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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis Doctoral

Implicancias de los receptores de lasImplicancias de los receptores de lasendotelinas sobre la regulación central deendotelinas sobre la regulación central dela tirosina hidroxilasa y sus consecuenciasla tirosina hidroxilasa y sus consecuencias

sobre la presión arterial en ratassobre la presión arterial en ratashipertensas DOCA-salhipertensas DOCA-sal

Cassinotti, Luis Roberto

2018-04-06

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cassinotti, Luis Roberto. (2018-04-06). Implicancias de los receptores de las endotelinas sobrela regulación central de la tirosina hidroxilasa y sus consecuencias sobre la presión arterial enratas hipertensas DOCA-sal. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires.Cita tipo Chicago:

Cassinotti, Luis Roberto. "Implicancias de los receptores de las endotelinas sobre la regulacióncentral de la tirosina hidroxilasa y sus consecuencias sobre la presión arterial en ratashipertensas DOCA-sal". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. 2018-04-06.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Biológica

Implicancias de los receptores de las endotelinas sobre la

regulación central de la tirosina hidroxilasa y sus consecuencias

sobre la presión arterial en ratas hipertensas DOCA-sal.

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires

en el área Química Biológica

Lic. Cassinotti Luis Roberto

Director de tesis: Dr. Marcelo Sergio Vatta.

Consejeros de estudio: Dr. Omar Pedro Pignataro.

Lugar trabajo: Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de

Buenos Aires e Instituto de la Química y el Metabolismo del Fármaco (IQUIMEFA, UBA-

CONICET).

Buenos Aires, 2018

IMPLICANCIAS DE LOS RECEPTORES DE LAS ENDOTELINAS SOBRE LA REGULACION

CENTRAL DE LA TIROSINA HIDROXILASA Y SUS CONSECUENCIAS SOBRE LA

PRESIÓN ARTERIAL EN RATAS HIPERTENSAS DOCA-SAL.

Resumen. El sistema nervioso central (SNC) tiene un papel preponderante en la regulación a

corto plazo de la presión arterial. Sin embargo, diferentes estudios muestran que el mismo

participa también en la modulación a largo plazo. Las endotelinas y sus receptores (ETA y ETB) se

expresan en diversas áreas del SNC, muchas de ellas involucradas en la regulación de la función

cardiovascular. Nuestras investigaciones buscan entender la interacción entre el sistema

endotelinérgico central y la transmisión catecolaminérgica, y su posible participación en la

modulación de la función cardiovascular tanto en situaciones normales como patológicas. En el

presente trabajo estudiamos los efectos de la inhibición central crónica (7 días) de los receptores

ETA o de la activación de los receptores ETB sobre el funcionamiento del sistema

catecolaminérgico en un modelo de hipertensión arterial (HTA) sal dependiente como es el

DOCA-sal. Para esto se evaluó el sistema catecolaminérgico mediante la determinación de

diferentes parámetros de la tirosina hidroxilasa (TH) en el hipotálamo anterior (HA), el

hipotálamo posterior (HP) y en el bulbo olfatorio (BO). Al respecto, se estudiaron los niveles de

actividad de la enzima, así como también los niveles de expresión, fosforilación y su ARNm. Por

un lado, el HA y el HP son núcleos importantes en la regulación central del sistema

cardiovascular. Por otro lado, el BO se comunica con diversas áreas relacionadas con la

modulación de la actividad cardiovascular, sin embargo, poco se conoce sobre su participación

en este sentido. En paralelo, se evaluaron las consecuencias a largo plazo de la inhibición ETA o

de la activación ETB sobre parámetros hemodinámicos como la presión arterial sistólica (PAS) y

la frecuencia cardiaca (FC). La inhibición ETA moduló de manera diferencial los distintos factores

analizados de la TH, principalmente en el HA, el HP y el BO derecho los animales DOCA-sal.

Además, debido al tratamiento, la PAS disminuyó significativamente en estos animales

hipertensos. Se observaron resultados similares sobre este parámetro hemodinámico al activar

crónicamente el receptor ETB. Concluimos que los receptores de las endotelinas juegan un papel

clave en la modulación crónica del sistema catecolaminérgico central y en el desarrollo de la HTA

sal dependiente en este modelo animal abriendo un nuevo campo de discusión y experimentación

sobre los posibles beneficios terapéuticos de encontrar nuevos antagonistas ETA o agonistas ETB

con mayor acción específica sobre el SNC.

PALABRAS CLAVE: ENDOTELINAS; HIPERTENSIÓN; DOCA-sal; TIROSINA HIDROXILASA;

HIPOTÁLAMO; BULBO OLFATORIO.

IMPLICATIONS OF THE ENDOTHELIN RECEPTORS ON CENTRAL REGULATION OF THE TYROSINE HYDROXYLASE AND ITS CONSEQUENCES ON BLOOD PRESSURE

IN DOCA-SALT HYPERTENSIVE RATS.

Abstract. Central nervous system (CNS) has a relevant role on short-term regulation of blood

pressure. However, new findings remark his long-term participation. Endothelins and its

receptors (ETA and ETB) are expressed in various areas at the CNS, many of them involved on

cardiovascular function regulation. Our researches aim to understand the interaction between

central endothelinergic system and catecholaminergic transmission. In the present work we study

the effects of ETA chronic blockade or ETB chronic activation over the functioning of

catecholaminergic system in the development and/or maintenance of salt dependent

hypertension using the DOCA-salt animal model. We assessed the catecholaminergic system

throughout the study of the tyrosine hydroxylase (TH) in both, anterior and posterior

hypothalamus, both important nucleus that participates in the regulation of cardiovascular

system. We also investigate the olfactory bulb. This telencephalic region communicates with

diverse areas related with cardiovascular activity regulation, however, little is known about its

participation in this sense. In parallel, we assessed the consequences of ETA blockade or ETB

activation over systolic blood pressure and heart rate. Chronic ETA blockade modulates TH

mainly at both anterior and posterior hypothalamus and at the right olfactory bulb of DOCA-salt

animals. Also, a significant systolic blood pressure reduction was observed in these animals.

Similar results were observed in this hemodynamic parameter when ETB was chronically

activated. We conclude that endothelin receptors play a key role in chronic central

catecholaminergic system modulation and in the development of salt dependent hypertension in

this animal model.

KEY WORDS: ENDOTHELIN; HYPERTENSION; DOCA-salt; TYROSINE HYDROXYLASE;

HIPOTHALAMUS; OLFACTORY BULB.

“Si quieres ir rápido camina solo

Si quieres llegar lejos ve acompañado”

Proverbio africano

A Paula.

Agradecimientos

Agradezco profundamente a:

A la Universidad de Buenos Aires por haber sido la institución que permitió mi formación

profesional y destacar su carácter de universidad pública, libre y gratuita. En particular

a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales donde me convertí en Biólogo y la

Facultad de Farmacia y Bioquímica siendo mi espacio de trabajo durante estos años de

formación doctoral.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y a la

Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) por financiar

económicamente la labor realizada durante estos 5 años.

Al Instituto de la Química y el Metabolismo del Fármaco (IQUIMEFA-UBA-CONICET)

y la Cátedra de Fisiología (FFyB-UBA) por darme el espacio y las herramientas para

realizar el presente trabajo de Tesis.

Al Profesor Dr. Marcelo S. Vatta, por haberme dado la oportunidad de trabajar en su

grupo de investigación. Por trabajar a la par nuestra, día a día, en las innumerables

tareas que tienen que ver con llevar adelante un laboratorio. Por sus consejos,

correcciones, sugerencias, enseñanzas y principalmente por haber estado presente,

humana y profesionalmente, siempre.

Al Profesor Dr. Omar P. Pignataro, mi consejero de estudios. Por guiarme en la elección

de los cursos de posgrado, por su amabilidad y su buen humor.

