influência do sexo e do ciclo hormonal nos efeitos agudos ... · indivíduos de segunda classe,...
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Biociências
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
THIEZA GRAZIELLA ARAÚJO DA SILVA GÓES DE MELO
Influência do sexo e do ciclo hormonal nos efeitos agudos
da fluoxetina na memória e comportamentos relacionados à
ansiedade e depressão em ratos
Tese apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte,
como requisito para defesa de
doutorado, Programa de Pós-
graduação em Psicobiologia.
NATAL/RN
2016
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THIEZA GRAZIELLA ARAÚJO DA SILVA GÓES DE MELO
Influência do sexo e do ciclo hormonal nos efeitos agudos
da fluoxetina na memória e comportamentos relacionados à
ansiedade e depressão em ratos
Tese apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte,
como requisito para defesa de
doutorado, Programa de Pós-
graduação em Psicobiologia.
Orientadora: Regina Helena da
Silva
Co-Orientador: Ramón Hypolito
Lima
NATAL/RN
2016
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Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB
Melo, Thieza Graziella Araujo da Silva Goes de.
Influência do sexo e do ciclo hormonal nos efeitos agudos da
fluoxetina na memória e comportamentos relacionados à ansiedade e
depressão em ratos Tese / Thieza Graziella Araujo da Silva Goes de Melo. - Natal, 2016.
145f.: il.
Orientador: Profa. Dra. Regina Helena da Silva.
Coorientador: Prof. Dr. Ramón Hypolito Lima. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Antidepressivos - Tese. 2. Fluoxetina - Tese. 3. Esquiva
discriminativa - Tese. 4. Ciclo estral - Tese. I. Silva, Regina
Helena da. II. Lima, Ramón Hypolito. III. Universidade Federal
do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.89-008.454
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Título: Influência do sexo e do ciclo hormonal nos efeitos agudos da fluoxetina na
memória e comportamentos relacionados à ansiedade e depressão em ratos
Autor: Thieza Graziella Araújo da Silva Góes de Melo
Data da defesa: 27/07/2016
Banca Examinadora:
___________________________________
Profa. Regina Helena da Silva
Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP-SP
___________________________________
Profa. Alessandra Mussi Ribeiro
Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP-SP
___________________________________
Profa. Elaine Cristina Gavioli
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN
___________________________________
Profa. Vanessa de Paula Soares Rachetti
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN
___________________________________
Prof. Flávio Freitas Barbosa
Universidade Federal da Paraíba, UFPB
5
“The only thing we have to fear is fear itself”
(Franklin Delano Roosevelt)
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Agradecimentos
Ao pensar em agradecimentos, avalio a importância, contribuição e
propósito de agradecer. Esses aspectos relacionados não apenas ao que me
acrescentaram, mas também o que eu vou acrescer ao agradecer. E por mais
bizarro que possa soar, agradecer sempre é necessário. Acrescenta-se muito
mais a quem doa, assim como amor, que a quem recebe. É algo de somar o bem;
algo definitivamente necessário.
Retrospectivamente, por ser psicóloga, não penso apenas no doutorado,
mas no caminho que me trouxe até aqui. E esse caminho é longo, antigo e de
chão bem batido. Antes de mim, pelo menos três gerações construíram e trilharam
partes desse caminho, coube-me apenas uns últimos metros; mas os últimos
metros de toda caminhada sempre são o verdadeiro desafio do caminhante.
Três gerações atrás minha bisavó, Dona Ernestina, mulher firme, no sertão
do nordeste brasileiro, em meados de 1900 (nascida em 1903) decidiu que seus
filhos iriam estudar. Nem bem a escravidão havia sido abolida, quem eram esses
indivíduos de segunda classe, independentemente de cor ou raça, para “decidir”
algo? Absolutamente ninguém. Mulheres não decidiam. Mulheres obedeciam.
Bem, Dona Ernestina Góes DECIDIU. E estava decidido.
Minha avó, Dona Guiomar Góes, seguindo as decisões já tomadas de sua
mãe, estudou. E, achando simples os primeiros metros, resolveu alongar esse
caminho. Estudou e tornou-se professora. Não só professora, mas professora de
geometria (pensar fora da caixinha faz parte!); não só professora de geometria,
diretora de uma das escolas públicas mais renomadas da época. E não havia
problema que não fosse resolvido com a praticidade que reina e rege até hoje a
sua vida: quando faltava na escola, ela dava o que tinha em casa, depois podia
repor, quando necessário. E quantas diretoras eram responsáveis por escolas de
renome no sertão do nordeste brasileiro? Certamente poucas! Até porque
mulheres foram educadas para servir o marido em meados de 1930 (nascida em
1927).
Dona Inácia, minha mãe, incrivelmente não filha de Dona Guiomar!, mas
bem poderia ter sido pelos metros caminhados. Mãe solteira, com todo o estigma
que o título carregava nos anos 1990; fez graduação à noite depois de dois turnos
trabalhando e com um quarto turno à espera em casa; achando pouco, fez pós-
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graduação; escreveu um livro. Ah! Também plantou árvores. Dona Inácia
caminhou uns metros extras na independência necessária da mulher e na
construção do conhecimento.
Como não considerar essas três gerações de pedras fundamentais?
Impossível restringir esses agradecimentos a esses quatro anos.
Minha família Góes com exemplares incríveis, como minha tia Maria Góes,
torna desperdício pensar em tão poucos anos, quando já se contam às centenas.
Impossível não dizer o quanto minha família Pereirinha de siris-na-lata foi
fundamental pra empoderar geração após geração. A cada geração de primos um
sucesso ainda maior de assertividade. Assertividade essa, interpretada como
agressividade por tantos, reconhecido como selo de autenticidade Pereirinha.
Ora! Quem são as mulheres (ainda hoje) para serem assertivas?
Por vezes, agradecer é parte de reconhecer o impacto de outros em quem
você é. E, neste momento, estou nesse processo de re-conhecer esses impactos.
Preciso considerar todos que passaram pelo meu caminho e deixaram suas
marcas, boas ou ruins. Apenas escolherei ter gratidão pelos que deixaram boas
marcas.
Creio não ser mais que pleonástico dizer o quão importantes, pra quem sou
hoje, são minha mãe e minha avó. Devo um agradecimento impagável em uma
única vida. Elas construíram os alicerces da minha personalidade, moral e ética;
e para isso não existe receita de sucesso maior, que o exemplo. Da minha avó
aprendi o senso de praticidade que tento aplicar sempre que possível. Da minha
mãe a incompetência em mentir, a pouca ou nenhuma necessidade de divulgar
minha vida, a não ser em casos especiais.
E, lembrando da importância do exemplo, eu não poderia deixar de ver a
continuidade do trabalho. Meu padrasto, segundo ele, tinha direito a 1cm2 do meu
diploma de mestrado (eu sempre achei que tinha direito a muito mais!). Nesse
doutorado ele continuou seu trabalho de ser meu educador no exemplo. Esteve
sempre disposto a me ajudar, mesmo que isso signifique 100km de deslocamento
apenas para me fazer companhia; gerando desafios que me fizeram, a cada vez,
pensar ainda mais fora da caixinha; e sendo um porto seguro de aceitação,
carinho, amor e atenção; sendo sempre presente e a me apoiar a seguir os meus
sonhos.
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Como não considerar nesse percurso minha família Barros Brazuco-
Dinamarquesa? Aquela tão siri-na-lata quanto os Pereira (leia “tão assertiva
quanto”). Intensificadas pela sociedade dinamarquesa em todo o seu impacto
feminino/feminista. Como não considerar todas as mudanças que aconteceram
em dois meses de amor e aceitação intensivos na Dinamarca? As mudanças que
me fizeram enxergar tão mais além das aparências; que me fizeram aceitar minha
assertividade ainda melhor.
Preciso agradecer ao meu pai, que à sua forma, sempre fez o possível para
que eu alcançasse meus objetivos.
A última, não menos importante, família a quem preciso agradecer são os
meus amigos. Minha mãe me ensinou a importância de ser atenciosa e honesta;
de saber que pode confiar naqueles que eu chamo de “amigos” a qualquer
momento, para qualquer situação; exatamente como eu me esforço para que eles
saibam que podem contar com o mesmo que me oferecem. Enquanto algumas
pessoas, em toda a minha vida, quiseram usar minha assertividade contra mim,
algumas usaram como incentivo para se aproximar de alguém que eles sabem
que será sempre leal e sincera e espera apenas o mesmo de volta. Amigos esses
que sempre estiveram ali por mim. Amigos que merecem diversas vidas para eu
pagar o bem que já me fizeram e a paciência que tiveram durante minha vida toda,
especialmente durante a graduação, mestrado e doutorado. Amigos de longa
data, né Marília, Renata e Wanessa?, ou aqueles de nem tanto tempo, mas de
importância na intensidade, não é Naíra? Amigos encontrados nos mais diversos
lugares: laboratório, como Luane e Marla; graduação como Andressa; da
EMUFRN como Diogo, Agosto e Glauberto. Através de outras pessoas como Dr.
Márcio, Alice, Aline, Anne, Deivyson, Bruno, Girão, Amanda, Rodrigo, Nicolau,
Carlos e Alberto. Os que também são parentes como Sânzia e Saniza. E aqueles
que eu não sei nem como classificar, mas são importantes e ponto final. Amigos
de todos os tipos. Minha enorme família de amigos a qual eu não conseguiria
terminar nunca de agradecer por escrito.
Agradeço à profa Regina, me orientando desde a graduação e que me
possibilitou construir uma história acadêmica. História essa com o plot escolhido
por mim em todos os capítulos; algo muito difícil de se permitir.
Vanessa, minha querida “aluna”. Também agradeço, não só pela ajuda
durante os experimentos; pelos dias infindáveis de ciclo no laboratório; pelas
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reuniões cheias de dedicação para a construção do conhecimento sobre
antidepressivos. Obrigada por cada vez ir mais longe na busca por conhecimento
e ser incentivada e incentivo para o meu crescimento.
A todos, e a cada um, agradeço por cada “sim” e cada “não”.
Todas essas pecinhas compuseram essa minha história até hoje.
Claramente, continuarão em outras etapas. Mas aí são outros capítulos... ;)
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Quando partido, um coração
Nunca volta a ser o mesmo.
Rachaduras, cicatrizes,
Pedacinhos perdidos por aí...
Nisso, os japoneses têm razão:
Preencha as marcas com o ouro
Dos pequenos prazeres do dia-a-dia...
Xícaras de um bom chá
Em uma varanda ensolarada,
livros, amigos, paisagens, lugares...
Logo ele estará mais forte,
Mais sábio,
E muito mais belo.
Recrie seu coração
Após o baque:
Escolha mais vida;
Menos Prozac.
;)
(Alberto K. Busquets)
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Resumo
Transtornos depressivos e os relacionados a traumas e estresse, os quais
possuem uma grande incidência na população mundial, apresentam-se em alta
comorbidade. Além dos sintomas emocionais, indivíduos afetados por essas
patologias apresentam alterações cognitivas importantes. A primeira linha de
tratamento farmacológico para a maioria desses transtornos são os
antidepressivos, especialmente os inibidores da recaptação de serotonina (ISRS)
e inibidores seletivos da recaptação de serotonina e noradrenalina (ISRSN).
Apesar de mulheres serem até duas vezes mais afetadas pelos transtornos
citados, as pesquisas pré-clínicas sobre os efeitos dos antidepressivos nesse
sexo não são tão representativas quanto aquelas realizadas no sexo masculino.
Além disso, possíveis influências do ciclo hormonal natural das mulheres na ação
desses fármacos têm sido pouco exploradas. Nosso trabalho buscou investigar os
efeitos da administração aguda de fluoxetina na memória, ansiedade e
comportamento tipo-depressivo em ratas nas diferentes fases do ciclo estral. Para
tanto, utilizamos avaliações comportamentais na tarefa de esquiva discriminativa
em labirinto em cruz elevado (EDL). A EDL é realizada em um labirinto em cruz
elevado modificado que permite a avaliação concomitante de parâmetros
cognitivos e emocionais. Fluoxetina (5, 10 ou 20 mg/kg) ou veículo foram
administrados agudamente, i.p., em ratas em diferentes fases do ciclo estral e em
ratos, antes da sessão treino, depois da sessão de treino, ou antes do teste. Em
cada experimento, os animais foram testados e retestados 24 h e 48 h depois de
uma sessão inicial de treino, respectivamente. O comportamento tipo-depressivo
também foi avaliado através do teste do nado forçado (NF). Num geral, os
resultados de memória mostraram que os efeitos da fluoxetina no comportamento
de fêmeas variaram de acordo com a fase do ciclo estral e o momento da
administração. Prejuízos na memória, comportamentos tipo-ansioso e depressivo
também foram observados nas ratas após o tratamento com fluoxetina. Apesar de
a clínica e estudos comportamentais com animais mostrarem efeitos
antidepressivos e ansiolíticos com o tratamento prolongado com essa substância,
os presentes resultados sugerem a possibilidade de importantes efeitos colaterais
cognitivos e emocionais que possam surgir no início do tratamento clínico, os
quais podem variar com o sexo e a fase do ciclo hormonal.
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Palavras-chave: esquiva discriminativa, antidepressivos, fluoxetina, ciclo estral.
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Abstract
Depressive and stress and trauma-related disorders, which have great incidence
among world population, present high comorbidity. Besides the respective
emotional characteristics, individuals affected by these pathologies present
important cognitive alterations. The first line of pharmacological treatment for both
depressive and, to some extent, stress and trauma-related disorders are the
antidepressants, mainly selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) and
serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs). Even though women are
approximately twice more affected by these disorders than men, the pre-clinical
research on the effects of antidepressants on this sex is not as representative as
in male subjects. Further, possible influences of the natural female hormonal cycle
on the action of these drugs have been poorly explored. Our study aimed to
investigate the acute effects of three doses of fluoxetine on the behavior of female
rats at different phases of the estrous cycle, using the plus-maze discriminative
avoidance task (PMDAT). The PMDAT is held in a modified elevated plus-maze
that allows concomitant evaluation of cognitive and emotional parameters.
Fluoxetine (5, 10 and 20mg/ml/kg) or vehicle were given i.p. to female rats at
diferent cycle phases before training, after training or before testing. Animals were
tested and retested 24h and 48h after the training session, respectively.
Depressive-like behavior was also evaluated by the forced swimming test. Overall,
the memory results showed that the effects of fluoxetine on female behavior varied
according to the estrous cycle phase and period of administration. In addition,
memory deficits, anxious- and depressive-like behaviors were observed in female
rats after fluoxetine treatment. Despite clinical and animal studies show
antidepressant and anxiolytic beneficial effects of fluoxetine prolonged treatment,
the present results suggest possible cognitive and emotional acute side effects
which may be influenced by sex and hormonal state.
Key-words: discriminative avoidance task, forced swimming test, antidepressants,
fluoxetine, estrous cycle
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Sumário
1. Introdução ............................................................................................................. 16
1.1. Aprendizado, memória e extinção ................................................................ 16
1.2. Psicopatologias e déficits cognitivos ............................................................ 22
1.2.1. Transtornos de ansiedade: transtornos relacionados a trauma e
estresse 24
1.2.2. Transtorno depressivo ............................................................................. 28
1.3. Teorias da depressão e tratamentos: Fluoxetina ....................................... 35
1.4. Dimorfismo sexual e os transtornos depressivos e relacionados à trauma
e estresse 42
Justificativa ...................................................................................................................... 46
Objetivos .......................................................................................................................... 48
2. Materiais e métodos ............................................................................................ 50
2.1. Animais ................................................................................................................. 50
2.2. Fármaco ............................................................................................................... 50
2.3. Procedimentos experimentais ........................................................................... 51
2.3.1. Verificação do ciclo estral ........................................................................... 51
2.3.2. Esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado ............................ 53
2.3.3. Nado Forçado............................................................................................... 55
2.3.4. Delineamento experimental ....................................................................... 55
2.7. Análise estatística ............................................................................................... 58
3. Artigo a ser submetido ........................................................................................ 59
15
4. Resultados complementares ........................................................................... 110
5. Considerações finais ......................................................................................... 124
Anexos ............................................................................................................................ 144
16
1. Introdução
1.1. Aprendizado, memória e extinção
Aprender é um processo relacionado com uma habilidade do sistema
nervoso de sofrer alterações de acordo com as influências no meio, tanto interno
quanto externo. Essas alterações podem ser devidas a processamentos de
percepção ou armazenamento e alterações de informações, visando a
manutenção da homeostase (Benfenati, 2007; Panegyres, 2004; Ritter et al.,
2015). A associação de informações como “memória” já era idealizada pelos
gregos (Lisman et al., 2011). A ideia de que as informações são armazenadas no
cérebro dependendo de alterações na força das sinapses já existia no século 19
(Cooke e Bear, 2014). Contudo, o conceito moderno das modificações plásticas
na sinapse como uma unidade de acomodação de informações vem dos escritos
de Donald Hebb em “The Organization of Behavior” (Cooke e Bear, 2014; Park et
al., 2014; Ritter et al., 2015). Essas informações armazenadas são sujeitas a
modificações em resposta à experiência; esse seria um processo de plasticidade
que estaria envolvido na modificação de conexões sinápticas e,
consequentemente, nos processos de aprendizado e memória (Benfenati, 2007;
Sihra et al., 2014).
A neurobiologia considera “plasticidade” uma propriedade fundamental do
sistema nervoso, desenvolvida bem cedo na evolução (Spatz, 1996). Essa
habilidade, combinada com a concorrência de informações, também engloba a
capacidade de selecionar informações para serem armazenadas e posteriormente
evocadas (Benfenati, 2007).
Ainda segundo Hebb, qualquer tipo de formação de assembleias neurais –
neurônios que disparam em conjunto – para armazenamento e alteração de
informações necessita de plasticidade. Ainda, para que essa plasticidade ocorra
17
é necessário que exista um continuum da atividade sináptica associativa entre os
neurônios pré e pós-sináptico. Esse continuum é referido na plasticidade
Hebbiana como “neurônios que disparam juntos, conectam juntos”. Essa atividade
é especificamente modulada pela intensidade da despolarização (fortificação ou
enfraquecimento sináptico) do neurônio (Park et al., 2014).
Dentre esses processos estão o potencial de disparo e resposta entre os
neurônios e a permanência desse potencial. Estudos indicam que o tempo de
disparo do neurônio pós-sináptico referente ao pré-sináptico pode fortalecer ou
enfraquecer a sinapse (Favero et al., 2014). A LTP e a LTD (do inglês long term
potentiation e long term depression) são as formas mais comuns de
exemplificação da plasticidade Hebbiana e traduzem o fortalecimento de uma
sinapse (LTP) ou o enfraquecimento da mesma (LTD). Mecanicisticamente, essas
alterações plásticas Hebbianas podem incluir uma alteração pós-sináptica nos
receptores de glutamato pré-existentes na superfície do neurônio. O glutamato é
o neurotransmissor mais abundante no sistema nervoso central e possui um papel
essencial na transmissão sináptica excitatória, dessa forma sendo o mais
estudado no que diz respeito a sua participação em processos de plasticidade
(Cooke e Bear, 2014; Park et al., 2014).
A área CA1 do hipocampo foi a mais estudada com relação às afirmações
de Hebb; e as modificações hebbianas nessa área são mediadas por um tipo de
canal ativado por glutamato, denominado de receptor NMDA (NMDAR). A
abertura desse canal é caracterizada por um mecanismo de detecção de
coincidência (essencial para cumprir a hipótese hebbiana) – é necessária a
liberação de glutamato pré-sináptico e uma concomitante despolarização pós-
sináptica. Essa ativação do NMDA resulta num influxo de Ca2+, o qual ativa a
proteína Ca2+/proteína quinase II dependente de calmodulina (CaMKII), que então
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dispara alterações bioquímicas que fortalecem a sinapse. Estudos indicam que
interferências farmacológicas e genéticas com os NMDARs e a CaMKII
comprometem fortemente a formação de memórias (Lisman et al., 2011).
Contudo, a formação de memórias não obedece apenas uma forma tão
simples de associação para o seu funcionamento, como sugeriu Hebb. Estudos
indicam que, em CA1, além dos fatores hebbianos, e de outros, é necessária a
ação do neurotransmissor dopamina. Essa liberação de dopamina depende de
processos sistêmicos como motivação e estímulo de novidade. Estudos indicam
que os disparos dessas assembleias neurais podem acontecer em situações de
aumento ou diminuição da ativação de células dopaminérgicas. Situações de
estresse e medo são algumas das situações que diminuem essa ativação das
células dopaminérgicas (Lisman et al., 2011).
A formação de uma memória possui fases. Essas podem ser consideradas
na classificação mais clássica com aquisição, consolidação, evocação e extinção
(para uma revisão ver Kandel, 2009); ou com conceitos mais recentes que
compreendem as fases de aquisição, consolidação e reconsolidação (Gisquet-
Verrier et al., 2015). Para ambas as formas de classificação, a aquisição se trata
de um processo celular e molecular onde mudanças facilitam ou dificultam a
comunicação entre neurônios (Benfenati, 2007; Kandel, 2009). Para a
consolidação, temos mudanças funcionais seguidas por transcrição gênica e
síntese proteica, produzindo alterações fenotípicas nos neurônios, associadas a
rearranjos estruturais nas redes neurais. A evocação seria, literalmente, a
retomada das informações de forma consciente ou não, correspondendo à
reativação da rede neuronal envolvida com o armazenamento da informação em
questão (Benfenati, 2007; Kandel, 2009).
19
O conceito de reconsolidação implica que as memórias (novas ou já
consolidadas), ao serem evocadas, exigem uma nova cascata proteica para que
ocorra modificações no modo como a informação está armazenada (para uma
revisão ver Gisquet-Verrier et al., 2015). Durante a reconsolidação, a memória
está lábil e pode ser modificada da sua forma original sempre que é evocada
(Gisquet-Verrier et al., 2015). Para essa nova teoria, a extinção seria um processo
molecularmente distinto e mutuamente excludente da reconsolidação (Merlo et al.,
2014).
A extinção de memórias é um mecanismo natural. Extinção seria a
aquisição de um novo aprendizado. Esse aprendizado teria relação com um
previamente existente, contudo apresentaria alterações suficientes para uma nova
formação e semelhanças o bastante para reativação da memória antiga. A
extinção seria então uma alteração no engrama – alterações neurais para
formação de memórias – de uma memória, porém o novo engrama é armazenado
como uma outra memória capaz de inibir a evocação da memória inicial (Furini et
al., 2015). Esses engramas são passiveis de alterações de acordo com a força
das sinapses que os formam (Favero et al., 2014).
Comportamentalmente, a extinção foi inicialmente descrita por Pavlov e
Anrep, em 1927, em estudos de condicionamento alimentar. Nos primeiros 30
anos de estudos acerca da extinção, eles ficaram restritos a extinção de estímulos
condicionados. Eles observaram que a resposta ao estímulo incondicionado vai
diminuindo até sumir, caso o estímulo que foi pareado com ele pare de ser
apresentado. Também foi Pavlov que iniciou os estudos de condicionamento de
medo em animais, não utilizando o termo “medo”, contudo. Ainda existem
discussões sobre essa nomenclatura para o fenômeno que acontece com
animais. LeDoux sugere o uso de “ameaça” e “resposta de defesa” no lugar dos
20
termos “memória de medo” ou “resposta de medo” (LeDoux, 2014; Furini et al.,
2015).
