r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715

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OCIEDADE BRASILEIRA DEORTOPEDIA E TRAUMATOLOGIA

www.rbo.org .br

rtigo original

nfluência da terapia celular mononuclearobre a degeneracão discal em coelhos�

odrigo Caldonazzo Fávaro, André de Oliveira Arruda, Luiz Roberto Gomes Vialle Emiliano Neves Vialle ∗

ontifícia Universidade Católica do Paraná, Hospital Universitário Cajuru, Servico de Ortopedia e Traumatologia, Curitiba, PR, Brasil

nformações sobre o artigo

istórico do artigo:

ecebido em 9 de fevereiro de 2016

ceito em 18 de março de 2016

n-line em 22 de junho de 2016

alavras-chave:

olágeno

isco intervertebral

erapia celular

istologia

oelho

r e s u m o

Objetivo: Avaliar a influência da injecão de células-tronco mononucleares autólogas sobre

as alteracões histológicas do colágeno no ânulo fibroso do disco intervertebral após lesão

experimental.

Métodos: Foram submetidos 32 coelhos New Zealand a puncão do discos intervertebrais lom-

bares seguida de injecão intradiscal de células mononucleares provenientes da crista ilíaca

versus injecão de solucão salina nos seguintes períodos tempo: dois meses após a lesão

(CT2M e SS2M), duas semanas (CT2S e SS2S), imediatamente após a lesão (CTCP e SSCP) e

sem induzir a degeneracão (CTSP e SSSP). Após dois meses da terapia celular, os animais

foram submetidos a eutanásia e as alteracões do colágeno nos discos intervertebrais foram

avaliadas histologicamente.

Resultados: Houve diferenca estatisticamente significativa na CEAF entre os grupos CT2S e

SS2S (p = 0,018). Essa diferenca decorreu de um aumento do colágeno do tipo I no grupo SS2S

(56,7%) comparado com o CT2S (13,28%).

Conclusão: O tratamento com células mononucleares precursoras mesenquimais é capaz de

reduzir as alteracões na distribuicão do colágeno do tipo I e III no AF de discos degenerados

de coelhos até duas semanas após a inducão da degeneracão.

© 2016 Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. Publicado por Elsevier Editora

Ltda. Este e um artigo Open Access sob uma licenca CC BY-NC-ND (http://

creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Influence of mononuclear cell therapy on disc degeneration in rabbits

a b s t r a c t

eywords:

ollagen

ntervertebral disc

Objective: The objective of this research was to evaluate the influence of autologous mono-

nuclear stem cells injections on histological changes of collagen in the fibrous annulus of

the intervertebral disc after experimental injury.

� Trabalho desenvolvido na Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Hospital Universitário Cajuru, Servico de Ortopedia e Trauma-ologia, Curitiba, PR, Brasil.∗ Autor para correspondência.

E-mail: evialle@hotmail.com (E.N. Vialle).ttp://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2016.03.007102-3616/© 2016 Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Este e um artigo Open Accessob uma licenca CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

708 r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715

Cell and tissue-based therapy

Histology

Rabbit

Methods: 32 New Zealand rabbits were submitted to intervertebral disc puncture, followed

by intradiscal injection of mononuclear cells from the iliac crest versus saline injection in

the following time periods: two months after the injury (SC2M and SS2M), two weeks (SC2W

and SS2W) immediately after injury (SCCP and SSCP), and without inducing degeneration

(SCSP and SSSP). Two months after cell therapy, the animals were euthanized and collagen

changes in the intervertebral discs were histologically evaluated.

Results: There were significant differences in ELAF between SS2W and SS2S groups

(p = 0.018). This difference was due to an increase in type I collagen in SS2W group (56.7%)

compared to SC2S (13.28%).

Conclusion: Treatment with mononuclear mesenchymal stem cells reduced changes in the

type I and III collagen distribution in rabbits AF degenerated discs up to two weeks after the

induction of degeneration.

© 2016 Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. Published by Elsevier Editora

Ltda. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://

mentais foram puncionados com agulha 40X12 mm (18 G 1 ½),em uma profundidade de 5 mm, que permaneceu no interiordo DIV por 5 segundos (fig. 2).

Figura 1 – Preparo cirúrgico.