A los miembros de mi comisión de seguimiento: la Dra. Claudia Bregonzio, la Dra. Silvia

García y nuevamente al Dr. Omar Pignataro. Por sus consejos, sugerencias y

correcciones orientándome hacia un trabajo científico de calidad.

A mis compañeras de trabajo. La Dra. Julia Guil (Juli), la Bioq. Mercedes Schöller

(Mechi), la Dra. Mónica Navarro (Moni) y la Dra. Sandra Hope (San). Gracias Juli,

Mechi, Moni y San por aceptar un forastero, biólogo, de exactas y hombre. Tanto por las

infinitas veces que me ayudaron en mis experimentos como por las charlas, anécdotas,

risas, mates y comidas compartidas. Bendito fui entre todas ustedes.

A la Dra. Liliana Bianciotti (Lili). Por colaborar siempre con nuestro laboratorio, por

asistirme en la escritura del paper y por ayudarme en la búsqueda posdoctoral.

A todos los que fueron pasando por el laboratorio: Vani, Tony, Ale, Flor, May, Aldi,

Carla, Majo y Lu. Por la ayuda que nos dieron, a todos, en el laboratorio. Por compartir

el día a día, haciendo el esfuerzo aún en medio de la cursada.

A Gaby Noceti por ayudarme con el trabajo de bioterio, cuidando los animales,

pesándolos, controlándoles la comida y el agua para que mis experimentos salgan bien.

A la gente de la Cátedra de Fisiología y del INIGEM. A Nati G, Facu, Debo, Vicky,

Estefa, Myr, Ani N, Anita, Fede, Mechi, Franquito, Nati O, Bernardita, Caro, Romi,

Beatriz, Lucho, Juan, Gra, Ingrid, Sandra L, Alicia, Ro, Analía, Gaby MP, Andrea, Ana,

Edith y Amalia. Por darme una mano siempre que lo necesité. Por las charlas, festejos,

almuerzos y congresos compartidos.

A mis amigos del barrio (Sarandí) que creen que lo que hago es difícil y que por eso

dicen que soy inteligente. A Nacho, Maira, el Tero, Martín, Rodrigo, Brenda, Cynthia,

Seba, Javi y Eze. Uno nunca debe olvidar sus orígenes.

A mis amigos de la facultad, Los Pinos. A Gustavo, JP, Beto, Nahuel, Hugo, Ferraro,

Sato, Ale y Aldi. Porque saben del esfuerzo que demanda la carrera en Exactas y algunos

también entienden el del doctorado. Y aunque digan que los becarios “vivimos de sus

impuestos”, lo hago feliz, porque reinvierto gran parte de sus aportes en compartir

tiempo con ellos.

A Sandino, Dinito. Mi amigo fiel, con su mirada de amor incondicional me llena el alma.

A mi familia. A mis viejos Isabel y Luis que, si bien creen que soy médico, están orgullosos

de que lo sea. A mis hermanos Martín, Diego y Ezequiel por compartir la vida y el amor

por Arsenal. A mis sobrinos: Santi, Facu, Thiago, Avril y Martina.

A Pau, todo. Porque está siempre a mi lado, haciéndome reír en las buenas, abrazándome

en las malas. Por entender mis momentos de estrés y enseñarme a salir de ellos con la

mejor actitud. Por su energía interminable. Por su alegría. Porque la admiro tanto. Por

compartir su vida conmigo y por su sonrisa. La amo, y esta tesis es para ella.

Índice

1. Introducción........................................................................................................................ 1

1.1. Hipertensión ................................................................................................................... 1

1.2. Regulación de la presión arterial. ....................................................................... 3

1.3. El hipotálamo. ............................................................................................................... 6

1.3.1. Hipotálamo anterior. ............................................................................................... 7

1.3.2. Hipotálamo posterior. ............................................................................................. 8

1.4. Los bulbos olfatorios. ................................................................................................ 9

1.5. El modelo DOCA-sal. ................................................................................................ 12

1.6. El sistema catecolaminérgico .............................................................................. 16

1.6.1. Regulación de la tirosina hidroxilasa. ................................................................ 18

1.6.2. Efectos sobre la regulación de la presión arterial. ......................................... 21

1.7. El sistema endotelinérgico. .................................................................................. 21

1.7.1. Las endotelinas. ....................................................................................................... 21

1.7.2. Los receptores de las endotelinas ...................................................................... 23

1.7.3. Endotelinas centrales, el sistema catecolaminérgico y la fisiología

cardiovascular. ......................................................................................................... 25

1.8. Asimetrías funcionales. .......................................................................................... 26

1.9. Antecedentes de nuestro laboratorio. .......................................................... 28

1.9.1. Modulación del sistema catecolaminérgico por endotelinas en el

hipotálamo. .............................................................................................................. 28

1.9.2. Modulación del sistema catecolaminérgico por endotelinas en el bulbo

olfatorio ..................................................................................................................... 30

2. Hipótesis y objetivos ................................................................................................. 32

3. Materiales y métodos ............................................................................................... 35

3.1. Animales. ....................................................................................................................... 35

3.2. Desarrollo del modelo DOCA-sal. ..................................................................... 36

3.2.1. Caracterización del modelo DOCA-sal. .............................................................. 37

3.3. Cirugías y procedimientos experimentales. ................................................ 41

3.3.1. Grupos experimentales. ........................................................................................ 42

3.3.2. Preparación de BQ-610, IRL1620 y las bombas osmóticas. .......................... 42

3.3.3. Colocación de la bomba osmótica y la cánula ICV. ........................................ 44

3.3.4. Registros de presión arterial sistólica y frecuencia cardiaca. ...................... 45

3.3.5. Obtención y procesamiento de las muestras. ................................................. 46

3.4. Drogas y reactivos. .................................................................................................... 47

3.5. Actividad de la tirosina hidroxilasa. ................................................................ 48

3.6. Expresión de la tirosina hidroxilasa total y fosforilada. ....................... 49

3.7. Expresión del ARNm de la tirosina hidroxilasa. ........................................ 50

3.8. Análisis estadístico. .................................................................................................. 52

4. Resultados .......................................................................................................................... 54

4.1. Bloqueo crónico del receptor ETA. .................................................................... 54

4.1.1. Parámetros hemodinámicos. ............................................................................... 54

4.1.2. Hipotálamo anterior y posterior. ........................................................................ 57

4.1.2.1. Actividad de la tirosina hidroxilasa. .................................................................... 58

4.1.2.2. Expresión de la tirosina hidroxilasa total y fosforilada. ....................................... 59

4.1.2.3. Expresión del ARNm de la tirosina hidroxilasa. ................................................... 62

4.1.3. Bulbos olfatorios. .................................................................................................... 63




4.1.4. Resumen: Bloqueo crónico del receptor ETA. .................................................. 69

4.2. Activación crónica del receptor ETB. ............................................................... 72

4.2.1. Parámetros hemodinámicos. ............................................................................... 72





4.2.3. Bulbos olfatorios. .................................................................................................... 83




4.2.4. Resumen: Activación crónica del receptor ETB. ............................................... 88

5. Discusión.............................................................................................................................. 91

5.1. El modelo DOCA-sal. ................................................................................................ 92

5.1.1. El sistema catecolaminérgico hipotalámico. .................................................... 95

5.1.2. El sistema catecolaminérgico en el bulbo olfatorio. ...................................... 96

5.2. Implicancias de los receptores de las endotelinas. ................................. 97


5.2.2. El bulbo olfatorio. ................................................................................................. 104

5.2.3. Parámetros cardiovasculares............................................................................. 107

5.3. Discusión general. .................................................................................................... 110

6. Conclusiones ................................................................................................................... 122

7. Perspectivas .................................................................................................................... 124

8. Abreviaturas ................................................................................................................... 127

9. Bibliografía ....................................................................................................................... 129

~ 1 ~

1. Introducción

1.1. Hipertensión.

La hipertensión arterial (HTA) es una enfermedad multifactorial, de evolución crónica

y según el último informe de la organización mundial de la salud, afecta a más de 1000

millones de personas en todo el mundo. Ya sea directa o indirectamente es la responsable

de más de 10 millones de muertes por año, representando en 2008 el 18% del total [1,2].