O fenômeno da extinção de memórias, sejam elas de medo ou não, parece
estar intimamente ligado ao fenômeno da reconsolidação de memórias,
mencionado acima. Na reconsolidação é necessária a evocação de uma memória
previamente existente, enquanto na extinção essa memória deve estar latente.
Quanto maior o tempo entre o treino e a re-exposição a uma mesma situação,
maiores as chances de extinção, ao invés de uma possível reconsolidação, de um
evento (Furini et al., 2015).
A extinção pode levar a um esquecimento das memórias relacionadas, nas
circunstâncias adequadas (Quirk et al., 2010); ou ainda a uma redução da ativação
da memória inicial a níveis tão baixos que se assemelhem a um esquecimento
(Furini et al., 2015). O desuso de sinapses pode levar a um processo de atrofia
dessas. E essa atrofia sináptica pode levar a um ponto de esquecimento dessas
memórias. Assim, após a retirada do reflexo condicionante o animal tenderá a
suprimir essas sinapses o que eventualmente levará a um esquecimento real da
memória associada (Furini et al., 2015).
A extinção de memórias aversivas, ou de comportamentos relacionados ao
medo, é um fenômeno bastante estudado. Apesar disso, as pesquisas em busca
dos mecanismos de inibição da memória inicial, pró-extinção dessa, ainda não
foram elucidados. Enquanto isso, as pesquisas que focam nos aspectos
comportamental e psicológico do condicionamento e extinção produziram dados
que são fundamentais para as pesquisas atuais dos mecanismos neurais onde a
extinção de medo é formada (para uma revisão mais extensa sobre o assunto ver
Milad e Quirk, 2012).
21
As pesquisas sobre a extinção de medo tiveram início no começo da
década de 90. Estudos mostraram que a extinção era uma forma de inibição e que
o bloqueio de receptores GABA-A poderia impedir a extinção (Harris e Westbrook,
1998 apud Milad e Quirk, 2012). Também indicaram que é necessário o
envolvimento de receptores NMDA no núcleo basolateral da amígdala (Falls et al.,
1992). Outras áreas neurais também foram relacionadas a extinção. Essas áreas
são coincidentes com áreas de funcionamento alterado em transtornos de
ansiedade como o TEPT (transtorno de estresse pós-traumático; Milad e Quirk,
2012).
Como ocorre nos demais tipos de aprendizado, a extinção é dependente
de plasticidade. O envolvimento de receptores NMDA e do córtex pré-frontal
infralímbico (ilPFC) sugerem uma necessidade de plasticidade. Ainda, estudos
envolvendo a medição dos níveis de BDNF (do inglês, brain derived neurotrophic
factor) mostram a necessidade da presença desse fator para a plasticidade e a
posterior facilitação na extinção de memórias (Siuciak et al., 1997; Palazidou,
2012; Leal et al., 2015).
Possivelmente por estar envolvido com a extinção de memórias aversivas,
o BDNF também está relacionado a potenciais efeitos antidepressivos. De fato,
uma injeção intracerebroventricular ou diretamente no mesencéfalo dessa
substância possui a capacidade de aumentar a atividade das vias serotonérgicas,
dopaminérgicas e/ou noradrenérgicas (Siuciak et al., 1997). Estudos também
mostram que alterações nos níveis de BDNF no cérebro de camundongos adultos
alteram a neurotransmissão hipocampal de 5-HT (Deltheil et al., 2008). Enquanto
alterações na transmissão de 5-HT, através de tratamentos crônicos com ISRS,
também se mostraram capazes de aumentar as quantidades de BDNF em
camundongos (Santarelli et al., 2003). Como mencionado, o BDNF é um fator
22
diretamente relacionado à plasticidade neural. (Arantes-Gonçalves e Coelho,
2006; Lipsky e Marini, 2007; Santarelli et al., 2003). Em CA1 (sub-região
hipocampal) essa plasticidade ocorre através da indução de LTP (para uma
revisão ver Leal et al., 2015). Deve-se ressaltar que o hipocampo é uma estrutura
cujo hipofuncionamento e sua redução de volume são fortemente relacionados à
depressão, o que foi detectado tanto em humanos, quanto em modelos animais
(Bremner et al., 2000; Santarelli et al., 2003).
Por fim, existem indicações de que a plasticidade de longa duração
hebbiana possui um importante papel no desenvolvimento do sistema nervoso
central e em patologias neurológicas como autismo, retardo mental sindrômico,
demência, perda cognitiva, dependência, processos dolorosos e transtornos
relacionados à ansiedade (Park et al., 2014).
1.2. Psicopatologias e déficits cognitivos
Todas as psicopatologias conhecidas estão descritas e classificadas em
um manual, o Diagnostic and Statistical Manual (DSM), atualmente na sua 5a
edição (APA, 2013). Esse manual reúne as informações acerca de critérios de
diagnóstico, sintomas, características auxiliares no diagnóstico, prevalência,
desenvolvimento e curso do transtorno, fatores de risco e prognóstico, relações
com a cultura e gênero que impliquem no diagnóstico, diagnóstico diferencial,
comorbidades e relações com outros diagnósticos e transtornos. Nesse manual
existe uma grande lista de psicopatologias que interferem no funcionamento dos
processos cognitivos.
Existe uma grande predominância de déficits cognitivos associados aos
transtornos relacionados a traumas e/ou estresse. Uma boa parte das
psicopatologias com esses sintomas exibem um padrão de dificuldade de
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evocação e extinção de memórias. De forma geral, relacionam-se com a
dificuldade de extinguir memórias aversivas (Yaffe, 1999; Ravnkilde, 2002; Phelps
e LeDoux, 2005; Pardo, 2006).
O estresse não é necessariamente ruim. Estresse é a palavra utilizada para
descrever experiências desafiadoras, tanto emocional quando fisicamente. O
“bom estresse” seria o desafiador, de duração controlada, o qual deixa a sensação
de excitação e conquista. Já o estresse prolongado, sobre o qual o indivíduo não
tem controle, exaustivo emocional e fisicamente ou perigoso, é o chamado
“estresse ruim” (McEwen, 2006; 2007).
A resposta de estresse ativa o sistema nervoso autônomo e o eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), disparando a resposta de “luta ou fuga”. Essa
resposta é a forma clássica de organizar o comportamento fisiológico e
comportamental numa situação ameaçadora ou perigosa. O organismo necessita
de um nível ótimo de estresse para sobreviver, e a liberação do cortisol (hormônio
liberado em situações de estresse) é essencial para diversas atividades básicas.
Porém, uma quantidade inadequada ou excessiva de hormônios adrenocorticais
pode ser perigosa (Quervain et al., 1998). Essas alterações são muito propensas
a ocorrer em humanos, pela sua capacidade de prolongar períodos de elevada
atividade desses sistemas. Esse prolongamento da atividade autonômica pode
ser devido à ansiedade, ou exposição a ambientes adversos, ou ainda mudanças
no estilo de vida, ou psicopatologias que podem resultar da submissão ao estresse
crônico (McEwen, 2006; 2007).
As psicopatologias mais comumente associadas ao prolongamento do
estresse são os transtornos depressivos. Já os transtornos de ansiedade, em
especial os relacionados ao estresse e traumas, são comumente associados a
estresses agudos de intensidade elevada, que podem causar danos psicológicos.
24
Contudo, esses dois tipos de transtornos estão sendo, atualmente, estudados em
conjunto. Alguns dos fatores para essa combinação são a grande prevalência de
comorbidade de ambos, o tratamento similar e alguns dos sintomas, como os
déficits do processamento cognitivo (Haber et al., 2013).
1.2.1. Transtornos de ansiedade: transtornos relacionados a trauma e
estresse
Segundo a American Psychiatry Association (APA), há dois transtornos de
ansiedade que se caracterizam pela dificuldade em levar uma vida normal após
um evento traumatizante. São os transtornos relacionados à estresse e trauma:
transtorno de estresse agudo e o transtorno de estresse pós-traumático. Em
ambos o indivíduo passa por situações em que se identifica um evento ameaçador
da vida, dano severo ou violência sexual nas seguintes situações: presenciando
o evento, sofrendo o evento, sabendo do evento ocorrido a terceiros próximos ou
sendo exposto a essas situações aversivas constantemente (comum em
profissionais como bombeiros, policiais e primeiros a chegar a cenas criminais;
APA, 2013).
A sintomatologia é similar em ambos os transtornos, o que os diferencia é
a temporalidade do aparecimento e a persistência dos sintomas. Enquanto o
transtorno de estresse agudo tem um aparecimento imediato ou com poucos dias
após o evento traumático, persistindo de 3 dias a 1 mês, o TEPT caracteriza-se
pela persistência dos sintomas por mais de 1 mês (APA, 2013).
Após o evento traumatizante, ou evento disparador, podem ser
apresentados os seguintes sintomas: reações dissociativas (flashbacks), reações
fisiológicas e estresse psicológico relacionados a pistas internas ou externas que
lembrem o evento (mudança de temperatura, cheiro, ruído...), sonhos
25
estressantes com conteúdo relacionado ao evento e memórias intrusivas,
involuntárias e recorrentes do evento traumático. As reações dissociativas
costumam aparecer com completa perda de consciência do ambiente a volta que
podem durar de alguns segundos a horas. As memórias intrusivas do evento se
apresentam involuntariamente e normalmente incluem informações emocionais,
sensoriais e/ou fisiológicas comportamentais do evento. Os sonhos estressantes
também se enquadram nas formas de reexperiência de sintomas (APA, 2013).
Pode haver também evitação de pessoas, locais, situações, conversas,
memórias, pensamentos ou sentimentos que podem ser associados ao trauma.
Os indivíduos evitam sempre ou quase sempre entrar em contato com os
disparadores (APA, 2013).
Existem ainda sintomas de excitação inadequada relativa ao evento como
humor irritável ou ataques de raiva, comportamento autodestrutivo ou displicente
com relação à própria vida, hipervigilância, resposta de medo exagerada,
distúrbios de sono e ainda déficits de concentração e memória. Dentre as
alterações cognitivas e de humor podem aparecer: a persistência de crença
negativa e exagerada sobre si mesmo, outros ou o mundo, inabilidade de
experienciar sentimentos positivos, diminuição no interesse de participar de
atividades, persistência de estado emocional negativo, sentimentos de desapego
ou estranhamento ao outro, persistência distorcida de informações cognitivas
sobre causas ou consequências do evento e ainda incapacidade de lembrar
aspectos importantes sobre o evento. Esses sintomas podem ser relacionados a
comportamentos do próprio indivíduo ou de outros. Podem não ser diretamente
relacionados ao evento, mas demonstrar uma incapacidade de confiar em si
mesmo, ou nos outros. O indivíduo pode apresentar variações na manifestação e
predominância dos sintomas (baseados em medo, alterações cognitivas,
26
emocionais, ou outras variações). Ainda, alguns indivíduos podem apresentar
combinações nas manifestações dos sintomas (APA, 2013).
O TEPT é um transtorno que varia de acordo com a influência cultural e
estudos indicam um menor número de casos na Europa, Ásia, África e América
Latina, do que nos Estados Unidos (EUA). Pode também variar de acordo com o
grupo de indivíduos e fatores de risco. Por exemplo, é aumentado entre policiais,
bombeiros, paramédicos e veteranos de guerra, e também entre mulheres.
Supõe-se que a susceptibilidade feminina ao transtorno pode ser agravada pela
maior possibilidade de ocorrência de violência interpessoal sofrida por esse sexo
na maioria das sociedades, não descartando a influência dos fatores biológicos e
genéticos (APA, 2013).
Aproximadamente 80% dos indivíduos com TEPT atendem a critérios para
outro transtorno mental (depressão, transtorno bipolar ou transtorno de uso de
substâncias, por exemplo). Os tratamentos podem variar de acordo com a
prevalência de sintomas e responsividade aos fármacos. Contudo, são indicados
tratamentos farmacológicos e psicoterápicos, para uma melhor reestruturação
neural dos estímulos aversivos (Karpova et al., 2011).
Numa tentativa de entender o que ocorre em transtornos que envolvam o
medo, como o TEPT, é utilizado o modelo de condicionamento Pavloviano. Nesse
modelo, é utilizada uma versão do modelo clássico de condicionamento. O
estímulo condicionado (EC) é pareado a um estímulo aversivo (EA), como choque
nas patas ou sopro de ar. Esse pareamento que vai evocar a reação condicionada
(RC; freezing, resposta de sobressalto ou respostas autonômicas).
Em uma exposição inicial a uma informação sensorial aversiva, um som,
por exemplo, a informação é redirecionada para uma estrutura, já bastante
estudada pelo seu papel no medo, a amígdala. Esse input é recebido do córtex
27
auditivo e do tálamo auditivo simultaneamente, podendo ser mediado por ambas
as estruturas para um condicionamento de medo (LeDoux, 2003). Existem
evidências de que o tálamo auditivo esteja mais envolvido nesse processamento
de medo e também que existem alterações na amígdala durante esse
processamento mediado pelo tálamo. Essa ativação da amígdala não ocorreria
em atividades mediadas pelo córtex (Mahan e Ressler, 2012).
Para a interpretação e processamento dessas informações que são
direcionadas à amígdala, os seus núcleos basal e basal acessório recebem
projeções vindas do hipocampo e do córtex pré-frontal (PFC, do inglês prefrontal
cortex). O hipocampo é uma estrutura conhecida por sua relação na mediação
das respostas de medo e na formação de memórias, especialmente de memórias
espaciais (Palazidou, 2012). E o córtex pré-frontal é destacado nas funções de
regulação e emocionais (Palazidou, 2012). No transtorno citado o PFC está
menos responsivo, enquanto a amígdala e o hipocampo ficam hiperresponsivos a
estímulos aversivos e emocionais (Milad e Quirk, 2012; Mahan e Ressler, 2012).
No TEPT existe o envolvimento de outras áreas para o processamento da
informação como o giro parahipocampal, o córtex orbitofrontal, córtex sensório-
motor, tálamo e córtex cingulado anterior. Todas essas regiões têm suas funções
comprometidas nesse transtorno. O giro parahipocampal, o córtex orbitofrontal e
o córtex cingulado anterior apresentam diminuição do seu volume e/ou densidade.
O tálamo apresenta diminuição da circulação sanguínea, e o córtex sensório-
motor é o que apresenta um padrão de aumento de resposta e sensibilidade aos
estímulos (Mahan e Ressler, 2012).
Os pacientes com TEPT demonstram respostas características aos
estímulos de medo, em experimentos. Por exemplo, apresentam-se com uma
maior sensibilidade ao estresse, uma generalização de respostas associadas ao
28
medo, dificuldade para extinguir condicionamento e aprender respostas inibitórias
de medo. Essas respostas inadequadas podem ser decorrentes de uma
plasticidade sináptica aberrante (Mahan e Ressler, 2012).
Uma das possibilidades para explicação dessa plasticidade aberrante seria
uma sinalização ineficiente, ou inadequada de BDNF. Esse fator é diretamente
relacionado à plasticidade neural. Também é diretamente correlacionado com
TEPT em humanos, modelos animais de condicionamento de medo, extinção e
aprendizado inibitório (Soliman et al., 2010).
Outras possibilidades recentemente investigadas envolvem alterações na
produção de proteínas específicas, como a Bax e Bcl-2. Alterações no balanço da
produção dessas proteínas, para positivo ou negativo, seriam cruciais para
modificações nas taxas de apoptose de algumas áreas. Outras proteínas estariam
relacionadas a alterações nas taxas metabólicas de neurônios e células da glia. E
esse balanço de proteínas seria sensível a protocolos de estresse agudo, que
buscam simular o TEPT. O aumento da apoptose ou alteração no metabolismo
dessas áreas seriam relacionados à sintomatologia apresentada pelo transtorno.
Alguns estudos sugerem alterações na produção de Bax e Bcl-2 na amígdala e
hipocampo para o balanço da apoptose, enquanto outros destacam a importância
da produção e balanço entre NAA/Cr (N-acetilaspartato e creatina) e Cho/Cr
(cholina moieties e creatina) nas mesmas áreas para o controle do metabolismo
(Ding et al., 2010; Li et al., 2010; Han et al., 2015).
1.2.2. Transtorno depressivo
A depressão é um dos transtornos mais comuns na população mundial
(APA, 2013) e uma das mais antigas psicopatologias já descritas. Foi descrita por
Hipócrates, 400 a.C., que foi o primeiro a utilizar o termo “melancolia” que, em
29
grego, significa “bile negra”. Outros sintomas eram descritos associados à
melancolia, sendo que apenas no século XIX a depressão foi adequadamente
estudada, quando alterações cerebrais passaram a ser foco dos estudos (Nestler
et al., 2002).
Atualmente, a depressão atinge cerca de 350 milhões de pessoas no
mundo, segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2012). Estima-
se que em 2030 será a doença com maior contribuição para os gastos com saúde
(Willner et al., 2013). Sua etiologia apresenta cerca de 40-50% de componente
genético (Fava e Kendler, 2000). Pesquisas recentes sugerem alterações em um
marcador genético relacionado com a estrutura da mitocôndria, o SIRT1 (Ledford,
2015). Apesar desse componente genético forte, ele ainda não é determinante,
pois outros aspectos não-genéticos são considerados bastante relevantes para o
desenvolvimento da depressão (Fava e Kendler, 2000). A depressão pode
apresentar sintomas semelhantes ao TEPT, contudo com estímulos disparadores
diferentes (APA, 2013).
Desde os anos 60 a depressão é classificada como “depressão maior”
devido a sua sintomatologia descrita no DSM (Nestler et al., 2002). Segundo a
APA, a sintomatologia da depressão é caracterizada por humor deprimido ou
perda de interesse nas atividades prazerosas e mais, pelo menos, cinco sintomas.
O humor deprimido se apresenta por boa parte do dia, quase todos os dias. Essa
alteração de humor pode ser uma queixa relatada pelo próprio paciente, ou algo
observado por outros. Outros sintomas são a diminuição do interesse, ou prazer,
por todas ou quase todas as atividades; alterações no peso, apetite, sono e
comportamento motor (sendo essas caracterizadas por aumento da expressão
desses aspectos ou diminuição dessas manifestações quando comparado ao
comportamento normal do indivíduo). Pode-se apresentar ainda fadiga ou
30
diminuição da energia constantemente, sentimentos de desvalia ou culpa
inapropriada, diminuição da habilidade de pensar ou raciocinar, indecisão e
dificuldades de concentração. Os déficits cognitivos também podem se
manifestar, e são caracterizados por dificuldades de recordar fatos ou eventos.
Podem ocorrer pensamentos recorrentes sobre morte e suicídio, sem planos, ou
tentativas de suicídio, ou ainda, planos para esse fim podem estar presentes
(APA, 2013).
Devido à heterogeneidade nos sintomas e intensidade dos mesmos, a
depressão é considerada uma síndrome que compreende numerosas patologias
de causas distintas (Nestler et al., 2002), além de estar correlacionada a diversas
outras psicopatologias (APA, 2013). Apesar da sua grande parcela de etiologia
genética, os genes relacionados a essa vulnerabilidade ainda não estão
totalmente elucidados. É também bastante influenciada por fatores externos como
estresse, traumas emocionais, infecções virais e até alterações no
desenvolvimento cerebral (Fava e Kendler, 2000).
Como mencionado, uma das teorias para o desenvolvimento da depressão
envolve uma pré-disposição genética, associada a eventos em diversas fases do
desenvolvimento. A pré-disposição genética varia em torno dos 40%, mas alguns
eventos podem aumentar essas chances de desenvolvimento. É relatado, por
exemplo, que uma interação parental emocionalmente pobre ou abusos na
infância podem agravar os riscos de depressão (para uma revisão ver Willner et
al., 2013). De fato, experiências biopsicossociais traumáticas temporárias podem
ser convertidas em vulnerabilidades de longo prazo (Willner et al., 2013). Contudo,
as interações entre a genética e os eventos parecem ser fundamentais para
explicar a variabilidade da incidência da depressão (Papakostas et al., 2004).
31
Pacientes com depressão possuem acentuada elaboração de informações
negativas, dificuldades em desapego de materiais negativos e dificuldades no
controle do processamento de informações negativas. Isso pode estar associado
ao grande volume de pensamentos automáticos negativos e ruminação
patológica. Pessoas com depressão são particularmente sensíveis a feedbacks
psicológicos negativos, os quais tem um efeito desproporcional no desempenho
posterior. A patologia também é associada a uma diminuição na capacidade de
antecipar recompensas, e até em considerar recompensas imediatas (Beck, 1967;
1991; Willner et al., 2013).
Alterações hormonais também podem acentuar sintomas depressivos, ou
até mesmo desencadear um episódio depressivo. São exemplos desse fenômeno
alterações no cortisol (hiper e hipocortisolemia) e na função da tiroide (hiper e
hipotireoidismo). Outras doenças também são conhecidas por apresentarem
sintomas correlatos à depressão, como as doenças de Parkinson e Alzheimer,
alguns tipos de câncer, asma, diabetes e acidentes vasculares cerebrais.
Contudo, o estresse é um dos desencadeantes mais comuns da depressão.
Usualmente, o estresse mais perigoso para desencadear esse transtorno é o
estresse crônico, não o agudo (Nestler et al., 2002).
Nesse sentido, como já mencionado, o estresse agudo é conhecido por
desencadear transtornos de ansiedade e transtornos relacionados ao estresse e
traumas (TEPT e transtorno agudo de ansiedade), e o transtorno depressivo maior
pode ser comórbido a esses transtornos. Contudo, além de seu curso para
desencadeamento de episódios estar geralmente relacionado a uma exposição
continuada a estresses (leves a moderados), seria ainda necessária a presença
de uma predisposição genética junto aos fatores ambientais (Nestler et al., 2002).
32
Apesar de a sintomatologia da depressão ser bastante diferente daquela
de transtornos de ansiedade em diversos aspectos, os aspectos emocional e
cognitivo são semelhantes, além de poderem ser disparados por eventos
estressantes e possuírem o mesmo tratamento farmacológico (Haber et al., 2013).
Como já foi dito, há uma incapacidade de ressignificação das memórias aversivas
que influenciam nos demais sintomas. A ressignificação de memórias é
considerada importante desde Freud, que trouxe a sua importância para
tratamento de desejos repetitivos e/ou intrusivos (Freud, 1914; Friedman, 2008).
O seu uso atualmente é mais amplamente divulgado para tratamento de
transtornos de ansiedade que envolvam traumas e fobias, através de uma
reexposição ao estímulo causador do transtorno, por meio de uma terapia
comportamental (Beck, 1991).