Introducão

A degeneracão discal faz parte do processo de envelheci-mento e compreende a perda das características estruturais,biológicas e bioquímicas do disco intervertebral (DIV).1

Caracteriza-se pela apresentacão de células disfuncionais eum decréscimo dos seus componentes intracelulares, levaà perda gradual de fluido intradiscal.2 Isso acarreta umadesidratacão discal que inclui uma cascata de fatores quepodem levar a sintomas e limitacão funcional. O principalsintoma da degeneracão discal é a dor lombar.3

A etiologia da degeneracão discal é multifatorial e tantofatores ambientais quanto constitucionais exercem papéiscom variáveis graus de importância.4 Esforco físico, má pos-tura, obesidade, ocupacão, cigarro, álcool e diabetes estãoenvolvidos na etiologia da degeneracão discal sintomática(DDS).5

A dor lombar é a segunda causa de consulta médica nosEstados Unidos. Em todo o mundo, cerca de 60 a 80% daspessoas terão dor lombar durante a vida. Segundo dados ame-ricanos, 20 bilhões de dólares ao ano são gastos em custosdiretos para tratamento da dor lombar crônica; somados àsdespesas indiretas, esse valor ultrapassa os 100 bilhões dedólares.6,7

A fim de amenizar esse quadro alarmante, diversasestratégias terapêuticas têm sido tentadas, incluindo desdemodalidades não invasivas – como medicacão antinflamatóriae fisioterapia – até procedimentos cirúrgicos, como artrodese,terapia intradiscal eletrotérmica e substituicão total do disco.Entretanto, os meios terapêuticos atuais direcionam-se ao tra-tamento dos sintomas, e não à interrupcão e/ou recuperacãodo processo degenerativo.8 Como opcões de aplicacão denovas tecnologias, diversos modelos biológicos de tratamentotêm sido propostos. Por meio do uso de elementos celulares,propõe-se a atuacão direta na modulacão do processo dege-nerativo, por meio da introducão de células potencialmentecapazes de reconstruir o tecido lesado.9

A partir de um modelo animal previamente estudado e vali-dado nessa instituicão de ensino,10 o objetivo desta pesquisa é

avaliar a influência da injecão de células mononucleares autó-logas sobre as alteracões histológicas do colágeno no ânulofibroso (AF) do disco intervertebral após lesão experimental.

creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Material e métodos

Os experimentos deste estudo foram feitos de acordo comas normas e os princípios éticos do Colégio Brasileiro deExperimentacão Animal (Cobea). Os métodos foram baseadosem estudos prévios feitos nessa instituicão10–12 e nos traba-lhos de Lipson e Muir,13 Masuda et al.14 e Rousseau et al.15

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso deAnimais da Pontifícia Universidade Católica do Paraná sob on◦ 377 e foi executado de acordo com as normas da Declaracãode Helsinque da Associacão Médica Mundial.

Foram usados coelhos (Oryctolagus cuniculus), machos,brancos, da raca New Zealand, entre 2,5 a 3 kg, com cerca deoito meses de vida.

Após o procedimento anestésico padrão (10-12) os coelhosforam posicionados em decúbito lateral direito e submetidosa uma lombotomia com exposicão da coluna lombar por viaretroperitoneal (fig. 1), expôs-se a superfície anterior de 5 DIVslombares consecutivos (L2-L3 a L6-L7). Os três discos experi-

Os coelhos anestesiados eram posicionados em decúbitolateral direito e abordados em acesso posterolateralretroperitoneal.

r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715 709

Tabela 1 – Distribuicão dos coelhos nos grupos injetados com células-tronco

Células-tronco

Grupo CT2M CT2S CTCP CTSP

Coelhos(n = 14)

4 3 4 3

Discos intervencão(n = 37)

12 9 7 9

Discos controle(n = 60)

16 14 16 14

CT2M, injecão de CT após 2 meses da puncão; CT2S, injecão de CT após

puncão; CTSP, injecão de CT sem puncão.

Figura 2 – Preparo da agulha para executar a puncão.Delimitamos os 5 mm finais de uma de 40 x 12 mm(18 G1 ½) a partir de seu bisel e a dobramos no formato de Sc

(dd

daslostc

gg

o

-

-

-

cd

om o intuito de padronizar a profundidade das puncões.