Según este artículo, 1/3 de las personas mayores de 25 años es hipertenso, un 1/3 de los

hipertensos no lo sabe y dentro de los que conocen su padecimiento, 1/3 no responde

apropiadamente a los diferentes tratamientos disponibles hoy en día [1,2]. La HTA se

caracteriza por cambios hemodinámicos que provocan un aumento sostenido de la presión

arterial sistólica (PAS) y/o diastólica (PAD) por encima de los 140 mmHg y los 90 mmHg

respectivamente (Tabla 1) [3,4]. Debido a que no presenta síntomas durante su desarrollo,

se la conoce como el “asesino silencioso”. Su carácter asintomático deriva en una alta tasa

de morbilidad y mortalidad debido al daño ocasionado en órganos blanco como el corazón,

el riñón, la vasculatura, la retina y el sistema nervioso central (SNC). Por ello, la HTA es

considerada la causa principal de enfermedades cardiovasculares, accidentes

cerebrovasculares y falla renal [1,2].

Aproximadamente el 50% de las muertes de individuos menores de 70 años a nivel

mundial se deben a patologías no transmisibles como lo es la HTA. En Argentina, esta

proporción representa el 80%, siendo el 42 % de ellas por enfermedades cardiovasculares.

El estudio RENATA 2 es el último trabajo realizado sobre la incidencia de la HTA sobre la

población argentina [5]. Si bien fue hecho en el año 2015 sus resultados aún no fueron

publicados. Por esta razón, debemos apoyarnos en el estudio RENATA inmediatamente

anterior publicado en el año 2012 [6]. Esta investigación reportó que cerca del 34% de los

individuos estudiados eran hipertensos, con una mayor prevalencia en pacientes hombres.

Además, el 37% de los hipertensos desconocía su enfermedad. Llamativamente, el 56% de

los individuos hipertensos estaban tratados pero sólo el 27% pudo controlar su presión

arterial (PA) [6].

La investigación científica en el campo de esta enfermedad resulta un factor de vital

importancia ya que, en la mayoría de los casos, la falta de conocimiento acerca de los

~ 2 ~

mecanismos fisiopatológicos subyacentes en la génesis, desarrollo y/o mantenimiento de la

HTA la convierten en un serio problema para el sistema de salud a nivel global. Esto no

repercute solamente a nivel humano, en cuanto a su calidad y expectativa de vida, sino

también a nivel económico representando un gasto creciente en políticas públicas sanitarias

orientadas a la prevención y el tratamiento de la HTA [1,2].

Múltiples factores llevan al desarrollo y mantenimiento de la HTA. Estos componentes

son de índole genético, ambientales, anatómicos, adaptativos, asociados al sistema

nervioso, humorales, endócrinos, hemodinámicos, etc. [7,8]. Esta complejidad dificulta el

estudio y la compresión de los mecanismos implicados en la génesis, desarrollo y

mantenimiento de esta patología. En este contexto, se hace conveniente la clasificación

según su factor de origen en esencial y secundaria. La HTA esencial es aquella cuya causa es

desconocida (en general con una fuerte influencia hereditaria) y esto ocurre

aproximadamente en el 90% de los casos [9,10]. Por otro lado, la HTA secundaria es aquella

que muestra algún factor responsable y sucede entre el 5% y el 10% de los casos [11,12]. En

esta última, el aumento de la PA puede ser un indicador de alguna enfermedad subyacente

aún más grave [13]. En muchos de estos pacientes, la HTA puede ser estudiada y controlada

sin la necesidad de un tratamiento crónico. Los factores más frecuentes de HTA secundaria

incluyen enfermedades de origen renal y endocrinopatías como Cushing, feocromocitoma,

hipertiroidismo e hiperaldosteronismo [13–15]. Algunos de los factores que contribuyen al

desarrollo de HTA incluyen la obesidad, el consumo de alcohol, la edad y diferentes fuentes

de estrés asociadas a la vida en sociedades desarrolladas (trabajo, depresión, ansiedad, mala

alimentación, etc.) [13,16–20].

CLASIFICACIÓN DE LA PRESIÓN ARTERIAL

Condición PA sistólica (mmHg) PA diastólica (mmHg)

Óptima < 120 < 80 Normal 120-129 80-84

PA limítrofe 130-139 85-89

Hipertensión arterial HTA nivel 1 140-159 90-99 HTA nivel 2 160-179 100-109 HTA nivel 3 ≥ 180 ≥ 110

Tabla 1. Clasificación de la presión arterial. Valores considerados sin el uso de drogas antihipertensivas y sin enfermedad aguda. PA: Presión arterial, HTA: Hipertensión arterial. Modificado de “Consenso de hipertensión arterial”, Sociedad Argentina de Cardiología, 2013 [4].

~ 3 ~

El consumo de 5 gr. diarios de sal contribuye al desarrollo de HTA y de enfermedades

cardiovasculares, entonces resulta alarmante que actualmente el consumo promedio a nivel

mundial sea cercano a los 10 gr. [1,21–23]. En este sentido, diferentes abordajes se han

puesto en práctica con el objetivo de prevenir y reducir la incidencia de la HTA. Un estudio

muy importante utilizó una dieta denominada DASH (por su nombre en inglés: Dietary

Approach to Stop Hypertension) basado en la reducción de la ingesta de carnes rojas y

azucares elevando el consumo de vegetales y frutas. Se observó que esta dieta combinada

con una reducción en el consumo de sodio disminuye efectivamente la PA tanto en pacientes

normotensos como en hipertensos [24,25]. Otro grupo de investigación realizó un

seguimiento a largo plazo (10-15 años) de pacientes sometidos a la dieta TOHP (por su

nombre en inglés: Trials of Hypertension Prevention). Los resultados indicaron que una dieta

con bajo sodio disminuye no solo la PA sino que reduce hasta en un 30% el riesgo de morir

por una enfermedad cardiovascular, padecer infarto de miocardio y/o un accidente

cerebrovascular [26,27].

Esta íntima relación entre el aumento de la PA y la ingesta elevada de sodio se

correlaciona con alteraciones a nivel central [14,16,28]. Un tercio de las personas

normotensas son sensibles al sodio; y en ellos los mecanismos que llevan a un incremento

de la PA parecen implicar modificaciones en la regulación del SNC (principalmente en la rama

simpática) y en el sistema renina-angiotensina (SRA) [20,29]. Se ha demostrado que la alta

ingesta de sodio y el consecuente aumento de la PA va acompañado de alteraciones a nivel

noradrenérgico [30,31]. Además, los pacientes que padecen HTA también presentan una

mayor actividad del SNC probablemente inducida por el exceso en el consumo de sal [32]. Si

bien es plausible la interrelación entre la generación de HTA ligada al alto consumo de sodio

y acompañada por una desregulación del SNC, los mecanismos por los cuales se desarrolla

y mantiene el estado hipertensivo no están claramente identificados [22,23,29,33–35].

