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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Identificação de sorovares de Leptospira Identificação de sorovares de Leptospira Identificação de sorovares de Leptospira Identificação de sorovares de Leptospira

por por por por PCRPCRPCRPCR----RFLP do gene que codifica a RFLP do gene que codifica a RFLP do gene que codifica a RFLP do gene que codifica a

subunidade subunidade subunidade subunidade ββββ da RNA polimerase (rpoB)da RNA polimerase (rpoB)da RNA polimerase (rpoB)da RNA polimerase (rpoB)

ORIENTADO: Lenice Roteia Cardoso Jung

ORIENTADOR: Prof. Dr. Álvaro Cantini Nunes

CO-ORIENTADORA: Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim

BELO HORIZONTE

Outubro - 2009

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Lenice Roteia Cardoso Jung

Identificação de sorovares de Leptospira por PCR-RFLP do gene que codifica a subunidade ββββ da RNA

polimerase (rpoB)

ORIENTADOR: ÁLVARO CANTINI NUNES

CO-ORIENTADORA: MARIA ROSA QUARESMA BOMFIM

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Biologia Geral

Belo Horizonte, MG

Outubro/2009

Dissertação apresentada ao Departamento de

Biologia Geral do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais, como requisito para obtenção do grau

de mestre em Genética.

iii

043 Jung, Lenice Roteia Cardoso Identificação de sorovares de Leptospira por PCR-RFLP do gene que codifica a subunidade β da RNA polimerase (rpoB). [manuscrito] / Lenice Roteia Cardoso Jung. – 2009. 57 f. : il. ; 29,5 cm. Orientador: Álvaro Cantini Nunes. Co-orientadora: Maria Rosa Quaresma Bomfim Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Biologia Geral.

Leptospira – Identificação – Teses. 2. Genética – Teses. 3. Reação em cadeia de polimerase – Teses. 4. Polimorfismo de fragmento de restrição. I. Nunes, lvaro Cantini. II. Bomfim, Maria Rosa Quaresma. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Biologia Geral. IV. Título. CDU: 575

v

Esse trabalho é dedicado aos meus pais,

“in memoriam”, pois me fizeram compreender

o sentido do trabalho, valorizar o conhecimento

e superar as adversidades, na

busca por meus objetivos.

vi

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

Agradeço ao Departamento de Genética, na figura do meu orientador o

Professor Dr. Álvaro Cantini Nunes, a grande oportunidade, aceitando-

me como mestranda, sua eficiente orientação, a valiosa experiência e a

confiança que me presenteou;

À Secretaria de Educação do Estado de Minas Gerais, representada pela

Dra. Vanessa Guimarães, por autorizar a licença solicitada, para que eu

pudesse freqüentar o mestrado em genética.

À co-orientadora e amiga, Dra Maria Rosa Quaresma Bomfim, agradeço

a disponibilidade, dedicação, altruísmo e sabedoria.

Ao professor Élvio Carlos Moreira e ao técnico Antônio Benjamin de Paula,

do laboratório de Leptospiras do DMP da Escola de Veterinária, sou grata

pela gentileza de fornecer as linhagens de referência, para a pesquisa.

Às professoras Regina Maria Nardi Drummond e Vera Lúcia dos Santos,

agradeço por me permitirem usar o Laboratório de Microbiologia

Aplicada;

Aos colegas: doutorando João Luiz Moreira e mestranda Marlene de

Miranda minha gratidão por guiarem meus “primeiros passos” no

laboratório de genética;

Aos professores, colegas e funcionários, com os quais convivi durante o

Mestrado em Genética e no LGMPP, sou grata pelo aprendizado, a ótima

convivência, a preciosa cooperação e profissionalismo durante os

trabalhos e estudo.

A toda minha família e amigos, agradeço o estímulo, carinho e

paciência, em função da minha constante ausência;

E mais uma vez, agradeço a Deus, por me conceder sempre, esse precioso

tesouro que é ter: saúde, energia e disposição, suficientes para realizar

tudo o que desejo, com muita alegria e paz.

Obrigada!

vii

O conhecimento participa do Infinito;

ele amplia nossas capacidades;

quanto mais alto nele subimos,

mais vastas e magníficas, são as perspectivas,

que se descortinam à nossa frente.

Luiz Roberto Garcia Sierra

Livro: “REFORMA INTERIOR, UM CONVITE À REFLEXÃO”

SUMÁRIO

viii

RESUMO ...................................................................................................................... 1

ABSTRACT .................................................................................................................. 2

1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 3

1.1. A leptospirose : contextualização histórica............................................................. 3

1.2. Patogênese na leptospirose .................................................................................. 4

1.3. Características do gênero Leptospira..................................................................... 5

1.3.1. As leptospiras: características estruturais e requerimentos nutricionais............. 5

1.3.2. Identificação e taxonomia: a complexidade do gênero Leptospira...................... 7

1.3.3. O genoma de Leptospira spp. ............................................................................ 11

2. OBJETIVO GERAL.................................................................................................... 12

2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 12

3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 13

3.1. Cultivo dos sorovares de Leptospira de referência ............................................... 13

3.2. Extração do DNA ................................................................................................... 13

3.3. Quantificação do DNA ........................................................................................... 15

3.4. Seleção dos genes para amplificação e estudo de polimorfismo ......................... 15

3.5. Padronização da PCR – específica para o gene rpoB e análise de restrição ...... 16

3.5.1. Análise in silico dos genes ................................................................................. 16

3.5.2. Gene rpoB .......................................................................................................... 17

3.5.3. Digestão com endonucleases de restrição ........................................................ 17

3.5.4. Análise dos produtos da PCR-específica e da digestão enzimática ................. 18

3.5.5. Confecção dos dendogramas ............................................................................ 18

4. RESULTADOS ......................................................................................................... 19

Análise dos dendogramas construídos a partir dos produtos de PCR digeridos com

as enzimas TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI ............................................................ 35

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 45

6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 52

8. APÊNDICE ............................................................................................................... 56

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Ciclo de vida, vias de infecção, o reservatório e a patogenia das leptospiras ..... 4

FIGURA 2. a, b) estrutura das leptospiras; c) posição dos flagelos e eixo de rotação no

espaço periplasmático ............................................................................................................ 6

FIGURA 3. Leptospira interrogans, sorovar Icterohaemorrhagiae, exibindo as estruturas em

gancho. a. eletromicroscopia, b. microscopia em campo escuro ........................................... 6

FIGURA 4. Arquitetura da superfície das leptospiras, mostrando na membrana externa (OM,

outer membrane) a camada de lipopolissacarídeos que define os sorovares ....................... 8

FIGURA 5. Características dos genomas já seqüenciados de leptospiras patogênicas e

saprofíticas ............................................................................................................................ 12

FIGURA 6. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos de rpoB depositadas no GenBank

e geradas por seqüenciamento pelo nosso grupo ................................................................ 20

FIGURA 7. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos de rpoB indicando os sítios de

restrição de TaqI (verde), Tru1I (azul), Sau3AI (roxo), MslI (vermelho) e EcoNI (laranja)

(continuações) ................................................................................................................. 21-26

FIGURA 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos de PCR do gene rpoB

digeridos com a endonuclease de restrição TaqI; Mr corresponde ao padrão de massa

molecular 100 pb ladder ....................................................................................................... 30


digeridos com a endonuclease de restrição Tru1I; Mr corresponde ao padrão de massa



digeridos com a endonuclease de restrição Sau3AI; Mr corresponde ao padrão de massa



digeridos com a endonuclease de restrição MslI; Mr corresponde ao padrão de massa



digeridos com a endonuclease de restrição EcoNI; Mr corresponde ao padrão de massa


FIGURA 13. Dendograma dos 68 sorovares de Leptospira obtido pela análise das bandas

geradas com a endonuclease de restrição TaqI ................................................................... 39

x


geradas com a endonuclease de restrição Tru1I ................................................................. 40


geradas com a endonuclease de restrição Sau3AI .............................................................. 41


geradas com a endonuclease de restrição MslI ................................................................... 42


geradas com a endonuclease de restrição EcoNI ................................................................ 43


geradas com as endonucleases de restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI ................ 44

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Linhagens, sorovares, sorogrupos e espécies do gênero Leptospira, usados na

pesquisa ................................................................................................................................ 14

TABELA 2. Genes estruturais candidatos a análise de restrição para a identificação

molecular dos sorovares de Leptospira, iniciadores e referência bibliográfica .................... 16

TABELA 3. Condições da PCR - específica com os iniciadores Lept 1900f e 2500r,

produzidos para amplificação de parte do gene rpoB .......................................................... 17

TABELA 4A. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima TaqI ............. 27

TABELA 4B. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima Tru1I ............ 27

TABELA 4C. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima Sau3AI ........ 28

TABELA 4D. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima MslI .............. 28

TABELA 4E. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima EcoNI ........... 28

TABELA 5. Agrupamento dos sorovares, sorogrupos e espécies do gênero Leptospira,

usados na pesquisa, pelos perfis de restrição compostos pelas cinco endonucleases ....... 29

TABELA 6. Sorovares de Leptospira identificados pela metodologia de PCR-RFLP do gene

rpoB com as enzimas restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI ...................................... 37

xi

Abreviaturas e Símbolos

% - por cento

µµµµ – micro

BSA – “bovine serum albumin” / albumina de soro bovino

DNA – ácido desoxirribonucléico

dNTP – 2’-desoxirribonucleotídeo 5’-trifosfato

EDTA – ácido etilenodiaminotetracético

ELISA – “enzyme-linked immunosorbent assay” / ensaio de imunoadsorção por ligação

enzimática

EST – “Expressed Sequence Tags” / Marcadores de seqüências expressas

g – grama

h – horas

kDa – quilo Dalton

L – litro

LPS – lipopolissacarídeos

m – mili

M – molar

MLST – “Multi Locus Sequence Typing” / Tipagem por seqüência de múltiplos locos

nm – nanômetro

ºC – graus Célsius

OM – “outer membrane” / membrana externa

OMS – Organização Mundial de Saúde

pb – pares de bases

PCR – “polymerase chain reaction” / reação em cadeia da polimerase

PFGE – “Pulse Field Gel Electrophoresis” / Eletroforese em Gel de Campo Pulsátil

rpm – rotações por minuto

PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida

Tris – tris-(hidroximetil)-aminometano

U – unidade

V – volts

VNTR – “Variable Number of Tandem Repeats” / Número variável de repetições em

tandem

xg – gravidade

1

RESUMO

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com altas taxas de mortalidade e

morbidade em humanos e animais, cujo agente etiológico é classificado em uma variedade

de sorogrupos e sorovares em função de seus determinantes antigênicos. A caracterização

destes sorovares circulantes é essencial para o melhor entendimento da epidemiologia da

doença e, para tanto, até recentemente, a observação da bactéria requeria microscopia de

campo escuro e a principal identificação era baseada em sorotipagem. Atualmente, estudos

envolvendo ferramentas moleculares alternativas para a detecção, identificação e

classificação das linhagens epidemiológicas se fazem necessários, na tentativa de viabilizar

a tipagem de rotina através da aplicação de um método mais rápido, preciso e de fácil

execução. Esta necessidade por rapidez e caracterização específica das leptospiras tem

estimulado o uso de novos testes moleculares tais como amplificação por PCR de regiões

variáveis de genes conservados para a tipagem dos sorovares. O objetivo deste estudo foi

investigar a possível identificação dos sorovares de Leptospira por RFLP do gene rpoB,

codificador da subunidade beta da RNA polimerase. DNA foi extraído de 68 sorovares de

Leptospira, pertencentes a 11 espécies patogênicas e saprofíticas diferentes. Ensaios por

PCR foram realizados usando iniciadores específicos desenhados para amplificar um

fragmento polimórfico do gene rpoB. A digestão enzimática foi realizada usando as

endonucleases de restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI, selecionadas previamente

pelos perfis de digestão in silico de ESTs (Expressed Sequence Tags) e seqüências de

nucleotídeos disponíveis nos bancos de dados. Os fragmentos de restrição foram separados

por eletroforese em géis de poliacrilamida e corados com nitrato de prata. A metodologia

empregada permitiu diferenciar 37% dos sorovares testados. Contudo 43 sorovares de 9

espécies ainda permaneceram agrupados sem um perfil individual. Por outro lado, vale

ressaltar que neste trabalho foram avaliados apenas cerca de 25% das quase 268 sorovares

já descritas na literatura. A tipagem por PCR-RFLP se mostrou viável apesar de manter a

maior parte dos sorovares agrupada em pequenos clusters, podendo ser muito útil no

estudo epidemiológico da leptospirose e para o desenvolvimento de estratégias apropriadas

de prevenção, ou ainda, para a identificação das espécies de Leptospira.

2

ABSTRACT

Leptospirosis is a zoonotic disease with high mortality and morbidity rates in humans and

animals throughout the world, which its causal agent, Leptospira spp., has been classified

into serogroups and serovars as a function of their antigenic determinants. Identification of

Leptospira species is not as important as the determination of the serovar of isolates

because this is essential to an understanding of the epidemiology of leptospirosis. Modern

DNA-based methodologies have greatly improved laboratory procedures for the detection,

identification and classification of epidemiologic strains. To date, observation of these

bacteria requires dark-field microscopy, and their major identification has long relied on

serotyping. The development of alternative tools for identification of Leptospira serovars is

required for routine typing, to circumvent the need of the preparation of rabbit immune sera

against them and become the methodology less time-consuming, more accurate and easy to

be done. This need for rapid and specific characterization of leptospires has stimulated the

use of new molecular tests such as PCR amplification of variable regions of conserved

genes for serovar typing. The aim of this study was to investigate the possible identification

of Leptospira serovars by RFLP typing of rpoB gene, coding the beta subunit of RNA

polymerase. DNA was extracted from 68 Leptospira serovars, belonging to 11 different

pathogenic and saprophytic species. Polymerase chain reaction (PCR) assays were

performed using specific primers designed to amplify a polymorphic fragment of the gene

rpoB. The enzymatic digestion was performed using the restriction endonucleases TaqI,

Tru1I, Sau3AI, MslI and EcoNI, previously selected based on in silico digestion of Expressed

Sequence Tags and nucleotide sequences available in databases. The restriction fragments

were separated in polyacrylamide gels and stained with silver nitrate. We were able to

differentiate 37% of the serovars tested, however 43 serovars from 9 species were not

separated yet, been grouped at small clusters. By use of restriction typing, the phylogenetic

study of extremely fastidious Leptospira species can be carried out without the need to

culture them. In addition, this technique is a promising tool to evaluate genetic diversity of

related strains and may be useful to differentiate Leptospira serovars within the species.

3

INTRODUÇÃO

1.1. A leptospirose: contextualização histórica

Foi em 1886 que WEIL deu seu nome à doença humana que afetava as tropas de

Napoleão Bonaparte, caracterizando-a como uma doença infecciosa que causa

esplenomegalia, icterícia e nefrite (FAINE et al., 1999). O agente causador ainda não era

conhecido, mas estava associado a várias síndromes em animais domésticos e selvagens.

Em 1907, STIMSON usou uma técnica descrita por LEVADITH para corar e observar

espiroquetas nos tecidos de rins de pacientes mortos com sintomas da Febre de Weil. A

coloração foi reproduzida e fotografada por NOGUCHI em 1928, que a denominou de

Spirochaeta ? (interrogans). E foi no Japão, onde a doença de Weil era comum entre os

mineradores, que em 1914 INADA e colaboradores conseguiram infectar, com sucesso,

porquinhos da índia, nos quais observaram uma bactéria espiralada denominando-a

Spirochaeta icterohaemorrhagiae. Estes pesquisadores conseguiram ainda preparar um

soro imune contra a bactéria e demonstraram proteção passiva e bacteriólise intraperitoneal

nas cobaias. Em trabalhos sucessivos foram descritos o modo de infecção, a distribuição

das bactérias nos tecidos, a excreção, multiplicação, filtrabilidade e características

morfológicas, inclusive a degeneração de suas células dentro de formações granulares.

Entre 1914 e 1918, durante a Primeira Guerra Mundial na Europa, houve aumento da

doença, estimulando a pesquisa de campo na Alemanha. Dessa época em diante foram

conhecidos outros agentes da doença, de origem leptospiral, que reagiam com diferentes

soros testados (sorovares) e, ainda, que alguns desses sorovares provocavam icterícia e

outros não.

Nas últimas décadas a leptospirose ficou conhecida como uma importante

antropozoonose mundialmente distribuída causada por espiroquetas patogênicas do gênero

Leptospira (Ordem Spirochaetales, família Leptospiraceae), podendo acometer animais

silvestres, domésticos e o homem. A doença tem distribuição cosmopolita, ocorrendo em

ambientes urbanos de cidades industrializadas e em desenvolvimento, bem como nas áreas

rurais de todo o Planeta (BHARTI et al., 2003). De acordo com LEVETT em 2001 e

MCBRIDE et al. em 2005, trata-se de uma zoonose que tem os roedores como reservatório,

sendo o Rattus norvegicus o principal reservatório urbano (Figura 1).

Em publicação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de 1999, a leptospirose foi

considerada uma doença infecciosa reemergente, principalmente de regiões tropicais e

subtropicais, com a ocorrência de extensos surtos na Nicarágua, Índia, Brasil, Sudeste da

Ásia, Estados Unidos da América, China, Malásia, e outros países, com mais de 500.000

casos cada ano e índice de mortalidade superior a 10%.

1.2. Patogênese na leptospirose

As características da doe

atingindo muitos órgãos. A tran

entre os animais reservatório

preferência, mas não exclusiv

doença na forma grave. Os rato

sorogrupo Icterohaemorrhagiae

reservatórios para o sorogrupo B

renais de vários animais e sob

terem sido excretadas na urin

penetra na pele lesada ou por m

mas são apenas hospedeiros te

mais comum é através das muc

estabelecendo uma infecção sis

atingindo o sistema sanguíneo,

leptospiras raramente penetram

em monocamadas celulares, se

Desse modo, causam as form

disseminação por excreção das

Figura 1. Ciclo de vida, as vias

A infecção de seres hum

água e alimentos contaminados

ença variam desde uma infecção simples até

ansmissão da leptospirose requer a circulação

rios. Os sorovares das Leptospiras aprese

ividade, por certos hospedeiros, nos quais n

atos da espécie Rattus norvegicus servem de r

e, enquanto os camundongos da espécie Mus

Ballum. As Leptospiras colonizam e se espalha

obrevivem por semanas e até meses, no solo

rina. Os humanos são hospedeiros acidentais

r membranas mucosas, produzindo a forma agu

temporários da bactéria. Nos animais, a forma

ucosas ocular, genital e oral ou pequenos ferim

sistêmica ao atravessarem as barreiras naturais

o, para disseminação através das junções intr

m nas células, embora esta já tenha sido obse

sem alterar a polarização elétrica da célula (KO

mas aguda e crônica da doença, levando a

s leptospiras durante longo tempo.

s de infecção, o reservatório e a patogenia das l

manos pode ocorrer por respingos de urina o

os por urina de outros hospedeiros, geralment

4

é a forma grave

ão do patógeno

sentam alguma

não causam a

reservatório do

us musculus são

lham nos túbulos

lo e água, após

ais e a bactéria

guda da doença,

a de penetração

imentos na pele,

is dos tecidos e

ntracelulares. As

servada in vitro,

KO et al., 2009).

a colonização e

leptospiras.

ou ingestão de

nte os roedores.

