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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
INFECÇÃO EXPERIMENTAL EM SUÍNOS POR Leptospira interrogans
SOROGRUPOS ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA
Adriana da Silva Santos Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito
GOIÂNIA
2014
ii
ADRIANA DA SILVA SANTOS
INFECÇÃO EXPERIMENTAL EM SUÍNOS POR Leptospira interrogans
SOROGRUPOS ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA
Tese apresentada para obtenção do grau de
Doutor em Ciência Animal junto ao Programa
de Pós-Graduação da Escola de Veterinária e
Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Moema Pacheco Chediak Matos (EVZ/UFG)
Prof. Dr. Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura
(EVZ/UFG)
GOIÂNIA
2014
iii
iv
ADRIANA DA SILVA SANTOS
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois sem Sua vontade nada disso seria possível.
Aos meus pais, Hernani e Esmeraldina, pelo amor e apoio incondicional.
Aos familiares e amigos, que independente da distância, sempre
estiveram ao meu lado, me fortalecendo nos momentos mais difíceis dessa jornada.
Ao Prof. Dr. Luiz Augusto Batista Brito que me concedeu a oportunidade
de ingressar no doutorado pelo Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da
Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Obrigada pela
confiança e pelos ensinamentos.
Ao Comitê de Orientação composto pela Prof. Dr. Veridiana Maria
Brianezi Dignani de Moura e Prof. Dr. Moema Pacheco Chediak Matos. Em especial
agradeço a Prof.ª Moema Matos pela amizade e carinho, e por me guiar nesse
mundo acadêmico desde o relatório final na graduação.
Ao Prof. Dr. Jurij Sobestiansky com quem tive a grande oportunidade de
aprender sobre sanidade na suinocultura.
Ao Dr. Marcelo Almeida e à Agroceres Pic pela gentileza em nos doar os
suínos para o experimento.
Ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas da Faculdade de Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo, em especial ao Prof. Dr. Sílvio Arruda
Vasconcellos e à técnica de laboratório Zenaide Maria de Morais, por cederem as
cepas bacterianas, pela calorosa acolhida e por compartilharem comigo de seus
vastos conhecimentos acerca da leptospirose.
Ao Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, em especial à Prof. Dr.
Valéria de Sá Jayme, por possibilitar a execução dos testes de soroaglutinação
microscópica, isolamento bacteriano e reação em cadeia da polimerase.
Aos coautores desse trabalho, meus braços direito e esquerdo durante o
experimento, Adriana Faria, Helton Oliveira, Hugo Ferreira, Sílvia Carneiro, Thaís
Freitas e Victor Garcia. Obrigada pela amizade e paciência, serei sempre grata pelo
auxílio.
Aos amigos do Setor de Patologia Animal que compartilharam das
alegrias e dificuldades de se estar em uma pós-graduação, além dos “pepinos” e
casos legais que são inerentes a um laboratório de patologia.
vi
À Prof. Dr. Ana Paula Santin e Prof. Dr. Regiane Porto pelo incentivo e
ajuda nesses quatro anos.
Aos técnicos do Laboratório de Histologia do Setor de Patologia Animal,
Antônio Souza da Silva e Lorena Cintra, pela amizade e aprendizado nesses últimos
anos.
Aos colegas e dirigentes do Instituto Federal Goiano Câmpus Urutaí pela
ajuda nestes últimos semestres, permitindo a finalização deste projeto dentro do
tempo predeterminado.
Ao Programa de Pós-Graduação da Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás pelas boas condições fornecidas para a realização
deste estudo.
À Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
por ser minha casa durante a graduação e o doutorado, estando sempre de portas
abertas a quem almeja conhecimento.
Ao CNPQ pela concessão da bolsa de pesquisa.
Enfim, a todos que contribuíram de maneira direta ou indireta, para
finalização de mais uma etapa acadêmica.
Meus sinceros agradecimentos.
vii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS .............................................................. 1
1 Introdução ................................................................................................................ 1
2 Leptospirose Suína .................................................................................................. 2
2.1 Agente etiológico ................................................................................................... 2
2.2 Epidemiologia ........................................................................................................ 5
2.3 Patogênese ........................................................................................................... 9
2.4 Alterações clínicas .............................................................................................. 13
2.5 Diagnóstico .......................................................................................................... 15
2.6 Controle e profilaxia ............................................................................................ 21
2.7 Importância em Saúde Pública ............................................................................ 22
3 Objetivos ................................................................................................................ 23
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 24
CAPÍTULO 2 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E SOROLÓGICAS DA INFECÇÃO
AGUDA EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans SOROGRUPOS
ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA EM FÊMEAS SUÍNAS ............................ 32
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DA INFECÇÃO AGUDA
EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans EM FEMEAS SUÍNAS ................... 555
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 72
viii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
FIGURA 1 - Fotomicrografia eletrônica mostrando a morfologia espiralada e
terminação em formato de gancho da Leptospira interrogans .................................... 3
FIGURA 2 - Diagrama esquemático demonstrando os principais fatores de virulência
das bactérias Gram-negativas. Nota-se o detalhe da parede celular representado no
esquema inferior. LPS: lipopolissacarídeo. ................................................................. 4
FIGURA 3 - Esquema ilustrativo da cronologia da infecção por Leptospira spp. em
diferentes estados imunológicos do hospedeiro. ....................................................... 11
FIGURA 4 - Rim, suíno: múltiplos pontos brancos apresentando distribuição aleatória
e bilateral na superfície cortical. ................................................................................ 14
CAPÍTULO 2 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E SOROLÓGICAS DA INFECÇÃO
AGUDA EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans SOROGRUPOS
ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA EM FÊMEAS SUÍNAS
FIGURA 1 – Ilustração do padrão de identificação individual utilizada dentro dos
grupos. ...................................................................................................................... 36
FIGURA 2 - A. Observa-se a tela cobrindo a área superior da baia. B. Vista frontal
da baia. A seta indica a placa metálica sobre a canaleta de escoamento de
resíduos..................................................................................................................... 37
FIGURA 3 – Equipamentos de proteção individual utilizados durante período
experimental. ............................................................................................................. 38
FIGURA 4 – Inoculação de 5mL de suspensão de cultivo contendo Leptospira
interrogans sorovar Pomona, via intraperitoneal em suíno. ...................................... 39
FIGURA 5 – A. Monitoramento da temperatura corporal de um suíno durante o
exame clínico diário. B. Punção venosa jugular e utilização do cachimbo. ............... 40
FIGURA 6 – Suíno G II-4, 2 dpi: animal apático, isolado do grupo e buscando a luz
solar na baia. ............................................................................................................. 45
FIGURA 7 - Reação em Cadeia da Polimerase Clássica (PCR). Eletroforese em gel
de agarose de amostras de soros negativas ao 6º dpi dos GII (1 a 6) e GII (7-9),
ix
testadas para amplificação do fragmento de 242 pb pelo oligonucleotídeo lipL32. C-:
controle negativo; C+: controle positivo; M: marcador de peso molecular (1Kb Plus
DNA Ladder, Invitrogen®,Life Technologies).............................................................45
FIGURA 8 – Rim de suíno do GII com superfície cortical pálida. ............................ 477
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DA INFECÇÃO AGUDA
EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans EM FEMEAS SUÍNAS
FIGURA 1- Rim, suíno: nefrose tubular aguda e difusa, caracterizada por
degeneração das células tubulares, contendo no lúmem material eosinofílico hialino
(HE, 40X)................................................................................................................... 60
FIGURA 2 – Rim, suíno, nefrite intersticial mononuclear: A. Infiltrado de plasmócitos
e linfócitos peritubular discreto (HE, 20X). B. Infiltrado de linfócitos e plasmócitos
peritubular acentuado (HE, 10X). .............................................................................. 61
FIGURA 3 – Fígado, suíno: Infiltrado discreto de linfócitos e em menor número de
plasmócitos entre os hepatócitos adjacentes à veia centrolobular (zona III). (HE,
20X). .......................................................................................................................... 62
FIGURA 4 - Pulmão, suíno: Pneumonia intersticial mononuclear multifocal discreta.
Observe o infiltrado de plasmócitos e linfócitos em bronquíolos terminais (seta) e em
alvéolos (HE, 20X). ................................................................................................... 63
FIGURA 5 – Suíno. A. Linfonodo mesentérico com hiperplasia linfoide difusa e
acentuada, caracterizada por aspecto homogêneo sendo impossível distinguir os
folículos linfoides (HE, 5X). B. Córtex cerebral proliferação focal discreto da micróglia
(microgliose focal discreta) (HE, 10X). ...................................................................... 63
x
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E SOROLÓGICAS DA INFECÇÃO
AGUDA EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans SOROGRUPOS
ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA EM FÊMEAS SUÍNAS
TABELA 1 - Distribuição das titulações individuais dos animais dos grupos GII e GIII,
inoculados respectivamente com estirpes dos sorogrupos Pomona e
Icterohaemorrhagiae no 3º, 6º e 9º dpi. ................................................................... 466
TABELA 2 - Associação entre animais positivos e negativos na SAM com a presença
ou não de palidez renal à necropsia. ....................................................................... 477
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DA INFECÇÃO AGUDA
EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans EM FEMEAS SUÍNAS
TABELA 1 - Distribuição da frequência de lesões histopatológicas e da
soroaglutinação microscópica (SAM) em suínos experimentalmente infectados por
Leptospira interrogans. .............................................................................................. 59
TABELA 2 - Associação entre o diagnóstico histopatológico e sorologia na SAM em
cérebro, fígado, linfonodos, pulmão e rim de animais experimentalmente infectados
com Leptospira interrogans .......................................................................................65
xi
RESUMO
A leptospirose suína é uma antropozoonose difundida mundialmente e causada por
espiroquetas da espécie Leptospira interrogans, principalmente pelos sorovares
Pomona, Icterohaemorrhagiae, Taravossi, Canicola, Grippotyphosa e Bratislava.
Neste trabalho descreve-se a infecção experimental por L. interrogans sorogrupo
Icterohaemorrhagiae sorovar Conpenhageni estirpe Fiocruz L1-130, e sorogrupo
Pomona sorovar Kennewicki estirpe Pomona From, em 18 fêmeas suínas com 40
dias de idade divididas em três grupos: GI (controle), GII (inoculados com sorogrupo
Pomona) e GIII (inoculados com sorogrupo Icterohaemorrhagiae). Compararam-se
entre os grupos, o curso clínico da doença, os resultados dos exames sorológicos e
de detecção da bactéria durante o período experimental pelas técnicas de reação
em cadeia da polimerase (PCR) e isolamento bacteriano. Foram ainda descritas as
principais alterações histológicas observadas em cérebro, fígado, linfonodos, pulmão
e rins de 12 animais experimentalmente infectados e soropositivos para leptospirose.
Em lesões sugestivas da doença utilizou-se a técnica de impregnação pela prata de
Warthin-Starry, como método de detecção direta. Durante o período experimental
foram negativas na soroaglutinação microscópica todas as amostras do GI
(controle), havendo no GII positividade exclusiva ao sorogrupo Pomona nos seis
animais a partir do 6º dia pós-infecção (dpi), e no GIII, apenas ao sorogrupo
Icterohaemorrhagiae, em cinco animais a partir do 3º dpi. Na necropsia a única
alteração observada foi rim pálido em 50% do G I, 83,33% do GII e em 83,33% GIII
(p>0,05). Somente nos suínos soropositivos constataram-se lesões sugestivas de
leptospirose, como microgliose mononuclear focal no cérebro (8,33%), hiperplasia
linfoide em linfonodos do mediastino e mesentério (41,66%), pneumonia intersticial
mononuclear multifocal (58,33%), hepatite mononuclear focal (41,66%), além de
nefrose tubular aguda (100%) e nefrite intersticial (91,66%). Houve forte associação
entre a condição sorológica e as lesões de hepatite mononuclear (p=0,0128), nefrite
intersticial mononuclear (p=0,0004), nefrose tubular (p<0,0001) e pneumonia
intersticial mononuclear (p=0,0377).
Palavras-chave: estirpe Fiocruz L1-130, estirpe LPF, leptospirose suína, lesão renal,
soroaglutinação microscópica.
xii
ABSTRACT
Swine leptospirosis is a worldwide anthropozoonosis caused by spirochetes of the
species Leptospira interrogans, predominantly by serovars Pomona,
Icterohaemorrhagiae, Taravossi, Canicola Grippotyphosa and Bratislava.
Experimental infection were performed in 18 sows at 40 days of age with L.
interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Conpenhageni strain Fiocruz L1-
130, and serogroup Pomona serovar Kennewicki strain Pomona From divided in
groups: GI (control), GII (inoculated with serogroup Pomona) and GIII (inoculated
with serogroup Icterohaemorrhagiae). Clinical course of the disease, results of
serological tests and detection of bacteria by polymerase chain reaction (PCR) and
bacterial isolation during the experiment, were compared between groups.
Additionally, the main histological changes observed in brain, liver, lymph nodes,
lung and kidney of 12 animals experimentally infected and seropositive for
leptospirosis were described. In lesions suggestive of the disease the technique of
silver impregnation of Warthin-Starry, was used as direct detection method. During
the experimental period, all samples of the GI (control) were negative in the
microscopic agglutination test, with the GII positivity exclusive to serogroup Pomona
in six animals from 6 dpi, and in GIII, only to serogroup Icterohaemorrhagiae in five
animals from 3 dpi. At necropsy the only change was pale kidney in 50% of GI,
83.33% of GII and 83.33% of GIII (p> 0.05). Only in seropositive pigs was found
lesions suggestive of leptospirosis as focal microgliosis in the brain (8.33%),
lymphoid hyperplasia in lymph nodes of the mediastinum and mesentery (41.66%),
mononuclear interstitial pneumonia (58.33 %), multifocal mononuclear hepatitis,
further acute tubular nephrosis (100%) and interstitial nephritis (91.66%). There was
a strong association between serological condition and lesions of mononuclear
hepatitis (p = 0.0128), mononuclear interstitial nephritis (p = 0.0004), tubular
nephrosis (p <0.0001) and mononuclear interstitial pneumonia (p = 0, 0377).
Keywords: microscopic agglutination test, renal injury, strain Fiocruz L1-130, strain
LPF, swine leptospirosis.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 Introdução
A ordem Spirochaetales inclui importantes patógenos de interesse na
medicina e medicina veterinária, como os agentes causais da doença de Lyme, da
sífilis e da leptospirose. Leptospira, do prefixo grego leptos que significa delgado e
do latim spira espiral, é um gênero de bactérias, cujo isolamento ocorreu pela
primeira vez em 1907, em tecido renal de um paciente com suspeita clínica de morte
por febre amarela. Entretanto, em 1886, o alemão Adolf Weil já havia descrito a
leptospirose como uma doença infecciosa caracterizada por icterícia (LEVETT,
2001; SHARMA & YADAV, 2008; MUSSO & LASCOLA, 2013).