O processo de isolamento e obtencão das células troncoCT) mononucleares foi feito por meio da puncão-aspiracãoa medula óssea da crista ilíaca e faz parte do protocolo jáesenvolvido e consolidado nessa instituicão de ensino.16

Após coleta e isolamento das células, elas foram intro-uzidas no DIV do animal com a mesma técnica cirúrgicanteriormente descrita. O material foi colocado no limiteuperior do DIV previamente perfurado, com, no entanto, agu-ha de menor calibre 13X4,5 (26 G ½). Foram feitos exatamentes mesmos procedimentos nos animais que receberam apenasolucão salina (SS) isotônica, injetou-se a quantidade idên-ica ao do volume celular, obedeceu-se às mesmas condicõesitadas.

Foram usados 32 animais divididos em oito grupos: quatrorupos experimentais que receberam células-tronco e quatrorupos controle que receberam solucão salina.

Os grupos foram divididos de acordo com o período em quecorreu a injecão de CT:

CT2M (quatro animais): transplante de células-troncomononucleares autólogas após dois meses da cirurgia deinducão de degeneracão discal;

CT2S (quatro animais): transplante de células-tronco mono-nucleares autólogas após duas semanas da cirurgia deinducão de degeneracão discal;

CTCP (quatro animais): transplante de células-tronco mono-nucleares autólogas imediatamente após a cirurgia deinducão de degeneracão discal.

Essa diferenciacão periódica permitirá a análise críticaomparativa quanto ao período mais indicado da implantacãoa terapia celular frente ao processo degenerativo.

2 semanas da puncão; CTCP, injecão de CT no mesmo momento da

- CTSP (quatro animais), grupo que recebeu as células-troncomononucleares, mas não passou pelo procedimento cirúr-gico de inducão de degeneracão discal.

Da mesma forma, os animais que fizeram parte do grupocontrole foram subdivididos de acordo com o pareamento emrelacão ao grupo experimental e receberam injecão de solucãosalina isotônica, da seguinte forma: SS2M (quatro animais),correspondente ao CT2M; SS2S (quatro animais), correspon-dente à CT2S; SSCP (quatro animais), correspondente a CTCPe SSSP (quatro animais), correspondente a CTSP.

Dos 32 coelhos, seis morreram durante o procedimentocirúrgico ou no pós-operatório. Assim, 26 coelhos foram ana-lisados histologicamente, divididos conforme a tabelas 1 e 2.

Após oito semanas da injecão de material (CTs/solucãosalina isotônica) no DIV, os coelhos foram sacrificados cominjecão em dose excessiva de pentobarbital (90 mg/kg) e acoluna vertebral foi coletada para análise histológica.

Após o processamento das amostras obtidas, desidratadase encaixadas em blocos de parafina, seccões de seis micra deespessura foram feitas. As seccões foram coradas com siriusred para a análise do colágeno. Através do microscópio comluz polarizada, foram observados os aspectos referentes àdisposicão de colágeno nos DIVs com o aumento de 20 vezes.

De cada lâmina preparada com um DIV, foram fotogra-fados seis campos de visão pelo software DinoCapture® 2.0V1.2.7(AnMo Electronics Corporation). Os seis campos forampré-definidos para todos os discos e iniciam na camada maisperiférica das lamelas do AF (fig. 3). Essa convencão permiteuma amostra panorâmica e abrangente da estrutura do AF.

As imagens foram processadas pelo software Image ProPlus®V.4.50 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD), quepermite quantificar os pontos verdes (colágeno tipo III) e ver-melhos da lamina (colágeno do tipo I) e estratificá-los comsuas respectivas percentagens (fig. 4).

Resultados

No intuito de comparar os grupos e descobrir possíveisdiferencas estatisticamente significantes entre eles, avalia-mos individualmente cada variável: camada interna do ânulo

fibroso (CIAF); camada interna do ânulo fibroso (CEAF) e ânulofibroso (AF) como um todo.

