emprego de terapia celular em modelo experimental de doença
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MÔNICA YONASHIRO MARCELINO
EMPREGO DE TERAPIA CELULAR EM MODELO EXPERIMENTAL DE
DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia.
São Paulo
2012
MÔNICA YONASHIRO MARCELINO
Emprego de terapia celular em modelo experimental de doença
inflamatória intestinal
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do
Título de Mestre em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. João Tadeu Ribeiro Paes
Versão original
São Paulo
2012
À meus pais, familiares e amigos pelo apoio e
incentivo constante.
Obrigada!
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Carlos e Luci, pelo apoio, amizade e paciência em todos os momentos da
minha vida, permanecendo ao meu lado nas dificuldades e vitórias.
Aos meus irmãos, Guilherme e Caio, minhas avós, Takeko e Enedina, e todos os meus
familiares pelo companheirismo e incentivo.
Ao Prof. Dr. João Tadeu Ribeiro Paes, meu orientador, por abrir as portas do seu laboratório,
mesmo sem me conhecer, pelos ensinamentos oferecidos e por toda a atenção dispensada.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Luiz Claudio Di Stasi, do Laboratório de Fitomedicamentos
da Unesp – Botucatu, e a equipe do seu laboratório, particularmente, a Ana Quaglio, pelas
sugestões, ensinamentos e colaboração desde o início da realização deste trabalho.
A Profa. Dra. Elenice Deffune, do Laboratório de Engenharia Celular da Unesp – Botucatu,
pelo auxílio prestado durante o desenvolvimento deste estudo.
Ao Prof. Dr. André Dorini por acreditar no meu potencial e me ajudar ingressar na vida
acadêmica.
A Profa. Dra. Renata Bittencourt pelos conhecimentos transmitidos, disposição, paciência e
boa vontade.
Aos companheiros do Laboratório de Genética e Terapia Celular – GenTe Cel, da Unesp –
Campus de Assis, em especial, Natália Fuoco e Thaís, pela amizade, companheirismo,
parcerias científicas e festivas, e por terem proporcionados momentos tão bons e agradáveis
durante o decorrer do meu mestrado.
Ao José Gilberto Milani (Giba) e ao Allan Chiea de Souza pelo apoio técnico e ajuda
incondicional nos momentos de dificuldades.
A Eliana, Fábia e Marcos, da Secretária de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia,
pela atenção e por sempre estarem dispostos a colaborar.
A todos que direta ou indiretamente me auxiliaram na realização deste trabalho.
“É necessário abrir os olhos e perceber que as coisas boas estão
dentro de nós, onde os sentimentos não precisam de motivos nem
os desejos de razão. O importante é aproveitar o momento e
aprender sua duração, pois a vida está nos olhos de quem saber
ver.”
(Gabriel García Marques)
RESUMO
Marcelino MY. Emprego de terapia celular em modelo experimental de doença inflamatória
intestinal. [dissertação (Mestrado em Biotecnologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2012.
A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é um estado patológico crônico, recidivante, que
acomete o trato gastrointestinal. Incluem-se no espectro da DII duas entidades nosológicas: a
Colite Ulcerativa e a Doença de Crohn. A colite é uma doença caracterizada pela inflamação
difusa da mucosa do cólon. Afeta o reto (95% dos casos) e as porções proximais do cólon, de
maneira simétrica e contínua, ou seja, não há áreas de mucosas normais entre as partes
afetadas. Apesar da existência de terapias para melhora dos sintomas, não há nenhum
tratamento curativo. O tratamento cirúrgico envolve procedimentos complexos associados a
altas taxas de morbimortalidade. Neste contexto, a terapia celular (TC) com células-tronco
(CT) desponta como uma nova opção de tratamento. Pretendeu-se, no presente estudo,
verificar a segurança e a eficácia do transplante de células-tronco derivadas do tecido adiposo
(ASC) em ratos com colite ulcerativa induzida por ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). A
população celular foi isolada do tecido adiposo, da região inguinal de ratos, por dissociação
mecânica e cultivada na presença de Alpha-Mem (Minimum Essential Medium Eagle Alpha
Modification), soro bovino fetal e antibiótico/antimicótico. O comportamento celular foi
verificado por meio da morfologia, proliferação, viabilidade, capacidade de aderência à
superfície plástica e parâmetros de diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica. Os
animais foram avaliados, considerando-se os aspectos clínicos (presença de diarréia, consumo
de alimento e peso corporal), macroscópicos (escore e extensão da lesão, relação
peso/comprimento do cólon, aderência a órgãos adjacentes), microscópicos e bioquímicos
(determinação do conteúdo de glutationa total e da atividade enzimática da mieloperoxidase).
No modelo experimental de colite ulcerativa, a infusão de ASC reduziu significativamente a
presença de aderências entre o cólon e órgãos adjacentes, bem como diminuiu a quantidade de
células inflamatórias na mucosa lesada. Conclui-se que as ASC podem promover e/ou
acelerar o processo de regeneração da mucosa intestinal inflamada e assim, serem empregadas
como uma opção terapêutica com amplo potencial de aplicabilidade no tratamento da DII.
Palavras-chave: Células-tronco derivadas do tecido adiposo. Terapia celular. Doença
inflamatória intestinal. Colite ulcerativa.
ABSTRACT
Marcelino MY. Employment of cell therapy in experimental model of inflammatory bowel
disease. [Masters thesis (Biotechnology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo; 2012.
Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a chronic pathological condition, relapsing, that afflicts
the gastrointestinal tract. Comprise in the spectrum of IBD two nosological entities: ulcerative
colitis and Crohn's disease. Colitis is a disease characterized by the diffuse inflammation of
the colonic mucosa. Afflicts the rectum (95% of cases) and the proximal portions of the colon,
continuously and symmetrically, in other words, there are no areas of normal mucosa between
the afflict parties. Despite the existence of therapies for symptom improvement, there is no
curative treatment. Surgical treatment involves complex procedures associated with high
morbimortality rates. In this context, cell therapy (CT) with stem cell (CT) has emerged as a
new treatment option, with broad potential applicability. It was intended in this study verify
the safety and efficacy of the transplantation of adipose derived stem cells (ASC) in rats with
ulcerative colitis induced by trinitrobenzenosulfonico acid (TNBS). The cell population was
isolated from the adipose tissue, of the inguinal region of the rats by mechanical dissociation
and cultured in the presence of Alpha-MEM (Minimum Essential Medium Eagle Alpha
Modification), fetal bovine serum and antibiotic / antimycotic. The cell behavior was verified
by the morphology, proliferation, viability, ability to adhere to the plastic surface and
parameters of osteogenic differentiation, adipogenic and chondrogenic. The animals were
evaluated, considering the aspects clinical (presence of diarrhea, food consumption and body
weight), macroscopic (score and lesion length, weight / length of the colon, adherence to
adjacent organs), microscopic and biochemical (determination the content of total glutathione
and enzymatic activity of myeloperoxidase,). In experimental ulcerative colitis, infusion of
ASC significantly reduced the presence of adhesions between the colon and adjacent organs
and decreased the amount of inflammatory cells in the injured mucosa. It is concluded that the
ASC can promote and/or accelerate the healing process of the intestinal mucosa inflamed and
thus be employed as a therapeutic option with wide potential application in the treatment of
IBD.
Keywords: Adipose derived stem cell. Cell therapy. Inflammatory bowel disease. Ulcerative
colitis.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Extração de tecido adipose da região inguinal de ratos.........................................33
Figura 2- Isolamento e cultura das células-tronco do tecido adiposo....................................34
Figura 3- Procedimento de indução da colite ulcerativa.......................................................36
Figura 4- Comportamento das células-tronco derivadas do tecido adiposo em diferentes
períodos de cultura....................................................................................................................42
Figura 5- Diferenciação condrogênica das ASC......................................................................43
Figura 6- Diferenciação osteogênica das ASC........................................................................44
Figura 7- Diferenciação adipogênica das ASC ....................................................................45
Figura 8- Média do consumo diário de ração por grupo experimental em modelo de doença
inflamatória intestinal por administração de TNBS/álcool.....................................................46
Figura 9- Avaliação do peso corporal dos animais em modelo experimental de doença
inflamatória intestinal...............................................................................................................47
Figura 10- Avaliação dos níveis de glutationa total na mucosa intestinal de modelo animal de
doença inflamatória intestinal.................................................................................................50
Figura 11- Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO) na mucosa intestinal de doença
inflamatória intestinal.............................................................................................................51
Figura 12- Fotomicrografias da mucosa de cólon de ratos após indução de colite ulcerativa
por meio da administração de solução alcoólica de TNBS....................................................52
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Modelos animais de doença inflamatória intestinal...............................................26
Quadro 2- Aplicações das células-tronco derivadas do tecido adiposo.................................30
Quadro 3- Grupos experimentais.............................................................................................32
Quadro 4- Critério de avaliação da severidade e extensão da lesão colônica..........................37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Efeito do tratamento com células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) na
incidência de diarreia em modelo animal de doença inflamatória intestinal............................47
Tabela 2- Parâmetros macroscópicos do tratamento com ASC em modelo experimental de
doença inflamatória intestinal por administração de TNBS.....................................................49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-ASA- Ácido 5-aminossalicilato
6-MP - 6-mercaptopurina
AINES - Antiinflamatórios não esteroidais
ALPHA-MEM – “Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification”
anti-TNF- α - Bloqueadores do fator de necrose tumoral alfa
ASC – “Adipose-derived stem cell”
ASCA - Anti- Saccharomyces cerevisiae
AZA - Azatioprina
CD - Doença de Crohn
CEUA - Comitê de Ética na Utilização de Animais
CFU-F - Unidades formadoras de colônias fibroblásticas
CO - Contraceptivos orais
CT - Células-tronco
CTA - Células-tronco adultas
CTE - Células-tronco embrionárias
CTH - Células-tronco hematopoéticas
CTM - Células-tronco mesenquimais
DII - Doença Inflamatória Intestinal
DSS - Dextran sulfato de sódio
DTNB - Ácido ditiobisnitrobenzóico
E.P.M – Erro padrão da média
GSH – Glutationa
GSSG – Gluatationa oxidada
HE – Hematoxilina-eosina
HTAB - Brometo de hexadeciltrimetilamônio
HEPES – “N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid”
HLA - Antígeno leucocitário humano
MPO - Mieloperoxidase
MSC – “Multipotent mesenchymal stromal cells”
MTX – Metrotexato
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NIH – “National Institutes of Health”
PBS - “Phosphate Balanced Saline”
PCR - Proteína C Reativa
PVP-I - Polivinilpolirridona-iodo
RPMI – 1640 – “Roswell Park Memorial Institute – 1640”
SBF – Soro bovino fetal
TC – Terapia Celular
TCA – Ácido Tricloroacético
TGI - Trato gastrointestinal
TMO - Transplante de medula óssea
TNBS - Ácido trinitrobenzenosulfônico
TNF-α - Fator de necrose tumoral-α
UC - Colite Ulcerativa
VHS - Velocidade de Hemossedimentação
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................16
1.1 Doença Inflamatória Intestinal........................................................................................16
1.2 Aspectos Epidemiológicos da Doença Inflamatória Intestinal......................................17
1.3 Etiologia.............................................................................................................................18
1.3.1 Fatores Ambientais.........................................................................................................18
1.3.1.1 Status geográfico, social, econômico e educacional....................................................18
1.3.1.2 Dieta..............................................................................................................................18
1.3.1.3 Tabagismo.....................................................................................................................19
1.3.1.4 Fármacos......................................................................................................................19
1.3.1.5 Estresse.........................................................................................................................19