1.2. Regulación de la presión arterial.

La PA se define como la presión que ejerce la sangre sobre las paredes de las arterias

y se mide normalmente en milímetros de mercurio (mmHg). Este parámetro puede

subdividirse en dos componentes principales: la PA diastólica (PAD), que es el valor mínimo

de presión que se observa durante la diástole, y la PA sistólica (PAS), que es el valor máximo

de presión alcanzado durante la sístole cardíaca. Los valores de PA considerados “normales”

rondan los 80 mmHg para la PAD y 120 mmHg para la PAS (Tabla 1) [4]. La PAD está

~ 4 ~

influenciada por el volumen minuto (VM, o gasto cardíaco). A su vez, el VM es el producto

de la cantidad de sangre eyectada en cada latido (VS, volumen sistólico) por el número de

latidos por minuto (FC, frecuencia cardíaca). Por otro lado, la PAS está afectada por la

resistencia total periférica (RTP). La función principal de la regulación de la PA es la de

permitir la correcta circulación y un adecuado intercambio de gases, nutrientes y desechos

a lo largo de todos los lechos vasculares. Los mecanismos implicados son complejos, pero

puede clasificarse en tres categorías principales [36–41]:

✓ Regulación nerviosa: Estos mecanismos actúan mediante reflejos (feedback) o por

anticipación (feedforward) (figura 1). Ambos tipos de respuestas no son

independientes una de la otra, sino que interactúan entre sí. Las vías de

retroalimentación en general son respuestas rápidas de ajuste fino implicando la

modulación del balance autonómico. El barorreflejo es el clásico ejemplo de este

tipo de mecanismo. Allí, los barorreceptores ubicados en el seno carotídeo y el

cayado aórtico censan la PA. Ante un descenso repentino de este parámetro

aumentará la descarga autonómica simpática. Esto provoca una mayor contracción

del músculo cardíaco, un aumento de la FC y de la RTP. Este reflejo provoca un

inmediato aumento de la PA. En el caso en que se produzca un súbito aumento, la

respuesta predominante será a través del nervio vago disminuyendo la FC

regularizando la PA.

Los mecanismos de anticipación también son respuestas rápidas y están

relacionadas con la regulación mediada por los comandos centrales superiores

(figura 1) [36]. Estos comandos están compuestos por distintos núcleos y áreas

fuertemente implicados en la regulación central de la PA. Entre ellos podemos

nombrar el hipotálamo, la corteza motora, la amígdala y el cerebelo entre otros.

Estos centros actúan sobre el tallo encefálico modulando la descarga parasimpática

y principalmente la descarga simpática [36].

Es importante mencionar otros núcleos y áreas relacionadas con la regulación

central de la fisiología cardiovascular que modulan la PA, la FC y el balance

hidrosalino. Entre estos encontramos sectores del hipotálamo como el núcleo

paraventricular (NPV) y el núcleo dorsomedial, el locus coeruleus (LC), las cortezas

medial prefrontal e insular y el área gris periacueductal [33,36,42–50].

~ 5 ~

✓ Regulación humoral: Los mecanismos humorales de regulación de la PA suelen ser

un poco más lentos al ser comparados con la respuesta nerviosa. Incluyen complejos

mecanismos como el sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), las

catecolaminas en la médula adrenal, la hormona antidiurética (ADH, o [VP],

vasopresina) y los Péptidos natriuréticos (ANP, BNP y CNP) entre otros (tabla 2).

✓ Regulación local: Factores como las endotelinas (ETs), el óxido nítrico (ON), la

adenosina, los niveles de O2 y el CO2 modifican el comportamiento de las arterias de

bajo calibre, modulando la capacidad de perfusión e irrigación a nivel local en los

distintos tejidos. El ON, la adenosina y el CO2 actúan como vasodilatadores, mientras

que las ETs y el O2 como potentes vasoconstrictores (tabla 2).

Figura 1. Esquema ilustrativo de la regulación de la presión arterial. Las líneas rojas representan vías aferentes y las negras eferentes. Los cuadros color naranja representan las distintas fuentes de estímulos intrínsecos y extrínsecos, los cuadros color azul las principales áreas centrales involucradas, el cuadro verde indica los factores humorales y la regulación local, mientras que los recuadros rojos indican los sistemas efectores. Modificado de R. Dampney y col; 2016 [36].

~ 6 ~

MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA PRESIÓN ARTERIAL

Mecanismos Factores Efectos regulatorios

Nerviosos

Descarga simpática Tono vascular, FC y contractilidad,

funciones renales

Descarga parasimpática Tono vascular, FC y contractilidad,

funciones renales

Humorales

Catecolaminas circulantes FC y la contractilidad del corazón

Sistema renina-angiotensina- aldosterona Funciones renales

Vasopresina vasoconstrictor

Péptidos natriurético atrial vasodilatador

Locales

Endotelinas vasoconstricción/vasodilatación

Óxido nítrico vasodilatación

Prostaglandinas vasoconstricción

Adenosina vasodilatación

Oxígeno vasoconstricción

Dióxido de carbono vasodilatación

Tabla 2. Mecanismos de regulación de la presión arterial. Se detallan los factores involucrados en los diferentes mecanismos de regulación y sus efectos principales.

1.3. El hipotálamo.

Una de las áreas del SNC estudiadas en el presente trabajo de tesis es el hipotálamo

(Figura 2). Esta región del cerebro es una compleja estructura compuesta por áreas y

núcleos que integran y regulan diversos mecanismos fisiológicos tales como el sistema

cardiovascular, el balance energético, el equilibrio hidrosalino, el control de la temperatura

corporal y funciones comportamentales de defensa, agresión y reproducción

[33,34,42,43,45–47,51,52]. El hipotálamo recibe constantemente información útil para

censar en todo momento la situación del individuo y su interacción con el medioambiente.

A su vez, modula el funcionamiento de centros superiores e inferiores para otorgar una

respuesta acorde a cada situación. Además, es una de las regiones del SNC que presenta

mayores cambios funcionales y neuroquímicos en animales hipertensos [14,33,53].

A nivel humoral, el eje hipotálamo-hipofisario cumple un papel fundamental en la

regulación de la mayoría de las vías hormonales dado que los factores liberados por el

hipotálamo pueden actuar en la adenohipófisis a través de los vasos porta largos. En

paralelo, importantes núcleos del hipotálamo como el NPV y el supraóptico (NSO) tienen

extensas proyecciones axonales que llegan a la neurohipófisis y permiten enviar a

circulación péptidos con función endócrina como por ejemplo la VP.

El hipotálamo se encuentra ubicado en la porción ventromedial del diencéfalo y puede

ser dividido en anterior (HA), medio y posterior (HP) (Figura 2) [33,54–56]. La porción

anterior llega hasta el borde posterior del quiasma óptico. El segmento medio puede

~ 7 ~

subdividirse en dorsal y ventral, se encuentra apoyado sobre el tallo pituitario separándolo

de la base del cerebro. Por su parte, el HP limita en su extremo caudal con el área tegmental

ventral del mesencéfalo y los cuerpos mamilares.

1.3.1. Hipotálamo anterior.

El HA está compuesto por varios núcleos, entre ellos el NSO, la sección anterior

del NPV, el núcleo anteroventral del tercer ventrículo (AV3V, o área de Brody) y el

área hipotalámica anterior (AHA) [57–59]. El área AV3V de Brody es una región

fundamental para la regulación central de la PA. Tiene como principal componente el

núcleo preóptico al que llegan proyecciones desde distintas regiones como el bulbo

olfatorio (BO, otra de las regiones del SNC que estudiaremos en este trabajo de tesis),

el núcleo del tracto solitario (NTS), los órganos circunventriculares, los núcleos

parabraquiales y catecolaminérgicos de la protuberancia, así como también desde el

bulbo raquídeo [57–61]. Se ha demostrado que la ablación de esta área en ratas

normotensas de la cepa Sprague-Dawley produce una HTA fulminante [33,60,62] y su

estimulación eléctrica reduce la PA tanto en animales normotensos como en modelos

animales de HTA como el SHR y el DOCA-sal (utilizado en el presente trabajo) [34,63–

69]. Por otro lado, el AHA posee proyecciones neuronales que alcanzan la zona medial

del diencéfalo la cual está involucrada en la regulación central de la PA tanto en

animales normotensos como hipertensos [70,71]. Allí, neuronas noradrenérgicas

actúan sobre receptores α-2-adrenérgicos que llevan a una reducción de la PA

[30,34,62,72–76].