O termo leptospirose deve ser usado para descrever as infecções por
Leptospira, tanto em humanos quanto em animais (SHARMA & YADAV, 2008).
Trata-se de uma doença de distribuição mundial, que constitui sério problema de
Saúde Pública, por apresentar ampla variedade de hospedeiros, incluindo o homem,
grande número de mamíferos de vida livre, animais domésticos, anfíbios e répteis
(MCBRIDE et al., 2005; CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009), sendo assim, de
notificação obrigatória segunda a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE,
2014). A distribuição geográfica da doença é influenciada por fatores climáticos tais
como altas temperaturas e índices pluviométricos, além do risco de exposição do
hospedeiro e presença de animais reservatórios domésticos e silvestres (SHARMA
& YADAV, 2008; SYKES et al., 2011).
Os vários sorovares possuem hospedeiros específicos, denominados
portadores ou mantenedores, que são fontes de infecção para os hospedeiros
acidentais. Nesses hospedeiros a bactéria infecta cronicamente os túbulos renais,
sendo excretadas na urina por longos períodos (HUNTER, 2004).
As infecções em animais domésticos estão associadas a diferentes
síndromes, incluindo alterações hemolíticas, lesões hepáticas, nefrite intersticial
crônica, mastite, abortos e, em equinos, uveítes recorrentes (PRESCOTT, 2007;
MONAHAN et al., 2009). Em humanos são descritos principalmente, quadros
2
hemorrágicos, alterações pulmonares, insuficiência renal e hepática (MERIEN et al.,
1998; ADLER & MOCTEZUMA, 2010; ARAÚJO et al., 2010).
Os suínos têm sido apontados como os mais importantes animais
domésticos portadores da doença, pois neles geralmente as manifestações clínicas
variam de discretas a ausentes, o que dificulta a identificação da infecção na granja.
Adicionalmente à importância econômica, a leptospirose suína é uma importante
zoonose de alto risco ocupacional, uma vez que atingem várias categorias
profissionais, principalmente médicos veterinários, magarefes, e funcionários de
granjas suínas que estão frequentemente sujeitos ao contato direto com o agente
(CAMPOS et al., 2011; GONÇALVES & COSTA, 2011; GUERRA, 2013; WILSON &
SWAI, 2013; OLIVEIRA et al., 2013).
2 Leptospirose Suína
2.1 Agente etiológico
A leptospirose suína é uma doença causada por espiroquetas
pertencentes ao gênero Leptospira que são morfologicamente similares, contudo
antigenicamente e geneticamente distintas (ELLIS, 2012). As leptospiras são
bactérias aeróbias obrigatórias com temperaturas ótimas de crescimento entre 28-
30ºC (LEVETT, 2001). Possuem 0,1µm de diâmetro, 6-20 µm de comprimento e dois
flagelos, um em cada extremidade, que se encontram imersos no espaço
periplasmático, ao contrário do que ocorre com a maioria das bactérias. A rotação
destes flagelos induz alterações morfológicas, como o característico formato de
gancho visualizado na Figura 1, que permitem a mobilidade dessas bactérias em
ambientes aquosos ou mesmo com consistência gelatinosa (LEVETT, 2001;
BARTHI et al., 2003).
As bactérias do gênero Leptospira são subdividas segundo suas
características genotípicas, em 22 espécies: L. biflexa, L. meyeri, L. wolbachii, L.
yanagawae, L. kmetyi, L. vanthielii, L. borgpetersenii, L. alexanderi, L. interrogans, L.
kirschneri, L. noguchii, L. santarosai, L. weilii, L. wolffii, L. alstonii, L. fainei, L. inadai,
3
L. licerasiae, L. idonii, L. parva, L. broomii e L. terpstrae (BARTHI et al., 2003,
ADLER & MOCTEZUMA, 2010; ZAKERI et al., 2010; DSMZ, 2014).
FIGURA 1 - Fotomicrografia eletrônica mostrando a morfologia espiralada e
terminação em formato de gancho da Leptospira interrogans
Fonte: MUSSO & LASCOLA (2013).
Como integrantes do grupo de bactérias Gram-negativas, as leptospiras
possuem uma parede celular externa rica em lipopolissacarídeos (LPS), cuja
variação determina os distintos sorovares existentes (SHARMA & YADAV, 2008;
ADLER & MOCTEZUMA, 2010). Adicionalmente, os LPS juntamente com outras
proteínas de membrana constituem os principais fatores de virulência existentes nas
bactérias Gram-negativas, como demonstrados na Figura 2.
4
FIGURA 2 - Diagrama esquemático demonstrando os principais fatores de virulência das
bactérias Gram-negativas. Nota-se detalhe da parede celular representado
no esquema inferior. LPS: lipopolissacarídeo
Fonte: Adaptado de Wu et al. (2008)
De acordo com a heterogeneidade dos carboidratos que compõem os
LPS de membrana, estas bactérias são ainda categorizadas em sorovares
(CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009). Sorovares antigenicamente relacionados pelo
teste de adsorção de aglutinação cruzada compõem os sorogrupos. Entretanto, há
pouca correlação entre a classificação sorológica e a genotípica. Diferentes
sorovares podem pertencer a uma ou mais espécies, e membros de um mesmo
grupo genético não necessariamente pertencem ao mesmo sorogrupo (BARTHI et
al., 2003). Por exemplo, cepas de L. hardjo pertencem tanto à espécie L. interrogans
como as L. borgpetersenii e L. meyeri. Tal fato segundo BRENNER et al. (1999),
pode explicar a ocorrência de diferentes síndromes clínicas por um mesmo sorovar.
O Quadro 1, exemplifica a classificação em espécies, sorogrupo e
sorovares, citando as cepas de referência de espécies patogênicas descritas do
gênero Leptospira, frequentemente utilizadas em estudos experimentais.
5
QUADRO 1 - Cepas de referência de espécies patogênicas descritas de Leptospira.
Espécie Sorogrupo Sorovar Cepa
L. interrogans Pomona Kennewicki Pomona From (LPF)
L. interrogans Icterohaemorrhagiae Copenhageni Fiocruz L1-130
L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V
L. noguchii Panama Panama CZ 214 k
L. borgpetersenii Sejroe Sejroe M84
L. weilii Celledoni Celledoni Celledoni
L. santarosai Tarassovi Atlantae LT81
L. alexanderi Manhao Manhao 3 LT 60
L. alstonii ND Sichuan 79,601
L. kmetyi ND ND Bejo-Iso 9
ND: não determinado
Fonte: Adaptado de PICARDEAU (2013).
2.2 Epidemiologia
A leptospirose suína é uma doença de notificação obrigatória, classificada
na lista da Organização Mundial de Saúde Animal como “Doenças, Infecções e
Infestações Comuns a Múltiplas Espécies”. Grupo ao qual pertencem as doenças
transmissíveis de grande importância do ponto de vista socioeconômico e/ou
sanitário, com considerável repercussão no comércio internacional de animais e
produtos de origem animal (OIE, 2014).
No Brasil, de acordo com normativa do Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (BRASIL, 2002) para garantira classificação em Granjas de
Reprodutores Suídeos Certificadas (GRSC), a granja candidata deve ser livre de
peste suína clássica, doença de Aujeszky, brucelose, tuberculose, sarna e livre ou
controlada, mediante vacinação, para leptospirose.
A infecção em suínos vem sendo descrita mundialmente, e no Brasil, tem-
se registros nos estados de São Paulo, Rio Grande do Sul, Paraná, Santa Catarina,
Minas Gerais, Goiás, Rio de Janeiro, Ceará, Pernambuco, Bahia e Piauí (FAVERO
6
et al., 2002; SHIMABUKURO et al., 2003; SOTO et al., 2007; GONÇALVES &
COSTA, 2011).
Os diferentes sorovares de L. interrogans possuem afinidades específicas
para animais hospedeiros, onde são reconhecidas duas categorias distintas:
hospedeiro acidental onde há infecção por sorovares não adaptados e o hospedeiro
mantenedor ou reservatório quando o animal foi infectado por um sorovar adaptado
ao seu organismo (HUNTER, 2004; RADOSTITS et al., 2006). Nos hospedeiros
reservatórios, as bactérias localizam-se na luz dos túbulos renais e podem ser
excretadas vivas na urina por várias semanas ou meses, sendo fonte de infecção
para o homem e animais domésticos (OLIVEIRA, 2007).
Mundialmente, os principais sorovares de leptospiras encontrados
infectando e causando doença em suínos são: Pomona, Icterohaemorrhagiae,
Taravossi, Canicola, Grippotyphosa e Bratislava (HUNTER, 2004; ADLER &
MOCTEZUMA, 2010; WASIŃSKI & PEJSAK, 2010; ELLIS, 2012; ROMERO-VIVAS
et al., 2013).
A prevalência de diferentes sorovares de leptospira em uma população
depende dos reservatórios animais presentes nessa região e dos sorovares que eles
albergam (OLIVEIRA et al., 2013). Em diferentes estados brasileiros, estudos de
prevalência indicam a frequência dos sorovares Autumnalis, Copenhageni, Hardjo e
Wolffii (SOUZA, 2000; RAMOS & LILENBAUM, 2002; FREITAS et al., 2004;
HASCHIMOTO et al., 2008; GONÇALVES, 2009; OSAVA et al.; 2010; SILVA et al,
2010; CAMPOS et al., 2011; RAUBER-JUNIOR et al., 2011). Outros sorovares são
descritos em estudo retrospectivo de exames sorológicos efetuados em suínos com
suspeita clínica de leptospirose, como os sorovares Grippotyphosa e
Icterohaemorrhagiae em Minas Gerais; Pomona, no Rio Grande do Sul; Pomona e
Icterohaemorrhagiae, em Pernambuco e Rio de Janeiro; Autumnalis, no Ceará; e
Icterohaemorrhagiae em Goiás, Paraná, Santa Catarina e São Paulo, todos
identificados por FAVERO et al. (2002).
Em Goiás, em estudo da prevalência de Leptospira interrogans em
reprodutores suínos, SOUZA (2000) encontrou prevalência de 65,16%, com
preponderância do sorovar Icterohaemorrhagiae. Para alguns autores como
SHARMA & YADAV (2008) e ELLIS (2012) os suínos são considerados
reservatórios para os sorovares Pomona, Tarassovi e Bratislava. A estes
7
reservatórios é atribuída a maior parcela de contribuição pela manutenção dos focos
de leptospirose, tendo em vista a longa duração dessa condição e a ampla facilidade
de deslocamento atribuída a estes animais, uma vez que os mesmos podem não
apresentar sinais da infecção (OLIVEIRA et al., 2013).
Segundo OLIVEIRA (2007), suínos infectados podem eliminar na urina
grande quantidade de leptospiras por longo período entre 30 a 60 dias após a
infecção, servindo de fonte de transmissão da doença na granja. Roedores e
animais silvestres também atuam como portadores da doença podendo transmitir
aos suínos e ao homem, principalmente, sorovares do sorogrupo
Icterohaemorragiae (SHARMA & YADAV, 2008; ADLER & MOCTEZUMA, 2010;
SILVA et al., 2010; MAJETIC et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2013).
Dentre as principais vias de infecção da leptospirose em suínos destaca-
se a ingestão de água e alimentos contaminados pela urina, fetos abortados e
descargas uterinas de animais portadores (ADLER & MOCTEZUMA, 2010). As
espiroquetas podem também penetrar no organismo através das mucosas, da pele
íntegra imersa em água ou da pele com solução de continuidade (LEVETT, 2001).
A transmissão da leptospirose depende das condições que favoreçam a
sobrevivência do microrganismo no ambiente, do número de animais portadores na
população e do período pelo qual o animal elimina a bactéria (HUNTER, 2004).
Diversos fatores de risco podem estar associados à transmissão da doença entre
suínos, e destes para outros animais, incluindo o homem. Dentre esses fatores
destacam aqueles que aumentam a viabilidade das bactérias no ambiente. Alguns
estudos experimentais confirmam que as leptospiras podem ficar até 180 dias
viáveis no ambiente com condições ideais de pH, umidade e proteção a raios
solares. Já verificou-se que o sorovar Pomona pode resistir até seis meses em solos
saturados de umidade, entretanto, em solos secos sua sobrevida cai para 30
minutos (SOTO et al., 2007). Sendo assim, a ocorrência da leptospirose tem forte
associação com fatores climáticos.
Segundo a pesquisa de BOQVIST et al. (2012), realizada em sistemas de
criações ao ar livre, para cada milímetro extra de chuva, houve aumento significativo
na soropositividade dos animais à Leptospira spp. Entretanto os pesquisadores não
encontraram essa mesma correlação em relação à temperatura. Em regiões de
clima seco, infecções acidentais ocorrem próximas a águas represadas com alta
8
concentração de animais (OLIVEIRA et al., 2013). Para DELBEM et al. (2004), a
presença de água estagnada próximo às baias dos suínos seria a principal via de
transmissão da leptospirose.
Sobre a sazonalidade da infecção, estudo realizado por JUNG et al.
(2009) em 20 granjas comerciais, constatou aumento significativamente maior no
número de suínos positivos para leptospirose no verão, demonstrando que, neste
período de altas temperaturas e umidade, há maior risco de infecção do suíno pelas
leptospiras. Entretanto, BORDIN (2010) avaliando casos de falhas reprodutivas em
granjas suínas no Brasil, observou maior frequência de animais positivos durante o
outono e inverno.
Com relação à predisposição etária, JUNG et al. (2009) também
destacaram correlação positiva entre animais de terminação e soropositividade.
Acredita-se que tal fato se deva a ausência de antibióticos na ração de suínos nessa
fase.
Os sistemas de manejo adotados igualmente influenciam na transmissão
da doença. Em granjas com sistema de quarentena, VALENÇA et al. (2013)
encontraram baixa prevalência de infecção quando comparado às granjas onde esse
sistema não ocorre. Isto pode ser atribuído à adoção de medidas sanitárias
preventivas, como imunização dos reprodutores antes de introduzi-los no plantel.
Para MORÉS (1999), a introdução da doença em uma granja ocorre principalmente
pela aquisição de reprodutores oriundos de granjas ou de exposições de animais,
onde a leptospirose pode estar presente. Além dos veículos e visitantes que também
podem ser um meio comum de transmissão da leptospirose suína.