1.3.2 Fatores Genéticos............................................................................................................20
1.3.3 Defeitos Imunoregulatórios e Exposição Microbiana...................................................21
1.3.3.1 Disfunção nas respostas imunológicas do hospedeiro aos componentes normais do
lúmen.........................................................................................................................................21
1.3.3.2 Infecção mediante a presença de um patógeno específico...........................................21
1.3.3.3 Alterações na barreira intestinal..................................................................................21
1.4 Diagnóstico.........................................................................................................................22
1.5 Tratamento........................................................................................................................22
1.5.1 Tratamento Clínico – Farmacológico............................................................................23
1.5.2 Cirúrgico..........................................................................................................................24
1.6 Modelos Experimentais da Doença Inflamatória Intestinal.........................................25
1.7 Células-tronco....................................................................................................................27
1.7.1 Células-tronco Mesenquimais........................................................................................28
1.7.2 Células-tronco derivadas do tecido adiposo…………………………………………...29
1.8 Terapia Celular em Doença Inflamatória Intestinal.....................................................30
2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................32
2.1 Animais..............................................................................................................................32
2.2 Grupos Experimentais......................................................................................................32
2.3 Extração do tecido adiposo...............................................................................................32
2.4 Desinfecção do tecido adiposo..........................................................................................33
2.5 Isolamento e cultura das células-tronco derivadas do tecido adiposo por dissociação
mecânica...................................................................................................................................33
2.6 Viabilidade Celular...........................................................................................................34
2.7 Diferenciação in vitro das células-tronco derivadas do tecido adiposo........................35
2.7.1 Diferenciação Condrogênica..........................................................................................35
2.7.2 Diferenciação Osteogênica.............................................................................................35
2.7.3 Diferenciação Adipogênica.............................................................................................35
2.8 Modelo experimental de doença inflamatória intestinal...............................................36
2.9 Transplante Celular..........................................................................................................36
2.10 Avaliação da atividade anti-inflamatória intestinal.....................................................37
2.10.1 Avaliação Macroscópica...............................................................................................37
2.10.2 Determinações Bioquímicas.........................................................................................38
2.10.2.1 Determinação do conteúdo de glutationa total...........................................................38
2.10.2.2 Determinação da atividade da mieloperoxidase........................................................39
2.10.3 Análise Histológica.......................................................................................................39
2.11 Análise Estatística...........................................................................................................40
2.12 Aspectos Éticos................................................................................................................40
3. RESULTADOS....................................................................................................................41
3.1 Cultura e caracterização das células-tronco derivadas do tecido adiposo..................41
3.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória intestinal.......................................................45
3.2.1 Avaliações Macroscópicas..............................................................................................48
3.2.1.1 Relação peso/comprimento do cólon (P/C)..................................................................48
3.2.1.2 Aderências.....................................................................................................................48
3.2.1.3 Severidade e extensão do prejuízo intestinal................................................................48
3.3 Determinações Bioquímicas.............................................................................................49
3.4 Análise Histológica ...........................................................................................................51
4 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ..........................................................................................53
REFERÊNCIAS .................................................................................................................58
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Doença Inflamatória Intestinal
A Doença Inflamatória Intestinal (DII) compreende duas entidades nosológicas de
caráter crônico e recidivante: a Doença de Crohn (CD) e a Colite Ulcerativa (UC). Estas duas
desordens apresentam pontos de similaridade, entretanto, distinguem-se quanto a diferentes
aspectos fisiopatológicos e manifestações clínicas (Latella, Papi, 2012; Lennard-Jones, 1989;
Xavier, Podolsky, 2007).
A Doença de Crohn é uma condição inflamatória transmural da mucosa que pode
acometer qualquer região do trato gastrointestinal (TGI), em especial o iléo terminal e a
região perianal. Tipicamente apresenta-se de forma descontínua, atingindo várias porções do
TGI e associada a complicações, tais como fístulas, estenoses e abcessos (Baumgart,
Sandborn, 2007; Khor et al., 2011).
Diferentemente da CD, a Colite Ulcerativa é uma doença caracterizada pela inflamação
difusa da mucosa do cólon. Afeta o reto (95% dos casos) e as porções proximais do cólon, de
maneira simétrica e contínua, não havendo áreas de mucosa normal entre as partes afetadas
(Kornbluth et al., 2010). A UC pode ser classificada de acordo com a sua localização
anatômica e extensão em proctite (inflamação restrita ao reto), colite distal (inflamação
abrange o cólon sigmóide com ou sem envolvimento do cólon descendente) e pancolite ou
colite total, quando a inflamação envolve todo o colo (Baumgart, Sandborn, 2007; Farraye et
al., 2011).
A CD pode, clinicamente, ser descrita como leve, moderada e severa. A doença leve
caracteriza-se por ausência de dor abdominal intensa, obstrução intestinal, perda de peso e
também não há sinais de toxicidade sistêmica, que inclui febre, taquicardia, anemia e aumento
na taxa de sedimentação eritrocitária. Na forma moderada há sintomas de toxicidade
sistêmica, perda de peso, dor e sensibilidade na região abdominal, náusea e vômito sem
obstrução intestinal ou anemia significante. A forma severa é caracterizada por febre alta,
caquexia, vômito persistente, obstrução intestinal e abscesso (Hanauer et al., 2009; Mowat et
al., 2011; Singh et al., 2011).
Comumente a sintomatologia da UC inclui hematoquesia, urgência retal e tenesmo e
assim como a CD pode ser caracterizada como leve (4 evacuações diárias com ou sem sangue
e ausência de toxicidade sistêmica), moderada (misto de sintomas da doença leve e severa) e
severa (fezes sanguinolentas e mais de 6 evacuações por dia, sensibilidade abdominal e
17
toxicidade sistêmica). Pacientes com UC fulminante tipicamente evacuam mais de 10 vezes
por dia, apresentam quadros de anemia com necessidade de transfusão, toxicidade sistêmica,
distensão e sensibilidade abdominal (Baumgart, Sandborn, 2007; Hanauer et al., 2009;
Ortigoza, 2005; Singh et al., 2011).
1.2 Aspectos Epidemiológicos da Doença Inflamatória Intestinal
A UC e a CD apresentam uma distribuição etária bimodal, sendo que as maiores taxas
de incidência são observadas em indivíduos com idade entre 15 e 30 anos e um menor pico de
incidência verificado em pacientes com idade entre 50 e 70 anos (Hanauer, 2006; Horn,
Ufberg, 2011; Stange et al., 2008).
Apesar das mudanças temporais nos padrões epidemiológicos da UC e da CD, algumas
características tem sido constantes em diferentes estudos. A UC é ligeiramente mais comum
em homens, enquanto a CD tem predileção por mulheres. Ambas as doenças acometem
grupos que pertencem a um nível socioeconômico mais elevado, sendo as maiores taxas
encontradas nos países industrializados e os menores percentuais na África, Ásia e América
do Sul. Além disso, a DII atinge com maior freqüência indivíduos brancos (Abraham, Cho,
2009; Hanauer, 2006; Horn, Ufberg, 2011; Marshall, 2008; Thukkani et al., 2011).
A DII atinge aproximadamente 2,2 milhões de pessoas na Europa, 1,4 milhões nos
Estados Unidos e 150 mil no Canadá (Peyrin-Biroulet et al., 2011; Souza et al., 2008). No
Japão, segundo registros do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, o número de
portadores triplicou desde o início da década de 1990 e as estimativas mais recentes apontam
uma prevalência de afetados superior a 100.000 (Asakura et al., 2009; Talley et al., 2011).
Um grande obstáculo a ser enfrentado quando se discute a epidemiologia das DII no
Brasil, deve-se ao fato de que a UC e a CD não são consideradas doenças de notificação
compulsória e que, portanto, a prevalência real estaria sendo subestimada. Apesar disso, pode-
se considerar que há, em nosso país, uma baixa incidência e prevalência de DII (Souza et al.,
2008). Segundo Oliveira et al. (2010), houve, no entanto, um aumento considerável nos casos
de CD e UC no Sudeste do Brasil, conforme o levantamento realizado junto ao Hospital
Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (SP – Brasil).
18
1.3 Etiologia
Apesar de serem conhecidas há mais de cinco décadas, a CD e a UC são consideradas
desordens inflamatórias intestinais idiopáticas, uma vez que os fatores desencadeadores
permanecem elusivos. Provavelmente uma série de elementos contribui para o
desenvolvimento da inflamação na mucosa, entre os quais, valem citar, as causas ambientais,
fatores genéticos, defeitos imunoregulatórios e exposição a micro-organismos (Baumgart,
Carding, 2007; Fiocchi, 1998; Hanauer, 2006; Lapaquette et al., 2012).
1.3.1 Fatores Ambientais
1.3.1.1 Status geográfico, social, econômico e educacional
As maiores taxas de incidência e prevalência da DII têm sido observadas nas regiões
mais desenvolvidas, especialmente nos Estados Unidos e Europa, na zona urbana e,
sobretudo, nas classes sociais mais elevadas. Uma justificava para esses achados tem sido a
“hipótese da higiene”, que foi invocada para explicar o aumento na prevalência de várias
doenças inflamatórias e auto-imunes, que parecem ser resultantes da falta de exposição
precoce para selecionar agentes microbianos, devido às condições rigorosas de saneamento
(Bernstein et al., 2010; Thukkani et al.; 2011).
1.3.1.2 Dieta
Vários estudos tentam relacionar os componentes da dieta com a fisiopatologia da DII,
entretanto, estes são normalmente inconclusivos, visto que há uma dificuldade significativa
para se conseguir definir a real composição de cada dieta. Apesar disso, existem dados na
literatura que sugerem que alguns itens alimentares podem auxiliar ou inibir o surgimento das
inflamações intestinais crônicas. O consumo de açúcar pode ser um fator de risco para a CD,
enquanto a ingestão de gorduras e ácidos graxos está associada à UC. Dietas ricas em fibras,
frutas e vegetais parecem atuar como fatores protetores e reduzir o risco da DII (Carbonnel et
al., 2009; Danese et al., 2004; Fiocchi, 1998; Hanauer et al., 2006; Latella, Papi, 2012).
19
1.3.1.3 Tabagismo
O tabagismo tem um marcante efeito contrário sobre a UC e a CD, corroborando a
teoria de que mecanismos distintos estão envolvidos na gênese de cada forma de DII. O
cigarro é considerado um importante fator de risco para a CD, visto que em fumantes há uma
maior incidência e os episódios de recorrência são mais frequentes que em não-fumantes.
Verificou-se, ainda, que a cessação do hábito tabágico melhora o curso da doença (Hanauer,
2006; Latella, Papi, 2012; Qin, 2012).
Os resultados e proposições acerca do binômio tabagismo-colite são, no entanto
conflitantes. Há estudos que relatam que o tabaco atua como um agente protetor contra a UC.
Em fumantes o risco de desenvolvimento da doença é menor e quando estes param de fumar
as taxas aumentam. Embora não seja possível afirmar quais substâncias do cigarro estão
envolvidas nessas associações, sabe-se que o emprego de adesivos transdérmicos de nicotina
associado à terapêutica convencional melhora a sintomatologia de pacientes com UC leve ou
moderada (Danese et al., 2004; Fiocchi, 1998; Latella e Papi, 2012; Qin, 2012).