La disminución de la actividad neuronal del HA atenúa la respuesta del

barorreflejo incrementando la PA [33,42,77]. Además, se demostró que lesiones en

este núcleo también aumentan la PA [14,33,62] y que el uso de fármacos hipotensores

estimulan la descarga noradrenérgica de esta región [34,68,69]. También se

comprobó que una dieta rica en sodio aplicada en ratas Dahl sensibles a la sal produce

una respuesta importante en distintas áreas del HA, llevando a un aumento de la PA.

Estas modificaciones no se observaron cuando estos animales consumieron una dieta

normal [78]. Todos estos trabajos sugieren fuertemente que el HA funciona como un

área simpatoinhibitoria y que la respuesta cardiovascular estaría fuertemente

condicionada por la activación o inhibición de los núcleos que la componen.

~ 8 ~

Figura 2. Representaciones gráficas del cerebro de rata. a. vista dorsal (imagen izquierda) y ventral (imagen derecha). b. vista lateral. En rojo se marcan los bulbos olfatorios, en azul el hipotálamo anterior y en verde el hipotálamo posterior. Modificado de The rat brain in stereotaxic coordinates, Paxinos & Watson, 2007 y de Rat brain anatomy pictures, 1996 [79,80].

1.3.2. Hipotálamo posterior.

El HP es una conocida región simpatoexcitatoria y presenta numerosas

proyecciones aferentes y eferentes provenientes de centros superiores e inferiores,

muchos de ellos implicados en la regulación central de la función cardiovascular

[33,34,81–84]. Las conexiones aferentes provienen desde la amígdala, el septum, el

hipocampo, la corteza orbital, el sistema límbico, el tálamo, el tronco encefálico, el BO

~ 9 ~

y desde el mismo HA (aunque probablemente estas proyecciones sean

bidireccionales) [33,34,79,81,82,84–90]. Por otro lado, las proyecciones eferentes

alcanzan la medula espinal, el cerebro anterior y la región cortical, inervando a su vez

otras regiones del hipotálamo, el tálamo, la amígdala y el septum.

Se observó que la activación del HP aumenta la descarga simpática y atenúa

el efecto bradicárdico del barorreflejo [57,88]. Además, lesiones en el HP reducen la

PA en modelos experimentales de hipertensión como el DOCA-sal y el SHR [33,91]. En

estos últimos, se observó una mayor liberación de noradrenalina (NA) y de acetilcolina

acompañada de la incapacidad del ácido gamma-aminobutírico (GABA) de inhibir

neuronas dopaminérgicas [33,69,91–93]. Este desbalance de neurotransmisores

podría contribuir al desarrollo y/o mantenimiento del estado hipertensivo [33,91]. A

diferencia del HA, estas evidencias indican que el HP funcionaría como un área

simpatoexcitatoria y que la respuesta cardiovascular también estaría condicionada

por la activación o inhibición de los núcleos que lo componen.

Lo descripto hasta aquí demuestra que el hipotálamo es una región fundamental en

la regulación de la función cardiovascular, ya que presenta una alta densidad de fibras

noradrenérgicas y regula la PA tanto en situaciones fisiológicas como fisiopatológicas

[33,34,47,67,86,94–96]. Un reciente trabajo demuestra una relación entre las dietas de alto

contenido de sodio en distintos tipos de HTA y la importancia de la activación de un área

hipotalámica como el NPV lo cual lleva a una mayor actividad vasomotora simpática y un

consecuente aumento de la PA [97]. En este sentido, se ha demostrado que el hipotálamo

es crucial en la modulación central de la descarga simpática ante la ingesta crónica de

elevadas cantidades de sal [98]. A nivel estructural, el hipotálamo juega un papel crítico en

la HTA. Esto se comprobó al trasplantar células hipotalámicas de animales hipertensos SHR

a animales normotensos que terminaron desarrollando esta patología [99]. Además, la clara

división anatómica y funcional entre el HA y el HP nos lleva a pensar que existe una relación

estrecha e interdependiente en la regulación de la función cardiovascular.

1.4. Los bulbos olfatorios.

El BO es la estructura encargada de procesar toda la información proveniente del

medio exterior mediante la olfacción. Se encuentra en el extremo anterior del telencéfalo y

está constituido por dos proyecciones (bulbos izquierdo y derecho) que representan

~ 10 ~

aproximadamente el 4% del cerebro de la rata (Figura 2) [100]. Cada bulbo posee una

compleja organización conformada por capas celulares concéntricas (Figura 3) [101–103].

Desde la capa exterior a la central encontramos: la capa del nervio olfativo (ONL, de su

nombre en inglés Olfactory Nerve Layer) seguida de la capa glomerular (GL, Glomerular

Layer), la capa plexiforme externa (EPL, External Plexiform Layer), la capa mitral (MCL, Mitral

Cell Layer), la capa plexiforme interna (IPL, Inner Plexiform Layer) y finalmente la capa

granulocítica (GCL, Granulocytic Cell Layer). A su vez, cada BO puede separarse en BO

principal (MOB, Main Olfactory Bulb) y BO accesorio (AOB, Accesory Olfactory Bulb) (Figura

3) [102,103]. El MOB recibe información relacionada con los aromas desde el epitelio

sensitivo olfatorio y envía proyecciones hacia las cortezas piriforme y prefrontal, el NTS, la

amígdala y el hipotálamo. En cambio, el AOB tiene como aferencia más importante el órgano

vomeronasal, relacionado con la detección de feromonas. Esta área envía sus proyecciones

a la amígdala, el NTS y núcleos olfatorios accesorios [104]. Toda la información proveniente

del epitelio olfativo que es proyectada hacia el MOB lo hace por medio del nervio olfatorio

que se encuentra recubierto por células gliales. Dentro del BO, los nervios pierden el

recubrimiento de células gliales y sus terminales glutamatérgicas descargan en los

glomérulos olfatorios de la GL donde se integra toda la información [102]. Allí la señal se

procesa a través de interneuronas periglomerulares GABAérgicas y dopaminérgicas entre

otras. Las proyecciones de las GCL llegan hasta esta zona y se proyectan a través del tracto

olfatorio por medio de las células mitrales y empenachadas [104].

El BO tiene numerosas conexiones con otras regiones del SNC y ello proporciona una

idea del amplio espectro de funciones biológicas en las cuales estaría involucrado [105]. Esta

región conecta con áreas del sistema límbico como la amígdala, el septum, las cortezas

piriforme y frontoorbital. También, interactúa con el área preóptica, la región ventromedial

e inclusive con el hipotálamo [105–111]. Es importante destacar que muchas de estas

regiones y áreas tienen una participación crucial en la regulación central de la función

cardiovascular modificando directamente la PA [110,112–115]. Este es el caso del NTS el

cual es considerado el sitio primario para la integración de aferencias viscerales como el

barorreflejo [116,117]. Un importante núcleo noradrenérgico como el LC inerva el BO desde

sus capas centrales disminuyendo la inervación hacia la periferia del mismo [118,119]. Esta

aferencia neuronal corresponde al 40% de la inervación extrínseca total y se ha comprobado

que resultan cruciales en la modulación de la olfacción y el aprendizaje olfativo [119].