Existe uma ampla variação na prevalência e intensidade dos sintomas
nesses transtornos. Uma das questões levantadas é porque alguns indivíduos
desenvolvem os transtornos, enquanto outros em situações semelhantes não. No
caso do TEPT de 5-30% das pessoas que são submetidas a traumas
desenvolvem o transtorno, enquanto os demais aparentemente são resilientes
(Mahan e Ressler, 2012). Alguns dos seguintes aspectos podem ser cruciais para
o desenvolvimento dos transtornos: genética, predisposição, rede de suporte
social e experiências prévias (Beck, 1991; Nestler, 2002).
Uma das teorias envolve a vulnerabilidade genética mais as experiências
prévias de crenças negativas sobre si mesmo. O indivíduo cria uma crença na
qual se torna inferior caso não conquiste alguns desafios, ou seja superior em
outros. Nesse padrão de resposta, os indivíduos se tornariam muito mais
vulneráveis a experiências negativas na vida adulta. Seriam indivíduos mais
susceptíveis a psicopatologias de ansiedade e humor (Beck, 1991).
33
As alterações cerebrais para regulação do humor se dão em diversas
áreas. Em indivíduos deprimidos, são reveladas alterações no fluxo de sangue e
alterações de constituição de diversas áreas como córtex pré-frontal, córtex
cingulado, hipocampo, estriado, amígdala e tálamo (Nestler et al., 2002). Além
disso, a análise post mortem de algumas dessas áreas revelam alterações
neuronais específicas, como diminuição de receptores 5-HT1A e aumento no
número de 5-HT2, mas ainda existem controvérsias quanto a esses achados
(Power, 2004).
Quanto à relação entre as alterações nas áreas cerebrais e os sintomas,
sugere-se que alterações no hipocampo e neocórtex estejam relacionadas com
os déficits cognitivos, como impedimentos na memória, e os sentimentos
negativos de culpa, desespero, desvalia e pensamentos suicidas. O estriado (em
especial o núcleo accumbens e o estriado ventral) e amígdala (e outras áreas
correlatas) estariam relacionados com a memória emocional e, dessa forma,
poderiam estar mediando a anedonia, ansiedade e a motivação reduzida nos
pacientes com o transtorno. Devido à presença de vários sintomas
neurovegetativos, também se propõe uma participação do hipotálamo. Existem
diversas áreas do cérebro que trabalham em conjunto com o hipotálamo, para a
regulação das funções alteradas. Por esse motivo, se propõe uma formulação de
um circuito neural no qual o hipotálamo estaria envolvido na depressão (Nestler
et al., 2002; Krishnan e Nestler, 2008).
Estudos com ressonância magnética funcional (fMR) e tomografia por
emissão de pósitrons (PET) mostram ainda uma relação entre a atividade da
amígdala e o córtex pré-frontal, especificamente a região do córtex cingulado
subgenual, e emoções disfóricas. A atividade dessas áreas aparece aumentada
em indivíduos saudáveis em um momento de tristeza, e cronicamente
34
aumentadas em indivíduos depressivos. Essas alterações são restauradas com o
tratamento da psicopatologia (Krishnan e Nestler, 2008).
As alterações na amígdala são descritas e relacionadas a alterações no
processamento emocional e percepção dos eventos estressantes. Porém,
estudos que buscam alterações físicas, no volume, se mostram inconsistentes
(Palazidou, 2012). Tais alterações podem servir como um mecanismo de
feedback positivo para o quadro depressivo. São indicados padrões de
processamento cognitivo potencialmente capazes de intensificar os sintomas
negativos da depressão (ver fig.1). A percepção do indivíduo deprimido tem um
menor limiar para eventos negativos verbais e de imagens; maior capacidade de
relembrar feedbacks negativos que positivos; maior propensão a relembrar algum
evento negativo numa hora específica do dia que eventos positivos no mesmo
momento do dia; e tendência a apresentar uma interpretação negativa dos
eventos e perspectiva pessimista dos efeitos de eventos/ações (Beck, 1991).
Figura 1. Ciclo de feedback positivo dos sintomas depressivos.
evento negativo
interpretação de padrão negativo
falta de expectativas
positivas
sentimentos de
incapacidade
atitudes/posturas negativas
35
Esse ciclo envolve outras estruturas para esses comportamentos, mas a
participação da amígdala é importante para a manutenção dessas alterações
cognitivas, de forma negativa, dos eventos. Podemos então, sugerir que a
hipertrofia da amígdala se deve ao aumento da sua atividade (Palazidou, 2012).
É interessante ressaltar que essa hipertrofia da amígdala se dá
concomitante a uma diminuição do volume do hipocampo. Essa diminuição do
volume hipocampal está relacionada a um possível efeito da excitotoxicidade
causada pelo aumento do cortisol cerebral (Bland et al., 2005; Palazidou, 2012).
O hipocampo é uma das estruturas de mediação da atividade da amígdala. A
diminuição do seu volume resulta na diminuição da mediação exercida na
atividade amigdalar, além de possivelmente estar relacionada ao aparecimento
dos déficits de memória (Palazidou, 2012).
Há também alteração na espessura do PFC. O PFC também é uma
estrutura mediadora da função amigdalar. Outra função comprometida pela
diminuição da espessura do PFC é a tomada de decisão, que pode ser
relacionada com a alteração psicomotora (Palazidou, 2012).
As alterações estruturais descritas podem ser decorrentes de alterações na
rede de modulação monoaminérgica. Essa rede se ramifica para a área frontal do
cérebro vinda de projeções da área centro-cerebral e de núcleos do tronco
encefálico. A via dopaminérgica origina-se na área tegmental ventral (VTA), a
serotonérgica emerge do núcleo dorsal da raphe, da área cinzenta periaquedutal
e a noradrenérgica é oriunda do locus coeruleus. Em soma ao controle do alerta
e consciência, esses neurotransmissores também estão envolvidos na modulação
de estímulos emocionais (Krishnan e Nestler, 2008).
1.3. Teorias da depressão e tratamentos: Fluoxetina
36
Em 1951, a isoniazida e a iproniazida foram desenvolvidas para o
tratamento da tuberculose. Como efeito colateral ao tratamento, a iproniazida
demonstrou uma melhora no humor e euforia nos pacientes. Em 1952, Zeller e
colaboradores provaram que a droga era um inibidor da monoaminoxidase
(IMAO). Assim, foi a primeira droga utilizada como antidepressivo, em 1956, até
se descobrir sua hepatoxicidade (Nestler et al., 2002; Meyer e Quenzer, 2005;
Aguiar et al., 2011).
A enzima monoaminoxidase é responsável pela degradação dos
neurotransmissores monoaminérgicos dentro do neurônio. Existem dois tipos de
MAO: A e B e sua diferença é com relação ao substrato que é degradado. A MAO-
A caracteriza-se por uma preferência pela serotonina e noradrenalina, enquanto
a MAO-B metaboliza especialmente os substratos da feniletilamina, como a
dopamina (Aguiar et al., 2011).
A inibição da MAO-A está ligada também a efeitos hipertensivos, além dos
efeitos antidepressivos. Já a MAO-B está associada a efeitos neuroprotetores
contra a degeneração. Os IMAO podem atuar de duas maneiras: de forma
reversível e irreversível. A forma irreversível é de alto risco à vida do paciente,
pois mesmo com a interrupção do uso do medicamento demoram-se vários dias
para a reversão do quadro inibitório e os riscos de interação medicamentosa, e
até alimentícia, são altos (Meyer e Quenzer, 2005; Aguiar et al., 2011).
Em 1958, pesquisas para a descoberta de anti-histamínicos levaram ao
desenvolvimento da imipramina. Nesse momento passaram a existir duas das
classes de antidepressivos conhecidos hoje: os IMAO e os tricíclicos. Enquanto,
como já mencionado, os IMAO são responsáveis por aumentar a
neurotransmissão monoaminérgica através da inibição da enzima de degradação,
os tricíclicos aumentam essa transmissão através do bloqueio da proteína de
37
recaptação das monoaminas (Moreno et al., 1999; Nestler et al., 2002; Aguiar et
al., 2011).
Os antidepressivos tricíclicos têm esse nome pela sua estrutura, contendo
três anéis. Sua síntese, inicialmente foi relacionada a efeitos antipsicóticos devido
à similaridade estrutural com a clorpromazina (primeiro antipsicótico descoberto).
Contudo, a imipramina demonstrou ação antidepressiva e não antipsicótica. Os
tricíclicos não atuam somente impedindo a recaptação de serotonina,
noradrenalina e dopamina, mas também agem bloqueando receptores
histaminérgicos, alfa-adrenérgicos e muscarínicos. Devido ao seu bloqueio
colinérgico, podem causar déficits cognitivos, ou agravar os existentes (Moreno et
al., 1999; Aguiar et al., 2011).
Esses mecanismos de ação dessas drogas levaram à elaboração de
hipóteses de causas biológicas para o surgimento da depressão. Uma vez que a
inibição da monoaminoxidase se provou um método eficiente no tratamento,
supôs-se que a depressão estaria relacionada a um déficit de monoaminas na
fenda sináptica. Drogas que depletam esses neurotransmissores seriam capazes
de induzir quadros depressivos, enquanto drogas que aumentassem a liberação
ou manutenção desses neurotransmissores na fenda sináptica, seriam capazes
de melhorar os sintomas da depressão (Krishnan e Nestler, 2008). Assim, a
inibição da degradação dos neutransmissores recaptados possibilita um maior
volume de monoaminas de volta à fenda sináptica. O mesmo raciocínio se
aplicaria para a inibição do transportador responsável pela recaptação dessas
substâncias (Aguiar et al., 2011).
Nesse sentido, existem evidências da importância das monoaminas no
surgimento dos sintomas da depressão. Uma restrição da ingestão de alimentos
envolvidos na síntese do triptofano (precursor da 5-HT) diminui os níveis
38
plasmáticos do triptofano em até 80%, levando a uma queda nos níveis de
serotonina cerebral. Há ainda alteração com a inibição da tirosina hidroxilase, o
alfa-metil-para-tirosina (AMPT), causando também uma depleção das
catecolaminas, DA e NA. A depleção do triptofano e a inibição da AMPT causam
o aparecimento dos sintomas de depressão em pacientes previamente em
remissão pelo uso de ISRS e ISRN, respectivamente (Delgado et al., 1990, 1991,
1994, 1999; Miller et al., 1996; Willner et al., 2013). O uso de fármacos que
induzem a depleção dessas monoaminas também é um fator indutor de quadros
depressivos (Freis, 1954; Guay, 2010; Tian et al., 2010; Aia et al., 2011; Ghia et
al., 2011).
Apesar de conhecidamente as monoaminas cerebrais estarem envolvidas
com a fisiopatologia da depressão, a hipótese monoaminérgica tal como descrita
acima não parecia ser suficiente para explicar alguns aspectos do tratamento com
antidepressivos. Assim, uma segunda hipótese foi desenvolvida devido a estudos
posteriores com a imipramina. Esses estudos mostravam que a administração
dessa droga levava a um efeito na fenda sináptica em algumas horas, enquanto
os efeitos comportamentais demoravam pelo menos 2 semanas para aparecerem.
Preconizou-se então que a administração prolongada dessa droga levava a uma
modificação estrutural, como por exemplo uma redução na quantidade e função
dos receptores monoaminérgicos, resultando em um feedback positivo para um
aumento na liberação de neurotransmissores. A hipótese inicial, da liberação de
neurotransmissores foi então alterada para a modificação na sensibilidade dos
receptores monoaminérgicos (Willner et al., 2013).
As principais monoaminas envolvidas nas ações de antidepressivos
também têm envolvimento com o funcionamento neuroendócrino. O
funcionamento neuroendócrino também está envolvido com uma das possíveis
39
teorias para o surgimento da depressão. Esta hipótese seria relacionada a uma
resposta não adaptada/mal adaptada aos estímulos estressores, causando efeitos
maléficos. Como já foi mencionado, alterações no sistema endócrino de regulação
da resposta ao estresse constituem-se em elementos de diferenciação entre a
depressão e transtornos de ansiedade. Em ambos, alterações na resposta do eixo
HPA, seja uma hipersensibilidade a essa resposta, seja uma ativação prolongada,
podem levar aos quadros psicopatológicos.
Estudos mostram que aproximadamente 50% dos pacientes
diagnosticados com depressão possuem uma alteração chamada
hipercortisolemia. Essa alteração está relacionada a um aumento da atividade do
eixo HPA, ou alterações de sensibilidade do eixo e regulação da alça de feedback,
causando uma maior liberação de cortisol na corrente sanguínea (Nestler et al.,
2002).
O aumento dos níveis de cortisol também está relacionado a inibição da
neurotransmissão de 5-HT. Essa alteração propõe uma relação direta com os
sintomas de humor da depressão. As alterações nos níveis de cortisol parecem
levar aos sintomas depressivos, não o contrário. Isso se sugere pelos efeitos da
diminuição das taxas de cortisol, através de medicação, acompanhada pelo alívio
dos sintomas depressivos (Nestler et al., 2002).
Apesar da não-especificidade das classes de medicamentos existentes,
apenas em 1988 foi desenvolvida a fluoxetina, primeira droga da classe dos
Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina (ISRS). Essa classe foi
desenvolvida a partir de pesquisas com os tricíclicos. Receberam essa
nomenclatura por apresentarem uma baixa afinidade por receptores adrenérgicos,
colinérgicos e histaminérgicos, enquanto apresentam uma maior afinidade pelo
bloqueio das proteínas de recaptação de serotonina. Devido ao seu mecanismo
40
de ação, relacionado majoritariamente ao neurotransmissor serotonérgico, pode
causar “síndrome serotonérgica”, que é uma urgência médica caracterizada pela
presença exacerbada de serotonina na fenda sináptica ocasionando agitação,
nervosismo, vômito, ataxia, mioclonias, tremor, convulsões, coma e até a morte
do paciente (Aguiar et al, 2011).
Após os ISRS foram desenvolvidos outros medicamentos com mecanismos
variados. Contudo, o uso dos ISRS na depressão ainda é bastante significativo,
sendo a fluoxetina uma das drogas mais prescritas até hoje para esse fim (Dunlop
e Davis 2008).
Um dos efeitos da fluoxetina na reversão dos sintomas das psicopatologias
é a melhora nos déficits cognitivos (Monleón et al., 2002; Drapier et al., 2007;
Castañé et al., 2015). Os mecanismos pelos quais essa melhora acontece ainda
não são completamente claros. Contudo, o tempo necessário para o aparecimento
dos efeitos antidepressivos, seria após o 7º dia de tratamento, segundo estudos
utilizando voluntários saudáveis (Harmer et al., 2009; Harmer, 2010), leva ao
levantamento de possibilidades sobre seu mecanismo de ação mais amplo. A
serotonina possui também um papel regulador na divisão celular e um papel crítico
no controle da proliferação das células adultas neurais, fato que explicaria sua
eficácia na melhora dos sintomas depressivos considerando o papel da
neurogênese hipocampal na fisiopatologia da depressão. Algumas possibilidades
relacionam fluoxetina com alterações na liberação de BDNF, o que está
relacionado a uma das teorias mais recentes da depressão (Santarelli et al., 2003;
Paizanis et al., 2007).
Os efeitos da fluoxetina sobre a liberação de BDNF vem sendo discutidos.
Se, por um lado a fluoxetina tem ação imediata no cérebro, com o aumento da
disponibilidade de neurotransmissor na fenda sináptica (e o BDNF está
41
relacionado com a disponibilidade de serotonina versus a quantidade de cortisol
circundante), por outro esse mesmo BDNF precisa de pouco tempo para exercer
modificações estruturais capazes de reestabelecer a comunicação neural
adequada (Dulawa et al., 2004; Arantes-Gonçalvez e Coelho, 2006; Palazidou,
2012).
Estudos sugerem também uma associação entre o BDNF e a ansiedade.
Em humanos foi observado que tanto o estresse crônico, quanto o agudo tem a
capacidade de diminuir a expressão de BDNF no hipocampo e aumentar os
comportamentos agressivos e ansiosos (Arantes-Gonçalves e Coelho, 2006).
Nesse sentido, comumente se administram ISRS para o tratamento de alguns
transtornos de ansiedade, e acredita-se que o mecanismo de ação desse efeito
envolva o aumento da liberação de BDNF (Dulawa et al., 2004; Palazidou, 2012).
A fisiopatologia e o tratamento da depressão envolvem também adaptação
e plasticidade neural. De acordo com essa hipótese, a depressão seria resultado
de uma falha na execução de respostas adaptativas apropriadas ao estresse e a
estímulos aversivos, ou seja, perda da plasticidade sináptica. De fato, a exposição
crônica a situações de estresse induz um quadro semelhante à depressão, com
redução dos níveis hipocampais de BDNF (Gould et al., 1999; Sen et al., 2003;
Arantes-Gonçalves e Coelho, 2006), componente da família das neurotrofinas,
que, entre várias outras moléculas, apresenta um papel reconhecidamente
importante na plasticidade sináptica (Arantes-Gonçalves e Coelho, 2006; Monfils,
2007; Kalueff, 2007; Karpova et al., 2011).
Estudos utilizando fluoxetina apontam para a necessidade de neurogênese
para a melhora dos sintomas cognitivos associados aos transtornos de humor e
ansiedade. Nesses estudos a administração crônica de fluoxetina melhorou a
42
neurogênese, fator intimamente relacionado à quantidade de BDNF circundante
(Santarelli et al., 2003; David et al., 2009; Karpova et al., 2011).
1.4. Dimorfismo sexual e os transtornos depressivos e relacionados à
trauma e estresse
É de amplo conhecimento o fato de que a fisiologia de homens e mulheres
é diferente. Essas diferenças, contudo, não se restringem aos aparelhos
reprodutores e dimorfismo sexual secundário. Existem diferenças que permeiam
tamanho e processamento de estruturas cerebrais, influenciando e alterando
comportamentos, que não só são sexuais e reprodutivos (Andreano e Cahill,
2009).
Essas diferenças, quanto ao aspecto cerebral, acentuam-se nos efeitos do
estresse e psicopatologias associadas. Mulheres são mais susceptíveis a sofrer
de doenças mentais relacionadas ao estresse e têm duas vezes mais chances de
experienciar depressão, fobias, ansiedade social e TEPT (Mahendran e Yap,
2005; WHO, 2012; Farrell et al., 2013; Graham e Milad, 2013). Além disso, tendem
a apresentar, com maior frequência, sintomas considerados atípicos, como humor
irritável, por exemplo (APA, 2013; Bigos et al., 2009). Sem descartar a influência
de aspectos socioculturais, essa susceptibilidade parece estar ligada à flutuação
hormonal, uma vez que a diferença nas taxas de acometimento dessas
psicopatologias tende a diminuir após a menopausa. O estrógeno está
relacionado a uma modulação da serotonina e do eixo HPA (Nur et al., 2007). Uma
evidência disso é que as taxas de depressão são mais altas em mulheres na
presença de flutuações hormonais intensas, tais como logo antes da
menstruação, imediatamente após a gravidez e durante a menopausa (Bigos et
al., 2009).
43
Alguns estudos indicam uma maior susceptibilidade do sexo feminino aos
efeitos do estresse e, especificamente, aos efeitos do cortisol/corticosterona. Em
um estudo com ratos machos e fêmeas submetidos a um estresse inescapável
foram observados os níveis de corticosterona em dois momentos: imediatamente
após o estresse agudo e 60 minutos após. Nos resultados foram encontrados altos
níveis plasmáticos de corticosterona nas fêmeas em ambos os momentos, tanto
comparando ao seu basal, quanto ao serem comparadas com os machos. A
resposta de aumento da corticosterona nos machos também foi significativa nas
duas medições, mas com menores taxas do hormônio no plasma (Bland et al.,
2005).
Essa resposta aumentada e prolongada ao estresse pode estar relacionada
a uma maior sensibilidade ao cortisol. Essa sensibilidade aumentada pode ser
relacionada com os efeitos deletérios desse hormônio no cérebro, que pode levar
a uma excitotoxicidade (Bland et al., 2005), com consequentes alterações de
funcionalidade e até a danos em estruturas. Dentre as estruturas cerebrais que se
observam alterações decorrentes da toxicidade induzida por glicocorticoides
destaca-se o hipocampo (Palazidou, 2012).
Essa estrutura apresenta dimorfismo sexual. As mulheres apresentam um
hipocampo proporcionalmente maior, diferenças na neuroquímica e maior
sensibilidade ao estresse nessa área (Bland et al., 2005; Goldstein et al., 2001;
Madeira e Lieberman, 1995). As diferenças sexuais para a neuroquímica cerebral
são diversas, como por exemplo alterações nos níveis dos neurotransmissores
GABA (ácido γ -aminobutírico), acetilcolina, vasopressina, opióides e monoaminas,
especialmente a serotonina. Essa é sintetizada em uma proporção muito inferior
em cérebros de mulheres saudáveis quando comparadas com homens saudáveis
(Nishizawa et al., 1997). Também em menor quantidade são os níveis de
44
metabólitos de serotonina em tecido post mortem, e além de um menor número
de células nos núcleos da rafe (Nestler et al., 2002).
Aspectos farmacocinéticos e farmacodinâmicos da ação dos
antidepressivos podem ser distintos entre os sexos. Uma evidência dessa
diferenciação para as respostas aos antidepressivos é a melhor responsividade
do sexo feminino aos ISRS e as altas taxas de abandono do tratamento com
tricíclicos (Dalla et al., 2009), comparando-se aos homens. Alguns estudos
argumentam que os ISRS não seriam uma opção de tratamento para mulheres
em menopausa, até estudos indicarem a melhora da sua eficácia com tratamento
combinado de estradiol (Zanardi et al., 2007). Estudos com ratos são controversos
com relação a essa afirmativa, corroborando-a em alguns estudos e
contradizendo-a em outros (Li et al., 2013; Charoenphandhu et al., 2011,
respectivamente). Ainda em modelos animais, alguns estudos mostram não haver
diminuição da imobilidade no nado forçado em fêmeas tratadas com um
antidepressivo tricíclico, enquanto machos respondem positivamente ao mesmo
tratamento e com a mesma dose (Barros e Ferigolo, 1998). Nesse sentido, sugere-
se um metabolismo mais lento como explicação para a resposta diminuída aos
tricíclicos em fêmeas adultas (Wilson e Roy, 1986).
Os estudos com antidepressivos, mesmo a fluoxetina, poucas vezes
utilizam fêmeas (para uma revisão ver Pehrson et al., 2015). Além disso, quando
o fazem, poucas vezes exploram as fases do ciclo estral das ratas, mesmo com o
crescente corpo de evidências da influência dos hormônios na incidência dos
transtornos de humor e ansiedade e nos efeitos da fluoxetina (para revisão ver
Cahill, 2006; Andreano e Cahill, 2009).
