde a 1 rad (EPSTEIN, WONG e
STEVENSON-MOORE, 1987).
As doses totais de irradiação empregadas para tratamento de tumores de
cabeça e pescoço podem ser de até 8000 cGy, podendo ter indicação exclusiva
pré ou pós-operatória (DIB et al., 2000 e NAGLER, 2001). Essa dose total é
baseada na localização, no tipo histológico, e se a radioterapia será usada sozinha
ou em combinação com outras modalidades de tratamento. A maioria dos
pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço utiliza doses entre 50 e 70 Gy
com finalidade terapêutica, que geralmente é realizada num período de cinco a
sete semanas, uma vez ao dia com doses de 2 Gy por fração (DOBBS, BARRETT
e ASH, 1999, VISSINK et al., 2003).
A radioterapia pode ser fornecida em doses fracionadas, ou hiperfracionadas.
O fracionamento é uma questão importante na resposta da radioterapia. Doses
hiperfracionadas são doses baixas, porém são realizadas em dois tratamentos
diários, enquanto a fracionada apenas em um. Esse hiperfracionamento tem
32
demonstrado um melhor controle do tumor em alguns casos, porém aumenta a
toxicidade aguda (WHITERS e McBRIDE, 1998). Estudos em ratos Wistar
demonstram que doses hiperfracionadas podem diminuir a força de tensão em
feridas cutâneas (OZBECK et al., 2005).
2.2- EFEITOS ADVERSOS DA RADIOTERAPIA
Além do efeito anti-neoplásico, a radioterapia causa alterações teciduais no
campo da radiação com efeitos colaterais muitas vezes severos. A irradiação
ionizante afeta muito precocemente o conteúdo do ácido desoxirribonucléico (ADN
- DNA) nuclear, levando a aneuploidia (CAMARGO et al., 2005).
A alteração na região irradiada predispõe os tecidos bucais a infecção
bacteriana e atraso de cicatrização, podendo ainda resultar em dermatite de
radiação, fibrose, edema, telangectasia, hipossalivação, mucosite (doses acima
180 cGy), hipogeusia ou ageusia, cáries (devido à diminuição da saliva e
mudanças em sua composição química), candidose, danos em glândulas salivares
(fibrose, degeneração gordurosa, atrofia acinar e necrose celular),
osteorradionecrose e trismo. Algumas dessas lesões podem ser tratadas, sendo
que outras podem evoluir para sequelas (HAPPONEN et al., 1983; SILVERMAN,
1994; THORN et al., 2000; MOURA, CASTRO e FREIRE, 2003).
De acordo com o período em que ocorrem, esses efeitos adversos são
classificados em agudos e tardios. A morbidade aguda ocorre durante a
radioterapia e acomete tecidos com alta taxa de renovação celular, como a
mucosa bucal. Os efeitos tardios podem apresentar-se meses ou anos após o
33
tratamento, observando-se os mesmos em tecidos e orgãos de maior
especificidade celular, como músculos e ossos. O comprometimento da formação
dentária, desenvolvimento e crescimento podem ocorrer quando o tratamento é
realizado durante a infância (DIB et al., 2000).
A resposta aguda da mucosa é um resultado da interrupção da mitose das
células epiteliais, já que o ciclo celular do queratinócito basal é de
aproximadamente quatro dias (SCULLY e EPSTEIN, 1996). A mucosite induzida
pela radioterapia é definida como uma inflamação reacional da mucosa bucal e
orofaringeana durante a radioterapia de cabeça e pescoço, e é caracterizada por
uma atrofia do tecido epitelial escamoso com ausência de dano vascular, e por um
infiltrado inflamatório localizado na região basal (HANDCHEL et al., 1999). Os
efeitos agudos na cavidade bucal causados pela radioterapia devem ser
abordados pelo cirurgião-dentista, pois estes podem muitas vezes limitar ou até
mesmo impedir a conclusão do tratamento oncológico, causando impacto no
prognóstico e qualidade de vida do paciente. A redução dos efeitos secundários
do tratamento oncológico é aparentemente a melhor solução para diminuir a
morbidade psico-social dos pacientes sobreviventes (BJORDAL, MASTEKAASA e
KAASA, 1995), além do custo e tempo total do tratamento (SONIS et al., 2000).
Em relação à dentição, o problema mais comum são as cáries de radiação,
que podem se tornar visíveis com três meses após o início da radioterapia, e em
casos severos uma dentição que era saudável pode ser totalmente destruída em
um ano (DREIZEN et al., 1977b). Acredita-se que a causa da destruição dentária
seja mudanças no fluxo e consistência salivar, o que promove um maior acúmulo
34
de ácidos e placa bacteriana nessas superfícies, levando a uma rápida
descalcificação do esmalte (VISSINK et al., 2003a). Além da alteração do fluxo
salivar, também já foi constatada diminuição do seu pH, numa média de 7,6 antes
da radioterapia e 6,8 após o tratamento (LIMA et al., 2004). Por esse motivo é
necessária uma avaliação odontológica criteriosa dos elementos dentários antes
da radioterapia. Caso haja necessidade de extração é importante que se espere
um período de no mínimo de dez a quatorze dias, para que ocorra uma boa
cicatrização antes de iniciar o procedimento radioterápico (STARCKE e
SHANNON, 1977).
O fator mais importante e que é limitador da dose é a tolerância dos tecidos
normais adjacentes à radiação. Dependendo do estágio e localização do tumor
principal e dos linfonodos afetados, a radiação pode se dirigir para boca, glândulas
salivares, mandíbula e maxila. Com isso, apesar de uma elaboração de tratamento
com doses ótimas, podem ocorrer efeitos não desejados nesses tecidos (VISSINK
et al., 2003a).
2.3- EFEITOS DA RADIOTERAPIA SOBRE O TECIDO ÓSSEO
A radiação ionizante externa é uma modalidade importante no tratamento de
lesões malignas de cabeça e pescoço. Esse tratamento gera efeitos adversos nos
tecidos ósseos regionais, incluindo numa diminuição da capacidade de
cicatrização de fraturas ósseas e osteorradionecrose (MITCHELL e LOGAN,
1998). Esses efeitos colaterais são consistentes, já que diminuem a
vascularização e reduzem o número de osteócitos, suprimindo a atividade
35
osteoblástica. A exposição de cultura de células similares a osteoblastos (MC3T3-
E1, clones de células osteoblásticas) à radiação ionizante ocasiona uma
diminuição na proliferação celular e um aumento na atividade da fosfatase
alcalina, marcador de diferenciação dos osteoblastos (DUDZIAK et al., 2000).
Além desse fator, a radioterapia pode levar os tecidos irradiados da cavidade
bucal a desenvolverem alterações como a endoarterite obliterante, que pode
resultar em um estado de hipovascularidade local, com consequente hipóxia
tecidual. Pode ocorrer ainda um estado de hipocelularidade, caracterizado
principalmente pela ausência de osteoblastos e defeito nos osteoclastos (MARX,
1983; HARRIS, 1992; MAXYMIW, WOOD e LIU, 1991; THORN et al., 2000;
MOURA, CASTRO, FREIRE, 2003).
As lesões teciduais vão depender da dose total de radioterapia, dose efetiva
biológica, tamanho do campo irradiado, do número e intervalo entre as sessões,
fracionamento da dose e agressão cirúrgica e/ou traumática ao tecido irradiado.
Os casos severos de destruição tecidual geralmente estão associados a doses
maiores que 7.000 cGy, embora 6.000 cGy possam resultar em
osteorradionecrose na mandíbula (CARLSON e ZAK, 1994; JERECZEK-FOSSA e
ORECCHIA, 2002).
As grandes alterações na matriz óssea após a irradiação são desenvolvidas
lentamente, nas quais as mudanças iniciais são resultados de uma injúria ao
sistema de remodelagem óssea, ou seja, os osteoblastos, osteócitos e
osteoclastos. Os osteoblastos tendem a ser mais radiossensíveis que os
osteoclastos, portanto pode ocorrer um aumento da atividade da lise celular. Ainda
36
hoje não foi comprovado se a alteração na atividade de remodelagem óssea é um
resultado direto do dano da radiação das células desse sistema, ou de um
resultado indireto do dano vascular causado pela radiação, ou ainda, uma
combinação dos dois fenômenos. A injúria na fina vascularização óssea e nos
tecidos adjacentes leva primeiramente a uma hiperemia, seguido de uma
endoarterite, trombose e progressivamente uma obliteração de pequenos vasos.
Com o tempo, a medula exibe uma acelularidade evidente com pequena ou
ausência total de vascularização, fibrose e degeneração gordurosa. Algumas
lacunas ficam destituídas de osteócitos, ocorre uma atrofia do endósteo com
redução da atividade dos osteoblastos e osteoclastos. O periósteo se apresenta
com uma fibrose significativa, com uma perda semelhante dos elementos de
remodelagem (VISSINK et al., 2003a).
Em caso de pacientes jovens, ainda em fase de crescimento, a radiação
ionizante pode comprometer o crescimento dos ossos na região irradiada,
resultando em deformidades (GOLDWEIN, 1991); no entanto, estudos em ratos
Sprague-Dawley demonstram que esse efeito pode ser minimizado se as doses
forem ministradas de forma fracionada (EIFEL, 1988), ou se combinadas com o
uso de melatonina antes da radioterapia (YAVUZ et al., 2003).
Vários estudos em animais correlacionam a cicatrização da ferida óssea com
o tratamento radioterápico. Jacobsson et al. (1985) avaliaram a capacidade de
regeneração da maturação óssea após as irradiações de 5, 8, 11, 15 e 25 Gy com
dose única de Cobalto 60. Nesta pesquisa, os autores utilizaram a metodologia da
câmara de crescimento ósseo (The Bone Growth Chamber, BGC). A BGC
37
consistiu na inserção de um implante de titânio na superfície proximal da metáfise
das duas tíbias dos coelhos, sendo que a radiação ionizante foi aplicada em
apenas uma das tíbias. Cada animal serviu como próprio controle. Após o período
de quatro semanas de cicatrização, os implantes foram removidos e o volume do
osso neoformado foi aferido através da microrradiografia e microdensiometria. Os
autores observaram que em doses entre 5 e 8 Gy, a regeneração óssea foi
reduzida em aproximadamente 20%, quando comparadas com a área controle que
não foi irradiada; em doses entre 8 e 11 Gy, observou-se uma diferença crítica, já
que um pequeno aumento da dose provocou uma enorme redução de formação
óssea, variando de 23 a 64%; nas doses acima 11 Gy, foi observada uma
diminuição na neoformação óssea entre 65 a 75% quando comparado ao grupo
controle.
Morales Marx e Gottlieb (1987) estudaram os efeitos da pré e pós-radiação
na capacidade de cicatrização de enxerto ósseo em coelhos. Os autores
concluíram que enxertos colocados em tecidos previamente irradiados falharam
na formação de osso, resultando numa estrutura enfraquecida e histologicamente
deficiente em trabéculas ósseas. No entanto, enxertos ósseos irradiados após
quatro semanas apresentavam-se menos afetados pela radiação do que aqueles
irradiados nas primeiras quatro semanas, apresentando trabéculas ósseas
estruturalmente e histologicamente superiores ao trabeculado encontrado em
enxertos colocados em locais previamente irradiados.
Arnold et al. (1998) avaliaram os efeitos da dose da radiação, a seqüência e
o intervalo entre a cirurgia e a radioterapia. Os autores efetuaram um defeito
38
ósseo de 1,2 milímetros (mm) no fêmur de ratos e compararam a capacidade de
cicatrização antes e após o tratamento radioterápico. Foi concluído que a
capacidade de cicatrização aumenta se a radioterapia é dada com mais de quatro
dias após a cirurgia. O mesmo grupo de pesquisadores em outro estudo
irradiaram ratos com doses únicas de radiação X e após um dia promoveram um
defeito ósseo que se estendia através do córtex da diáfise até a cavidade medular.