1.3.1.4 Fármacos
Uma meta-análise baseada em 14 estudos realizados entre 1980 e 2007 sugere uma
associação entre o uso de contraceptivos orais (CO) e a DII. Embora o mecanismo dessa
relação não seja totalmente conhecido, é provável que as propriedades trombogênicas dos CO
sobre a musculatura intestinal possam induzir as lesões intestinais da DII. Além disso,
mulheres que utilizam CO por longos períodos podem apresentar sintomas exacerbados da
doença e/ou recidivas (Zapata et al., 2010).
Outra classe de fármacos que tem sido extensivamente estudada, devido a sua relação
com a DII, são os antiinflamatórios não esteroidais (AINES). A administração contínua desse
tipo de medicamento aumenta diretamente o risco de desenvolvimento ou reincidência da UC
e CD (Ananthakrishnan et al., 2012; Danese et al., 2004; Kefalakes et al., 2009).
1.3.1.5 Estresse
Evidências de que o estresse possa modular as manifestações do curso natural da DII
são fundamentadas por observações clínicas, modelos experimentais de UC e estudos de
interações neuroimunes em animais de laboratórios. A exacerbação dos sintomas desta
20
moléstia parece estar relacionada com o estresse crônico. Apesar de não se conhecer o
mecanismo específico de como isso ocorre, acredita-se que deva ser decorrente de uma
complexa interação entre o sistema nervoso, endócrino e imunológico que resultará em um
desequilíbrio na permeabilidade intestinal e na liberação de citocinas pró-inflamatórias na
mucosa (Danese et al., 2004; Latella, Papi, 2012; Maunder, Levenstein, 2008).
1.3.2 Fatores Genéticos
Há uma vasta literatura que demonstra que os fatores genéticos desempenham um papel
significativo na DII (Baumgart, Carding, 2007; Khor et al., 2011; Kucharzik et al., 2006;
Reynisdottir et al., 2004; Ribeiro, 2009; Russel, Satsangi, 2004; Tsianos et al., 2012). Esta
afirmação pode ser justificada basicamente por 4 evidências:
1 - Estudos de hereditariedade demonstram que a freqüência da DII é maior em gêmeos
monozigóticos que em dizigóticos. Estes trabalhos também evidenciam que a taxa de
concordância é muito menor para a UC do que para a CD. Para a UC, a taxa de
concordância para gêmeos monozigóticos variam de 6 a 17%, enquanto para dizigóticos
é entre 0 e 5%. Em se tratando da DC, esses valores são bem mais elevados, sendo de
37 a 58% para monozigóticos e de 3,9 a 12% para dizigóticos (Khor et al., 2011;
Reynisdottir et al., 2004; Ribeiro, 2009);
2- Parentes de pacientes com DII apresentam risco maior de desenvolver a doença.
Estudos populacionais reportam que de 5 a 10% dos pacientes possuem um parente
portador da doença, enquanto na população geral esta taxa varia de 0,2 a 0,5%
(Baumgart, Carding, 2007; Khor et al., 2011; Reynisdottir et al., 2004);
3- Existem diferenças étnicas e raciais na ocorrência da DII. Estudos apontam que o
risco de aparecimento da doença é superior na população judaica (Kucharzik et al.,
2006; Ng et al., 2012; Russel, Satsangi, 2004; Tsianos et al., 2012);
4 - Mutações gênicas: em especial, no gene NOD2/CARD15, responsável pela produção
de citocinas inflamatórias e antiinflamatórias, manutenção da homeostasia intestinal e
síntese de defensinas. Estima-se que modificações no gene NOD2 sejam responsáveis
por 27% dos casos de CD (Baumgart, Carding, 2007; Khor et al., 2011; Kucharzik et
al., 2006; Ng et al., 2012; Reynisdottir et al., 2004; Ribeiro, 2009).
21
1.3.3 Defeitos Imunoregulatórios e Exposição Microbiana
Para um epitélio intestinal saudável, é necessário que exista uma interação dinâmica
entre as células epiteliais intestinais, os micro-organismos intestinais e as células
imunológicas locais. Estas associações são essenciais para a manutenção da homeostasia
intestinal, bem como da constituição do sistema imunológico contra patógenos. Entretanto,
verifica-se que em pacientes com DII há um desequilíbrio nessa cadeia de reações, que pode
ser explicado por meio de algumas teorias: disfunção nas respostas imunológicas do
hospedeiro aos componentes normais do lúmen, infecção mediante a presença de um
patógeno específico e/ou alterações na barreira intestinal (Hanauer, 2006; Maloy, Powrie,
2011; Matricon et al., 2010).
1.3.3.1 Disfunção nas respostas imunológicas do hospedeiro aos componentes normais do
lúmen
Normalmente, a exposição a bactérias comensais inibe a resposta imune do intestino
para micróbios e antígenos alimentares a que está constantemente exposto. Entretanto, em
pacientes com DII essa tolerância é perdida e a presença da microbiota luminal desencadeia
uma resposta inflamatória das células que revestem a mucosa, gerando uma reação
imunológica crônica e destrutiva (Hanauer, 2006; Hansen et al., 2010).
1.3.3.2 Infecção mediante a presença de um patógeno específico
Vírus, bactérias e parasitas têm sido considerados possíveis responsáveis pela etiologia
da DII. Na mucosa intestinal de pacientes com CD e UC tem sido verificada a presença
excessiva de agentes potencialmente patogênicos, tais como Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium avium, Paramyxovirus e
Helicobacter hepaticus (Hanauer, 2006; Matricon et al., 2010, Qin, 2012).
1.3.3.3 Alterações na barreira intestinal
A barreira intestinal é constituída por um biofilme bacteriano, que por sua vez é
composto por muco e pelo epitélio intestinal. Sua função é a de proteger o organismo contra
potenciais ameaças bacterianas e antígenos. Entretanto, na DII esse mecanismo de defesa é
22
prejudicado e ocorre um aumento na permeabilidade do revestimento epitelial do intestino,
resultando numa constante estimulação do sistema imune da mucosa. Além disso, as bactérias
do lúmen parecem intensificar ainda mais o defeito, estabelecendo um circuito auto-
sustentável e retroalimentador na mucosa inflamada que possibilita a absorção e translocação
de bactérias. Dessa forma, produtos bacterianos terão a capacidade de atravessar a barreira da
mucosa e entrar em contato direto com as células do sistema imunológico, o que acarretará
numa clássica resposta imune adaptativa (Hanauer, 2006; Kucharzik et al., 2006; Matricon et
al., 2010).
Em pacientes com CD a permeabilidade intestinal encontra-se aumentada em 36% e a
translocação bacteriana de Escherichia coli, Enterococcus ssp, Clostridium perfigens
verificada nos nódulos mesentéricos varia entre 30-50% contra 5-15% em indivíduos
saudáveis (Matricon et al., 2010).
1.4 Diagnóstico
O diagnóstico da UC e da CD compreende as características clínicas, exames
laboratoriais que incluem hemograma, VHS (Velocidade de Hemossedimentação), análises
bioquímicas, tais como PCR (Proteína C Reativa), ferritina e albumina sérica, pesquisa de
sangue oculto e cultura das amostras de fezes para descartar a possibilidade de patologias
decorrentes de infecções causadas por microorganismos. Além disso, os seguintes testes
também devem ser realizados: Raio X abdominal, endoscopia, colonoscopia e exame
anatomopatológico – biópsia (Bernstein et al., 2010; Kornbluth et al., 2010; Mowat et al.,
2011; Ortigosa, 2005; Solberg et al., 2009; Stange et al., 2008).
Marcadores sorológicos têm sido empregados para auxiliar no estudo de casos mais
complexos, uma vez que aumentam a precisão do diagnóstico e possibilitam distinguir a CD
da UC. Entre estes marcadores, destacam-se o anticorpo Anti- Saccharomyces cerevisiae -
ASCA e o anticorpo Anti-citoplasma de neutrófilos –pANCA (Engel, Neurath, 2010; Mowat
et al., 2011).
1.5 Tratamento
O tratamento dos pacientes com DII depende da localização anatômica da doença, bem
como de sua severidade (Engel; Neurath, 2010; Mowat et al., 2011) e consiste, basicamente,
em tratamento clínico-farmacológico e cirúrgico.
23
1.5.1 Tratamento Clínico – Farmacológico
As medidas terapêuticas por meio de medicamentos ou fármacos comumente usadas
são:
• Tratamento de suporte: em situações de desequilíbrio eletrolítico e desidratação deve-
se administrar fluidos e eletrólitos por via intravenosa. Transfusões de sangue devem ser
realizadas quando os pacientes apresentam anemia decorrente de graves hemorragias.
Medicamentos para a dor podem ser utilizados em caso de necessidade, com exceção
dos opiáceos. Os antiinflamatórios não esteroidais devem ser evitados, uma vez que
podem exacerbar os sintomas da doença. Antidiarréicos são utilizados para reduzir a
quantidade de fezes e melhorar a o quadro urgência retal, entretanto, não devem ser
empregados em casos graves da doença, pois podem acelerar o surgimento do
megacólon tóxico (Horn, Ufberg, 2011; Kefalakes et al., 2009);
• Aminossalicilatos: agentes antiinflamatórios derivados do ácido 5-aminossalicilato (5-
ASA) e da mesalazina, que podem ser administrados por via oral e retal. São as drogas
de primeira escolha para o tratamento da UC de grau leve a moderado e são empregados
com a finalidade de induzir e manter a remissão da doença. Em pacientes com CD sua
eficácia é menor, embora seja utilizado para terapia de manutenção da remissão
(Bernstein et al., 2010; Horn, Ufberg, 2011);
• Glicocorticóides: são indicados para o tratamento da DII devido ao seu significativo
potencial de suprimir a inflamação e aliviar os sintomas rapidamente. Além disso,
também são usados quando o 5-ASA não consegue controlar adequadamente as crises
agudas. Entretanto, os esteróides não são eficientes e nem recomendados como terapia
de manutenção ou na prevenção de recorrências, uma vez que o seu uso prolongado
pode causar osteoporose, miopatias, catarata e necrose avascular da cabeça do fêmur,
além de aumentar a susceptibilidade a infecções oportunistas (Bernstein et al., 2010;
Ford et al., 2011; Harris et al., 2009);
• Imunomoduladores: incluem os análogos da tiopurina, azatioprina (AZA) e o 6-
mercaptopurina (6-MP), o metrotexato (MTX) e a ciclosporina. A AZA e o 6-MP são
utilizados em pacientes com DII, sendo mais eficazes no tratamento da CD do que na
UC. O MTX é indicado para a indução da remissão em pacientes com CD ativa e na
prevenção de recidivas em indivíduos com CD inativa, mas não deve ser administrado
em casos de UC. Este imunomodulador pode acarretar fibrose hepática e devido a sua
embriotoxicidade é contraindicado na gravidez. A ciclosporina é uma droga
24
imunosupressora potente que tem sido empregada para tratar pacientes com DII severa.
Os efeitos decorrentes do uso desse medicamento compreendem infecções oportunistas
potencialmente fatais, hepatotoxicidade, insuficiência renal e convulsões (Engel,
Neurath, 2010; Harris et al., 2009; Mowat et al., 2011);
• Bloqueadores do fator de necrose tumoral alfa: o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) é
uma citocina pró-inflamatória que desempenha um papel fundamental na patogênese da
DII, uma vez que sua expressão encontra-se elevada nos pacientes portadores dessa
doença. Na última década, a terapia com bloqueadores do fator de necrose tumoral alfa
(anti-TNF-α), que incluem o Infliximabe, Adalimumabe e Certolizumabe Pegol, tem
auxiliado no tratamento dos pacientes com CD e UC. O Infliximabe é utilizado em
pacientes com CD de grau moderado a severo e em indivíduos com UC que não
respondem ao tratamento com um esteróide ou imunossupressor. Recomenda-se,
também, o seu uso para a terapêutica da CD com fístulas. Contudo, o Adalimumabe e o
Certolizumabe Pegol são empregados somente em casos de CD (Corte et al., 2012;
Engel, Neurath, 2010; Grundström et al., 2012; Horn, Ufberg, 2011).