De acordo com DELBEM et al. (2002) são fatores de risco à infecção, a
ausência de medidas de controle de roedores nas granjas que podem aumentar em
7,8 vezes as chances de infecção, pois tais animais são reservatórios principalmente
pra o sorovar Icterohaemorrhagiae. No Brasil, a alta frequência do sorovar
Icterohaemorrhagiae em relação ao Pomona, tradicionalmente diagnosticado como
prevalente em suínos, é atribuída por FAVERO et al. (2002) às falhas no controle de
roedores em granjas nacionais.
A presença de fêmeas reprodutoras positivas por L. interrogans sorovar
Icterohaemorrhagiae é citada por NETO et al. (1997) como importante fator de risco
para o nascimento de leitões fracos. SOTO et al. (2006) demostraram a transmissão
9
vertical pela detecção de L. interrogans sorovar Canicola em leitões clinicamente
saudáveis nascidos de matrizes infectadas experimentalmente, ressaltando que a
manutenção de animais com infecção subclínica pode permitir a persistência da
bactéria no rebanho, expondo outros animais ao risco de infecção
Acerca do manejo reprodutivo, FAINE et al. (1999) demonstraram
transmissão venérea associada a utilização de reprodutores infectados pelos
sorovares Bratislava e Pomona. Entretanto, ALTHOUSE & ROSSOW (2011)
descrevem que a leptospirose é considerada uma doença cujo agente etiológico já
foi isolado do sêmen de suínos, porém sem risco de infecção via inseminação
artificial. Desta forma, há ainda muita controvérsia em relação à forma venérea de
transmissão em suínos, diferentemente do observado em ruminantes e equinos,
onde tal forma já foi demonstrada (LILENBAUM et al, 2008; VINODH et al., 2008;
HAMOND et al., 2013).
2.3 Patogênese
As pesquisas nos últimos anos têm contribuído para a elucidação da
patogenia da infecção por bactérias do gênero Leptospira. No entanto, muitos
questionamentos acerca da doença ainda precisam ser esclarecidos. Por exemplo, a
razão pelo qual alguns hospedeiros apresentam graves manifestações clínicas
enquanto outros podem ser assintomáticos, ainda é desconhecida. Mas tal fato pode
estar relacionado tanto a fatores dependentes da bactéria como do próprio
hospedeiro (GARCÍA-VÁZQUEZ et al., 2010).
A habilidade de uma bactéria patogênica em causar doença em um
hospedeiro suscetível é determinada por múltiplos fatores de virulência que agem
individualmente ou em conjunto em diferentes estágios da infecção. Tais fatores
geralmente estão envolvidos em interações diretas com o tecido do hospedeiro ou
em mecanismos de evasão ao sistema imunológico hospedeiro (MERIEN et al.
1997; CINCO et al., 2002; CHEN et al.; 2005, MERI et al.; 2005).
Fatores de virulência de bactérias Gram-negativas podem ser divididos
em grupos de acordo com suas funções e mecanismos de virulência. Assim, há as
proteínas de membrana que exercem função de adesão, colonização e invasão,
10
promovem a comunicação intercelular e são responsáveis pela resistência aos
antibióticos; os LPS da parede celular com propriedades antifagocíticas; e as
proteínas secretadas, como as toxinas, que modificam o ambiente celular do
hospedeiro e possibilitam algumas interações entre a célula hospedeira e a bactéria
(HAAKE, 2000; MATSUNAGA et al., 2003; WU et al., 2008; CONFER & AYALEW,
2013).
O fato das leptospiras penetrarem no organismo hospedeiro por abrasões
na pele e mucosas intactas, disseminando-se rapidamente para outros tecidos em
um curto período após infecção é atribuído por LI et al. (2007) a capacidade de
translocação celular destas bactérias. Para BAROCHI et al. (2002) esta habilidade
das leptospiras em passar pelas células seria um facilitador a disseminação do
microrganismo antes que fossem reconhecidas pelo sistema imunológico do animal.
Após a replicação no sítio primário, as bactérias atingem a corrente
sanguínea e esta fase coincide com o desenvolvimento de apatia e febre no
hospedeiro. Posteriormente, elas podem colonizar os pulmões, fígado, sistema
nervoso central, rins, olhos e trato genital. Os sinais clínicos, que são vistos após um
período de incubação entre 2º e 16º dias, são dependentes do sítio de localização
da bactéria no organismo (HUNTER, 2004).
Aumentos nos níveis de anticorpos conseguem debelar a infecção na
maioria dos órgãos, entretanto as espiroquetas podem persistir nos rins e serem
excretadas na urina por semanas ou meses. A extensão da lesão nos órgãos é
variável e está sujeita à suscetibilidade do hospedeiro e à virulência da bactéria.
Alguns sorovares são propensos a produzir hemorragia aguda, lesões hepáticas ou
mais comumente lesões renais (LEVETT, 2001; GREENE et al., 2006; ADLER &
MOCTEZUMA, 2010; GARCÍA-VÁZQUEZ et al., 2010).
A Figura 3 esquematiza cronologicamente, as principais etapas da
patogênese da leptospirose frente aos diferentes níveis de anticorpos específicos no
hospedeiro.
As leptospiras alcançam o interstício renal por via hematógena durante a
fase denominada de intersticial. Esta fase coincide com a leptospiremia e
caracteriza-se por alterações vasculares incluindo edema, hiperemia e tumefação
endotelial. Posteriormente, segue-se a fase tubular, onde as bactérias podem ser
visualizadas no lúmen dos túbulos contorcidos proximais (CHEVILLE et al., 1980).
11
De acordo com o hospedeiro infectado, há diferenças nos mecanismos
pelos quais ocorrem as alterações renais na leptospirose. A infecção do hospedeiro
reservatório ou mantenedor geralmente é crônica e assintomática. Em contrapartida,
a infecção do hospedeiro acidental é aguda e cursa com diferentes sinais clínicos.
Sugerindo assim, que nos primeiros, a colonização dos túbulos renais ocorre sem
significantes danos teciduais ou sem a estimulação do sistema imunológico local
(MONAHAN et al., 2009).
FIGURA 3 - Esquema ilustrativo da cronologia da infecção por Leptospira spp. em
diferentes estados imunológicos do hospedeiro.
Fonte: Adaptado de GREENE et al. (2006).
A nefrite intersticial multifocal a difusa, principal alteração observada na
fase crônica, é constituída por infiltrado inflamatório, principalmente no interstício da
região dos túbulos contorcidos distais e proximais, composto predominantemente
por linfócitos e discretos agregados de macrófagos (PRESCOTT, 2007).
Em humanos, há uma predisposição genética à leptospirose aguda,
associada com diferenças alélicas que alteram os receptores do complexo principal
de histocompatibilidade (MHC). O MHC de classe II (MHC II) representam moléculas
12
transmembrânicas necessárias para a apresentação de antígenos aos linfócitos
auxiliares. Assim, são normalmente encontradas em células apresentadoras de
antígeno (APCs), como as células dendríticas, macrófagos e linfócitos B. Entretanto,
a expressão de MHC II também ocorrem em células epiteliais, incluindo as células
dos túbulos renais, que podem funcionar como APCs não profissionais (MONAHAN
et al., 2009).
No estudo da patogenia da leptospirose suína, RADAELLI et al. (2009)
constataram marcada variabilidade na expressão e distribuição do MHC II durante a
fase de nefrite intersticial crônica. Os autores não verificaram expressão de MHC II
em túbulos renais contendo leptospiras, enquanto nos túbulos adjacentes e sem
colonização bacteriana houve graus variados de expressão desse receptor. Os
pesquisadores concluíram que nos túbulos positivos para expressão de MHC II, mas
livres da Leptospira, a resposta imune já teria debelado a infecção. Nas células
renais positivas para MHC II a ativação de linfócitos T auxiliares peritubulares
induziria a produção de citocinas pró-inflamatórias, que contribuiriam com resposta
imunológica anti-Leptospira spp.
As leptospiras também podem se localizar no útero de porcas prenhes,
causando frequentemente abortos, natimortalidade e doença neonatal (BORDIN,
2010). A doença neonatal por seu turno, geralmente resulta da infecção no último
terço do período gestacional. A patogênese da doença reprodutiva é pouco
estudada, mas alguns autores acreditam que a infecção transplacentária ocorra
durante o período limitado da leptospiremia materna (RADOSTITS et al., 2006;
ELLIS, 2012).
Em leitões pode ocorrer a forma hemorrágica, caracterizada por
hemoglobinúria e icterícia, particularmente em infecções pelo sorovar
Icterohaemorrhagiae (OSAVA et al., 2010; ELLIS, 2012). Lesões do endotélio
vascular geralmente são observadas nas fases iniciais da leptospirose. Petéquias
multifocais podem ocorrer em diversos órgãos e tecidos de humanos e animais. A
vasculite parece afetar primariamente os capilares, o que explica a maior severidade
das lesões em órgãos como o fígado, rim e pulmão. As alterações vasculares podem
romper a integridade vascular, gerando aumento na permeabilidade das células
endoteliais. Entretanto, os mecanismos pelos quais bactérias do gênero Leptospira
13
causam a doença vascular ainda estão pouco elucidados (ADLER & MOCTEZUMA,
2010).
2.4 Alterações clínicas
De modo geral, a leptospirose em suínos é de curso crônico, assintomática,
podendo se manter no rebanho silenciosamente por longos períodos. O sorovar
Pomona geralmente causa infecções discretas a inaparentes, sendo também
associado à nefrite intersticial crônica, identificada somente durante o abate, como
pontos brancos (white spots) na superfície cortical renal (Figura 4). Porém, tal
infecção subclínica também pode ser observada por outros sorovares.
SHIMABUKURO et al. (2003) e HASCHIMOTO et al. (2008) identificaram lesão renal
em suínos positivos, principalmente para o sorovar Icterohaemorragiae.
Quando há manifestação clínica, esta caracteriza-se, principalmente, por
transtornos reprodutivos, como retorno ao cio nas primeiras semanas de gestação,
descargas vulvares, aborto em fase final de gestação, natimortos e nascimento de
leitões debilitados (ADLER & MOCTEZUMA, 2010; GONÇALVES & COSTA, 2011).
Na forma crônica da leptospirose suína, comum nos animais adultos, pode ocorrer a
eliminação da bactéria na urina. A infertilidade, com ocorrência de abortamentos e
natimortos, é comum aos sorovares Canicola, Pomona e Icterohaemorrhagiae
(HUNTER, 2004; SOTO et al., 2007; ELLIS, 2012).
No Brasil, RENDE et al. (2007) descrevem que a doença tem sido uma
das principais causas de falhas reprodutivas em granjas de suínos de vários
estados, principalmente das regiões Sul e Sudeste. SOTO et al. (2007) citam que
em estudo realizado no Rio Grande do Sul, 31 de 86 granjas apresentaram
transtornos reprodutivos associados à leptospirose, sendo os sorovares Bratislava e
Icterohaemorrhagiae predominantes. Para AZEVEDO et al. (2008), em estudo
realizado em São Paulo, os sorovares prevalentes em fêmeas com transtornos
reprodutivos além dos supracitados foram Hardjo (33,3%), Shermani (19,1%), e
Grippotyphosa (4,8%).
14
FIGURA 4 - Rim, suíno: múltiplos pontos brancos apresentando
distribuição aleatória e bilateral na superfície
cortical.
Fonte: Arquivos do Setor de Patologia Veterinária da FAVET/UFRGS
A fase aguda, mais rara, pode ser observada em neonatos, onde se
observam hemorragias subcutâneas, hematúria, icterícia e morte (ADLER &
MOCTEZUMA, 2010). Tal forma também pode acometer animais em fase de
crescimento, causando letargia e icterícia, estando geralmente associada à infecção
pelo sorovar Icterohaemorrhagiae (HUNTER, 2004; RADOSTITS et al., 2006; ELLIS,
2012).
RENDE et al. (2007) utilizaram as dosagens bioquímicas séricas de
bilirrubina, glicose e proteínas plasmáticas para monitorar a infecção experimental
pelo sorovar Wolffii em suínos. Neste trabalho, os autores concluíram que o
aumento das taxas de bilirrubinas leva a uma definição de um diagnóstico de
hemólise aguda, e que a hipoglicemia, a hipolipidemia e a hipoproteinemia
observadas, podem ser devido às lesões hepáticas e septicemia. Ao final do
experimento, notou-se ainda que as dosagens, em todos os animais, retornaram aos
seus valores normais a partir do décimo quinto dia.
15
2.5 Diagnóstico
O erro diagnóstico é frequente em casos de suspeita de leptospirose, o que
pode induzir ao tratamento errôneo na doença aguda, e também à manutenção do
agente em um rebanho, gerando importantes perdas econômicas. O curso natural
da doença influencia diretamente no tipo de método diagnóstico eleito, assim como
no tipo de amostra a ser coletada (LOUREIRO et al., 2013).
O diagnóstico pode ser realizado à partir de amostras de sangue, urina,
líquido cefalorraquidiano ou de tecidos durante a necropsia (MUSSO & LASCOLA,
2013). A leptospirose pode ser diagnosticada a partir de investigações clínicas e
epidemiológicas, aliadas às provas laboratoriais (FAINE et al., 1999; HUNTER,
2004; RADOSTITS et al., 2006; SHARMA & YADAV, 2008; CERQUEIRA &
PICARDEAU, 2009; MUSSO & LASCOLA, 2013; PICARDEAU, 2013). Entretanto,
LOUREIRO et al. (2013) enfatizam que o diagnóstico laboratorial da doença em
animais é um desafio, pois ainda não há um método altamente sensível e específico
que promova um diagnóstico confiável e rápido.
Os dados epidemiológicos estão relacionados aos fatores de risco e
ambientais que propiciam a disseminação do agente, assim como a existência de
possíveis reservatórios da doença (OLIVEIRA et al., 2013). Os sinais clínicos,
geralmente passam despercebidos pelos tratadores e criadores, em especial nos
animais adultos, mas quando presentes são observados principalmente nas fêmeas,
já que a doença afeta, sobretudo, os órgãos reprodutivos. Em suínos jovens, os
sinais mais sugestivos da doença são febre, anorexia, icterícia e hemoglobinúria
(SHIMABUKURO et al., 2003; RADOSTITS et al., 2006, ELLIS, 2012; LOUREIRO et
al., 2013).