Para cada variável e cada tipo de colágeno, em cada umdos momentos de aplicacão, testou-se a hipótese nula de

710 r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715

Tabela 2 – Distribuicão dos coelhos nos grupos injetados com solucão salina

Solucão salina

Grupo SS2M SS2S SSCP SSSP

Coelhos(n = 12)

3 2 4 3

Discos intervencão(n = 35)

9 6 12 8

Discos controle(n = 55)

15 10 17 13

ão dea sem

SS2M, injecão de solucão salina após 2 meses da puncão; SS2S, injecsalina no mesmo momento da puncão; SSSP, injecão de solucão salin

resultados de colágeno no grupo com aplicacão de célula--tronco iguais aos resultados de colágeno no grupo comaplicacão de solucão salina. Nas tabelas 3-5 são apresentadasas estatísticas descritivas e os valores de p dos testes estatís-ticos.

Quando comparamos a CIAF dos grupos injetados com CTcom o dos injetados com SS notamos que não houve diferencaestatisticamente significante entre os grupos (tabela 3).

Quando comparamos a CEAF dos grupos injetados com CTcom o dos injetados com SS notamos que houve diferencaestatisticamente significante entre os grupos CT2S e SS2S(p = 0,018). Essa diferenca decorreu de um aumento do colá-

geno do tipo I no grupo SS2S (56,7%) comparado com oCT2S (13,28%). Os valores de colágeno do tipo I e III e ascomparacões dos grupos são demonstrados na tabela 4 efigura 5.

Controle

Figura 3 – Ferramenta DinoCapture.Ilustracão esquemática dos seis campos fotografados em um disum da porcão externa e um da porcão interna do ânulo; dois camexterna e um da porcão interna do ânulo; dois campos centro daum da porcão interna do ânulo. Nota-se a preponderância do vero colágeno do tipo III e do vermelho na camada interna do ânulo

solucão salina após 2 semanas da puncão; SSCP, injecão de solucão puncão.

Quando comparamos o AF dos grupos injetados comCT com o dos injetados com SS notamos que houvediferenca estatisticamente significante entre os grupos CT2Se SS2S (p = 0,025). Novamente essa diferenca decorreu de umaumento do colágeno do tipo I no grupo SS2S (76,1%) compa-rado com o CT2S (53,32%). Os valores de colágeno do tipo Ie III e as comparacões dos grupos são demonstrados natabela 5.

Discussão

A inducão da degeneracão discal foi estudada a fundo emoutro braco desta linha de pesquisa por meio de lâminascoradas em hematoxicilina-eosina, fast-green e sirius red.10

No estudo em questão foram usadas lâminas obtidas da

co controle. Dois campos ângulo lateral direito do disco,pos ângulo lateral esquerdo do disco, um da porcão

porcão convexa do disco do disco, um da porcão externa ede na camada externa do ânulo fibroso (CEAF) que denota

fibroso (CIAF) que indica o colágeno do tipo 1.

r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715 711

CIAF CEAF

Figura 4 – Ferramenta Image Pro Plus.Exemplo do software a fazer a contagem de pixels em uma fotografia da camada interna do ânulo fibroso (CIAF) e da camadaexterna do ânulo fibroso (CEAF). São três informacões para cada imagem: 1 – O número de objetos; 2 – A porcentagem deo tal da

mdecc

bjetos ocupada na imagem e 3 – A porcentagem da área to

esma espécie e populacão de coelhos e a inducão daegeneracão discal foi conduzida igualmente ao presente

studo. A padronizacão da inducão da degeneracão discal nosoelhos deste experimento por meio do método de puncãoom agulha foi eficaz e reproduziu de maneira semelhante

Tabela 3 – Comparacão entre os grupos definidos pelo uso das

salina na CIAF

Variável Col Grupo n Média Mín

CIAF I CT2M 12 73,37 2,SS2M 9 85,5 42,

III CT2M 12 26,63 1,SS2M 9 14,5 2,

I CT2S 9 93,36 88,SS2S 6 95,6 87,

III CT2S 9 6,64 1,SS2S 6 4,4 0,

I CTCP 7 96,61 92,SSCP 12 96,9 90,

III CTCP 7 3,39 0,SSCP 12 3,1 0,

I CTSP 9 91,16 78,SSSP 8 94,8 85,

III CTSP 9 8,84 1,SSSP 8 5,2 1,

Nota-se que não houve diferenca estatisticamente significante entre os grCol, colágeno; CT2M, injecão de CT após 2 meses da puncão; CT2S, injecãmomento da puncão; CTSP, injecão de CT sem puncão; SS2M, injecão de

puncão; SSCP, injecão de SS no mesmo momento da puncão; SSSP, injecãoa Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis; p < 0,05.