Neste caso, a cicatrização da lesão foi acompanhada por um período de trinta
semanas até se obter o fechamento ósseo. Nos ratos não irradiados esse
fechamento se deu na sétima semana. Radiações com doses até 15 Gy causaram
um atraso dose-dependente na formação do calo ósseo primário e na sua
subseqüente troca por osso maduro, enquanto que em doses mais elevadas, a
capacidade de cicatrização tornou-se suprimida ou até mesmo comprometida
permanentemente. (ARNOLD, KUMMERMEHR e TROTT, 1995).
Outros pesquisadores observaram os efeitos da irradiação em osso cortical e
suas mudanças conforme o tempo. Para tal pesquisa, Maeda et al. (1988)
utilizaram ratos do tipo Sprague-Dawley e irradiaram 3500 cGy na coxa direita,
sendo observado que com duas semanas após a irradiação, os animais
apresentavam diminuição no peso, desaparecimento de células ósseas, contração
dos osteócitos e um decréscimo significativo das atividades de movimento ósseo;
a medula óssea apresentou redução de elementos hematopoiéticos e sinusóides
com um aumento de gordura. Nenhuma mudança na força de torção e nas
propriedades geométricas foi observada. No período de seis a dez semanas após
a irradiação, as anormalidades histológicas do osso permaneceram, porém houve
39
uma aceleração no processo de reabsorção. No entanto, um aumento significativo
na força e no osso cortical foi observado no fêmur contra-lateral (não irradiado).
Entre quatorze e dezoito semanas ocorreu uma diminuição do osso cortical e um
aumento de porosidade, quando comparados com os ratos controle. Outras
propriedades histomórficas, tais como a porosidade óssea, contagem de
osteócitos e neoformação de periósteo começaram a se restabelecer após dezoito
semanas da irradiação, se assemelhando as do grupo controle.
Kiyohara, Sakurai e Kashima (2003) observaram mudanças estruturais e
radiográficas do osso irradiado. Através de uma unidade geradora de radiação X,
trinta e cinco ratos receberam um total de 30 Gy num campo de 15X15 mm na
porção distal do fêmur, e foram sacrificados após uma, duas, três e quatro
semanas da utilização da radiação ionizante. Após a análise histológica das
epífises, foi possível constatar que com uma semana da radiação ionizante
ocorreu um aumento dos adipócitos tanto nas trabéculas como no tecido medular.
Após duas semanas, os adipócitos aumentaram mais e houve uma diminuição do
osso esponjoso e nas células da medula. Após três semanas, ocorreu um
decréscimo tanto no trabeculado ósseo quanto nas células da medula do osso
esponjoso. Após quatro semanas o osso esponjoso diminuiu ainda mais e o
espaço da medula óssea foi aumentado. Esses resultados foram corroborados
com os achados radiográficos.
Estudos de Takahashi et al. (1994) analisaram as mudanças no sistema de
Harvers após altas doses de radiação X com finalidade terapêutica. Um total de
25, 50 e 100 Gy foi irradiado no joelho dos animais, que foram avaliados através
40
da microangiografia, sendo constatado após quatro semanas da irradiação uma
dilatação na microvascularização. A partir da 12o semana pós-radiação, essa
vascularização estava bem diminuída e nenhum sinal de melhora no osso
subcondral foi observado após a 52o semana. Na análise morfológica foi revelado
na 4o semana duas mudanças nos canais de Harvers: uma oclusão dos canais
haversianos com perda de células no interior do canal, e uma dilatação capilar
com uma reabsorção anormal da matriz óssea perivascular através dos
osteoclastos. Essa reabsorção não foi substituída por uma neoformação óssea,
levando assim a um aumento da porosidade óssea. Após a 4o semana ocorreu um
decréscimo progressivo celular, incluindo as células endoteliais, células
mesenquimais perivascular, osteoblastos, osteócitos e osteoclastos, além da
diminuição do número de canais harversianos. A histomorfometria revelou que
tanto a variável tempo-dependente, quanto na dose-dependente levaram a um
decréscimo na densidade capilar e no número de osteócitos no osso subcondral.
A radioterapia de tumores de cabeça e pescoço freqüentemente diminui a
capacidade de cicatrização dos ossos do complexo maxilofacial. Uma das
complicações com maior morbidade é a osteorradionecrose, caracterizada
clinicamente por uma fístula buco-cutânea, exposição óssea e dor (NEAL, 2000),
ocorrendo predominantemente na mandíbula (90%), porém pode ser vista na
maxila (10%) e raramente observada em outros ossos faciais (HORIOT et al.,
1981, NÉMETH et al., 2000).
Alguns autores relatam que o maior perigo de desenvolvimento da
osteorradionecrose ocorre nos primeiros doze meses após a radioterapia, após
41
esse período ocorre uma diminuição das chances de seu aparecimento (MURRAY
et al., 1980). Por outro lado, outros autores, ao contrário do que se pensa,
acreditam que o risco de osteorradionecrose não diminui conforme o tempo e
pode se perpetuar ao longo de toda vida do indivíduo (KANATAS, ROGERS e
MARTIN, 2002).
O tratamento da osteoradionecrose dos ossos após a radioterapia ainda é
um desafio para o clínico. Estudos de Wurzler et al. (1998), avaliaram o potencial
das Proteínas Morfogenéticas do osso (BMPs) na capacidade de formação óssea
em animais previamente irradiados. As BMPs são proteínas morfogenéticas que
induzem a diferenciação óssea. Para a realização desse estudo, dois defeitos
ósseos de 3 mm de diâmetro foram criados na calvária de ratos. O tecido ósseo foi
previamente irradiado com uma dose única de 1200 cGy e os defeitos foram
tratados com doses diferentes do recombinante humano (rh) BMP-2, utilizando o
colágeno tipo I como carreador. Os autores concluíram que o BMP-2 induz a
regeneração óssea e tem excelentes aplicações em cirurgias reconstrutivas
maxilo-faciais após a radioterapia.
Thorn JJ et al. (2000) analisaram um grupo de oitenta pacientes com
osteorradionecrose e observaram que em mais da metade dos casos a lesão foi
iniciada após de exodontias, no entanto em um terço dos casos ocorreu
espontaneamente. Além disso, foi possível constatar que osteorradionecrose se
desenvolveu nos primeiros três anos em 74% dos casos, tendo predileção pela
região de molares na mandíbula. Praticamente em todos os pacientes, com
42
exceção de um, a osteorradionecrose foi encontrada no mesmo local da área
irradiada.
Um outro aspecto que causa discussão na literatura é sobre a colocação de
implantes após a radioterapia. Enquanto algumas pesquisas demonstram que é
possível a osteointegração de implantes dentários em tecidos irradiados
(BROGNIEZ et al., 2002), outros autores acreditam que os implantes devem ser
evitados, já que com a radioterapia o osso fica comprometido e com uma menor
capacidade de cicatrização (GRANSTROM et al., 1994). Acredita-se que os
implantes só podem ser colocados se a dose máxima de radiação for até 55 cGy
ou 65 cGy. Caso a dose exceda esse valor é necessária à utilização do oxigênio
hiperbárico (NICHIMURA et al., 1998).
O oxigênio hiperbárico tem sido utilizado amplamente no combate dos efeitos
não desejados da radioterapia, e até mesmo na osteorradionecrose. A terapia com
oxigênio hiperbárico consiste na inalação de 100% de oxigênio numa pressão de
pelo menos 1,5 atmosferas absolutas (ATA). Nessa técnica, o oxigênio é utilizado
como uma droga que é dissolvida no plasma e entregue aos tecidos
independentemente da hemoglobina (MAYER et al., 2005). Esse tratamento
estimula a angiogênese, através do aumento da neovascularização e otimização
de níveis celulares de oxigênio, aumentando a proliferação de osteoblastos e
fibroblastos, formação de colágeno e suporte para os novos vasos sanguíneos e
consequentemente uma melhor cicatrização no local da injúria (MYERS e MARX,
1990; CHAVEZ e ADKINSON, 2001).
43
Vários estudos comprovaram que a associação do oxigênio hiperbárico com
a colocação dos implantes promove uma melhor osteointegração minimizando as
possíveis falhas do mesmo (GRANSTROM, JACOBSON e TJELLSTRON, 1992;
GRANSTROM, TJELLSTROM e BRANEMARK, 1999). Além disso, o oxigênio
hiperbárico ajuda na prevenção da osteorradionecrose caso seja utilizado antes
das extrações dentárias (MARX, JOHNSON e KLINE, 1985). Quando utilizado
antes de procedimentos cirúrgicos, o oxigênio hiperbárico promove uma redução
na deiscência da ferida, diminuição da infecção e aceleração do processo
cicatricial (MARX, 1994).
2.4- LASERTERAPIA
A terapia com Laser de baixa intensidade é baseada na bioestimulação dos
tecidos, através de uma luz monocromática. Nas últimas décadas, a luz Laser tem
sido utilizada e testada no tratamento de lesões em tecidos duros e moles. Artigos
científicos desde 1971 têm demonstrado um efeito positivo da luz Laser nos
tecidos moles (MESTER, et al., 1971), aceleração na regeneração de nervos
lesionados (ROCHKIND et al., 1986; ANDERS, et al., 1993), aumento na formação
de novos capilares, através da liberação de hormônios de crescimento (KOVACS,
MESTER e GOROG, 1974), estimulação de DNA e da síntese do ácido
ribonucléico (RNA) celular (KARU et al., 1982; KARU, SMOLYANINOVA e
SELENIN, 1991; SAPERIA et al., 1996), indicando um crescimento celular e
síntese proteica. Os fatores de crescimento transformadores ß1 (TGF-ß1) tem
efeitos diretos na cicatrização e na regulagem de reabsorção-aposição óssea. O
44
TGF-ß1 estimula a proliferação de células precursoras da linhagem dos
osteoblastos e tem efeitos de estimulação direta na formação do colágeno ósseo.
(BONEWALD e MUNDY, 1990). Com isso, um efeito bioestimulador na síntese de
colágeno (CHEN e ZHOU, 1989; GHAMSARI et al., 1995) e a transformação de
fibroblastos em miofibroblastos (POURREAU-SCHNEIDER et al., 1990) também
estão muito bem documentadas.
A ação do Laser no tecido hematopoiético também já foi estudada. O Laser
diminui os mastócitos na medula óssea e os basófilos na periferia sanguínea; e
aumenta os eosinófilos. Não há mudanças no sangue periférico nos níveis de
hemoglobina, hematócrito, eritrócito ou reticulócito (PYCZEK, SOPALA e
DABROWSKI, 1994). No entanto, num estudo experimental de fraturas de rádio
em coelhos apresentaram alterações e aumento da atividade das células
sanguíneas, de macrófagos, fibroblastos e osteoclastos no grupo tratado com a
Laserterapia (TANG e CHAI, 1986).
O efeito da terapia com o Laser de baixa intensidade na regeneração óssea
tem se tornado foco de pesquisas recentes. Fraturas ósseas em ratos
apresentaram uma formação mais rápida de tecido ósseo com um melhor
trabeculado e maior vascularização após irradiações a cada dois dias com o Laser
de Hélio-Neônio (HeNe), 2,4J/cm2 durante três semanas (TRELLES e MAYOYO,
1987). Além disso, a Laserterapia tem demonstrado ser capaz de modular a
inflamação (LIZARELLI, LAMANO-CARVALHO e BRENTEGANI, 1999). Pacientes
com a síndrome da dor foram tratados com o Laser em doses entre 4-12 Joules
45
por centímetro quadrado (J/cm2) e 40% apresentaram uma melhora da dor e
desaparecimento do edema (KUCHARSKA e BATKO, 1997).