2.5.1 Métodos diretos
As leptospiras podem ser visualizadas pelo exame direto a partir de
amostras de sangue colhidas durante a leptospiremia na primeira semana da
infecção, ou da urina, durante a leptospirúria a partir da segunda ou terceira semana
da infecção. Para isso, necessita-se de um microscópio de campo escuro ou de
16
contraste de fase, pois essas bactérias não são visíveis à microscopia de luz
(PICARDEAU, 2013). Além da necessidade de um microscópio específico, existe a
possibilidade de diagnóstico falso positivo em amostras cheias de filamentos de
fibrina e restos celulares (MUSSO & LASCOLA, 2013).
O cultivo e isolamento bacteriano, e a técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR) detectam, respectivamente, a leptospira patogênica ou seu ácido
nucleico. Ambos auxiliam na detecção da fase aguda da doença, quando ainda não
são observados anticorpos específicos. Eles também podem confirmar a infecção
ativa em animais positivos aos testes sorológicos, mas com histórico de vacinação
contra leptospirose (SYKES et al., 2011).
O método de diagnóstico considerado definitivo para leptospirose é o
cultivo e isolamento bacteriano, pois permite a identificação do sorovar infectante,
possibilitando a execução de estudos epidemiológicos e profiláticos (FAINE et al.,
1999; ADLER & MOCTEZUMA, 2010). Para o cultivo de Leptospira spp.,
comumente, utiliza-se o meio semissólido de Fletcher ou o meio líquido de
Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH), enriquecidos com soro de coelho
ou soro bovino (SHARMA & YADAV, 2008). Antibióticos são geralmente adicionados
em tentativas de isolamento a partir de espécimes contaminadas com outros
microrganismos, como a urina e o sêmen. A combinação de 5-fluorouracil e ácido
nalidíxico tem sido eficiente quando misturado aos meios líquidos, como o EMJH
(MIRAGLIA et al., 2009).
O isolamento pode ser realizado a partir de amostras de fetos abortados,
tecidos como fígado, pulmão e cérebro, fluidos corporais como líquido
cefalorraquidiano, sangue e urina de animais clinicamente infectados e não tratados
com antibióticos (LEVETT, 2001; MIRAGLIA et al., 2008; ELLIS, 2012). Entretanto,
para o sucesso desse teste os tecidos devem estar frescos. Assim, em casos de
diagnóstico pós-morte podem ocorrer falsos negativos, uma vez que as leptospiras
podem morrer antes da inoculação no meio de cultura (SHIMABUKURO et al., 2003;
SOTO et al., 2006).
A presença dessa bactéria no trato reprodutor, no rim ou urina, somada à
ausência de evidências de infecção generalizada, caracteriza a infecção crônica.
Entretanto, o não isolamento na urina de um animal, não descarta a possibilidade de
este ser portador renal crônico, conforme amplamente reconhecido pela maioria dos
17
autores. Tal resultado pode indicar apenas que esse animal não está excretando
números detectáveis de bactérias no momento do teste, o que pode representar um
ponto negativo ao diagnóstico (RADOSTITS et al., 2006).
Outro ponto negativo da cultura é o crescimento muitas vezes fastidioso,
necessitando longos períodos de incubação de três a quatro semanas. Além disso,
há possibilidade de ocorrer resultado falso negativo após este período
(WUTHIEKANUN et al., 2007; SHARMA & YADAV, 2008; PICARDEAU, 2013;,
SYKES et al., 2011, MUSSO & LASCOLA, 2013).
Nos últimos anos, a técnica molecular de PCR vem sendo amplamente
utilizada nos estudos da leptospirose suína, sendo descrita como importante
ferramenta de diagnóstico, bem como para investigações epidemiológicas
(SHIMABUKURO et al., 2003; LEVETT et al., 2005; SOTO et al., 2006; CHEEMA et
al., 2007; SOTO et al., 2007; FEARNLEY et al., 2008; MIRAGLIA et al., 2008;
STODDARD et al., 2009; SANTOS et al., 2011; PICARDEAU, 2013; ROMERO-
VIVAS et al., 2013).
Em humanos, essa técnica possibilitou à BOURHY et al. (2011), a
confirmação rápida do diagnóstico na fase inicial da doença (dentro das primeiras
duas semanas de exposição), antes dos títulos de anticorpos estarem em níveis
detectáveis. Entretanto, em infecçoes crônicas, SHIMABUKURO et al. (2003)
observaram dificuldade na extração do ácido desoxirribonucleico (DNA) bacteriano
de tecidos de suínos positivos na técnica de soroaglutinação microscópica (SAM)
bacteriano, que pode ser explicado pela pequena quantidade de leptospiras neste
tipo de infecção.
Fatores inerentes à amostra também são importantes quando se utiliza a
PCR, como observado no estudo de STODDARD et al. (2009), onde a melhor
detecção de material genético de leptospiras em humanos, ocorreu em amostras de
sangue, plasma e urina centrifugada. Já para LEVETT et al. (2005), as amostras de
soro e urina tiverem resultados mais significativos, sendo ainda, o DNA melhor
amplificado nos soros obtidos de amostras sanguíneas conservadas com ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) e citrato, mas não com heparina. Outra limitação
deste método é que ele permite apenas a detecção do material bacteriano
(PICARDEAU, 2013), sendo necessárias técnicas adicionais para caracterização
molecular do isolado (MIRAGLIA et al., 2008).
18
O exame anatomopatológico também pode ser útil no diagnóstico da
leptospirose. Macroscopicamente, as lesões da fase crônica da leptospirose
compreendem focos branco-acinzentados, predominantemente na região cortical
renal (OLIVEIRA, 2007; HASCHIMOTO et al., 2008; ELLIS, 2012). OLIVEIRA FILHO
et al. (2012) analisaram por exames microbiológicos 400 rins condenados por
apresentarem pontos brancos na superfície cortical, em dois frigoríficos do estado de
Mato Grosso. Nenhuma amostra apresentou positividade ao teste de
imunofluorescência anti-Leptospira spp, demonstrando assim, que tal alteração,
apesar de ser sugestiva, não é exclusiva da leptospirose. Nessas amostras
detectou-se material genético de Parvovírus suíno (27,25%), Circovírus suíno
(28,50%) e Torque teno vírus Tipo 1 (94%) e 2 (87,5%).
As lesões teciduais decorrentes desta infecção podem ser detectadas em
cortes histológicos corados por hematoxilina e eosina (HE). Na fase aguda, as
alterações são caracterizadas por lesão tubular renal, necrose hepática focal, e
meningoencefalite mononuclear. Na fase crônica as principais alterações
histopatológicas encontram-se no rim e se caracterizam por nefrite intersticial focal
progressiva, composta predominantemente por linfócitos e em padrão folicular
(PRESCOTT, 2007).
HASCHIMOTO et al. (2008), examinando cortes histológicos de rins de
suínos positivos na SAM (título de anticorpos ≥ 20), observaram infiltrado
mononuclear intersticial, focos de fibrose na porção cortical, além de espessamento
de túbulos e glomérulos adjacentes às lesões. Concluindo-se haver correlação
positiva entre a nefrite intersticial e a positividade na SAM. Adicionalmente à
observação microscópica, outros métodos que podem confirmar Leptospira spp. em
tecidos incluem a impregnação pela prata e a imuno-histoquímica (IHQ)
(CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009; SYKES et al., 2011; MUSSO & LASCOLA,
2013; PICARDEAU, 2013).
A coloração de prata de Warthin-Starry é uma das mais empregadas e
indicadas devido ao seu menor custo e tempo de processamento (KIERNAN, 2002;
HAANWINCKEL et al., 2004). Esta técnica tem baixa sensibilidade, como
demonstrado por FIGUEIREDO et al. (2013) que não conseguiram marcação
positiva em 18 tecidos renais oriundos de suínos soropositivos na SAM. Além disso,
seu uso pode ser limitado por alguns problemas, como estabilidade dos reagentes,
19
falhas na identificação de microrganismos ou seus produtos antigênicos,
principalmente quando em meio intracelular, e coloração de estruturas não
identificadas como espiroquetas (SCANZIANI et al., 1989; KIERNAN, 2002; SYKES
et al., 2011).
Na atualidade, a imuno-histoquímica (IHQ) surge como um recurso
diagnóstico seguro e eficiente para a identificação de constituintes teciduais ou
celulares através da interação antígeno-anticorpo (DELGADO et al., 2007). De
acordo com, HAANWINCKEL et al. (2004), a IHQ é um método de fácil execução e
que demanda pouco tempo de preparação. Nesse trabalho, o autor e colaboradores,
compararam a técnica de IHQ, o cultivo bacteriano e a técnica de impregnação pela
prata de Whartin-Starry. Ao final, de 40 amostras sabidamente positivas, 31 foram
positivas no cultivo e todas foram positivas na prata e na IHQ, havendo correlação
positiva entre estas últimas.
Para GONÇALVES (2009), em estudo de prevalência realizado em suínos
na região Nordeste, houve êxito na utilização da técnica. De um total de 200
animais, 23 rins apresentaram marcação positiva à técnica de imuno-histoquímica
anti-Leptospira spp, embora somente sete animais fossem sororreativos à SAM. A
marcação imuno-histoquímica em animais soronegativos também foi encontrada por
CAMPOS et al. (2011), em análises de fígados e pulmões de suínos oriundos de
frigoríficos também no nordeste do país. Entretanto, futuros estudos são necessários
para determinar com maior certeza as características, vantagens e desvantagens da
aplicação da IHQ na rotina diagnóstica da leptospirose (DELGADO et al., 2007).
2.5.2 Métodos indiretos
O diagnóstico sorológico fornece dados sobre a situação da granja, não
sendo definitivo para casos isolados. Preconiza-se que exames sorológicos sejam
realizados pelo menos em dez por cento dos reprodutores machos e fêmeas do local
investigado (OLIVEIRA, 2007). Dentre as técnicas indiretas mais utilizadas
destacam-se a de soroaglutinação microscópica (SAM) e o ensaio imunoenzimático
(ELISA) (PICARDEAU, 2013).
20
A SAM há mais de um século é o diagnóstico mais utilizado, sendo o
método de referência preconizado pela Organização Mundial de Saúde (FAINE et
al., 1999; LEVETT, 2001; SHARMA. & YADAV, 2008; CERQUEIRA & PICARDEAU,
2009; MUSSO & LASCOLA, 2013). Geralmente, são utilizadas 24 cepas
representativas dos diversos sorogrupos de bactérias patogênicas existentes. Para
isso, necessita-se da manutenção de coleções de bactérias vivas que contemplem
esses sorogrupos. Consideram-se positivos os soros que tenham 50% de
aglutinação em comparação ao controle negativo, onde não é aplicado soro
(PICARDEAU, 2013).
O diagnóstico da infecção aguda não é possível pela SAM porque esta
técnica depende da detecção de anticorpos específicos contra os antígenos de
Lepstopira spp. que só são detectáveis a partir da segunda semana após infecção. A
infecção crônica pode passar despercebida, pois a partir do vigésimo dia após a
infecção, os títulos de anticorpos declinam (SYKES et al., 2011).
Em áreas onde a leptospirose não é endêmica, um título baixo (<1/100) na
SAM em um ou mais antígenos indica que o paciente é portador da doença. Já em
áreas endêmicas, precisa-se de um alto título (>1/400–800) para o diagnóstico
presuntivo. Entretanto, a confirmação da leptospirose requer a demonstração da
soroconversão ou do aumento significativo dos títulos de anticorpos no teste de
amostras pareadas coletadas com duas semanas de diferença (CERQUEIRA &
PICARDEAU, 2009).
Para OLIVEIRA (2007) não há título sorológico que seja considerado
positivo para todos os casos. O pesquisador reporta que suínos infectados por
leptospiras do sorovar Bratislava podem não ser sororreagentes.
O uso de vacinas polivalentes dificulta o diagnóstico, visto que, não há
diferenciação entre anticorpos vacinais e os produzidos na infecção ativa. Porém,
alguns autores citam que os títulos vacinais detectáveis geralmente não ultrapassam
1/400 (FAINE et al., 1999, LEVETT, 2001, HASCHIMOTO et al., 2008).
A interpretação do resultado pode ser influenciada pela frequência com que
ocorrem as reações cruzadas entre sorogrupos e pelo caráter subjetivo de análise.
Trata-se de uma técnica onerosa e de difícil implantação, altamente dependente de
um técnico experiente, tanto na execução quanto na análise dos dados obtidos
21
(SHARMA. & YADAV, 2008; CERQUEIRA & PICARDEAU, 2009; MUSSO &
LASCOLA, 2013; PICARDEAU, 2013).
O ELISA para a detecção de anticorpos é mais simples e rápido que a
SAM, sendo utilizado principalmente em laboratórios e hospitais humanos. A maioria
desses testes utiliza frações bacterianas (lipoproteínas ou porinas da membrana
externa) para detectar anticorpos específicos da classe IgM. Nesse teste, a detecção
de IgM pode ser observada entre o quarto e quinto dia, possibilitando assim o
diagnóstico precoce da leptospirose (PICARDEAU, 2013).
Em suíno, HARTLEBEN et al. (2013) utilizaram uma proteína
recombinante da proteína de membrana LipL32 (rLipL32/ELISA) para a detecção de
anticorpos específicos em soros positivos na SAM. Os autores encontraram 100%
de sensibilidade e 85,1% de especificidade, não havendo reação positiva a outras
bactérias responsáveis por doenças em suínos.
Apesar desses resultados, vários autores descrevem que a sensibilidade
e especificidade na maioria das tentativas de padronizações do teste, são muito
variáveis. Também não é possível identificação dos sorovares ou sorogrupos
envolvidos na infecção. Sendo, portanto, não recomendado o uso isolado desta
técnica (LEVETT, 2001; BHARTI et al., 2003; MCBRIDE et al., 2005; CERQUEIRA &
PICARDEAU, 2009; WASIŃSKI & PEJSAK, 2010; MUSSO & LASCOLA, 2013;
PICARDEAU, 2013).
2.6 Controle e profilaxia
O controle e profilaxia da infecção em suínos incluem medidas higiênicas,
de manejo, de combate a roedores, vacinação e tratamento medicamentoso
(OLIVEIRA, 2007; BORDIN, 2010, OLIVEIRA et al., 2013). A desinfeção das
instalações pode ser realizada com produtos contendo hipoclorito de sódio. O
tratamento medicamentoso das fontes de infecção tem por objetivo principal reduzir
a transmissão do agente. Os antibióticos utilizados, como a estreptomicina, irão
cessar a eliminação do agente através da urina, sêmen e secreção vaginal, mas não
necessariamente eliminarão todos os suínos do estado portador (HUNTER, 2004).
22
As vacinas atualmente disponíveis no mercado brasileiro contra a
leptospirose são polivalentes, produzidas com cepas íntegras inativadas do agente.