imagem.

aos resultados de outros estudos que usaram a mesmatécnica.10,17–20

Grande parte dos estudos contemporâneos usa aimuno-histoquímica para avaliar os diferentes tipos decolágeno.1,21–23 Como podemos notar, os precursores nessa

células-tronco e os grupos definidos pelo uso da solucão

imo Máximo Desvio Padrão Valor de pa

39 98,65 29,18 0,286

5 97,5 18,235 97,61 29,18 0,286

5 57,5 18,293 98,33 3,28 0,157

7 99,6 4,267 11,07 3,28 0,157

4 12,3 4,256 99,56 2,40 0,800

4 99,4 2,844 7,44 2,40 0,800

6 9,6 2,809 98,52 6,07 0,149

9 98,7 4,448 21,91 6,07 0,149

3 14,1 4,4

upos.o de CT após 2 semanas da puncão; CTCP, injecão de CT no mesmoSS após 2 meses da puncão; SS2S, injecão de SS após 2 semanas da

de SS sem puncão.

712 r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715

Tabela 4 – Comparacão entre os grupos definidos pelo uso das células-tronco e os grupos definidos pelo uso da solucãosalina na CEAF

Variável Col Grupo N Média Mínimo Máximo Desvio Padrão Valor de pa

CEAF I CT2M 12 25,85 1,24 68,87 19,58 0,201

SS2M 9 39,2 13,1 82,8 21,0III CT2M 12 74,15 31,13 98,76 19,58 0,201

SS2M 9 60,8 17,2 86,9 21,0I CT2S 9 13,28 2,72 20,99 6,55 0,018

SS2S 6 56,7 8,7 98,7 32,8III CT2S 9 86,72 79,01 97,28 6,55 0,018

SS2S 6 43,3 1,3 91,3 32,8I CTCP 7 14,91 6,38 29,11 8,16 0,063

SSCP 12 9,1 1,6 21,9 6,9III CTCP 7 85,09 70,89 93,62 8,16 0,063

SSCP 12 90,9 78,1 98,5 6,9I CTSP 9 12,05 2,29 36,52 10,54 0,773

SSSP 8 15,0 3,1 60,6 19,7III CTSP 9 87,95 63,48 97,71 10,54 0,773

SSSP 8 85,0 39,4 96,9 19,7

Nota-se que houve diferenca estatisticamente significante entre os grupos CT2S e SS2S (p = 0,018).Col, colágeno; CT2M, injecão de CT após 2 meses da puncão; CT2S, injecão de CT após 2 semanas da puncão; CTCP, injecão de CT no mesmomomento da puncão; CTSP, injecão de CT sem puncão; SS2M, injecão de SS após 2 meses da puncão; SS2S, injecão de SS após 2 semanas dapuncão; SSCP, injecão de SS no mesmo momento da puncão; SSSP, injecão de SS sem puncão.a Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis; p < 0,05.

Tabela 5 – Comparacão entre os grupos definidos pelo uso das células-tronco e os grupos definidos pelo uso da solucãosalina no AF

Variável Col Grupo n Média Mínimo Máximo Desvio padrão Valor de pa

Ânulo fibrosocomo um todo

I CT2M 12 49,61 2,16 78,59 22,21 0,155

SS2M 9 62,3 27,8 88,9 16,1III CT2M 12 50,39 21,41 97,84 22,21 0,155

SS2M 9 37,7 11,1 72,2 16,1I CT2S 9 53,32 47,90 59,15 3,62 0,025

SS2S 6 76,1 48,2 97,4 17,5III CT2S 9 46,68 40,85 52,10 3,62 0,025

SS2S 6 23,9 2,6 51,8 17,5I CTCP 7 55,76 51,10 64,33 4,57 0,151

SSCP 12 53,0 48,6 60,7 3,5III CTCP 7 44,24 35,67 48,90 4,57 0,151

SSCP 12 47,0 39,3 51,4 3,5I CTSP 9 51,61 43,83 64,43 6,59 0,534

SSSP 8 54,9 45,5 79,5 11,1III CTSP 9 48,39 35,57 56,17 6,59 0,564

SSSP 8 45,1 20,5 54,5 11,1

Nota-se que houve diferenca estatisticamente significante entre os grupos CT2S e SS2S (p = 0,025).Col, colágeno; CT2M, injecão de CT após 2 meses da puncão; CT2S, injecão de CT após 2 semanas da puncão; CTCP, injecão de CT no mesmomomento da puncão; CTSP, injecão de CT sem puncão; SS2M, injecão de SS após 2 meses da puncão; SS2S, injecão de SS após 2 semanas da