Em um estudo in vitro, Yamada (1991) irradiou com o Laser de HeNe culturas
de células osteoblásticas. A taxa de crescimento celular e a síntese de DNA
aumentaram somente quando a cultura estava em fase de crescimento. À longo
prazo, o acúmulo de cálcio obteve um aumento de 46% se comparado ao grupo
controle, após quatro sessões de irradiações de 1 J/cm2. No entanto, a atividade
da fosfatase alcalina permaneceu inalterada. Em um outro estudo, culturas de
células de medula óssea foram irradiadas com o Laser de 690 nanômetros (nm),
as quais apresentaram um aumento de depósito ósseo quando comparados a
culturas não irradiadas, concluindo que o Laser tem um efeito bioestimulador nos
osteoblastos (DORTBUDAK, HAAS e MAILATH-POKORNY, 2000). Acredita-se
que a Laserterapia resulta numa pequena liberação de oxigênio singleto, agindo
como um radical livre influenciando na formação de adenosina-trifosfato (ATP),
atuando no metabolismo celular (KUDOH et al., 1989).
A Laserterapia também tem demonstrado acelerar a proliferação celular em
estudos de Ueda e Shimizu (2001). Esses achados corroboram com resultados de
um estudo por Ozawa (1998) onde é sugerido que a irradiação a Laser possui dois
papéis principais na estimulação da formação óssea. O primeiro é a estimulação
da proliferação celular, especialmente na proliferação de células nodulares da
linhagem dos osteoblastos; e o segundo papel é a estimulação da diferenciação
celular, especialmente em células precursoras, resultando em um aumento do
número de células osteoblásticas mais diferenciadas e um aumento na formação
46
óssea. Os dois processos apenas podem ser estimulados através da irradiação à
Laser em células imaturas. Tais achados foram confirmados em novas pesquisas
de Ueda e Shimizu (2003), que afirmam que além de aumentar a proliferação
celular, o Laser estimula a formação de nódulos ósseos in vitro, e aumenta a
atividade e expressão genética da fosfatase alcalina. O aumento da atividade da
fosfatase alcalina já havia sido demonstrada em estudos anteriores de
Guzzardella et al. (2002).
Nagasawa (1991) pesquisou em um dos seus experimentos a capacidade de
regeneração óssea em trinta e seis ratos submetidos a defeitos no fêmur de 1 mm
de diâmetro. Antes da sutura, os defeitos foram irradiados com um tipo diferente
de luz Laser (Neodímio (Nd:YAG), Arseneto de Gálio e Alumínio (GaAlAs), HeNe,
Dióxido de Carbono (CO2), Fluoreto de Criptônio (KrF) exímero 248 nm). Em todos
esses grupos os ratos receberam doses de 100 J/cm2, exceto no grupo do
exímero, onde a dose foi de 2 J/cm2, e no grupo controle que não foi submetido à
luz Laser. Após dez dias a ferida foi analisada na microscopia óptica. No grupo
controle, foi possível constatar a presença de osteoclastos, com algumas
amostras com aspecto esponjoso e com poucas trabéculas ósseas. No grupo do
Nd:Yag foi observado uma formação esponjosa ativa com trabéculas bem visíveis.
Formações similares foram encontradas nos grupos de HeNe e GaAlAs. No grupo
tratado com o Laser de CO2 ocorreu um atraso na cicatrização, enquanto que no
grupo exímero foi observado sinais de necrose.
Yaakobi (1996) realizou defeitos ósseos na tíbia de ratos. A irradiação Laser
HeNe nos dias cinco e seis após o ato cirúrgico promoveu um aumento de 100%
47
no acúmulo de cálcio, quando comparado ao grupo controle. A atividade
osteoblástica também obteve um aumento devido a uma reflexão da atividade da
fosfatase alcalina.
Pinheiro (2001) avaliou morfometricamente a quantidade de osso
neoformado após irradiações Laser de 830 nm em feridas cirúrgicas em fêmur de
ratos. Quarenta e oito ratos da linhagem Wistar foram divididos em quatro grupos,
contendo doze animais em cada. O grupo A recebeu uma dose trans-cutânea de
4,8 J/cm2, três vezes na semana e foi sacrificado após vinte e oito dias. O grupo C
recebeu apenas três sessões e foi sacrificado após sete dias. O grupo B e D
serviram como controle, não receberam Laser e foram sacrificados com sete e
vinte e oito dias. Nos seus resultados foi possível observar uma diferença
significante de osso neoformado entre o grupo C e o grupo controle; no entanto,
não houve diferença significativa entre o grupo A e o controle.
Nicolau et al. (2003) estudaram os efeitos do Laser GaAlAs (densidade de
energia (DE) de 10 J/cm², área de spot de 0,08 cm², potência (P) de 0,005 Watts
(W), energia (E) de 0,8 J) na cicatrização de feridas ósseas. O fêmur de quarenta
e oito ratos foi perfurado por uma broca cirúrgica (vinte e quatro animais
receberam radiação com Laser nos dias dois, quatro, seis e oito após cirurgia e
vinte e quatro animais serviram como controle). Os animais foram sacrificados no
5o, 15o e 25o dia após a cirurgia. Nos grupos irradiados com Laser foi possível
observar uma maior aposição mineral no 15o e 25o dia após a cirurgia, uma maior
atividade osteoblástica quinze dias após a cirurgia e maior atividade osteoclástica
vinte e cinco dias após a cirurgia. Todos os resultados foram estatisticamente
48
significantes. O Laser também promoveu um aumento significativo do volume
ósseo cinco dias após a cirurgia.
Lirani (2004) avaliou os efeitos do Laser GaAlAs no reparo ósseo
(comprimento de onda () de 780 nm, DE=112,5 J/cm2, P=30 miliwatts (mW),
sessões de cinco vezes por semana, por doze dias). Após o ensaio mecânico, a
carga no limite máximo suportada pelo grupo Laser foi significantemente maior
(p<0,05) que o grupo controle (sem Laser). Na análise histomorfométrica, o grupo
tratado com Laser apresentou significância estatística quanto ao número e
superfície de osteoblastos e o volume e superfície de osteóide. Com esses
achados a autora conclui que o Laser é capaz de acelerar o reparo ósseo.
Khadra et al. (2004b) observaram os efeitos do Laser de 830 nm (GaAlAs,
P=75 mW, área de spot de 0,13 cm², densidade de potência (DP) de 550 mW/cm²,
DE=23 J/cm², E=3 J, tempo (t) de 40 seg.) em defeitos do osso parietal de ratos.
Através de uma análise histoquímica foi possível observar que o Laser aumentou
os níveis de cálcio, fósforo e proteína no grupo irradiado, quando comparado ao
controle (não irradiado). Na análise histológica foi possível observar um aumento
da angiogênese e formação de tecido conjuntivo com uma maior neoformação
óssea
Garavello, Baranauskas e Da Cruz-Hofling (2004) analisaram a influência do
Laser HeNe na angiogênese da medula na tíbia de ratos. Um orifício foi
confeccionado através de uma broca odontológica na tíbia e a superfície foi
irradiada com Laser HeNe diariamente (DE de 31,5 ou 94,5 J/cm2) por sete ou
49
quatorze dias, começando a primeira irradiação vinte e quatro horas após a
cirurgia. Após análises de microscopia óptica foi possível constatar que o Laser
acelerou a deposição de matriz óssea, aumentou significativamente o número de
vasos sanguíneos após sete dias de irradiação com a DE de 94,5 J/cm2. No
entanto, com quatorze dias, as duas DE utilizadas refletiram numa diminuição
significante dos vasos sanguíneos. Esses efeitos foram atribuídos ao tratamento
com o Laser, já que nenhum aumento significante no número de vasos
sanguíneos foi detectado na perna não irradiada.
Saito e Shimizu (1997) investigaram os efeitos da Laserterapia na
regeneração óssea da sutura palatina mediana durante a expansão palatina. Os
autores utilizaram o Laser de GaAlAs, P=100 mW por sete dias (três ou dez
minutos diários), três dias (sete minutos por dia, no dias zero a dois ou quatro a
seis) e por um dia (vinte e um minutos seguidos sem interrupção, no dia zero). A
regeneração óssea da sutura palatina mediana estimada através de um método
histomorfométrico no grupo de sete dias de irradiação demonstrou uma
aceleração de 1,2 a 1,4 vezes quando comparado com o grupo não irradiado, e
esse aumento foi dose-dependente. A irradiação foi mais efetiva nos dias zero a
dois do que nos dias quatro a seis, ou no dia de dose única. Esses achados
sugerem que a Laserterapia pode acelerar a regeneração óssea na sutura palatina
durante uma rápida expansão palatina e que esse efeito é dependente não só na
dose total da irradiação Laser, mas no tempo e frequência da irradiação.
Uma outra indicação do Laser é na Implantodontia. O Laser é capaz de
aumentar a proliferação celular, aumentar a síntese de osteocalcina e produção do
50
TGF-β1, possivelmente resultando numa maior adesão celular com uma
modulação da atividade celular do tecido ao redor do implante (KADHRA et al.,
2005). Estudos de Asanami et al. (1993) demonstram um bom resultado do Laser
na neoformação óssea quando utilizado com implantes de hidroxiapatita em
mandíbulas de coelhos. Estudos de Khadra et al. (2004a) utilizaram o Laser
GaAlAs na cicatrização óssea de implantes de titânio. O Laser foi aplicado
imediatamente após a cirurgia e mantido por dez dias consecutivos com
aplicações diárias. Após uma análise histomorfométrica foi possível constatar que
os implantes que foram submetidos à ação do Laser apresentavam uma maior
quantidade de osso aderido ao implante, quando comparado ao grupo controle,
sem Laser. Além disso, os níveis de cálcio e fósforo estavam mais elevados no
grupo irradiado do que no não irradiado, sugerindo um maior processo de
maturação óssea. Tal fato já havia sido comprovado em estudos anteriores de
Guzzardella et al. (2003), onde além de encontrar uma maior interface
hidroxiapatita-osso, os autores observaram um aumento da microdureza óssea
nos local onde o Laser foi aplicado.
Pinheiro et al. (2003) avaliaram histologicamente a influência da Laserterapia
(=830 nm, P=40 mW, DE=4 J/cm²) sobre o reparo de defeitos padronizados em
fêmur de ratos submetidos ao implante de osso bovino Gen-ox®. Os animais
foram irradiados a cada 48 h, por duas semanas e sacrificados quinze, vinte e um
e trinta dias após a cirurgia. Os resultados mostraram evidência de um reparo
ósseo mais avançado nos espécimes irradiados em relação ao grupo não
51
irradiado. O reparo nos espécimes irradiados foi caracterizado por uma maior
neoformação óssea, bem como por uma maior proliferação de fibras colágenas no
interior do defeito já a partir de quinze dias após a cirurgia. Os autores concluíram
que o Laser possui um efeito positivo na biomodulação do reparo de defeitos
ósseos submetidos a implante de osso bovino inorgânico.
2.5- IMAGENS RADIOGRÁFICAS DIGITAIS
O objetivo principal da realização de qualquer tipo de tomada radiográfica é a
reprodução mais fiel possível do objeto de interesse, pois a qualidade de imagem
se traduz no elemento de fundamental importância para o direcionamento de um
radiodiagnóstico. O sistema de imagens digitais apresenta diversas vantagens,
como um baixo custo, menor radiação e maior facilidade de manuseio, uma vez
que não precisam, como as convencionais, passar por um processo laboratorial
de revelação que poderia prejudicar e até alterar diagnósticos (WATANABE et al.,
1999.; NASSAR e NASSAR, 2002).