Os sorovares comumente utilizados para produção da vacina são: Canicola,
Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Pomona, Grippotyphosa e Bratislava (SOTO et
al., 2007).
CARPENTER et al. (2006) avaliaram estratégias de controle em uma
granja com 900 porcas em terminação. Neste estudo, as estratégias de controle
utilizadas foram o descarte de animais sororreagentes, com posterior desinfecção
das baias, tratamento preventivo com antibióticos à base de hidrocloreto de
tetraciclina na água, e curativo com oxitetraciclina e estreptomicina. Além de adoção
de programas rígidos de controle de roedores. Para os autores a vacinação apenas
reduz a prevalência da infecção no rebanho sem eliminar a doença. De modo
similar, a antibioticoterapia sozinha, também não elimina as bactérias dos suínos
portadores, pois verificou-se que o tratamento com antibióticos não reduziu o
número de carcaças condenadas ao abate.
2.7 Importância em Saúde Pública
A leptospirose animal representa um ponto de preocupação para os
profissionais envolvidos com a saúde animal e saúde pública veterinária.
Investigações sorológicas e isolamento de leptospiras em animais domésticos e
silvestres são importantes para uma melhor compreensão da cadeia epidemiológica
da enfermidade (GUERRA, 2013; OLIVEIRA et al., 2013).
O contato com suínos portadores em sistemas de produções ou com
carcaças de suínos abatidos em frigoríficos são relatados como importantes fatores
de risco para a transmissão da doença do suíno para o homem (BHARTI et al.,
2003; MCBRIDE et al., 2005; CAMPOS et al., 2011), sendo trabalhadores rurais,
médicos veterinários e magarefes os principais grupos de risco à infecção (LIM,
2009).
No Brasil, amostras de suínos abatidos clandestinamente e provenientes
de criatórios sem nenhuma medida higiênico-sanitária e sob condições precárias,
23
analisadas por SANTOS et al. (2011), demostraram positividade em
aproximadamente 20%.
No estudo realizado na comunidade rural do município de Mapastepec,
Colômbia, LEAL-CASTELLANOS et al. (2003) observaram que os principais fatores
de risco para a leptospirose em humanos eram a presença de água estagnada, a
criação de animais domésticos, em especial bovinos e suínos, e o contato com
excretas de animais sem o uso de luvas. Adicionalmente, CALDERÓN et al. (2013)
identificaram na região de Córdoba, também na Colômbia, uma alta soroprevalência
em suínos, caninos e humanos, sugerindo que esses seriam os principais elos
epidemiológicos da leptospirose na região.
3 Objetivos
Como objetivo principal propôs-se a reprodução experimental da infecção
por Lepstospira interrogans sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Pomona, em fêmeas
suínas.
Como objetivos específicos, a obtenção de informações sobre as
características clínicas e sorológicas da infecção experimental frente aos dois
sorogrupos, além da avaliação do teste de soroaglutinação microscópica, reação em
cadeia da polimerase, anatomopatológica e do teste de Warthin-Starry como
métodos diagnósticos.
24
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32
Capítulo 2 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E SOROLÓGICAS DA INFECÇÃO
AGUDA EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans SOROGRUPOS
ICTEROHAEMORRHAGIAE E POMONA EM FÊMEAS SUÍNAS
RESUMO
A leptospirose é uma zoonose de caráter ocupacional que representa risco para a
saúde pública, principalmente médicos veterinários, magarefes, e funcionários de
granjas suínas que estão sujeitos ao contato direto com o agente. Neste trabalho
reproduziu experimentalmente a leptospirose suína aguda pelos sorogrupos
Icterohaemorrhagiae e Pomona, comparando-se entre os grupos, o curso clínico da
doença, os resultados dos exames sorológicos e de detecção da bactéria durante o
período experimental pelas técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e
isolamento bacteriano. Para isso, 18 fêmeas suínas com 40 dias de idade foram
divididas em três grupos: GI (controle), GII (inoculados com sorogrupo Pomona) e
GIII (inoculados com sorogrupo Icterohaemorrhagiae). Durante o período
experimental de 21 dias, não se verificou alterações clínicas significativas. Os
parâmetros referentes ao hemograma, bioquímica sérica e urinálise também foram
normais. As amostras de urina e sangue testadas pela técnica de PCR, e inoculadas
em meio seletivo de Fletcher foram negativas para todos os grupos e dias testados.
Na soroaglutinação microscópica (SAM) foram negativas todas as amostras colhidas
no dia 0 e em todos os outros dias para o GI. No GII houve positividade exclusiva ao
sorogrupo Pomona nos seis animais a partir do 6º dia pós-infecção (dpi), com
titulação de 1/200 (2/6) e 1/800 (4/6). No GIII detectaram-se amostras a partir do 3º
dpi com titulações de 1/100 (2/6), 1/200 (3/6). Não foram observadas reações
cruzadas entre os sorogrupos. Rins pálidos foram observados na necropsia em 50%
(3/6) do GI, 83,33% (5/6) do GII e em 83,33% GIII (5/6), não havendo diferença
estatística entre os grupos (p>0,05). A infecção experimental em fêmeas suínas foi
assintomática sendo comprovada pela SAM de amostras pareadas.
Palavras-chave: infecção subclínca, leptospirose, rins pálidos, Sus scrofa
domesticus, teste de soroaglutinação microscópica
33
CLINICAL AND SOROLOGICAL FEATURES OF ACUTE EXPERIMENTAL
INFECTION IN FEMALE PIGS WITH Leptospira interrogans SOROGROUPS
ICTEROHAEMORRHAGIAE AND POMONA
ABSTRACT
Leptospirosis is an occupational zoonosis that represents risk to public health, mostly
to veterinarians, butchers, and swine farm’s workers that are in direct contact with the
bacteria. This paper experimentally reproduced the acute swine leptospirosis by
serogroups Icterohaemorrhagiae and Pomona, comparing between groups, the
clinical course of the disease, the results of serological tests and the detection of
bacteria by polymerase chain reaction (PCR) and bacterial isolation, during the trial
period. For this, 18 sows at 40 days of age were divided into three groups: GI
(control) GII (challenged with serogroup Pomona) and GIII (inoculated with serogroup
Icterohaemorrhagiae). During the experimental period of 21 days, there was no
significant clinically changes. The parameters related to blood count, serum
biochemistry and urinalysis were also normal. Samples of urine and blood tested by
PCR, and inoculated into Fletcher selective medium were negative for all groups. In
microscopic agglutination test (MAT), all samples collected on day 0 and every other
day for GI (control), were negative. In GII the positivity was unique to serogroup
Pomona in six animals from 6 dpi, with titers of 1/200 (2/6) and 1/800 (4/6). In GIII
antibodies to serogroup Icterohaemorrhagiae was detected in samples from 3 days
post infection (dpi) with titers of 1/100 (2/6), 1/200 (3/6). No cross- reactions between
serogroups were observed. Pale kidneys were observed at necropsy in 50 % (3 /6) of
GI, 83.33 % (5 /6) of GII and 83.33 % (5/ 6) of GIII, with no statistical difference
between groups (p> 0.05). Experimental infection of sows was asymptomatic being
proven by MAT of paired sera.
Keywords: leptospirosis, microscopic agglutination test, pale kidneys, subclinical
infection, Sus scrofa domesticus.
34
INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma zoonose reemergente causada por bactérias do
gênero Leptospira e apresentam ampla distribuição geográfica, sendo mais
prevalente em países de clima tropical (SHARMA & YADAV, 2008; MUSSO &
LASCOLA, 2013).
A doença tem caráter ocupacional, representando risco para a saúde
pública, principalmente para médicos veterinários, magarefes e funcionários de
granjas suínas que estão expostos ao contato direto com o agente (CAMPOS et al.,
2011; GONÇALVES & COSTA, 2011; GUERRA, 2013; WILSON & SWAI, 2013;
OLIVEIRA et al., 2013).
A leptospirose suína é uma doença de notificação obrigatória, classificada
na lista da Organização Mundial de Saúde Animal como “Doenças, Infecções e
Infestações Comuns a Múltiplas Espécies”. Pertence ao grupo das doenças
transmissíveis e de grande importância do ponto de vista socioeconômico e/ou
sanitário, com considerável repercussão no comércio internacional de animais e
produtos de origem animal (OIE, 2014).
No Brasil, a doença é descrita em granjas e frigoríficos dos estados de
São Paulo, Rio Grande do Sul, Paraná, Santa Catarina, Minas Gerais, Goiás, Rio de
Janeiro, Ceará, Pernambuco e Piauí (FAVERO et al., 2002; SHIMABUKURO et al.,
2003; SOTO et al., 2007; GONÇALVES & COSTA, 2011).
Os sorovares Pomona, Icterohaemorrhagiae, Taravossi, Canicola,
Grippotyphosa e Bratislava são os principais isolados de suínos doentes ou
portadores sem sintomatologia clínica (WASIŃSKI & PEJSAK, 2010; ROMERO-
VIVAS et al., 2013).
No Brasil, estudos de prevalência indicam também a frequência dos
sorovares Autumnalis, Copenhageni, Hardjo e Wolffii, além dos principais sorovares
isolados (SOUZA, 2000; HASCHIMOTO et al., 2008; GONÇALVES, 2009; CAMPOS
et al., 2011; RAUBER-JUNIOR et al., 2011).
Os suínos infectados são considerados importantes reservatórios dessas
bactérias, pois apresentam prolongado período de leptospiremia não acompanhada
de sinais clínicos, albergando as bactérias nos túbulos renais e eliminando-as na
urina por meses (OLIVEIRA et al., 2013).
35
O diagnóstico para a confirmação dos casos clínicos e identificação dos
animais portadores baseia-se na investigação clínica e epidemiológica e análise das
provas laboratoriais. A confirmação da leptospirose pode ocorrer por detecção de
anticorpos no soro ou pela demonstração de lepstospiras nos tecidos e fluidos dos
animais acometidos (OLIVEIRA, 2007; SHARMA & YADAV, 2008; CERQUEIRA &
PICARDEAU, 2009; MUSSO & LASCOLA, 2013).
Os testes sorológicos são amplamente utilizados no mundo e a técnica de
soroagluitinação microscópica (SAM) é o teste de eleição recomendado pela
Organização Mundial da Saúde (PICARDEAU, 2013).
Neste trabalho buscou-se a reprodução experimental da leptospirose
suína aguda pelos sorogrupos Icterohaemorrhagiae e Pomona, comparando-se o
curso clínico da doença, os resultados dos exames sorológicos e de detecção da
bactéria durante o período experimental.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no mês de julho de 2012, que compreende
climaticamente ao período de seca na região Centro-Oeste, onde as temperaturas
variaram de 13,7 a 29,2ºC, com umidade do ar média de 36% e 0,2 mm de
precipitação pluviométrica, segundo o Instituto Nacional de Meteorologia (INMET,
2013).
A conduta experimental seguiu os princípios éticos de pesquisa em
animais, após avaliação e aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da Universidade Federal de Goiás (UFG), protocolo 12/12 (Anexo 1).
Animais
Utilizaram-se 18 suínos híbridos comerciais, com 40 dias de idade, peso
médio de 15 kg, fêmeas, oriundos de Granjas de Reprodutores Suídeos Certificadas
(GRSC), e de matrizes negativas e não vacinadas para leptospirose. Os animais
foram aleatoriamente distribuídos em três baias, identificados, alojados no Galpão
de Experimentação da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da UFG e
36
submetidos a um período de adaptação de doze dias. Para a identificação dos
animais optou-se pela diferenciação de acordo com padrão de manchas individuais,
principalmente do dorso, face externa da orelha e região glútea (Figura 1).
FIGURA 1 – Ilustração do padrão de identificação individual utilizada dentro dos grupos.
Os suínos recebiam água ad libitum. O arraçoamento era realizado duas
vezes ao dia, com ração industrializada, sem aditivos e na quantidade recomendada
para fase de crescimento. A ração era acondicionada em tambor fechado e
suspenso, em local totalmente fechado.
Estrutura física
As baias de alvenaria com dimensão de 12,19 m2 com piso de cimento
eram localizadas em área de acesso restrito apenas ao grupo de pesquisa. Para
impedir a entrada de roedores, as baias foram cobertas com tela viveiro hexagonal
galvanizada na parte frontal e superior (Figura 2). Com o mesmo propósito, as
canaletas externas para escoamento de resíduos das baias foram cobertas com tela
ou chapa metálica.
37
FIGURA 2 - A. Observa-se a tela cobrindo a área superior da baia. B. Vista frontal da
baia. A seta indica a placa metálica sobre a canaleta de escoamento de
resíduos.
Medidas sanitárias
Na tentativa de se evitar a contaminação cruzada entre os grupos,
adotou-se a entrada de apenas uma pessoa por baia, que era também responsável
pela limpeza, arraçoamento e avaliação clínica daquele grupo. Adicionalmente,
materiais como termômetro, rodos, esfregões e materiais de contenção (cachimbos),
eram exclusivos para cada grupo.
Os equipamentos de proteção individual (EPI) incluíam óculos, máscaras,
luvas de borracha, botas e macacões impermeáveis, conforme a Figura 3.
Após o uso, os materiais descartáveis eram identificados como material
de risco biológico e no caso das agulhas, também como perfurocortantes. Óculos,
botas, rodos, esfregões, cachimbos e termômetros eram lavados com detergentes
comuns e depois colocados em solução de hipoclorito de sódio a 5% por uma hora.
A higienização das baias era realizada duas vezes ao dia. Todos os
dejetos passaram por tratamento em caixas coletoras individuas, utilizando-se de
solução cloro a 10%, permanecendo nessas pelo período mínimo de três horas,
sendo posteriormente lançados em esgoto de decantação (SCHERER, 2004).
38
FIGURA 3 – Equipamentos de proteção
individual utilizados durante
período experimental.
Inoculação e colheita de material
As cepas foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Zoonoses
Bacterianas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo. A inoculação de Leptospira ocorreu por via intraperitoneal (ZHANG et al.,
2012), após assepsia da pele da região abdominal com solução de álcool etílico a
70%, como demonstrado na Figura 4. O Grupo I (controle) recebeu 5 mL de solução
fisiológica estéril. O Grupo II foi inoculado com 5 mL de cultura de Leptospira
interrogans sorogrupo Pomona sorovar Kennewicki amostra Pomona From (LPF) e o
Grupo III, com Leptospira interrogans sorogrupo Icterohaemorrhagiae sorovar
Copenhageni amostra Fiocruz L1-130. Ambos contendo de 10 a 20 bactérias por
campo ao aumento de 200x em microscópio de campo escuro (SOTO et al., 2006).