Dois dos estudos mais importantes encontrados para o desenvolvimento
dessa tese utilizando fêmeas e fluoxetina, e buscando verificar efeitos na memória
45
e ansiedade foram os seguintes: o primeiro trabalho utilizou um tratamento
crônico, de 20 dias, para avaliar os efeitos da fluoxetina na ansiedade e memória
com a esquiva discriminativa com fêmeas. Devido ao tipo de tratamento escolhido,
não foi possível a separação dos efeitos por fases do ciclo. Não foram encontrados
efeitos na ansiedade. Os efeitos na memória se destacaram pela melhora na
extinção de uma tarefa aversiva (Melo et al., 2012). O outro estudo utilizou ratos
machos e fêmeas, realizando tratamentos agudo e crônico com fluoxetina. As
ratas mostraram um padrão de extinção do comportamento de medo apenas no
grupo de baixa concentração hormonal. O aumento da ansiedade no tratamento
agudo, por sua vez, pareceu não estar ligada à concentração hormonal ou sexo
dos animais; enquanto o efeito ansiolítico parece estar ligado apenas ao
tratamento crônico (Lebrón-Milad et al., 2013).
46
Justificativa
Os antidepressivos possuem um padrão paradoxal de efeitos sobre a
ansiedade, a memória e os sintomas depressivos. Enquanto os principais
sintomas depressivos só vão minimizar após algumas semanas de tratamento, os
efeitos na ansiedade e na memória podem aparecer agudamente (Harmer et al.,
2009; Harmer, 2010; Lebrón-Milad et al., 2013). Além de respostas temporalmente
diferentes, também podem ser de diferentes tipos, como aumento ou diminuição
dos déficits mnemônicos e de níveis de ansiedade. Essas respostas com tempos
diferenciados são importantes para a compreensão dos mecanismos pelos quais
ocorrem as modificações responsáveis pela diminuição dos sintomas depressivos
promovidos pela fluoxetina.
Além disso, conforme comentado na introdução, alguns estudos mostram
que os efeitos da fluoxetina e outros antidepressivos podem estar envolvidos com
a ação de hormônios sexuais. Nesse sentido, estudos indicam uma maior
incidência e prevalência dos transtornos de humor e ansiedade em mulheres que
em homens, consequentemente maior prescrição de antidepressivos, inclusive
fluoxetina, para mulheres. Apesar disso, as pesquisas farmacológicas tendem a
utilizar modelos experimentais com animais machos (Zucker e Beery, 2010).
Existem ainda evidências de que as mulheres são mais susceptíveis a efeitos
adversos de certos medicamentos quando comparadas aos homens (Kim et al.,
2010). Além disso, um dos efeitos adversos da administração aguda da fluoxetina
é o aumento da ansiedade, tanto em humanos como em modelos animais (Dunlop
e Davis, 2008), e como mencionado, transtornos de ansiedade são mais
prevalentes em mulheres (Bekker e van Mens-Verhulst, 2007). Contudo, esse
efeito de aumento da ansiedade ainda é controverso, aparecendo em alguns
estudos e em outros não (Drapier et al., 2007).
47
O presente trabalho buscou verificar as interações de um tratamento agudo
com fluoxetina e os níveis hormonais endógenos sobre as etapas de uma tarefa
que envolve memória aversiva. Levou-se em consideração, para tanto, o sexo dos
sujeitos experimentais e, em especial, o ciclo hormonal das fêmeas.
Para a fase de aquisição da memória, utilizamos uma comparação entre os
efeitos da administração aguda de três doses de fluoxetina antes do treino tarefa
de memória em ratos machos e fêmeas, com concomitante avaliação da
ansiedade. Foram também abordadas as possíveis influências do ciclo estral das
ratas, utilizando assim animais separados pela sua fase do ciclo estral,
possibilitando uma abordagem sobre os efeitos hormonais relacionados à fase do
ciclo estral. Para a consolidação, utilizamos as mesmas doses, contudo
administradas logo após a sessão de aquisição da memória. E para verificar os
efeitos na evocação dessa memória os animais foram tratados antes da sessão
de teste.
Acreditamos que nossa abordagem permitiu a obtenção de informações
relevantes a cerca de aspectos clínicos do tratamento com fluoxetina: seus
possíveis efeitos agudos sobre as várias etapas da memória e sobre a ansiedade,
possíveis diferenças nesses efeitos entre os sexos e possível influência de
estados hormonais na ação dessa substância.
48
Objetivos
A primeira etapa deste trabalho teve como objetivo investigar os efeitos de
um tratamento agudo pré-treino com fluoxetina em machos e fêmeas saudáveis
avaliando: (1) influência do tratamento na aprendizagem; (2) influência do ciclo
estral na aprendizagem; (3) os efeitos do tratamento na memória (4) parâmetros
clássicos e não-clássicos de ansiedade, relacionando-os ao tratamento e/ou ciclo;
(5) averiguar os efeitos do tratamento e ciclo na locomoção dos animais. Todas
essas avaliações foram realizadas na esquiva discriminativa em labirinto em cruz
elevado, que permite a avaliação concomitante de tais fenômenos.
Na segunda etapa, nossas investigações foram centralizadas em duas
etapas do ciclo estral que demonstraram efeitos opostos nos resultados da
primeira etapa, as quais apresentam perfis hormonais distintos. Estro e Proestro
foram as fases escolhidas para as etapas seguintes de investigação dos efeitos
na memória que incluíam manipulação da consolidação através da administração
de fluoxetina logo após a sessão de aquisição da memória, investigando assim
(6) influência de tratamento e/ou ciclo na evocação; e administração pré-teste,
afim de avaliar (7) alterações decorrentes do tratamento e/ou ciclo na evocação e
extinção da tarefa. Essa segunda etapa também foi utilizada para avaliar alguns
dos mesmos aspectos da primeira etapa e relacioná-los à influência do
tratamento, como os efeitos na ansiedade e locomoção.
Em nossa terceira etapa utilizamos, novamente, todas as fases do ciclo
estral e todas as doses de fluoxetina, para analisar os efeitos do tratamento agudo
no teste do nado forçado e, assim, averiguar (8) alterações nos comportamentos
tipo depressivos.
49
A maior parte dos resultados obtidos foram organizados na forma de um
artigo científico para submissão e os resultados restantes estão compilados em
sequência (itens 3 e 4 desse documento, respectivamente).
50
2. Materiais e métodos
2.1. Animais
Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Wistar, adultos,
provenientes do Biotério Setorial do Laboratório de Estudos de Memória (LEME-
UFRN) e do Biotério Central da Universidade Federal de São Paulo (CEDEME-
UNIFESP). Os ratos foram alojados sob condições de temperatura controlada (21-
23 °C) e iluminação (12/12h claro e escuro). Comida e água ad libitum. Foram
manipulados de acordo com a lei brasileira para uso de animais em pesquisa
científica (Lei no 11.794) e foram feitos todos os esforços para minimizar a dor e
sofrimento dos animais, assim como o número de animais utilizados, e os
procedimentos foram aprovados pelas comissões de ética no uso de animais em
pesquisa nas referidas universidades (ver anexo 1).
2.2. Fármaco
Foi utilizado cloridrato de fluoxetina (Sigma Pharma, Brasil), o qual foi
diluído em solução salina com 50µl de Tween 80 por ml. Em cada experimento, a
fluoxetina foi administrada em doses de 5, 10 ou 20 mg/kg, e o grupo controle
recebeu solução salina com Tween 80 (veículo). As administrações foram
realizadas por via intraperitoneal, em um volume de injeção de 1 ml/kg.
O fármaco ou veículo foram injetados 30 min antes dos procedimentos
comportamentais ou logo após o fim da tarefa comportamental (de acordo com os
respectivos protocolos). O intervalo entre a injeção e o início dos procedimentos
foi escolhido com base em estudos anteriores utilizando a esquiva discriminativa
ou outras tarefas nas quais as doses foram efetivas (Carr et al., 2011; Cryan e
Lucki, 2000; Djordjevic et al., 2012; Dulawa et al., 2004; Iñiguez et al., 2010;
51
Javelot et al., 2011; Li et al., 2009; Melo et al., 2012; Miyamoto et al., 2010; Taylor
et al., 2004; Wang et al., 2011).
2.3. Procedimentos experimentais
2.3.1. Verificação do ciclo estral
O ciclo estral foi monitorado por, pelo menos, dois ciclos completos antes
do início dos experimentos comportamentais, sempre entre as 10-12 h, pelo
seguinte procedimento: Pipetas plásticas são inseridas gentilmente na vagina,
com água destilada (aproximadamente 0,1 ml). Uma leve pressão é aplicada ao
bulbo da pipeta para a coleta de células vaginais. O material coletado é colorido
com azul de metileno (5 mg/ml) e analisado sob microscópio ótico. Foram
adicionados aos experimentos apenas animais que apresentaram ciclo normal.
No começo do terceiro ciclo os animais foram selecionados de acordo com
suas fases do ciclo para os grupos de tratamento. Tentamos equilibrar o número
de animais de cada fase do ciclo em cada dia de experimento. Além disso, a coleta
e análise do ciclo foi realizada antes de qualquer outro procedimento
comportamental ou farmacológico. Para a diferenciação das quatro fases do ciclo
estral foram utilizados os mesmos critérios visuais descritos por outros artigos:
estro – predominância de células cornificadas; proestro – predominância de
células epiteliais nucleadas; diestro – predominância de leucócitos; metaestro –
proporções similares de células cornificadas, nucleadas e leucócitos (Medeiros et
al., 2014; Scharfman et al., 2003).
52
Figura 2. Foto micrografias do esfregaço vaginal de ratas nas diferentes fases do
ciclo estral a. metaestro; b. diestro; c. proestro; d. estro (arquivo pessoal).
A fim de mimetizar o tempo e forma de manipulação necessária para a
coleta do ciclo, utilizada com as fêmeas, os machos foram submetidos a
manipulações semelhantes pelo mesmo período aproximado de tempo, sem,
contudo, a introdução de pipetas.
53
2.3.2. Esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado
Os animais foram submetidos a uma sessão de aquisição da tarefa na EDL
à partir das 12 h, seguida por uma primeira sessão de evocação 24 h após a
primeira (teste), e uma segunda sessão de evocação 48 h após a sessão de treino
(reteste). Teste e reteste ocorrem da mesma forma que a aquisição, a não ser
pela ausência de estímulos (Fig. 3).
Figura 3. Esquema do design experimental referente à tarefa da esquiva
discriminativa em labirinto em cruz elevado e sessões.
O aparato utilizado é uma versão modificada do labirinto em cruz elevado,
feito em madeira, contendo dois braços fechados (50 × 15 × 40 cm), sendo um
braço aversivo (AV) e um não aversivo (NAV), oposta a dois braços abertos (OA;
50 × 15 cm). Em uma sala com iluminação à 5 lx. A tarefa consiste em três
sessões: treino, teste e reteste, cada uma com duração de 10 min.
Na sessão de treino, cada rato é colocado no centro do aparato com a
orientação do corpo para o cruzamento entre os braços abertos. Toda vez que o
animal entra com as quatro patas no braço fechado aversivo, estímulos aversivos
são ligados até o animal deixar o braço. Os estímulos aversivos utilizados são
uma luz de 100 W (1500 lx no chão do aparato) e um ruído (white noise) de 80 dB
54
produzido por uma lâmpada e alto-falantes colocados no braço fechado aversivo.
Nas sessões de teste e reteste os animais são novamente colocados no aparelho,
mas sem a apresentação do estímulo aversivo. A lâmpada e caixa de som
continuam presentes no braço aversivo, contudo permanecem desligados. Vários
estudos realizados com este aparato têm mostrado que o estímulo aversivo é
eficiente. Estudos também demonstram eficiência na tarefa na avaliação de
comportamentos tipo-ansiosos (Melo et al., 2012; Munguba et al., 2011; Patti et
al., 2006; Ribeiro et al., 2010, 2011; Silva et al., 2004).
Para a avaliação da memória foi utilizada a comparação entre os tempos
absolutos gastos nos braços fechados – aversivo e não-aversivo – e a
porcentagem de tempo gasto no braço aversivo [% TAV = tempo em NAV / (tempo
em NAV + AV) x 100]. Para a porcentagem de TAV geral, quando toda a sessão
for considerada, e o TAV% em blocos de tempo, quando a variável for analisada
ao longo das sessões. Nas sessões completas as durações foram divididas em
cinco blocos, de dois minutos cada, a fim de avaliar o aprendizado na sessão de
treino, evocação da tarefa na sessão teste e a possível extinção no reteste.
Ansiedade será avaliada pela percentagem de tempo gasto nos braços
abertos [% = TOA tempo na OA / (tempo de OA + NAV + AV) x 100] e pela
atividade de avaliação de risco para entrada nos braços abertos, caracterizada
pelos comportamentos de esticar-se para avaliar o ambiente, antes de entrar ou
recuar (Setem et al., 1999) – tempo e frequência. A atividade motora foi avaliada
pela distância total percorrida (m) no conjunto do aparelho nas sessões.
As sessões foram gravadas com uma câmera digital colocada sobre o
aparelho e a quantificação comportamental realizada por um software de
monitoramento de vídeo (Anymaze®, Stoelting, EUA).
55
2.3.3. Nado Forçado
Nesse teste as ratas foram colocadas em um cilindro (40 cm altura x 25 cm
largura) com água (30 cm de profundidade, 24-26o C), por dois dias consecutivos.
No primeiro dia os animais foram submetidos a 15 min de exposição forçada
(sessão pré-teste). Vinte e quatro horas depois da sessão pré-teste os animais
foram colocados no cilindro com água novamente (sessão de teste) por 5 min e
as manifestações comportamentais foram quantificadas. Foram avaliados
imobilidade – onde o animal apresenta apenas os comportamentos mínimos para
manter a cabeça acima do nível da água – e escalada – comportamento no qual
o animal tenta escalar as paredes do cilindro na tentativa de escapar.
As sessões foram gravadas com uma câmera digital posicionada acima do
aparato e a quantificação comportamental foi realizada simultaneamente ao teste,
por um experimentador cego ao grupo e tratamento.
2.3.4. Delineamento experimental
Os animais foram alocados em 5 experimentos. As fêmeas foram
separadas em grupos de acordo com a fase do ciclo.
Experimento 1:
Para esse experimento foram utilizadas fêmeas, separadas pelas fases do
ciclo estral no dia do treino (momento da injeção) da tarefa da EDL. Fluoxetina (5,
10 e 20 mg/kg) ou veículo (n=6-11/tratamento/fase) foram administrados 30
56
minutos antes da sessão de treino, para a avaliação dos efeitos comportamentais
durante a aquisição da tarefa.
Figura 4. Delineamento experimental, experimentos 1 e 2.
Experimento 2:
Foram utilizados machos, submetidos a um delineamento experimental
semelhante e aos mesmos tratamentos farmacológicos que as fêmeas do
experimento 1 (n=8-12/tratamento).
Experimento 3:
Foram utilizadas fêmeas, separadas pelas fases do ciclo estral no dia do
treino da tarefa (momento da injeção) da EDL. O tratamento com fluoxetina (5, 10
ou 20mg/kg) ou veículo (n=6-7/tratamento/fase) foi realizado imediatamente após
o treino, para a avaliação dos efeitos na consolidação da memória.
Figura 5. Delineamento experimental, experimento 3.
57
Experimento 4:
Foram utilizadas fêmeas, separadas pelas fases do ciclo estral no dia do
teste da tarefa (momento da injeção) da EDL. Fluoxetina (5, 10 e 20mg/kg) ou
veículo (n=6/tratamento/fase) foram administrados 30 minutos antes da sessão de
teste, para a avaliação dos efeitos na evocação da memória da tarefa e demais
aspectos comportamentais passíveis de avaliação na tarefa.
Figura 6. Delineamento experimental, experimento 4.
Experimento 5:
Para esse experimento as fêmeas utilizadas foram separadas em grupos,
de acordo com a fase do ciclo no dia do teste (momento da injeção) do NF. O
tratamento com fluoxetina (5, 10 ou 20mg/kg) ou veículo (n=5-11/tratamento/fase)
foi administrado 30 minutos antes do teste do NF.
Figura 7. Delineamento experimental, experimento 5.
58
2.7. Análise estatística
Para a avaliação dos parâmetros da tarefa de esquiva discriminativa
análises de variância foram utilizadas para a análise do tratamento x sessão x
ciclo estral (ANOVA de 3 vias) para frequência e tempo em avaliação de risco.
ANOVA de 2 vias para %TAV, %TOA, a distância percorrida e frequência e tempo
em avaliação de risco. ANOVA de 2 vias (tratamento x sessão, em grupos
divididos pelo ciclo estral) e ANOVA de 1 via (tratamento), em animais separados
pelo ciclo estral ou sem considerar o ciclo, foram aplicadas para %TAV, %TOA e
frequência e tempo em avaliação de risco. Utilizamos post hoc Sidak para a
análise de múltiplas comparações de ciclo e sessão e Dunnett para avaliação de
tratamento. O tempo absoluto gasto nos braços aversivo e não aversivo foi
analisado por amostras pareadas utilizando o teste t de student. Para a avaliação
dos blocos de minutos de %TAV foi utilizada ANOVA de medidas repetidas. Todos
os resultados foram considerados significativos quando p<0,05, exceto nas
comparações de blocos de minutos pareadas, onde foi aplicada a correção de
Bonferroni para a significância estatística.
Para a avaliação dos parâmetros da tarefa de nado forçado foram utilizadas
ANOVAs de 2 vias (tratamento X fase do ciclo estral) e 1 via (tratamento),
considerando ou não a separação por fases do ciclo, respectivamente, para os
tempos em imobilidade e em escalada. Para as análises de post hoc utilizamos o
Sidak para avaliação dos efeitos do ciclo e Dunnett para comparações dos
tratamentos.
59
3. Artigo a ser submetido
Estrous cycle and fluoxetine interactions on the modulation of memory and
anxiety- and depression-like behaviors in rats
Melo, T.G.1; Paiva-Santos, M.A.2; Sousa, V.M.1; Bioni, V.S.2; Cunha, D.M.G.2;
Lima, A.C.2; Ferreira, L.S.1; Feitosa, A.S.1; Cunha, J.A.S.1; Medeiros, A.M. 2;
Lima, R.H.1; Ribeiro; A.M.3; Silva, R.H.1,2
1Memory Studies Laboratory, Physiology Department, Federal University of Rio
Grande of Norte, Natal, Brazil
2 Behavioral Neuroscience Laboratory, Department of Pharmacology, Federal
University of São Paulo, São Paulo, Brazil
3 Laboratory of Neuroscience and Bioprospecting of Natural Products, Department
of Biosciences, Federal University of São Paulo, Santos, Brazil
Abstract
Depressive and stress and trauma-related disorders, which have great incidence
among world population, present high comorbidity. Besides the respective
emotional characteristics, individuals affected by these pathologies present
important cognitive alterations. The first line of pharmacological treatment for both
depressive and, to some extent, stress and trauma-related disorders are the
antidepressants, mainly selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) and
serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs). Even though women are
approximately twice more affected by these disorders than men, the pre-clinical
research on the effects of antidepressants on this sex is not as representative as
60
in male subjects. Further, possible influences of the natural female hormonal cycle
on the action of these drugs have been poorly explored. Our study aimed to
investigate the acute effects of three doses of fluoxetine on the behavior of female
rats at different phases of the estrous cycle, using the plus-maze discriminative
avoidance task (PMDAT). The PMDAT is held in a modified elevated plus-maze
that allows concomitant evaluation of cognitive and emotional parameters.
Fluoxetine (5, 10 and 20mg/ml/kg) or vehicle were given i.p. to female rats at
diferent cycle phases before training, after training or before testing. Animals were
tested and retested 24h and 48h after the training session, respectively.
Depressive-like behavior was also evaluated by the forced swimming test. Overall,
the memory results showed that the effects of fluoxetine on female behavior varied
according to the estrous cycle phase and period of administration. In addition,
memory deficits, anxious- and depressive-like behaviors were observed in female
rats after fluoxetine treatment. Despite clinical and animal studies show
antidepressant and anxiolytic beneficial effects of fluoxetine prolonged treatment,
the present results suggest possible cognitive and emotional acute side effects
which may be influenced by sex and hormonal state.
1. Introduction
Anxiety disorders are a large chapter of Diagnostic and Statistical Manual
of Mental Disorders (APA, 2013). They are associated to traumatic events and
difficulties to extinguish fear and anxiety related to chronic stressors or specific
events. Anxiety-like responses are part of the evolutionary behavioral repertoire of
both humans and other animals, but they can be abnormally inadequate to certain
stimuli and/or persistent, which generates the anxiety disorder (Ji et al., 2015; Luck
61
and Lipp, 2015). They are also frequently comorbid with major depressive disorder
(APA, 2013).
Depression is a common mental disorder and a worldwide health concern
(WHO, 2012). The World Health Organization (WHO) estimates that 350 million
people are affected by the psychopathology (2012). In both psychopathologies, as
well as in their comorbidity, women are proximately twice more affected than men
(Mahendran and Yap, 2005; WHO, 2012; Farrell et al., 2013; Graham and Milad,
2013).
The first line of pharmacological treatment for these disorders is the use of
antidepressants (Marks et al., 1998; Brunello et al., 2001; Nestler et al., 2002;
Dulawa et al, 2004; Nandam et al., 2007; Dunlop and Davis, 2008; Lebrón-Milad
et al., 2013), mainly selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) and serotonin-
norepinephrine reuptake inhibitors (SNRIs). It follows that the largest amount of
these drugs is prescribed for women.
Among other alterations (APA, 2013), the cognitive deficit is the most
studied symptom in both mood and anxiety disorders (Austin et al., 2001;
Castaneda et al., 2008; MacQueen et al., 2003; Marks et al., 1998; Nestler et al.,
2002; Paizanis et al., 2007; Schulz et al., 2007; Melo et al., 2012; Lebrón-Milad et
al., 2013). These deficits are usually related to a failure to extinct aversive
emotional experiences (APA, 2013; Graham and Milad, 2013; Lebrón-Milad et al.,
2013). For this reason, there is a growing interest in studying the effects of
antidepressant treatment on extinction of fear responses and fear inhibition
(Lebrón-Milad et al., 2013). Despite of the several studies, the mechanisms of the
cognitive deficits due to the mentioned psychopathologies, as well as are the
mechanisms to regain the cognitive function through the treatment are not clear
yet (Karpova et al., 2011; Kobayashi et al., 2013; Lebrón-Milad et al., 2013).
62
In parallel, despite the greater incidence in women, preclinical research on
the effects of the antidepressants on females is incipient compared to those on
males (Melo et al., 2012; Monleón et al., 2002; Lebrón-Milad et al., 2013). Some
studies indicate a differential effect of antidepressant drugs related to the gender
(Li et al., 2013; Monleón et al., 2002). Further, a possible influence of the female
hormonal cycle in these effects should be considered. Depending on the cycle
phase, the alterations on levels of estrogen, as estradiol, modify the response on
the extinction memory recall of a task in heathy humans (Milad et al., 2010). There
is also evidence that co-administration of estradiol can enhance the speed for
therapeutic effects of SSRIs (fluoxetine or paroxetine) administration, through a
faster desensitization of the 5-HT1A receptors (Li et al., 2013). As for progesterone,
animal studies shown a facilitation on recall of fear extinction, while human studies
showed no alterations (Milad et al., 2009; Milad et al., 2010).