~ 11 ~

Figura 3. Organización del bulbo olfatorio de rata. a. Corte longitudinal del bulbo olfatorio. Se observan algunas de las diferentes capas celulares que lo componen. G: capa glomerular; MC: células mitrales; AOB: bulbo olfatorio accesorio. Modificado de Elsaesser y col; 2007 [103]. b. Representación del corte coronal del bulbo olfatorio donde se muestran las distintas capas celulares concéntricas. Se marcan a: capa glomerular; b: capa granular externa; c: capa externa plexiforme; d: células mitrales; e: capa interna plexiforme; f: capa granular interna y g: capa granulocítica. Modificado de Heine, Galaburda y col; 1986 [101].

Las interconexiones del BO con diversas áreas del SNC implicadas en la regulación de

la función cardiovascular permite suponer que esta área podría jugar un papel importante

en la génesis, desarrollo y/o mantenimiento de la HTA. Existen muchos trabajos en animales

de experimentación que demuestran la existencia de una relación entre la olfacción, el

balance autonómico y la fisiología cardiovascular [120]. En este sentido, varias

investigaciones orientadas estudiar la depresión sugieren que esta región podría estar

relacionada con la patogénesis de enfermedades cardiovasculares como es el caso de la

HTA. Se observó que pacientes deprimidos presentan un desbalance en la regulación

autonómica que deriva en hipertensión, en aumento de la descarga simpática y de la FC,

dislipemia y también enfermedades coronarias [16,121–124]. Por otro lado, en 1937 Allen

y col. demostraron que la exposición de perros a diferentes estímulos olfatorios produce

alteraciones en la respiración y la PA [125]. Además, en las últimas décadas se observó que

ratas consientes expuestas a humo también presentan cambios en la PA, la FC y respiratoria;

acompañado de un aumento de la actividad del sistema nervioso simpático [108,126].

La integridad del BO es necesaria para que el SNC genere una respuesta

simpatoexcitatoria normal ante diversos estímulos fisiológicos [127,128]. La bulbectomía

bilateral es usada como un modelo experimental de depresión y demostró que incrementa

los niveles de NA y la monoamino oxidasa (MAO) en el tronco encefálico [105–107,109,129].

~ 12 ~

A su vez, la remoción del BO modula el comportamiento de neurotransmisores como la

serotonina, acetilcolina, glutamato, GABA y NA [105,109,129]. Además, este procedimiento

produce cambios endócrinos, en la termorregulación y comportamentales con una menor

respuesta sexual y una mayor actividad exploratoria e hiperactividad. También se

observaron cambios en la respuesta inmune y la función cardiovascular

[105,109,112,127,130,131]. Algunos autores postulan que, las variaciones producidas en

este último punto podrían deberse a las modificaciones en la función autonómica [16,132].

Posiblemente, todos estos antecedentes evidencian la existencia de una estrecha

relación entre el BO y la regulación de la función cardiovascular, sin embargo, los

mecanismos que subyacen a la misma son aún desconocidos.

1.5. El modelo DOCA-sal.

Los múltiples factores que llevan al desarrollo de HTA demandan diferentes

herramientas para poder estudiar los distintos aspectos de esta patología [133]. Existen

distintos modelos animales de HTA donde cada uno posee ventajas y desventajas según el

enfoque elegido para su estudio [134–136]. Estos modelos pueden ser clasificados de

manera general en genéticos o no genéticos.

Entre los modelos genéticos encontramos frecuentemente: las ratas SHR (de su

nombre en inglés: Spontaneously Hypertensive Rats) y las Dahl sensibles a la sal. Las ratas

SHR son de la cepa Wistar y desarrollan la enfermedad de manera espontánea [137]. Se

utilizan principalmente en el estudio de la HTA esencial [137–139] y en ellas aparecen

complicaciones derivadas del estado hipertensivo como hipertrofia, disfunción endotelial e

insuficiencia cardíaca [140–142]. Mientras que las ratas Dahl sensibles a la sal son útiles para

estudiar las implicancias de una dieta con alto contenido de sodio. En estos animales esta

dieta provoca un aumento en los niveles de NA en el hipotálamo y desarrollan HTA

[33,143,144]. Se observó además que la inyección intracerebroventricular (ICV) de NaCl en

estas ratas incrementa la PA y la descarga de NA hacia la periferia [145–147].

Por otra parte, los modelos no genéticos son generados mediante la realización de

una cirugía, como es el caso de las ratas Goldblatt 1 y Goldblatt 2, o bien por la exposición a

factores hormonales, nutricionales, vasoactivos y estresantes. Estos casos incluyen el

modelo DOCA-sal, ratas con dieta rica en fructosa que desarrollan síndrome metabólico, la

infusión crónica de angiotensina II (Ang-II) o la exposición a estímulos estresantes

[134,136,148]. El modelo Goldblatt I se caracteriza por la colocación de un clip en la arteria

~ 13 ~

del hilio renal, reduciendo el aporte sanguíneo en uno de los riñones mientras que se realiza

la nefrectomía del otro. El Goldblatt II se basa en la colocación del clip en uno de los riñones

sin intervenir en el remanente. Las características más importantes de este modelo son que

permiten estudiar los efectos de distintos grados de insuficiencia renal, y la dependencia del

SRA.

En el presente trabajo de tesis utilizamos el modelo DOCA-sal que se caracteriza por

una activación neuroendocrina, aumento de la actividad simpática y el desarrollo de

expansión de volumen que conducen a elevación de la presión sanguínea (Tabla 3) [53,149].

Este modelo presenta un SRA marcadamente deprimido a nivel periférico, con muy bajas

concentraciones circulantes de angiotensina [149]. Además, al desarrollar HTA

independientemente de algún componente genético, es útil para estudiar los mecanismos

neurales de regulación de la PA y los efectos derivados de la hipervolemia y la ingesta

elevada de sal [149]. Además, se ha demostrado que en este modelo las ETs juegan un papel

relevante en el aumento de la PA de manera crónica [53,149,150].

El modelo se realiza en ratas de la cepa Sprague-Dawley y consiste en la

administración subcutánea de acetato de 11-deoxicorticosterona (DOCA) junto con NaCl 1%

en el agua de bebida [107,150,151]. La concentración de NaCl puede variar levemente según

la bibliografía consultada y a veces se utilizan mezclas con KCl. La DOCA es un

mineralocorticoide análogo de la aldosterona y puede administrarse en forma de pellets o

dosis inyectables utilizando como vehículo aceite de sésamo, maíz o soja [152–159]. La

administración inyectable permite ajustar la dosis en relación con el peso, especialmente

cuando se trabaja con animales jóvenes. Cuando este modelo se combina con nefrectomía

unilateral se observa el desarrollo de hipertrofia cardíaca y renal, nefroesclerosis;

acompañado de un rápido desarrollo de HTA fulminante [160]. En cambio, el modelo sin

nefrectomía genera una HTA progresiva que va de leve a moderada dentro de las primeras

5 semanas de tratamiento. También produce un aumento del gasto cardíaco, hipertrofia del

ventrículo izquierdo, disfunción endotelial, glomeruloesclerosis y una marcada poliuria

(Tabla 3) [107,149,150,161–163].