39
FIGURA 4 – Inoculação de 5mL de suspensão de cultivo contendo Leptospira interrogans
sorovar Pomona, via intraperitoneal em suíno.
Os animais foram monitorados por 21 dias pós-infecção (dpi) e as
informações anotadas em fichas individuais. Aferiu-se a temperatura retal duas
vezes ao dia com intervalo de 12 horas (Figura 5A). Nos tempos 0, 3, 6, 9, 13 e 21
dpi colheu-se amostras de sangue da veia cava cranial ou da jugular, para
realização de cultura bacteriológica e hemograma. O soro obtido por centrifugação
foi congelado e posteriormente, submetido à bioquímica sérica, técnica de reação
em cadeia da polimerase (PCR) clássica e soroaglutinação microscópica (SAM).
No 6º, 13º e 21º dpi também foram colhidas e congeladas amostras de
urina para urinálise, cultura bacteriológica e PCR, por micção espontânea antes do
arraçoamento matinal.
Para contenção dos animais utilizou-se o cachimbo apenas nas colheitas
de sangue, como preconizado por DEWEY & STRAW (2006) e ilustrado na Figura
5B.
40
FIGURA 5 – A. Monitoramento da temperatura corporal de um suíno durante o exame
clínico diário. B. Punção venosa jugular e utilização do cachimbo.
Hematologia e Bioquímica sérica
Os exames hematológicos foram realizados no Laboratório Multiusuário
do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal (PPGCA) da EVZ/UFG.
Para o hemograma utilizou-se 3 mL de sangue em tubo com ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) (BD Vacutainer®). A contagem das células
sanguíneas foi determinada pelo método automático utilizando-se o aparelho BC
2800 Vet (Mindray® Medical International. Limited), adaptado com o cartão próprio
de leitura para a espécie suína. Adicionalmente, realizou-se o esfregaço sanguíneo
corado pelo método de Giemsa para contagem diferencial de leucócitos e avaliação
da morfologia celular.
41
Para as provas de bioquímica sérica obteve-se 5 mL de sangue em tubo
seco (BD Vacutainer®). Os tubos permaneceram em temperatura ambiente por uma
hora para posterior centrifugação. Após a retração do coágulo, dividiram-se as
amostras em microtubos de polipropileno de 1,5 mL (Eppendorf®). A partir das
recomendações sobre o uso dos reagentes comerciais padronizados (Labtest,
Labtest® Diagnóstica S.A.), dosou-se a albumina sérica, bilirrubina total, bilirrubina
direta, creatinina, proteínas totais, ureia e as enzimas aspartato amino transferase
(AST) e gamaglutamiltransferase (Gama GT). A leitura foi realizada em
espectrofotômetro semiautomático Analisador Bioquímico Semiautomático modelo
Bio-2000 (Bio-Plus® Produtos para Laboratórios Ltda). Os valores de referência
utilizados foram os descritos por LOYNACHAN (2012).
Urinálise
Para avaliação das amostras de urina utilizou-se os valores de referências
citados por GOLDBERG (2007). Imediatamente após a colheita observou-se os
aspectos físicos, como volume, coloração e odor. A densidade foi medida em
refratômetro e para os aspectos químicos (pH, presença de proteínas, bilirrubina,
urobilinogênio, corpos cetônicos, glicose, nitrito, sangue/hemoglobina e leucócitos),
utilizou-se tiras reagentes para urinálise (BioColor 10, Bioeasy® Diagnóstica Ltda.).
Isolamento bacteriano
Amostras de 0,5 mL de sangue colhidos nos tempos 0, 3, 6, 9, 13 e 21 dpi
e de 0,5 mL de urina colhidas nos 6º, 13º e 21º dpi foram adicionadas a tubos
contendo 0,3 mL de meios seletivos de Fletcher, acrescidos de 5-fluorouracil e ácido
nalidíxico, nas doses respectivas de 300 mg e 20 mg por litro de meio. Esses foram
incubados em estufas à temperatura de 28-30ºC. As culturas foram avaliadas
semanalmente por um período de seis semanas, sendo considerados negativas,
após quatro meses, segundo protocolo preconizado por BOLIN & CASSELLS
(1990).
42
Extração do DNA genômico das amostras
Para a extração do DNA utilizou-se o kit comercial DNeasy Blood &
Tissue (Qiagen® Biotecnologia Brasil Ltda.), seguindo-se o protocolo do fabricante.
As amostras foram quantificadas em espectofotômetro em duas absorbâncias
diferentes, com razão de A260/280 entre 1,8 e 2,0 (SAMBROOK et al., 1989). Foram
testadas as amostras de soro colhidas nos tempos 0, 3, 6, 9, 13 e 21 dpi e amostras
de urina no 6º, 13º e 21º dpi. Utilizou-se como controle positivo o DNA extraído de
cultura com leptospiras viáveis do sorovar Hardjo da coleção do Laboratório de
Leptospirose do Setor de Medicina Veterinária Preventiva da EVZ/UFG.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Após a extração as amostras foram submetidas à PCR clássica segundo
o descrito por ROMANI (2012). Para isso, preparou-se um mix com 12,5 μL de água
ultrapura (Gibco®, Life Technologies), 2 μL de solução tampão de PCR 10x (200
mM Tris-Hcl com pH 8.4 e 500 mM KCl) (Invitrogen®, Life Technologies), 0,6 μL de
cloreto de magnésio a 1.5 mM (Invitrogen®, Life Technologies), 1 μL de cada
oligonucleotídeo a 0.25pmol (LipL32-45F - 5’ - AAG CAT TAC CGC TTG TGG TG -
3’ /LipL32-286R - 5′- GAA CTC CCA TTT CAG CGA TT - 3’), 0,6 μL de solução de
dNTPs (Invitrogen®, Life Technologies) e 0,3 μL de Taq DNA polimerase
(Invitrogen®, Life Technologies).
Para amplificação do fragmento de 242 pares de bases (pb) pelo
oligonucleotídeo lipL32 foi utilizado termociclador (Eppendorf mastercycler
gradient®) e a adaptação do protocolo de amplificação de STODDART et al. (2009),
onde as amostras foram submetidas à desnaturação inicial de três minutos a 95 °C,
seguido por 35 ciclos de amplificação de 95 °C por um minuto, 60 °C por 45
segundos, 72 °C por um minuto e extensão final a 72 °C por dez minutos.
Posteriormente, realizou-se eletroforese em gel de agarose na concentração de
0,8% para a visualização do fragmento de 242 pares de bases amplificado do gene
lipL32 de Leptospira spp. Utilizou-se como tampão de corrida o TBE 1X (100 mL de
Tris-EDTA borato diluído em 900 mL de água destilada).
43
Após a eletroforese, os géis foram submersos em solução contendo
SYBR® Safe (Invitrogen®, Life Technologies), na proporção de 8 μL do corante para
400 mL de TBE 1X e visualizados em luz ultravioleta.
Teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM)
As amostras de soros colhidas foram submetidas ao teste de
soroaglutinação microscópica (SAM) no Laboratório de Leptospirose da EVZ/UFG.
Os soros foram adicionados em diluições crescentes a culturas de
diversas sorovariedades de Leptospira spp. mantidas e cultivadas em meio
Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). Empregou-se uma coleção de 19
antígenos vivos de leptospiras (Andamana, Australis, Autumnalis, Bratislava,
Butembo, Canicola, Castelonis, Copenhageni, Grippothyphosa, Hardjo, Hebdomadis,
Icterohaemorraghiae, Patoc, Pomona, Pyrogenes, Sentot, Shermani, Tarassovi e
Wolffii) que compõem a coleção de culturas vivas desse laboratório.
Os soros que apresentaram 50% ou mais de leptospiras aglutinadas na
diluição 1/100 foram considerados positivos e então diluídos seriadamente a razão
dois até a determinação da diluição máxima positiva de acordo com PICARDEAU
(2013).
Eutanásia e necropsia
Ao final do período experimental todos os animais sofreram eutanásia
seguindo a Resolução nº 1000 do Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV,
2012).
A necropsia dos animais realizou-se no Laboratório de Necropsia do Setor
de Patologia Animal da EVZ/UFG, sendo as alterações observadas anotadas em
fichas individuais. Ao final, as carcaças foram incineradas em forno crematório da
própria EVZ/UFG, localizado dentro da sala de necropsia.
44
Análise estatística
A avaliação das análises não paramétricas entre os grupos foi realizada a
partir do teste Kruskal-Wallis, considerando-se diferença significativa para p<0,05.
Nos casos de diferença estatística utilizou-se método de comparação de Dunn,
sendo significativos valores de p<0,01.
Para se verificar a existência de associação entre duas variáveis
qualitativas empregou-se o teste de Fischer. Os dados foram tabulados no programa
Excel 2010 e processados no software Graphpad Instat, versão 3.0.
RESULTADOS
No presente trabalho conseguiu-se reproduzir experimentalmente a
leptospirose suína aguda, inoculando-se por via intraperitoneal estirpes dos
sorogrupos Pomona e Icterohaemorrhagiae, em fêmeas suínas com idade de 40
dias.
Ao longo dos 21 dias do ensaio experimental as alterações clínicas
observadas foram discretas em todos os grupos, excetuando um suíno do GII e
outro do GIII que manifestaram apatia no 2º dpi (Figura 6) e no 6º dpi,
respectivamente. Em relação à média das temperaturas corporais dos animais nos
três grupos, apenas no 7º dpi pode-se observar alteração significativa (p<0,01),
quando comparados os GII e GIII.
O hemograma e a bioquímica sérica dos animais de todos os grupos em
todos os períodos analisados apresentaram-se dentro dos valores referenciais
normais para a espécie. O mesmo foi observado para os exames físicos e químicos
da urina. As amostras de sangue e urina testadas pela PCR (Figura 8) e inoculadas
em meio seletivo de Fletcher adicionado de antibióticos foram negativas para todos
os grupos e dias testados.
45
FIGURA 6 – Suíno G II-4, 2 dpi: animal apático, isolado do grupo e
buscando a luz solar na baia.
FIGURA 7 – Reação em Cadeia da Polimerase Clássica (PCR).
Eletroforese em gel de agarose de amostras de soros
negativas ao 6º dpi dos GII (1 a 6) e GII (7-9), testadas
para amplificação do fragmento de 242 pb pelo
oligonucleotídeo lipL32. C-: controle negativo; C+:
controle positivo; M: marcador de peso molecular (1Kb
Plus DNA Ladder, Invitrogen®, Life Technologies).
46
Na SAM, foram negativas todas as amostras colhidas no dia 0 e em todos
os outros dias para o GI (controle). No GII houve positividade exclusiva ao sorogrupo
Pomona em todos os animais a partir do 6º dpi, com titulação de 1/200 (2/6) e 1/800
(4/6). No GIII, cinco suínos foram positivos para o sorogrupo Icterohaemorrhagiae a
partir do 3º dpi apresentando titulação de 1/100 (2/6) e 1/200 (3/6) e um suíno a
partir do 6º dpi com titulação de 1/800. Estas titulações mantiveram-se nos dois
grupos até o final do experimento. Não foram observadas reações cruzadas entre os
sorogrupos, sendo a positividade do GII exclusiva para os sorogrupos Pomona e
para o GIII o sorogrupo Icterohaemorrhagiae (Tabela 1).
A única alteração macroscópica observada à necropsia foi rins de aspecto
pálido (Figura 9) em 50% (3/6) do GI, 83,33% (5/6) do GII e em 83,33% GIII (5/6),
não havendo, entretanto diferença estatística entre os grupos estudados (p>0,05).
Quando se confrontou os resultados da SAM com o achado de necropsia
pelo teste de Fischer (p=0,2682) não foi possível estabelecer associação estatística
entre eles, como mostra a Tabela 2.
TABELA 1 - Distribuição das titulações individuais dos animais dos grupos GII e GIII,
inoculados respectivamente com estirpes dos sorogrupos Pomona e
Icterohaemorrhagiae no 3º, 6º e 9º dpi.
Grupo Titulação
3 dpi 6 dpi 9 dpi
GII-1 negativo 1/800 1/800
GII-2 negativo 1/800 1/800
GII-3 negativo 1/200 1/800
GII-4 negativo 1/800 1/800
GII-5 negativo 1/800 1/800
GII-6 negativo 1/200 1/800
GIII-1 1/200 1/800 1/800
GIII-2 1/100 1/800 1/800
GIII-3 1/100 1/400 1/800
GIII-4 1/200 1/800 1/800
GIII-5 1/200 1/800 1/800
GIII-6 negativo 1/800 1/800
47
‘
Figura 8 – Rim de suíno do GII com superfície cortical pálida.
TABELA 2 - Associação entre animais positivos e negativos na SAM com a presença
ou não de palidez renal à necropsia.
SAM Total
positivo negativo
Palidez Renal Presente 10 (56%) 3 (17%) 13 (72%)
Ausente 2 (11%) 3 (17%) 5 (28%)
Total 12 (67%) 6 (33%) 18 (100%
p= 0,2682 (Intervalo de confiança de 95%)
DISCUSSÃO
No presente experimento utilizaram-se os sorogrupos Pomona e
Icterohaemorrhagiae, por serem os mais frequentemente isolados em granjas
suinícolas no Brasil, na tentativa de se entender melhor a relação entre hospedeiro e
patógeno desta enfermidade. Esta preocupação é compartilhada com a maioria dos
autores como SOUZA (2000), SHIMABUKURO et al. (2003), DELBEM et al. (2004),
SOTO et al. (2007) e RAUBER-JUNIOR et al. (2011).
48
Neste trabalho a via intraperitoneal se mostrou eficaz para a inoculação
de leptospiras em suínos, por ser rápida e não necessitar de contenção química ou
da utilização de cateteres para a aplicação no inóculo. ZHANG et al (2012) já
preconizava esta via de inoculação como uma das principais, para modelos
experimentais com leptospiras em animais de laboratório. Os autores também
descrevem a possibilidade de inoculação por meio da pele escarificada, porém neste
experimento esta via embora aparentemente de fácil execução foi descartada devido
ao ambiente experimental não ser estéril, existindo a possibilidade de contaminação
dessas lesões por outros microrganismos oportunistas, que poderiam mascarar
dados relativos à temperatura corporal e resultados de exames complementares
como hemograma.
A leptospirose em suínos ocorreu na forma assintomática neste estudo.