1.5.2 Cirúrgico
Estima-se que entre 70 a 75 % dos pacientes com CD e que, aproximadamente, 30% dos
indivíduos com UC necessitem de tratamento cirúrgico. As técnicas cirúrgicas mais
empregadas para o tratamento da DII são drenagem de abcessos, ressecação intestinal
segmentar, anastomose íleo-retal, ileostomia temporária, colostomia em casos de fístula
perianal severa e proctocolectomia total associada a ileostomia total (Bernstein et al., 2010,
Mowat et al., 2011).
Na doença de Crohn, a cirurgia é indicada quando a terapia medicamentosa não
consegue aliviar de maneira apropriada os sintomas ou quando os pacientes apresentam
complicações, tais como fístulas, abcessos, obstrução e/ou desnutrição. Apesar deste
procedimento aumentar o período de remissão em alguns casos, raramente é curativo e a
intervenção cirúrgica deverá ser repetida com freqüência (Bernstein et al., 2010; Hwang,
Varma, 2008; Roses, Rombeau, 2008).
Ao contrário da CD, a colite ulcerativa pode ser curada mediante cirurgia, no entanto,
esta forma de tratamento está associada a altas taxas de morbimortalidade. Recomenda-se a
intervenção cirúrgica em episódios de hemorragia massiva, colite tóxica, megacólon tóxico,
25
perfuração intestinal, desnutrição grave, presença de displasia, câncer e/ou incapacidade de
tratamento médico (Bernstein et al., 2010; Hwang, Varma, 2008; Roses, Rombeau, 2008).
Apesar da introdução de novas abordagens terapêuticas clínicas e de sua contribuição
para o prolongamento e melhora na qualidade de vida dos portadores da DII e/ou na
prevenção da reincidência, não há nenhum tratamento clínico curativo. O tratamento
cirúrgico, por sua vez, envolve procedimentos complexos associados a altas taxas de
morbimortalidade e manifestações extra-intestinais pós-cirúrgicas (Orsi, 2008; Teixeira et al.,
2001). Considerando esses aspectos, diversos modelos experimentais têm sido propostos no
intuito de ampliar o conhecimento acerca dos processos fisiopatológicos e viabilizar novas
abordagens terapêuticas da DII (Asquith et al., 2010; Borm, Bouma, 2004; Eckmann, 2006;
Gonzalez-Rey et al., 2009; Khalil et al., 2007; Mizoguchi, Mizoguchi, 2008; Morris et al.,
1989; Sollid, Johansen, 2008; Uhlig, Powrie, 2009; Wirtz, Neurath, 2007).
1.6 Modelos Experimentais da Doença Inflamatória Intestinal
A patogênese da DII não é completamente conhecida, entretanto avanços têm sido
alcançados por meio dos modelos experimentais que mimetizam as manifestações da doença.
Os modelos in vitro são úteis para caracterizar os tipos celulares de indivíduos
susceptíveis a DII e para testar a toxicidade, a eficácia e a farmacocinética de novas drogas.
Apesar de serem relativamente baratos e de simples execução apresentam algumas limitações,
como o fato de não permitir a análise concomitante dos vários tipos de células que constituem
o trato gastrointestinal (Borm, Bouma, 2004).
Por sua vez, os modelos animais, mesmo sendo mais demorados e onerosos, conseguem
incorporar os diversos tipos celulares, a histologia e os processos envolvidos na DII, assim
como no sistema humano. Os diferentes modelos in vivo podem ser divididos em quatro
categorias, conforme apresentado no Quadro 1 (Blumberg et al., 1999; Borm, Bouma, 2004;
Hibi et al., 2002; Jurjus et al., 2004).
Ressalta-se ainda, que os modelos animais são importantes na identificação dos genes
susceptíveis a DII, bem como para a realização de estudos pré-clínicos de novas formas de
tratamento (Borm, Bouma, 2004).
O modelo de colite espontânea compreende animais que desenvolvem a inflamação da
mucosa naturalmente, ou seja, sem a administração de qualquer substância exógena. É a
categoria que melhor permite determinar os fatores genéticos envolvidos na inflamação da
mucosa, uma vez que a doença progride espontaneamente, em algumas espécies animais
26
(Quadro 1) com origem genética relativamente definida (Blumberg et al., 1999; Born, Bouma,
2004).
Quadro 1- Modelos Animais de Doença Inflamatória Intestinal
Modelo Espontâneo Camundongo C3H/HeJBir
Camundongo SAMP1/Yit
“Cotton-top tamarins”
(primatas encontrados na América do Sul)
Modelo de indução por administração
de agentes exógenos
Enema
Ácido trinitrobenzenosulfônico (TNBS)
Oxazolona
Formalina
Oral
Indometacina
Carrageenan (derivada de algas vermelhas
Eucheuma spinosum)
Dextran sulfato de sódio
Subcutânea
Ciclosporina A
Intracolônica
Polissacarídeo peptidoglicano
Modelo de animais geneticamente
modificados
Knockout
Camundongo knockout IL-2
Camundongo knockout IL-2/Rα
Camundongo knockout IL-10
Camundongo knockout TGF-β
Camundongo knockout STAT3
Camundongo knockout TNF-3’UTR
Camundongo mutante para o receptor de
células T
Camundongos com deficiência do fator
trefoil
Transgênicos
Camundongo transgênico IL-7
Camundongo transgênico STAT-4
Rato transgênico HLA B27
Modelo de transferência adotiva Transferência de células – T CD4+/
CD45RBhigh
Transferência de células – T CD8 hsp60
específica
Transferência de medula óssea em
camundongos Tgε26
27
A categoria em que a indução da colite é realizada por meio da administração de
agentes exógenos é a mais extensivamente estudada, devido a sua capacidade de demonstrar
diversos tipos de reações imunológicas, particularmente reações histopatológicas, bem como
correlacionar a imunopatogênese com o tratamento. Em geral, nesse tipo de modelo, é
necessário infundir uma substância que promova a destruição, mesmo que temporária, da
mucosa intestinal, para que o agente indutor da colite possa atingir o sistema imunológico e
assim desencadear uma reação inflamatória (Born, Bouma, 2004; Blumberg et al., 1999;
Jurjus et al., 2004; Kawada et al., 2007; Morris et al., 1989; Wirtz, Neurath, 2000).
Animais geneticamente modificados, seja por uma alteração em um gene alvo ou pela
introdução de um transgene, também têm sido empregados como modelos experimentais de
DII. A principal vantagem deste tipo de modelo deve-se à capacidade de identificar os
defeitos imunológicos que conduzem à inflamação da mucosa, bem como verificar os
mecanismos envolvidos. Além disso, permite analisar o papel das células epiteliais intestinais
e/ou alterações na integridade da barreira intestinal no processo inflamatório (Blumberg et al.,
1999; Born, Bouma, 2004; Uhlig, Powrie, 2009; Wirtz, Neurath, 2007).
A transferência adotiva de células, metodologia em que populações celulares específicas
são transferidas para um hospedeiro imunologicamente comprometido, é uma das maneiras de
se mimetizar a doença inflamatória intestinal. Este modelo é uma ferramenta versátil que
possibilita o estudo de uma série de aspectos genéticos e imunológicos que contribuem para o
desenvolvimento e progressão desta patologia intestinal (Blumberg et al., 1999; Hibi et al.,
2002; Lin, Hackam, 2011; Wirtz, Neurath, 2000).
1.7 Células-tronco
Células indiferenciadas que apresentam capacidade de autoduplicação e de dar origem a
células diferenciadas são denominadas células-tronco (NHI, 2001). Melton e Cowan (2004)
definiram as células-tronco (CT) como uma entidade clonal auto-renovável, multipotente e
que pode originar vários tipos de células diferenciadas.
Há 3 propriedades fundamentais que caracterizam as CT: (1) capacidade de auto-
renovação, (2) habilidade de originar células diferenciadas, em geral, de múltiplas linhagens e
(3) potencial de reparar funcionalmente um determinado tecido in vivo (Bajada et al., 2008;
Melton, Cowan, 2004; NHI, 2001; Padín-Iruegas, Lópes, 2012; Roobrouck et al., 2008).
28
Em função de seu potencial de diferenciação, as CT podem ser classificadas como
totipotentes (capacidade de originar todos os tipos de células embrionárias e extra-
embrionárias), pluripotentes (capacidade de gerar todos os tipos de células do embrião, mas
não tecidos extra-embrionários, como placenta, âmnion e córion), multipotentes (capacidade
de originar diversas linhagens celulares que dão origem aos tecidos), oligopotente (capacidade
de originar um subconjunto mais restrito de linhagens celulares que as células-tronco
multipotentes) e unipotente (capacidade de originar apenas um tipo de célula madura)
(Chandar, Viselli, 2011; Padín-Iruegas, Lópes, 2012; Wagers, Weissman, 2004).
As células-tronco também podem ser divididas de acordo com o seu tecido de origem
em células-tronco embrionárias (CTE) e células-tronco adultas (CTA). São classificadas como
CTE as células isoladas da massa interna do blastocisto embrionário e CTA as derivadas de
tecidos pós-natais, células-tronco oriundas do feto e do cordão umbilical, e incluem as
células-tronco hematopoéticas - CTH e as células-tronco mesenquimais - CTM (Brunt et al.,
2012; Lakshmipathy, Verfaillie, 2005; NIH, 2001; Roobrouck et al., 2008).
1.7.1 Células-tronco Mesenquimais
As CTM foram pioneiramente descritas por Friedenstein et al. (1964), após a realização
de um estudo em que amostras de todo o conteúdo da medula óssea foram colocadas em
frascos de cultura de plástico. Os autores verificaram a presença de uma pequena quantidade
de células aderentes e aparentemente heterogêneas, sendo o tipo celular mais aderente o que
apresentava morfologia fusiforme e grupamentos de 2 a 4 células. Observaram, também, que
as células permaneciam dormentes nos primeiros 2 a 4 dias e após esse período começavam a
se multiplicar rapidamente e adquiriam aspecto em forma de fuso. No entanto, a característica
mais marcante das células era a capacidade de se diferenciar em colônias que se
assemelhavam a pequenos depósitos de osso ou cartilagem.
Em função das diferentes nomenclaturas, tais como células do estroma medular,
unidades formadoras de colônias fibroblásticas (CFU-F), células-tronco esqueléticas, a
Sociedade Internacional de Terapia Celular sugeriu, em 2006, que esse grupo celular passasse
a ser denominado de células estromais mesenquimais multipotentes (multipotent
mesenchymal stromal cells - MSC). Além disso, definiu 3 critérios para caracterizar essa
população de células estromais, multipotentes, não-hematopoéticas e de aspecto
fibroblastóide: capacidade de aderência à superfície plástica, presença (≥ 95%) de marcadores
de superfície CD105, CD73 e CD90, e ausência (≤ 2) dos CD45, CD34, CD14 ou CD11b,
29
CD79a ou CD19 e HLA classe II, e potencial de diferenciar-se em osso, cartilagem e tecido
adiposo, sob determinadas condições in vitro (Bydlowsk, 2009; Caplan, 1991; Dominici et al.,
2006).