Si bien no se conoce en detalle los mecanismos involucrados en el desarrollo de HTA

en este modelo, los factores que contribuyen a esta patología pueden dividirse en no

neurales y neurales [53,161–166]. Por un lado, los componentes no neurales actúan tanto a

nivel central como periférico e incluyen la participación del sistema vasopresinérgico, los

péptidos natriuréticos y las ETs, que regulan la actividad cardiovascular y están ampliamente

~ 14 ~

distribuidos en el cuerpo, incluyendo el SNC [33,53]. En este sentido, se ha observado un

aumento de los niveles periféricos circulantes de ETs, en particular de la isoforma 1 (ET-1) y

de la actividad de sus receptores (ETA y ETB) [33,150,152,167–169]. El receptor ETB a nivel

renal responde de manera anormal afectando la regulación del metabolismo hidrosalino. La

administración periférica de antagonistas del receptor ETA fue evaluada de diversas

maneras. La administración oral incrementó los niveles de ET-1 plasmática y redujo la PA

media (PAM) tanto en controles normotensos como en los animales DOCA-sal [170]. Un

efecto similar sobre la PA se observó en los animales hipertensos al administrarse de forma

intravenosa [152]. Por su parte, la administración central de ETs en el área gris

periacueductal redujo la PA y la FC de estos animales [171]. Asimismo, la administración ICV

de bloqueantes del receptor de aldosterona, así como también algunos diuréticos lograron

reducir la PA [172].

EFECTOS DEL TRATAMIENTO DOCA-sal

Componentes Efectos

Neural/Neurohormonal

Aumento de la actividad simpática

Aumento de la liberación de vasopresina

Aumento de la expresión del receptor AT1R

Disminución de la expresión del receptor AT2R

Disminución de la expresión de la ACE2

Cardiovascular

Aumento de la hipertrofia del ventrículo izquierdo

Aumento del diámetro de los miocitos

Aumento del gasto cardíaco

Aumento de la fracción de eyección

Aumento de la resistencia periférica

Alteraciones en el barorreflejo

Renal

Aumento de la retención de sodio

Aumento de la retención de agua

Aumento de la liberación de aldosterona

Desarrollo de hipertrofia renal

Inmune

Aumento de la infiltración de células T

Aumento de IFN-γ

Aumento de IL-17

Aumento de TNF-α

Tabla 3. Efectos del tratamiento DOCA-sal. Se detallan los componentes afectados por el tratamiento DOCA-sal en las distintas partes del cuerpo. Adaptado de Basting y col; 2017[149].

A nivel periférico se observó que la VP también estaría involucrada tanto en el

desarrollo como en el mantenimiento de la HTA de este modelo (Tabla 3) [165]. Se encontró

una mayor descarga de esta neurohormona a nivel plasmático acompañada con un

incremento de sus sitios de unión en el lecho mesentérico de animales DOCA-sal [173].

Además, es importante destacar que los bloqueantes de Ang-II no reducen la PA en este

~ 15 ~

modelo [174] por lo cual se lo considera independiente del SRA al menos a nivel periférico.

Por el contrario, algunos trabajos indican que en este modelo los sitios de unión al receptor

de Ang-II están aumentados en la corteza cerebral, el NPV y en el área postrema, sugiriendo

una mayor actividad a nivel central del SRA [175,176].

Varios trabajos demuestran que la DOCA actuaría aumentando la sensibilidad del SNC

al sodio, potenciando el apetito por la sal [149,177–180]. Esto facilitaría el aumento de la

PA debido a la ingesta en exceso de dicho ion. El modelo DOCA-sal sería dependiente de

este factor desde el inicio del tratamiento. Así, se vio que la administración central de

bloqueantes de canales de sodio reduce la PA [181]. Además, se encontraron niveles de

osmolaridad elevados tanto en sus fluidos corporales como en el líquido cefalorraquídeo

(LCR) acompañado de altos niveles plasmáticos sodio [157,158]. La detección de este ion en

el SNC se realiza a nivel de los órganos circunventriculares, principalmente en el órgano

subfornical (SFO, de su nombre en inglés: Subfornical organ). Allí, se expresa un canal sodio-

específico y altamente regulado en células ependimarias y astrocitos [182]. Altos niveles del

ion activan la apertura del canal y mediante un complejo mecanismo, neuronas GABAérgicas

inhibirían el accionar de otras neuronas implicadas en la regulación de la ingesta de sodio.

En este sentido, se demostró que la producción local de la isoforma 3 de las ETs (ET-3), en

el SFO modula la sensibilidad del canal por el ion [182]. En coincidencia, se observó que el

bloqueo central de los canales epiteliales de sodio, ENaC (de su nombre en inglés: Epithelial

Na+ channel), produce una disminución de la PA en animales DOCA-sal y disminuye la

expresión de cFOS (factor de transcripción aumentado en los animales DOCA-sal) en el NPV

sin afectar otros centros simpáticos inferiores [183]. Todo esto indica que la modulación

neuroendocrina del NPV también sería fundamental en el modelo DOCA-sal [183]. A nivel

periférico, la retención de sodio se ve facilitada dado un aumento en el tono simpático renal

de las ratas DOCA-sal lo cual parece ser un factor muy importante en el desarrollo y

mantenimiento de la HTA de este modelo [184].

Por otro lado, existen los mecanismos neurales (Tabla 3). Estos actúan principalmente

provocando un aumento de la descarga simpática [184]. El sistema catecolaminérgico esta

alterado en el desarrollo de la HTA de este modelo [75,184]. Por ejemplo, a nivel periférico

la cantidad de vesículas catecolaminérgicas, la duración de la secreción de las mismas y la

cantidad de catecolaminas secretadas ante un estímulo es mucho mayor en las ratas DOCA-

sal que en las normotensas [185]. A nivel SNC, se demostró que la ablación del área

postrema o del área AV3V de Brody impide la elevación de la PA y disminuye los niveles de

~ 16 ~

NA en el tronco cerebral de las ratas DOCA-sal [53,72,186,187]. Además, se comprobó que

la estimulación del LC en este modelo lleva a incrementos aún mayores de la PA [93].

También se observó que la estimulación del hipotálamo aumenta la descarga simpática y la

respuesta presora sobre los vasos en mayor proporción en los animales DOCA-sal que en las

ratas normotensas [188]. Consecuentemente, se ha demostrado que el recambio de NA en

el tallo cerebral es menor mientras que, en el corazón, en otros tejidos y en los niveles

plasmáticos este recambio está incrementado. Paralelamente, se vio que la disminución de

la actividad de neuronas catecolaminérgicas en el HA resulta esencial para la sensibilidad a

la sal en este modelo de HTA [189]. Estos resultados sugieren que la menor actividad de vías

centrales inhibitorias o el aumento de la actividad de vías excitatorias noradrenérgicas

podrían llevar a una descarga simpática aumentada [33,68,150,184,190].

Aunque el modelo DOCA-sal se ha estudiado ampliamente a nivel periférico, los

mecanismos centrales subyacentes en su génesis, desarrollo y mantenimiento aún no han

sido completamente dilucidados [154,155,191,192]. No se conoce con exactitud cuál es el

papel a nivel SNC de los sistemas endotelinérgico y catecolaminérgico en este sentido. Sin

embargo, estos trabajos demuestran la existencia de una fuerte relación entre el consumo

de sal, el sistema endotelinérgico, la actividad catecolaminérgica y la regulación de la PA en

este modelo de hipertensión.

1.6. El sistema catecolaminérgico.

Las catecolaminas son compuestos orgánicos formados por un núcleo catecol y un

grupo amino cuya principal función es la de actuar como neurotransmisores. Entre ellas, las

más importantes en términos fisiológicos son la dopamina, NA y adrenalina [193]. Los

niveles de catecolaminas y sus funciones biológicas están reguladas por los distintos pasos

de la neurotransmisión. Estos pasos incluyen la síntesis, el empaquetamiento en vesículas,

el transporte, la liberación desde células cromafines y neuronas, las características de sus

receptores, la recaptación por parte de las células secretoras y adyacentes, así como

también su degradación [194]. Los detalles de la síntesis de catecolaminas pueden

observarse en la figura 4 [195].