Studies already described a decrease in fear expression after extinction at
the inhibitory avoidance in male (rats), but not in females, chronically treated with
fluoxetine (Monleón et al., 2002). A recent study by our group addressed the
effects of chronic fluoxetine (one of the most used SSRI) on the extinction of an
aversive memory task on females. Those results showed that untreated females
failed to extinguish the task (as had been previously demonstrated by another
study - Ribeiro et al., 2010). Prolonged treatment with fluoxetine potentiated the
extinction of the task (Melo et al., 2012). Nevertheless, one hindrance to better
understood the effects of fluoxetine on females’ behavior in that study was the
impossibility to separate the animals by estrous cycle phases, due the protocol
used. Indeed, the need for a specific number of days of treatment preclude the
selection of animals that were in a certain phase at the day of behavioral
experiment, unless the number of animals were highly increased.
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The task used in that study was the plus-maze discriminative avoidance
task (PMDAT), which can be useful to investigations on the effects of
antidepressants on aversive memory because emotional parameters can also be
investigate concomitantly during the task. This is of relevance because alterations
in the emotional state can modify learning of the task irrespective of a direct effect
of drugs in cognitive mechanisms (Silva and Frussa-Filho, 2000).
Our study aimed to investigate the acute effects of three doses of fluoxetine
on aversive memory acquisition, consolidation and retrieval and anxiety-like
behavior of female rats submitted to the PMDAT at different estrous cycle phases.
Possible cycle-dependent effects of acute fluoxetine on depressive-like behaviors
were also investigated in the forced swimming test.
2. Materials and methods
2.1. Animals
We used 379 three-month-old female (150–270g) and 37 three-to-four-
month-old male Wistar rats (300-515g) from our Sectorial Colony of Memory
Studies Laboratory (LEME-UFRN) and from the Central Colony from University of
São Paulo (CEDEME-UNIFESP). They were housed in groups of 4–5 animals in
plastic cages (30×37×16 cm) in a room with acoustic isolation and controlled
temperature (21–25 °C), humidity and luminosity (12 h light:12 h dark, lights on
6:30 a.m.). Food and water were available ad libitum during the experiments. The
rats were handled according to Brazilian law for the use of animals in scientific
research (Law Number 11.794), and all procedures described were approved by
the local ethics committee (CEUA-UFRN and CEUA-UNIFESP, protocols numbers
17/2013 and 9309030216, respectively). We made all efforts to minimize animal
pain, suffering or discomfort as well as the number of animals used.
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2.2. Treatment and general procedures
Animals were allocated in groups according to the estrous cycle phase at
the moment of injection. Further, for each phase of the estrous cycle we allocated
them in one of these treatment groups (n=6-11/group/phase): vehicle
(physiological saline with Tween 80) and fluoxetine (fluoxetine chlorhydrate, Sigma
Pharma, Brazil, diluted in physiological saline with one drop of Tween 80 per ml)
at the doses of 5, 10 and 20 mg/kg. Treatments were given i.p. ate a volume of 1
mL/kg. The estrous cycle was monitored by vaginal smears for at least two full
cycles before the beginning of the behavioral experiments.
Plastic pipettes were gently introduced in the vagina with distillated water
(approximately 0.1 ml). Slight, brief pressure was applied to the bulb of the pipette
to collect vaginal cells. The material collected was stained with methylene blue (5
mg/ml) and analyzed by optical microscope. The vaginal smears were collected
and analyzed before the treatment and behavioral protocol. For the four phases of
estrous cycle differentiation we used the same visual criteria as other articles
described: estrus (E) — predominance of cornified cells; proestrus (P) —
predominance of epithelial nucleated cells; diestrus (D) — predominance of
leucocytes; and metestrus (M) — similar proportion of nucleated cells, leucocytes
and cornified cells (Medeiros et al., 2014; Scharfman et al., 2003). The visual cell
criteria for differentiation it is correlate to hormone blood analysis of the phases
(Turner and Bagnara, 1971 apud Scharfman et al., 2003). All animals included in
the study were cycling normally.
At the beginning of the third cycle the animals started to be selected for
behavioral sessions, according to the phase they were assigned to the treatment
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groups. The number of animals at each phase was similar for each experiment
day. Thus, all the phases were mixed on the daily choose and order to avoid
alterations due the time on the experimental room.
2.3. Plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT)
The apparatus employed for the PMDAT is a modified elevated wood plus-
maze containing two enclosed arms (50×15×40 cm) in opposition to two open arms
(50×15 cm). In the 10-minute training session, each rat was placed in the center
of the apparatus, and every time the animal entered the aversive enclosed arm,
the rat encountered an aversive situation that lasted until the animal left the arm.
The aversive stimuli included a 100W light (1500 lx at the maze floor level) and an
80 dB noise applied through a speaker placed over the aversive enclosed arm. In
the test and retest sessions held 24h and 48h later, respectively, the rats were
again placed in the apparatus for 10 min without receiving the aversive stimulation.
The lamp and the speaker were still present over the aversive arm but in the off
position. Several studies performed with this behavioral model have demonstrated
that the aversive stimuli used are effective. Indeed, when exposed to these stimuli
in a certain arm of the maze, the animals progressively avoid the specific arm
during a behavioral session. Studies also showed the efficiency of the task in
anxiety-like behaviors evaluation (Melo et al., 2012; Munguba et al., 2011; Patti et
al., 2006; Ribeiro et al., 2010; Silva et al., 2004).
Learning was evaluated by the percentage of time spent in the aversive
enclosed arm [(time spent in aversive enclosed arm/time spent in both enclosed
arms)*100] during the training session. Retrieval and extinction of the task were
evaluated by the comparison of the absolute time spent in the aversive (AV) and
the non-aversive enclosed arms (NAV) in each group in test and retest sessions,
respectively. Both classical (percentage of time spent in open arms, %TOA: time
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spent in open arms/time spent in both open and enclosed arms) and non-classical
(risk assessment of the open arms) anxiety related measures were registered.
Locomotor activity was evaluated by the distance traveled within the apparatus on
the whole session. The behavior of the animals was monitored and analyzed using
the video-tracking software Anymaze (Stoelting, USA).
2.4. Forced swimming test (FST)
In this test rats were placed in a cylinder (40 cm high × 25 cm wide) filled
with water (30 cm deep, 24–27 °C), for two consecutive days. On the first day, the
animals were submitted to 15 min of forced exposure (pre-test session). Twenty-
four hours after this pre-test session, rats were again placed in the water tank (test
session) for 5 min, and immobility duration and climbing behavior were registered.
The behavior of the animals was monitored and analyzed using the video-tracking
software Anymaze (Stoelting, USA). Time spent in immobility and tentative
climbing the cylinder wall were recorded.
2.5. Experimental design
Experiments 1 and 2:
138 female (distributed in P, E, D and M phases, experiment 1) and 37 male
(experiment 2) rats received treatment 30 minutes before the training session of
the PMDAT. Test and retest sessions were performed 24 and 48 h later,
respectively.
Experiment 3:
52 female rats (distributed in P and E phases) were trained in the PMDAT
and received treatment immediately after leaving the apparatus. Test and retest
sessions were performed 24 and 48 h later, respectively.
Experiment 4:
67
50 female rats were trained in the PMDAT. 24h later, rats in P and E phases
and fluoxetine or vehicle treatment was performed 30 minutes before the test
session. Retest session was performed 24 h later.
Experiment 5:
139 female rats were trained in the FST. 24h later, rats in P, E, M and D
phases and received treatment (fluoxetine or vehicle) 30 minutes before the test
session.
The interval between the administration and the injections was chosen
based on previous studies with the plus-maze discriminative task or other protocols
in which the doses were effective (Carr et al., 2011; Cryan and Lucki, 2000;
Djordjevic et al., 2012; Dulawa et al., 2004; Iñiguez et al., 2010; Javelot et al., 2011;
Li et al., 2009; Melo et al., 2012; Miyamoto et al., 2010; Taylor et al., 2004; Wang
et al., 2011).
2.6. Statistical Analysis
Multivariate analyses of variance for estrous treatment x session (two-way
ANOVA) was applied to %TAV, %TOA and the distance travelled on the apparatus.
The treatment x session (two-way ANOVA) separated for each cycle were also
applied to %TOA. One-way ANOVAs were performed to evaluate treatment effect
on distance separately. We used Sidak’s post hoc to multiple comparisons analysis
for session and estrous cycle evaluation and Dunnett’s post hoc for treatment
evaluation. Moreover, the analysis of absolute time (s) spent in AV x NAV was run
by paired-samples student’s t-test, split by treatment and by cycle and treatment.
All analysis were perform at SPSS software and results were considered
significant when p < 0.05.
68
3. Results
3.1. Effects of estrous cycle, sex and fluoxetine treatment in learning and
memory
3.1.1. Pre-training administration
The comparisons for the time spent in aversive and non-aversive arm using
Student’s T test for treatment evaluation showed that both female (Fig.1A-C) and
male (Fig.1D-F) animals, in the training session learned the task, by a lower
exploration of the aversive arm: female VE [t(37) = -11.11; p < 0.001], F5 [t(36) =
-8.11; p < 0.001], F10 [t(30) = -6.68; p< 0.001] and F20 [t(31) = -11.36; p< 0.001];
male VE [t(11) = 12.92; p < 0.001], F5 [t(8) = 12.06; p < 0.001], F10 [t(7) = 15.11;
p < 0.001] and F20 [t(7) = 15.63; p < 0.001] compared to non-aversive arm. The
same analysis to the test session showed that altogether the females did not had
impairment on retrieval caused by treatment: VE [t(37) = 7.21; p < 0.001], F5 [t(36)
= 7.75; p < 0.001], F10 [t(30) = 6.36; p < 0.001], F20 [t(31) = 4.53; p < 0.001]. VE
[t(11) = 3.01; p = 0.012] and F20 [t(7) = 3.17; p = 0.016] males were able to
distinguish the enclosed arms, the other two treatments did not seem to be able to
recognize which arm was aversive on training and explored both enclosed arms
similarly. For the retest session the females continued to discern the enclosed
arms, despite the treatment: VE [t(37) = 8.92; p < 0.001], F5 [t(36) = 7.49; p <
0.001], F10 [t(30) = 5.82; p < 0.001] and F20 [t(31) = 4.47; p < 0.001], while males
were not able to distinguish the enclosed arms anymore, suggesting extinction of
the task.
The same evaluation was performed for the female rats on the experiment
1 with estrous cycles phases and treatments considered for analysis (Fig.2A-L).
For the training session, similar results were shown: VE P [t(8) = -7.06; p < 0.001],
69
E [t(8) = -6.77; p < 0.001], M [t(10) = -4.33; p = 0.001], D [t(8) = -5.16; p = 0.001];
F5 P[t(6) = -3.83; p = 0.009], E [t(9) = -6.28; p < 0.001], M [t(8) = -3.36; p = 0.01],
D [t(10) = -3.24; p = 0.009]; F10 P [t(5) = -2.80; p = 0.03], E [t(7) = -3.52; p = 0.01],
M [t(7) = -3.58; p = 0.009], D [t(8) = -2.89; p = 0.02]; F20 P [t(5) = -4.43; p = 0.007],
E [t(9) = -13.61; p < 0.001], M [t(7) = -7.14; p < 0.001] and D [t(7) = -3.01; p = 0.02].
For the test session, all VE groups continued to distinguish the arms,
spending more time at the non-aversive arm, except for E group: VE P [t(8) = 5.99;
p < 0.001], M [t(10) = 2.97; p = 0.014] and D [t(8) = 4.90; p = 0.001]. All groups
treated with F5 continued to avoid the aversive arm at the test of the task: P [t(6)
= 4.95; p = 0.003], E [t(9) = 2.97; p = 0.016], M [t(8) = 3.51; p = 0.008] and D [t(10)
= 5.44; p < 0.001]. E group was also the only group that did not retrieve the task
on the test session when treated with F10: P [t(5) = 4.08; p = 0.01], M [t(7) = 3.66;
p = 0.008] and D [t(8) = 3.39; p = 0.009]. For F20 treatment, E and D were not able
to retrieve the task on the test session (P [t(5) = 8.95; p < 0.001] and M [t(7) = 6.87;
p < 0.001]).
In the retest session, all VE and F5 treated groups continued to discriminate
the arms,: VE P [t(8) = 6.36; p < 0.001], E [t(8) = 3.88; p = 0.005], M [t(10) = 3.10;
p = 0.011] and D [t(8) = 6.03; p < 0.001]; F5 P [t(6) = 11.80; p < 0.001], E [t(9) =
2.71; p = 0.024], M [t(8) = 2.42; p = 0.042] and D [t(10) = 5.02; p = 0.001]. The E
group was the only group treated with F10 that was not able to remember the task
on the retest session (P [t(5) = 5.09; p = 0.004], M [t(7) = 4.28; p = 0.004] and D
[t(8) = 2.99; p = 0.017]). For the F20 treatment, E and D increased their
explorations on the aversive arm, showing extinction (P [t(5) = 4.63; p = 0.006] and
M [t(7) = 9.67; p < 0.001]). In summary, fluoxetine was effective in inducing deficits
in E and D females, and promoted a mild improvement in E rats.
70
To compare the female groups across the sessions irrespective of their
estrous cycle phase we ran a multifactorial ANOVA (Fig.3A) and showed no effects
for treatment and sessions in %TAV, suggesting no extinction of the task. In males
(Fig.3B), ANOVA to treatment X session for %TAV showed a session [F(2,99) =
66.15; p < 0.001] effect. Sidak’s post hoc pointed to a difference between training
and the other sessions (p < 0.001), with an increase on the exploration of the
aversive arm. This indicates male rats extinguished the task irrespective of
treatment.
3.1.2. Post-training administration
Comparisons using Student’s T test session for the time spent in aversive
and non-aversive arm (Fig.1G-I) for evaluation of training session showed that all
animals learned the task: VE [t(13) = -15.02; p < 0.001], F5 [t(11) = -8.41; p <
0.001], F10 [t(11) = -11.04; p < 0.001] and F20 [t(11) = -10.84; p < 0.001]. For test
session only VE and F20 groups spent more time on the non-aversive arm,
demonstrating memory retrieval: VE [t(13) = -3.67; p = 0.003], F20 [t(11) = -2.96;
p = 0.013]. In the retest session, none of the groups demonstrated to remember
the task.
The same evaluation was performed considering estrous cycles phases and
treatments of female rats (Fig.5A-F) and training showed similar results, i.e., all
groups learned the task: VE P [t(6) = -9.78; p < 0.001], E [t(6) = -10.71; p < 0.001];
F5 P [t(5) = -4.96; p = 0.004], E [t(5) = -7.43; p = 0.001]; F10 [t(5) = -7.21; p =
0.001], E [t(5) = -7.70; p = 0.001]; F20 [t(5) = -6.12; p = 0.002], E [t(5) = -10.46; p
< 0.001]. In the test, only VE groups spent less time in aversive arm (P [t(6) = -
2.87; p = 0.028]; E [t(6) = -2.46; p = 0.049]) indicating a memory deficit induced by
all doses of fluoxetine. The retest evaluation showed that no group had recall the
task and spent more time on aversive arm.
71
Two-way ANOVA of %TAV (Fig.3C) for session X treatment showed
session effect [F(2,138) = 49.41; p < 0.001]. Sidak’s post hoc pointed to training
different to test and retest (p < 0.001) sessions, indicating a fade of the memory of
the task, but unspecific for treatment.
3.1.3. Pre-test administration
We used Student’s T test to compare the time spent in aversive and non-
aversive arm (Fig.1J-L) to evaluate the training and all groups seemed to be able
to learn the task: VE [t(11) = 12.48; p < 0.001], F5 [t(11) = 15.59; p < 0.001], F10
[t(11) = 17.83; p < 0.001] and F20 [t(11) = 11.77; p < 0.001]. For test session only
VE distinguished the arms and spent more time in the non-aversive arm [t(11) =
2.69; p = 0.02]. In the retest session none of the treatment groups discriminate the
arms.
Separating the groups by cycle and treatment (Fig.6A-F), and performing
Student’s T test, the same profile of results was found for training, all groups
learned the task (VE P [t(5) = 16.45; p < 0.001], E [t(5) = 6.38; p = 0.001], F5 P
[t(5) = 12.93; p < 0.001], E [t(5) = 9.65; p < 0.001], F10 P [t(5) = 14.31; p < 0.001],
E [t(5) = 10.59; p < 0.001], F20 P [t(5) = 6.56; p = 0.001], E [t(5) = 10.85; p <
0.001]). The same evaluation for test and retest sessions showed that no group
distinguished the enclosed arms, suggest a learning deficit in both phases
irrespective of treatment.
Two-way ANOVA evaluating treatment X session for %TAV (Fig.3D)
pointed to a session effect [F(2,132) = 36.41; p < 0.001] and Sidak’s post hoc
showed that training differed from test and retest (p < 0.001), indicating an
extinction of the memory of the task across sessions.
72
3.2. Effects of estrous cycle and fluoxetine treatment on anxiety-like
behavior and locomotion
3.2.1. Pre-training administration
Two-way ANOVA was used to investigate treatment X session effects
(Fig.4A) and we found treatment [F(3,402) = 4.84; p = 0.003] and session [F(2,402)
= 15.76; p < 0.001] effects. Dunnett’s post hoc for treatment showed VE differ to
F20 (p = 0.017); Sidak’s post hoc for session indicated training differs from test (p
= 0.001) and retest (p < 0.001). For males, we did not found any effect on the two-
way ANOVA on %TOA (Fig.4B).
To further explore the effects reported above, we did a two-way ANOVA for
treatment X session (Table 1), considering cycle. For P group we found session
[F(2,72) = 9.92; p < 0.001] effect, where Sidak’s post hoc showed training differed
from test (p = 0.014) and retest (p < 0.001). E group showed no effect at any
variable. M group showed a treatment [F(3,96) = 4.92; p = 0.003] effect and
Dunnett’s post hoc pointed to VE differ to F20 (p = 0.001). D group showed a
session [F(2,99) = 8.14; p = 0.001] effect and Sidak’s post hoc indicated training
differed from test (p = 0.005) and retest (p = 0.001).
For locomotion two-way ANOVA for females (Table 2) showed significant
effect to session [F(2,402) = 11.16; p < 0.001]. Sidak’s post hoc comparisons for
session showed training differ to test and retest (p < 0.001) sessions. One-way
ANOVA to evaluate treatment pointed to effect on training [F(3,134) = 3.26; p =
0.023]. Dunnett’s post hoc showed VE different to F20 (p = 0.009). There was no
treatment effect on test and retest sessions.
Two-way ANOVA for locomotion in males (Table 2) showed differences
between subjects’ effects for treatment and session [F(6,99) = 2.66; p = 0.019] and
session [F(2,99) = 12.46; p < 0.001] effect. Sidak’s post hoc for session indicated
73
training different to test (p < 0.001). One-way ANOVA for locomotion in males
pointed to treatment effect in training session [F(3,33) = 4.26; p = 0.012] and
Dunnett’s post hoc pointed to VE differ to F10 (p = 0.029) and F20 (p = 0.012) and
marginally to F5 (p = 0.053). Test and retest sessions did not show any effect.
3.2.2. Post-training administration
Two-way ANOVA for %TOA (Fig.4C) considering treatment X session
effects showed treatment [F(3,138) = 6.74; p < 0.001] effect. Dunnett’s post hoc
indicated difference between VE and F5 (p < 0.001) and F20 (p = 0.004).
Comparisons with two-way ANOVA for %TOA (Table 1) to treatment X
session, split by cycle, were performed. P group showed treatment [F(3,63) = 8.42;
p < 0.001] effect. Dunnett’s post hoc showed VE differ to F5 (p < 0.001). E group
also showed treatment [F(3,63) = 3.66; p = 0.017]. Dunnett pointed to VE different
to F20 (p = 0.006).
One-way ANOVA all cycles together did not show treatment effect for
locomotion on training, test or retest session. Two-way ANOVA for locomotion
(Table 2) did not show any effect from treatment or session.
3.2.3. Pre-test administration
Two-way ANOVA for %TOA (Fig.4D) showed interaction between treatment
and session [F(6,132) = 3.88; p = 0.001] and treatment effect [F(3,132) = 2.70; p
= 0.048]. Dunnett’s post hoc pointed to VE different to F20 (p = 0.028). Two-way
ANOVA with split cycle (Table 1) showed P group alterations in session [F(2,60) =
5.24; p = 0.008] and interaction between session and treatment [F(6,60) = 2.46; p
= 0.034]. Sidak’s post hoc pointed to test differ to training (p = 0.028) and retest (p
= 0.015). E group showed treatment effect [F(3,60) = 3.00; p = 0.038] and
Dunnett’s post hoc pointed to VE differing to F5 (p = 0.026).
74
For locomotion the two-way ANOVA pointed to interaction between subject
effects [F(6,132) = 6.12; p < 0.001], treatment [F(3,132) = 4.03; p = 0.009] and
session [F(2,132) = 16.19; p < 0.001] effects. Dunnett’s post hoc to treatment
showed VE different to F20 (p = 0.002); Sidak’s post hoc pointed test differing to
training and retest (p < 0.001). One-way ANOVA to treatment evaluation showed
no effect on training and retest sessions, but there was an effect on test session
[F(3,44) = 22.63; p < 0.001]. Dunnett’s post hoc for treatment showed VE different
to F5 (p = 0.001), F10 and F20 (p < 0.001).
3.3. Effects of estrous cycle and fluoxetine treatment on depressant
behavior
One-way ANOVA to all females to evaluate antidepressant effect from
treatment with fluoxetine on FST (Table 3) showed no effect on immobility or
climbing time. Two-way ANOVA comparing treatment X cycle was performed and
showed a cycle effect for climbing time [F(3,123) = 3.70; p = 0.014]. Sidak’s post
hoc pointed to P group differ to E (p = 0.016) and D (p = 0.033). One-way ANOVA,
considering the cycle phase, was performed to clarify the cycle effect on immobility
and climbing time. P group showed effect on immobility time [F(3,19) = 4.34; p =
0.017]. Dunnett’s post hoc pointed to VE differing to F5 (p = 0.049) and F20 (p =
0.008), but no other cycle presented treatment effect on immobility or climbing.
75
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TrainingNav
Av
* * * *
A
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TestNav
Av
* * * *
B
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs N
Av
(s)
RetestNav
Av
* * * *
C
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TrainingNav
Av
* * * *
G
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TestNav
Av
* *
H
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
RetestNav
Av
I
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TrainingNav
Av
* * * *
J
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TestNav
Av
*
K
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
RetestNav
Av
L
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
TrainingNav
Av
* * * *
D
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs N
Av
(s)
TestNav
Av
E
* *
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
RetestNav
Av
F
Figure 1. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on learning and memory in the plus-maze discriminative avoidance task in experiments 1 (females, pre-training - A, B, C), 2 (males, pre-training - D, E, F), 3 (females, post-training - G, H, I) and 4 (females, pre-test - J, K, L). Mean ± SE for time spent in aversive (AV) and non-aversive (NAV) enclosed arm in the training, test and retest sessions. Females were considered together for analysis irrespective of cycle phase. Paired-samples Student’s T test: *p ≤ 0.05 compared to NAV.