A imagem digital não possui o caráter estático de uma radiografia
convencional, ou seja, a técnica permite que as características da imagem
possam ser alteradas para que atinjam requisitos específicos de diagnóstico ou
ainda, para corrigir sub ou superexposições. Dessa forma, o contraste e a
densidade podem ser ajustados, a fim de se obter maiores informações
(FAGUNDES e CAMPOS, 2001). Além da interpretação subjetiva das imagens
digitais, a partir da mensuração dos níveis de cinza de áreas selecionadas nessas
52
imagens, uma grande variedade de análises podem ser realizadas (SARMENTO,
PRETTO, COSTA, 1999).
Diversos estudos comprovaram a superioridade e fidelidade dos sistemas
digitais em nível ósseo, principalmente no que diz respeito à perda óssea
periodontal (VOS, et al. 1986.; BRAGGER e PASQUALI, 1988). A radiografia de
subtração digital é um método que permite a detecção de pequenas alterações
ósseas com grande precisão, sensibilidade e especificidade, além de permitir
estimativas de área e volume de ganho ou perda óssea (RIBEIRO e FEITOSA,
1999). Na dentística também é possível utilizar as radiografias digitais,
principalmente no que se refere à visualização de cáries incipientes interproximais
(VERDONSCHOT et al., 1992, LAMBERTI, 2004).
Na endodontia é possível a utilização dos sistemas digitais para avaliar
condutos radiculares obturados (SARMENTO et al., 1998; LEAL et al., 2001) e
ainda a detecção de lesões periapicais. Neste aspecto tem sido bastante
documentada a superioridade dessas imagens em relação às radiografias
convencionais (SARMENTO e PRETTO, 2003; SARMENTO et al., 2005).
53
PROPOSIÇÃO
54
3- PROPOSIÇÃO
3.1- Objetivo Geral
Analisar o efeito do Laser de 780 nm na prevenção e tratamento dos efeitos
secundários da radioterapia em tecido ósseo.
3.2- Objetivos Específicos
- Avaliar clinicamente, radiograficamente e histologicamente a ação do Laser
de baixa intensidade infravermelho de 780 nm, P= 40 mW, emissão contínua
(CW), sobre o tecido ósseo de ratos submetidos à radiação ionizante
(radioterapia).
- Determinar o efeito do Laser de baixa intensidade infravermelho na
prevenção dos efeitos secundários da radioterapia no tecido ósseo, quando
iniciado um dia antes da radioterapia e logo após sua conclusão; e no tratamento
dos efeitos secundários da radioterapia, quando iniciado quatro semanas após a
radioterapia.
55
METODOLOGIA
56
4- METODOLOGIA
Esse experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Santa Izabel
(ANEXO A), e pela Comissão Interna da Faculdade de Odontologia da
Universidade Federal da Bahia (UFBA), (ANEXO B), de acordo com as Normas do
Conselho Nacional de Saúde para prática didático-científica da vivissecção de
animais – Resolução no1 de 13 de junho de 1988 e em observância da Lei 6688
de 08 de maio de 1979.
4.1- DELINEAMENTO DA PESQUISA
Foi realizado um estudo sob os paradigmas quantitativo e qualitativo
(PÁDUA, 1998), conforme especificado a seguir:
Estudo Experimental Verdadeiro, com grupo controle e só pós-teste.
Diagrama:
(CAMPBELL e STANLEY, 1970, 1973 e 1979)
E estudo descritivo não-experimental (KÖCHE, 1997).
4.2- POPULAÇÃO E AMOSTRA
Nesse estudo foram utilizados vinte e dois ratos da espécie Rattus
Norvegicus Albinus, Rodentia Mammalia, da linhagem Wistar, clinicamente sadios,
adultos, machos pesando aproximadamente entre 210 e 260 gramas (g), oriundos
da Faculdade Adventista de Fisioterapia (Cachoeira-BA). Os referidos animais
R X O1
O2
57
foram colocados em gaiolas individuais, medindo 20X30X13 cm e mantidos no
Laboratório de Experimentação Animal da União Metropolitana de Educação e
Cultura (Lauro de Freitas-BA), em condições ambientais de temperatura (22° C) e
luminosidade (ciclo 12 h dia / 12 h noite), umidade relativa de 50%, alimentados
com uma ração comercial sólida sob forma de pelotas (Nuvilab® CR 1) e com
água corrente ad libidum.
Diariamente foi realizada a higienização das gaiolas e do biotério, troca de
maravalha, troca de água dos recipientes e reposição de ração.
4.3- COLETA E PROCEDIMENTOS DE COLETA DE DADOS
A população foi distribuída aleatoriamente em quatro grupos, mantidos
individualmente em gaiolas devidamente etiquetadas na sua porção externa e
organizados de acordo com o Quadro 1.
QUADRO 01- Distribuição dos grupos
GRUPO
No DE
ANIMAIS
DESCRIÇÃO
I
4
Controle – Radioterapia
II
6
Radioterapia + Laser iniciado no dia anterior
III
6
Radioterapia + Laser iniciado no mesmo dia
IV
6
Radioterapia + Laser iniciado após quatro semanas
58
Grupo I- Grupo controle, formado por quatro animais, que foram submetidos
apenas à radiação ionizante (Cobalto 60- 3000 cGy).
Grupo II- Formado por seis animais, que foram submetidos à radiação
ionizante (Cobalto 60- 3000 cGy). No dia anterior a radioterapia foi iniciada as
aplicações com o Laser ( = 780 nm, P= 40 mW, CW, 4 pontos, DE= 100 J/cm2,
tempo (t) de 100 segundos (seg), a cada 48 horas durante 14 dias).
Grupo III- Formado por seis animais, que foram submetidos à radiação
ionizante (Cobalto 60- 3000 cGy) e iniciado o tratamento com o Laser no mesmo
dia, logo após a radioterapia (780 nm, P= 40 mW, CW, 4 pontos, DE=100 J/cm2,
t=100 seg, a cada 48 horas durante 14 dias).
Grupo IV- Formado por seis animais, que foram submetidos à radiação
ionizante (Cobalto 60- 3000 cGy) e iniciada a Laserterapia somente quatro
semanas após a ionizante (780 nm P=40 mW, CW, 4 pontos, DE=100 J/cm2, t=
100 seg, a cada 48 horas durante 14 dias).
Todos os animais dos grupos I, II, III e IV foram sacrificados seis semanas
após a radioterapia.
4.4- MATERIAIS
4.4.1- Equipamentos
- Bomba de Cobalto 60,Theratron 780® (Figura 01).
- Laser de diodo infravermelho (GaAlAs–Twin Laser, MMOptics®, São
Carlos, SP - Brasil), com P=40 mW e =780 nm, CW (Figura 02).
59
- Óculos de proteção adequado MMOptics® para o comprimento de onda do
Laser infravermelho
- Aparelho radiográfico Timex®, 70 kilovoltagem (kV) e 7 miliamperagem
(mA).
- Micrótomo LEICA® RM212SRT (Alemanha), utilizado no corte dos blocos de
parafina.
- Sistema fotográfico digital Vidcap® e um Microscópio estereoscópico Zeiss
Axiolab®, utilizado na digitalização e captura das imagens histológicas.
- Sistema radiográfico digital DenOptix® (Figura 03).
Figura 01- Bomba de Cobalto
60
Figura 02- Aparelho Laser GaAlAs
Figura 03- Sistema Digital DenOptix®
61
4.4.2- Materiais para anestesia e sacrifício
- Anestésico Tiopental Sódico (THIONEMBUTAL®).
- 01 cabo de bisturi, lâminas número (no) 15 e porta-agulha (para colocação
da lâmina do bisturi).
- 01 pinça de dissecção e tesoura de Metzembaum.
- Gaze, luvas de procedimento, máscaras, gorros, aventais.
- Lápis, papel e borracha.
4.5- PESAGEM DOS ANIMAIS
Os animais foram pesados numa balança digital (Filizola®) de sensibilidade
digital de 25 g a 3 quilos (kg). A pesagem foi realizada no dia do procedimento
radioterápico e na data de sacrifício. Os ratos foram pesados sempre pela mesma
pessoa e os dados registrados em uma planilha.
4.6- PROCEDIMENTO DE DADOS
4.6.1- PROCEDIMENTO RADIOTERÁPICO
Todos os animais foram submetidos à anestesia geral através de injeção
intraperitonial de Tiopental Sódico- 0,2 mililitros (ml) a cada 100 g. Os ratos foram
então tricotomizados na região coxo-femural da perna traseira e imobilizados
durante o procedimento radioterápico em dois dispositivos de acrílico construídos
especialmente para esse procedimento baseado no experimento de Machado,
2002. Cada dispositivo (Figura 04) consiste em uma porção abaulada (casulo)
onde ficava acomodado o corpo do animal (decúbito ventral) e uma porção
62
retilínea onde seu fêmur ficava posicionado. Cada dispositivo continha casulos, de
forma que cabia cinco animais no seu interior. Os dois dispositivos foram
colocados no campo de irradiação, portanto, a cada sessão de irradiação foram
simultaneamente irradiados dez animais (Figura 05 e 06).
Figura 04- Casulos de acrílico utilizados no posicionamento dos animais
Figura 05- Organização dos animais na sessão de radioterapia e posicionamento do chumbo no dispositivo de acrílico
63
Figura 06- Visão próxima dos animais durante a radioterapia
A radioterapia foi realizada no Hospital Santa Izabel, e o aparelho utilizado foi
a bomba de Cobalto marca Theratron 780. Blocos de chumbo foram utilizados
para delimitar a superfície a ser irradiada, com objetivo de irradiar somente uma
área de 20 X 20 mm no fêmur do animal, protegendo o restante do corpo contra os
efeitos da radiação. Para suportar tais blocos foi confeccionado um outro
dispositivo de acrílico composto por 2 placas, de forma que os blocos de chumbo
pudessem ser posicionados de maneira adequada (Figura 05 e 06). Esse
dispositivo foi contido na porção superior da bomba de Cobalto. O aparelho foi
colocado a uma distância da fonte para superfície de 80 cm. Nenhum tipo de bolus
foi utilizado durante o procedimento. Um total de aproximadamente 3000 cGy
(uma média de 60 cGy/min), em uma única sessão foi irradiado no fêmur,
utilizando apenas um campo de irradiação, de cima para baixo. A porção inferior
irradiada teve como base o joelho do animal, sendo o restante do fêmur irradiado
a partir desse ponto (Figura 07).
64
4.6.2- PROCEDIMENTO COM O LASER
O procedimento com o Laser foi realizado no Laboratório de Experimentação
Animal da UNIME. O aparelho utilizado foi o Laser de diodo infravermelho (GaAlAs
– Twin Laser – cedido pela MMOPTICS®, São Carlos, SP - Brasil), com P=40 mW
e =780 nm, CW. A dose aplicada foi de 100 J/cm2, em quatro pontos a cada 48
horas durante duas semanas (GERBI et al., 2005), perfazendo um total de sete
aplicações, que ocorreram sempre no horário do meio dia, iniciando a primeira
aplicação um dia antes, no mesmo dia, ou quatro semanas após a radioterapia, a
depender do grupo em questão.
A caneta Laser foi recoberta por filme PVC, bem justaposto à sua superfície,
sem formar rugosidades, evitando assim a difusão do Laser, além disso, o Laser
foi aplicado de forma perpendicular e em contato com a superfície a ser irradiada.
Os pontos da radiação foram escolhidos de acordo com a palpação e
marcados com caneta de retroprojetor, sendo o primeiro ponto a 0,5 cm acima da
porção mais inferior do fêmur, o segundo ponto também no fêmur a 1 cm de
distância do primeiro ponto, e os dois pontos restantes sendo um de cada lado.
Todos os pontos possuíam uma distância de 1cm, de forma que não ocorresse
uma overdose de radiação nesta região, conforme mostrado na Figura 07. Durante
todo o processo de irradiação à Laser, as marcações de caneta eram diariamente
refeitas, de tal maneira que facilitasse o processo de irradiação (Figura 08).