jecão

puncão; SSCP, injecão de SS no mesmo momento da puncão; SSSP, ina Teste não paramétrico de Kruskal-Wallis; p < 0,05.

área datam do fim dos anos 1990.1,21 Essa avaliacão temcomo principal vantagem a sua especificidade, no entanto,em nosso meio, ainda é um método caro. Em nosso estudo, osirius red mostrou-se um método simples e barato para avaliaro colágeno do tipo I e III.

Quanto ao número de células injetados no tratamento, osestudos atuais não apresentam um padrão definido. Alguns

sugerem que o cultivo celular é essencial para o sucesso dotratamento, no entanto a maioria dos estudos não discuteconsideracões sobre o número celular ideal. Serigano et al.22

indicaram que a dose ótima de células-tronco mesenquimais

de SS sem puncão.

(CTM) autólogas em cachorros é de 1 × 106 células. No entanto,Ghosh et al.23 sugerem que uma dose menor de 0,1 × 106 podeser mais eficaz. Segundo os autores, um número exacerbadode células nesse ambiente com baixa oferta nutricional podelevar as células a competir pelo suplemento, o que pode serdestrutivo para o NP devido ao acúmulo de células mortas eprodutos de degradacão celular.23

Ainda no cultivo celular, a estimulacão da diferenciacãodiscogênica das CTMs também pode ser conseguida porcocultura. As CTMs podem ser cultivas diretamente com ocontato com células do DIV. Durante a cocultura de CTM

r e v b r a s o r t o p . 2 0 1 6;5 1(6):707–715 713

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

Dis

trib

uiçã

o do

col

ágen

o em

(%

)

10%

0%

CT2M

p = 0,201 p = 0,018 p = 0,063

Grupos

p = 0,773

CT2S CTCP CTSPSS2M SS2S SSCP SSSP

Col 3

Col 1

Figura 5 – Comparacão percentual da distribuicão do colágeno na camada externa do ânulo fibroso (CEAF)entre os diferentes grupos injetados com células-tronco e com solucão salina.Nota-se que houve diferenca estatisticamente significante entre os grupos CT2S e SS2S (p = 0,018). Col 1, colágeno do tipo 1;Col 3, colágeno do tipo 3; CT2M, injecão de CT após 2 meses da puncão; CT2S, injecão de CT após 2 semanas da puncão;CTCP, injecão de CT no mesmo momento da puncão; CTSP, injecão de CT sem puncão. SS2M, injecão de solucão salina após2 meses da puncão; SS2S, injecão de solucão salina após 2 semanas da puncão; SSCP, injecão de solucão salina no mesmom ncã

dqrbicar

runeCa1r

mpaidpdrhddOntt

omento da puncão; SSSP, injecão de solucão salina sem pu

erivadas de medula óssea e células do NP, foi visualizadoue elas se comunicam de uma maneira bidirecional queesulta em uma melhoria no fenótipo das células do NP e tam-ém na diferenciacão das células CTM.24 Isso sugere que a

mplantacão das CTMs pode exercer efeitos parácrinos nasélulas do NP degeneradas que residem no disco e ajudar

restaurar a funcão celular discal normal e o processo deeparo.