Uma das características responsáveis pelo grande interesse nas CTM em estudos
clínicos e pré-clínicos está vinculada à possibilidade de serem isoladas de fontes distintas,
como a medula óssea, tecido adiposo, cordão umbilical, polpa dentária, músculo esquelético,
tecido sinovial, cartilagem articular, líquido aminiótico, tendão e pele (Bajada et al., 2008;
Bydlowsk, 2009; Rankin, 2012).
1.7.2 Células-tronco derivadas do tecido adiposo
As células-tronco derivadas do tecido adiposo (adipose-derived stem cell – ASC) foram
pioneiramente identificadas por Zuk et al. (2001) e desde então, tem sido extensivamente
estudadas pela comunidade científica, uma vez que são encontradas em quantidade abundante,
são de fácil obtenção (procedimentos pouco invasivos e com mínima mortalidade) e podem se
diferenciar em múltiplas linhagens celulares (osteócito, adipócito e condrócitos) de maneira
reprodutível. Além disso, podem ser empregadas de forma segura em transplantes autólogos
e alogênicos (Bunnel et al., 2008; Locke et al., 2011; Mizuno, 2009; Villageois et al., 2012;
Yarak and Okamoto, 2010).
Em função das características anteriormente relacionadas, há uma série de relatos na
literatura com o emprego das ASC em estudos clínicos e pré-clínicos, conforme sumarizado
no Quadro 2 (Ando et al., 2008; Zuk, 2010). Observa-se que um grande percentual das
pesquisas é realizado em modelos experimentais, in vivo e in vitro, visto que há a necessidade
de ampliar o conhecimento acerca da eficácia das ASC.
30
Quadro 2- Aplicações das células-tronco derivadas do tecido adiposo.
Emprego das ASC Patologia e/ou injúria
Modelos experimentais
Doença Inflamatória Intestinal
Reparo do disco intervertebral
Lesão medular
Regeneração do nervo periférico
Glioblastoma
Esclerose múltipla
Doença de Huntington
Traumas
Incontinência urinária
Disfunção erétil
Lesões do fígado
Diabetes
Colite
Isquemia
Artrite reumatóide
Lesões e queimaduras de pele
Fenda palatina
Lesões de tendão
Humanos
Defeito na calvária
Doença de Crohn
Incontinência urinária
Doença do enxerto versus hospedeiro
Fonte: Adaptado de Zuk, 2010.
1.8 Terapia Celular em Doença Inflamatória Intestinal
As células-tronco hematopoéticas e mesenquimais (CTH e CTM) têm despertado o
interesse de clínicos e investigadores em DII. Apesar das pesquisas estarem em fase inicial, há
indícios baseados em relatos de casos, estudos pré-clínicos in vitro e em modelos animais de
que a terapia celular com células-tronco desponta como uma promissora alternativa
terapêutica para o tratamento da colite ulcerativa e síndrome de Crohn (Ando et al., 2008;
Dalal et al; 2012; García-Olmo et al., 2005; Gonzalez-Rey et al., 2009; Hayashi et al., 2008;
Lanzoni et al., 2008; Singh et al., 2011; Tanaka et al., 2008).
Sabe-se que pacientes portadores de DII apresentam uma maior tendência a desenvolver
doenças hematológicas severas, tais como linfomas e leucemia. Comumente estas desordens
do sistema sanguíneo são tratadas por meio do transplante de células mononucleares da
medula óssea ou pelo transplante de células-tronco hematopoéticas, entretanto, também, tem
sido observado que o transplante celular atua de forma efetiva no tratamento da doença de
31
Crohn e da colite ulcerativa (Ashworth, 2012; Bewtra, 2012; Setshedi, 2012; Wei et al.,
2009).
Kashyap e Forman (1998) descreveram o primeiro relato de paciente com linfoma de
Hodgkin associado a CD que apresentou remissão da DII e manteve ausência de
manifestações clínicas por 7 anos, após o transplante de medula óssea (TMO) autólogo. Em
outro estudo, 6 indivíduos com CD foram submetidos a TMO alogênico para leucemia
mieloide e foi verificado que cinco permaneceram livres do sintomas relacionados a CD por
mais de 1 ano (Lopez-Cubero et al., 1998). Em 2003, Ditschkowski et al. demonstrou que 10
dos 11 pacientes com DII (7 com CD e 4 com UC), mantiveram-se livres dos indícios da
doença, após o transplante alogênico de células-tronco para leucemia mielóide e síndromes
mielodisplásicas.
Estudos em modelos experimentais também têm mostrado resultados que comprovam
que o transplante de células-tronco pode alterar o curso ou história natural da DII, inibindo ou
retardando a progressão da doença. Khalil et al (2007) verificou que o transplante de células-
tronco CD 34-, isoladas do sangue periférico e da medula óssea de camundongos, podem atuar
na recuperação da colite induzida por dextran sulfato de sódio (DSS). A administração local
de CT derivadas do tecido adiposo em ratos com colite induzida por TNBS mostrou acelerar o
processo de regeneração das regiões lesadas do cólon (Ando et al., 2008).
Acredita-se que as células mesenquimais possam estar envolvidas na regeneração
tecidual, uma vez que possuem a habilidade de modular as respostas imunológicas das células
pró-inflamatórias para induzir um ambiente com um fenótipo mais tolerante à inflamação.
Além disso, regulam a função do sistema imunológico nos tecidos inflamados, acionando
citocinas pró-inflamatórias e a secreção de quimiocinas (Aggarwal, Pittenger, 2005; Tanaka et
al. 2008). Dessa forma, conclui-se que as CTM podem apresentar uma ação antiinflamatória
em resposta à indução de lesão em modelos experimentais in vivo e portanto, atuar como um
potencial agente terapêutico em doenças inflamatórias como a colite ulcerativa e a síndrome
de Crohn.
Neste contexto, pretende-se no presente estudo verificar a segurança e a eficácia do
transplante de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em ratos com colite
ulcerativa induzida por ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). Sendo assim, propõe-se, com
esta abordagem, avançar nos aspectos fisiopatológicos da colite, bem como sugerir e avaliar a
eficácia de novas alternativas terapêuticas no tratamento das doenças inflamatórias intestinais.
32
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Animais
Foram utilizados 33 ratos albinos machos da linhagem Wistar, espécie Rattus
norvegicus, oriundos do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista – Campus de
Botucatu – SP. Deste total, 5 animais (peso médio de 500 g) foram empregados para obtenção
das células tronco derivadas do tecido adiposo e 28 animais (peso médio 300 - 400 g) para
modelo de doença inflamatória intestinal experimental. Os animais foram mantidos em
temperatura controlada (22 ± 2 °C) e expostos a ciclos claro/escuro de 12 horas
respectivamente, e receberam dieta sólida (Nuvilab®; Paraná, Brasil) e água ad libitum.
2.2 Grupos Experimentais
Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais: Branco, Controle e
Tratado, conforme apresentado no Quadro 3.
Quadro 3- Grupos Experimentais
Grupo Característica
Branco Animais não colíticos
Controle – PBS Animais colíticos e tratados com veículo
(tampão fosfato salino – PBS).
Tratado Animais colíticos e tratados com células-
tronco derivadas do tecido adiposo
2.3 Extração do tecido adiposo
Para a coleta do tecido adiposo, cinco ratos foram sacrificados por meio de
aprofundamento de anestesia com Tiopental sódico (Cristália, SP, Brasil), 400 mg/Kg, por via
intraperitonial. Em seguida, a região inguinal foi tricotomizada e foi submetida a um processo
de antissepsia com polivinilpolirridona-iodo (PVP-I), para posterior extração de
33
aproximadamente 2 g de tecido adiposo da região inguinal (lados direito e esquerdo) de cada
um dos animais, obtendo-se um total de 10 g de tecido.
Figura 1. Extração do tecido adiposo da região inguinal de ratos
2.4 Desinfecção do tecido adiposo
Após a coleta, o tecido adiposo foi mantido em meio RPMI 1640 com HEPES (Gibco®,
New York, EUA) suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal – SBF (Gibco®, New York,
EUA) e 2% de antibiótico/antimicótico 100X (Gibco®, New York, EUA), a 4 °C durante um
período de 24 horas para desinfecção.
2.5 Isolamento e cultura das células-tronco derivadas do tecido adiposo por dissociação
mecânica
Após o processo de desinfecção, o tecido adiposo foi colocado em uma placa de Petri
(vidro), contendo meio RPMI 1640 com HEPES suplementado com 2% de antibiótico –
antimicótico, e dissociado mecanicamente com o auxílio de duas agulhas de seringa (BD™,
New Jersey, USA) em forma de Z, para desprendimento das células do tecido (Figura 2.A). O
meio contendo as células dissociadas foi colocado em seringas que permaneceram em posição
vertical, por cerca de dez minutos. Em seguida, a solução celular foi filtrada em um filtro de
70 µm (Cell Strainer - BD Falcon™, New Jersey EUA) para a separação de restos celulares
(Figura 2.B). O material coletado foi centrifugado durante 10 minutos a 900 g. O precipitado
34
obtido (Figura 3.C) foi homogeneizado em 1 mL de meio ALPHA-MEM (Gibco®, New
York, EUA) suplementado com 20% SBF e 1% antibiótico/antimicótico. Uma alíquota de 10
µL foi retirada para contagem em câmara de Neubauer e determinação da viabilidade celular.
Após a contagem, as células foram plaqueadas em garrafas de cultura (BD Falcon™, New
Jersey, EUA) a uma concentração de 1x105 células/cm
2, na presença de meio ALPHA-MEM
suplementado com 20% de SBF e 1% de antibiótico/antimicótico, e incubadas em estufa a 37
°C e 5% de CO2. A primeira troca do meio de cultura foi feita após 72 horas e as trocas
seguintes a cada 48 horas. Ao atingirem 60 – 80% de confluência as células foram dissociadas
com a utilização de Tryple™ (Gibco®, New York, EUA).
Figura 2- Isolamento e cultura das células-tronco do tecido adiposo.
A: Processo de dissociação mecânica. B: Separação dos restos de tecidos. C: Precipitado (seta).
2.6 Viabilidade Celular
Para verificação da viabilidade e contagem celular foi empregada câmara de Neubauer
com 10 L de azul de tripan e 10 L de suspensão celular.
35
2.7 Diferenciação in vitro das células-tronco derivadas do tecido adiposo
2.7.1 Diferenciação Condrogênica
Para induzir a diferenciação condrogênica, as ASC foram plaqueadas a uma
concentração de 1x105 células/cm
2 e cultivadas em meio ALPHA-MEM suplementado com
20% de SBF e 1% de antibiótico – antimicótico, até atingirem uma confluência de 60-80%.
Em seguida, as células foram cultivadas durante 14 dias em presença do kit de diferenciação
condrogênica StemPro® (Gibco®, New York, USA), segundo a metodologia proposta pelo
fabricante. A diferenciação condrogênica foi confirmada pela análise da coloração com
Alcian Blue (Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, EUA).
2.7.2 Diferenciação Osteogênica
Para induzir a diferenciação osteogênica, as ASC foram plaqueadas a uma concentração
de 1x105 células/cm
2 e cultivadas em meio ALPHA-MEM suplementado com 20% de SBF e
1% de antibiótico – antimicótico, até atingirem uma confluência de 60-80%. Em seguida, as
células foram cultivadas durante 21 dias na presença do kit de diferenciação osteogênica
StemPro® (Gibco®, New York, USA), segundo a metodologia proposta pelo fabricante. A
diferenciação osteogênica foi confirmada pela análise da coloração com Alizarin Red S
(Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, EUA).