76
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (P)Nav
Av
* * * *
A
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (M)Nav
Av
* * * *
G
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (E)Nav
Av
* ** *
D
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (D)Nav
Av
* * * *
J
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (M)Nav
Av
* ** *
H
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (D)Nav
Av
* * *
K
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (P)Nav
Av
* * * *
B
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (E)Nav
Av
*
E
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (D)Nav
Av
* * *
L
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (M)Nav
Av
**
* *
I
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (E)Nav
Av
* *
F
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (P)Nav
Av
** *
C
*
Figure 2. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on learning and memory in the plus-maze discriminative avoidance task in experiment 1 separated by the estrous cycle phases P (A, B, C), E (D, E, F), M (G, H, I), D (J, K, L). Mean ± SE for time spent in aversive (AV) and non-aversive (NAV) enclosed arm in the training, test and retest sessions. Paired-samples Student’s T test: *p ≤ 0.05 compared to NAV.
77
0
20
40
60
80
Training Test Retest
%TA
V
Post-training
VE F5 F10 F20
C
# #
0
20
40
60
80
Training Test Retest
%TA
V
Pre-test
VE F5 F10 F20
D
# #
0
20
40
60
80
Training Test Retest
%TA
VPre-training
VE F5 F10 F20
A
0
20
40
60
80
Training Test Retest
%TA
V
Pre-training (Males)
VE F5 F10 F20
B
# #
Figure 3. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on learning and memory in the plus-maze discriminative avoidance task in experiments 1 (females, pre-training - A), 2 (males, pre-training - B), 3 (females, post-training - C) and 4 (females, pre-test - D). Mean ± SE for %TAV in the apparatus in the training, test and retest sessions. Treatment x sessions: two-way ANOVA followed by Sidak’s post hoc for session effect: #p < 0.05 compared to training session.
78
0
10
20
30
40
50
60
70
Training Test Retest
%TO
APre-training VE
F5F10F20
*
* *
#
A
0
10
20
30
40
50
60
70
Training Test Retest
%TO
A
Post-training VEF5F10F20
* * * *
C
0
10
20
30
40
50
60
70
Training Test Retest
%TO
A
Pre-test VEF5F10F20
*
D
0
10
20
30
40
50
60
70
Training Test Retest
%TO
A
Pre-training (Males) VEF5F10F20
B
Figure 4. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on anxiety-like behavior in the plus-maze discriminative avoidance task in experiments 1 (females, pre-training - A), 2 (males, pre-training - B), 3 (females, post-training - C) and 4 (females, pre-test - D). Mean ± SE for %TOA in the apparatus in the training, test and retest sessions. Treatment x sessions: two-way ANOVA followed by Sidak’s post hoc for session and Dunnett’s post hoc for treatment effects: *p < 0.05 compared to vehicle; #p < 0.05 compared to other sessions.
79
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (P)Nav
Av
* * * *
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (E)Nav
Av
* * * *
D
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (P)Nav
Av
*
B
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (E)Nav
Av
*
E
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (P)Nav
Av
C
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (E)Nav
Av
F
Figure 5. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on learning and memory in the plus-maze discriminative avoidance task in experiment 3 separated by the estrous cycle phases P (A, B, C) and E (D, E, F). Mean ± SE for time spent in aversive (AV) and non-aversive (NAV) enclosed arm in the training, test and retest sessions. Paired-samples Student’s T test: *p ≤ 0.05 compared to NAV.
80
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (E)Nav
Av
* * * *
D
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (P)Nav
Av
B
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Test (E)Nav
Av
E
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (P)Nav
Av
C
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Retest (E)Nav
Av
F
0
200
400
600
VE F5 F10 F20
Av
vs. N
Av
(s)
Training (P)Nav
Av
* * * *
A
Figure 6. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on learning and memory in the plus-maze discriminative avoidance task in experiment 4 separated by the estrous cycle phases P (A, B, C) and E (D, E, F). Mean ± SE for time spent in aversive (AV) and non-aversive (NAV) enclosed arm in the training, test and retest sessions. Paired-samples Student’s T test: *p ≤ 0.05 compared to NAV.
81
Experiments pre-training treatment
Groups %TOA
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 22.4 ± 8.7 14.7 ± 3.5# 6.6 ± 2.5#
VE E 29.3 ± 9.3 22.5 ± 10.7 15.4 ± 6.1
VE M 47.3 ± 11.1 49.3 ± 11.1 33.3 ± 8.9
VE D 32.3 ± 11.8 19.8 ± 10.1# 18.5 ± 5.6#
F5 P 35.9 ± 15.5 25.8 ± 8.3# 16.9 ± 2.1#
F5 E 20.3 ± 6.7 17.3 ± 5.5 11.2 ± 3.2
F5 M 40.9 ± 14.4 20.7 ± 5.4 18.2 ± 5.7
F5 D 35.8 ± 10.4 19.0 ± 5.4# 13.8 ± 3.7#
F10 P 45.9 ± 15.4 14.5 ± 6.0# 6.9 ± 2.1#
F10 E 28.6 ± 10.0 30.2 ± 11.8 21.3 ± 7.3
F10 M 44.5 ± 15.0 32.2 ± 12.1 34.4 ± 11.7
F10 D 57.1 ± 14.1 21.9 ± 5.4# 20.6 ± 6.4#
F20 P 32.1 ± 14.9 5.2 ± 3.4# 1.6 ± 1.2#
F20 E 12.6 ± 4.7 14.5 ± 5.1 9.4 ± 3.8
F20 M 19.7 ± 9.8* 10.3 ± 2.9* 10.2 ± 2.3* F20 D 44.5 ± 14.5 22.0 ± 5.4# 20.4 ± 8.0#
Experiment post-training treatment
Groups %TOA
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 10.4 ± 1.9 8.1 ± 2.1 8.8 ± 1.4 VE E 8.7 ± 2.7 9.2 ± 3.1 6.7 ± 2.2 F5 P 24.5 ± 6.4* 26.7 ± 6.5* 21.1 ± 3.9* F5 E 11.5 ± 3.5 12.0 ± 5.2 8.1 ± 2.4 F10 P 16.0 ± 4.5 11.4 ± 3.2 5.6 ± 1.2 F10 E 15.5 ± 4.0 12.3 ± 3.9 6.7 ± 1.9 F20 P 14.4 ± 4.3 14.6 ± 3.8 14.2 ± 5.5 F20 E 15.6 ± 4.3* 16.2 ± 3.9* 17.0 ± 4.3*
Experiment pre-test treatment
Groups %TOA
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 11.4 ± 1.1b 12.3 ± 2.6 7.0 ± 1.4b
VE E 9.6 ± 3.9 22.0 ± 6.2 11.6 ± 3.6
F5 P 10.7 ± 3.3b 5.9 ± 1.6 12.8 ± 3.5b
F5 E 7.3 ± 3.3* 4.7 ± 0.9* 8.5 ± 3.1*
F10 P 11.2 ± 1.9b 4.2 ± 1.3 16.7 ± 3.5b
F10 E 8.3 ± 2.0 4.8 ± 1.2 11.2 ± 2.0
F20 P 11.2 ± 3.4b 3.1 ± 0.8 9.6 ± 2.8b
F20 E 11.1 ± 1.2 4.0 ± 3.4 7.8 ± 4.6
Table 1. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on anxiety-like behavior in the plus-maze discriminative avoidance task in experiments 1 (females, pre-training), 2 (males, pre-training), 3 (females, post-training) and 4 (females, pre-test). separated by estrous cycle phases (Proestrus: P, Estrus: E, Metestrus: M and Diestrus: D). Mean ± SE for percentage of time spent in open arms (%) in the apparatus in the training, test and retest sessions. ANOVAs followed by Sidak’s post hoc for session and Dunnett’s post hoc for treatment: *p < 0.05 compared to vehicle; #p < 0.05 compared to training session; bp < 0.05 compared to test session.
82
Experiments pre-training treatment
Groups Distance (m)
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 11.1 ± 2.1 16.4 ± 3.0# 13.1 ± 2.9#
VE E 19.1 ± 1.6 26.8 ± 11.0# 16.7 ± 2.3#
VE M 17.6 ± 1.8 21.9 ± 4.9# 20.5 ± 3.7#
VE D 16.6 ± 1.8 13.6 ± 3.1# 16.0 ± 3.8#
VE Males 17.8 ± 1.7 16.2 ± 1.9# 16.0 ± 1.8
F5 P 13.0 ± 1.1 16.7 ± 1.9# 20.6 ± 2.2#
F5 E 13.2 ± 1.9 16.4 ± 3.0# 21.0 ± 6.8#
F5 M 12.2 ± 3.0 19.4 ± 4.1# 20.5 ± 3.8#
F5 D 9.1 ± 1.3 14.2 ± 2.4# 16.7 ± 2.9#
F5 Males 11.1 ± 2.4 21.9 ± 1.8# 15.5 ± 2.4
F10 P 9.3 ± 2.7 19.6 ± 4.7# 16.1 ± 4.6#
F10 E 26.6 ± 10.2 18.3 ± 2.5# 19.4 ± 2.4#
F10 M 11.7 ± 1.1 14.3 ± 3.1# 27.1 ± 7.1#
F10 D 8.9 ± 1.3 19.1 ± 3.4# 22.9 ± 3.0#
F10 Males 10.1 ± 2.1 20.8 ± 2.4# 18.2 ± 2.2
F20 P 13.5 ± 1.4* 9.8 ± 2.8* # 7.9 ± 4.1* #
F20 E 9.3 ± 0.9* 19.1 ± 1.5* # 17.4 ± 2.2* #
F20 M 9.1 ± 1.6* 17.5 ± 3.8* # 16.9 ± 3.2* #
F20 D 8.6 ± 1.6* 20.9 ± 2.8* # 18.3 ± 3.0* #
F20 Males 9.1 ± 2.1 19.0 ± 2.2# 14.5 ± 2.3
Females: One-way ANOVA (Treatment)
VE 16.2 ± 1.0 19.8 ± 3.1 16.8 ± 1.7 F5 11.7 ± 1.0 16.5 ± 1.5 19.5 ± 2.2 F10 12.7 ± 2.8 17.7 ± 1.7 21.8 ± 2.3 F20 9.9 ± 0.7* 17.4 ± 1.5 15.7 ± 1.6
Males: One-way ANOVA (Treatment)
VE Males 17.8 ± 1.7 16.2 ± 1.9 16.0 ± 1.8
F5 Males 11.1 ± 2.4 21.9 ± 1.8 15.5 ± 2.4
F10 Males 10.1 ± 2.1* 20.8 ± 2.4 18.2 ± 2.2
F20 Males 9.1 ± 2.1* 19.0 ± 2.2 14.5 ± 2.3
Experiment post-training treatment
Groups Distance (m)
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 19.9 ± 2.2 23.1 ± 1.9 23.9 ± 1.6 VE E 22.2 ± 2.0 21.9 ± 3.4 20.3 ± 3.2 F5 P 27.1 ± 4.1 30.1 ± 3.8 28.5 ± 3.3 F5 E 22.5 ± 3.0 25.0 ± 5.0 22.2 ± 4.4 F10 P 22.6 ± 2.6 25.3 ± 3.4 22.4 ± 3.3 F10 E 26.8 ± 3.3 23.9 ± 4.1 19.7 ± 3.0 F20 P 21.5 ± 3.1 26.3 ± 4.9 22.9 ± 2.4 F20 E 25.0 ± 0.9 26.9 ± 1.6 23.4 ± 3.1
One-way ANOVA (Treatment)
VE 21.5 ± 1.5 22.9 ± 1.9 21.9 ± 1.8 F5 24.8 ± 2.5 27.6 ± 3.1 25.4 ± 2.8 F10 24.7 ± 2.1 24.6 ± 2.5 21.0 ± 2.2 F20 23.2 ± 1.6 26.6 ± 2.4 23.1 ± 1.9
Experiment pre-test treatment
Groups Distance (m)
Training Test Retest
Two-way ANOVA (Treatment X Sessions)
VE P 23.7 ± 2.5# 25.5 ± 2.5 19.1 ± 2.2#
VE E 18.6 ± 3.1# 25.6 ± 3.9 23.2 ± 3.1#
F5 P 24.5 ± 3.1# 14.9 ± 2.5 23.8 ± 1.5#
F5 E 19.4 ± 4.4# 16.8 ± 2.4 18.1 ± 3.0#
F10 P 25.1 ± 4.9# 11.6 ± 3.4 24.8 ± 4.5#
F10 E 22.9 ± 2.9# 11.1 ± 2.0 25.3 ± 2.4#
F20 P 25.1 ± 3.9# 8.0 ± 2.2* 23.5 ± 3.7#
F20 E 23.5 ± 3.3# 3.6 ± 1.2* 14.9 ± 3.6#
One-way ANOVA (Treatment)
VE 21.2 ± 2.1 25.6 ± 2.1 21.2 ± 1.9 F5 22.0 ± 2.7 15.9 ± 1.7* 20.9 ± 1.8 F10 24.0 ± 2.7 11.4 ± 1.9* 25.0 ± 2.4 F20 24.3 ± 2.5 5.8 ± 1.3* 19.2 ± 2.8
83
Forced swim pre-test treatment
Groups Immobility (s) Climbing (s)
Two-way ANOVA (Estrous Cycle X Treatment) One-way ANOVA (Treatment – split by cycle)
VE P 9.6 ± 3.4 59.8 ± 15.5e d
VE E 55.3 ± 9.7 70.2 ± 10.8 VE M 57.0 ± 6.8 74.0 ± 13.4 VE D 34.3 ± 6.8 92.7 ± 14.0 F5 P 50.8 ± 17.5* 57.5 ± 14.1 e d F5 E 49.0 ± 8.1 82.8 ± 8.1 F5 M 54.8 ± 10.7 56.1 ± 6.8 F5 D 50.4 ± 6.3 73.2 ± 17.3 F10 P 32.9 ± 8.0 35.2 ± 6.5 e d F10 E 54.3 ± 8.8 65.6 ± 11.6 F10 M 45.8 ± 7.2 55.3 ± 9.9 F10 D 47.0 ± 7.0 49.4 ± 11.3 F20 P 64.6 ± 11.5* 31.9 ± 12.7 e d F20 E 59.3 ± 8.7 77.0 ± 8.0 F20 M 51.8 ± 11.8 82.1 ± 6.7 F20 D 54.7 ± 15.1 76.2 ± 16.8
One-way ANOVA (Treatment)
VE 42.5 ± 4.8 75.3 ± 6.6 F5 51.4 ± 5.4 68.3 ± 6.1 F10 47.0 ± 4.3 54.1 ± 5.9 F20 56.9 ± 5.9 70.4 ± 6.3
Table 2 Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on locomotion in the plus-maze discriminative avoidance task in experiments 1 (females, pre-training), 2 (males, pre-training), 3 (females, post-training) and 4 (females, pre-test), separated by the estrous cycle phases (Proestrus: P, Estrus: E, Metestrus: M and Diestrus: D). Mean ± SE for distance travelled (m) in the apparatus in the training, test and retest sessions. ANOVAs followed by Sidak’s post hoc for session and Dunnett’s post hoc for treatment: *p < 0.05 compared to vehicle; #p < 0.05 compared to other sessions.
Table 3. Effects of vehicle (VE) or fluoxetine (F) treatment (5, 10 and 20 mg/kg) on depressive-like behavior in the FST in experiment 5 separated by the estrous cycle phases (Proestrus: P, Estrus: E, Metaestrus: M and Diestrus: D) Mean ± SE for immobility time (s) and climbing time (s) during, test session. Two-way ANOVA. ANOVAs followed by Sidak’s post hoc for cycle and Dunnett’s post hoc for treatment: *p < 0.05 compared to vehicle and one-way ANOVA separated by estrous cycle phases: ep < 0.05 compared to Estrus and dp < 0.05 compared to Diestrus.
84
4. Discussion
Fluoxetine is one of the most prescribed antidepressants to treat mood and
anxiety disorders (Dulawa, 2004; Dunlop and Davis, 2008; Lebrón-Milad et al.,
2013; Nestler et al., 2002). Fluoxetine is a selective serotonin reuptake inhibitor
and it has a widely known mechanism of action. It avoids serotonin reuptake by
blocking the reuptake bomb, acting through norfluoxetine, its pharmacologically
active metabolite (Moreno et al., 1999).
Some studies indicate a modulation by estradiol and progesterone on the
effects of fluoxetine (Benmansour et al., 2012; Gomes, et al., 2014; Lebrón-Milad
et al., 2013; Li, et al., 2013). Those hormones seem to be a direct path to enhance
the fluoxetine effect in 5-HT1A receptor protein levels. Desensitization of 5-HT1A
receptor is involved on the improvement of the symptoms of depression and the
signaling of the receptor may accelerate the symptoms improvement (Li et al.,
2013). Our data demonstrated effects that were modulated by both treatment and
hormonal status on memory and anxiety- and depression-related behaviors.
4.1. Memory
The extinction of an aversive memory seems to be fundamental to improve
cognitive deficits, as well as to decrease depressed and anxious behavior. Our
previous studies demonstrated that non-treated mixed cycle female rats in PMDAT
kept avoiding the aversive arm even in the absence of the stimuli (Ribeiro et al.,
2010). In addition, chronic fluoxetine treatment not only elicited an extinction
behavior but also showed the best results among the evaluated antidepressants
(Melo et al., 2012).
In the case of the present study, our intent was to investigate the effects
acute fluoxetine, so we could have a precise indication of the cycle phase the
85
animals were in when treated and tested. In addition, we aimed at evaluating
possible effects of fluoxetine on separate stages of the memory processes. For
this purpose, we performed the injection at three different moments: pre-training
(to verify possible effects on acquisition/learning of the task), post-training (to verify
specific effects on memory consolidation without interference with the learning
process) and pre-test (to assess possible effects on retrieval, and further influence
on extinction mechanisms).
In the pre-training experiment, our results altogether show the peculiarity of
hormonal alterations on modulation of fluoxetine treatment and the importance of
the administrated dose. All females together, for each treatment, showed no effect
on memory acquisition of the PMTAD. In addition, they did not present any type of
extinction of the memory, or even a deficit in retrieving the task with an acute pre-
training administration.
The lack of effect of pre-training administration on the performance at test
was different from which was found for males, that had the performance decreased
by all doses of fluoxetine, except F20. Corroborating this result, Monleón et al
(2002) showed an alteration in males in acquisition of fear, while females were not
affected by chronic fluoxetine treatment. The lack of extinction is another feature
that was different from male animals, and this result corroborates a previous study
(Ribeiro et al., 2010).
When we considered the estrous cycle phases for analysis, however,
animals in each phase showed a different range of results for the treatment, as
well as basal difference for vehicle treated animals.
For the pre-training treatment P, M and D vehicle groups were able to
retrieve the task in the test session. EVE group not only was not able to fully
discriminate the arms, but also had this effect reversed by EF5 treatment. Other
86
groups did not seem to be affected by F5 treatment. On the other hand, there was
a potential amnestic effect induced by F20 treatment, observed at E and D groups.
Although we cannot ensure that E group had the performance worsened by F20,
considering the lack of a significant difference between the arms showed by the
respective VE group, D group was once able to remember and F20 impaired its
memory retrieval, or alternatively, it could have enhanced the beginning of the
extinction process.
Data suggest an influence of gonadal hormonal alterations. Most of the
results indicated E group as more susceptive to have a poor retrieval or highly
efficient extinction of the aversive task, when compared to other groups. The
results for E time on the aversive arm suggest an alteration on the behavioral
pattern on the F5 dose only, in which the animals presented the lower exploration
of the arm. The other animals in E groups demonstrated an increased time spent
in the aversive arm. Studies suggest an influence of the estradiol levels on the
effect of fluoxetine for the desensitization of 5-HT1A receptor (Li et al., 2013).
However, vehicle showed similar patterns of behavior with the other treatment
doses, for the pre-training treatment. That suggests another mechanism
predominantly dependent on hormones for the memory aspects, on the strategy
for our task.
Apparently, the proestrus hormonal pattern acted enhancing the memory of
the task, when the treatment was given before the acquisition. The same memory
persistence appeared in when rats in proestrus went through PMDAT after
treatment with a classical anxiolytic drug (diazepam, Silva et al., 2016).
Altogether, the results from experiments performed with pre-training
administration indicates that acute effects of fluoxetine on memory seem to depend
on sex and estrous cycle phases. However, it is worth mentioning that the
87
treatment did not affect the acquisition of the task, i.e., the behavior during the
acquisition phase (training) was not modified even with the administration of the
drug being held before this session. This suggest that the brain mechanisms
related to the consolidation of memory were most likely affect by the treatment
without consequences to the behavioral modification involved in learning (in the
case of the task used here, the decrement in exploration of the aversive arm). If it
is true, the detrimental effect of fluoxetine would be present even if the injection
was held after the training, when the mechanisms of consolidation continue for
hours after the event (Bekinschtein et al., 2010; Santini et al., 2004).
In the protocol that we used to investigate the effects of post-training
administration, the groups treated with fluoxetine at the highest dose (F20) had a
similar performance compared to VE. The other doses worsened the consolidation
process. Further analyses considering estrous phases results showed that only VE
groups were able to properly retrieve the memory. This suggests that the effects
of fluoxetine were more generalized when given post-training compared to pre-
training administration (in which the effects were more dependent on the cycle
phase). It is important to note that the consolidation processes lasts for hours,
beginning at the moment of the event to be learned. Thus, it is possible that the
post-training administration acted on more specific time points of the mechanisms
leading to consolidation, which might be less dependent of the hormonal status.
Additionally, the basal differences between P and E phases detected in the
previous experiment could be related to the specificity of fluoxetine’s effects. In the
experiment with post-training administration, there was no difference between
estrous cycle phases in animals treated with vehicle. In summary, these data can
be interpreted as a minor importance of the role in the consolidation of the memory
by the interaction of serotonin with sex hormones.
88
Alternatively, a different type of stimuli was offered by the injection in the two
situations; while the PMDAT task is more psychologically aversive, the injection
can elicit a different type of response (more physical) and, due to the moment of
the administration, alter the intensity in which aversive memory will be retrieved. In
other words, the presence of an injection before the behavioral session could
induce a stronger aversive memory than when the training was held without a
previous injection, and this could reflect on retrieval upon test. In this respect,
although there are studies about stress induced by chronic saline injections (Izumi
et al., 1997), one injection could be enough for females under our experimental
design.
Pre-test injection protocol had a different design from the other experiments.
The estrous cycle phase considered is the one on the test day, different from pre-
training and post-training protocols that considered the estrous cycle phase at the
acquisition day. Considering that, the acquisition of the memory happened in a
different phase for translational comparison to pre-training experiment. We choose
this configuration to evaluate fluoxetine treatment directly on the hormonal effects
at the memory stage of retrieval and a possible influence on extinction of the pre-
learned and consolidated task.
When we analyzed all groups together, only VE showed to retrieve the task.
However, when we separated the groups by cycle none of the groups retrieved the
task. Following the same line discussed above, the difference in the results among
experiments, especially in VE groups, can be due to the injection effect, which
could be a confound bias because it was not present in the training phase.