5

As bactérias após a penetração pela pele lesada ou membranas mucosas alcançam o

sistema circulatório e sendo altamente móveis, migram para o líquido cefalorraquidiano,

produzem hialuronidases, multiplicam-se rápida e intensamente, atingindo vários órgãos,

sendo responsáveis pelo rompimento de pequenos vasos, causando as principais

manifestações da leptospirose. Os fatores de virulência das leptospiras mais conhecidos são

os filamentos axiais (para a penetração em “saca-rolhas”), a capa de proteínas específicas e

lipopolissacarídeos (endotoxinas).

Os sintomas da doença são freqüentemente confundidos com os de uma gripe

comum, indo até a falência renal. Estes sintomas podem ser semelhantes aos da Dengue,

Malária e várias outras doenças, atrasando o diagnóstico que raramente é feito em tempo

de se tratar o paciente com os cuidados necessários e, se a doença não for tratada, o

paciente pode desenvolver meningite, falência dos rins, fígado, respiratória e até morrer.

1.3. Características do gênero Leptospira

1.3.1. As leptospiras: características estruturais e requerimentos nutricionais

As leptospiras formam um grupo de bactérias que divergiu cedo na evolução dos seres

vivos; vivem em vários ambientes como agentes infecciosos de animais ou em vida livre

(Figura 1). As leptospiras são aeróbias obrigatórias, altamente flexíveis e móveis, com forma

alongada, helicoidal e suas células têm diâmetro que varia conforme o grupo de 0,09 µm a

0,75 µm e comprimento de 3 µm a 500 µm. Possuem uma estrutura típica, sendo envoltas

por um envelope de várias camadas (envelope externo), logo abaixo a camada de

peptideoglicanos (parede celular) e a membrana plasmática externa envolvendo o conteúdo

do cilindro protoplasmático da célula (OM) (Figura 2). Entre o envelope externo e a parede

celular estão os flagelos axiais, responsáveis pelo movimento rotatório da bactéria, um em

cada pólo, estendidos para o centro, porém nunca se tocam. As proteínas FlaA e FlaB

formam a bainha e centro dos flagelos, respectivamente. PICARDEAU et al. em 2001,

demonstraram que mutantes para essas proteínas não têm mobilidade. Os

lipopolissacarídeos (LPS) do envelope externo são o alvo principal do sistema anticorpo-

complemento, na reação bactericida do hospedeiro (JOHNSON, 1977). Na maioria das

espécies há uma dobra em forma de gancho em uma das extremidades da célula,

conferindo mais uma característica exclusiva ao grupo (Figura 3).

6

a..

b..

Figura 2. a, b) estrutura das Leptospiras; c) posição dos flagelos e eixo de rotação no

espaço periplasmático.

O seqüenciamento dos genes que codificam a porção 16S do RNA ribossômico indica

que as espiroquetas são o grupos mais antigos entre as bactérias, que evoluíram de um

único ancestral comum, as proto-espiroquetas (MATTHIAS et al., 2008), e contém

ramificações, que refletem a patogenicidade das espécies. Considerando a relação

constante de divergência em 1 a 2% em cada 50 milhões de anos, para o gene rrs, calcula-

se que o tempo de separação entre L. interrogans e L. biflexa esteja entre 590 e 295

milhões de anos (CERQUEIRA E PICARDEAU, 2009).

Figura 3. Leptospira interrogans, sorovar Icterohaemorrhagiae, exibindo as estruturas em

gancho. a. eletromicroscopia, b. microscopia em campo escuro.

Os lipopolissacarídeos (LPS) do envelope externo constituem o principal antígeno de

Leptospira e são estrutural e imunologicamente similares aos LPS de organismos Gram-

negativos. (ADLER E DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2009). Os lipopolissacarídeos são o

primeiro contato da bactéria com os tecidos do hospedeiro e o alvo do sistema anticorpo-

complemento, na reação bactericida do hospedeiro (JOHNSON, 1977).

Os lipídios A das leptospiras possuem características pouco comuns tais como uma

unidade do dissacarídeo glicosamina, fosforilado e metilado. Vários polipeptídios estruturais

e funcionais estão presentes na OM e atuam na interação célula-hospedeiro, juntamente

7

com os LPS. Estes polipeptídios são lipoproteínas, abundantes na superfície celular, LipL32,

LipL21 e LipL41 (NASCIMENTO et al., 2004).

A temperatura ideal para crescimento das leptospiras, em laboratório, é entre 28 e

30ºC, mas já foi comprovado que as bactérias patogênicas se reproduzem melhor em

temperatura corporal, desde que não ultrapasse 42ºC. Estas sobrevivem sob congelamento,

voltando a reproduzirem-se aos 10ºC. Não sobrevivem na ausência de água e são muito

sensíveis a produtos químicos, detergentes, ácidos e metais pesados, mesmo em baixas

concentrações. Utilizam ácidos graxos de cadeia longa como fonte de carbono, sais de

amônio e são exigentes quanto a algumas vitaminas (B1 e B12) e o pH do meio (7,2 a 7,4).

1.3.2. Identificação e taxonomia: a complexidade do gênero Leptospira

O gênero Leptospira pertence ao filo Spirochaetes e inclui três subgrupos, o de

espécies saprófitas com Leptospira biflexa, L. wolbachii, L. kimetyi, L. meyeri, L. vauthielli, L.

terpstrae e L. yanagawae, o grupo de espécies patogênicas com L. interrogans, L.

kirschneri, L. noguchii, L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. alexanderi e L. alstonii, e

um grupo intermediário onde estão as espécies L. inadai, L. broomi, L. fanei, L. wolffii e L.

licerasiae, cuja patogenicidade ainda não foi definida.

O gênero é dividido em mais de 250 sorovares, pertencentes a duas espécies: L.

interrogans e L. biflexa (classificação sorológica ou sensu lato), contendo as linhagens

patogênicas e saprofíticas, respectivamente. Esta classificação sorológica é baseada em

testes imunológicos como reação de soro-aglutinação microscópica (SAM) e absorção

cruzada de aglutininas. Contudo, o desenvolvimento da biologia molecular tem proposto

mudanças taxonômicas, classificando em três espécies não patogênicas, L. biflexa, L.

meyeri, L. wolbachii, e em sete patogênicas, L. interrogans, L. inadai, L. kirschneri, L.

noguchii, L. santarosai, L. weilii e L. borgpetersenii (OLIVEIRA et al, 2009). A caracterização

das Leptospiras isoladas de pacientes é importante para compreender as propriedades

epidemiológicas da doença e o sorovar é usado para classificar essas bactérias, definindo-

os com base na heterogeneidade estrutural dos carboidratos que compõem a camada de

lipopolissacarídeos (LPS) (CERQUEIRA E PICARDEAU, 2009) presente na membrana

externa (OM), conforme ilustrado na Figura 4.

8

Fig

ura

4.

Arq

uitetura da superfície das leptospiras, mostrando na membrana externa (outer membrane) a

camada de lipopolissacarídeos (LPS) que define os sorovares (ZUERNER et al., 2000).

Com os métodos genéticos, que levam a classificação sensu stricto, ficou claro que o

conceito de “sorovar” já não é satisfatório, pois falha ao definir linhagens

epidemiologicamente importantes. Por exemplo, por tipificação molecular demonstrou-se

que é possível discriminar, com mais eficiência, linhagens do sorogrupo Grippotyphosa, do

que com tipificação sorológica (STEINEN et al., 1992; HARTSKEERT et al., 2004). A

correlação entre classificação sorológica e genotípica é baixa e a identificação é complicada

porque sorovares de um mesmo sorogrupo podem estar distribuídos entre espécies

diferentes. Estudos sobre essa falta de correlação entre espécie e sorovar levam a

suposição que os genes que determinam os sorotipos são transferidos horizontalmente

entre espécies, porém a base da transferência entre diferentes espécies de Leptospira, que

seria responsável pela troca genética de determinantes LPS, ainda é desconhecida

(CERQUEIRA E PICARDEAU, 2009).

A tipificação molecular começou em 1990 com o surgimento dos métodos baseados em

PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase) e PFGE (Eletroforese em Gel de Campo

Pulsátil). A identificação em nível de espécies auxilia os estudos epidemiológicos apenas no

sentido de diferenciar grupos patogênicos de saprofíticos. Uma vez que cada sorovar está

associado a um tipo de hospedeiro, sua identificação é essencial para o desenvolvimento de

estudos epidemiológicos (CERQUEIRA E PICARDEAU, 2009; WENJUN et al., 2009).

Após o isolamento da bactéria é possível identificar o sorovar por vários métodos

moleculares, como os baseados na análise de REA (Restriction Endonuclease Analysis) e

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de genes específicos (THIERMANN et

al., 1985; PEROLAT et al., 1993), pela comparação dos perfis de bandas da digestão

obtidos após eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida. Estes métodos são

eficientes para diferenciar algumas linhagens de Leptospira, porém são muito trabalhosos e

9

demandam grande volume de cultura dessas bactérias, além de formarem muitas bandas,

dificultando a comparação entre elas (RAMADASS, 2001). A REA pode ser feita em

produtos amplificados por PCR e os genes responsáveis pelas subunidades 16S e 23S do

RNA ribossômico tem sido os favoritos (RALPH et al., 1993; WOO et al., 1997).

A análise por PFGE é considerada um método forte de classificação de linhagens de

Leptospira, pois mostra as diferenças no número de bandas e tamanho dos perfis de

macrorestrição que podem ser originados por rearranjos no genoma, inserção, deleção,

inversão ou substituição de bases, dentro dos sítios de restrição.

Segundo os critérios de classificação genética por hibridização DNA-DNA, duas

linhagens são consideradas pertencentes à mesma espécie genômica se (1) o DNA da

Leptospira isolada for 70% ou mais relacionado com o DNA da amostra de referência, a uma

temperatura ótima de reassociação de 55ºC; (2) os DNAs destas forem 60% ou mais

relacionados entre si, a uma temperatura estringente de reassociação de 70ºC; (3) os DNAs

relacionados entre si apresentarem 5% ou menos de bases não pareadas (RAMADASS et

al., 1992 e WOO et al., 1997).

A metodologia de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), também denominado

“fingerprinting”, usa a amplificação por PCR com iniciadores pequenos de seqüência

conhecida para gerar perfis linhagem- ou espécie-específicos (LEVETT, 2001). RALPH et

al. (1993) associaram a essa técnica o seqüenciamento do gene do RNA ribossômico 16S e

confirmaram a diferenciação entre as espécies de Leptospira.

A metodologia de AP-PCR (Amplified Fragment Length Polymorphism) envolve

procedimentos nos quais o DNA é cortado com duas enzimas de restrição, os fragmentos

ligados a adaptadores que são complementares as extremidades geradas pela restrição, e

amplificados com iniciadores específicos complementares aos adaptadores para gerar

imagens de perfis “footprints”, que são comparadas por programas próprios, em

computador. Atualmente, diversos programas de informática para análise de géis podem ser

usados para observar a relação entre as linhagens, tornando possível a construção de

dendogramas e a comparação com dados de outros laboratórios (GALLOWAY E LEVETT,

2008).

Nos últimos anos as seqüências completas do genoma de várias leptospiras

patogênicas e saprofíticas foram publicadas, bem como seqüências de partes de genes têm

sido depositadas em diversos bancos de dados, para que possam ser acessadas e

comparadas, por pesquisadores. Já são conhecidas diversas seqüências repetitivas e de

inserção no genoma das Leptospiras bem como de estruturas típicas de tandem repeats,

pequenas seqüências de DNA repetitivas; algumas polimórficas, que são denominadas

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Esse tipo de seqüência é extensivamente

usado para identificar eucariotos e, análises em bancos de dados dessas repetições,

10

mostraram que L. interrogans apresenta muitas delas, com tamanhos menores que 100 pb,

enquanto L. borgpetersenii, possui poucas. A utilização da técnica do MLVA (Multi Locus

VNTR Analysis) requer construção de iniciadores específicos, para cada espécie, pouco

relacionada filogeneticamente. Essa técnica e específica para linhagens patogênicas e pode

distinguir sorovares dos gêneros patogênicos mais pesquisados, entre as leptospiras.

Cada método avaliado tem apresentado sua própria sensibilidade, especificidade e

reprodutibilidade. Provavelmente, alguns importantes fatores tais como: a técnica de

extração do DNA, qualidade do DNA obtido, tipo de amostra clínica, presença de inibidores,

tipo de iniciadores, termocicladores e qualidade dos reagentes, dentre outros, têm

contribuído para variações da taxa de reprodutibilidade de algumas destas técnicas.

Esses fatores, somados à falta de validação internacional e protocolos padronizados

têm dificultado a implementação rotineira desses métodos pelos laboratórios que trabalham

no diagnóstico e identificação das Leptospiras.

Recentemente, a técnica de seqüenciamento de múltiplos locos gênicos tem sido

aplicada na tipagem de bactérias patogênicas gerando resultados com alto grau de precisão

que são adequados para a maioria de estudos epidemiológicos e populacionais. Multi Locus

Sequence Typing (MLST) é um método que mede, diretamente, a variação existente nas

seqüências internas de fragmentos de DNA de um grupo de genes estruturais, geralmente

sete ou oito genes, caracterizando as linhagens pelo perfil obtido. A técnica é baseada na

amplificação por PCR, de partes de seqüências dos genes selecionados, seguida de

seqüenciamento automático de DNA (AHMED et al.,2006).

Com a técnica de MLST pode-se conhecer as linhagens mais relacionadas e definir os

loci, cuja variação na seqüência possibilitará sua utilização na identificação rotineira, de

sorovares patogênicos. A vantagem desse método é a facilidade de acesso às seqüências

dos iniciadores (primers) e a obtenção de diversos protocolos, que estão disponíveis em

bancos de dados, além da deposição das ESTs obtidas de cada sorovar (ADLER & DE LA

PEÑA MOCTEZUMA, 2009).

O MLST também permite que sejam produzidos iniciadores para regiões específicas

dos genes selecionados, que após a amplificação por PCR, são submetidas à digestão com

endonucleases de restrição e analisadas por eletroforese em gel, dispensando o uso do

seqüenciamento de DNA. A visualização dos polimorfismos por esta estratégia sem o

seqüenciador de DNA permite que a técnica seja emprega em mais laboratórios e com

menor custo, por não necessitar de equipamentos especiais.

Vale ressaltar que, a identificação dos sorovares é de suma importância epidemiológica

uma vez as vacinas existentes contra leptospirose animal são preparadas a partir dos

sorovares circulantes em cada região e que o homem é o hospedeiro susceptível, na cadeia

de transmissão.

11

1.3.3. O genoma de Leptospira spp.

Os cromossomas das Leptospiras são caracterizados por seu teor de bases C+G que

fica entre 35 e 41 mol%, dependendo da espécie e o tamanho do genoma está entre 3,0 e

4,6 Mb (Figura 5). As espécies de Leptospira interrogans e L. borgpetersenii (sensu stricto)

possuem um genoma complexo, contendo dois cromossomas circulares de

aproximadamente 4 Mb e 300 Kb, respectivamente. Estudos comparativos do cromossoma

mais longo mostram uma organização genética com grandes rearranjos nas L. interrogans,

que diferencia as duas linhagens relacionadas, demonstrando longo período de mudanças

na escala evolutiva (BORSAUX et al., 2005). NASCIMENTO et al. (2004), descreveram a

presença de seqüências de inserção (elementos IS) no genoma de L. interrogans,

distribuídas ao longo do cromossoma; juntos esses elementos IS e as transposases ocupam

2% do genoma, além disto, descobriram que essas seqüências estão localizadas e podem

ser responsáveis pela variação no grau de patogenicidade e especificidade de alguns

sorovares, para determinados hospedeiros.

Na tentativa de elucidar a diversidade sorológica entre as leptospiras, os genes

envolvidos na biossíntese dos lipopolissacarídeos e lipoproteínas também estão sendo

intensamente estudados, uma vez que Leptospira spp. possui mais genes para lipoproteínas

que os genomas de bactérias não espiraladas. Conhecendo-se a habilidade com a qual as

leptospiras atravessam os tecidos do hospedeiro, deduz-se que seu genoma codifica

diversos tipos de proteases e hemolisinas que facilitam essa penetração. Das proteínas da

parede celular e membrana plasmática, já estão sendo pesquisadas suas funções na

fisiologia da bactéria, tentando desvendar os mecanismos envolvidos nos processos de

especificidade com hospedeiros e patogenia.

Já foram identificados nove genes que codificam hemolisinas, incluindo uma proteína

formadora de poro e uma esfingomielinase, além de uma colagenase microbiana conhecida

por estar envolvida com a destruição de tecidos do hospedeiro em L. interrogans sendo que

esses genes não existem nas L. biflexa.

A origem de replicação do maior cromossoma (replicon) das leptospiras foi localizada

entre os genes dnaA e dnaN, tal como em outros genomas de bactérias. A seqüência total

do genoma de algumas espécies já é conhecida, entretanto, os mecanismos de trocas

genéticas entre essas bactérias ainda é pouco estudado. Já estão sendo desenvolvidas

ferramentas para manipulação genética e estudo dos fatores de virulência e patogenia

(BHARTI et al., 2003). Nas L. biflexa existe um cromossoma adicional de 74 Kb e ainda

podem ter um quarto replicon circular de 74 Kb (bacteriófago LE1).

13

Figura 5. Características dos genomas já seqüenciados de leptospiras patogênicas e

saprofíticas (PICARDEAU et al., 2008).

OBJETIVO GERAL

Identificar espécies e sorovares de Leptospira spp. usando a técnica PCR-RFLP do

gene da subunidade β da RNA polimerase (rpoB).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Selecionar na literatura genes com segmentos altamente polimórficos para diferenciação

dos sorovares de Leptospira;

2. Alinhar as seqüências do gene rpoB (codificador da subunidade β da RNA polimerase) de

Leptospira spp. presentes no GenBank e realizar digestão in silico com endonucleases de

restrição;

3. Amplificar por PCR um segmento polimórfico do gene rpoB de 68 sorovares de Leptospira

spp. e realizar digestão com as endonucleases de restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e

EcoNI.

4. Identificar os diferentes perfis de restrição e construir dendogramas para agrupá-los.

14

MATERIAL E MÉTODOS

Para a execução do presente trabalho, foram selecionados sessenta e oito sorovares

de Leptospira de referência (Tabela 1), distribuídos entre onze espécies, originárias do “Pan

American Institute for Food Protection and Zoonosis” (INNPAZ), gentilmente cedidas pelo

professor Dr. Élvio Carlos Moreira do Departamento de Medicina Preventiva da Escola de

Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais

3.1. Cultivo dos sorovares de Leptospira de referência

Os sorovares foram cultivados em meio de cultivo EMJH (Ellinghausen – McCullogh

– Johnson – Harris, Difco, BD Biosciences), no Laboratório de Microbiologia Aplicada do

Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Os meios

foram preparados e suplementados com Leptospira Enrichment EMJH (Difco, BD

Biosciences). Para o meio semi-sólido foram acrescidos 0,2% de ágar, tornando o meio

adequado para manutenção de culturas de Leptospira. As amostras foram mantidas em

meio semi-sólido EMJH, repicadas de 3 em 3 meses e incubadas a uma temperatura média

de 28-30ºC, até a formação do típico anel de crescimento. Para a obtenção do DNA foram

retiradas alíquotas de 0,5 ml e inoculadas em tubos contendo 6,0 ml do meio EMJH líquido,

no qual o crescimento ocorre de três a cinco dias, para a maioria dos sorovares. O

crescimento no meio líquido foi observado pela turvação delicada e clara e conferido em

microscopia de campo escuro (ELLINGHAUSEN, 1973).

3.2. Extração do DNA

Para a obtenção do DNA dos sorovares de Leptospira a cultura de cada tubo foi

transferida para tubo Falcon de 15 ml e centrifugada por 30 minutos a 3.000 rotações por

minuto (rpm). O sobrenadante foi desprezado e o sedimento suspenso em 1 ml de PBS (140

mM NaCl; 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 em 1000ml, pH 7.2 ) e transferido

para tubo Eppendorf de 1,5 ml que foi centrifugado por 5 minutos à 14.000 rpm. O

sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi suspenso em 1 ml de PBS e novamente

centrifugado por 2 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante descartado. Esse procedimento

foi repetido até que o sedimento estivesse completamente livre de restos de meio. Em cada

tubo Eppendorf foi adicionado 1 mg de lisozima (10 mg/ml em TE: Tris 50 mM, EDTA 10

mM, pH 8.0) e incubado por 1 hora e trinta minutos à 37°C, depois centrifugado por 2

minutos à 14.000 rpm e o sobrenadante descartado, adicionou-se 400 µl do tampão de lise

do Kit Wizard Genomic DNA Purification System da Promega Co. para rompimento das

células e liberação do DNA.

15

Tabela 1. Linhagens, sorovares e espécies do gênero Leptospira, usados na pesquisa.

Espécie Sorogrupo Sorovar Linhagem Número L. biflexa Andamana Andamana CH11 1 Espécie-tipo Semaranga Patoc Patoc I 2 L.borgpetersenii Autumnalis Srebarna 1409/69 3 Ballum Ballum Mus 127 4 Bataviae Moldaviae 114-2 5 Celledoni Withcombi Withcomb 6 Hebdomadis Nona Nona 7 Hebdomadis Worsfoldi Worsfoldi 8 Icterohaemorragiae Tonkini LT 96-68 9 Espécie-tipo Javanica Javanica Veldrat bataviae 46 10 Mini Mini Sari 11 Pyrogenes Kwale Julu 12 Sejroe Sejroe M 84 13 Tarassovi Tarassovi Perepelicin 14 L. inadai Canicola Malaya H6 15 Panama Mangus TRVL 137774 16 Tarassovi Kaup LT 64-68 17 L. interrogans Australis Australis Ballico 18 Australis Muenchen Munchen C90 19 Autumnalis Autumnalis Akiyami A 20 Djasiman Djasiman Djasiman 21 Bataviae Bataviae Van Tienen 22 Canicola Canicola Hond Utrech IV 23 Djasiman Sentot Sentot 24 Gryppotyphosa Valbuzzi Valbuzzi 25 Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis 26 Espécie-tipo Icterohaemorragiae Icterohaemorrhagiae RGA 27 Louisiania Lanka LT 25-67 28 Mini Szwajizak Szwajizaki 29 Pomona Pomona Pomona 30 Pyrogenes Pyrogenes Salinem 31 Sarmin Waskurin LT 63-68 32 Sejroe Hardjo Hardjoprajitno 33 L. kirschneri Australis Ramisi Musa 34 Bataviae Djatzi HS 26 35 Canicola Bafani Bafani 36 Espécie-tipo Cynopteri Cynopteri 3522 C 37 Gryppotyphosa Gryppotyphosa Moskva V 38 Hebdomadis Kambale Kambale 39 Icterohaemorr Mwogolo Mwogolo 40 Pomona Mozdok 5621 41 L. meyeri Mini* Parameles* Bandicoot 343* 42* Espécie-tipo Ranarum Ranarum Ranaram (ICF) 43 Semaranga Semaranga Veldrat Semaranga 44 L. noguchii Autumnalis Fortbragg Fort Bragg 45 Djasiman Huallaga M7 46 Espécie-tipo Panama Panama CZ 214K 47 Pyrogenes Myocastoris LSU 1551 48 Shermani Carimagua 9160 49 L. santarosai Autumnalis Alice Alice 50 Bataviae Kobbe CZ 320K 51 Cynopteri Tingomariensis M13 52 Gryppotyphosa Canalzonae CZ188K 53 Hebdomadis Maru CZ 285B 54 Javanica Vargonicas 24 55 Mini Georgia LT 117 56 Pomona Tropica CZ 299U 57 Pyrogenes Alexi HS 616 58 Sarmin Weaveri CZ 390U 59 Sejroe Trinidad TRVL 34056 60 Shermani Luis M6 61 Tarassovi Bakeri LT 79 62 L. weilli Celledoni Celledoni Celledoni 63 Espécie-tipo Javanica Coxi Cox 64 Sarmin Sarmin Sarmin 65 Tarassovi Vughia LT 89-68 66 L. terpstrae Icterohaemorragiae Hualien LT 11-31 67 L. yanagawae Semaranga Sao paulo São Paulo 68

*reclassificação proposta para L. interrogans serovar Parameles

16

O material contido em cada tubo foi homogeneizado e transferido para os tubos com

colunas de filtro, devidamente marcadas e seguiu-se o protocolo fornecido com o Kit: os

tubos Eppendorf foram centrifugados por 5 minutos à 14000 rpm e o filtrado foi desprezado.

Foram adicionados 650 µl da solução de lavagem do Kit, previamente acrescida de 95% de

etanol P. A. e centrifugados por 2 minutos à 14000 rpm. Essa lavagem foi repetida por mais

três vezes e cada filtro foi transferido para novo Eppendorf de 1,5 ml e adicionou-se 100 µl

da água do Kit (nuclease free water), em temperatura ambiente, deixando em repouso por 2

minutos, centrifugando-se a seguir por 2 minutos à 14.000 rpm e o DNA obtido foi estocado

à -20°C até o uso.

Para testar a eficiência do método de extração, aplicou-se 5 µl do DNA obtido

acrescido de 1 µl de tampão de amostra 6X (0,25% de azul de bromofenol e 0,25% de

xileno cianol e 4 mL de sacarose a 40%l), em gel de agarose à 0,8% contendo 0,5 µg/ml de

brometo de etídio (10 mg/ml). A eletroforese foi feita a 100 V por 15 minutos o gel foi

exposto à luz Ultra Violeta (UV) e fotografado.

3.3. Quantificação do DNA

O DNA total extraído foi quantificado em aparelho espectrofotômetro Gene Quant RNA/ DNA

Calculator (Pharmacia), usando-se 2 µl de cada amostra diluídos em 498 µl de água Milli-Q

estéril. Para cada amostra de DNA lida foi feito um controle branco (500 µl de água Milli-Q

estéril).

3.4. Seleção dos genes para amplificação e estudo de polimorfismos

Oito genes foram escolhidos por serem conservados (Tabela 2), ou seja, possuírem

seqüências codificadoras de proteínas estruturais, fundamentais à sobrevivência da célula.

Entretanto, esses genes estão sujeitos a mutações, como adição e deleção, transferência e

cópias de seqüências, em regiões do gene que não afetam a sobrevivência da bactéria,

denominadas regiões hipervariáveis. Essas regiões são as candidatas ideais ao estudo

proposto para diferenciação dos sorovares.

O gene rpoB, codificador da subunidade β da enzima RNA polimerase, foi

inicialmente escolhido, por estar sendo bastante estudado em outros organismos e ser

considerado, por vários pesquisadores, um diferenciador entre espécies de bactérias em

substituição ao gene do RNA 16S ribossômico (AHMED et al. 2006) e também por existirem

várias seqüências de Leptospira já depositadas nos bancos de dados, facilitando o acesso e

minimizando o custo do trabalho. Os iniciadores foram confeccionados pela Integrated DNA

Technologies (IDT) por intermédio da Prodimol Biotecnologia S/A.

17

Tabela 2. Genes estruturais candidatos a análise de restrição para a identificação molecular

dos sorovares de Leptospira, iniciadores e referência bibliográfica.

Gene Tamanho do gene (pb)

Tamanho do produto (pb)

Função do gene

Seqüências dos iniciadores

Referência bibliográfica

rpoB 3678 595 SUBUNIDADE BETA

RNA POLIMERASE

F-CCTCATGGGTTCCAAATGCA R-CGCATCCTCRAAGTTGTAWCCTT

LA SCOLA ET AL., (2006)

gyrB 2136 504 DNA GIRASE Β

F-TGAGCCAAGAAGAAACAAGCTACA R- MATGGTTCCRCTTTCCGAAGA

SLACK ET AL., (2006)

lipL32 819 474 LIPOPROTEÍNA DA

MEMBRANA EXTERNA

F- ATCTCCGTTGCACTCTTTGC R- ACCATCATCATCATCGTCCA

AHMED ET AL., (2006)

lipL41 1068 518 LIPOPROTEÍNA DA

MEMBRANA EXTERNA

F- TAGGAAATTGCGCAGCTACA R- GCATCGAGAGGAATTAACATCA


secY 1383 549 PRÉ-PROTEÍNA

TRANSLOCASE

F- ATGCCGATCATTTTTGCTTC R- CGTCCCTTAATTTTAGACTTCTTC


icdA 1197 557 ISOCITRATO

DESIDROGENASE

F- GGGACGAGATGACCAGGAT R- TTTTTTGAGATCCGCAGCTTT


rrs2 1512 541 RRNA 16S

F- CATGCAAGTCAAGCGGAGTA R- AGTTGAGCCCGCAGTTTTC


adk 564 531 ADENILATO QUINASE

F- GGGCTGGAAAAGGTACACAA R- ACGCAAGCTCCTTTTGAATC


3.5. Padronização da PCR - específica para o gene rpoB e análise de restrição

3.5.1. Análise in silico dos genes

As análises in silico foram usadas para confirmar a anotação funcional dos genes, bem

como para encontrar enzimas cujos sítios pudessem diferenciar os sovares entre si, em pelo

menos 20 pares de base (pb). As seqüências de cada gene usado no presente trabalho

foram pesquisadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) e copiadas em uma

pasta no formato Word. Em cada seqüência foi feita a busca da presença dos iniciadores

(senso e anti-senso) de cada gene. Cada seqüência encontrada foi submetida ao programa

NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2) para a busca de enzimas e seu respectivos

sítios de restrição. Para a escolha de enzimas que pudessem diferenciar o maior número

possível de sorovares gerando fragmentos maiores que 100 pb e mais de dois fragmentos.

Os resultados gerados pelos programas foram impressos e analisados visualmente.

18

3.5.2. Gene rpoB

Para a padronização da PCR, inicialmente foi usado o DNA extraído de 23 sorovares

de referência e os iniciadores Lept 1900f (5’ CCT CAT GGG TTC CAA CAT GCA-3’) e 2500r

(5’ CGC ATC CTC RAA GTT GTA WCC TT-3’) descritos por ( LA SCOLA et al., 2006), que

foram gentilmente cedido pela Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim. Nas amplificações por

PCR foram utilizados 1,5 mM de MgCl2, 200µM de dNTPs (MBI Fermentas), 25-50 ng do

DNA extraído, Taq DNA polimerase, 1,5 Unidades; Tampão da Taq DNA polimerase 1x e 50

picomoles de cada iniciador. Os ciclos da amplificação foram efetuados como descrito na

tabela 3.

Tabela 3. Condições da PCR - específica com os iniciadores Lept 1900f e 2500r, produzidos

para amplificação de parte do gene rpoB.

ciclo desnaturação anelamento extensão

Primeiro 95ºC – 2 min 51ºC – 30 seg 72ºC – 2 min

33 subseqüentes 94ºC – 30 seg 51ºC – 30 seg 72ºC – 2 min

Último 94ºC – 30 seg 51ºC – 30 seg 72ºC – 10 min

3.5.3. Digestão com endonucleases de restrição

Os mapas de restrição do gene rpoB apontou sítios de reconhecimento para diferentes

enzimas. As enzimas TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI foram selecionadas por

apresentarem sítios num maior número de sorovares e gerarem fragmentos com tamanhos

adequados à visualização por eletroforese em gel de poliacrilamida. A digestão enzimática

foi feita em volume final de 10 µl, sendo 4 µl do produto amplificado, 1 U da enzima, 1X do

tampão da enzima, acrescido de água Milli-Q estéril até completar o volume final da reação.

Os tubos foram incubados em estufa a 37ºC ou 65ºC, de acordo com a temperatura

sugerida pelo fabricante. O tempo de incubação variou com a enzima usada, sendo de no

mínimo 2 h e máximo 12 h. Após a digestão, o produto digerido foi aplicado em gel de

poliacrilamida 6% e a eletroforese realizada em voltagem constante de 100 volts em tampão

Tris-Borato-EDTA (MANIATIS et al., 1989) por 1,5 h. Para visualisar a migração relativa do

fragmento digerido foi utilizado o padrão molecular 100 pb DNA ladder (fragmentos de 1500,

1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400 300, 200 e 100 pares de base). Depois da eletroforese, o

gel foi fixado com etanol 10% e ácido acético 0,5% por 10 minutos e em seguida corado

19

pelo nitrato de prata a 0,2% por 15 minutos. Após coloração, o gel foi lavado com água

bidestilada por 30 segundos. A revelação das bandas ocorreu pelo uso da solução de NaOH

0,75 M e 0,45% de formaldeído em 150 ml de volume final de água bidestilada, até o

aparecimento das bandas. O gel foi transferido para a solução fixador e acondicionado a 4ºC

até ser fotografado (SANGUINETTI et al., 1994).

3.5.4. Análise dos produtos da PCR-específica e da digestão enzimática

Para a análise do perfil de migração dos fragmentos gerados pela PCR - específica,

bem como dos produtos digeridos pelas enzimas de restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e

EcoNI, em cada 5µl do produto, foram adicionados 5µl do tampão de corrida (xilenocianol e

azul de bromofenol) na concentração 2X. Esta mistura foi aplicada em gel de poliacrilamida

6%, sendo que a eletroforese ocorreu a 100V em tampão TBE 1X (Tris Borato, EDTA 0,5M)

(MANIATIS et al., 1989). Para cálculo da migração relativa do fragmento amplificado, foi

utilizado o padrão molecular 1Kb DNA Ladder. Esse marcador apresenta fragmentos com

tamanhos de 3054, 2036,1636, 1018, 517, 506, 396, 344, 298, 220, 202,154, 134 e 75 pares

de base. Depois da eletroforese, o gel foi fixado com etanol 10% e ácido acético 0,5% por

10 minutos e em seguida corado pelo nitrato de prata a 0,2% por 15 minutos. Após

coloração, o gel foi lavado com água bidestilada por 30 segundos. A revelação das bandas

ocorreu pelo uso da solução de NaOH 0,75 M e 0,45% de formaldeído em 150 ml de volume

final de água bidestilada, por aproximadamente 10 minutos ou até o aparecimento das

bandas. Posteriormente o gel foi transferido novamente para a solução fixadora,

acondicionado a 4ºC até ser fotografado (SANGUINETTI et al., 1994).

3.5.5. Confecção dos Dendogramas

Para a confecção dos dendogramas o tamanho molecular dos fragmentos,

mostrados em gel para cada perfil foram medidos usando-se o programa

LabImage version 2.7.0 (Kapelan GmbH, 1999-2003). Os resultados foram

dispostos em tabelas para a confecção de uma matriz fenotípica baseada na

presença (1) ou na ausência (2) de cada fragmento de DNA obtido das

leptospiras de referência que foram amplificados por PCR-específica, com o

par de iniciadores rpoB. A análise do agrupamento dos fragmentos foi feita

pelo programa TFPGA (Tools for Population Genetic Analyses) software

package (MILLER, 1998), baseada na similaridade como descrito por Nei

(1972). A distância original foi dada pela média aritmética ponderada ou

Unweighted Pair Group Method (UPGMA) algorithm (SNEATH & SOKAL, 1973).

20

4. RESULTADOS

As seqüências de rpoB presentes no GenBank mais aquelas obtidas pela Dra. Maria

Rosa Quaresma Bomfim por seqüenciamento de nucleotídeos (ver Apêndice) – depositadas

no GenBank com os identificadores gi|218750493|gb|EU747302.1| L. borgpetersenii serovar

Ballum, gi|218750509|gb|EU747310.1| L. borgpetersenii serovar Castellonis;

gi|218750499|gb|EU747305.1| L. borgpetersenii serovar Hardjo-bovis;

gi|218750511|gb|EU747311.1| L. borgpetersenii serovar Sejroe; gi|218750503|gb|

EU747307.1| L. borgpetersenii serovar Tarassovi; gi|218750517|gb|EU747314.1| L.

borgpetersenii serovar Whitticombi; gi|218750489|gb|EU747300.1| L. interrogans serovar

Bratislava; gi|218750523|gb|EU747299.1| L. interrogans serovar Canicola; gi|218750513|

gb|EU747312.1| L. interrogans serovar Djasiman; gi|218750497|gb|EU747304.1| L.

interrogans serovar Hebdomadis; gi|218750505|gb|EU747308.1| L. interrogans serovar

Wolffii – foram alinhadas com o programa ClustalW e é mostrado nas figuras 6 e 7.

21

Figura 6. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos de rpoB depositadas no GenBank e

geradas por seqüenciamento pelo nosso grupo.

22

Australis --------------------------------------------------TCCGTGAAGA 10

Bataviae --------------------------------------------------TCCGTGAAGA 10

Icterohaemorrhagiae -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 41

Schueffneri TGTAACCTTCCTAATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGA 60

Pyrogenes --------------------------------------------------TCCGCGAAGA 10

Wolffi -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 41

Djasiman ------------------TTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 42

Autumnalis --------------------------------------------------TCCGTGAAGA 10

Ballum -----------------------------------------TTCCTCTTCTCCGTGAAGA 19

Hebdomadis -----------------GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 43

Sejroe -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 41

Canicola ---------CCTCATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 51

Hardjo-bovis ---------CCTCATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 51

Javanica -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 41

Castellonis -----------------GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 43

Bratislava ----------------GGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 44

Tarassovi -----------------GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 43

Cynopteri -------------------TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 41

Panama -------------------TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 41

Proechymis --------------------------------------------------TCCGTGAAGA 10

Cascata -------------------TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGA 41

Shermani -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGGGAAGA 41

Celledoni -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGA 41

Whitticombi ------------------TTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGA 42

Manhao -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGA 41

Pingchang -------------------TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGGGAAGA 41

Hurstbridge -------------------TCCAACATGCAACGCCAGGCGGTGCCTCTACTCCGCCAAGA 41

Lyme -------------------TCCAACATGCAGCGCCAAGCGGTGCCTTTACTCCGCCAGGA 41

Saopaulo1 -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTGCCTCTTCTTACGGAAGA 41

Saopaulo -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTGCCTCTTCTTACGGAAGA 41

Patoc -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCGGTACCACTCTTAACAGAAGA 41

Holland -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCGGTTCCTCTTTTAACAGAAGA 41

Codice -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTGCCACTACTCACGGAAGA 41

Ranarum -------------------TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTTCCTCTTCTCACAGAAGA 41

*41 * **

Australis AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 70

Bataviae AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 70

Icterohaemorrhagiae AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Schueffneri AGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 120

Pyrogenes AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 70

Wolffi AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Djasiman AGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 102

Autumnalis AGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 70

Ballum AGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 79

Hebdomadis AGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 103

Sejroe AGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Canicola AGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 111

Hardjo-bovis AGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 111

Javanica AGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Castellonis AGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 103

Bratislava AGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 104

Tarassovi AGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 103

Cynopteri AGCTCCTTTTGTAGGAACGGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Panama AGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Proechymis AGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 70

Cascata AGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Shermani AGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Celledoni AGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACTAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Whitticombi AGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACTAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 102

Manhao AGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTAT 101

Pingchang AGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCTAGAATTTGTAT 101

Hurstbridge AGCTCCCTATGTGGGAACGGGAATGGAGAGCCGTGCCGCATACGACTCCAGAATTTGCGT 101

Lyme AGCTCCCTATGTGGGAACCGGAATGGAAAGTCGTGCTGCGTATGATTCCCGAATTTGCGT 101

Saopaulo1 AGCTCCATTTGTGGGAACTGGTATGGAAGCTCGTGCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTAT 101

Saopaulo AGCTCCATTTGTGGGAACTGGTATGGAAGCTCGTGCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTAT 101

Patoc GGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAGCTCGTGCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTAT 101

Holland AGCTCCTTTTGTGGGAACTGGTATGGAAGCTCGTGCGGCTTATGACGCAGGTGTTTGTAT 101

Codice AGCTCCGTTTGTAGGAACTGGGATGGAAGCTCGTGCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTAT 101

Ranarum AGCGCCGTTTGTAGGAACAGGTATGGAAGCTCGTGCTGCTTATGATGCAGGGGTTTGTAT 101

** ** 60*** ***** ** ***** * ** ** ** ** * * **** *

Figura 7. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos de rpoB indicando os sítios de restrição de TaqI (verde), Tru1I (azul), Sau3AI (roxo), MslI (vermelho) e EcoNI (laranja).

23

Australis CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 130 Bataviae CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 130

Icterohaemorrhagiae CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 161

Schueffneri CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 180

Pyrogenes CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 130

Wolffi CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 161

Djasiman CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 162

Autumnalis CGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 130

Ballum CGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 139

Hebdomadis CGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 163

Sejroe CGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 161

Canicola CGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 171

Hardjo-bovis CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAG 171

Javanica TGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAGATCATCGTCGTGGAAAG 161

Castellonis TGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAGATCATCGTCGTGGAAAG 163

Bratislava TGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAGATCATCGTCGTGGAAAG 164

Tarassovi CGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAAACCATCGTTGTGGAAAG 163

Cynopteri CGTAAACAAACACGACGGCGTTGTTACATCCGTGGACGCGGAAACCATCGTTGTGGAAAG 161

Panama CGTAAACAAACACGACGGCGTTGTCATTTCCGTGGACGCGGAAACGATCGTCGTGGAAAG 161

Proechymis CGTAAACAAACACGACGGCGTTGTCATTTCCGTGGACGCGGAAACGATCGTCGTGGAAAG 130

Cascata CGTAAACAAACACGACGGTGTAGTTACTTCCGTGGACGCGGAAACGATCGTCGTGGAAAG 161

Shermani CGTAAACAAACACGACGGTGTGGTCGTATCCGTAGACGCGGAAACGATCGTTGTGGAAAG 161

Celledoni CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTTATATCGGTTGACGCAGAACAAATCGTTGTGGAAAG 161

Whitticombi CGTAAACAAACACGACGGTGTCGTTATATCGGTTGACGCAGAACAAATCGTTGTGGAAAG 162

Manhao CGTAAACAAACACGATGGTGTCGTTACATCTGTTGACGCTGAAACGATCGTCGTGGAAAG 161

Pingchang CGTAAACAAACACGACGGCGTCGTTACATCCGTGGACGCGGAAAACATCGTCGTTGAGAG 161

Hurstbridge GATCGCAAAACAAGACGGATACGTGAAATACGTAGACGCCGAAAAAGTCATCGTCGAGCA 161

Lyme AATCGCGAAACAAGACGGATACGTGAAATACGTCGATGCGGAAAAAGTCGTCGTCGAGCA 161

Saopaulo1 CGTTGCCAAAAAAGATGGAGTGGTTTCCAAAGTGGATGCGACTGGTGTTTGGATCAAAGA 161

Saopaulo CGTTGCCAAAAAAGATGGAGTGGTTTCCAAAGTGGATGCGACTGGTGTTTGGATCAAAGA 161

Patoc CGTTGCGAAAAAAGATGGTGTGGTTTCCAAAGTGGATGCAACAGGTGTTTGGATCAAAGA 161

Holland TGTTGCCAAAAAAGATGGTGTGGTTTCGAAAGTGGATGCCACAGGTGTTTGGATCAAAGA 161

Codice CGTTGCGAAAAAAGACGGTGTAGTTTCTAAAGTAGATGCTACAGGTGTTTGGATCAAAGA 161

Ranarum TGTTGCGAAAAAAGATGGTGTAGTTTCTAAAGTAGATGCTACTGGTGTTTGGATCAAAGA 161

* *** *126 ** ** 140 *144 ** 153 161 *

Australis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 190

Bataviae AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 190

Icterohaemorrhagiae AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Schueffneri AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 240

Pyrogenes AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 190

Wolffi AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Djasiman AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 222

Autumnalis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 190

Ballum AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 199

Hebdomadis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 223

Sejroe AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Canicola AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 231

Hardjo-bovis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 231

Javanica AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAGACCAACCAAGG 221

Castellonis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAGACCAACCAAGG 223

Bratislava AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAGACCAACCAAGG 224

Tarassovi AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAAACAAACCAAGG 223

Cynopteri AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATAAATATTCTCTTACAAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Panama AAAGGGCGGAAAAGAATCCGACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Proechymis AAAGGGCGGAAAAGAATCCGACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 190

Cascata AAAGGGCGGAAAAGAATCCGACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Shermani AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGG 221

Celledoni AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTTAAAAAGACAAACCAAGG 221

Whitticombi AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTTAAAAAGACAAACCAAGG 222

Manhao AAAGGGCGGAAAAGAATCCGACACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Pingchang AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACTTACTCTCTGACTAAATTCAAAAAGACCAACCAAGG 221

Hurstbridge AAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTACGACTTAACGAAATTTAAGAAAACCAACCAAGG 221

Lyme AAAGGGCGGCAAAGAATCCGATACGTACGACTTGACGAAATTTAAGAAGACCAACCAAGG 221

Saopaulo1 AGACCAATCCAAAGAGATTGTCCACTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Saopaulo AGACCAATCCAAAGAGATTGTCCACTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Patoc AGACCAATCCAAAGAGATTGTCCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Holland AGACCAATCCAAAGAGATTGTCCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Codice AGACCAATCTAAAGAGATCGTTCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

Ranarum AGACCAATCCAAAGAGATCGTCCACTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGG 221

* * ***** * ** * *207**** ** ** ** ********

Figura 7 (cont.). Alinhamento das seqüências de nucleotídeos de rpoB indicando os sítios

de restrição de TaqI (verde), Tru1I (azul), Sau3AI (roxo), MslI (vermelho) e EcoNI (laranja).

24

Australis AGCCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 250

Bataviae AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 250

Icterohaemorrhagiae AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 281

Schueffneri AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 300

Pyrogenes AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 250

Wolffi AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 281

Djasiman AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 282

Autumnalis AACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 250

Ballum AACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 259

Hebdomadis AACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 283

Sejroe AACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 281

Canicola AACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 291

Hardjo-bovis AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGT 291

Javanica AACCTGCTTCAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCAGAGATCAACGGAAAAGT 281

Castellonis AACCTGCTTCAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCAGAGATCAACGGAAAAGT 283

Bratislava AACCTGCTTCAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCAGAGATCAACGGAAAAGT 284

Tarassovi AACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGT 283

Cynopteri AACCTGCTTCAACCAAAAGCCGATCGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGT 281

Panama AACCTGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTAGGCGTAGTTCATTCCGAGATCAACGGAAAAGT 281

Proechymis AACCTGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTTGGTGTGGTTCATTCCGAGATCAACGGAAAAGT 250

Cascata AACCTGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTTGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGT 281

Shermani AACCTGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTGGGAGTGGTTCACTCCGATCGAAACGGTAAAGT 281

Celledoni AACCTGTTTCAATCAGAAGCCGATCGTAGGAGTCGTTCACTCCGAGATCAGCGGAAAGGT 281

Whitticombi AACCTGTTTCAATCAGAAGCCGATCGTAGGAGTCGTTCACTCCGAGATCAGCGGAAAGGT 282

Manhao AACCTGTTTCAATCAGAAACCGATCGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGT 281

Pingchang AACTTGCTTTAACCAAAAGCCAATCGTCGGAGTGGTTCACTCCGATTTTAACGGAAAGGT 281

Hurstbridge CACTTGCTTCAATCAAACTCCCGTCGTCGGAGTGATTCACTCGGAGATCGACGGGAAAGT 281

Lyme CACTTGCTTTAACCAAACTCCCGTAGTCGGAGTGATCCACTCCGAGATAGACGGAAAAGT 281

Saopaulo1 TACTTGTTTTAACCAAAAACCAAACGTATCCATGTTACACACCACAACTGGTGGTAAGGT 281

Saopaulo TACTTGTTTTAACCAAAAACCAAACGTATCCATGTTACACACCACAACTGGTGGTAAGGT 281

Patoc TACTTGTTTTAACCAAAAACCAAACGTATCCATGTTACACACCACAACTGGTGGCAAGGT 281

Holland AACTTGTTTTAACCAAAAACCAAACGTTTCCATGTTGCATACGACGACTGGTGGTAAAGT 281

Codice AACTTGTTTTAACCAAAAACCAAACGTGGCTATGTTACACACGACCACTGGCGGAAAGGT 281

Ranarum TACTTGTTTTAACCAAAAACCGAACGTATCCATGCTTCATACCACAACAGGTGGAAAGGT 281

* ** *240* ** * **252 ** * * ** 276 277 279** ** **

Australis TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 310

Bataviae TTCCAAGGTCTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 310

Icterohaemorrhagiae TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 341

Schueffneri TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 360

Pyrogenes TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 310

Wolffi TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 341

Djasiman TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 342

Autumnalis TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 310

Ballum TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 319

Hebdomadis TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 343

Sejroe TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 341

Canicola TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 351

Hardjo-bovis TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATA 351

Javanica TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATA 341

Castellonis TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATA 343

Bratislava TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATA 344

Tarassovi TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATA 343

Cynopteri TTCCAAGGTTTCTAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATA 341

Panama AAGCAAGGTTTCTAAAGAAAAAATCGAAGTAACCGGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATA 341

Proechymis AAGCAAGGTTTCTAAAGAAAAAATCGAAGTAACCGGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATA 310

Cascata TTCCAAGGTTTCTAAAGAAAAAATCGAAGTCACCAGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATA 341

Shermani TACTAAGGTTTCCAAAGAGAAAATCGAAGTCACCGGCGAAAACGGAGACGTAAAAGAATA 341

Celledoni TACGAAAGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTAACATCCGAAAACGGAACAGTAAAAGAATA 341

Whitticombi TACGAAAGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTAACATCCGAAAACGGAACAGTAAAAGAATA 342

Manhao TACGAAAGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTAACATCCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATA 341

Pingchang TTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGACATATCAAAGAATA 341

Hurstbridge CAGTAAGGTGACCAAGGAAAAAATCGAAGTCACTGCGGATAACGGAAGCATAAAAGAATA 341

Lyme CAACAAGGTAACCAGGGAGAAAATTGAAGTCACTGCGGATAACGGAAGCATAAGAGAATA 341

Saopaulo1 GAGTAAGGTTTCCAAAGAACGCATTGAAGTGACTTCTCCCAATGGAGAAAAAGAAATCCA 341

Saopaulo GAGTAAGGTTTCCAAAGAACGCATTGAAGTGACTTCTCCCAATGGAGAAAAAGAAATCCA 341

Patoc AAGTAAGGTTTCGAAAGAACGTGTCGAAGTGACAACTCCTAACGGAGAAAAAGAAACTCA 341

Holland AGGTAAGGTTTCCAAAGAACGTGTGGAGATTACTTCTCCTAACGGAGAAAAAGAAACCCA 341

Codice TAGTAAAGTATCCAAGGAACGAGTGGAACTCACTTCTCCCAACGGGGAGAAAGAAATCCA 341

Ranarum AAGTAAAGTTTCTAAAGAACGGATCGAAGTAACGTCTCCAAACGGAGAAAAAGAAACACA 341

** ** * * ** *315 317** ** ** * *



25

Australis TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 367

Bataviae TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 367

Icterohaemorrhagiae TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCTGCAGGCGAAGAAGT 398

Schueffneri TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCTGCAGGCGAAGAAGT 417

Pyrogenes TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCAATCGTCTCGGCAGGCGAAGAAGT 367

Wolffi TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCAATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 398

Djasiman TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCAATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 399

Autumnalis TG--TTCTTCAAATTGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 367

Ballum TG--TTCTTCAAATTGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 376

Hebdomadis TG--TTCTTCAAATTGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 400

Sejroe TG--TTCTTCAAATTGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 398

Canicola TG--TTCTTCAAATTGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 408

Hardjo-bovis TG--TTCTTCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCAATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGT 408

Javanica CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTTGGGCGAAGAAGT 398

Castellonis CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTTGGGCGAAGAAGT 400

Bratislava CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTTGGGCGAAGAAGT 401

Tarassovi CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAA-ACAATATGCTCCGATCGTTTCTTCGGGCGAAGAAGT 400

Cynopteri CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAA-ACAATATGCGCCGATCGTTTCTTCGGGCGAAGAAGT 398

Panama CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAG-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGT 398

Proechymis CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAG-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGT 367

Cascata CG--TTCTCCAAATCGGAAGCAG-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGT 398

Shermani CG--TTCTCCAAATTGGAAGTAA-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGT 398

Celledoni CG--TTCTCCAAGTCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTATCTTCGGGCGAAGAAGT 398

Whitticombi CG--TTCTCCAAGTCGGAAGCAA-ACAATATTCTCCGATCGTATCTTCGGGCGAAGAAGT 399

Manhao CA--TTCTCCAGATCGGAAGCAG-ACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGTGAGGAAGT 398

Pingchang CA--TTCTCCAAATGGGAAGCAG-ACAATATTCTCCGATCGTATCTTCCGGAGAAGAAGT 398

Hurstbridge TA--ATCTGGCTTCGGGTTCTAA-ACAGTATCATCCGATCGTTTCCAACGGAGAAGAGGT 398

Lyme CA--ATCTTACTTCCGGTTCTAA-ACAGTATCATCCGATCGTTTCCAACGGAGAAGAAGT 398

Saopaulo1 TGAACTCCACCTCTCCGAGGAAGTACAATTCCTCGCTGTTGTCAAAGAAGGGCAGGAAAT 401

Saopaulo TGAACTCCACCTCTCCGAGGAAGTACAATTCCTCGCTGTTGTCAAAGAAGGGCAGGAAAT 401

Patoc TGAACTTCTTCTTTCTGATGAAGTTCAGTTCCATGCTGTTGTCAAAGAAGGACAAGAGGT 401

Holland TGAACTTTTCCATTCGGAAGATGTGCAATACGTTGCGGTTGTGAAAGAAGGCCAAGACTT 401

Codice CGAACTTTTCCATTCGGAAGAAGTTCAGTTTGTGGCCGTTGTAAAAGAAGGCCAAGACTT 401

Ranarum CGAACTTTTCCATTCGGAAGAAGTACAGTATTTATCCGTGGTGAAAGAAGGCCAAGACTT 401

* 365* ** * *384 ** ** * ** *

Australis AAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGG 427

Bataviae AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGG 427

Icterohaemorrhagiae AAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGG 458

Schueffneri AAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGG 477

Pyrogenes AAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 427

Wolffi AAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGG 458

Djasiman AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 459

Autumnalis AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 427

Ballum AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 436

Hebdomadis AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 460

Sejroe AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 458

Canicola AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 468

Hardjo-bovis AAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGG 468

Javanica AAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 458

Castellonis AAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 460

Bratislava AAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 461

Tarassovi AAAACGAGGAACGACTCTCGCAGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 460

Cynopteri AAAACGAGGAACGACTCTCGCAGGACAAGTTGTAGTAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 458

Panama AAAACGCGGAACCACTCTCGCAGGACAAATCGTCATCGGCGAGAAGTTGGACGAAATCGG 458

Proechymis AAAACGCGGAACCACTCTCGCAGGACAAATCGTAACAGGCGAGAAGTTGGACGAGATTGG 427

Cascata AAAACGTGGAACGACTCTTGCGGGACAAATCGTCACAGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 458

Shermani AAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAATCGTCACGGGCGAGAAGTTGGACGAGATGGG 458

Celledoni AAAACGAGGATCGACTCTCGCGGGACAAGTGGTCACAGGTGAGAAGTTGGACGAACTGGG 458

Whitticombi AAAACGAGGATCGACTCTCGCGGGACAAGTGGTCACAGGTGAGAAGTTGGACGAACTGGG 459

Manhao AAAACGCGGAACCACTCTCGCGGGACAAATCGTCACAGGCGAGAAGTTGGATGAACTCGG 458

Pingchang AAAACGAGGAACCACTCTCGCGGGACAAATCGTTACCGGCGAGAAGTTGGATGAGATGGG 458

Hurstbridge TCGCAGAGGAACCACTCTTGCGGGACAAGTCGTCTTTGGCGAGAGAATGGATGAGCTCGG 458

Lyme TCGGAGAGGAACTACTCTTGCAGGACAAGTCGTCTTTGGCGAGAGAATGGACGAGCTCGG 458

Saopaulo1 TGGAGTGGGTGCTCCTGTTGCGGGTCAAATCATCAAAGGGGAAAAATACGGTGAGTTTGG 461

Saopaulo TGGAGTGGGTGCTCCTGTTGCGGGTCAAATCATCAAAGGGGAAAAATACGGTGAGTTTGG 461

Patoc AGGAATTGGAGCTCCAGTTGCCGGACAAATCATCAAAGGGGAAAAATACGGTGACTTCGG 461

Holland AGGAATTGGTGCCCCAGTAGCGGGACAAATCATCAAAGGCGAAAAATACGGTGAGTTTGG 461

Codice AGGAATTGGAACACCAGTTGCGGGACAAATCATCAAAGGGGAAAAATACGGTGACTTTGG 461

Ranarum AGGAATTGGTGCACCGGTGGCCGGGCAAATCATCAAAGGGGAAAAATACGGTGAGTTTGG 461

416 419* * ** ** *** * * ** ** * * ** * **



26

Australis AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 487

Bataviae AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 487

Icterohaemorrhagiae AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 518

Schueffneri AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 537

Pyrogenes AAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGACAATGGAGTTCT 487

Wolffi AAATATCCTCGTAAAAGGTACGGTTCTTGCCGACGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 518

Djasiman AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 519

Autumnalis AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCT 487

Ballum AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCT 496

Hebdomadis AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCT 520

Sejroe AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCT 518

Canicola AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCT 528

Hardjo-bovis AAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGACAATGGAGTTCT 528

Javanica AAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGGGTTCT 518

Castellonis AAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGGGTTCT 520

Bratislava AAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGGGTTCT 521

Tarassovi AAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGTGTCCT 520

Cynopteri AAATATCCTCGTTAAGGGAACCGTTCTTGCAGACGGTCCCGCGGTTGACAACGGTGTTCT 518

Panama AAATATCCTCGTGAAAGGAACCGTTCTTGCAGACGGTCCTGCGGTTGACAACGGAGTTCT 518

Proechymis AAACATTCTCGTGAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCT 487

Cascata AAATATTCTCGTGAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGTCCCGCCGTTGACAACGGAGTTCT 518

Shermani AAATATCCTCGTTAAGGGAACCGTTCTTGCGGACGGACCTGCGGTCGACAACGGAGTGCT 518

Celledoni AAATATCCTCGTAAAAGGAACGGTCCTTGCGGACGGACCTGCGGTTGACAACGGAGTTCT 518

Whitticombi AAATATCCTCGTAAAAGGAACGGTCCTTGCGGACGGACCTGCGGTTGACAACGGAGTTCT 519

Manhao AAACATTCTCATTAAAGGCACGGTTCTCGCCGACGGTCCTGCGGTGGACAACGGAGTTCT 518

Pingchang AAATATCCTGGTAAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGTCCTGCGGTTGACAACGGAGTACT 518

Hurstbridge AAACATTCTGCAAAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGACCTGCAGTCGATAACGGAACTCT 518

Lyme AAACATTCTGCAAAAAGGAACCGTTCTCGCGGACGGACCTGCCGTCGATAACGGAACTCT 518

Saopaulo1 ACAAATCCTGCAAAAAGGAACTGTCCTTGCAAACGGTCCATCCACTGACGCTGGTTACTT 521

Saopaulo ACAAATCCTGCAAAAAGGAACTGTCCTTGCAAACGGTCCATCCACTGACGCTGGTTACTT 521

Patoc TCAGATCCTTCAAAAAGGAACTGTCCTAGCCAACGGGCCATCCACTGACGCTGGGTATTT 521

Holland ACAAATCCTCCAAAAAGGAACTGTTCTTGCCAATGGACCATCCACTGACGCTGGTTATTT 521

Codice TCAGATCCTACAAAAAGGAACTGTCCTTGCCAACGGTCCATCCACTGACGCTGGTTATTT 521

Ranarum ACAAATCCTCCAAAAAGGAACTGTCCTTGCGAATGGTCCTTCCACTGACGCTGGTTATTT 521

*465 479 480* ** ** ** ** ** * ** ** * 513 ** *

Australis CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 541

Bataviae CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 541

Icterohaemorrhagiae CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Schueffneri CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGA 597

Pyrogenes CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 541

Wolffi CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTT------ 572

Djasiman CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACA---------- 569

Autumnalis CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 541

Ballum CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGA 556

Hebdomadis CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACT------- 573

Sejroe CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACT------- 571

Canicola CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACA---------- 578

Hardjo-bovis CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAG-- 586

Javanica CGCTCTCGGTAGAAATGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Castellonis CGCTCTCGGTAGAAACGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACT------- 573

Bratislava CGCTCTCGGTAGAAACGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGA 581

Tarassovi CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTC----- 575

Cynopteri CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Panama CGCTCTTGGAAGAAACGTTCTCGCGGCTTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Proechymis CGCTCTTGGAAGAAACGTTCTTGCGGCTTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGA 547

Cascata CGCTCTGGGAAGAAACGTTCTTGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTTGAG-- 576

Shermani CGCACTCGGAAGAAACGTTCTCGCGGCTTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Celledoni CGCTCTCGGAAGAAACGTTCTCGCTGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Whitticombi CGCTCTCGGAAGAAACGTTCTCGCTGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAA--------- 570

Manhao CGCTCTCGGTAGAAACGTTCTTGCGGCTTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Pingchang CGCTCTCGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Hurstbridge TGCTTTAGGACGGAACGTGCTCGTAGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Lyme TGCATTAGGACGAAACGTTCTGGTAGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 572

Saopaulo1 GGCTCTTGGGAGAAACGTTCTTGTGGCATTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 575

Saopaulo GGCTCTTGGGAGAAACGTTCTTGTGGCATTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 575

Patoc GGCACTTGGACGAAATGTTCTCGTTGCCTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 575

Holland GGCACTTGGCCGTAACGTTCTTGTGGCATTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 575

Codice GGCTCTAGGCCGAAACGTACTCGTTGCCTTTATGCCATGGGAAGGATACAACTT------ 575

Ranarum GGCACTGGGACGTAATGTACTCGTTGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT------ 575

** * ** * ** ** ** * ** ** ***** 567***** **** 582



27

Australis -----------

Bataviae -----------

Icterohaemorrhagiae -----------

Schueffneri TGCGAAGGTTA 608

Pyrogenes -----------

Wolffi -----------

Djasiman -----------

Autumnalis -----------

Ballum -----------

Hebdomadis -----------

Sejroe -----------

Canicola -----------

Hardjo-bovis -----------

Javanica -----------

Castellonis -----------

Bratislava ATGCG------ 586

Tarassovi -----------

Cynopteri -----------

Panama -----------

Proechymis TGC-------- 550

Cascata -----------

Shermani -----------

Celledoni -----------

Whitticombi -----------

Manhao -----------

9Pingchang -----------

Hurstbridge -----------

Lyme -----------

Saopaulo1 -----------

Saopaulo -----------

Patoc -----------

Holland -----------

Codice -----------

Ranarum -----------

Figura 7 (cont.). Alinhamento das seqüências de rpoB indicando os sítios de restrição de

TaqI (verde), Tru1I (azul), Sau3AI (roxo), MslI (vermelho) e EcoNI (laranja).

Dos sessenta e oito sorovares analisados em busca de polimorfismos tipo RFLP em

parte da seqüência codificadora do gene da subunidade β da RNA polimerase, vinte e cinco,

de nove espécies, foram identificados após restrição pelas enzimas TaqI, Tru1I, Sau3AI,

MslI e EcoNI, correspondendo a aproximadamente 37% (Tabela 6).

A enzima TaqI apresentou 10 perfis de restrição distintos esquematizados na Tabela

4A e figura 8, sendo capaz de identificar apenas os sorovares 46 (Huallaga) e 50 (Alice) com

perfis sorovar-específicos. Contudo, o perfil G foi observado em quase todos os sorovares

de Leptospira santarosai, com exceção dos sorovares Alexi, Alice e Tingomariensis, e no

sorovar Muenchen que é da espécie Leptospira interrogans.

A enzima Tru1I também apresentou 10 perfis de restrição distintos, esquematizados na

Tabela 4B e figura 9, identificando os sorovares 46 (Huallaga) e 60 (Trinidad) com perfis

sorovar-específicos. Todavia, a combinação de ambas as enzimas gerou 23 perfis distintos

com algumas observações interessantes: o perfil AA é espécie-específico, pois foi

observado apenas para Leptospira biflexa, o perfil AC é apresentado por todos os sorovares

de Leptospira kirschneri, não sendo espécie-específico devido a presença deste no sorovar

Hualien de L. terpstrae, e os perfis AG, FG, FE, CE, FD, BE e GE são únicos dos sorovares

11 (Mini), 17 (Kaup), 28 (Lanka), 29 (Szwajizak), 32 (Waskurin), 48 (Myocastoris) e 54

(Maru), respectivamente.

28

Tabela 4A. Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima TaqI.

Perfil Tamanho dos fragmentos (pb)

A 315 277

B 315 198 69 10

C 315 104 173

D 144 171 104 173

E 144 171 104 94 69 10

F 315 104 94 69 10

G 277 38 198 69 10

H 592

I 144 369 69 10

J 277 38 277

Perfil A: sorovares 1, 2, 7, 11, 16, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 52 , 65 e 67

Perfil B: sorovares 3, 4, 5, 10, 12, 14 e 48

Perfil C: sorovares 6, 8, 29, 64 e 66

Perfil D: sorovares 9, 20, 23, 25, 26, 30, 31, 33 e 58

Perfil E: sorovares 13, 15, 18, 21, 22, 24, 27 e 42

Perfil F: sorovares 17, 28 e 32

Perfil G: sorovares 19, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61 e 62

Perfil H: sorovares 44, 63 e 68

Perfil I: sorovar 46

Perfil J: sorovar 50

Tabela 4B – Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima Tru1I.


A 41 166 33 352

B 240 240 112

C 480 112

D 207 33 352

E 240 352

F 240 39 313

G 592

H 279 313

I 41 199 352

J 207 33 240 112

Perfil A: sorovares 1 e 2

Perfil B: sorovares 3, 5, 12, 14, 19, 31, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61 e 62

Perfil C: sorovares 4, 10, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e 67

Perfil D: sorovares 6, 8, 32, 44, 63, 64, 66 e 68

Perfil E: sorovares 7, 13, 15, 16, 21, 24, 27, 28, 29, 45, 47, 48, 49, 52 e 54

Perfil F: sorovares 9, 18, 20, 22, 23, 25, 26, 30, 33 e 42

Perfil G: sorovares 11 e 17

Perfil H: sorovares 43 e 65

Perfil I: sorovar 46

Perfil J: sorovar 60

29

Tabela 4C – Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima Sau3AI.


A 153 312 129

B 252 24 108 208

C 153 99 24 108 208

D 416 176

E 276 108 32 176

F 384 32 176

G 276 140 176

H 153 123 108 32 176

I 252 132 79 129

Perfil A: sorovares 1 e 2 Perfil B: sorovares 3, 5, 12, 14, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 46, 48, 55 e 67 Perfil C: sorovares 4, 7, 10, 11, 16, 19, 34, 45, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 59, 60, 61 e 62 Perfil D: sorovares 6, 33 e 44 Perfil E: sorovares 8, 27, 28, 64 e 66 Perfil F: sorovares 9, 18, 20, 22, 23, 25, 26, 30, 42, 63 e 68 Perfil G: sorovares 13, 15, 21, 24, 31 e 58 Perfil H: sorovares 17, 29, 32 e 65 Perfil I: sorovar 43

Tabela 4D – Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima MslI.


A 592

B 161 431

C 126 466

D 140 452

E 317 278

Perfil A: sorovares 1, 2, 34, 44, 46, 54 e 63 Perfil B: sorovares 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 35, 36, 37, 38, 41 e 67 Perfil C: sorovares 7, 8, 9, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 39, 40, 43, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 64, 65 e 66 Perfil D: sorovares 27, 42, 45, 47, 48, 49 e 52 Perfil E: sorovar 68

Tabela 4E – Perfis de restrição dos sorovares de Leptospira com a enzima EcoNI.


A 567 25

B 479 88 25

C 60 507 25

D 60 419 88 25

E 365 205 25

Perfil A: sorovares 1, 2, 6, 7, 8, 9, 11, 16, 17, 20, 23, 26, 30, 32, 33, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 54, 57, 63, 64, 65 e 66 Perfil B: sorovares 3, 4, 5, 10, 12, 14, 19, 50, 51, 53, 55, 56, 59, 60, 61 e 62 Perfil C: sorovares 13, 15, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 29 e 42 Perfil D: sorovares 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 58 e 67 Perfil E: sorovar 68

30

Tabela 5: Agrupamento dos sorovares, sorogrupos e espécies do gênero Leptospira, usados na pesquisa, pelos perfis de restrição compostos pelas cinco endonucleases.

TaqI Tru1I Sau3AI MslI EcoNI Perfil Espécie/Sorogrupo/Sorovar

1 A A A A A 1 L. biflexa/Andamana/Andamana 2 A A A A A 1 L. biflexa/Semaranga/Patoc 3 B B B B B 2 L. borgpetersenii/Autumnalis/Srebarna 5 B B B B B 2 L. borgpetersenii/Bataviae/Moldaviae

12 B B B B B 2 L. borgpetersenii/Pyrogenes/Kwale 14 B B B B B 2 L. borgpetersenii/Tarassovi/Tarassovi 4 B C C B B 3 L. borgpetersenii/Ballum/Ballum

10 B C C B B 3 L. borgpetersenii/Javanica/Javanica 6 C D D B A 4 L. borgpeterseni /Celledoni/Withcombi 7 A E C C A 5 L. borgpetersenii/Hebdomadis/Nona

16 A E C C A 5 L. inadai/Panama/Mangus 8 C D E C A 6 L. borgpeterseni /Hebdomadis/Worsfoldi

64 C D E C A 6 L. weilli/Javanica/Coxi 66 C D E C A 6 L. weilli/Tarassovi/Vughia 9 D F F C A 7 L. borgpetersenii/Icterohaemorragiae/Tonkini

20 D F F C A 7 L. interrogans/Autumnalis/Autumnalis 26 D F F C A 7 L. interrogans/Hebdomadis/Hebdomadis 30 D F F C A 7 L. interrogans/Pomona/Pomona 11 A G C B A 8 L. borgpetersenii/Mini/Mini 13 E E G C D 9 L. borgpetersenii/Sejroe/Sejroe 15 E E G C D 9 L. inadai/Canicola/Malaya 24 E E G C D 9 L. interrogans/Djasiman/Sentot 17 F G H C A 10 L. inadai/Tarassovi/Kaup 18 E F F C D 11 L. interrogans/Australis/Australis 22 E F F C D 11 L. interrogans/Bataviae/Bataviae 19 G B C C B 12 L. interrogans/Australis/Muenchen 51 G B C C B 12 L. santarosai/Bataviae/Kobbe 53 G B C C B 12 L. santarosai/Gryppotyphosa/Canalzonae 56 G B C C B 12 L. santarosai/Mini/Georgia 61 G B C C B 12 L. santarosai/Shermani/Luis 62 G B C C B 12 L. santarosai/Tarassovi/bakeri 59 G B C C B 12 L. santarosai/Sarmin/weaveri 21 E E G C E 13 L. interrogans/Djasiman/Djasiman 23 D F F C F 14 L. interrogans/Canicola/Canicola 25 D F F C D 15 L. interrogans/Gryppotyphosa/Valbuzzi 27 E E E D E 16 L. interrogans/Icterohaemorragiae/Icterohaemorrhagiae 28 F E E C D 17 L. interrogans/Louisiania/Lanka 29 C E H C D 18 L. interrogans/Mini/Szwajizak 31 D B G C C 19 L. interrogans/Pyrogenes/Pyrogenes 58 D B G C C 19 L. santarosai/Pyrogenes/Alexi 32 F D H C A 20 L. interrogans/Sarmin/Waskurin 33 D F D C A 21 L. interrogans/Sejroe/Hardjo 34 A C C A C 22 L. kirschneri/Australis/Ramisi 35 A C B B C 23 L. kirschneri/Bataviae/Djatzi 36 A C B B C 23 L. kirschneri/Canicola/Bafani 37 A C B B C 23 L. kirschneri/Cynopteri/Cynopteri 38 A C B B C 23 L. kirschneri/Gryppotyphosa/Gryppotyphosa 41 A C B B C 23 L. kirschneri/Pomona/Mozdok 67 A C B B C 23 L. terpstrae/Icterohaemorrhagiae/Hualien 39 A C B C C 24 L. kirschneri/Hebdomadis/Kambale 40 A C B C C 24 L. kirschneri/Icterohaemorrhagiae/Mwogolo 42 E F F D D 25 L. meyeri/Mini/Parameles 43 A H I C A 26 L. meyeri/Ranarum/Ranarum 44 H D D A A 27 L. meyeri/Semaranga/Semaranga 45 A E C D A 28 L. noguchii/Autumnalis/Fortbragg 47 A E C D A 28 L. noguchii/Panama/Panama 49 A E C D A 28 L. noguchii/Shermani/Carimagua 52 A E C D A 28 L. santarosai/Cynopteri/Tingomariensis 46 I I B A A 29 L. noguchii/Djasiman/Huallaga 48 B E B D A 30 L. noguchii/Pyrogenes/Myocastoris 50 J B C C B 31 L. santarosai/Autumnalis/Alice 54 G E C A A 32 L. santarosai/Hebdomadis/Maru 55 G B B C B 33 L. santarosai/Javanica/Vargonicas 57 G B C C A 34 L. santarosai/Pomona/Tropica 60 G J C C B 35 L. santarosai/Sejroe/Trinidad 63 H D F A A 36 L. weilli/Celledoni/Celledoni 65 A H H C A 37 L. weilli/Sarmin/Sarmin 68 H D F E G 38 L. yanagawae/Semaranga/Sao paulo

Mr 1 2 3 4 5 6

Mr 19 20 21 22 23 24

Mr 37 38 39 40 41 42

Mr 55 56 57 58 59 60

Figura 8. Eletroforese em gel

digeridos com a endonuclease

molecular 100 pb ladder.

7 8 9 Mr 10 11 12 13 14 1

25 26 27 Mr 28 29 30 31 32 3

43 44 45 Mr 46 47 48 49 50 5

61 62 63 Mr 64 65 66 67

l de poliacrilamida 6% dos produtos de PCR

se de restrição TaqI; Mr corresponde ao pad

31

15 16 17 18

33 34 35 36

51 52 53 54

68

R do gene rpoB

drão de massa

Mr 1 a 1 9

Mr 37 a 55




Mr 20 a 36

Mr 56 a 68

l de poliacrilamida 8% dos produtos de PCR

se de restrição Tru1I; Mr corresponde ao pad

32

36

68

R do gene rpoB

adrão de massa

Mr 1 2 3 4 5 6

Mr 19 20 21 22 23 24

Mr 37 38 39 40 41 42

Mr 55 56 57 58* 59 60



molecular 100 pb ladder (*perfil

Mr 1 2 3 4 5 6

7 8 9 Mr 10 11 12 13 14 1

4 25 26 27 Mr 28 29 30 31 32 33

43 44 45 Mr 46 47 48 49 50 5

0 61 62 63 Mr 64 65 66 6

el de poliacrilamida 6% dos produtos de PCR

e de restrição Sau3AI; Mr corresponde ao pad

fil G determinado por nova eletroforese colada n

7 8 9 Mr 10 11 12 13 14 1

33

15 16 17 18

33 34 35 36

51 52 53 54

67 68

R do gene rpoB

adrão de massa

na figura).

15 16 17 18

Mr 19 20 21 22 23 24

Mr 37 38 39 40 41 42

Mr 55 56 57 58 59 60




Mr 1 2 3 4 5 6

25 26 27 Mr 28 29 30 31 32

2 43 44 45 Mr 46 47 48 49 50

0 61 62 63 Mr 64 65 66


se de restrição MslI; Mr corresponde ao pad

7 8 9 Mr 10 11 12 13 14 1

34

33 34 35 36

51 52 53 54

67 68

R do gene rpoB

drão de massa

15 16 17 18

Mr 19 20 21 22 23 24

Mr 37 38 39 40 41 42

Mr 55 56 57 58 59 60




25 26 27 Mr 28 29 30 31 32 33

2 43 44 45 Mr 46 47 48 49 50 51

61 62 63 Mr 64 65 66 67


e de restrição EcoNI; Mr corresponde ao pad

35

33 34 35 36

51 52 53 54

67 68

R do gene rpoB

adrão de massa

36

A enzima Sau3AI apresentou 9 perfis de restrição distintos, esquematizados na Tabela

4C e figura 10, e individualmente foi capaz de identificar apenas o sorovar 43 (Ranarum)

com um perfil sorovar-específico. Todavia, a combinação das três enzimas gerou 30 perfis

distintos com a identificação dos sorovares 6 (Withcombi), 27 (Icterohaemorrhagiae), 33

(Hardjo), 34 (Ramisi), 44 (Semaranga), 55 (Vargonicas) e 65 (Sarmin), que apresentaram os

perfis CDD, EEE, DFD, ACC, HDD, GBB e AHH, respectivamente.

A enzima MslI apresentou apenas 5 perfis de restrição distintos, esquematizados na

Tabela 4D e figura 11, e individualmente foi capaz de identificar apenas o sorovar 68

(Saopaulo) com um perfil sorovar-específico. A combinação das quatro enzimas gerou 34

perfis distintos com a identificação dos sorovares 42 (Parameles) e 63 (Celledoni), que

tiveram os perfis EFFD e HDFA, respectivamente.

Finalmente, a enzima EcoNI apresentou apenas 7 perfis de restrição distintos,

esquematizados na Tabela 4E e figura 12, e individualmente também foi capaz de identificar

apenas o sorovar 68 (Saopaulo) com um perfil sorovar-específico. A combinação das cinco

enzimas gerou 38 perfis distintos com a identificação dos sorovares 21 (Djasiman), 23

(Canicola), 25 (Valbuzzi) e 57 (Tropica), que tiveram os perfis EEGCE, DFFCF, DFFCD e

GBCCA, respectivamente.

Análise dos dendogramas construídos a partir dos produtos de PCR digeridos com as

enzimas TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI

As Figuras 13 a 18 mostram os dendogramas construídos com o auxílio do TFPGA

(Tools for Population Genetic Analyses) software package conforme MILLER (1998). Os

perfis foram agrupados segundo a similaridade usando-se a distância original de NEI (1972)

e segundo a média aritmética ponderada ou agrupamento pelo algoritmo UPGMA. Este

dendograma foi construído baseado nos dados da matriz gerada pelos perfis (presença ou

ausência de fragmentos) da PCR-específica obtidos com os DNAs extraídos de Leptospira

de referência amplificados pelos iniciadores rpoB (Tabelas 4A,4B.4C,4D,4E e Tabela 5).

A análise dos perfis gerados pela digestão com a enzima TaqI (Figura 13) permitiu

agrupar os 68 diferentes sorovares de Leptospira em dois grupos. O grupo 1, formado pelos

agrupamentos A (ramos 1, 2, 3, 4 e 5) e B (ramos 1 e 2). Em todos os ramos do grupo A os

sorovares apresentaram 100% de similaridade, correspondendo aos idênticos perfis de

restrição mostrados no gel. Ramo 1: sorovares das espécies L. santarosai, L. terpstrae

(antiga genomospecie 4), L. noguchii, L. meyeri, L. kirschneri, L. inadai, L. borgpetersenii e

L. biflexa (saprofítica). Ramo 2, sorovares das espécies L. weilli, L. interrogans e L.

borgpetersenii. Ramo 3, sorovares das espécies L. santarosai, L. yanagawae (antiga

genomospecie 5), L. meyeri. Ramo 4, sorovares das espécies L. noguchii e L. borgpetersenii

37

e no ramo 5 do grupo A, sorovares das espécies L. interrogans e L. inadai. No grupo B ramo

1, os sorovares das espécies L. santarosai e L. interrogans apresentaram 100% de

similaridade, e no ramo 2 do grupo B ficou apenas o sorovar Alice pertencente a L.

santarosai. O grupo 2, formado pelos agrupamentos A (ramos 1 e 2) e B mostram a seguinte

distribuição dos sorovares: no ramo 1, espécies L. interrogans, L. santarosai e L.

borgpetersenii. No ramo 2, espécies L. interrogans, L. meyeri, L. inadai e L. borgpetersenii,

apresentaram 100% de similaridade. O grupo 2 B, formado apenas pelo sorovar Huallaga da

espécie L. noguchii.

A Figura 14 mostra a análise fenotípica dos perfis gerados pela digestão com a enzima

Tru1I, permitiu agrupar os 68 sorovares de Leptospira em 3 grupos. O grupo 1, formado

pelos agrupamentos A (ramos 1, 2, 3, 4 e 5), B (ramos 1, 2 e 3) e C (ramos 1 e 2). Nos

ramos (1, 2, 4 e 5) do grupo A os sorovares apresentaram 100% de similaridade,

correspondendo aos idênticos perfis de restrição mostrados no gel. Ramo 1: sorovares das

espécies L. weilli, L. yanagawae, L. meyeri, L. interrogans, L. borgpetersenii. Ramo 2,

sorovares de L. santarosai, L. interrogans e L. borgpetersenii. Ramo 4, sorovares de L.

kirschneri, L. terpstrae e L. borgpetersenii. No ramo 5, sorovares das espécies L.

borgpetersenii e L. inadai. No ramo 3, apenas o sorovar Trinidad de L. santarosai. Nos

ramos (1, 2 e 3) do grupo 2, agrupamento B, todos os sorovares apresentaram 100% de

similaridade entre si. No ramo 1, ficaram agrupados os sorovares das espécies L.

santarosai, L. noguchii, L. interrogans, L. borgpetersenii e L. inadai. No ramo 2, espécies L.

interrogans, L. meyeri e L. borgpetersenii. No ramo 3, espécies L. meyeri e L. weilli. No ramo

1 do grupo 3, do agrupamento C, ficaram os dois sorovares da espécie saprofítica L. biflexa.

No ramo 2 ficou o sorovar Huallaga de L. noguchii.


Sau3AI que permitiu agrupar os 68 sorovares de Leptospira em 2 grupos. O grupo 1,

formado pelos agrupamentos A (ramos 1, 2, 3, 4 e 5) e B com um agrupamento A contendo

os ramos 1 e 2. Em todos os ramos do grupo A os sorovares apresentaram 100% de

similaridade, no ramo 1 foram agrupados os sorovares das espécies L. weilli, L. interrogans,

L. borgpetersenii. No ramo 2, L. weilli, L. yanagawae e L. meyeri. No ramo 3, L. interrogans,

L. santarosai, L. inadai e L. borgpetersenii. No ramo 4, L. interrogans, L. meyeri e L.

borgpetersenii. No ramo 5, espécies L. interrogans, L. weilli e L. inadai. O agrupamento B,

do grupo 1, no ramo 1 ficou os dois sorovares de L. biflexa e no ramo 2 ficou o sorovar

Ranarum de L. meyeri. No ramo1 do grupo 2, agrupamento A, ficou a maioria dos sorovares

da espécie L. santarosai, L. noguchii, L. kirschneri, L. interrogans e L. borgpetersenii. E no

ramo 2, ficaram os sorovares de L. santarosai, L. weilli, L. noguchii, L. borgpetersenii e L.

kirschneri.

38

Tabela 6: Sorovares de Leptospira identificados pela metodologia de PCR-RFLP do gene

rpoB com as enzimas restrição TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI.

Identificação Espécie Sorovar 06

Leptospira borgpetersenii Withcombi

11 Mini 17 Leptospira inadai Kaup 21

Leptospira interrogans

Djasiman 23 Canicola 25 Valbuzzi 27 Icterohaemorrhagiae 28 Lanka 29 Szwajizak 32 Waskurin 33 Hardjo 34 Leptospira kirschneri Ramisi 42

Leptospira meyeri Parameles

43 Ranarum 44 Semaranga 46

Leptospira noguchii Huallaga

48 Myocastoris 50

Leptospira santarosai

Alice 54 Maru 55 Vargonicas 57 Tropica 60 Trinidad 63

Leptospira weilli Celledoni

65 Sarmin

68 Leptospira yanagawae Saopaulo

A análise dos perfis gerados pela digestão com a enzima MslI (Figura 16) permitiu

agrupar os 68 diferentes sorovares de Leptospira em dois grupos. O grupo 1 formado pelos

agrupamentos A (ramos 1, 2 e 3) e B (ramo 1). Em todos os ramos do grupo A os sorovares

apresentaram 100% de similaridade, correspondendo aos idênticos perfis de restrição

mostrados no gel. Ramo 1 do agrupamento A: espécies L. weilli, a maioria dos sorovares de

L. santarosai e de L. interrogans, L. meyeri, L. kirschneri, L. inadai e L. borgpetersenii. Ramo

2, espécies L. santarosai, L. weilli, L. meyeri, L. kirschneri e os dois sorovares de L. biflexa.

No ramo 3 sorovar Saopaulo da espécie L. yanagawae. Ainda no grupo 1, o agrupamento B

apresentou um ramo contendo os sorovares das espécies L. noguchii, L. santarosai, L.

meyeri e L. interrogans. O grupo 2 apresentou um agrupamento contendo a maioria dos

sorovares da espécie de L. borgpetersenii, L. kirschneri e L. terpstrae.

39


EcoNI que permitiu agrupar os 68 sorovares de Leptospira em 2 grupos. O grupo 1,

agrupamento A, ramos 1, 2 e 3 e o grupo 2, agrupamento A apresentando os ramos 1 e 2.

Nos dois grupos formados os sorovares apresentaram 100% de similaridade,

correspondendo aos idênticos perfis de restrição mostrados no gel. Grupo 1, ramo 1,

agrupamento A: sorovares das espécies L. weilli, L. santarosai, L. noguchii, L. meyeri, L.

interrogans, L. inadai, L. borgpetersenii e L. biflexa. No ramo 2 ficou o sorovar Sao Paulo de

L. yanagawae. No ramo 3 do grupo 1 ficaram os sorovares de L. inadai, L. meyeri, L.

borgpetersenii e a maioria dos sorovares da espécie L. interrogans. No ramo 1 do grupo 2,

agrupamento A, ficaram os sorovares das espécies L. interrogans e L. borgpetersenii e a

maioria dos sorovares da espécie L. santarosai. No ramo 2 do grupo 2 ficaram os sorovares

de L. santarosai, L. terpstrae, L. interrogans e a maioria dos sorovares de L. kirschneri.

A Figura 18 mostra o dendograma obtido a partir de uma matriz construída usando os

resultados das análises dos fragmentos gerados com as endonucleases de restrição TaqI,

Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI. Nesta figura, verificou-se que os 68 sorovares de Leptospira

formaram um grande grupo constituído por 3 agrupamentos denominados de A (formado

pelos ramos de 1 a 10); B (ramos de 1 a 10); C (ramos 1 e 2) e D (ramos de 1 a 16). No

ramo 1 do agrupamento A, ficaram os sorovares de L. weilli, L. borgpetersenii. No ramo 2

apenas o sorovar Withcombi de L. borgpetersenii; ramo 3, sorovares de L. inadai e L.

interrogans; ramo 4, L. interrogans; ramo 5, L. weilli, ramo 6, L. meyeri; ramo 7, L. weilli;

ramo 8, L. yanagawae; ramos 9 e 10, L. biflexa. No agrupamento B, ramo 1 ficou 6

sorovares de L. santarosai e 1 da espécie L. interrogans; nos ramos 2, 3 e 4, sorovares de

L. santarosai; no ramo 5, L. noguchii, no ramo 6, L. noguchii e L. santarosai, ramo 7, L.

borgpetersenii e L. inadai; ramo 8, L. kirschneri e L. terpstrae; ramo 9, L. kirschneri; ramo 10,

L. noguchii. No agrupamento C, ramo 1, sorovares de L. interrogans e L. borgpetersenii, no

ramo 2, L. interrogans. No agrupamento D, ramos 1, 2, 3 e 4, sorovares de L. interrogans;

ramo 5, L. meyeri; ramo 6, L. santarosai; ramo 7, L. borgpetersenii; ramo 8, L. noguchii;

ramo 9, L. kirschneri; ramos 10 e 11, L. borgpetersenii, ramo 12, L. interrogans e L.

santarosai; ramo 13, L. interrogans, L. inadai e L. borgpetersenii; ramo 14 a 16, sorovares da

espécie L. interrogans.

Figura 13. Dendograma resulta

Leptospira obtidos pela anális

restrição TaqI. O nível de reprod

repetições.

tante do agrupamento UPGMA dos perfis dos 68

se conjunta das bandas geradas pela end

odutibilidade foi garantido pela análise de “Boot

40

68 sorovares de

ndonuclease de

otstrap” de 1000



restrição Tru1I. O nível de repro

repetições.



rodutibilidade foi garantido pela análise de “Boot

41

68 sorovares de

ndonuclease de

otstrap” de 1000



restrição Sau3AI. O nível de re

1000 repetições.



reprodutibilidade foi garantido pela análise de

42

68 sorovares de

ndonuclease de

e “Bootstrap” de



restrição MslI. O nível de reprod

repetições.



odutibilidade foi garantido pela análise de “Boot

43

68 sorovares de

ndonuclease de

otstrap” de 1000



restrição EcoNI. O nível de rep

1000 repetições.



eprodutibilidade foi garantido pela análise de

44

68 sorovares de

ndonuclease de

e “Bootstrap” de



restrição Taq1, Tru1I, Sau3AI, M

análise de “Bootstrap” de 1000 r


se conjunta das bandas geradas pelas endo

MslI e EcoNI. O nível de reprodutibilidade foi

repetições.

45

68 sorovares de

donucleases de

oi garantido pela

46

5. DISCUSSÃO

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a leptospirose humana tem sido

considerada uma doença reemergente em todo o mundo. Estudos têm demonstrado que o

aumento dos surtos epidêmicos está diretamente relacionado com a explosão demográfica e

com fatores sócio-econômicos e ambientais. Conseqüentemente, as estratégias para o

diagnóstico, identificação e caracterização dos sorovares de Leptospira, envolvidos nas

infecções, precisam ser aprimoradas para o êxito do reconhecimento dos mecanismos de

transmissão, fontes de contaminação e reservatórios, assim como os métodos

epidemiológicos de prevenção e tratamento.

Para esse grupo de bactérias, a tipificação das linhagens isoladas de pacientes é

importantíssima já que existe preferência de determinados sorovares por alguns

hospedeiros, além de diferenças nos sinais clínicos, mecanismos de invasão e evolução da

doença. Portanto é essencial a rápida e eficiente identificação do agente etiológico, para

tratamento adequado e imunização (CERQUEIRA & PICARDEAU 2009; WENJUN et al.,

2009).

As leptospiras têm sido identificadas por métodos que envolvem o estudo das relações

sorológicas: reação de soroaglutinação microscópica (MAT) e testes de absorção cruzada

de aglutininas (CAAT), ambos baseados nos antígenos de superfície da célula. Esta

classificação, denominada sensu lato reconhece duas espécies, a saber: L. interrogans,

patogênica para homens e animais, e L. biflexa, saprofítica (CERQUEIRA & PICARDEAU

2009). As técnicas sorológicas de classificação e identificação apresentam alguns

obstáculos: exigem tempo e paciência na execução e preparação dos soros imunes de

coelhos (TERPSTRA et al., 1985). Poucos laboratórios têm capacidade de realizar CAAT e

a identificação de sorogrupos por MAT não é aceita oficialmente A inabilidade das espécies

patogênicas crescerem em temperaturas de 13 a 30°C durante 3, 7, 10 e 13 dias; e o não

crescimento, em presença de 8-azaguanina (225 µg ml-1) em 30°C, têm sido usado para

diferenciar espécies de Leptospiras patogênicas das não patogênicas (PEROLAT et

al.,1998).

Entre os métodos moleculares, a técnica de hibridização quantitativa de DNA-DNA

para medir a homologia genética tem sido usada como referência, para a distribuição dos

sorovares, dentro das espécies de Leptospira. O método visa comparar os genomas de

linhagens isoladas desconhecidas com vários cuja classificação já tenha sido definida e

publicada (sorovar, sorogrupo ou espécie, de referência). Após cultivo e extração dos DNAs,

eles são marcados in vitro com 32P, desnaturados e depois hibridizados, com sorovares de

referência, à 55°C e em uma temperatura estringente de 70°C, determinando-se também a

composição C+G da linhagem. Para isso (YASUDA, et al., 1987) definiram espécies como

47

um grupo de sorovares cujos DNAs estejam 70% ou mais relacionados na temperatura

ótima de reassociação de 55°C e 55% ou mais relacionados na temperatura estringente de

70°C e ainda aqueles, cujo DNA relacionado tenha menos que 6% bases não pareadas. É

possível também medir o conteúdo C+G das linhagens testadas, de acordo com o grau de

hibridização, (nas temperaturas definidas), com as linhagens de referência. Usando a

técnica de hibridização foi demonstrado que várias linhagens de L. interrogans sensu lato

são na verdade 6 espécies diferentes e não uma como fora classificada (YASUDA et al.,

1987). Atualmente já foram descritas 20 espécies no gênero Leptospira (YASUDA et al.,

1987; LEVETT et al., 2005, 2006; PEROLAT et al., 1998).

A hibridização DNA-DNA foi usada por (YASUDA et al., 1987) para comparar 44

sorovares de 23 sorogrupos conhecidos e outros 3 ainda não tipificados de L. interrogans e

sorovares únicos de L. parva e Leptonema illini. A relação obtida confirmou as novas

espécies L. parva e Leptonema illini e demonstrou que L. interrogans e L. biflexa são muito

heterogêneas. Eles descreveram sete novas espécies: L. borgpetersenii, L. inadai, L.

noguchii, L. santarosai, L. weilii, L. meyeri e L. wolbachii. Analisando, por hibridização em

slot blot, 66 sorovares de espécies de Leptospira potencialmente patogênicas conseguiu-se

classificar 57 desses sorovares, colocando-os em 6 grupos e propor uma nova espécie

Leptospira kirschneri, que agrupa os sorovares Bulgarica, Butembo, Cynopteri, Danin,

Grippotyphosa, Kabura, Kambale, Ramisi e Tsaratsovo. Foram usadas 16 linhagens de

referência como marcadores (RAMADASS et al.,1992).

A hibridização não é empregada rotineiramente, para a identificação das espécies de

Leptospira, por ser de execução tecnicamente complexa, laboriosa e por requerer o uso de

isótopos radioativos, ficando restrita aos laboratórios de referência (MOREY et al., 2006)

além disto, já foi observado que não há muita correlação entre os sistemas de classificação

sorológica e genotípica uma vez que um determinado sorogrupo pode ser freqüentemente

encontrado em várias espécies de Leptospira. Portanto esse método continua sendo

utilizado apenas para determinação de espécies em estudos filogenéticos (YASUDA, et

al.,1987).

A técnica REA (Restriction Endonucleasis Analysis) foi usada por BOLIN & ZUERNER

(1996), no genoma integral de 147 linhagens isoladas de L. interrogans, sorovar Pomona,

linhagem kennewickiem, usando as enzimas EcoRI e HpaII. Com os perfis idênticos obtidos

da digestão com EcoRI foi confirmada a identidade dos sorovares e que L. interrogans,

sorovar Pomona, tipo kennewickiem é linhagem geneticamente diferente; com a enzima

HpaII obteve-se 6 perfis distintos cuja variação foi de acordo com os animais de onde foram

isolados. Várias linhagens de Hardjo e Balcanica, (sorogrupo Hebdomadis de L. interrogans)

foram examinadas por REA e obtidos perfis que possibilitaram sua clara diferenciação

quando restrita pela enzima EcoRI (MARSHALL et al, 1981).

48

A amplificação de material genético por PCR possibilitou o desenvolvimento de uma

gama de protocolos nos quais partes do genoma das Leptospiras podem ser estudados e

comparados. Muitas pesquisas dependentes do PCR, têm sido organizadas com objetivos

de tipificação, estudo do genoma e produtos do metabolismo das Leptospiras.

Utilizando primers pequenos, de seqüências conhecidas RAPD (Polimorfismo do DNA

amplificado ao acaso) foi usado por (RAMADASS et al.,1997) com 14 linhagens de

laboratório dos sorovares (Australis, Autumnalis, Ballum, Bataviae, Canicola,

Grippotyphosa, Hardjoprajitno, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Pomona,

Pyrogenes, Panama e Tarassovi. As linhagens foram amplificadas com os primers B11

(CCGGAAGAAGGGGCGCCAT) e B12 (CGATTTAGAAGGACTTGCACAC) e o produto

analisado por gel de agarose, resultou em poucas bandas e produziu perfis diferentes para

muitos sorovares. Os resultados mostraram que sorovares Javanica, Hardjoprajitno e

Autumnalis produzem poucas bandas enquanto os outros sorovares, maior número de

bandas porém não os discrimina. Essa mesma técnica foi usada por (ROY et al., 2003),

para comparar isolados clínicos de 1929 até 2002, das Ilhas Andamana, e possibilitou

concluir apenas, que são da mesma linhagem, já identificada por MAT como pertencente ao

sorogrupo Grippotyphosa.

Testando o método de RAPD para tipificação de sorovares, diferentes pesquisadores

não conseguiram grande poder de discriminação, em relação aos métodos sorológicos

(LEVETT, 2001; ROY et al.,2003).

Além da hibridização DNA-DNA, e todos os outros métodos moleculares acima

citados, a amplificação por PCR específica do gene 16s rRNA tem contribuído para a

caracterização molecular de algumas espécies de Leptospira. Neste caso, a vantagem é

que o uso de DNA molde, em especial da região que codifica o gene 16s rRNA, considerada

conservada entre as bactérias, mas ao mesmo tempo, com variabilidade e quantidade de

informações suficientes, pode revelar claramente as relações filogenéticas entre as espécies

(MOREY et al., 2006). Entretanto, a identificação das espécies de Leptospira usando a

amplificação do gene da região 16s rRNA tem mostrado que há significante homologia entre

as seqüências o que torna essencial que a maioria dos genes amplificados, sejam também

seqüenciados, para verificar a diferença entre eles.

A análise filogenética da família Leptospiraceae, realizada por seqüenciamento da

fração 16S do gene do RNA ribossômico, revelou a formação de cinco grupos de espécies:

as leptospiras patogênicas como L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii, L. alexanderi, L.

borgpetersenii e L. santarosai formando um clado diferente das espécies não patogênicas L.

biflexa, L. wolbachii, L. meyeri e genomospecies 3, 4 e 5 e um terceiro clado contendo as

espécies L. fanei, L. broomi e L. inadai, claramente diferenciado das patogênicas e das não

patogênicas; esses três grupos foram ainda diferenciados dos últimos dois clados, que

49

incluem as espécies: Treponema parva e Leptonema illini (PEROLAT et al., 1998, MOREY

et al.,2006, HOOKEY et al., 1993). Foi observado também que alguns sorovares têm

característica de mais de uma espécie e algumas espécies contêm ambos sorovares:

patogênicos e não patogênicos, tal como havia sido observado por (YASUDA, .et al.,1987).

Com a análise por PCR usando a seqüência de 330 pb do gene para o RNA

ribossômico 16S e os primers: (F)fD3 AGAGTTTGATCCTGGCTTAG; (R)UniB

T(AC)AAGGAGGTGATCCAGC; (F)LeptoA* GGCGGCGCGTCTTAAACATG e (R)LeptoB*

TTCCCCCCATTGAGCAAGATT (produzidos a partir do sorovar Semaranga, linhagem

Veldrat Semarang 173), foi testado o poder discriminatório, em linhagens de diferentes

coleções de referência. Essas linhagens foram amplificadas, seqüenciadas, alinhadas e

comparadas entre si. Com os resultados obtidos foram construídas árvores filogenéticas e

os clusters formados, indicaram o posicionamento de linhagens de L alexanderi, separando-

as de linhagens de L. borgpetersenii e L. weilii e de algumas espécies patogênicas que

foram identificadas em nível de sorovar. Foi possível confirmar a similaridade nas

seqüências das linhagens dos sorovares Autumnalis e Icterohaemorrhagiae do Instituto

Pasteur ligadas a L. interrogans, e os sorovares de L. borgpetersenii, Vughia e Celledoni (L.

weilii) e Canalzone (L. santarosai). As linhagens de referência dos sorovares Tarassovi,

Bakeri e Mengdeng, encontrados no banco de dados, mostraram compatibilidade com as

espécies: L. borgpetersenii, L. santarosai e L. weilii, respectivamente. A espécie L. meyeri

de 3 diferentes coleções de referência mostrou distribuição heterogênea. Outras linhagens

como sorovares Parameles e Ranarum diferiram nas coleções de origem, enquanto o

sorovar Sofia de 3 diferentes coleções eram idênticos e pertencentes à L. borgpetersenii

(POSTIC et al., 2000).

A análise por PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) é considerado um método forte

de classificação de linhagens, já que mostra variação no número e comprimento de bandas

obtidas por macrorestrição, que podem ser originados devido a rearranjos no genoma. A

técnica RAPD, associada à eletroforese em gel de campo pulsátil, foi considerada um ótimo

meio de caracterizar sorovares patogênicos pelo tipo, circular ou linear e tamanho da

molécula de DNA (TAYLOR et al., 1991) e pelo tamanho da molécula, quando usada a

amplificação ex.: L. interrogans possuem apenas uma cópia dos genes rrs. (ZUERNER et

al., 1991; 1993).

A análise por Multilocus VNTR (MLVA) de 99 linhagens de referência e 156 isolados

clínicos foi usada para tentar diferenciar espécies e sorovares de Leptospiras patogênicas

por meio das regiões repetidas em tandem em vários loci do genoma (SALAUN et al. 2006).

Desenharam primers margeando as seqüências VNTL dos dois cromossomos CI e CII das

linhagens Lai e Copenhageni de L. interrogans e Hardjo-bovis de L. borgpetersenii,

encontradas in silico. Em trabalho anterior, (MAJED et al.,2005) mostraram que apenas

50

três marcadores (VNTR-7, VNTR-10 e VNTR-19) seriam necessários para identificar

sorovares de L. interrogans; então redefiniram esses primers e construíram outros para a

análise (VNTR-4, VNTR- Lb4 e VNTR-Lb5). Nas linhagens de referência, verificaram que

alguns dos primers não amplificavam todos os sorovares, que VNTR-10 foi o mais eficiente

e que a espécie L. borgpetersenii foi amplificada quase que exclusivamente quando usaram

VNTR-Lb4 e VNTR-Lb5. Consideraram um quadro de iniciador versus número de sorovares

amplificados em cada espécie, para o resultado. Foi possível diferenciar as espécies (L.

interrogans, L. kirschneri e L. borgpetersenii) nas quais os sorovares foram apenas

relacionados com as respectivas espécies, excetuando-se os sorovares Schueffneri de L.

interrogans e Grippotyphosa, Bogvere, Bim e Valbuzzi de L. kirschneri. L. biflexa não

apresentou tandem repeats, exceto dentro do gene infB1. Conseguiram confirmar 34 das

linhagens isoladas pertencem a sete sorogrupos (Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona,

Grippotyphosa, Autumnalis, Sejroe e Ballum).

A utilidade da técnica MLVA mostrou limitações, no sentido que possibilita

demonstrar somente que há diversidade genética dentro de alguns sorovares e que as

variações nestas são muito pequenas, nos sorovares das linhagens de coleções, em relação

às variações existentes na população natural impossibilitando a definição de um método

preciso de diferenciação entre eles. Devido aos resultados obtidos do uso de

seqüenciamento e alinhamento de fragmentos de genes estruturais, após amplificação,

surgiu a técnica MLST (Multilocus Sequence Typing). Com MLST (AHMED et al., 2006)

conseguiram diferenciar 120 linhagens de Leptospiras a partir de seqüências obtidas das

regiões hipervariáveis, de 6 genes estruturais. Observaram também a presença de sítios de

polimorfismo nas seqüências e que muitas das linhagens de Leptospira não estão

agrupadas com outras geneticamente similares, quando observadas após serem

organizadas em árvores filogenéticas. Esse pode ser um método adequado para identificar

leptospiras em nível de espécies, com a vantagem de resultar no depósito de seqüências

em bancos de dados, facilitando os trabalhos futuros; com isto a técnica permite também

que após amplificação das seqüências dos genes escolhidos, eles sejam submetidos à

restrição por endonucleases, dispensando o uso de seqüenciamento para análise.

O gene mais usado para identificação baseada em seqüenciamento de DNA é o do

rRNA 16S (rrs). Porém já foi demonstrado (AHMED et al, 2006; LA SCOLA et al., 2006) que

esse gene não possui suficiente polimorfismo e é necessário amplificar um segmento de

1500 pb para se obter uma identificação confiável.

LA SCOLA et al., (2006), alinharam os genomas totais das Leptospiras, que já estão

disponíveis no GenBank (L. biflexa - Patoc AF150880; L. interrogans - Lai, NC-004342; L.

interrogans - Copenhageni, NC-005823) para determinar as regiões mais variáveis, que

margeiam as regiões conservadas do gene rpoB. A partir dessa determinação desenharam

51

o par de iniciadores (Lept 1900f 5’ -CCT-CAT-GGG-TTC-CAA-CAT-GCA-3’ e Lept 2500r 5’-

CGC-ATC-CTC-RAA-GTT-GTA-WCC-TT-3’) que margeiam as posições 1900 e 2500 do

gene e possibilitam a amplificação de um segmento de 600 pares de bases, em 19

linhagens de L. interrogans. As seqüências amplificadas foram alinhadas e analisadas em

suas proporções de similaridades com o gene rpoB e rrs disponíveis no GenBank. A partir

do gene rpoB conseguiu-se distinguir com eficácia 11 sorovares dos 19 sorovares testados,

diferenciando-os dos de outras espécies; e comparando com o gene rrs, observou-se maior

polimorfismo no rpoB o que levou à dedução de que com esse gene é possível distinguir

espécies com um nível de diferença bem maior no número de pares de base.

Em uma alternativa da técnica de MLST, sem usar seqüenciamento, testou-se a

variação de nucleotídeos em parte de um gene estrutural, das espécies e sorovares

estudados e a possibilidade de tipificação de linhagens patogênicas. Nesse estudo foi

utilizada à técnica PCR-RFLP e os iniciadores produzidos por (LA SCOLA et al, 2006), que

amplificam 595 pb do gene rpoB. Foram testados 68 sorovares de referência, obtidos do

INNPAZ. O seqüenciamento foi substituído pela análise dos produtos após restrição com

cinco endonucleases comerciais: TaqI, Tru1I, Sau3AI, MslI e EcoNI, e o resultado

visualizado em gel de poliacrilamida a 6%, corado por prata. Os 38 perfis obtidos da análise

dos fragmentos formados nos géis foram confrontados com os perfis obtidos da restrição in

silico, usando como molde, seqüências do gene rpoB que estão depositadas em bancos de

dados, para confirmar o comprimento das bandas. As enzimas que forneceram maior

número de perfis, no trabalho foram a TaqI e Tru1I, com dez perfis diferentes cada uma,

seguida da enzima Sau3AI que forneceu 9 perfis; EcoNI forneceu 7 perfis e por fim MslI

forneceu 5 perfis diferentes. Com os resultados dos grupos formados e tamanho dos

fragmentos das bandas, nos perfis de cada enzima, foram construídos dendogramas e

observados a formação de clusters, que tal como já tem sido relatado por (PEROLAT et al.,

1998; MOREY et al.,2006; HOOKEY et al., 1993) indicam que sorovares de várias espécies

apresentam perfis idênticos na seqüência analisada, sugerindo que a amplificação desse

método de análise, usando várias seqüências de genes estruturais, poderá mostrar a

precisa classificação sensu stricto desses sorovares. Foi criado um perfil de identificação

para 25 dos sorovares testados, que estão incluídos em 9 espécies de Leptospira, usando

apenas as seqüências que já estão disponíveis nos bancos de dados e conseguiu-se

confirmar que a técnica PCR-RFLP, associada ao gene rpoB, possibilita uma boa

diferenciação no nível de espécies e sorovares.

52

6. CONCLUSÃO

Com esse trabalho comprovou-se que PCR-RFLP é uma metodologia prática e

eficiente, que possibilita a diferenciação de espécies e sorovares com ótimo poder

discriminatório, reprodutibilidade e facilidade de interpretação dos resultados, além de um

custo adequado para a maioria dos laboratórios de pesquisa. A técnica demonstrou, ainda,

ser adequada para estudos filogenéticos e de tipificação de espécies, sorovares e linhagens.

A seleção do gene rpoB e utilizando apenas a seqüência polimórfica contendo 595 pares de

base, do gene, possibilitou a obtenção de perfis de restrição que forneceram a precisa

identificação de 37% dos sorovares testados. Demonstrou-se que a metodologia se adéqua

ao objetivo proposto assim como se demonstrou, mais uma vez, que a tipificação sorológica

fornece uma classificação pouco confiável em se tratando de leptospiras patogênicas. A

adição de novas enzimas, com a produção de diferentes perfis ou a utilização da mesma

técnica, porém com seqüências polimórficas de outros genes estruturais deve, certamente,

aumentar a proporção de sorovares identificados. A análise dos dendogramas feitos com

resultados da restrição de cada enzima e com o resultado de todas as enzimas juntas

indicou a formação de clusters onde sorovares de várias espécies apresentam perfis

idênticos, na seqüência do lócus analisado, sugerindo que à medida que ocorrem estudos

envolvendo métodos genômicos, as linhagens serão corretamente classificadas. Os grupos

formados com os perfis do gene rpoB apresentaram variado grau de similaridade e na

formação dos clados, podem ser observadas etapas nas quais podem ter ocorrido

transferências gênicas entre alguns sorovares, assim como a medida da distância relativa

entre eles, durante a evolução (figuras 13 a 18).

53

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58

8. APÊNDICE >gi|83272337|gb|DQ296130.1| Leptospira genomosp. 1 serovar Pingchang RpoB

(rpoB) gene, partial cds

TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGGGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCTAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGCGTCGTTACATCCGTGGACGCGGAAAACATC

GTCGTTGAGAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACTTACTCTCTGACTAAATTCAAAAAGACCAACCAAGGAACT

TGCTTTAACCAAAAGCCAATCGTCGGAGTGGTTCACTCCGATTTTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGACATATCAAAGAATACATTCTCCAAATGGGAAGCAGACAATATTCTCCG

ATCGTATCTTCCGGAGAAGAAGTAAAACGAGGAACCACTCTCGCGGGACAAATCGTTACCGGCGAGAAGTTGGAT

GAGATGGGAAATATCCTGGTAAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGTCCTGCGGTTGACAACGGAGTACTCGCTCTC

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272363|gb|DQ296143.1| Leptospira genomosp. 3 serovar Holland RpoB


TCCAACATGCAACGCCAAGCGGTTCCTCTTTTAACAGAAGAAGCTCCTTTTGTGGGAACTGGTATGGAAGCTCGT

GCGGCTTATGACGCAGGTGTTTGTATTGTTGCCAAAAAAGATGGTGTGGTTTCGAAAGTGGATGCCACAGGTGTT

TGGATCAAAGAAGACCAATCCAAAGAGATTGTCCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGAACT

TGTTTTAACCAAAAACCAAACGTTTCCATGTTGCATACGACGACTGGTGGTAAAGTAGGTAAGGTTTCCAAAGAA

CGTGTGGAGATTACTTCTCCTAACGGAGAAAAAGAAACCCATGAACTTTTCCATTCGGAAGATGTGCAATACGTT

GCGGTTGTGAAAGAAGGCCAAGACTTAGGAATTGGTGCCCCAGTAGCGGGACAAATCATCAAAGGCGAAAAATAC

GGTGAGTTTGGACAAATCCTCCAAAAAGGAACTGTTCTTGCCAATGGACCATCCACTGACGCTGGTTATTTGGCA

CTTGGCCGTAACGTTCTTGTGGCATTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272349|gb|DQ296136.1| Leptospira genomosp. 5 serovar Saopaulo RpoB


TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTGCCTCTTCTTACGGAAGAAGCTCCATTTGTGGGAACTGGTATGGAAGCTCGT

GCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTATCGTTGCCAAAAAAGATGGAGTGGTTTCCAAAGTGGATGCGACTGGTGTT

TGGATCAAAGAAGACCAATCCAAAGAGATTGTCCACTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGTACT

TGTTTTAACCAAAAACCAAACGTATCCATGTTACACACCACAACTGGTGGTAAGGTGAGTAAGGTTTCCAAAGAA

CGCATTGAAGTGACTTCTCCCAATGGAGAAAAAGAAATCCATGAACTCCACCTCTCCGAGGAAGTACAATTCCTC

GCTGTTGTCAAAGAAGGGCAGGAAATTGGAGTGGGTGCTCCTGTTGCGGGTCAAATCATCAAAGGGGAAAAATAC

GGTGAGTTTGGACAAATCCTGCAAAAAGGAACTGTCCTTGCAAACGGTCCATCCACTGACGCTGGTTACTTGGCT

CTTGGGAGAAACGTTCTTGTGGCATTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272361|gb|DQ296142.1| Leptospira biflexa serovar Patoc RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAACGCCAAGCGGTACCACTCTTAACAGAAGAGGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAGCTCGT

GCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTATCGTTGCGAAAAAAGATGGTGTGGTTTCCAAAGTGGATGCAACAGGTGTT

TGGATCAAAGAAGACCAATCCAAAGAGATTGTCCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGTACT

TGTTTTAACCAAAAACCAAACGTATCCATGTTACACACCACAACTGGTGGCAAGGTAAGTAAGGTTTCGAAAGAA

CGTGTCGAAGTGACAACTCCTAACGGAGAAAAAGAAACTCATGAACTTCTTCTTTCTGATGAAGTTCAGTTCCAT

GCTGTTGTCAAAGAAGGACAAGAGGTAGGAATTGGAGCTCCAGTTGCCGGACAAATCATCAAAGGGGAAAAATAC

GGTGACTTCGGTCAGATCCTTCAAAAAGGAACTGTCCTAGCCAACGGGCCATCCACTGACGCTGGGTATTTGGCA

CTTGGACGAAATGTTCTCGTTGCCTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272339|gb|DQ296131.1| Leptospira santarosai serovar Shermani RpoB


TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGGGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTGGTCGTATCCGTAGACGCGGAAACGATC

GTTGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTGGGAGTGGTTCACTCCGATCGAAACGGTAAAGTTACTAAGGTTTCCAAAGAG

AAAATCGAAGTCACCGGCGAAAACGGAGACGTAAAAGAATACGTTCTCCAAATTGGAAGTAAACAATATTCTCCG

ATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGTAAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAATCGTCACGGGCGAGAAGTTGGAC

GAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGAACCGTTCTTGCGGACGGACCTGCGGTCGACAACGGAGTGCTCGCACTC

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCTTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272355|gb|DQ296139.1| Leptospira kirschneri serovar Cynopteri RpoB


TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACGGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGCGTTGTTACATCCGTGGACGCGGAAACCATC

GTTGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATAAATATTCTCTTACAAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTCAACCAAAAGCCGATCGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCTAAAGAA

AAAATCGAAGTCACTGGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAAACAATATGCGCCG

ATCGTTTCTTCGGGCGAAGAAGTAAAACGAGGAACGACTCTCGCAGGACAAGTTGTAGTAGGCGAGAAGTTGGAC

GAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGAACCGTTCTTGCAGACGGTCCCGCGGTTGACAACGGTGTTCTCGCTCTG

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

59

>gi|83272365|gb|DQ296144.1| Leptospira interrogans serovar Australis RpoB


TCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAA

ACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCG

ATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAGCCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGG

TTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAAC

TGAAAGAATATGTTCTTCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAAAGAG

GATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCG

TTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTT

GGGAAGGATACAACTT

>gi|83272367|gb|DQ296145.1| Leptospira interrogans serovar Autumnalis RpoB


TCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAA

ATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCG

ATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGG

TTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAAC

TGAAAGAATATGTTCTTCAAATTGGAAGCAAACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAACGAG

GATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCG

TTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTT

GGGAAGGATACAACTT

>gi|83272369|gb|DQ296146.1| Leptospira interrogans serovar Bataviae RpoB


TCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAA


ATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGG

TTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTCTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAAC

TGAAAGAATATGTTCTTCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAACGAG

GATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCG

TTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTT

GGGAAGGATACAACTT

>gi|83272343|gb|DQ296133.1| Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae RpoB (rpoB) gene, partial cds

TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATC

GTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATATGTTCTTCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTCCG

ATCGTCTCTGCAGGCGAAGAAGTAAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGAT

GAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCTCGCTCTG

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272371|gb|DQ296147.1| Leptospira interrogans serovar Pyrogenes RpoB


TCCGCGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAA


ATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGG

TTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAAC

TGAAAGAATATGTTCTTCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTCCAATCGTCTCGGCAGGCGAAGAAGTAAAAAGAG

GATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGTACGG

TTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGACAATGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTT

GGGAAGGATACAACTT

>gi|83272359|gb|DQ296141.1| Leptospira noguchii serovar Panama RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGCGTTGTCATTTCCGTGGACGCGGAAACGATC

GTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTAGGCGTAGTTCATTCCGAGATCAACGGAAAAGTAAGCAAGGTTTCTAAAGAA

AAAATCGAAGTAACCGGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAGACAATATTCTCCG

ATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGTAAAACGCGGAACCACTCTCGCAGGACAAATCGTCATCGGCGAGAAGTTGGAC

GAAATCGGAAATATCCTCGTGAAAGGAACCGTTCTTGCAGACGGTCCTGCGGTTGACAACGGAGTTCTCGCTCTT

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCTTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272345|gb|DQ296134.1| Leptospira borgpetersenii serovar Javanica RpoB


60

TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATTGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAGATCATC

GTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAGACCAACCAAGGAACC

TGCTTCAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCAGAGATCAACGGAAAAGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTCCG

ATCGTTTCTTTGGGCGAAGAAGTAAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGGAC

GAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGGGTTCTCGCTCTC

GGTAGAAATGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272347|gb|DQ296135.1| Leptospira meyeri serovar Ranarum RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTTCCTCTTCTCACAGAAGAAGCGCCGTTTGTAGGAACAGGTATGGAAGCTCGT

GCTGCTTATGATGCAGGGGTTTGTATTGTTGCGAAAAAAGATGGTGTAGTTTCTAAAGTAGATGCTACTGGTGTT

TGGATCAAAGAAGACCAATCCAAAGAGATCGTCCACTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGTACT

TGTTTTAACCAAAAACCGAACGTATCCATGCTTCATACCACAACAGGTGGAAAGGTAAGTAAAGTTTCTAAAGAA

CGGATCGAAGTAACGTCTCCAAACGGAGAAAAAGAAACACACGAACTTTTCCATTCGGAAGAAGTACAGTATTTA

TCCGTGGTGAAAGAAGGCCAAGACTTAGGAATTGGTGCACCGGTGGCCGGGCAAATCATCAAAGGGGAAAAATAC

GGTGAGTTTGGACAAATCCTCCAAAAAGGAACTGTCCTTGCGAATGGTCCTTCCACTGACGCTGGTTATTTGGCA

CTGGGACGTAATGTACTCGTTGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272341|gb|DQ296132.1| Leptospira weilii serovar Celledoni RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGAAGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACTAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTCGTTATATCGGTTGACGCAGAACAAATC

GTTGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTTAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGTTTCAATCAGAAGCCGATCGTAGGAGTCGTTCACTCCGAGATCAGCGGAAAGGTTACGAAAGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTAACATCCGAAAACGGAACAGTAAAAGAATACGTTCTCCAAGTCGGAAGCAAACAATATTCTCCG

ATCGTATCTTCGGGCGAAGAAGTAAAACGAGGATCGACTCTCGCGGGACAAGTGGTCACAGGTGAGAAGTTGGAC

GAACTGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACGGTCCTTGCGGACGGACCTGCGGTTGACAACGGAGTTCTCGCTCTC

GGAAGAAACGTTCTCGCTGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272353|gb|DQ296138.1| Leptospira wolbachii serovar Codice RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAACGCCAAGCAGTGCCACTACTCACGGAAGAAGCTCCGTTTGTAGGAACTGGGATGGAAGCTCGT

GCGGCTTATGACGCAGGGGTTTGTATCGTTGCGAAAAAAGACGGTGTAGTTTCTAAAGTAGATGCTACAGGTGTT

TGGATCAAAGAAGACCAATCTAAAGAGATCGTTCATTACCCACTCATTAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGAACT

TGTTTTAACCAAAAACCAAACGTGGCTATGTTACACACGACCACTGGCGGAAAGGTTAGTAAAGTATCCAAGGAA

CGAGTGGAACTCACTTCTCCCAACGGGGAGAAAGAAATCCACGAACTTTTCCATTCGGAAGAAGTTCAGTTTGTG

GCCGTTGTAAAAGAAGGCCAAGACTTAGGAATTGGAACACCAGTTGCGGGACAAATCATCAAAGGGGAAAAATAC

GGTGACTTTGGTCAGATCCTACAAAAAGGAACTGTCCTTGCCAACGGTCCATCCACTGACGCTGGTTATTTGGCT

CTAGGCCGAAACGTACTCGTTGCCTTTATGCCATGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272351|gb|DQ296137.1| Leptospira fainei serovar Hurstbridge RpoB


TCCAACATGCAACGCCAGGCGGTGCCTCTACTCCGCCAAGAAGCTCCCTATGTGGGAACGGGAATGGAGAGCCGT

GCCGCATACGACTCCAGAATTTGCGTGATCGCAAAACAAGACGGATACGTGAAATACGTAGACGCCGAAAAAGTC

ATCGTCGAGCAAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTACGACTTAACGAAATTTAAGAAAACCAACCAAGGCACT

TGCTTCAATCAAACTCCCGTCGTCGGAGTGATTCACTCGGAGATCGACGGGAAAGTCAGTAAGGTGACCAAGGAA

AAAATCGAAGTCACTGCGGATAACGGAAGCATAAAAGAATATAATCTGGCTTCGGGTTCTAAACAGTATCATCCG

ATCGTTTCCAACGGAGAAGAGGTTCGCAGAGGAACCACTCTTGCGGGACAAGTCGTCTTTGGCGAGAGAATGGAT

GAGCTCGGAAACATTCTGCAAAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGACCTGCAGTCGATAACGGAACTCTTGCTTTA

GGACGGAACGTGCTCGTAGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272357|gb|DQ296140.1| Leptospira inadai serovar Lyme RpoB (rpoB)

gene, partial cds

TCCAACATGCAGCGCCAAGCGGTGCCTTTACTCCGCCAGGAAGCTCCCTATGTGGGAACCGGAATGGAAAGTCGT

GCTGCGTATGATTCCCGAATTTGCGTAATCGCGAAACAAGACGGATACGTGAAATACGTCGATGCGGAAAAAGTC

GTCGTCGAGCAAAAGGGCGGCAAAGAATCCGATACGTACGACTTGACGAAATTTAAGAAGACCAACCAAGGCACT

TGCTTTAACCAAACTCCCGTAGTCGGAGTGATCCACTCCGAGATAGACGGAAAAGTCAACAAGGTAACCAGGGAG

AAAATTGAAGTCACTGCGGATAACGGAAGCATAAGAGAATACAATCTTACTTCCGGTTCTAAACAGTATCATCCG

ATCGTTTCCAACGGAGAAGAAGTTCGGAGAGGAACTACTCTTGCAGGACAAGTCGTCTTTGGCGAGAGAATGGAC

GAGCTCGGAAACATTCTGCAAAAAGGAACCGTTCTCGCGGACGGACCTGCCGTCGATAACGGAACTCTTGCATTA

GGACGAAACGTTCTGGTAGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|83272335|gb|DQ296129.1| Leptospira alexanderi serovar Manhao 3 RpoB


TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGATGGTGTCGTTACATCTGTTGACGCTGAAACGATC

61

GTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGACACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAAACCAACCAAGGAACC

TGTTTCAATCAGAAACCGATCGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGTTACGAAAGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTAACATCCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATACATTCTCCAGATCGGAAGCAGACAATATTCTCCG

ATCGTTTCTTCCGGTGAGGAAGTAAAACGCGGAACCACTCTCGCGGGACAAATCGTCACAGGCGAGAAGTTGGAT

GAACTCGGAAACATTCTCATTAAAGGCACGGTTCTCGCCGACGGTCCTGCGGTGGACAACGGAGTTCTCGCTCTC

GGTAGAAACGTTCTTGCGGCTTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACTT

>gi|167016089|gb|EU349502.1| Leptospira noguchii strain Cascata RpoB (rpoB)

gene, partial cds (serogroup Bataviae)

TCCAACATGCAGCGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTAGTTACTTCCGTGGACGCGGAAACGATC

GTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTTGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCTAAAGAA

AAAATCGAAGTCACCAGCGAAAACGGAGAAGTAAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAGACAATATTCTCCG

ATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGTAAAACGTGGAACGACTCTTGCGGGACAAATCGTCACAGGCGAGAAGTTGGAC

GAGATGGGAAATATTCTCGTGAAAGGAACCGTTCTTGCGGACGGTCCCGCCGTTGACAACGGAGTTCTCGCTCTG

GGAAGAAACGTTCTTGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTTGAG

>gi|167016091|gb|EU349503.1| Leptospira noguchii serovar Proechymis strain

1161U RpoB (rpoB) gene, partial cds

TCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAA

ACAAACACGACGGCGTTGTCATTTCCGTGGACGCGGAAACGATCGTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCG

ACAAATACGAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACCTGCTTTAACCAAAAGCCGATCGTTGGTGTGG

TTCATTCCGAGATCAACGGAAAAGTAAGCAAGGTTTCTAAAGAAAAAATCGAAGTAACCGGCGAAAACGGAGAAG

TAAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAGACAATATTCTCCGATCGTTTCTTCCGGCGAAGAAGTAAAACGCG

GAACCACTCTCGCAGGACAAATCGTAACAGGCGAGAAGTTGGACGAGATTGGAAACATTCTCGTGAAAGGAACCG

TTCTTGCGGACGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCTCGCTCTTGGAAGAAACGTTCTTGCGGCTTTCATGCCTT

GGGAAGGTTACAACTTCGAGGATGC

As seqüências a seguir foram depositadas pelo nosso grupo após seqüenciamento de DNA realizado pela Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim:

>gi|218750493|gb|EU747302.1| Leptospira borgpetersenii serovar Ballum RpoB


TTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTT

GTATCGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATCGTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAA

AAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACTTGCTTTAATCAGAAACCGATTG

TAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAA

ACGGTGAACTGAAAGAATATGTTCTTCAAATTGGAAGCAAACAATATTCTCCGATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAG

TAAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGACGAGATGGGAAATATCCTCGTAA

AAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGT

TCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGA

>gi|218750509|gb|EU747310.1| Leptospira borgpetersenii serovar Castellonis

RpoB (rpoB) gene, partial cds

GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCA

GAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATTGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAGATCA

TCGTCGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAGACCAACCAAGGAA

CCTGCTTCAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCAGAGATCAACGGAAAAGTTTCCAAGGTTTCCAAAG

AAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAAACAATATTCTC

CGATCGTTTCTTTGGGCGAAGAAGTAAAACGAGGAACGACTCTCGCGGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGG

ACGAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGGGTTCTCGCTC

TCGGTAGAAACGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGATACAACT

>gi|218750499|gb|EU747305.1| Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis


CCTCATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACCGGTAT

GGAAACCAGAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGC

GGAAAACATCGTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAA

CCAAGGAACCTGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGT

TTCCAAAGAAAAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATATGTTCTTCAAATCGGAAGCAAACA

ATATTCTCCAATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGA

GAAGTTGGACGAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGACAATGGAGT

TCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAG

62

>gi|218750511|gb|EU747311.1| Leptospira borgpetersenii serovar Sejroe RpoB


TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATC

GTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACT

TGCTTTAATCAGAAACCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATTAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAA

AAAATCGAAGTCACTGGTGAAAACGGTGAACTGAAAGAATATGTTCTTCAAATTGGAAGCAAACAATATTCTCCG

ATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAACGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGAC

GAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCCGACGGTCCTGCCGTTGATAATGGAGTTCTCGCTCTG

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACT

>gi|218750503|gb|EU747307.1| Leptospira borgpetersenii serovar Tarassovi


GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACCA

GAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGCGTTGTGACTTCCGTGGACGCGGAAACCA

TCGTTGTGGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATTCCCTTACGAAATTCAAAAAAACAAACCAAGGAA

CCTGCTTTAATCAGAAGCCGATCGTCGGAGTCGTTCACTCCGAGATCAACGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAG

AAAAAATCGAAGTGACCGGTGAAAACGGAGAACTGAAAGAATACGTTCTCCAAATCGGAAGCAAACAATATGCTC

CGATCGTTTCTTCGGGCGAAGAAGTAAAACGAGGAACGACTCTCGCAGGACAAGTTGTCGTAGGCGAGAAGTTGG

ACGAGATGGGAAATATCCTCGTTAAGGGTACGGTTCTTGCGGACGGCCCTGCGGTCGACAACGGTGTCCTCGCTC

TGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTC

>gi|218750517|gb|EU747314.1| Leptospira borgpetersenii serovar Whitticombi


TTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGAAGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACTAG

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CGGAAGAAACGTTCTCGCTGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAA

>gi|218750489|gb|EU747300.1| Leptospira interrogans serovar Bratislava RpoB


GGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTTCGTGAAGAAGCTCCGTTTGTCGGAACAGGTATGGAAACC

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CTCGGTAGAAACGTCCTCGCGGCGTTTATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGAATGCG

>gi|218750523|gb|EU747299.1| Leptospira interrogans serovar Canicola RpoB


CCTCATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTAT

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TCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACA

>gi|218750513|gb|EU747312.1| Leptospira interrogans serovar Djasiman RpoB


TTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAG

AGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACAT

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GGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGATACA

63

>gi|218750497|gb|EU747304.1| Leptospira interrogans serovar Hebdomadis RpoB


GTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTCGGAACTGGTATGGAAACCA

GAGCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAATAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACA

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TGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACT

>gi|218750515|gb|EU747313.1| Leptospira interrogans serovar Schueffneri


TGTAACCTTCCTAATGGGTTCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGCGAAGAAGCTCCTTTTGTCGG

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TGTAGGTGAGAAGTTGGATGAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGAACCGTTCTTGCTGATGGTCCTGCGGTCGA

CAACGGAGTTCTCGCTCTGGGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTTCGAGGATGC

GAAGGTTA

>gi|218750505|gb|EU747308.1| Leptospira interrogans serovar Wolffi RpoB


TCCAACATGCAACGTCAGGCGGTTCCTCTTCTCCGTGAAGAAGCTCCTTTTGTAGGAACTGGTATGGAAACCAGA

GCCGCTTACGATTCCAGAATTTGTATCGTAAACAAACACGACGGTGTCGTAACTTCCGTCGATGCGGAAAACATC

GTTGTAGAAAGAAAGGGCGGAAAAGAATCCGATACGTATCAACTTACGAAATTCAAAAAGACAAACCAAGGAACC

TGCTTTAATCAGAAGCCGATTGTAGGAGTGGTTCACTCCGAGATCAATGGAAAGGTTTCCAAGGTTTCCAAAGAA

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ATCGTCTCCGCAGGCGAAGAAGTAAAAAGAGGATCGACTCTCGCAGGACAAGTTGTTGTAGGTGAGAAGTTGGAT

GAGATGGGAAATATCCTCGTAAAAGGTACGGTTCTTGCCGACGGTCCTGCGGTCGACAACGGAGTTCTCGCTCTG

GGAAGAAACGTTCTCGCGGCGTTCATGCCTTGGGAAGGTTACAACTT

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