2.7.3 Diferenciação Adipogênica
Para induzir a diferenciação adipogênica, as ASC foram plaqueadas a uma concentração
de 1x105células/cm
2 e cultivadas em meio ALPHA-MEM suplementado com 20% de SBF e
1% de antibiótico – antimicótico, até atingirem uma confluência de 60-80%. Em seguida, as
células foram cultivadas durante 14 dias na presença do kit de diferenciação osteogênica
StemPro® (Gibco®, New York, USA), segundo a metodologia proposta pelo fabricante. A
diferenciação adipogênica foi confirmada pela análise da coloração com Oil Red O (Sigma-
Aldrich
, St. Louis, MO, EUA).
36
2.8 Modelo experimental de doença inflamatória intestinal
A indução do processo inflamatório intestinal foi realizada pelo método descrito por
Morris et al., (1989), com pequenas modificações. Os animais foram submetidos a um
período de jejum de 24 horas e, posteriormente, anestesiados com halotano (Hoechst Marion
Roussel®, São Paulo, SP, Brasil). O ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfônico – TNBS (Sigma-
Aldrich
, St. Louis, MO, Estados Unidos) foi preparado a partir de um liofilizado obtido da
solução aquosa comercial de origem a 5% (p/v), onde 0,25 mL de uma solução de 10 mg de
TNBS em etanol a 50% (v/v). O TNBS foi administrado por via retal (intracolônica) com o
auxílio de uma cânula de silicone (diâmetro de 2 mm), introduzido pelo ânus do animal até
uma distância de 8 cm. Os animais foram mantidos em posição vertical (de cabeça para baixo)
desde o momento da instilação do hapteno até a recuperação da anestesia (Figura 3). Os
animais do grupo branco foram submetidos ao mesmo procedimento, mas com administração
de solução salina em substituição ao TNBS. Todos os animais foram sacrificados 7 dias após
a indução da colite.
Figura 3. Procedimento de indução da colite ulcerativa
37
2.9 Transplante Celular
O transplante celular foi realizado 2 horas após a indução da doença inflamatória
intestinal. Para o transplante celular foram utilizadas células-tronco mesenquimais derivadas
do tecido adiposo de ratos da linhagem Wistar. A infusão das células foi feita por via
intravenosa (veia caudal). No grupo tratado foi infundido 1 mL de solução celular diluída em
PBS (Phosphate balanced saline - Gibco®, New York, USA), na concentração de 1 x 107
células/mL. O grupo controle recebeu tratamento similar, porém, foi infundido apenas o
veículo (PBS).
2.10 Avaliação da atividade anti-inflamatória intestinal
2.10.1 Avaliação macroscópica
Durante o desenvolvimento do estudo, foram avaliados em diferentes parâmetros tais
como: consumo de alimento, peso corporal e aparecimento de fezes diarréicas. Ao final dos
experimentos, os animais foram sacrificados, os cólons extraídos e analisados quanto aos
danos intestinais, considerando-se parâmetros macroscópicos e bioquímicos.
Na análise macroscópica, foram avaliados peso e comprimento do cólon, existência de
aderências entre o intestino e órgãos adjacentes e análise da severidade e extensão do prejuízo
intestinal, de acordo com uma escala descrita previamente por Bell et al., 1995 (Quadro 4).
Quadro 4- Critério de avaliação da severidade e extensão da lesão colônica
Escore Critério
0
1
2
3
4
5
6-10
Sem prejuízo
Hiperemia, sem úlceras
Úlcera linear sem inflamação significante
Úlcera linear com inflamação em um sítio
Dois ou mais sítios de ulceração/inflamação
Dois ou mais sítios de ulceração e inflamação ou um sítio de
inflamação maior que 1 cm ao longo da extensão do cólon
Se o prejuízo cobrir mais que 2 cm ao longo da extensão do cólon
(o escore é aumentado em 1 ponto para cada centímetro adicional)
38
Após a análise macroscópica, o cólon foi dividido em cinco fragmentos longitudinais.
Dois fragmentos foram congelados a -30 ºC para determinação da avaliação da atividade da
mieloperoxidase e para determinação dos níveis de glutationa total. Este último fragmento foi
pesado e congelado em 1 mL de ácido tricloroacético –TCA (Vetec Química Fina, Duque de
Caxias, RJ, Brasil) 5% (p/v) com o objetivo de inibir sua degradação pela gama-
glutamiltranspeptidase (Anderson, 1985). Os fragmentos restantes foram armazenados a -80
ºC.
2.10.2 Determinações Bioquímicas
Todas as determinações bioquímicas foram realizadas em homogeneizados de mucosa
intestinal colônica, sendo que a homogeneização foi realizada a frio durante aproximadamente
45 segundos, com ajuda de um homogeneizador automático (Janke & Kunkel Ultra Turrax;
Hielscher™, Teltow, Germany).
2.10.2.1 Determinação do conteúdo de glutationa total
A determinação do conteúdo de glutationa total foi realizada de acordo com o método
descrito por Anderson (1985), que está baseado na oxidação total da glutationa (GSH)
reduzida à sua forma oxidada (GSSG), após a incubação da amostra em ácido
ditiobisnitrobenzóico (DTNB). O DTNB reduzido adquire uma coloração amarelada, que
pode ser determinada espectrofotometricamente. O GSSG gerado é reduzido, por ação da
enzima glutationa redutase, na presença de NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato). O GSH formado se oxida novamente, gerando um ciclo contínuo, sendo que a
velocidade de redução do DTNB (com o seu conseqüente incremento de absorbância a 412
nm) é proporcional à quantidade total de glutationa (GSH + GSSG).
Para efetuar a determinação do conteúdo de glutationa total, foram utilizados os
fragmentos de cólon congelados com TCA. As amostras, após descongelamento, foram
homogeneizadas com uma solução de TCA 5% em uma proporção final de 1:20 (p/v). Após a
homogeneização, o material foi centrifugado a 2000 g por 5 minutos a 4 ºC. Do sobrenadante
foi utilizado 20 L, que foi colocado em uma placa de 96 canais, onde se adicionou 140 L
de NADPH (Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, Estados Unidos), 5 L de PBS e 20 L DTNB
(Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, Estados Unidos). A placa foi colocada no leitor de placas do
39
espectrofotômetro, onde permaneceu incubada por 5 minutos em uma temperatura de 30 ºC.
Após este período adicionou-se 15 L de glutationa redutase (Sigma-Aldrich
, St. Louis,
MO, Estados Unidos) e registrou-se o incremento de absorbância a 412 nm no
espectrofotômetro (Power Wave™ 340 – BioTek, Winooski, VT, EUA). A concentração de
glutationa foi calculada a partir da pendente da curva obtida por interpolação em uma curva
padrão realizada com glutationa (GSH), sendo os resultados foram expressos como nmol/g de
tecido.
2.10.2.2 Determinação da atividade da mieloperoxidase
A determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO) em fragmentos de cólon de
rato foi realizada pelo método de Krawisz et al. (1984). A atividade da mieloperoxidase é
utilizada como marcador da infiltração de neutrófilos, mesmo que esta enzima não seja
específica deste tipo celular. A determinação foi realizada em fragmentos de cólon (150 – 300
mg), que, após descongelamento, foram homogeneizados na presença de tampão brometo de
hexadeciltrimetilamônio – HTAB (Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, EUA) a uma proporção
de 1:20 (p/v), durante 45 segundos. O tampão HTAB, ao funcionar como um detergente
facilita a liberação da enzima mieloperoxidase dos grânulos intracelulares dos neutrófilos,
onde está armazenada. O homogeneizado resultante foi dividido em duas alíquotas de 1,0 mL
e armazenadas em eppendorff. O material foi sonicado por 10 segundos e submetido a um
triplo processo de congelamento-descongelamento durante 1-2 dias. Após o último
descongelamento, a alíquota foi centrifugada a 7000 g por 5 minutos a 4 ºC. Em uma placa de
96 canais, foi adicionado 100L do sobrenadante de cada amostra em poços distintos, 150 L
do tampão de reação (cloridrato de orto-dianisidina; Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO, EUA).
Em seguida, foi determinado o incremento de absorbância a 450 nm usando um
espectrofotômetro. A atividade da enzima mieloperoxidase foi calculada por interpolação em
uma curva padrão, realizada com MPO procedente de neutrófilos humanos. Uma unidade de
mieloperoxidase (U) foi considerada como aquela que degrada 1 nmol/min de peróxido de
hidrogênio a 25 ºC. Os resultados foram expressos em U/g de tecido.
40
2.10.3 Análise Histológica
Imediatamente após a avaliação macroscópica do processo inflamatório colônico,
amostras de tecido (0,5 mm) adjacentes à área de lesão foram coletadas para processamento
histológico. Essas amostras foram acondicionadas em cassetes histológicos, fixadas em
formalina 4% e submetidas à coloração com hematoxilina – eosina (HE).
2.11 Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão da média. Diferenças entre
as médias foram testadas por Análise de Variância (ANOVA) seguida por testes de
significância. Dados não paramétricos (escores) foram expressos como mediana e analisados
pelo teste de Kruscal-Wallis. Dados descontínuos foram analisados pelo teste qui-quadrado
(X2). Significância estatística foi considerada para valores de p < 0,05.
2.12 Aspectos Éticos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA) da
Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus de Assis (Registro n°: 012/2011).
41
3 RESULTADOS
3.1 Cultura e caracterização das células-tronco derivadas do tecido adiposo
Aspectos morfológicos, capacidade de adesão à superfície plástica, proliferação e
viabilidade das células-tronco isoladas do tecido adiposo foram observados com a finalidade
de verificar o comportamento celular. Para a cultura primária, plaqueou-se as ASC a uma
densidade de 1x105 células/cm
2 e após 48 horas foi verificada a aderência celular na superfície
de cultura. A partir de 72 horas, foi possível notar a presença de colônias celulares e pequenas
células com morfologia fusiforme. Conforme apresentado na Figura 4-A, no 7° dia da cultura
foi observada uma grande população de células alongadas com aspecto de fuso, semelhante ao
de fibroblastos. A confluência de 70 – 80% foi alcançada após, aproximadamente, 11 dias do
início da cultura (Figura 4-B).
Posteriormente à cultura primária, o crescimento celular tornou-se mais rápido, visto
que a confluência de 70 – 80% foi atingida em um intervalo menor de tempo (entre 3 – 4
dias). Observou-se, também, que após a terceira passagem a cultura apresentou-se como uma
monocamada homogênea de células fusiformes (Figura 4-C), indicando que as ASC estavam
purificadas, ou seja, não havia, provavelmente, contaminação com células não aderentes, tais
como adipócitos maduros e hemácias. As células foram cultivadas até a 5a passagem,
mantendo o padrão morfológico (Figura 4-D). A viabilidade celular foi mensurada em cada
uma das passagens, obtendo-se uma média de aproximadamente 99%.
42
Figura 4- Comportamento das células-tronco derivadas do tecido adiposo em diferentes
períodos da cultura.
A – Cultura primária (7 dias); B – 11 dias (confluência de 70 – 80%); C – Monocamada
homogênea de células com aspecto fibroblastóide (terceira passagem); D – Quinta passagem –
manutenção do padrão morfológico.