Em nosso trabalho usamos as células tronco mononuclea-es. Levamos em consideracão o fato de serem obtidas apósm processo mais simples do que as mesenquimais, poisecessitam apenas passar por dois processos de centrifugacão

pelo gradiente de densidade Ficoll-Hypaque, ao passo que asTM necessitam passar por esses mesmos processos e após,inda, pela cultura e expansão celular por aproximadamente4 a 16 dias, apresentam assim custos mais elevados e comiscos maiores de contaminacão.16

A injecão de CTM e células mononucleares precursorasesenquimais tipicamente é segura, ainda que tenha um

otencial para formacão de osteófitos periféricos, o que sugere importância de um carreador adequado e seguro quandonjetamos células nessa região.25 Nesse sentido, o carrea-or pode permitir a célula receber cargas axiais, importanteara estimular a síntese de matriz extracelular e induzir aiferenciacão das CTM sem outro estímulo exógeno.26 Dife-entes carreadores têm sido usados na literatura como algunsidrogéis26,27 e a cola de fibrina.28 Apesar de esses estu-os defenderem o uso de um carreador celular na aplicacãoas células tronco, a literatura é controversa nesse quesito.utros estudos usam apenas soro fisiológico29 ou, até mesmo,

enhum carreador.22 Em nosso estudo usamos o meio de cul-ura MEMD com 20% de soro bovino fetal, método que tambémêm sido usado com sucesso na literatura.30

o.

Na análise de nossos resultados, ao examinar o AF comoum todo, podemos notar uma diferenca entre os gruposque foram injetados dois meses após a puncão. O CT2Mdemonstrou um discreto aumento no colágeno do tipo III efoi dividido em 49,61% do tipo I e 50,39% do tipo III. O SS2Mdemonstrou 62,35% do tipo I e 37,65% do tipo III. Podemosobservar que o grupo que recebeu as CT apresentou umadivisão mais próxima dos grupos que não foram induzidos adegeneracão discal, enquanto o grupo de solucão salina teveum aumento expressivo na proporcão do colágeno do tipo I.Essa desproporcão deu-se na CEAF e indicou um desarranjona estrutura do AF. No entanto, essa diferenca não foi estatis-ticamente significante.

O mesmo aumento do colágeno do tipo I na CEAF e no AFcomo um todo pode ser observado também na comparacãodos grupos injetados duas semanas após a puncão. O CT2Sdemonstrou 53,32% do tipo I e 46,68% do tipo III. O SS2Sdemonstrou 76,15% do tipo I e 23,85% do tipo III. Mais uma vezpodemos observar que o grupo que recebeu as CT apresentouuma divisão mais próxima dos grupos que não foram induzi-dos à degeneracão discal, enquanto o grupo de solucão salinateve um aumento expressivo na proporcão do colágeno do tipo1, novamente à custa da CEAF. Na análise estatística nota-mos que houve diferenca estatisticamente significante tantona CEAF (p = 0,018) como no AF (p = 0,025).

Nossos dados sugerem que a terapia com CT mononucle-ares foi capaz de remodelar as alteracões causadas pela lesãocausada pela puncão por agulha quando as CT são injetadasapós duas semanas, mas não obteve o mesmo êxito quandoinjetadas após dois meses. Mesmo que os dados do CT2M

tenham sido mais próximos dos grupos que não foram indu-zidos à degeneracão discal do que os dados do CT2S, essadiferenca não teve significância estatística.

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No entanto, quando comparamos os grupos que foram inje-tados simultaneamente com a puncão, o CTCP demonstrou55,76% do tipo I e 44,24% do tipo III. Já o SSCP demonstrou 53%do tipo I e 47% do tipo III. Aqui encontra-se a maior incompa-tibilidade de resultados, uma vez que era esperado que o SSCPdemonstrasse degeneracão com uma mudanca na proporcãoentre o colágeno no tipo I e o do tipo III após a puncão. Issosugere que a lesão causada nos discos do SSCP cicatrizou.

Ao comparar os grupos injetados sem a puncão, o CTSPdemonstrou 51,61 do tipo I e 48,39% do tipo III. Enquantoo SSSP demonstrou 54,9% do tipo I e 45,10% do tipo III.Entre esses grupos notamos que não houve grande diferenca,como era esperado, uma vez que eles não foram induzidosà degeneracão pela puncão. Na análise estatística não houvediferenca estatisticamente significante entre os grupos. Essesdados indicam que as CTM não alteram a estrutura do colá-geno em discos injetados sem degeneracão discal.

Conclusão

O tratamento com células mononucleares precursoras mesen-quimais é capaz de reduzir as alteracões na distribuicão docolágeno do tipo I e III no AF de discos degenerados de coelhosaté duas semanas após a inducão da degeneracão.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

e f e r ê n c i a s

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