Terminados os procedimentos, os ratos foram colocados individualmente em
gaiolas, onde permaneceram até o dia do sacrifício.
65
Não foi feita nenhuma medicação analgésica, antiinflamatória ou antibiótica
durante todo o período experimental.
Área da radioterapia 2X2cm
2 cm
2cm0,5cm1cm
Pontos de aplicação do laser
JoelhoBacia
Área da radioterapia 2X2cm
2 cm
2cm0,5cm1cm
Pontos de aplicação do laser
JoelhoBacia
Área da radioterapia 2X2cm
2 cm
2cm0,5cm1cm
Pontos de aplicação do laser
JoelhoBacia
Figura 07- Pontos de irradiação com o Laser e área da radioterapia
Figura 08- Aplicação do Laser
66
4.7-SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DA AMOSTRA TECIDUAL
Os animais foram sacrificados seis semanas após a radioterapia, através de
uma overdose do anestésico Tiopental Sódico (aproximadamente 2 ml por
animal). Após a constatação da morte do animal, o fêmur foi desarticulado e as
pernas dos animais foram completamente removidas. Os espécimes foram
colocados em vidros previamente preparados e etiquetados, contendo solução de
Paraformaldeído tamponado 4% (ANEXO C) e seguidas para procedimento
radiográfico.
Após a tomada radiográfica, as peças foram incisadas longitudinalmente, de
modo a expor todo o fêmur. O fêmur foi totalmente removido, preservando o seu
periósteo e em seguida encaminhados ao Laboratório de Patologia da FOUFBA,
para procedimento histológico.
4.8- PROCEDIMENTO RADIOGRÁFICO
As peças cirúrgicas foram colocadas diretamente sobre uma placa de
imagem para radiografia cefalométrica do sistema radiográfico digital DenOptix®
300 dots per inch (dpi), pixel de 85 micrômetros (µm), de forma que a perna
estivesse com sua superfície ventral voltada para placa (Figura 09). Todas as
pernas, oriundas dos ratos do mesmo grupo, foram dispostas horizontalmente
sobre a mesma placa durante a exposição radiográfica. Isso evitou que possíveis
diferenças na exposição aos raios X (ruído fotônico (SARMENTO, CARVALHO e
LUZ, 2004)), alterassem a escala de cinza exibida nos espécimes de um mesmo
grupo experimental. Assim, as variações na densidade e no contraste da imagem
67
final, resultantes das oscilações da fonte de raios X, incontroláveis, ocorreram de
forma igual para todos os espécimes dentro de um mesmo grupo. Foi adicionado
ao conjunto um penetrômetro de alumínio de cinco degraus com 1 mm de
incremento. O aparelho radiográfico (70 kV e 7 mA) foi programado com um tempo
de exposição de 0,06 seg, distância focal de 1,20 m e feixe perpendicular ao
objeto.
Figura 09- Disposição das peças cirúrgicas sobre a placa de imagem, seta evidencia o penetrômetro de alumínio
Figura 10- Imagem radiográfica digital exibindo as peças cirúrgicas
68
Após a exposição radiográfica a placa foi levada à unidade de leitura do
sistema DenOptix®, permitindo a obtenção das imagens digitais correspondentes.
Estas foram exportadas do sistema e armazenadas em formato bmp (Bitmap)
(Figura 10). As imagens digitais foram então abertas no programa Photoshop®
(Adobe Systems Incorporated, Mountain View, California, USA) e corrigidas em
brilho a partir do penetrômetro e novamente salvas. Tal procedimento teve como
finalidade a uniformização dos tons de cinza exibidos pelas imagens dos
diferentes grupos avaliados, evitando que o ruído fotônico interferisse na posterior
mensuração dos valores dos níveis de cinza. Em seguida as imagens foram
abertas no programa Image Tool® (University of Texas Health Science Center,
San Antonio, Texas , USA), e traçando-se um polígono na região irradiada (pelo
Laser) de cada rato, através da ferramenta “histograma” foi mensurada a média
dos níveis de cinza daquela região (Figura 11).
A média dos níveis de cinza refere-se a um valor numérico que representa o
grau de brilho ou escurecimento dos pixels selecionados. Sabe-se que em um
computador de 8 bits, a escala de cinza pode exibir duzentos e cinqüenta e seis
possíveis tons de cinza, variando desde a cor preta até a cor branca, passando
por um número razoável de diferentes tons de cinza. Cada um desses tons é
representado no computador por um número, que varia do valor 0 (zero), que
equivale à cor preta, ao valor 255 (duzentos e cinqüenta e cinco), que representa
a cor branca (SARMENTO, PRETTO e COSTA, 1999). Mensurando-se o nível de
cinza de áreas selecionadas em uma imagem digital, pode-se avaliar o grau de
escurecimento de cada pixel, que por sua vez indicará a quantidade de tecido
69
mineralizado que foi atravessado pelo feixe de raios X, durante a exposição
radiográfica. Assim, pixels com valores de cinza mais altos, são brancos ou cinza
claros e representam áreas de maior conteúdo mineral. Áreas com níveis de cinza
pequenos (pretos ou cinzas escuros) indicam áreas com menor quantidade de
tecido mineralizado, que pode ter sido resultado, por exemplo, de processos de
reabsorção óssea (SARMENTO e RUBIRA, 1998; SARMENTO e PRETTO, 2003;
SARMENTO et al., 2005), ou no caso da estrutura dentária, ser resultante de uma
descalcificação como ocorre numa lesão de carie (LAMBERTI, 2004), ou ainda
significar uma maior porosidade ou menor quantidade de materiais odontológicos
(SARMENTO et al., 1998; LEAL et al., 2001; CRUZ et al., 2004). Os valores do
nível de cinza mensurados em cada espécime foram anotados numa ficha
específica, para posterior análise.
Figura 11- Mensuração da média dos níveis de cinza de área selecionada no fêmur através do Programa ImageTool®, utilizando-se a ferramenta "histograma"
70
4.9- PROCEDIMENTO LABORATORIAL
Após o período de fixação as peças foram descalcificadas em ácido nítrico à
10% por um período de trinta e oito horas. Após este procedimento, foram
cortadas (Figura 12), desidratadas e incluídas em parafina para posteriores cortes
histológicos de 5 µm, semi-seriados de 1:5.
Figura 12- Espécime óssea após o corte, esquerda grupo controle, direita grupo IV.
Para o corte dos blocos de parafina com as peças, utilizou-se um micrótomo
LEICA® RM212SRT (Alemanha).
Os cortes foram corados por Hematoxilina de Harris e Eosina Alcoólica (H/E)
e pela técnica de Picrosírius (ANEXO D), e analisadas em microscopia de luz com
aumentos de dez, vinte, quarenta e cem vezes. Para a digitalização e captura das
imagens foram utilizados um Sistema fotográfico digital Vidcap® e um Microscópio
estereoscópico Zeiss Axiolab®.
71
4.10- ANÁLISE HISTOLÓGICA
A análise dos espécimes através da microscopia de luz foi realizada por meio
de avaliação descritiva e semiquantitativa visando observar as características dos
efeitos da radioterapia e do Laser nos diferentes grupos, através da presença de
fibras colágenas, grau de atividade osteoblástica no periósteo, grau de reabsorção
óssea na proximidade da medula e proporção tecido adiposo/medular, em
aumentos de 4, 10, 20 e 40 vezes. A avaliação do grau foi realizada através de
valores numéricos 1 (leve), 2 (moderado), 3 (intenso).
Além disso, foi realizada através da microscopia de luz na lâmina histológica,
a escolha aleatória de dez campos ao longo de toda a cortical óssea, com o
aumento de vinte vezes. Esses campos foram fotografados e seguidos para
análise quantitativa da presença de osteócitos viáveis e canais de Harvers através
do programa de computação Image Tool®.
4.11- HIPÓTESES
H1- O Laser atua na prevenção dos efeitos danosos da radioterapia no tecido
ósseo.
H2- O Laser é capaz de tratar os efeitos adversos da radioterapia no tecido
ósseo.
4.12- ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os dados foram tabulados e analisados através dos testes não paramétricos
de Kruskal-Wallis, Qui-quadrado, teste Mann-Whitney e paramétrico teste t de
72
student não pareado, utilizando os programas de computação SPSS versão 9.0 e
INSTAT versão 3.0, com nível de significância estatística de 5% em todas as
análises.
73
RESULTADOS
74
5- RESULTADOS
5.1- INSPEÇÃO GERAL
Após a sessão de radioterapia, todos os animais, com exceção de um do
grupo IV (que foi a óbito), permaneceram sadios durante todo o período
observacional. Após o efeito anestésico, foi possível constatar uma falta de
movimentação das pernas irradiadas e dificuldade de locomoção dos animais.
Essa situação só foi amenizada a partir do quarto dia pós-radioterapia. A alopécia
foi constatada a partir da primeira semana em todos os animais, sendo mais
evidente nos grupos experimentais II, III e IV, que foram submetidos a
Laserterapia.
Ao final da sexta semana todos os animais deambulavam relativamente bem,
no entanto, no dia do sacrifício foi possível constatar pequenas erosões na pele da
perna de todos os animais dos grupos II, III, IV, de diferentes magnitudes. As
erosões estavam situadas na face interna da perna e não na superfície externa,
que encontrava-se mais próxima ao feixe da radiação. Todas as feridas foram
representadas por lesões maculares de aproximadamente 1 cm de diâmetro
(Figura 13), no entanto em dois animais, um do grupo II e um do grupo IV as
lesões se encontravam mais evidentes com aspecto eritematoso e mais severo
(Figura 14). No grupo controle, que recebeu somente radioterapia, tais erosões
não puderam ser observadas.
75
Figura 13- Aspecto clínico da lesão cutânea e alopécia, animal do grupo IV
Figura 14- Lesão cutânea severa, animal do grupo II
5.2- ANÁLISE DO PESO DOS ANIMAIS
Durante as seis semanas de duração do experimento, foi possível observar
que os ratos do grupo controle (somente radioterapia) apresentaram um ganho de
30,5% da massa corporal, correspondendo à menor taxa de incremento de massa
corporal dentre os grupos. Os ratos dos grupos experimentais apresentaram um
ganho maior, sendo que o grupo II (Laser um dia antes da radioterapia) apesar de
76
não apresentar os animais mais pesados ao tempo de sacrifício, obteve o maior
percentual de ganho de massa corporal, com 61,5%. O grupo III (Laser no mesmo
dia da radioterapia) apresentou um aumento de 52, 6% e o grupo IV (Laser quatro
semanas após a radioterapia) um aumento de 58,6%, conforme Quadro 02.
Quadro 02- Percentual de ganho de massa corporal dos animais
Grupo Massa corporal (g) % de ganho
Dia zero Sexta semana
Grupo Controle 256 334 30,5
Grupo II 218 352 61,5
Grupo III 234 357 52,6
Grupo IV 244 387 58,6
Comparando-se a massa corporal entre o dia zero e a sexta semana no
grupo controle, observa-se que houve diferença estatisticamente significante (p=
0,026, teste Mann-Whitney). Nos grupos experimentais essa diferença ainda foi
mais acentuada, no grupo II (Laser um dia antes da radioterapia), no grupo III
(Laser no mesmo dia da radioterapia) e no grupo IV (Laser quatro semanas após a
radioterapia), o valor de p (probabilidade de erro) foi menor que 0,0001 (teste t não
pareado), o que é considerado uma diferença extremamente significante (Figura
15).