Para verificar se as células isoladas do tecido adiposo se adequavam aos requisitos
preconizados pela Sociedade Internacional de Terapia Celular para validação das células-
tronco mesenquimais (Dominici et al., 2006), foram realizados testes de diferenciação in vitro
das ASC para obtenção de condrócitos, osteócitos e adipócitos. A Figura 5 mostra a
diferenciação condrogênica por meio da coloração com o corante Alcian Blue. O azul é
indicativo da síntese de proteoglicanos pelos condrócitos. A osteogênese foi confirmada
mediante coloração da matriz óssea dos osteoblastos e osteócitos com Alizarin Red S (Figura
6). Finalmente, com o auxílio do corante Oil Red O foi comprovada a diferenciação das ASC
em adipócitos. Conforme observado na Figura 7, os vacúolos lipídicos encontram-se corados
em vermelho.
A B
C D
43
Figura 5- Diferenciação condrogênica das ASC.
A - Cultivo das ASC na ausência de meio indutor (Aumento de 20 X); B - ASC
diferenciadas em condrócitos na ausência de corante (Aumento de 20 X); C e D -
Proteoglicanos sintetizados pelos condrócitos e corados com Alcian Blue (Aumento de
20X e 40X, respectivamente).
A B
C D
44
Figura 6- Diferenciação osteogênica das ASC.
A – Cultivo das ASC na ausência de meio indutor (Aumento de 20 X); B - ASC
diferenciadas em osteoblastos e osteócitos na ausência de corante (Aumento de 20 X); C e D
– Matriz óssea corada com Alizarin Red S (Aumento de 20X e 40X, respectivamente).
A B
C D
45
Figura 7- Diferenciação adipogênica das ASC.
A - Cultivo das ASC na ausência de meio indutor (Aumento de 20 X); B - ASC
diferenciadas em adipócitos na ausência de corante (Aumento de 20 X); C e D –
Vacúolos lipídicos corados com Oil Red O (Aumento de 20X e 40X, respectivamente).
3.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória intestinal
Com o propósito de verificar a atividade anti-inflamatória intestinal “in vivo” foram
avaliados o peso corpóreo, consumo alimentar e presença de fezes diarréicas.
O consumo de ração, calculado pela média da quantidade diária de alimentos ingerida
pelos animais de cada grupo experimental, mostrou, conforme apresentado na Figura 8, que a
média de consumo dos animais não colíticos (saudáveis) é superior ao dos animais colíticos
(submetidos ao tratamento com TNBS). O consumo do grupo branco diferiu estatisticamente
quando comparado aos grupos controle e tratado, entretanto, não houve diferença estatística
significativa entre o grupo controle e o tratado (p < 0.05; diferença estatística não
apresentada).
A B
C D
46
Figura 8- Média do consumo diário de ração por grupo experimental em modelo de
doença inflamatória intestinal por administração de TNBS/álcool.
A avaliação do peso corpóreo realizada diariamente, por meio da média do delta (Δ =
peso final – peso inicial) do peso corpóreo dos animais de cada grupo experimental, mostrou
que em decorrência da redução do consumo de alimentos, verifica-se, conforme a Figura 9,
que há uma diminuição no peso corpóreo dos animais submetidos à administração da solução
alcoólica de TNBS. Nota-se que o ganho não foi reestabelecido nos grupos controle - PBS e
tratado. A média do delta peso do corpóreo do grupo branco apresentou diferença
estatisticamente significativa quando comparada aos grupos controle e tratado, no entanto,
não diferiu significativamente entre os grupos controle e o tratado (p < 0.05; diferença
estatística não apresentada).
47
Figura 9- Avaliação do peso corporal dos animais em modelo experimental de doença
inflamatória intestinal.
A presença de fezes diarreicas foi monitorada diariamente, por meio da presença de
resíduos fecais na região anal, desde o procedimento de indução da colite ulcerativa até a
eutanásia dos animais. Dentre os animais colíticos, foi observado que a totalidade (100 %) dos
animais do grupo controle apresentaram fezes diarreicas contra 90% dos animais do grupo
tratado (Tabela 1). A análise dos resultados apresentados na Tabela 1 mostra que não houve
diferença estatística significativa entre os grupos controle e tratado.
Tabela 1- Efeito do tratamento com células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) na
incidência de fezes diarreicas em modelo animal de doença inflamatória intestinal.
Grupo *Diarréia (%)
Branco 0a
Controle - PBS 100b
Tratado com ASC 90b
*Diarréia foi analisada pelo teste X
2. Valores sem letras em comum apresentam diferença
estatística significativa em p<0.05.
48
3.2.1 Avaliações Macroscópicas
3.2.1.1 Relação peso/comprimento do cólon (P/C)
A lesão colônica decorrente do processo inflamatório está relacionada e pode ser
quantitativamente expressa por um aumento na razão peso-comprimento – P/C (mg/cm) do
cólon. Conforme os resultados apresentados na Tabela 2, não houve diferença estatística
significativa em relação ao P/C do cólon entre os grupos controle e tratado.
3.2.1.2 Aderências
A aderência entre o intestino e os órgãos adjacentes, também, é considerada uma
característica do processo inflamatório da mucosa intestinal. A Tabela 2 mostra um percentual
de aderência de 83,33% nos animais do grupo controle e de 20% nos animais colíticos e
tratados com ASC. Observou-se que houve diferença estatisticamente significativa entre o
grupo controle e o tratado.
3.2.1.3 Severidade e extensão do prejuízo intestinal
A administração da solução alcoólica de TNBS nos animais do grupo controle
desencadeou um processo inflamatório, caracterizado por lesões ao longo do cólon que
apresentaram extensão entre 1,20 a 5,50 cm e escore entre 5 e 9 (Tabela 2). A análise dos
resultados apresentados na Tabela 2 mostra que não houve diferença estatisticamente
significativa em relação à extensão e escore da lesão, entre os animais do grupo controle-PBS
em relação ao grupo tratado com ASC.
49
Tabela 2- Paramêtros macroscópicos do tratamento com células-tronco derivadas do tecido
adiposo (ASC) em modelo experimental de doença inflamatória intestinal por
administração de solução alcoólica de TNBS.
Grupo Escore
(0 – 10)*
Extensão da
lesão (cm)**
Relação
peso/comprimento
(mg/cm)**
Aderência
(%)***
Branco 0a
0a
106,77 ± 3,241a
0a
Controle
– PBS
7 (5-9)b
3,70 ± 0,741b
269,57 ± 43,851b
83,33b
Tratado
com ASC
6,5 (4-9)b 3,51 ± 0,415
b 199,36 ± 27,85
b 20
c
*Os valores de escore estão expressos em mediana (intervalo),
**extensão da lesão e relação peso-
comprimento colônico estão expressos em média ± E.P.M. (Erro Padrão da Média), ***
aderência
foi analisada pelo teste X2. Valores sem letras em comum apresentam diferença estatística
significativa em p<0.05.
3.3 Determinações Bioquímicas
O processo inflamatório da mucosa intestinal determina, entre outras características,
uma alteração de parâmetros bioquímicos, tais como: depleção no conteúdo da glutationa total
(GHS) e aumento da atividade da mieloperoxidase (MPO).
Conforme pode ser verificado pela análise dos resultados apresentados na Figura 10, os
animais submetidos à administração da solução alcoólica de TNBS apresentaram diferença
estatística significativa no que se refere à redução nos níveis de glutationa quando
comparados aos animais o grupo branco. Embora os níveis de glutationa foram maiores nos
animais tratados, não foi verificada diferença significativa quando confrontou-se os resultados
dos animais tratados com PBS com aqueles tratados com células-tronco derivadas do tecido
adiposo.
50
Figura 10- Avaliação dos níveis de glutationa total na mucosa intestinal de modelo animal de
doença inflamatória intestinal.
Glutationa
Bra
ncoPBS
Trata
do
0
500
1000
1500
2000
2500
**G
SH
(n
mo
l/g
tecid
o)
Dados expressos em média ± E.P.M. Valores sem letras em comum diferem em p<0.05.
Em se tratando da atividade da mieloperoxidase (MPO), averiguou-se que o
tratamento com células-tronco derivadas do tecido adiposo promoveu uma diminuição
estatisticamente significativa na atividade enzimatíca quando comparada ao grupo controle –
PBS, conforme pode ser verificado na Figura 11.
a
b b
51
Figura 11- Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO) na mucosa intestinal de
modelo animal de doença inflamatória intestinal.
Bra
ncoPBS
Trata
men
to
0
200
400
600
800
1000
***
*
MP
O (
U/g
tecid
o)
Dados expressos em média ± E.P.M. Valores sem letras em comum diferem em p<0.05.
3.4 Análise Histológica
Com a finalidade de avaliar qualitativamente a mucosa intestinal foi realizada a análise
microscópica. A Figura 12 (A) mostra a citoarquitetura normal do colón de um animal sadio,
onde as células estão intactas e se identifica claramente as camadas mucosa, submucosa e
muscular da mucosa e suas respectivas dimensões, sem nenhum tipo de alteração
morfológica. Na figura 12 (B), observa-se o colón de um animal com o processo inflamatório
induzido por TNBS, caracterizado pelo rompimento da mucosa e pela presença de células
alteradas quanto à forma, ao tamanho e ao número em relação aos animais sadios. Nota-se
ainda, um grande infiltrado celular na submucosa, típico da migração de neutrófilos devido ao
processo inflamatório colônico. Conforme apresentado na Figura 12 (C), verifica-se o cólon
de um animal submetido ao tratamento com ASC, onde se detecta um grande infiltrado celular
devido ao processo inflamatório colônico induzido por TNBS. Entretanto, não há rompimento
da mucosa, como claramente observado nos animais tratados com PBS. As células da mucosa
não estão expressivamente alteradas quanto à forma e existe uma nítida recuperação da
citoarquitetura do cólon.
a
b
c
52
Figura 12- Fotomicrografias da mucosa do cólon de ratos após indução de colite ulcerativa
por meio da administração de solução alcoólica de TNBS.
Os cortes foram corados com Hematoxilina-Eosina. (A) Grupo não colítico (branco): histologia do
cólon de um rato não colítico (Aumento de 10X); (B) Grupo controle – PBS: ulceração severa e
infiltração de células inflamatórias na submucosa (Aumento de 10X); (C) Grupo tratado com ASC:
infiltração de células inflamatórias na submucosa (Aumento de 5X). Onde, seta preta: ulceração na
submucosa; seta branca: infiltrado de células inflamatórias.
53
4 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) despontam como uma alternativa
terapêutica promissora para uma série de patologias. A Doença Inflamatória Intestinal (DII)
inclui-se nesse rol de doenças que poderão, eventualmente, se beneficiar da terapia celular
(TC) com células-tronco (CT), considerando-se a capacidade das CT exercerem um papel
imunomodulatório, com supressão ou inibição do processo inflamatório, bem como de
estimulação da angiogênese (Ando et al. 2008; Cheng et al., 2011; Cheng et al. 2012; Dalal et
al., 2012; González et al., 2009; Gonzalez-Rey et al., 2009; Locke et al., 2009; Locke et al.,
2011; Mizuno, 2009; Shigemura et al; 2006; Tanaka et al., 2008).
As ASC utilizadas, no presente estudo, foram identificadas como uma população de
células alongadas com aspecto fusiforme, característico das CTM (Bydlowski et al., 2009;
Dominici et al., 2006; Lennon et al., 2012). Além disso, mostraram capacidade de adesão à
superfície plástica, um dos critérios básicos que caracterizam e definem as CTM, conforme
preconizado pela Sociedade Internacional de Terapia Celular (Dominici et al., 2006).