Segundo LEVETT (2001), BHARTI et al. (2003) e MCBRIDE et al. (2005) a doença
nessa espécie manifesta-se predominantemente na forma subclínica, sendo o
animal acometido uma importante fonte de infecção para tratadores, médicos
veterinários e magarefes. Verificou-se ainda, neste estudo que suínos com 40 dias
de idade e sobre condições ambientais que favoreceram a menor quantidade de
bactérias no meio, se mostraram pouco suscetíveis a desenvolver a forma clínica da
doença. Assim, ressalta-se que condições adequadas de manejo, limpeza das
instalações e a genética dos animais possam auxiliar na redução da carga
bacteriana, reduzindo assim, a necessidade de antibióticos preventivos.
Os resultados do presente estudo demostraram que a infecção pelo
sorogrupo Icterohaemorrhagiae pode não apresentar sinais clínicos em suínos
adultos, com um mês e meio de idade, provavelmente por influência das variações
inerentes à imunidade do animal, à minimização de fatores estressantes e condições
climáticas e ambientais adequadas ao ambiente experimental, que podem ter
influenciado nos resultados obtidos. Essa justificativa foi igualmente descrita por
GONÇALVES (2009), que também descreveu a ocorrência da infecção por este
sorogrupo em animais com características de hospedeiro reservatório.
As discretas manifestações clínicas observadas impossibilitaram o
diagnóstico clínico da leptospirose aguda, sendo assim indispensável a utilização de
testes laboratoriais, como descrito por SHIMABUKURO et al. (2003) e MUSSO &
LASCOLA (2013). A apatia observada durante a primeira semana de infecção em
49
suínos dos Grupos GII (Pomona) e GIII (Icterohaemorrhagiae), podem ser atribuídas
à fase de leptospiremia conforme também descrito por SOTO et al (2007).
Não foram constatadas alterações significativas nos parâmetros avaliados
do hemograma, bioquímica sérica e urinálise, de nenhum dos dois grupos
inoculados. Na infecção experimental por L. interrogans sorovar Wolffi, RENDE et al.
(2007) encontraram alterações bioquímicas séricas relacionadas a um quadro
hemolítico, porém utilizaram quantidade de leptospiras inoculadas superiores ao
normalmente observado na literatura, se afastando da realidade da carga bacteriana
encontrada na infecção natural.
A produção de anticorpos específicos nos grupos GII e GIII pôde ser
detectada pela SAM no intervalo entre os dias 3 e 6 pós-infecção, estando de acordo
com o descrito por FIGUEIREDO et al. (2013) e diferindo-se do descrito por SYKES
et al. (2011), que detectaram anticorpos específicos a partir da segunda semana pós
infecção. Apesar da titulação alta observada, o diagnóstico da infecção em ambos
os grupos só foi comprovada pela demonstração da soroconversão a partir da
análise de amostras pareadas, com intervalo de duas semanas, assemelhando-se
ao descrito por CERQUEIRA & PICARDEAU (2009), MUSSO & LASCOLA (2013) e
PICARDEAU (2013). A manutenção dos altos títulos de anticorpos a partir do 6º dpi
até o final do experimento confirma que o presente estudo se restringiu a um quadro
de leptospirose aguda, pois segundo SYKES et al. (2011) o declínio dos títulos de
anticorpos caracterizam a fase crônica da infecção.
O isolamento bacteriano foi negativo para as amostras de urina e sangue,
mesmo utilizando-se meio seletivo adicionado de antibióticos, como sugerido por
MIRAGLIA et al. (2009) para amostras contaminadas. Os resultados negativos na
detecção de leptospira em fluidos biológicos tanto pela cultura quanto pela PCR
clássica podem ocorrer quando a concentração de bactéria nessas amostras for
menor que 10 bactérias/mL ou ainda em amostras congeladas antes da fase de
extração, como evidenciado também por MUSSO e LASCOLA (2013). GONZÁLEZ
et al. (2013) acrescenta que nas amostras de soro pode haver uma redução da
quantidade de bactérias devido a adesão dessas ao coágulo. Nas amostras de
urina, ANZAI (2006) destaca que outros fatores relacionados a resultados falsos
negativos incluem a fragilidade da leptospira em ambientes ácidos e à existência de
fatores inibidores, como ureia, creatinina e radicais ácidos.
50
A divergência entre os resultados positivos na SAM e os negativos na
PCR neste experimento, também foi relatada por CHEMA et al. (2007), que
identificaram em seu estudo a necessidade de padronização de testes de PCR mais
sensíveis, diminuindo assim os falsos negativos, o que também não foi realizado
neste estudo. Adicionalmente, em animais adultos a produção de anticorpos
específicos pode ter eliminado rapidamente a bactéria do sangue e tecidos.
Embora tenham sido utilizadas cepas diferentes, a palidez renal
observada com maior evidência nos grupos inoculados, em relação ao grupo
controle, pode ser atribuída segundo DROLET (2012) à degeneração tubular aguda
constatada pelo autor, em alguns casos de leptospirose.
CONCLUSÕES
A reprodução da leptospirose aguda suína em condições experimentais
utilizando-se o sorogrupo Icterohaemorrhagiae sorovar Copenhageni cepa L1-130 e
sorogrupo Pomona sorovar Kennewicki cepa Pomona From, foi possível pela
inoculação intraperitoneal. A doença em sua fase aguda em animais adultos
demostrou ser de caráter assintomático, com alterações macroscópicas
inespecíficas e que pôde ser facilmente diagnosticada pela técnica de
soroaglutinação microscópica de amostras colhidas com intervalos de uma semana.
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55
CAPÍTULO 3 – AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DA INFECÇÃO AGUDA
EXPERIMENTAL POR Leptospira interrogans EM FEMEAS SUÍNAS
RESUMO
A leptospirose suína é uma antropozoonose mundialmente distribuída. Neste estudo
avaliaram-se as diferenças histológicas em órgãos de 12 suínos infectados
experimentalmente com cepas de Leptospira interrogans positivos na
soroaglutinação microscópica (SAM), e seis suínos controles soronegativos. No
exame histológico de rotina foram avaliadas amostras de cérebro, fígado, linfonodos,
pulmão e rim. Em casos com lesões sugestivas de infecção por leptospirose
realizou-se a técnica de impregnação pela prata de Warthin-Starry. Todas as
amostras foram negativas na impregnação pela prata. Dentre estas se destacaram a
microgliose mononuclear focal leve em secções de cérebro (8,33%), a hiperplasia
linfoide em linfonodos do mediastino e mesentério (41,66%), a pneumonia intersticial
mononuclear multifocal leve no pulmão (58,33%), hepatite mononuclear multifocal
(41,66%), além de nefrose tubular aguda (100%) e nefrite intersticial em secções de
rim. No teste de Fischer (IC 95%) ocorreu associação entre a condição sorológica
dos animais e as lesões de hepatite mononuclear (p=0,0128), nefrite intersticial
mononuclear (p=0,0004), nefrose tubular (p<0,0001) e pneumonia intersticial
mononuclear (p=0,0377). A utilização da associação do exame histopatológico e a
soroaglutinação microscópica mostrou ser um facilitador no diagnóstico da
leptospirose em suínos. As associações das lesões microscópicas renais com
quadro de hepatite mononuclear podem indicar precocemente a infecção por
Leptospira interrogans em suínos.
Palavras-chave: hepatite mononuclear, leptospirose suína, nefrite intersticial
mononuclear, nefrose tubular, soroaglutinação microscópica.
56
HISTOPATHOLOGICAL EVALUATION OF Leptospira interrogans ACUTE
EXPERIMENTAL INFECTION IN FEMALE PIGS
ABSTRACT
Swine Leptospirosis is a globally anthropozoonosis. In this study we evaluated the
histological differences in organs of 12 pigs experimentally infected with strains of
Leptospira interrogans and positive to microscopic agglutination test (MAT), in
comparison with six pigs seronegative controls. In routine histological examination
samples of brain, liver, lymph nodes, lung and kidney were evaluated. In cases with
suggestive lesions of leptospirosis was performed the Warthin-Starry silver
impregnation technique. All samples were negative on silver impregnation. Only in
the 12 seropositive pigs was found lesions suggestive of leptospirosis. Among them
focal mononuclear microgliosis were seen in 8.33 % of brain sections, lymphoid
hyperplasia in lymph nodes of the mediastinum and mesentery (41.66 %), multifocal
mild mononuclear interstitial pneumonia in the lung (58.33 %), mononuclear hepatitis
(41.66 %), and acute tubular nephrosis (100 %) and interstitial nephritis (91.66%) in
kidney sections. In Fischer's test (95 % CI) there was association between
serological status of animals and the lesions of mononuclear hepatitis (p = 0.0128),
mononuclear interstitial nephritis (p = 0.0004), tubular nephrosis (p < 0.0001) and
mononuclear interstitial pneumonia (p = 0.0377). Associations between renal
histological lesions with mononuclear hepatitis may indicate early infection with
Leptospira interrogans in swines.
Keywords: microscopic agglutination test, mononuclear hepatitis, mononuclear
interstitial nephritis, swine leptospirosis, tubular nephrosis.
57
INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma doença de caráter ocupacional, sendo assim,
constitui-se em importante problema relacionado à saúde pública em diversos
países (LIM, 2009; GUERRA, 2013; OLIVEIRA et al., 2013).
Dentre os animais domésticos, os suínos estão entre os principais
portadores desta bactéria, podendo transmitir a doença para humanos e outras
espécies de animais. Mundialmente, os principais sorovares de leptospiras
encontrados infectando e causando doença em suínos são: Pomona,
Icterohaemorrhagiae, Taravossi, Canicola, Grippotyphosa, Bratislava (ADLER &
MOCTEZUMA, 2010; WASIŃSKI & PEJSAK, 2010; ELLIS, 2012; ROMERO-VIVAS
et al., 2013).
A doença geralmente é assintomática podendo se manter no rebanho
silenciosamente por longos períodos. Causa infecções discretas a inaparentes,
sendo também associada à nefrite intersticial crônica, identificada somente durante o
abate, como pontos brancos na superfície cortical renal (PRESCOTT, 2007;
OLIVEIRA, 2007; ELLIS, 2012).
O diagnóstico da leptospirose muitas vezes é laborioso sendo necessária
a associação entre as investigações clínica e epidemiológica, e provas laboratoriais.
Estas últimas podem contemplar a detecção direta ou indireta do agente ou de seu
material genético (MUSSO & LASCOLA, 2013; PICARDEAU, 2013). Dentre estas
técnicas complementares, o exame histopatológico, constitui-se fácil e eficiente meio
auxiliar no diagnóstico (HASCHIMOTO et al., 2008). Além disto, exame pós-morte
confere ao clínico uma oportunidade de entender o processo pelo qual a doença se
desenvolve individualmente nos suínos. Esse exame vai além da análise macro e
microscópica dos tecidos examinados, permitindo que tais amostras sejam ainda
avaliadas por outras técnicas que comprovem a presença do agente (TORRISON,
2012).
O estudo em tela teve o intuito de avaliar as lesões histológicas em
órgãos de suínos experimentalmente infectados e sororreagentes para Leptospira
interrogans, além da detecção da bactéria pela técnica de impregnação pela prata
de Whartin-Starry.
58
MATERIAL E MÉTODOS
Toda conduta experimental foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso
Animal (CEUA) da Universidade Federal de Goiás (UFG), sob número de protocolo
012/12 (Anexo 1).
Foram utilizadas amostras provenientes da necropsia de 18 suínos
híbridos comerciais, com 40 dias de idade, peso médio de 15 kg, fêmeas, oriundos
de Granjas de Reprodutores Suídeos Certificadas (GRSC), e de matrizes negativas
e não vacinadas para leptospirose. Destas, 12 fêmeas sofreram eutanásia no 21º dia
após a infecção experimental via intraperitoneal com 5mL de cultura de Leptospira
interrogans, contendo de 10 a 20 bactérias por campo de aumento de 200x em
microscópio de campo escuro (SOTO et al., 2006). Além de serem positivas na
soroaglutinação microscópica (SAM) com títulos de 1/800. Adicionalmente,
utilizaram-se amostras de seis animais não inoculados e negativos como controle.
O exame histológico foi realizado no Laboratório de Histopatologia do
Setor de Patologia Animal da EVZ/UFG. Foram colhidos 18 fragmentos de cérebro,
fígado, linfonodo mediastínico, linfonodo mesentérico, pulmão e rim
respectivamente. Os fragmentos foram fixados em solução de formalina tamponada
a 10%, desidratados em soluções crescentes de álcool etílico, depois clarificados em
xilol, incluídos em parafina e laminados a 5µm de espessura (LUNA, 1968). Os
cortes foram corados pela técnica de rotina de hematoxilina e eosina (HE), conforme
BEHMER et al. (1976). A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico de
campo claro, marca Carl Zeiss® modelo Jenaval.
Nos casos sugestivos de lesão por leptospirose, realizou-se a
impregnação pela prata pela técnica de Warthin-Starry. Os cortes desparafinizados e
hidratados foram impregnados em solução de nitrato de prata a 1% por 30 minutos
em 43ºC. Depois, a solução de trabalho foi adicionada aos cortes histológicos até a
visualização de tonalidade amarelo amarronzado. Os cortes foram lavados
rapidamente em água destilada e colocados em água quente para o fim da reação.
Posteriormente, as lâminas foram desidratadas em soluções crescentes de álcool
etílico e por último, passaram por duas vezes em xilol (PROPHET et al.,1992). Como
controle utilizou-se lâmina de um caso previamente testado e positivo à coloração de
Warthin-Starry.
59
Os resultados dos exames foram categorizados em positivo ou negativo e
as alterações histológicas descritas segundo o padrão morfológico da lesão.
Considerou-se (0) quando não havia lesão, (1) para a lesão discreta compreendendo
até 25% do corte do órgão, (2) para moderada compreendendo até 50% do corte do
órgão, (3) para acentuada, cujas alterações compreendiam acima de 50% do corte
do órgão. A análise entre as lesões foi realizada pelo teste não paramétrico de
Kruskal-Wallis, complementado com o teste de comparações múltiplas de Dunn,
para intervalo de confiança de 95%.
O teste de Fischer foi empregado com o intuito de verificar a existência de
associação entre os dados obtidos e a soropositividade. Os dados foram tabulados
no programa Excel 2010 e processados no software Graphpad Instat, versão 3.0.
RESULTADOS
Na análise histológica, somente os tecidos soropositivos na SAM
apresentaram alterações. Nesses casos constataram-se lesões sugestivas de
leptospirose nos 12 animais infectados, havendo ainda, associação significativa
entre o exame histopatológico e o teste sorológico (p < 0.0001), como demonstrado
na Tabela 1.
TABELA 1 - Distribuição da frequência de lesões histopatológicas e da
soroaglutinação microscópica (SAM) em suínos experimentalmente
infectados por Leptospira interrogans.