Alternatively, when considering all the cycle phases together, when retrieval did
happen for the VE group, a state dependent learning processes regarding the
effects of fluoxetine could cause the memory deficit. Data about fluoxetine state-
89
dependent-related effects are rare (Arenas et al., 2006) and inexistent in the
PMDAT, but this dependence on interoceptive cues to retrieve tasks have been
well reported for other psychoactive drugs (Hunt and Barnet, 2016; Patti et al.,
2006; Sanday et al., 2012; Sanday et al., 2013). Irrespective of these issues, the
possible effects of fluoxetine in this case did not seem to depend on estrous cycle
phase.
When considering the three protocols of investigation used here, we notice
that extinction of the task varied among experiments. Thus it was clear that the
profile of extinction of the aversive task was: 1- different between sexes; 2-
dependent on cycle phase in the moment of training (acquisition) and 3 –
dependent on the protocol (moment of injection). Some studies found an increase
in extinction under high levels of estradiol, like those found on proestrus (Glover et
al., 2012; Graham and Milad, 2013), due an increase in the activity of ventromedial
prefrontal cortex (vmPC), which is involved in fear inhibition (Zeidan et al., 2011).
Neuroimaging studies show an increased activity in vmPFC, hippocampus and
amygdala during extinction recall in women with high estrogen levels (Glover et
al., 2012). This activity suggests a modulation of hormones in these areas, which
are related to fear extinction. Studies show a differential dendritic morphology,
spine density in CA1 of the hippocampus according to presence or absence of
estradiol (Wooley and McEwen, 1994). It was also shown that there are differences
in spine density in female rats when proestrus and estrus phases are compared
(for a review see Farrell et al., 2013). Estrus phase is characterized by a decrease
in hormonal levels, coming from proestrus, when the levels of estradiol reach the
higher pic, except for progesterone which remains at high levels (Goldman et al.,
2007). Our data suggest that these alterations could be essential to memory recall
and fear behavior, but in an opposite direction.
90
The high activity on these areas combined to our task design seemed to
make a very strong memory trace. Another study from our group also indicated the
persistence of the memory, in proestrus phase even treated with an anxiolytic with
a known amnestic effect (Silva et al., 2016).
D group showed a better potential to extinguish the aversive memory from
the task, while E group was not able to recall and P group was not able to modify
the memory aspect. Apparently, the hormonal balance on estrous cycle and the
memory stage manipulation are the main keys for the effects of fluoxetine on
memory in the PMDAT. The PMDAT allows a complex assess on the memory
stages from learning to extinction. Simultaneously, it allows the evaluation of
anxiety-related and locomotion aspects. This task has shown effectiveness in
evaluating the effects of memory – enhancing and amnestic drugs, anxiolytic and
anxiogenic procedures and drugs, as well as locomotor activity (Silva and Frussa-
Filho, 2000; Silva et al., 1997, 2002a, b). Besides that, some studies also used this
task to analyze gender differences in all the aspects provided (Ribeiro et al., 2010).
4.2. Anxiety
Clinically, fluoxetine is well known for increase anxiety at the beginning of
the treatment (Spigset, 1999), while chronic treatment improves those symptoms
(Boyer and Feighner, 1989). In major depression, anxiety can be a symptom, or a
comorbid disorder (APA, 2013; Wittchen and Jacobi, 2005; Dunlop and Davis,
2008; Lebrón-Milad et al., 2013). The maintenance of the anxiety symptoms could
be due a persistence of the fear related or due aversive memory persistence (APA,
2013).
Some studies using elevated plus maze and fluoxetine in a single IP
injection found effects on the time on the open arms, reducing the exploration
91
(Drapier et al., 2007). Our results, all together, corroborated this acute anxiogenic
effect of fluoxetine in the PMDAT, at least regarding female rats. Further, when the
analysis of the time in the open arms were held considering the estrous cycle
phases, it was clear that this effect is influenced by hormonal status.
Our data found reduced exploration effect for F20 dose in experiments 1
and 4. The effect of reduction on exploration of the open arms on test and retest
sessions, found on first and second experiment, can be due one habituation to the
apparatus, that seems to be lowered by the injection before test session on the
forth experiment, reinforcing the stress theory around injection.
Studies have demonstrated several controversial data regarding anxiety-
like behavior in rats, suggesting that symptoms of anxiety are increased during
early stages of SSRI treatments, whereas a chronic SSRI treatment decreases 5-
HT neurotransmission inducing anxiolytic-like effect (for a review, see Borsini et
al., 2002; Bosker et al., 2001; Drapier et al., 2007; Holmes and Rodgers, 2003;
Kurt et al., 2000; Silva et al., 1999). One recent study has shown that a chronic
treatment with citalopram impaired fear extinction in male rats, while a subchronic
treatment had no effect (Burghardt et al., 2012). In other study citalopram and
fluoxetine had increased the fear expression in a single injection pre testing
(Burghardt et al., 2004). A study compared male and female in acute treatment
and described a small increase on anxiety in both genders, which disappears when
the number of animals were reduced (Lebrón-Milad et al., 2013). Other credited
the increase on anxiety to the activation of 5-HT2C with the SSRIs acute
administration (Burghardt et al., 2007).
It was unclear whether or not SSRI and gonadal hormones interact to
modulate anxiety-like behavior and the persistence of aversive memories in a
specific phase, while impaired the recall of other phases. Only a few studies have
92
conducted experiments involving female rats according to their phases of the
estrous cycle. Oppositely to our results, other studies have demonstrated that
female rats and women have showed good retrieval of extinction memory when
receiving extinction training during high gonadal hormones stages and bad recall
in rats during low levels of gonadal hormones. The high hormonal levels, in rats,
occur during proestrus and first half of estrus (Goldman et al., 2007; Lebrón-Milad
et al., 2013; Maeng and Milad, 2015).
It may be possible due to the large concentration of steroids hormonal
receptors not only in the hippocampus but also in other areas of the brain such as
the ventromedial prefrontal cortex. Those brain areas along with amygdala play a
role in the fear circuitry responsible for regulating fear responses. Previous studies
have shown that testosterone and estradiol regulate serotonin receptors (5HT1A
and 5HT2C) in those areas of the circuitry (McQueen et al., 1999; Nishizawa et al.,
1997). As we showed in our results, all together suggest, therefore, that gonadal
hormones itself may modulate the expression of aversive memories and anxiety-
like behavior, consequently.
Studies showed a high activity of amygdala on an acute treatment with
fluoxetine, in male rats. This activation acts through an enhancing on firing output
on lateral amygdala, and tends to lower down on a chronic treatment (Ravinder et
al., 2011). The high activity on the amygdala of females seems to be more relate
with the high levels of estradiol. Other studies showed that females use different
strategies to escape from aversive tasks (Ribeiro et al., 2010). in a parameter that
simulate a preventive reaction to innate fear. For the classical parameters we did
not found differences for the anxiety. We only found one other study that used
fluoxetine and cycling females, but they presented the results of estrus and
proestrus together, as one phase (Lébron-Milad et al., 2013); even when the two
93
stages showed a different hormonal pattern (for a review see Maeng and Milad,
2015).
4.3. Locomotion
The reduction on locomotor activity as an effect of drugs, it is usually caused
by lethargic or anxiogenic states (Borsini et al., 2002; Drapier et al., 2007; File et
al., 1999; Robert et al., 2011). On our study there were more than one indicative
of reduced locomotion on the higher dose by the antidepressant compared to
vehicle. On the first, second and forth experiments, animals showed a reduced
total covered distance with F20 dose on the administered session. On the second
experiment F10 dose also seemed to be able to reduce the locomotion and a
strong indicative, non-statistical, of a reduction on F5. The forth experiment
reinforced the indicative that all fluoxetine doses reducing locomotion of females
on the one-way ANOVA analysis.
The experiments and doses are similar to the found anxiety effects. This
could be an indication to altered locomotion due anxiety levels. The only
experiment there was not able to influence the locomotion was the third, that
treatment was after the behavioral task and which there was no increase on the
anxiety response. Previous studies also did not find alterations on chronic
fluoxetine treated rats locomotor activity (Iñinguez et al., 2015; Drapier et al.,
2007), but tend to lower behavioral aspects dependent on behavior on the classical
elevated plus-maze (Amodeo et al., 2015) and demonstrate higher anxiety
behaviors despite the non-specificity of the locomotor evaluation (Yang at al.,
2015).
94
4.4. Antidepressant aspects
Literature shows females spending less time in active behavior at the FST
when compared to males (for a review see Bogdanova et al., 2013). Our main
results regarding FST showed that P females had decrease climbing duration,
while fluoxetine induced an increase in immobility at this cycle phase, which is
compatible with the classically described depressive-like behavior (Porsolt et al.,
1977). Importantly, these effects were not observed when all females were
considered for analysis, irrespective of cycle phases. The lack of effect on
depressive-like behaviors for acute treatment with antidepressants in this test is
not surprising, because it is known that the clinical antidepressant action is
apparent only with a few weeks of repeated treatment (Gaynes et al., 2009).
However, the possible increase in depressive-like behavior pointed by our results
in proestrus female point to a relevance of deleterious effect in the beginning of
treatment, especially considering women and their respective cycle stage.
Major studies use males, instead of females, besides the majority in
population diagnostics of depression and anxiety disorders being in women.
Hence, the majority of antidepressant prescriptions are for women (see
Introduction). One of the arguments is the fact that male rats produce a more
consistent data, while females have behavioral oscillations due the hormonal cycle
(Milad et al., 2009; Lebrón-Milad et al., 2013). There is another concern about the
effects that can be related to sex, non-dependent on female hormonal cycle, but
dependent on the brain maturation in presence of the different hormonal patterns
(for a review see Gillies and McArthur, 2010; Arevalo et al., 2014).
There are some sex differences to be considered and to be investigated.
Despite women are basically half of world population, pharmaceutical field still
95
have less information about female brain and physiology for develop and distribute
drugs. There is a need to sex equality on the development and publishing of
scientific research (Berry and Zucker, 2011).
As mentioned, one of the arguments for lower numbers of research in
females is the non-consistent data found (Milad et al., 2009; Lebrón-Milad et al.,
2013). In addition, the majority of existent papers combined some estrous cycle
phases, like diestrus and metaestrus or estrus and proestrus, because of a similar
hormonal pattern (Lébron-Milad et al., 2013; Silva et al., 2016), or because they
found similar responses. Either way, maybe this phase combination is one of the
reasons of many controversial data. Our study indicated the hazard on do such
thing. Every cycle phase had a different pattern of results, depending on the dose
and memory manipulation. Although some of the patterns did not differ statistically
between them, they were visually different and, if combined, could lead to a fake
neutral response.
Combining effects on memory, anxiety and depressive-like behavior, our
results indicate important implications for treatment women with depression and
anxiety disorders with fluoxetine. The contemporary society has increased the
female participation on multiple work and social parameters, but did not increase
the needed respect and health security regarding, for example, drugs which can
be more aggressive to them.
Nevertheless, our study presents some limitations. We used healthy young
adult rats, with a single injection at a sorted moment of investigation, despite the
protocol being able to mimicry the cognitive aspects evolved on mood and anxiety
disorders. Additional studies to verify other memory aspects, plasticity alterations
by gonadal hormones, the effects of multiple injections, and possibly use animals
96
expressing a previous depressive or anxious state might help in the clarification of
the results reported herein.
In conclusion, the results suggest that the acute effects of fluoxetine on
memory vary according to the estrous cycle phase, as well as the memory phase
in which it was administered. In addition, anxious- and depressive-like behaviors
were observed in female rats, under certain conditions, after fluoxetine treatment.
Despite clinical and animal studies show antidepressant and anxiolytic beneficial
effects of fluoxetine prolonged treatment, the present results suggest possible
cognitive and emotional acute side effects which may be influenced by sex and
hormonal state.
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110
4. Resultados complementares
Devido à restrição de espaço no artigo, alguns dados foram suprimidos e
estão descritos a seguir. Em geral, como poderá ser observado, os mesmos
corroboram os resultados descritos e discutidos no artigo acima.
4.1. Aprendizado e memória
4.1.1. Administração pré-treino
A ANOVA de 2 vias (fase do ciclo estral X tratamento) para %TAV (Fig. 9)
não revelou efeitos na sessão de treino, mas apresentou efeito no fator ciclo
[F(3,120) = 6.01; p = 0.001] na sessão de teste. A análise de post hoc Sidak
indicou diferenças entre o grupo E e P (ep = 0.001), M (mp = 0.011) e D (dp =
0.035). Na sessão reteste também houve um efeito no fator ciclo [F(3,121) = 7.93;
p < 0.001]. Análise do post hoc Sidak indicou E diferindo de P (pp < 0.001), M (mp
= 0.001) e D (dp = 0.038). ANOVA de 1 via para efeito do tratamento em cada fase
do ciclo não revelou efeitos na sessão treino, teste ou reteste (Fig.8A-C). Machos
também não apresentaram efeito do tratamento em nenhuma das sessões (Fig.
8D-F).
A análise da ANOVA de medidas repetidas, separadas pela fase do ciclo,
com intuito de avaliar a %TAV no decorrer das sessões (Fig. 10) e a influência do
tratamento, para os animais tratados antes do treino, mostrou que as fêmeas
tiveram efeito do tempo em todos os grupos no treino P: [F(4,100) = 6.42; p <
0.000], E: [F(4,132) = 28.52; p < 0.001], M: [F(4,128) = 19.06; p < 0.001], D:
[F(4,132) = 21.58; p < 0.001]. Os machos (Fig.13) tiveram efeito do tempo
[F(4,132) = 22.01; p < 0.001]. As comparações post hoc indicaram as diferenças
entre os seguintes blocos, para cada grupo no treino: P blocos 1 ≠ 3 (p = 0.006),
4 (p = 0.009), 5 (p = 0.012), E blocos 1 ≠ 2, 3, 4, 5 (p < 0.001), M blocos 1≠ 2 (p =
111
0.025), 3, 4, 5 (p < 0.001), D blocos 1 ≠ 2 (p = 0.001), 3, 4, 5 (p < 0.001) e machos
blocos 1 ≠ 2 (p = 0.002), 3, 4 e 5 (p < 0.001) apenas para tempo. No geral, ocorreu
uma diminuição do tempo no braço aversivo ao longo da sessão de treino, o que
é esperado já que todos os grupos aprenderam a tarefa.
Na sessão teste foi encontrado o efeito tempo nos grupos P [F(4,100) =
3.35; p = 0.013], mas a análise do post hoc não confirmou esse efeito [blocos 1 ≠
3 (p = 0.055)], e machos [F(4,132) = 6.61; p < 0.001] e o post hoc indicou efeito
nos blocos 1 ≠ 3 (p = 0.043), 4 (p = 0.005) e 5 (p < 0.001). Na sessão reteste foi
encontrado efeito do tempo no grupo D [F(4,132) = 6.54; p < 0.001] e a análise
post hoc indicou efeito nos blocos 1 ≠ 2 (p = 0.046), 3 (p = 0.006), 4 (p = 0.033), 5
(p = 0.006).
4.1.2. Administração pós-treino
ANOVA de duas vias não encontrou alterações para tratamento X ciclo
estral na %TAV (Fig. 12) no treino, teste ou reteste. E ANOVA de uma via (Fig.
8G-I) também não encontrou alterações na variável quando separados os animais
pela fase do ciclo.
A ANOVA de medidas repetidas para a %TAV (Fig. 13) separadas pela fase
do ciclo para averiguar efeitos do tempo da sessão e tratamento mostrou efeito
interação tempo X tratamento para o grupo E [F(12,84) = 2.03; p = 0.03] e efeito
do tempo: P: [F(4,84) = 7.04; p < 0.001] e E: [F(4,84) = 9.10; p < 0.001], apenas
na sessão treino. Post hoc indicou alterações para o grupo P entre os blocos 1 ≠
2 (p = 0.012), 5 (p = 0.001) e blocos 1 ≠ 4 (p = 0.015), 5 (p < 0.001) para o grupo
E.
4.1.3. Administração pré-teste
A ANOVA de duas vias para %TAV (Fig. 16) considerando ciclo estral X
tratamento não encontrou alterações no treino, teste ou reteste. A ANOVA de uma
112
via (Fig.8J-L) para tratamento com separação pelas fases do ciclo estral também
não foi capaz de indicar alterações do tratamento nas sessões.
ANOVA de medidas repetidas para %TAV nos blocos de 2 minutos das
sessões (Fig. 15) indicou efeito do tempo na sessão treino: P [F(4,84) = 6.25; p <
0.001] e E: [F(4,84) = 6.46; p < 0.001]. A análise post hoc indicou blocos 1 ≠ 3 (p
= 0.015), 5 (p = 0.024)] [bl.2 ≠ 3 (p = 0.021), 5 (p = 0.008) para o grupo P e blocos
1 ≠ 5 (p = 0.014) para o grupo E. Na sessão de teste o grupo E mostrou efeito do
tempo E: [F(4,80) = 3.03; p = 0.022], mas não foi confirmado no post hoc. E na
sessão teste não houve efeito.
4.2. Ansiedade
4.2.1. Administração pré-treino
Foi realizada uma ANOVA de uma via para as fêmeas, ignorando as fases
do ciclo, para avaliar o efeito do tratamento na frequência e tempo gasto em
realização do comportamento de avaliação de risco (Tabela 1). Não foram
encontradas diferenças significativas para as variáveis nas sessões treino, teste
ou reteste. A ANOVA de três vias (sessão X tratamento X ciclo estral) encontrou
interação entre os fatores sessão X ciclo [F(6,314) = 3.59; p = 0.002] e tratamento
X ciclo [F(9,314) = 1.98; p = 0.041] e efeito do ciclo [F(3,314) = 3.41; p < 0.018] na
frequência. O post hoc de Sidak indicou o grupo M diferindo de P (pp = 0.021) e E
(ep = 0.02). A avaliação para o tempo gasto em avaliação de risco indicou
interação entre tratamento X ciclo [F(9,314) = 2.02; p = 0.036) e sessão X ciclo
[F(6,314) = 4.22; p < 0.001].
Devido a essas interações envolvendo o ciclo, mas a ausência de efeito
direto do ciclo, foi realizada ANOVA de duas vias (tratamento X ciclo) em cada
uma das sessões. Na variável frequência observamos efeito do ciclo [F(3,105) =
4.51; p = 0.005] no treino. Post hoc de Sidak indicou grupo P diferindo dos demais
113
grupos: E (ep = 0.02), M (mp = 0.008) e D (dp = 0.017). Na sessão teste foi indicado
um efeito dentre os fatores [F(9,105) = 2.25; p = 0.024). E na sessão reteste efeito
do ciclo [F(3,105) = 4.35; p = 0.006], onde o post hoc de Sidak indicou diferenças
entre grupo E e M (mp = 0.002) e D (dp = 0.023).
Para o tempo gasto em avaliação de risco encontramos efeito do ciclo
[F(3,105) = 3.80; p = 0.012] no treino. Post hoc de Sidak indicou grupo P diferindo
do E (ep = 0.046) e M (mp = 0.018). No teste encontramos interação entre os
fatores [F(9,105) = 2.09; p = 0.036]. E na sessão de reteste encontramos efeito do
ciclo [F(3,104) = 6.01; p = 0.001]; post hoc de Sidak indicou grupo E diferindo de
P (pp = 0.004), M (mp = 0.001) e D (dp = 0.006).
ANOVA de duas vias (sessão X tratamento) para os machos (Tabela 1)
indicou interação entre sessão e tratamento [F(6,99) = 2.30; p = 0.04] e efeito da
sessão [F(2,99) = 18.38; p < 0.001] para a frequência. Post hoc de Sidak indicou
a diferença entre a sessão de reteste e treino (#p < 0.001) e teste (#p = 0.002).
Para o tempo foi verificado efeito da sessão [F(2,99) = 2.05; p < 0.001]. Post hoc
de Sidak indicou diferenças entre as sessões de reteste e treino e teste (p <
0.001).
4.2.2. Administração pós-treino
ANOVA de uma via com todas as fases do ciclo juntas para avaliar efeito
do tratamento na frequência e tempo de realização da avaliação de risco (Tabela
1) não demonstrou alteração em nenhuma das sessões. ANOVA de três vias
comparando ciclo X tratamento X sessão indicou efeito do ciclo para frequência
[F(1,126) = 6.44; p = 0.012] e tempo [F(1,126) = 9.38; p = 0.003].
4.2.3. Administração pré-teste
A ANOVA de uma via com todos os ciclos juntos para avaliar o efeito do
tratamento não encontrou efeito nas sessões de treino e reteste, para frequência
114
e tempo de realização de avaliação de risco (Tabela 1). Para a sessão de teste
encontramos efeito do tratamento na frequência [F(3,44) = 8.84; p < 0.001], onde
o post hoc de Dunnett indicou VE diferindo de F10 (*p = 0.006) e F20 (*p < 0.001);
e efeito no tempo [F(3,44) = 4,35; p = 0.009], onde o post hoc de Dunnett indicou
VE diferente de F20 (*p = 0.003).
Comparações com a ANOVA de três vias para a avaliação de risco
(frequência e tempo) considerando fase do ciclo X tratamento X sessão (Tabela
1) indicou efeito da sessão [F(2,120) = 8.94; p < 0.001] na frequência; post hoc de
Sidak indicou teste diferindo de treino e reteste (bp = 0.001). Para o tempo gasto
em comportamento de avaliação de risco o efeito entre fatores indicou efeito na
sessão [F(2,120) = 2.63; p = 0.011] e no tratamento [F(3,120) = 3.19; p = 0.026].
Post hoc de Sidak indicou teste diferente de reteste (bp = 0.016) e marginalmente
diferente do treino (p = 0.057); o post hoc de Dunnett para o tratamento VE
diferindo de F20 (*p = 0.01).
115
0
20
40
60
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VTreinoA ♀
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TreinoG ♀
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V
TesteH ♀
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RetesteI ♀
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TreinoJ ♀
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VE F5 F10 F20
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V
TesteK ♀
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VE F5 F10 F20
%TA
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RetesteL ♀
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V
RetesteF ♂
Figura 8. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg) no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado nos experimentos 1 (fêmeas, pré-treino – A, B, C), 2 (machos, pré-treino – D, E, F), 3 (fêmeas, pós-treino – G, H, I) e 4 (fêmeas, pré-teste – J, K, L). Média ± SE for %TAV no aparato nas sessões de treino, teste e reteste. Não houve nenhuma diferença estatística para as análises realizadas.
116
0
20
40
60
80
VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (E)D ♀
0
20
40
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VE F5 F10 F20
%TA
VTreino (P)A ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (D)J ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (M)G ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (E)E ♀
p m
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (M)H ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (P)B ♀
0
20
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (D)K ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (E)F ♀
p m
0
20
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (D)L ♀
0
20
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (M)I ♀
0
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40
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80
VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (P)C ♀
Figura 9. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 1 (fêmeas, pré-treino), considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E, Metaestro: M e Diestro: D). Média ± SE para %TAV no aparato nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVAs de duas vias para tratamento x ciclo estral, seguida de post hoc de Sidak para efeito do ciclo: pp < 0.05 comparado ao Proestro; mp < 0.05 comparado ao Metaestro.