Além das características citadas, as ASC obtidas e isoladas neste estudo apresentaram,
quando submetidas, em cultura, a condições específicas de indução, a propriedade funcional
de diferenciação “in vitro”, nas linhagens condrogênica, osteogênica e adipogênica,
evidenciada pelas análises histoquímicas apresentadas nas Figuras 5, 6 e 7, coerentemente
com os critérios de validação reportados por vários outros autores (Dominici et al., 2006;
Ando et al., 2008; Bydlowski et al., 2009; Güven et al., 2012; Locke et al., 2011; Ra et al.,
2011).
Vale ressaltar, ainda, que, neste trabalho, empregou-se uma técnica inovadora e inédita
de dissociação mecânica para o isolamento e cultivo das ASC. Comumente, a digestão
enzimática, utilizando colagenase (enzima proteolítica de origem bacteriana), é o
procedimento mais utilizado para obtenção e isolamento das células tronco do tecido adiposo
(Bunnell et al., 2008; Mizuno, 2009; Ren et al., 2012; Zuk et al., 2001, 2002). Deve-se
enfatizar que a dissociação mecânica torna prescindível o uso de colagenase (de origem
bacteriana), tornando o processo menos dispendioso, além de eficiente. Destaca-se ainda, que
a fração estromal do tecido adiposo foi submetida a um procedimento de filtração, por meio
de um filtro de 70 µm, com o propósito de reduzir os adipócitos maduros e restos celulares e
assim, acelerar o processo de adesão e expansão das ASC. Essa variante metodológica,
originalmente proposta por nosso grupo de pesquisa, parece aumentar a eficiência do
processo.
54
O modelo experimental de doença inflamatória intestinal desenvolvido por Morris et al.
(1989) e reproduzido por outros autores mostra que a instilação intraluminal de solução
alcoólica de TNBS resulta em ulcerações, infiltração de leucócitos e formação de granulomas
decorrentes da inflamação na mucosa intestinal (Anderson et al., 2012; Camuesco et al., 2005;
González, 2009; Neurath et al., 2000; Witaicenis et al., 2010; Woodruff et al., 2003).
Witaicenis et al. (2010) relataram que após a administração de TNBS, em ratos da linhagem
Wistar, foi evidenciado necrose severa no cólon, espessamento da parede intestinal,
hiperemia, aumento na relação peso/comprimento do cólon, redução do consumo alimentar,
diminuição da massa corpórea, aumento da atividade da MPO e depleção dos níveis da GSH,
em relação ao grupo não colítico. No presente trabalho, também foram verificados resultados
semelhantes, visto que quando confrontados os resultados das análises “in vivo” (Figuras 8 e
9, Tabela 1), macroscópicas (Tabela 2), bioquímicas (Figuras 10 e 11), observou-se diferenças
significativas entre os grupos branco e colíticos.
Há relatos na literatura que sugerem que as ASC contribuem para o processo de
regeneração da mucosa intestinal em modelos animais e pacientes humanos (Ando et al.,
2008; Dalal et al., 2012; Garcia-Olmo et al., 2005; Garcia-Olmo et al., 2008; Garcia-Olmo et
al., 2009; Gonzalez-Rey et al., 2009; Melmed and Targan, 2010). Corroborando essas
informações, também foram observados resultados favoráveis da terapia com células-tronco
derivadas do tecido adiposo em colite ulcerativa induzida experimentalmente pela
administração intracolônica de solução alcoólica de TNBS.
Está bem estabelecido, que um dos sintomas dos portadores de DII é a redução no peso
corpóreo, visto que há uma diminuição na ingestão de alimentos e ocorrências de distúrbios
gastrintestinais, tais como diarreias e disenterias, na fase ativa da doença (Campos et al.,
2002; Strober et al., 2007). Uma redução no consumo de ração, com consequente
emagrecimento dos animais, após a indução da colite ulcerativa, foi averiguado nos grupos
colíticos. Entretanto, verificou-se que o consumo de alimentos e a diminuição no peso
corpóreo dos animais tratados com ASC foram semelhantes ao do grupo controle – PBS. De
acordo com Morris et al. (1989), o modelo de indução da DII por meio de TNBS/álcool
produz ulceração e espessamento da parede intestinal, sem afetar de forma significativa, a
longo prazo, o aumento do peso dos animais. Sendo assim, infere-se a necessidade de um
maior período para restabelecimento da ingestão alimentar normal e consequentemente
recuperação do peso corpóreo.
Comumente a diarreia desenvolve-se quando há inflamação no cólon e intestino
delgado, resultante da ação de mediadores inflamatórios no epitélio intestinal (Musch et al.,
55
1982; Wardle et al., 1993; Wegmann et al., 2000). A ocorrência deste parâmetro de
observação característico da DII foi verificada em 90% dos animais do grupo tratado com
ASC (Tabela 1), mostrando que após 7 dias de tratamento ainda há uma grande quantidade de
mediadores inflamatórios no cólon. Estes dados remetem à possibilidade que o período para
avaliação da eficácia da terapia celular, como uma alternativa de tratamento para a colite,
deva ser ampliado, além do período de 7 dias, adotado neste estudo.
Outros indicadores da severidade e extensão da lesão decorrente da colite ulcerativa e
da doença de Crohn são o aumento no peso e diminuição no comprimento do cólon inflamado
(Ando et al., 2008; Cestari et al., 2011; Luchini et al., 2008; Morris et al., 1989; Scarminio et
al., 2012; Son et al, 1998). Há uma nítida diferença na média da relação P/C, conforme os
resultados apresentados na Tabela 2. No entanto, não houve diferença estatística significativa
entre os animais tratados com células-tronco em comparação com os animais do grupo
controle (Tabela 2). Este efeito, possivelmente, deve-se à severa lesão causada pela
administração da solução alcoólica de TNBS, dificultando, assim, o processo de regeneração
da mucosa injuriada. Ando et al. (2008) relataram que injeção de ASC diretamente sob a
serosa da submucosa do cólon, diminui significativamente o peso do cólon inflamado. Isto é
um indicativo de que o local e a via de administração das células podem influenciar no
resultado final de um tratamento, conforme reportado por outros autores (Castelo-Branco et
al., 2012; Eggert et al., 1999; Hayashi et al., 2008; Kuo et al., 2008; Strauer, Kornowski,
2003). Neste estudo adotou-se a infusão de ASC por via intravenosa, dessa forma a
divergência dos resultados deste estudo e àquele reportado por Ando et al. (2008), poderia
estar vinculada a diferente via de infusão, adotada no trabalho.
A análise da intensidade da gravidade da DII também é verificada pela extensão e
escore da lesão (Camuesco et al., 2005; Di Stasi et al., 2004; Luchini et al., 2009). Como
apresentado na Tabela 2, os danos causados no cólon em decorrência da infusão de
álcool/TNBS são severos e extensos, o que torna improvável a recuperação da mucosa
intestinal após 7 dias da infusão de ASC. Em 2009, Wei et al., compararam a infusão de
células-tronco hematopoéticas (CTH), células-tronco mesenquimais da medula óssea e uma
mistura de ambos os tipos celulares, em ratos com colite induzida pela administração de
solução alcoólica de TNBS, após 7, 14 e 21 dias. Os autores verificaram que houve redução
no escore da lesão somente no 21° dia. Além disso, esse resultado só foi observado no grupo
tratado com a combinação das CTH e CTM. Sendo assim, é lícito inferir que devido à
intensidade e extensão da lesão, seria necessário ampliar o período de tempo para avaliar a
atuação das células tronco no que concerne à capacidade de redução do processo inflamatório
56
e promover a regeneração do tecido lesado. Outro aspecto a ser considerado, refere-se à
possibilidade de coinfundir CTH e CTM, visto que o efeito sinérgico, dos diferentes tipos
celulares, pode agir de maneira benéfica no tratamento de uma série de patologias (Asari et
al., 2011; Aksu et al., 2008; Koç et al., 2000; Liu et al., 2011; Meuleman et al., 2009).
A presença de aderências entre o cólon e os órgãos e/ou tecidos adjacentes, como
resultado de uma inflamação transmural, é uma característica comum da doença inflamatória
intestinal (Baldassano, Piccoli, 1999; Hoshino et al., 2007; Videla et al., 1994; Vilaseca et al.,
1990). A Tabela 2 mostra que houve uma redução significativa na incidência de aderências
nos animais colíticos e tratados com ASC em relação aos animais do grupo controle – PBS,
sugerindo que as ASC atuaram como um agente protetor e/ou redutor do processo
inflamatório.
A glutationa total, um constituinte do sistema de defesa, tem a capacidade de
desenvolver uma série de funções, entre as quais destacam-se os efeitos antioxidantes,
modulatórios e pró-oxidantes (Perricone et a., 2009). Nota-se que em modelos experimentais
de doença inflamatória intestinal, por meio da instilação de TNBS, há depleção de GSH
decorrente da inflamação colônica (Luchini et al., 2008; Scarminio et al., 2012; Sido et al.,
1998). Conforme observado na Figura 11, não há diferenças estatísticas significativas nos
níveis de GSH, quando confronta-se os dados dos grupos tratados em relação ao controle.
Sendo assim, pode-se verificar que as ASC utilizadas não apresentaram potencial para
promover o aumento nos níveis de GSH. Vale salientar, que não há relatos em humanos e
modelos animais com colite ulcerativa ou doença de Crohn que registrem dosagens dos níveis
de glutationa total após a infusão de células-tronco. Dessa forma, não há elementos
comparativos deste resultado com outros dados da literatura.
Entre as análises bioquímicas, a mieloperoxidase, enzima constituinte dos grânulos
azurófilos de neutrófilos, é uma importante ferramenta para identificar a presença de infiltrado
neutrofílicos, bem como para mostrar a existência de um processo inflamatório em
consequência da doença inflamatória intestinal. Sabe-se que o nível da MPO reflete a
quantidade de neutrófilos e que um decréscimo em sua atividade reflete uma redução da
inflamação em tecido lesado (Krawisz et al., 1984; Saiki, 1998). No presente estudo,
verificou-se que animais colíticos e tratados com ASC apresentaram uma diminuição
estatisticamente significativa da atividade da MPO em relação aos animais tratados com PBS
(Figura 12), mostrando que as ASC podem atuar como um agente antiinflamatório no
tratamento da colite ulcerativa, atenuando o dano causado pela administração de TNBS
(Anderson et al., 2012; Ando et al., 2008; González et al.; 2009).
57
Os resultados obtidos permitem concluir que a infusão de ASC representa um
procedimento seguro e viável, visto que não se constatou efeitos adversos nos animais do
grupo tratado com células-tronco derivadas do tecido adiposo, bem como não houve registro
de óbitos como decorrência direta dos procedimentos experimentais adotados.
A presença de aderências e a determinação da atividade da mieloperoxidase fornecem
indicativos de que as ASC possuem a capacidade de promover e/ou acelerar o processo de
regeneração da mucosa intestinal inflamada. No entanto, novas alternativas e adequações
metodológicas deverão ser inseridas em projetos futuros. Entre as proposições de readequação
metodológica, deverão ser considerados, entre outros aspectos: avaliar a eficácia da terapia
celular por um maior período de tempo; infundir as células por outras vias de administração,
tais como intraperitoneal ou tópica; viabilizar a terapêutica pela coinfusão das ASC em
associação com as CTH.
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