Lesões Histológicas Total
positivo negativo
SAM positivo 12 (67%) 0 12 (67%)
negativo 0 6 (33%) 6 (33%)
Total
12 (67%) 6 (33%) 18 (100%)
p< 0.0001 (Intervalo de confiança de 95%)
As frequências de lesões nos animais sorologicamente positivos foram de
8,33% (1/12) no cérebro, 66,66% (8/12) no fígado, 41,66% (5/12) nos linfonodos
60
mediastínicos e mesentéricos, 58,33% (7/12) no pulmão e 100% (12/12) no rim,
respectivamente.
Em todos os cortes de rim identificou-se nefrose tubular aguda,
caracterizada por degeneração tubular difusa e moderada, com aumento de
tamanho da célula epitelial tubular, muitas vezes, com vacuolizações citoplasmática
e material eosinofílico amorfo no lúmen (Figura 1). Em 91,66% (11/12) dos casos
observou-se também nefrite intersticial multifocal, discreta em 90,90% (10/11) e
acentuada em 9,09% (1/11), com padrão folicular e predomínio de linfócitos e
plasmócitos (Figura 2A e B).
FIGURA 1 - Rim, suíno: nefrose tubular aguda e difusa, caracterizada por
degeneração das células tubulares, contendo no lúmen material
eosinofílico hialino (HE, 40X).
61
FIGURA 2 – Rim, suíno, nefrite intersticial mononuclear: A. Infiltrado de plasmócitos e
linfócitos peritubular discreta (HE, 20X). B. Infiltrado de linfócitos e
plasmócitos peritubular acentuado (HE, 10X).
No fígado, 66,66% (8/12) das amostras avaliadas havia hepatite
mononuclear focal discreta, caracterizada por infiltrado de linfócitos e plasmócitos
(Figura 3), associada, em alguns casos, a focos discretos de necrose de
hepatócitos.
62
FIGURA 3 – Fígado, suíno: Infiltrado discreto de linfócitos e em menor número de
plasmócitos entre os hepatócitos adjacentes à veia centrolobular (zona III).
(HE, 20X).
No pulmão, também se verificou em 58,33% (8/12), infiltrado semelhante
entre alvéolos e na porção terminal de bronquíolos, característicos de pneumonia
mononuclear multifocal discreta (Figura 4).
As demais alterações compreenderam hiperplasia linfoide difusa
acentuada nos linfonodos mesentéricos (Figura 5 A) e mediastínicos em 41,66%
(5/12) das amostras, e microgliose focal discreta no córtex cerebral de um suíno
(8,33%) (Figura 5B).
A técnica de impregnação pela prata de Warthin-Starry foi negativa em
todas as amostras que apresentaram lesões
63
FIGURA 4 - Pulmão, suíno: Pneumonia intersticial mononuclear multifocal
discreta. Observe o infiltrado de plasmócitos e linfócitos em
bronquíolos terminais (seta) e em alvéolos (HE, 20X).
FIGURA 5 – Suíno. A. Linfonodo mesentérico com hiperplasia linfoide difusa e
acentuada, caracterizada por aspecto homogêneo sendo impossível
distinguir os folículos linfoides (HE, 5X). B. Córtex cerebral com
proliferação focal discreta da micróglia (microgliose focal discreta) (HE,
10X).
Na análise de variância das lesões entre os órgãos, o teste de Kruskal-
Wallis foi significativo (p<0,0001). Sendo observadas diferenças estatísticas entre a
microgliose cerebral, a nefrose tubular (p<0,001) e a nefrite intersticial (p<0,05); a
64
hepatite e a nefrose tubular (p<0,01); a nefrose tubular, pneumonia (p<0,01) e
hiperplasia linfoide (p<0,05).
No teste de Fischer (IC 95%) ocorreu associação entre a condição
sorológica dos animais e as lesões de hepatite mononuclear (p=0,0128), nefrite
intersticial mononuclear (p=0,0004), nefrose tubular (p<0,0001) e pneumonia
intersticial mononuclear (p=0,0377), como resume a Tabela 2.
65
TABELA 2 - Associação entre o diagnóstico histopatológico e sorologia na SAM em cérebro, fígado, linfonodos, pulmão e
rim de animais experimentalmente infectados com Leptospira interrogans
Cérebro Fígado* Linfonodos Pulmão** Rim***
MGFD + MGFD - HMFD + HMFD - HLDA + HLDA - PIMMD + PIMMD - NIMM + NIMM - NTDM + NTDM -
SA
M + 1 11 8 4 5 7 7 5 11 1 12 0
- 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6
0: ausência de lesão; HLDA: hiperplasia linfoide difusa acentuada; HMFD: hepatite mononuclear focal discreta; MGFD: microgliose
focal discreta; NIMM: nefrite intersticial mononclear multifocal; NTDM: nefrose tubular difusa moderada; PIMMD: pneumonia
intersticial multifocal discreta.
*p<0,0128 (teste de Fischer, IC 95%).
**p=0,0377 (teste de Fischer, IC 95%).
*** p=0,0004 para NIMM e p<0,0001 para NTDM (teste de Fischer, IC 95%)
66
DISCUSSÃO
As detecções de lesões sugestivas de leptospirose nos cortes histológicos
de animais com sorologia positiva demonstraram que esta associação é um método
auxiliar de diagnóstico para a doença em suínos, o que também foi descrito por
PRESCOTT (2007).
O presente estudo confirmou as observações de MONAHAN et al. (2009)
de que os rins são os principais órgãos-alvo da leptospirose. Isto pôde ser facilmente
observado pela associação dos resultados de positividade na SAM com a frequência
das lesões histopatológicas renais de nefrite intersticial mononuclear e nefrose
tubular apresentadas neste experimento.
A nefrite intersticial mononuclear encontrada em 91,6% dos rins de
animais soropositivos é descrita também por vários autores como UZAL et al.
(2002), CAMPOS et al. (2011), GONÇALVES & COSTA (2011), ELLIS (2012) e
FIGUEIREDO et al. (2013) como achado comumente observado na leptospirose
tanto em animais quanto em humanos. Em suínos, essa lesão tem sido
correlacionada aos sorovares dos sorogrupos Pomona, Tarassovi e Australis (ELLIS,
2012). Entretanto, OLIVEIRA-FILHO et al. (2012) e HASCHIMOTO et al. (2008) não
encontraram correlação positiva entre essa lesão microscópica e a positividade na
SAM, diferentemente do encontrado neste ensaio experimental onde esta relação foi
fortemente evidenciada.
A reprodução de modelo experimental de inoculação de leptospiras em
suínos permitiu observar que a nefrose tubular é a principal lesão histopatológica e
geralmente é acompanhada de infiltrado de plasmócitos e linfócitos focais,
entretanto o mecanismo pelo qual esta injúria tubular ocorre, ainda está pouco
elucidado. DROLET (2012), entretanto, afirma que a ocorrência de nefrose tubular
aguda predominantemente nos túbulos contorcidos proximais, ocorra graças à alta
taxa metabólica de suas células epiteliais, sendo especialmente suscetíveis à danos
causados por isquemia prolongada ou nefrotoxinas, que são as principais causas
deste tipo de nefropatia.
Na leptospirose alguns autores concordam que a degeneração tubular
resulta de alterações vasculares como hipóxia e hipovolemia, provavelmente
causadas por fatores de virulência bacteriana, com os lipopolissacarídeos e
67
esfingomielinases (HAAKE, 2000; MATSUNAGA et al., 2003; WU et al., 2008;
CONFER & AYALEW, 2013). Adicionalmente, ARAÚJO et al. (2010) descrevem que
a lesão degenerativa primária nos túbulos contorcidos proximais altera o transporte
de água e sódio, aumentando a excreção distal de potássio, a hipocalemia e poliúria,
agravando assim, os sinais clínicos.
Neste experimento lesões condizentes com quadro de leptospirose
também foram encontradas no fígado, pulmão e cérebro de suínos sorologicamente
positivos. Porém, apenas as alterações hepáticas e pulmonares tiveram associação
positiva no teste estatístico. Segundo ADLER & MOCTEZUMA (2010), OSAVA et al.
(2010) e ELLIS (2012), diferentes órgão podem ser colonizados pela bactéria
durante a fase de leptospiremia, o que confirma nossos achados.
A pneumonia intersticial mononuclear juntamente com a hepatite
mononuclear aqui descritas, configuraram os principais achados histológicos de
DELBEM et al. (2002) e CAMPOS et al (2011) em análises de materiais de
frigoríficos oriundos de suínos positivos para leptospirose. Neste último estudo, os
antígenos foram detectados pela técnica de imuno-histoquímica em células
fagocíticas do septo interalveolar, no endotélio vascular e no epitélio alveolar do
pulmão. No fígado, os antígenos estavam presentes nos hepatócitos.
Os resultados negativos no teste de impregnação pela prata de Whartin-
Starry, em amostras de animais positivos na SAM, podem ser devido à eliminação
das bactérias nos rins consequente à produção de anticorpos específicos.
FIGUEIREDO et al. (2013) também não conseguiram êxito ao utilizarem essa
técnica em 18 tecidos renais de suínos soropositivos. Da mesma maneira,
MIRAGLIA et al. (2008) só encontraram amostras de rins positivas no Warthin-Starry
em 2,92% (4/137) das amostras por eles testadas. Além do mais, para alguns
autores, a técnica de impregnação pela prata tem uso limitado por apresentar
problemas relacionados à instabilidade dos reagentes, à coloração de outras
estruturas que não as espiroquetas, e à dificuldade na identificação dos
microrganismos ou seus produtos antigênicos, principalmente quando em meio
intracelular (SCANZIANI et al., 1989; KIERNAN, 2002; SYKES et al., 2011, MUSSO
& LASCOLA, 2013).
68
CONCLUSÕES
A utilização da associação do exame histopatológico e a soroaglutinação
microscópica mostrou ser método auxiliar no diagnóstico da leptospirose em suínos.
Nestas condições experimentais de leptospirose suína, não se obteve
êxito com a utilização da técnica de impregnação pela prata nas amostras
previamente positivas na soroaglutinação microscópica.
A nefrose tubular aguda difusa acompanhada de nefrite intersticial
mononuclear multifocal foram as principais lesões histopatológicas da doença.
As associações das lesões microscópicas renais com quadro de hepatite
mononuclear focal podem indicar a infecção por Leptospira interrogans em suínos à
avaliação microscópica utilizando-se a coloração de rotina de hematoxilina e eosina.
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72
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
Embora se saiba que a leptospirose é uma zoonose importante em países
em desenvolvimento, como o Brasil, somente nas últimas décadas aumentou-se a
quantidade de pesquisas aprofundadas sobre a patogenia desta enfermidade.
Diversos estudos estão sendo realizados em linhagens celulares. Deve-se
salientar que experimentos in vitro muitas vezes não são representativos das
condições da infecção no hospedeiro. Trabalhos relatam ainda, dados obtidos pela
infecção de certos sorovares do gênero Leptospira em animais de laboratório e em
humanos. Porém, devido à especificidade dos sorovares aos diferentes hospedeiros
deve-se ter cuidado na extrapolação destes dados para outros sorovares, espécies
de Leptospira ou mesmo hospedeiro.
A utilização de modelos experimentais para o estudo da leptospirose
suína é de suma importância para o entendimento da patogênese dos diferentes
sorovares, e da relação entre estes e seus hospedeiros. No Brasil, diversos estudos
sorológicos têm sido conduzidos em suínos, entretanto não se sabe ainda a real
importância desses sorovares para a suinocultura brasileira.
O presente estudo permitiu através da tabulação e interpretação dos
resultados, a observação da ocorrência da leptospirose assintomática em suínos
jovens. Além de contribuir com dados sobre as alterações macroscópicas e
histológicas da leptospirose em suínos pelos sorogrupos Icterohaemorrhagiae e
Pomona, visto que há poucos relatos sobre o assunto na literatura disponível.
As manifestações clínicas inespecíficas encontradas neste estudo
mostram a necessidade de técnicas que possibilitem a rapidez no diagnóstico da
doença e adoção, com a maior precocidade possível, medidas adequadas de
tratamento e saúde pública. Na atualidade, a despeito da disponibilidade de meios
diagnósticos mais sensíveis e confiáveis, ainda são utilizados métodos antigos e
pouco sensíveis nas rotinas das granjas produtoras de suínos. Para reverter esta
situação há necessidade de investimentos em tecnologias de produção que
viabilizem a um custo adequado ao produtor destas novas ferramentas de
diagnóstico.
Cada técnica laboratorial realizada apresenta limitações para o uso no
diagnóstico de rotina. Resultados falso-negativos são comuns à maioria desses
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métodos, sendo assim necessária a padronização de técnicas mais sensíveis, e ao
mesmo tempo específicas. As técnicas de isolamento são demoradas e trabalhosas,
sendo restritas a poucos laboratórios e requer a presença de leptospiras viáveis, o
que dificulta ainda mais a detecção do microrganismo em materiais que não sejam
inoculados imediatamente após a colheita. A soroaglutinação microscópica e a
cultura, embora ainda sejam consideradas técnicas de referências, exigem
experiência do técnico responsável pelos exames e um esforço contínuo para a
manutenção das coleções de leptospiras viáveis.
Para o diagnóstico histológico, há necessidade ainda, de se testar outras
técnicas para identificação do agente, como a técnica de imuno-histoquímica ou
hibridização in situ. Assim, seria comprovada se as lesões histológicas compostas
por infiltrado inflamatório mononucleares, realmente são decorrentes da infecção por
leptospiras em suíno, visto que o teste de impregnação pela prata não se
apresentou como um teste eficiente.
Algumas lacunas ainda devem ser preenchidas. A utilização de antígenos
para detecção de ampla variedade de bactérias do gênero Leptospira,
principalmente nos testes sorológicos e nas infecções subclínicas ou recentes,
ajudaria na triagem dos animais positivos. Adicionalmente, o desenvolvimento de
vacinas de genes deletados seria crucial na diferenciação entre os animais
infectados e os vacinados.
É fundamental considerar ainda que, a identificação da espécie
responsável pela infecção é importantíssima para que se desenvolvam estratégias
de controle e prevenção da doença. Neste âmbito, as técnicas moleculares seriam
as soluções mais eficientes. Entretanto, o custo e o desenvolvimento de técnicas
voltadas mais para o diagnóstico da leptospirose humana tornam essa possibilidade,
em curto prazo, não acessível aos produtores de suínos.
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Anexo 1 - Aprovação do projeto protocolado sob o número 012/12, pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEAU)