indução neural: determinação do eixo inicial/definição do ......indução neural:...

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Indução neural: determinação do eixo inicial/definição do domínio

neural

1. Indução da formação da PLACA NEURAL pelo Mesoderma (Mudança na forma celular, expressão de marcadores gênicos)

1. Associação da Placa Neural com a Notocorda subjacente; constrição apical nas células da borda da Placa Neural

1. Dobramento da Placa Neural

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1. A convergência do Tubo Neural é uma combinação de fatores: Pressão lateral e constrição nos pontos de dobradiça e extensão convergente

1. Fusão do Tubo Neural na porção dorsal concomitante com a Migração da Crista Neural

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O QUE INDUZ AFORMAÇÃO DOSISTEMA NERVOSO?

Prêmio Nobel em 1935

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Resultados:1. Gerou dois eixos embrionários=

DUPLICAÇÃO AXIAL

1. O segundo embrião é composto de células doadoras E aceptoras.

Conclusão:O Lábio dorsal do blastóporo tem capacidade INDUTIVA

O ORGANIZADOR

Propriedades do Organizador:

1. Inicia Gastrulação 2. Participa do

Mesoderma Dorsal3. Induz formação de

tecido Nervoso a partir do Ectoderma

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https://www.youtube.com/watch?v=rSIurckMtfU

(A origem das células do blastóporo dorsal (Organizador)

https://www.youtube.com/watch?v=rSIurckMtfU

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A fertilização em anfíbios é seguida pela ROTAÇÃO CORTICAL, que forma o CRESCENTE CINZA

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Crescente cinza

O Organizador da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)

Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo pela metade

b) Foi um resultado aleatório

c) Porque dividiu o crescente cinza.

d) Porque dividiu o Organizador.

Spemann, 19381

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Porque neste experimento a situação (A) gerou dois embriões?

a) Porque dividiu o ovo pela metade

b) Foi um resultado aleatório

c) Porque dividiu o crescente cinza.

d) Porque dividiu o Organizador.

Spemann, 19381





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No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada

2

No experimento de Spemman, que tipo de molécula deve ser a responsável pela indução do novo eixo embrionário?

a)Fator de transcrição (proteína nuclear)b)Receptor de membranac)Ligante de membranad)Proteína extracelular secretada

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?

Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?

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1. O que é que há entre o crescente cinza e a região dorsal?Sem Crescente cinza não há região dorsal

ENTÃO, qual o elemento ativo no crescente cinza?


Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Transcrição zigóticaCrescente

CinzaOrganizador

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1. Expressão na região dorsal

1. Capaz de causar duplicação axial

3. Ser de origem materna

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Um gene candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:



1. Capaz de compensar pelo efeito do UV


•A TRANSCRIÇÃO no embrião de Xenopus só ocorre NA BLÁSTULA

•Os fatores indutivos do Organizador estão presentes ANTES da blástula

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U.V.

Quantidades crescentes de Ultravioleta alteram o desenvolvimento embrionário

U.V.

Dor

sal

Vent

ral

Dor

sal

Vent

ral

O tratamento com UV inibe a rotação cortical, altera a localização de Dsh, que passa de dorsal para homogêneo

Western Blot para DshDishevelled

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Heasman, J. Development 124, 4179-4191 (1997)

Membros da Família Wnt

Obs.: Wnt=Wingless +int

Via de sinalização Wnt

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controle Injetados com XDsh

O Dsh, assim como o Wnt, causa duplicação axial

Sokol et al.,Development 121:1637-1647 (1995)




Um gene/sinal candidato a indutor endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: Wnt/Dsh

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Dor

sal

Vent

ral

O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas

Western Blot para Dsh





Candidato: Wnt/Dsh

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Dor

sal

Vent

ral

O Dsh normalmente se encontra concentrado na região dorsal de blástulas

Western Blot para Dsh

Antes da Transcriçãozigótica





Candidato: Wnt/Dsh

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O embrião de Xenopus expressa beta-catenina desde cedo

vent

ral

dors

al

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Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

Schohl and Fagotto Development 129, 37-52 (2002)

Localização da beta-catenina na blástula de Xenopus

ventral dorsal

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Um gene/sinal candidato a dorsalizador endógeno deve ter a seguintes propriedades:

Candidato: VIA DO Wnt (beta-catenina)

Development 1992 Mar;114(3):699-709.Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs.Schroeder MM, Gard DL

O centríolo do esperma organiza a polimerização dos microtúbulos que resultam na rotação cortical

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Slide 37 da Profa Nathalie:

A rotação cortical desloca elementos citoplasmáticos especificamente para o crescente cinza

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1. Fertilização

1. Polimerização polarizada dos microtúbulos pelo aster espermático

1. Rotação cortical

1. Concentração de Dsh na região vegetal-dorsal

1. Inibição de GSK-3 na região vegetal-dorsal

1. Atividade da beta-catenina na região vegetal-dorsal

Região Ventral

Região Dorsal

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Acúmulo de beta catenina nuclear.


Spemann, 1938

Pergunta: O ovo recém-fertilizado tem sua potencialidade distribuída simetricamente?

Este pedaço é só endoderma!

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Crescente cinza

A região DORSAL da blástula deriva do crescente cinza (estágio 1 blastômero)

No experimento acima, ocorreu uma duplicação na blástula aceptora e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

3

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No experimento acima, ocorreu uma duplicação do na blástula aceptoar e uma duplicação do início da gastrulação.O que aconteceria com a gastrulação se fosse removido o crescente cinza de um embrião antes da primeira divisão celular?

a)Nada, porque o embrião se regenera.b)Nada, porque o início da gastrulação é determinado pelo Organizadorc)Ausência de gastrulação porque o crescente cinza dá origem ao Organizadord)Ausência de gastrulação porque faltariam células.

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Acúmulo de beta catenina nuclear.

1. O que é que há entre o crescente cinza e a gastrulação?Sem Crescente Cinza não há Organizador e não há gastrulação.

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1. Mas beta-catenina é uma proteína nuclear, e o efeito do Organizador depende de uma proteína secretada…

Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Crescente Cinza

Organizador

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Crescente Cinza

Organizador

?

Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula

Dsh no pólo vegetal

Dsh no crescente cinza

Transcrição zigótica

Organizador

Neural

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula




Organizador

2. Transcrição zigótica do que?

COMO É FORMADO O ORGANIZADOR?

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O Organizador de Spemann fica no MESODERMA DORSAL

Organizador de Spemann

Crescente cinza

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Após a gastrulação, as células do Organizador irão formar a notocorda

QUAL É A RELAÇÃO ENTRE

O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!

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Como é formado o MESODERMA?

Nieuwkoop, anos 70O pólo vegetal SECRETA elementos que induzem o

mesoderma mesmo antes da transcrição zigótica.

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?

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma

Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:

1. Capaz de induzir MESODERMA

1. Expresso no pólo vegetal


Um fator candidato a indutor endógeno do MESODERMA deve ter a seguintes propriedades:

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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do pólo vegetal que induzem o Mesoderma

Mas, VegT é uma proteína nuclear.....

VegT

Como é formado o MESODERMA DORSAL?

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Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais

b) Os blastõmeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas

c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior

d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza

4

Dale and Slack, 1987Neste experimento, conjugaram blastômeros do pólo vegetal (amarelo )em posições variadas em relação ao pólo dorsal (variando de 1 a 4) e calcularam a percentagem de sucesso em induzir genes dorsais no ectoderma (em azul)

a) Não há diferença entre o poder de indução de 1 a 4 porque todos induziram genes dorsais

b) Os blastômeros 1 e 4 têm um índice maior porque estão nas pontas

c) O blastômero 1 teve um índice mais alto porque é maior

d) O blastômero 1 teve índice mais alto porque tem o citoplasma do crescente cinza

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Dale and Slack, 1987Blastômero dorsal do pólo vegetal é capaz de induzir mesoderma DORSAL no ectoderma

NASCE O CENTRO DE NIEUWKOOP!

Hipótese: Existem fatores no pólo vegetal que induzem o Mesoderma Dorsal/Organizador

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5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição (proteína nuclear)

b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular

secretada

5 Dale and Slack, 1987Neste experimento, que tipo de molécula o blastômero vegetal produz para exercer seu efeito no ectoderma sobrejacente?

a) Fator de transcrição (proteína nuclear)

b) Receptor de membranac) Ligante de membranad) Proteína extracelular

secretada

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Hipótese: Existem fatores SECRETADOS do polo vegetal DORSAL que induzem o Mesoderma DORSAL

VegTQue elemento materno está na região dorsal ?

QUAL É A RELAÇÃO ENTRE

O CRESCENTE CINZA,BETA-CATENINA E O MESODERMA DORSAL???!!

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(VegT)

O Centro de Nieuwkoop é formado pela sobreposição de VegT e Beta-catenina

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β-catenina

VegT e outros TGF-betas

Mesoderma Dorsal

Mesoderma Ventral

Mas VegT e beta-catenina são fatores de transcrição!!!E são maternais (= antes da transcrição zigótica!)

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E agora????!!!!

β-catenina

VegT e outros TGF-betas

Mesoderma Dorsal (Org)

Mesoderma Ventral

?

?

Nieuwkoop

O que é secretado pelo Centro de Nieuwkoop para formar o Organizador?

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β-catenina

VegT

Mesoderma Dorsal (Org)

Mesoderma Ventral

?

?

Nieuwkoop

A presença SIMULTÂNEA dos fatores de transcrição beta-catenina e VegT inicia a transcrição zigótica de genes que codificam proteínas secretadas

Genes do Organizador

?

VegT Beta-Catenina

Nieuwkoop

Organizador

1. Ativado por VegT2. Ativado por beta-cat3. Induz Organizador

4. ZIGÓTICO!!

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Genes do

Organizador

Xnr-1/

Nodal

VegTBeta-Catenina Nieuwkoop

Organizador

1. Zigótico

2. Ativado por VegT

3. Ativado por beta-cat

4. Induz Organizador

O centro de Nieuwkooop no pólo vegetal, secreta Nodal, que

induz a formação do Organizador no mesoderma

Xnrs são expressos zigóticamente

Transc. Zigótica1. Zigótico2. Ativado por VegT3. Ativado por beta-cat4. Induz Organizador

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula




Organizador

Nodal(produzido pelo C. Nieuwkoop)

Neural

VegT no pólo vegetal




tecido Nervoso a partir do Ectoderma por proteínas secretadas

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula




Organizador

Nodal

Neural


?

O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?

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VIA DE SINALIZAÇÂO DE BMP

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Existem proteínas extracelulares que são inibidores de BMP e atuam evitando a ligação de BMP com o seu Receptor

O lábio do blastóporo dorsal produz inibidores de BMP como Chordin, Noggin e Follistatin.

NOGGINCHORDIN

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Development October 15, 2003 vol. 130 no. 20 4975-4988

Superexpressão de inibidores de BMP induzem um segundo eixo neural.

O que é que o lábio do blastóporo dorsal secretaque pode induzir diferenciação neural no ectoderma?

Inibidores de BMP

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SE inibição do BMP induz destino neural

BMP

Epidermal

Neural

BMP

Epidermal

Neural

ENTÃO BMP induz destino epidermal

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6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

6 Como provar que BMP4 comanda a decisão de epiderme e placa neural a partir do ectoderma?

a) Aumentar a quantidade de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido epitelial.

b) Reduzir a quantidade de inibidor de BMP4.Espera-se que tenha mais tecido neural

c) Reduzir o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

d) Aumentar o número de receptores de BMP4. Espera-se que tenha mais tecido neural

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mRNA para receptor dominante negativo de BMP (pg) Normal

Duplicação

0 88% 0

20 52% 27%

200 7% 76%

Suzuki et al. 1994 Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 25;91(22):10255-9.

Remoção da via de sinalização de BMP>> neural

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O potencial de cada célula é indefinido

A posição de cada célula em relação a fonte de morfógeno

é interpretada em programas de diferenciação distintos

Gradiente morfogenético

Fator Morfogenético:

Tem efeitos diferentes em doses-diferentes

Ou seja:

Gera um gradiente de resposta a partir da origem do fator

BMC Developmental Biology 2007 7:22

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EpitélioNeural

BMP

BMP4

O ectoderma exposto a altos níveis de BMP = Epitélio

EpitélioNeural

B M P

BMP4

O ectoderma exposto a baixos níveis de BMP = Neural

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BMP

Epidermal

Neural

SE BMP induz epidermal

Epidermal

Neural

ENTÃO ausência de sinal deve favorecer a diferenciação neural

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Epidermal

Neural

ENTÃO ausência de qualquer sinal favorece NEURAL

Modelo de diferenciação neural por default

Redução da densidade de células tronco aumenta a expressão de genes neuraisof neural markers. Evidence for the “default neural state”

Tropepe, V. et al., 2001. Neuron, 30(1), pp.65–78.

Neu

ralm

arke

rsP

lurii

pote

ncy

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Recém-fertilizado

Rotação cortical

Meso-blástula

Gástrula




Organizador

Nodal

Neural


Inibidor de BMP

Ausência de qq sinal……..

NeuralModelo de diferenciação neural por default

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E em outros modelos, é parecido?

• Próxima aula

indução neural: determinação do eixo inicial/definição do ......indução neural:...

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