77
200
240
280
320
360
400
0 6
Semana
Peso
(g
) Grupo I
Grupo II
Grupo III
Grupo IV
Figura 15- Média da massa corporal inicial e final dos animais
5.3- RESULTADOS RADIOGRÁFICOS
Após a análise das radiografias, a média dos níveis de cinza mensurado em
cada espécime foi comparada entre os grupos (teste t de Student). Assim, foi
possível observar que no grupo I (controle- somente radioterapia) a quantidade de
tecido ósseo foi a menor entre os grupos. No grupo II (Laser um dia antes da
radioterapia), foi observado um aumento desse volume, que foi estatisticamente
significante quando comparado ao grupo controle (p<0,01). No grupo III (Laser no
mesmo dia da radioterapia), ocorreu também um aumento da quantidade de tecido
ósseo, no entanto esse aumento não foi estatisticamente significante, quando
comparado com o grupo controle (p>0,01). No grupo IV (Laser após quatro
semanas da radioterapia) foi possível observar um aumento da quantidade de
78
tecido ósseo, que foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo
controle (p<0,01). Esses resultados são representados na Figura 16.
Figura 16- Média dos níveis de cinza, do tecido ósseo avaliado por grupo
5.4- RESULTADOS DO EXAME MICROSCÓPICO
Por meio da análise dos grupos experimentais e controle foram avaliados os
seguintes critérios: presença de fibras colágenas, grau de atividade osteoblástica
no periósteo, grau de reabsorção óssea na proximidade da medula e proporção
tecido adiposo/medular. Esses resultados foram analisados através do teste não
paramétrico Qui-quadrado para uma probabilidade de erro de 5%. Além disso, foi
realizada a contagem total de osteócitos e dos canais de Harvers em dez campos,
com aumento de vinte vezes. Tais resultados foram analisados pelo teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis para uma probabilidade de erro de 5%.
105
110
115
120
125
130
135
140
NIV
EIS
DE
CIN
ZA
GRUPO I GRUPO II GRUPO III GRUPO IV
GRUPOS
GRUPO I GRUPO II GRUPO III GRUPO IV
Controle
Laser dia anterior à
radioterapia, p<0,01
Laser logo após à
radioterapia, p>0,01
Laser quatro semanas após
à radioterapia, p<0,01
79
5.4.1- GRUPO CONTROLE (GRUPO I- SOMENTE RADIOTERAPIA)
Após seis semanas do início da radioterapia, foi possível observar na medula uma
grande quantidade de tecido adiposo e consequentemente uma diminuição de
tecido medular. Ocorreu um baixo índice da atividade osteoblástica, atividade esta
caracterizada pela presença de um cordão de osteoblastos localizados no
periósteo. Além disso, foram observadas áreas de reabsorção óssea de
intensidade moderada. Tal atividade osteoclástica foi caracterizada pela presença
de lacunas de reabsorção no osso cortical próximo a porção medular. Fibras
colágenas estavam presentes em 50% das amostras.
Após a contagem de osteócitos, a média do número obtido em dez campos
foi de 195. Em relação ao número de canais de Harvers, sua média em dez
campos foi de oito.
80
PRANCHA 01 Fotomicrografias do grupo I Controle (Somente radioterapia)
Figura 17- Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas da radioterapia. Observar presença exuberante de tecido adiposo na medula óssea. H/E, Aumento aproximado de 100x
Figura 18- Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas da radioterapia. Observar osso cortical com a presença de poucos osteócitos e canais de Harvers. H/E, Aumento aproximado de 100x
81
Figura 19- Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas da radioterapia. Observar osso cortical com a presença de poucos osteócitos. H/E, Aumento aproximado de 200x
Figura 20- Fotomicrografia da espécime do grupo controle após seis semanas da radioterapia. Observar áreas de reabsorção óssea na proximidade da medula. H/E, Aumento aproximado de 200x
82
5.4.2- GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os grupos experimentais apresentaram de uma maneira geral uma maior
quantidade de osteócitos (Figura 21). Após o teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis com múltiplas comparações, obteve-se um valor de significância
extremamente significante p=0,0002. Também foi possível observar uma diferença
muito significativa no número de canais de Harvers (Figura 22), com o valor de
significância de p=0,0015. Além disso, foi possível observar um aumento da
atividade osteoblástica em todos os grupos experimentais.
Figura 21- Média do no osteócitos em dez campos, a depender do grupo avaliado
0 50
100 150 200 250 300 350 400 450
Grupo I
Grupo II
Grupo III Grupo IV
Grupos
Número de osteócitos
Média do n
o osteócitos
83
Figura 22- Média do no canais de Harvers em dez campos, a depender do grupo avaliado
5.4.2.1 GRUPO II (LASER UM DIA ANTES DA RADIOTERAPIA)
Após seis semanas da radioterapia, combinadas com duas semanas de
aplicações de Laser, iniciadas um dia antes da radioterapia, foi possível observar
um aumento evidente da atividade osteoblástica, sendo estatisticamente
significante quando comparados com o grupo controle (p<0,05). Também no
grupo II foi observado um aumento da atividade osteoclástica, caracterizado pelas
lacunas de reabsorção localizadas na superfície interna do osso cortical próximo à
região medular, porém tal fato não foi estatisticamente significante quando
comparado ao grupo controle (p>0,05). A proporção tecido adiposo/tecido medular
se encontrou com grande quantidade de tecido medular e poucos adipócitos,
quando comparado ao grupo controle (p<0,05). A presença de colágeno foi
0
5
10
15
20
25
30
Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV
Grupos
Número de CH
Média do noCH
84
observada em 67% dos casos, mas essa diferença não foi estatisticamente
significante quando comparado ao grupo controle (p>0,05).
O osso cortical apresentou o número de osteócitos elevado, média de 406
em dez campos, havendo diferença significante quando comparado com o grupo
controle (p<0,05). O mesmo fato ocorreu com os canais de Harvers que também
apresentaram um aumento, média de vinte e sete em dez campos, sendo este
valor significativo quando comparado ao grupo controle (p<0,05).
85
PRANCHA 02 Fotomicrografias do grupo experimental II (Laser no dia anterior a
radioterapia)
Figura 23- Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da radioterapia. Medula óssea com menor proporção de tecido adiposo. H/E, Aumento aproximado de 100x
Figura 24- Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da radioterapia. Observar osso cortical com maior densidade de osteócitos. H/E, Aumento aproximado de 100X
86
Figura 25- Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da radioterapia. Observar osso cortical com a presença de canais de Harvers. H/E, Aumento aproximado de 200x
Figura 26- Fotomicrografia da espécime do grupo II após seis semanas da radioterapia. Observar presença de fibrilos de colágeno no interior da medula óssea. Picrosírius, Aumento aproximado de 200x
87
5.4.2.2- GRUPO III (LASER NO MESMO DIA DA RADIOTERAPIA)
Nesse grupo foi possível observar um aumento evidente da atividade
osteoblástica, sendo estatisticamente significante quando comparados com o
grupo controle (p<0,05). No entanto no que diz respeito ao processo de
reabsorção, foi observado um aumento moderado da atividade osteoclástica,
porém tal fato não foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo
controle (p>0,05). A proporção tecido adiposo/tecido medular se encontrou em
níveis semelhantes ao do grupo controle, com grande quantidade de adipócitos e
diminuição do tecido medular, não havendo diferença estatisticamente significante
(p>0,05). A presença de colágeno foi observada em 50% dos casos, mas essa
diferença não foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo
controle (p>0,05).
O osso cortical apresentou o número de osteócitos discretamente aumentado
quando comparado ao grupo controle, média de 286 em dez campos, porém essa
diferença não foi estatisticamente significante (p>0,05). O mesmo fato ocorreu
com os canais de Harvers que também apresentaram um aumento moderado,
com a média de vinte e um em dez campos, mas não foi estatisticamente
significante quando comparado ao grupo controle ( p>0,05).
88
PRANCHA 03 Fotomicrografias do grupo experimental III (Laser no mesmo dia da radioterapia)
Figura 27- Fotomicrografia da espécime do grupo III após seis semanas da radioterapia. Observar proporção tecido medular / tecido adiposo. H/E, Aumento aproximado de 100x
Figura 28- Fotomicrografia da espécime do grupo III após seis semanas da radioterapia. Observar osso cortical com a presença moderada de osteócitos. H/E, Aumento aproximado de 200x
89
Figura 29- Fotomicrografia da espécime do grupo III. Observar áreas de reabsorção óssea na proximidade da medula óssea. H/E, Aumento aproximado de 100x
Figura 30- Fotomicrografia da espécime do grupo III. Observar presença de fibrilos de colágeno na superfície cortical interna. H/E, Aumento aproximado de 100x
90
5.4.2.3-GRUPO IV (LASER QUATRO SEMANAS APÓS A RADIOTERAPIA)
Passadas seis semanas da aplicação da dose única da radioterapia,
combinada com duas semanas de aplicações de Laser, iniciadas na quinta e sexta
semanas, foi possível observar um aumento evidente da atividade osteoblástica,
sendo estatisticamente significante quando comparados com o grupo controle
(p<0,05). Além disso, foi observado um aumento da atividade osteoclástica, porém
tal fato não foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo controle
(p>0,05). A proporção tecido adiposo/tecido medular se encontrou com grande
quantidade de tecido medular e poucos adipócitos, quando comparado ao grupo
controle (p<0,05). A presença de colágeno foi observada em 40% dos casos, mas
essa diferença não foi estatisticamente significante quando comparado ao grupo
controle.
O osso cortical apresentou um elevado número de osteócitos, média de 354
em dez campos, havendo diferença estatística significante quando comparado
com o grupo controle (p<0,05). O mesmo fato ocorreu com os canais de Harvers
que também apresentaram um aumento significativo, média de 25 em dez
campos, quando comparado ao grupo controle (p<0,05).
91
PRANCHA 04 Fotomicrografias do grupo experimental IV (Laser quatro semanas após a radioterapia)
Figura 31- Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar menor proporção de tecido adiposo. H/E, Aumento aproximado de 100x
Figura 32- Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar osso cortical com a presença de muitos osteócitos. H/E, Aumento aproximado de 100x
92
Figura 33- Fotomicrografia da espécime do grupo IV. Observar osso cortical com a presença de canais de Harvers. H/E, Aumento aproximado de 200x
Figura 34- Fotomicrografia da espécime do grupo IV após seis semanas da radioterapia. Observar intensa atividade osteoblástica, com neo-formação óssea. H/E, Aumento aproximado de 200x
93
DISCUSSÃO
94
6- DISCUSSÃO
Uma das grandes dificuldades na Odontologia é como lidar com os efeitos
adversos da radioterapia. Com as chances de desenvolvimento da
osteorradionecrose a partir da intervenção cirúrgica dos dentes comprometidos
pela ação da radiação ionizante, ocorre uma diminuição na capacidade de
cicatrização na região, aumentando o risco de fraturas patológicas. A reabilitação
oral também é difícil, já que a capacidade de osteointegração dos implantes é
acometida (GRANSTROM, et al, 1994).
Desta forma, terapias que possam determinar o retorno da normalidade
desses tecidos precisam ser avaliados quanto a sua eficácia clínica. A laserterapia
é uma possível modalidade terapêutica para o tecido lesionado pela radioterapia.
Nesse estudo, avaliou-se o efeito da Laserterapia utilizando o Laser de
GaAlAs (780 nm, 40 mW, CW, área de spot 0,04 cm2, 100 J/cm² por ponto, t=100
seg.) sobre o tecido ósseo de ratos submetidos à radioterapia. O modelo animal
escolhido foi o rato, já que é o mais utilizado para área de avaliação dos efeitos
secundários da radioterapia (ARNOLD et al., 1998; MAEDA et al., 1998;
WURZLER et al., 1998.; KIYOHARA, SAKURAI e KASHIMA, 2003) e também na
área de regeneração óssea com o Laser (LIRANI, 2004; GERBI et al., 2005).
Devido às dificuldades inerentes ao estudo com animais, os ratos foram
expostos a uma única dose de irradiação, que foi suficiente para promover
mudanças trabeculares do osso. Além disso, essa dose única foi protocolada por
estudos anteriores variando de 25-35 Gy (JACOBSSON et al., 1985; ARNOLD et
95
al., 1998; MAEDA et al., 1998; WURZLER et al., 1998; KIYOHARA, SAKURAI e
KASHIMA, 2003).
O aparelho de Cobalto 60 foi o escolhido por ser o mais acessível, e
sabidamente causa mais efeitos adversos do que outras fontes de radiação
(PACHIGOLLA, POU e QUINN, 2000). Além disso, a profundidade de ação desse
aparelho começa a partir de 0,5 cm, enquanto os aceleradores lineares
(dependendo do tipo e megavoltagem) começam a agir a partir de 1,5 cm
(McENTEE, 2001). Levando em consideração a pequena espessura do fêmur do
rato (em torno de 0,6 mm sem tecidos moles e 2,4 cm com tecidos moles), ficou
claro que esse aparelho seria o mais apropriado para esse tipo de pesquisa. Essa
talvez seja a razão das erosões cutâneas encontradas nos animais dos grupos II,
III e IV, serem justamente na porção interna do fêmur do animal irradiado, devido à
penetrabilidade da radiação pelo Cobalto 60. A presença dessas lesões corrobora
com achados de Wurzler et al. (1998), no qual a radioterapia promoveu uma
descamação epitelial. Mas em seu estudo essas lesões iniciaram logo após a
radioterapia e regrediram na terceira semana. Na presente pesquisa as erosões
foram observadas somente na sexta semana, numa fase mais tardia, e ocorreram
apenas nos animais que receberam Laser. A presença dessas lesões nos grupos
experimentais será discutida mais adiante.
Com relação ao ganho de massa corporal, os animais do grupo controle,
ganharam menos massa corporal do que os animais que receberam o Laser
(grupos II, III e IV). O fato da radioterapia causar diminuição do ganho da massa
corporal, já havia sido constatado em estudos anteriores (MAEDA et al., 1998;
96
Wurzler et al., 1998), onde os grupos que sofreram irradiação ionizante ganharam
menos massa corporal do que animais que não receberam nenhum tipo de
radiação. Vale ressaltar que nessa pesquisa, tanto a bebida, quanto a comida
foram fornecidas ad libidum. No entanto nos grupos que receberam Laser o ganho
de massa corporal foi significativamente maior. Sendo assim, talvez seja possível
sugerir que o Laser promoveu uma maior atividade nos animais, aumentando seu
apetite e consequentemente sua massa corporal.
Já em relação à análise histológica, as alterações ósseas sofridas no grupo I
(controle, que recebeu somente radioterapia) foram visíveis e estavam
diretamente relacionadas com uma estrutura óssea escassa de células com a
presença de poucos osteócitos, quando comparadas ao grupo experimental que
utilizaram Laser. Tal fato já havia sido documentado previamente em estudos
anteriores de Maeda et al. (1998), que afirmaram que na sexta semana após
radioterapia ocorre uma redução do número de osteócitos estatisticamente
significante entre um osso normal e um que recebeu radiação ionizante; além
disso, é mencionada uma redução do tamanho dos osteócitos, descrevendo uma
possível retração dos mesmos (MAEDA et al.,1988). Nessa pesquisa observou-se
também pouca quantidade de canais de Harvers no grupo controle, quando
comparado ao experimental. Tal fato está de acordo com pesquisas de Morales,
Marx e Gottlieb (1987), onde foi observada uma diminuição da vascularização
local após a exposição de mandíbulas de coelhos à radiação ionizante. Além
desses efeitos, foi possível constatar no grupo controle uma baixa atividade
osteoblástica. Esses achados são consistentes em estudos de Matsumura et al.
97
(1996); Dare et al. (1997) e Dudziak et al. (2000), que encontraram uma
diminuição da proliferação osteoblástica, levando a crer que a radiação ionizante
implica na diferenciação terminal das células precursoras ósseas e osteoblastos.
Zonas de reabsorção óssea foram visíveis, mas não tão intensas como o
esperado, contrariando os achados de Kiyohara, Sakurai e Kashima (2003) que
encontraram reabsorção óssea a partir da quarta semana pós-radioterapia com
um afinamento das trabéculas ósseas. Uma outra característica encontrada no
grupo controle foi um aumento expressivo de tecido adiposo, com consequente
diminuição do tecido medular. Tal fato já havia sido documentado anteriormente
(MAEDA et al., 1988; KIYOHARA, SAKURAI e KASHIMA, 2003).
Em relação aos achados radiográficos, sabe-se que com o avanço da
tecnologia e a disponibilidade da informática como instrumento complementar nas
análises de imagens, é possível obter radiografias digitais ou digitalizadas que
forneçam informações precisas, aumentando significativamente o potencial de
diagnóstico, para uma melhor conduta terapêutica.
No sistema radiográfico digital DenOptix® as radiografias digitais podem ser
adquiridas com diferentes resoluções (150, 300 e 600 dpi), levando
consequentemente a uma variação no tamanho do pixel, na resolução espacial da
imagem (pl/mm), assim como no tamanho da sua matriz. Nessa pesquisa foi
utilizada uma resolução de 300 dpi. Esse valor foi baseado em estudos anteriores,
como o de Almeida et al. (2000), que comprovaram que as resoluções de 150 dpi
apresentam-se com qualidade inferior às de 300 e 600 dpi, e que essas últimas
apresentam um similar nível de eficiência, possibilitando o diagnóstico de registros
98
radiográficos sutis. No entanto, as imagens de 600 dpi demoram mais para serem
abertas, arquivadas, importadas e exportadas, além de consumirem uma memória
acentuada de arquivo, por essas razões as de 300 dpi foram as escolhidas.
Na presente pesquisa, os achados radiográficos demonstraram que o grupo
controle apresentou uma menor quantidade de tecido ósseo, quando comparado
ao grupo experimental, nos quais os valores de média dos níveis de cinza
estavam mais elevados. Esses achados corroboram com a análise histológica no
qual o grupo experimental apresentou-se mais celularizado quando comparado ao
controle, evidenciando uma boa sensibilidade do sistema radiográfico digital. A
alta sensibilidade de interpretação de sistemas digitais já havia sido documentada
por outros autores em diversas áreas da odontologia (VOS, et al. 1986;
BRAGGER e PASQUALI, 1988; VERDONSCHOT et al., 1992; SARMENTO e
RUBIRA, 1998; SARMENTO et al., 1998; LEAL et al., 2001; SARMENTO e
PRETTO, 2003; SARMENTO et al., 2005). Vale a pena ressaltar a possível
influência dos tecidos moles sobre os valores de nível de cinza encontrados, já
que estes foram radiografados juntamente com o tecido ósseo (PUPPIN, 2000).
Porém sua presença não invalida as constatações descritas acima, uma vez que
na macroscopia (Figura 12) pode-se notar que nos grupos experimentais o tecido
ósseo era mais espesso, e que na análise histológica os grupos experimentais
apresentaram maior quantidade de osteócitos, canais de Harvers e atividade
osteoblástica .
Quando se discute Laserterapia, sabe-se que esta modalidade terapêutica
tem sido utilizada com sucesso nos últimos anos, suas aplicações são inúmeras e
99
tem demonstrado bons resultados em nível de tecido ósseo. Já foi comprovado
seu efeito positivo em tratamentos ortodônticos (KAWASAKI e SHIMIZU, 2000), no
alvéolo dentário após extrações (KUCEROVA et al., 2000), em fraturas ósseas
(LUGER et al., 1998), após colocação de implantes (LOPES et al., 2005) e em
defeitos ósseos (ROCHKIND et al., 2004). Outros estudos comprovam a eficácia
do Laser na redução e aceleração do processo inflamatório, aumento da síntese
de colágeno, aumento na força de tensão, diminuição do tempo de cicatrização e
redução no tamanho da ferida (WOODRUFF et al., 2004).
Atualmente existem diversos tipos de Laseres com diferentes comprimentos
de onda, nos quais incluem-se o HeNe de 632,8 nm, GaAlAs de 805 ± 25 nm,
Arseneto de Gálio (GaAs) de 904 nm, que tem sido utilizado com grande eficiência
em doses, protocolos e formas de tratamento diferentes (BASFORD, 1995;
WALSH, 1997). A utilização do Laser GaAlAs, como o utilizado neste estudo tem
aumentado bastante nos últimos dez anos. Esse tipo de Laser é conhecido por ter
alto poder de penetração em comparação com os outros tipos, oferecendo ao
clínico uma ferramenta de grande eficiência (KHADRA et al., 2004b)
Os comprimentos de onda mais elevados geralmente são mais resistentes à
dispersão do que os mais baixos, além disso, possuem um alto poder de
penetração tecidual (KOLÁROVÁ, DITRICHOVÁ e WAGNER, 1999). Há relatos
que o comprimento de onda do Laser de 632,8 nm penetra 0,5-1mm antes de
perder 37% da sua intensidade (BASFORD, 1995). Já os Laseres no espectro
eletromagnético na faixa do infravermelho, penetram 2 mm antes de perder parte
de seu percentual de energia. Isso é um fator importantíssimo que leva a
100
indicação desse comprimento de onda para o tecido ósseo (PINHEIRO et al.,
2003).
Apesar de existirem pesquisas in vivo e in vitro com resultados positivos, os
resultados em algumas pesquisas não mostram efeitos relevantes do Laser
(COOMBE et al., 2001)
A grande dificuldade na análise comparativa do Laser em outras pesquisas
deve-se ao fato da falta de informações e da metodologia de aplicação. Alguns
estudos, por exemplo, não citam o funcionamento do aparelho utilizado. E isso é
importantíssimo, pois alguns aparelhos utilizam seu cálculo de dose baseado na
média de um centímetro quadrado, enquanto outros dispositivos se baseiam na
área do “spot”, que também pode sofrer variações, e é claro que com doses
diferentes se obtém resultados locais também divergentes. No caso do aparelho
utilizado nesse trabalho, o cálculo de dose do mesmo é baseado na área de 0,04
cm2, que é a área do spot do aparelho. Além disso, existem inúmeras outras
variáveis. Em primeiro lugar, a dose é na verdade um volume, e não uma área,
como é feito no seu cálculo. De acordo com Tunér e Hode (2004), existem
também outros fatores decorrentes de diferentes tipos de equipamentos, como o
feixe do raio Laser e seu design não ser homogêneo, o fato da potência poder
mudar de acordo com o aumento da temperatura do diodo, o comprimento de
onda pode variar de acordo com a elevação dessa temperatura, o fato do
comprimento de onda poder ser +/- 10 nm do que o informado no manual do
aparelho.
101
A dosimetria é uma questão fundamental nos resultados da Laserterapia.
Doses muito baixas podem não ter nenhum efeito sobre o tecido, e doses altas
podem resultar em pouco ou nenhum efeito, enquanto que doses extremamente
elevadas podem levar a efeitos inibitórios e contrários (GROSS e JELKMANN,
1990; SATTAYUT, HUGHES e BRADLY, 1999)
A dose do Laser utilizada nessa pesquisa (DE= 100J/cm2, E= 4 J, P= 40mW,
t= 100 seg, área do spot 0,04cm2) foi semelhante a estudos anteriores nos quais
houve efeitos positivos no osso (BASFORD, 1995; KUCEROVA et al., 2000;
LIRANI, 2004; KHADRA et al., 2005; GERBI et al., 2005). Além disso, o Laser foi
utilizado por quatorze dias com aplicações alternadas. Essas irradiações repetidas
são necessárias para manter continuidade no processo de reparo, já que uma
única sessão não é suficiente. Tal fato já havia sido mencionado anteriormente por
Tunér e Hode (2004) no qual também é recomendado que as aplicações de
Laserterapia sejam em quantidade aproximada de 3-4 sessões por semana
durante 2 semanas, podendo variar a cada caso.