117
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
inTreino (P)
VE F5 F10 F20
A ♀
# 3 4 5
0
20
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Treino (E)
VE F5 F10 F20
D ♀
#
0
20
40
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Treino (D)
VE F5 F10 F20
#
J ♀
0
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80
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Treino (M)
VE F5 F10 F20
#
G ♀
0
20
40
60
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Teste (P)
VE F5 F10 F20
B ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Teste (E)
VE F5 F10 F20
E ♀
0
50
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Teste (D)
VE F5 F10 F20
K ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Teste (M)
VE F5 F10 F20
H ♀
0
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40
60
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (D)
VE F5 F10 F20
#
L ♀
0
20
40
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (M)
VE F5 F10 F20
I ♀
0
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (E)
VE F5 F10 F20
F ♀
0
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (P)
VE F5 F10 F20
C ♀
Figura 10. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 1, considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E, Metaestro: M e Diestro: D). Média ± SE para %TAV em blocos de dois minutos nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVA de medidas repetidas, com comparação dos blocos com correção de Bonferroni: #p < 0.05 comparando aos outros blocos de minutos (quando específico para alguns blocos, está identificado pelo número do bloco ao qual foi estatisticamente significativa a diferença).
118
0
20
40
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100
1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
inTreino
VE F5 F10 F20
A ♂
#
0
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Teste
VE F5 F10 F20
B ♂
# 3 4 5
0
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste
VE F5 F10 F20
C ♂
Figura 11. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 2. Média ± SE para %TAV em blocos de dois minutos nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVA de medidas repetidas, com comparação dos blocos com correção de Bonferroni: #p < 0.05 comparando aos outros blocos de minutos (quando específico para alguns blocos, está identificado pelo número do bloco ao qual foi estatisticamente significativa a diferença).
0
20
40
60
80
VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (P)A ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (E)D ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (P)B ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (E)E ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (P)C ♀
0
20
40
60
80
VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (E)F ♀
Figura 12. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 3 (fêmeas, pós-treino), considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E). Média ± SE para %TAV no aparato nas sessões de treino, teste e reteste. Não foi identificada nenhuma diferença estatística.
119
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
inTreino (P)
VE F5 F10 F20
A ♀
# 2 5
0
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%TA
V -
2m
in
Treino (E)
VE F5 F10 F20
#4 5
D ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Teste (E)
VE F5 F10 F20
E ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Teste (P)
VE F5 F10 F20
B ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Reteste (E)
VE F5 F10 F20
F ♀
0
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60
80
100
1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (P)
VE F5 F10 F20
C ♀
Figura 13. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 3, considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E). Média ± SE para %TAV em blocos de dois minutos nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVA de medidas repetidas, com comparação dos blocos com correção de Bonferroni: #p < 0.05 comparando aos outros blocos de minutos (quando específico para alguns blocos, está identificado pelo número do bloco ao qual foi estatisticamente significativa a diferença).
120
0
20
40
60
80
VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (P)A ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Treino (E)D ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Teste (P)B ♀
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VE F5 F10 F20
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VTeste (E)E ♀
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (P)C ♀
0
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VE F5 F10 F20
%TA
V
Reteste (E)F ♀
Figura 14. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 4 (fêmeas, pós-treino), considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E). Média ± SE para %TAV no aparato nas sessões de treino, teste e reteste. Não foi identificada nenhuma diferença estatística.
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0
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Treino (E)
VE F5 F10 F20
#5
D ♀
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in
Teste (E)
VE F5 F10 F20
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in
Teste (P)
VE F5 F10 F20
B ♀
0
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%TA
V -
2m
in
Reteste (E)
VE F5 F10 F20
F ♀
0
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40
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
in
Reteste (P)
VE F5 F10 F20
C ♀
0
20
40
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1 2 3 4 5
%TA
V -
2m
inTreino (P)
VE F5 F10 F20
A ♀
# 3 5 #
3 5
Figura 15. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), no aprendizado e memória na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado no experimento 4, considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E). Média ± SE para %TAV em blocos de dois minutos nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVA de medidas repetidas, com comparação dos blocos com correção de Bonferroni: #p < 0.05 comparando aos outros blocos de minutos (quando específico para alguns blocos, está identificado pelo número do bloco ao qual foi estatisticamente significativa a diferença).
122
Experimento tratamento pré-treino
Grupos Avaliação de risco BA (n) Avaliação de risco BA (tempo)
Treino Teste Reteste Treino Teste Reteste
ANOVA 3 vias (Ciclo estral X Tratamento X Sessões) ANOVA 2 vias (Ciclo estral X Tratamento - ♀ ou Tratamento X Sessão - ♂)
VE P 7.9 ± 1.4e m d 7.4 ± 1.7 4.6 ± 0.9 12.1 ± 2.4e m 13.2 ± 4.0 7.3 ± 1.3 VE E 4.7 ± 1.0 7.5 ± 2.3 7.2 ± 1.7m d 8.2 ± 2.8 13.9 ± 4.1 13.0 ± 5.1p m d
VE M 2.8 ± 1.2p e 1.8 ± 0.6p e 1.5 ± 0.8p e 3.9 ± 1.9 2.5 ± 1.0 1.6 ± 0.9 VE D 3.6 ± 1.2 3.0 ± 0.8 1.1 ± 0.6 6.3 ± 2.7 3.4 ± 1.3 1.2 ± 0.7 VE Machos 19.9 ±3.1 15.1 ± 2.3 23.3 ± 2.6# b 20.8 ± 4.3 14.7 ± 2.7# 32.0 ± 4.2# b F5 P 5.1 ± 1.9 e m d 2.0 ± 0.6 3.1 ± 1.2 10.3 ± 3.9e m 3.2 ± 0.9 2.8 ± 1.3 F5 E 2.6 ± 0.5 2.2 ± 0.8 6.8 ± 1.0m d 3.6 ± 0.9 2.6 ± 0.8 13.0 ± 2.8p m d F5 M 2.7 ± 0.9 p e 4.3 ± 1.1 p e 3.7 ± 1.5 p e 4.3 ± 1.3 8.3 ± 2.8 8.6 ± 3.7 F5 D 3.7 ± 0.8 4.8 ± 1.6 5.3 ± 1.5 5.2 ± 1.0 9.0 ± 3.2 8.1 ± 2.5 F5 Machos 10.6 ± 2.8 18.2 ± 2.7 22.8 ± 3.2# b 10.1 ± 2.1 18.6 ± 4.9 26.9 ± 4.7# b F10 P 5.2 ± 1.5 e m d 4.8 ± 1.4 4.0 ± 2.2 9.7 ± 3.2e m 6.4 ± 2.1 7.1 ± 3.8 F10 E 2.5 ± 0.7 8.0 ± 2.8 7.0 ± 1.4m d 2.2 ± 0.7 12.0 ± 3.6 18.0 ± 3.5p m d F10 M 5.5 ± 1.7 p e 3.6 ± 1.9 p e 3.1 ± 1.1 p e 10.7 ± 3.6 8.2 ± 5.1 3.9 ± 1.5 F10 D 3.3 ± 1.0 7.0 ± 2.2 5.0 ± 1.4 6.1 ± 1.8 16.0 ± 6.5 9.0 ± 2.9 F10 Machos 7.3 ± 2.8 20.5 ± 4.0 28.1 ± 2.4# b 6.1 ± 2.0 21.7 ± 5.8 46.1 ± 11.2# b F20 P 8.3 ± 4.3 e m d 2.7 ± 0.9 5.8 ± 3.4 17.3 ± 9.8e m 4.6 ± 2.0 7.3 ± 4.8 F20 E 2.4 ± 0.7 4.4 ± 0.6 9.8 ± 1.9m d 5.7 ± 1.9 7.0 ± 1.5 17.4 ± 4.7p m d F20 M 2.6 ± 0.8 p e 5.1 ± 2.1 p e 4.5 ± 1.6 p e 4.0 ± 1.4 10.1 ± 5.5 7.7 ± 3.5 F20 D 3.1 ± 0.9 9.6 ± 1.6 4.9 ± 1.6 9.5 ± 3.5 20.2 ± 4.4 8.5 ± 3.0 F20 Machos 8.9 ± 2.3 15.5 ± 2.5 25.5 ± 5.5# b 7.9 ± 2.1 17.8 ± 4.5 40.6 ± 9.0# b
Tratamento X Sessões
VE 4.6 ± 0.7 4.5 ± 0.8 3.2 ± 0.6 7.4 ± 1.3 7.4 ± 1.6 4.9 ± 1.3 F5 3.7 ± 0.5 3.7 ± 0.6 4.4 ± 0.7 6.3 ± 1.1 6.5 ± 1.3 7.6 ± 1.5 F10 4.3 ± 0.7 5.7 ± 1.1 4.4 ± 0.8 7.7 ± 1.4 10.9 ± 2.6 8.0 ± 1.5 F20 4.0 ± 1.0 5.8 ± 0.9 5.9 ± 1.0 8.9 ± 2.4 11.3 ± 2.3 9.6 ± 2.0
Experimento tratamento pós-treino
Grupos Avaliação de risco BA (n) Avaliação de risco BA (tempo)
Treino Teste Treino Teste
Ciclo estral X Tratamento X Sessões
VE P 16.4 ± 1.6e 21.9 ± 4.9e 20.9 ± 3.3e 20.9 ± 3.5e 17.6 ± 4.0e 19.0 ± 4.5e VE E 13.1 ± 5.4 10.9 ± 5.0 14.7 ± 3.6 10.4 ± 3.5 8.2 ± 3.7 12.3 ± 3.1 F5 P 19.3 ± 3.7e 24.3 ± 7.5e 29.0 ± 4.0e 15.5 ± 3.8e 19.2 ± 5.7e 16.6 ± 3.0e F5 E 11.3 ± 5.0 14.2 ± 5.3 25.8 ± 6.8 9.4 ± 5.6 12.6 ± 4.4 20.7 ± 5.1 F10 P 23.3 ± 5.6e 16.3 ± 4.0e 15.2 ± 4.9e 18.6 ± 4.0e 14.9 ± 6.9e 12.2 ± 2.4e F10 E 14.3 ± 6.5 17.7 ± 8.0 18.3 ± 5.0 10.5 ± 5.0 15.1 ± 5.5 14.1 ± 4.4 F20 P 19.8 ± 3.0e 15.8 ± 3.3e 20.7 ± 3.1e 23.2 ± 5.3e 16.0 ± 3.7e 16.8 ± 4.7e F20 E 15.6 ± 4.9 14.7 ± 5.3 13.5 ± 3.6 11.2 ± 4.0 13.3 ± 5.0 8.6 ± 2.7
Tratamento X Sessões
VE 14.8 ± 2.7 16.4 ± 3.7 17.8 ± 2.5 15.7 ± 2.8 12.9 ± 2.9 15.7 ± 2.8 F5 15.3 ± 3.2 19.3 ± 4.6 27.4 ± 3.8 12.4 ± 3.3 15.9 ± 3.6 18.6 ± 2.9 F10 18.8 ± 4.3 17.0 ± 4.3 16.8 ± 3.4 14.5 ± 3.3 15.0 ± 4.2 13.2 ± 2.4 F20 16.7 ± 2.9 14.7 ± 3.0 17.1 ± 2.5 16.4 ± 3.7 14.7 ± 3.0 12.7 ± 2.9
Experimento tratamento pré-teste
Grupos Avaliação de risco BA (n) Avaliação de risco BA (tempo)
Treino Teste Treino Teste
Ciclo estral X Tratamento X Sessões
VE P 21.3 ± 4.4b 19.3 ± 2.6 14.3 ± 2.8b 20.2 ± 6.1b 21.7 ± 6.1 18.6 ± 5.8b VE E 21.1 ± 4.5b 19.1 ± 2.7 27.9 ± 7.3b 21.4 ± 6.0b 17.0 ± 2.9 27.3 ± 6.9b F5 P 16.5 ± 3.0b 14.7 ± 4.5 18.0 ± 3.8b 17.5 ± 4.4b 13.8 ± 4.2 24.0 ± 8.0b F5 E 18.0 ± 5.6b 12.2 ± 4.0 19.2 ± 4.8b 19.0 ± 6.8b 12.9 ± 4.9 17.8 ± 5.4b F10 P 26.3 ± 7.3b 10.7 ± 4.5 20.3 ± 5.8b 30.8 ± 10.8b 10.4 ± 4.2 18.9 ± 5.5b F10 E 16.8 ± 3.6b 8.8 ± 2.2 22.8 ± 3.8b 17.3 ± 4.0b 11.6 ± 5.3 24.3 ± 7.1b F20 P 25.5 ± 4.6* b 7.2 ± 2.0* 20.0 ± 4.2* b 19.9 ± 2.0* b 8.5 ± 3.9* 15.2 ± 2.8* b F20 E 17.2 ± 4.0* b 1.2 ± 0.5* 13.0 ± 2.6* b 12.6 ± 2.0* b 1.6 ± 1.0* 12.6 ± 2.1* b
Tratamento X Sessões
VE 18.8 ± 2.9 20.0 ± 2.0 22.6 ± 4.7 17.7 ± 4.1 20.7 ± 3.7 25.0 ± 5.0 F5 17.3 ± 3.0 13.4 ± 2.9 18.6 ± 2.9 18.2 ± 3.9 13.3 ± 3.1 20.9 ± 4.7 F10 21.8 ± 4.2 9.8 ± 2.4* 21.6 ± 3.3 24.0 ± 5.9 11.0 ± 3.2 21.6 ± 4.3 F20 21.3 ± 3.2 4.2 ± 1.3* 16.5 ± 2.6 16.2 ± 1.7 5.0 ± 2.2* 13.9 ± 1.7
123
Tabela 1. Efeitos do tratamento com veículo (VE) ou fluoxetina (F, 5, 10 e 20 mg/kg), em comportamentos tipo-ansiosos na esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado nos experimentos 1 (fêmeas, pré-treino), 2 (machos, pré-treino), 3 (fêmeas, pós-treino) e 4 (fêmeas, pré-teste), considerando-se as fases do ciclo estral (Proestro: P, Estro: E, Metaestro: M e Diestro: D). Média ± SE para frequência (n) e tempo (s) em comportamento de avaliação de risco nos braços abertos (BA) nas sessões de treino, teste e reteste. ANOVAs seguidas de post hocs Sidak ou Dunnett de acordo com a variável: *p < 0.05 comparando ao veículo; #p < 0.05 comparado à sessão de treino; bp < 0.05 comparado a sessão teste; pp < 0.05 comparando ao P; ep < 0.05 comparando ao E; mp < 0.05 comparando ao M; dp < 0.05 comparando ao D.
124
5. Considerações finais
Devido à demora no tempo de resposta do início do tratamento para o início
da melhora dos sintomas depressivos é que grande parte dos estudos investiga
os efeitos da administração crônica (Santarelli et al., 2003). Os estudos também
tendem a averiguar em tratamentos crônicos a reversão de possíveis déficits
cognitivos (Yaffe, 1999; Ravnkilde, 2002; Phelps e LeDoux, 2005; Pardo, 2006).
A importância desses estudos é inegável, contudo ainda é pequeno o número de
estudos envolvendo os efeitos da fluoxetina nas diversas etapas das memórias.
Apesar de saber-se que a percepção de indivíduos com depressão pode
estar alterada (Beck, 1967; 1991; Willner et al., 2013) e, dessa forma,
retroalimentar a persistência de memórias aversivas, poucos são os estudos que
investigam as alterações causadas pela fluoxetina nessas etapas de memória.
Num geral, a maioria dos experimentos focam na extinção de memórias de medo,
mas nem sempre é possível uma extinção dessas memórias. Estudos indicam a
necessidade da combinação de terapias psicofarmacológicas e psicoterapias para
uma maior eficiência dos efeitos dos antidepressivos (Karpova et al., 2011). E, em
alguns casos, a extinção de uma memória é inviável ou indesejado, uma
reconsolidação, através da ressignificação e utilização de terapias de exposição
(Beck, 1991; Knapp and Caminha, 2003) pode ser a opção mais viável para lidar
com memórias aversivas.
Para uma terapia comportamental mais eficaz o tratamento
psicofarmacológico associado deve ser adequado ao seu propósito. Normalmente
os efeitos diretos da ação do fármaco são a parte mais conhecida; a farmacologia
e farmacocinética das drogas não necessariamente explicam os efeitos num
organismo. Para a investigação dos efeitos no organismo é necessário avaliar
aspectos específicos, relacionados com a psicopatologia.
125
Essa investigação deve englobar os aspectos a serem tratados e a
população onde esse fármaco será administrado. Mulheres são duas vezes mais
afetadas por depressão e transtornos de ansiedade que homens (APA, 2013;
Monleón et al., 2002; Lebrón-Milad et al., 2013). Os fármacos mais receitados para
esses tratamentos são os antidepressivos (Marks et al., 1998; Brunello et al.,
2001; Nestler et al., 2002; Dulawa et al, 2004; Nandam et al., 2007; Dunlop e
Davis, 2008; Lebrón-Milad et al., 2013). Um dos sintomas recorrentes está
relacionado a alterações na memória (Nestler et al., 2002). Apesar disso,
mulheres ainda recebem prescrições de fármacos para melhora de sintomas que
elas possuem, mas que não foram investigados em fêmeas, então não se tem
certeza de atingir o objetivo proposto.
Ainda assim, a fluoxetina é um dos antidepressivos de primeira linha para
o tratamento de depressão e transtornos de ansiedade (Haber et al., 2013).
Apesar disso, são poucos os estudos investigando os efeitos desse fármaco em
aspectos de memória, um dos sintomas mais recorrentes da depressão e que tem
o potencial de retroalimentar o processo depressivo, em mulheres ou fêmeas
(Melo et al., 2012). E são ainda mais escassos os que fazem essa investigação
utilizando-se de uma investigação dos efeitos nas fases do ciclo (Lebrón-Milad et
al., 2013).
Nossos resultados indicam para uma grande importância com relação à
separação das fases do ciclo hormonal para a avaliação da dose e o esquema de
tratamento combinado com a psicoterapia. Aparentemente, o momento de início
pode agir de forma a não alterar a persistência de uma memória aversiva, mas
piorar os sintomas depressivos, caso do grupo proestro. Ou ainda, pode depender
da dose para melhorar a persistência de uma memória, caso do estro tratado com
fluoxetina 5 mg. Ou ainda, provocar um início de extinção de uma memória através
126
de reexposição ao contexto da memória, como aconteceu com o grupo diestro
tratado com 20 mg.
A fase de aquisição da memória aversiva parece ter uma grande influência
para a alteração posterior dessa memória. Já a consolidação das memórias
parece ser menos afetada pelo efeito do tratamento. E a evocação passa,
novamente, a ser afetada pelo tratamento. De forma geral, nossos resultados
apontam para a necessidade de investigações dos efeitos dos tratamentos com
fluoxetina nas etapas da memória e nas fases do ciclo hormonal, pois todas essas
variáveis parecem influenciar nos efeitos do fármaco.
Por fim, deve-se destacar que encontramos um aumento dos
comportamentos tipo-ansioso e tipo-depressivo em animais tratados agudamente
com fluoxetina, os quais variaram também de acordo com a fase do ciclo estral.
Somados aos resultados encontrados para a memória, aponta-se para a
possibilidade de importantes efeitos colaterais cognitivos e emocionais que
possam surgir agudamente, independente do efeito benéfico do tratamento
prolongado com este antidepressivo, os quais podem variar com o sexo e a fase
do ciclo hormonal.
127
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Anexos
145
, 04 de abril de 2016 CEUA N 9309030216
IImo(a). Sr(a). Pesquisador(a): Regina Helena Da Silva
Depto/Disc: Farmacologia Regina Helena Da Silva (orientador) Título do projeto: "INFLUÊNCIA DO SEXO E DO CICLO HORMONAL NOS EFEITOS DA FLUOXETINA NA
MEMÓRIA E ANSIEDADE EM RATOS". 2ª Via da carta de aprovação, com atualização de número de
animais emitida em 04 de abril de 2016. Parecer Consubstanciado da Comissão de Ética no Uso de Animais UNIFESP/HSP (2ª via)
Os antidepressivos possuem um padrão distinto de efeitos sobre a ansiedade, a memória e os sintomas
depressivos. Enquanto os principais sintomas depressivos só vão minimizar após algumas semanas de
tratamento, os efeitos na ansiedade e na memória podem aparecer agudamente. Alguns estudos mostram
que os efeitos da fluoxetina, principal antidepressivo utilizado na clínica, podem estar envolvidos com a ação
de hormônios sexuais femininos. Estudos com animais de laboratório fêmeas que pudesse esclarecer essa
questão são escassos, e o presente estudo verificará os efeitos da fluoxetina em fêmeas separadas pela fase
do seu ciclo estral, investigando aspectos comportamentais (memória e ansiedade), neuronais e hormonais
desses efeitos.
ANIMAIS - Serão utilizados: - 40 Ratos heterogênicos Wistar, Machos, Peso: 250g, idade: 3 meses - 240 Ratos heterogênicos Wistar, Fêmeas, Peso: 200, idade: 3 meses Proced ência: CEDEME Manutenção: Laboratório de Experimentação Animal Leal Prado VIG ÊNCIA DO ESTUDO: Início previsto para: 03/2016 com término
previsto para: 02/2017 A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, na reunião
de 07/03/2016, ANALISOU e APROVOU todos os procedimentos apresentados neste protocolo. 1. Comunicar toda e qualquer alteração do protocolo. 2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do
protocolo. 3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para possível auditoria dos órgãos competentes. 4. Relatórios parciais de andamento deverão ser enviados
anualmente à CEUA até a conclusão do protocolo.
Rua Botucatu, 572, 1º andar conjunto 14 CEP 04023-061 São Paulo - tel: 55 (11) 5571-1062 / fax: 55 (11) 5539-7162 : e-mail:[email protected] CEUA Nº
9309030216
146
PROTOCOLO N.º 017/2013
Professor/Pesquisador: REGINA HELENA DA SILVA
Natal (RN), 20 de agosto de 2013.
Prezado Professor/Pesquisador,
Vimos, através deste documento, informar que o projeto “INFLUÊNCIA DO
GÊNERO E DO CICLO HORMONAL NOS EFEITOS DA FLUOXETINA NA MEMÓRIA E
ANSIEDADE EM RATOS”, protocolo n° 017/2013, após análise das adequações, foi
considerado APROVADO por esta Comissão.
Informamos ainda que, segundo o Cap. 2, Art. 13 do Regimento, é função do
professor/pesquisador responsável pelo projeto a elaboração de relatório(s) de
acompanhamento que deverá(ão) ser entregue(s) dentro do(s) prazo(s) estabelecido(s)
abaixo:
- Relatório Final: JUNHO 2016 (30 dias após a conclusão do projeto).
Agradecemos a sua atenção e nos colocamos a disposição para eventuais
esclarecimentos.
Cordialmente,
UFRN – Campus Universitário – Centro de Biociências
Av. Salgado Filho, S/N – CEP: 59072-970 – Natal/RN e-mail: [email protected]
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS - - CEUA
John Fontenele Araujo Coordenador da CEUA