As feridas cutâneas apresentadas nos grupos II, III e IV que utilizaram Laser
em conjunto com a radioterapia, foram inesperadas, já que estudos anteriores
comprovaram que o Laser promoveu uma diminuição da resposta inflamatória
(MEDRADO et al., 2003). Isto contrariou o presente estudo no qual o processo
inflamatório foi acentuado. A razão da presença dessas feridas cutâneas pode
estar relacionada a um excessivo acúmulo de energia na célula, tanto ocasionado
pela radioterapia quanto em conjunto com a energia liberada pelo Laser,
ultrapassando assim o limiar de aceitação de energia do tecido. Deve ser
102
lembrado que as feridas estavam localizadas na porção mais interna da perna do
animal, confirmando a alta penetração do Laser infravermelho, e da radioterapia.
No entanto, à nível ósseo, o osso apresentou-se mais sadio e com maior
vitalidade nos grupos onde o Laser foi utilizado, demonstrando que o Laser
diminuiu os efeitos secundários causados pela radiação ionizante. Tais resultados
confirmam os achados em estudos anteriores onde o Laser acelera a cicatrização
de feridas ósseas, aumentando a atividade celular, sem alteração da estrutura
óssea (TRELLES e MAYAYO, 1987; NAGASAWA, KATO e NEGESHI, 1991;
GLINKOWSKY e ROWINSK, 1995; SAITO e SHIMIZU, 1997; LUGER et al., 1998;
FREITAS, BARANAUSKAS e CRUZ-HOFLING, 2000; NICOLAU et al., 2003).
A cicatrização óssea geralmente ocorre em três fases: uma fase inflamatória,
seguida por uma fase proliferativa e por final a fase de remodelação (THOMAS et
al., 1995). Acredita-se que o maior efeito bioestimulador do Laser encontra-se na
fase proliferativa, onde o processo metabólico celular é aumentado devido à
fotorecepção mitocondrial à luz monocromática. Além disso, o Laser aumenta o
metabolismo da cadeia respiratória de determinadas células, alterando suas
propriedades eletrofísicas (MEYERS, 1990; MEDRADO et al., 2003)
Os resultados desse estudo mostram um aumento do número de osteócitos
em todos os grupos onde o Laser foi utilizado (grupo II- Laser um dia antes da
radioterapia; grupo III- Laser no mesmo dia; grupo IV- Laser após quatro
semanas). Tal fato está de acordo com estudos anteriores recentes onde o Laser
apresentou um efeito positivo aumentando o número de osteócitos e proliferação
celular (DORTBUDAK, HAAS e MAILATH-POKORNY, 2002). O grupo III (Laser no
103
mesmo dia da radioterapia) não teve um aumento tão significante no número de
osteócitos. Esses resultados podem estar de acordo com pesquisas que sugerem
que a ação do Laser na estimulação da diferenciação celular ocorre especialmente
em células precursoras, no caso células osteoblásticas (OZAWA et al., 1998), e no
caso do grupo III, essas células deveriam estar num número bem pequeno já que
a primeira irradiação à Laser foi iniciada logo após a sessão de radioterapia.
Acredita-se que a Laserterapia intensifica a formação dos gradientes de prótons
da transmembrana eletroquímica da mitocôndria, fazendo com que mais cálcio
seja liberado pela mitocôndria. O cálcio adicional transportado para o citoplasma
leva à mitose e proliferação celular (FRIEDMANN, LUBART e LAULICHT, 1991).
Sendo assim, é sugerido que a bioestimulação da Laserterapia aumenta o
potencial osteogênico das células ósseas (KHADRA et al., 2005).
Além disso, foi possível observar um aumento estatisticamente significante
no número de canais de Harvers nos grupos experimentais (II e IV). A
neoangiogênese é muito importante no processo de reparo ósseo já que aumenta
a liberação de oxigênio e nutrientes da célula (NIYIBIZI e MYUNG, 2000). Em
relação ao aumento de colágeno, não foi possível verificar nenhuma diferença
significativa entre os grupos experimentais e o controle. Tal fato deve ter ocorrido
por uma ausência de uma agressão física, como um ato cirúrgico.
Foi observada em todos os grupos experimentais II, III e IV, a presença de
atividade osteoclástica, porém não foi estatisticamente significante quando
comparado ao grupo controle. Estudos de Garavello-Freitas et al. (2003)
demonstraram que o Laser estimula o crescimento trabecular e um aumento de
104
osteoclastos num primeiro momento, e posteriormente acelera a organização da
matriz colágena. A presença da atividade osteoclástica é muito importante no
processo de remodelação óssea.
Também foi possível constatar uma diminuição do número de adipócitos com
um aumento estatisticamente significante do tecido medular, nos grupos II (Laser
um dia antes da radioterapia) e IV (Laser quatro semanas após a radioterapia),
quando comparado ao controle, tal fato possivelmente ocorreu pela estimulação
do Laser na proliferação celular, aumentando a celularidade medular.
É importante relatar que o Laser deve ser evitado em áreas tumorais, pela
possibilidade de estimular o crescimento e proliferação do tumor. No entanto,
enquanto alguns estudos in vitro relataram uma estimulação através do Laser, o
efeito in vivo tem sido diferente. Acredita-se que o sistema imunológico é
provavelmente muito mais estimulado do que o tumor propriamente dito (TUNÉR e
HODE, 2004).
Antes de se pensar no tratamento, vale lembrar que prevenir sempre é
melhor. É de grande importância lembrar que os efeitos colaterais da radioterapia
podem ser minimizados se houver um planejamento criterioso. Antes de tudo é
importante saber o prognóstico do paciente para um melhor planejamento bucal
antes da radioterapia. Não é recomendado muitas extrações empíricas em dentes
assintomáticos cariados em pacientes com tumores em estágio terminal ou
avançado. Os dentes a serem extraídos devem esperar um prazo de pelo menos
14 a 21 dias de cicatrização antes do início da radioterapia. No entanto esse prazo
é grande e nem sempre há tempo hábil, quando o tratamento do tumor é de
105
extrema urgência. Às vezes esses pacientes são submetidos à radioterapia antes
de uma análise odontológica criteriosa e acabam desenvolvendo problemas
dentários futuros. Quando isso ocorre, o tratamento posterior torna-se mais difícil,
devido a todos os efeitos indesejáveis da radioterapia (SULAIMAN, HURYN e
ZLOTOLOW, 2003).
É de suma importância que o dentista se comunique com o radioterapeuta e
oncologista. Os dentes de prognóstico questionáveis que se encontram no campo
da irradiação devem ser extraídos antes do tratamento radioterápico. Os
elementos dentários que se encontram fora do campo não requerem um
tratamento tão radical, porém necessitam de um acompanhamento odontológico.
Após o tratamento radioterápico é recomendado um regime com a utilização de
flúor tópico, para uma maior proteção dos dentes, além disso, tanto as extrações
como outros procedimentos cirúrgicos no portal da radiação devem ser evitados
ao máximo, sempre que possível. No entanto, se for realmente necessário pode
se utilizar oxigênio hiperbárico antes das extrações, porém essa técnica não
previne o aparecimento da osteorradionecrose em todos os casos (SCHWARTZ e
BEUMER, 2004).
Um dos problemas com a oxigenação hiperbárica é o elevado custo do
equipamento, poucas câmaras existentes no Brasil (não existe em todos os
estados), baixa portabilidade desse equipamento e algumas contra-indicações
(portadores de doença pulmonar). Além disso, o tratamento com oxigênio
hiberbárico, dependendo do protocolo utilizado pode durar de 90-120 minutos, e
são necessários aproximadamente dez sessões antes do procedimento cirúrgico e
106
de cinco a sete pós-cirurgia (AITASALO et al, 1998). Por essa razão seria
interessante o desenvolvimento de novas técnicas e aparelhos portáteis para o
tratamento de tais patologias. Nesse estudo o Laser comprovou ter um efeito
benéfico no osso de ratos Wistar, tanto quando utilizado previamente à
radioterapia quanto num período posterior. Além disso, o Laser de baixa potência
tem a característica de ser um instrumento portátil e de baixo custo. No entanto é
importante lembrar do aparecimento de feridas cutâneas nas pernas irradiadas, o
que mostra que ainda é necessário cautela quanto sua utilização em pacientes
irradiados.
107
CONCLUSÕES
108
7- CONCLUSÕES
Com base nos resultados encontrados nesse estudo, sob o protocolo
utilizado, é possível concluir que:
1- A utilização da luz Laser estimulou a atividade de remodelação óssea e
irrigação sanguínea local, nos vários tempos experimentais, embora tenha
desencadeado reações inflamatórias cutâneas nos grupos II (Laser um dia antes
da radioterapia), III (Laser no mesmo dia da radioterapia) e IV (Laser quatro
semanas após a radioterapia). Tal fato não ocorreu com o grupo controle
(somente radioterapia).
2. Radiograficamente o Laser se mostrou eficaz tanto na prevenção, quando
a primeira aplicação foi iniciada antes da radioterapia, como também no
tratamento dos efeitos secundários da radioterapia, já que foi encontrado um
aumento da quantidade de tecido ósseo nos grupos II e IV, quando comparados
ao grupo controle.
3. Histologicamente os achados corroboraram com a análise radiográfica, já
que os grupos II e IV apresentaram um aumento do número de osteócitos, dos
canais de Harvers, e da atividade osteoblástica, quando comparados ao grupo
controle. O mesmo fato não ocorreu com o grupo III, no qual somente a atividade
osteoblástica estava acentuada.
109
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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124
ANEXOS
125
ANEXO A
APROVAÇÃO DA PESQUISA PELO COMITÊ DE ÉTICA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DA UFBA
126
ANEXO B APROVAÇÃO DA PESQUISA PELO HOSPITAL SANTA IZABEL
127
ANEXO C
SOLUÇÃO FIXADORA PARAFORMALDEÍDO TAMPONADO 4%
Solução Fixadora:
o Composição para 1000 ml:
Água destilada – 1000 ml
Paraformaldeído – 40 g
Fosfato de sódio monobásico – 4 g
Fosfato de sódio dibásico – 6,5 g
o Forma de preparo da solução:
Aquecer o volume total (ou não) da água
Com a água pré-aquecida, introduzir o Fosfato de
sódio monobásico;
Após a dissolução do Produto, adicionar o Fosfato de
sódio dibásico.
Quando a água já estiver próximo a ebulir (ferver),
introduzir o Paraformaldeído e dissolvê-lo bem.
Após a Solução estiver fria, completar o volume total,
se necessário, e filtrar a solução em papel filtro.
Verificar o pH que deve estar em torno de 7,0.
128
ANEXO D
COLORAÇÃO DE PICROSIRIUS2
Solução de Sirius Red
Água destilada............................................................100ml
Ácido pícrico saturado
Sirius Red....................................................................0,1g
Preparo da solução:
Adicionar Ácido pícrico à água destilada até saturar. Em seguida, acrescentar 0,1g do Sirius Red sob agitação.
Solução de Light Green
Light green..................................................................0,1g
Água destilada………………………………………100ml
Técnica de coloração
1. Desparafinizar
2. Hidratar os cortes – Álcool absoluto
Álcool a 80%
Álcool a 70%
Água destilada
3. Corar em solução de Sirius Red por 30 minutos
4. Contra-corar em solução de Light Green por 05 minutos
5. Lavar rapidamente em água corrente
6. Desidratar
7. Clarificar
8. Montar no bálsamo do canadá
Resultados: Fibras colágenas em vermelho, fundo esverdeado
2 Fonte: Labotarório de Patologia (FOUFBA).