~ 17 ~

Figura 4. Biosíntesis de catecolaminas. En color verde muestran las enzimas involucradas en la síntesis de catecolaminas, con especial énfasis en la tirosina hidroxilasa (TH). En azul y rosa se muestran los átomos de oxígeno involucrados en los pasos de hidroxilación, en rojo se marca la molécula de CO2 liberada por descarboxilación y en lila la transferencia del grupo metilo. Modificado de Tekin y col; 2014 [195].

~ 18 ~

1.6.1. Regulación de la tirosina hidroxilasa.

La tirosina hidroxilasa (TH) regula el paso limitante en la biosíntesis de las

catecolaminas convirtiendo la L-tirosina en L-DOPA [196,197] (figura 4). Esta enzima es

considerada un marcador específico de neuronas catecolaminérgicas y está presente en el

SNC (incluyendo el hipotálamo y el BO), la médula adrenal y en tejidos inervados por el

sistema nervioso simpático [194,196,198–201].

La TH pertenece a la familia de enzimas hidroxilasas de aminoácidos dependientes de

biopterina y hierro [202,203]. Estructuralmente es un tetrámero, donde cada subunidad

posee un dominio N-terminal regulatorio y un dominio C-terminal catalítico con un peso

molecular entre 50-60 Kda (Figura 5.a-c) [196,198]. Para desempeñar en óptimas

condiciones su actividad la TH requiere de varios cofactores entre los que se encuentran la

tetrahidrobiopterina, el oxígeno y el hierro [196,198,199,203]. La regulación de la TH es muy

compleja, sus niveles de expresión y actividad dependen de mecanismos que actúan a corto

y a largo plazo (Figura 5) [194–199,204,205].

✓ Regulación de la tirosina hidroxilasa a corto plazo: Estos mecanismos incluyen la

inhibición por retroalimentación (negative feedback), la regulación alostérica y

principalmente el equilibrio entre las distintas formas fosforiladas y desfosforiladas

de la enzima [194,198,199,206].

La inhibición por retroalimentación ocurre ante un aumento del producto final

principalmente por dopamina y NA. Las catecolaminas forman un complejo con la

TH-Fe3+ disminuyendo su actividad, pero a su vez le otorgan una mayor estabilidad

[198,199,203]. Por otro lado, existe un equilibrio entre el estado de fosforilación y

desfosforilación de la enzima que determina su nivel de actividad (Figura 5.d). Este

equilibrio depende de distintas fosfatasas y quinasas que responden a una amplia

variedad de estímulos fisiológicos. Las fosforilaciones o desfosforilaciones que más

influyen sobre la actividad y estabilidad de la TH ocurren en diferentes aminoácidos

serina ubicados en el dominio regulatorio. Estos sitios son las serinas situadas en la

posición 8, 19, 31 y 40 (Figura 5.e) [194,198,199,202,207]. La serina 8 es fosforilada

por el complejo p34cdc2 y p58 cyclin-A (dc2/cyclin-A) principalmente involucrado

en la regulación de la división celular. Hasta el momento no se conoce si la

fosforilación en este sitio repercute sobre la actividad o estabilidad de la TH. La

serina 19 es fosforilada principalmente por la CaMKll y por la MAPK. Si bien esta

~ 19 ~

fosforilación no activa directamente la TH, en presencia de la chaperona 14-3-3

induce un cambio conformacional en la enzima que la hace más susceptible a la

fosforilación en la serina 40 [199]. Por su parte, la activación de la vía PKC permite

que la MAPK pueda fosforilar la serina 31. Este evento produce un aumento

moderado de la actividad de la TH [208]. Por último, la serina 40 es el sitio más

promiscuo y produce un significativo aumento de la actividad enzimática. Las

quinasas que actúan fosforilando la TH en la serina 40 son primordialmente la PKA,

PKC, PKG y la CaMKII [195,198,199,202,207,209,210]. Si bien la fosforilación es

considerada un mecanismo de regulación enzimática a corto plazo también

interviene en la modulación de la activación y estabilidad de las TH sintetizadas de

novo como consecuencia de procesos regulatorios a largo plazo [194,198,199,211–

216]. Por otro lado, en cuanto a la desfosforilación de la TH, la PP2A y la PP2C son

las dos principales fosfatasas involucradas (Figura 5.d) [199,217,218]. La PP2A

interviene en la desfosforilación de las serinas 19 y 31 solo cuando la TH está en

bajas cantidades o cuando su fosforilación en la serina 40 es reducida [219]. En

cambio, a altas concentraciones de TH prevalece la desfosforilación por parte de la

PP2C [198,199]. Además, la velocidad de desfosforilación de la serina 40 por parte

de la PP2A disminuye cuando la serina 19 se encuentra fosforilada [199].

✓ Regulación de la tirosina hidroxilasa a largo plazo: En término de horas o días la

regulación de la TH está modulada por distintos mecanismos. Estos involucran la

síntesis y estabilidad de su ARNm, fenómenos de splicing alternativo, regulación de

la traducción y la estabilidad de la enzima. En este sentido, diversos trabajos

muestran que la administración de glucocorticoides, nicotina o el stress por

inmovilización pueden producir modificaciones de los niveles del ARNm de la TH

[220–225]. Si bien altos niveles del ARNm de la TH no siempre implican una mayor

expresión y/o actividad de esta enzima, frente a diversos estímulos esta modulación

diferencial del gen de TH bien podría conducir a cambios en el comportamiento

postraduccional [194,198,199]. La región 5’ del gen de TH contiene diversas

secuencias homólogas a elementos regulatorios altamente conservados en rata,

ratón, bovino y humano. Estos elementos incluyen: AP1, octamer, Sp1 y CRE entre

otros [226–228]. Los factores de transcripción más relevantes en la modulación de

~ 20 ~

la síntesis del ARNm de la TH son CREB (de su nombre en inglés cAMP response

element-binding), c-Fos y c-Jun [196,198,205,229–232].

Figura 5. Estructura y regulación de la tirosina hidroxilasa. a. Estructura lineal del monómero de la tirosina hidroxilasa detallando el dominio regulatorio en el amino-terminal, el dominio catalítico y el dominio de tetramerización (TIZ) en el carboxi-terminal. b. Representación gráfica tridimensional de la estructura cuaternaria de la TH. c. Representación gráfica tridimensional del monómero de la TH remarcando los diferentes dominios. El sitio activo contiene el Hierro y los aminoácidos His331, His336, y Glu376, que lo coordinan. d. Regulación de la tirosina hidroxilasa por quinasas y fosfatasas, se detallan los estímulos y los efectos sobre la enzima. e. Secuencia aminoacídica del domino regulatorio de la tirosina hidroxilasa de rata (rTH) y las variantes humanas (hTH1, hTH2, hTH3 y hTH4), en color se remarcan los sitios serina susceptibles de ser fosforilados. Modificado de Tekin y col; 2014 [195].

~ 21 ~

Se demostró que la activación de las vías PKA, PKC y el uso de agentes que movilizan

calcio inducen la expresión del gen, involucrando el accionar de estos factores de

transcripción [194,196,198,199,205,229–232]. En este sentido, la administración de

cocaína conduce a un aumento en los niveles del ARNm y la actividad de la TH

estimulando factores de transcripción que se unen a sitios AP-1 y CRE [227]. Por otra

parte, se sabe que sustancias que modulan la función catecolaminérgica a diferentes

niveles, alteran la expresión del mensajero y/o la actividad de la enzima

[194,198,199].

1.6.2. Efectos sobre la regulación de la presión arterial.

El sistema catecolaminérgico central juega un papel fundamental en la regulación de

la fisiología cardiovascular y en los puntos anteriores hemos comentado que la HTA altera

su funcionamiento [20,31–33]. Se observó que las dietas altas en sodio modifican el

comportamiento de las catecolaminas centrales incrementando la PA [14,16,28,177–

180,233]. También, alteraciones en el sistema catecolaminérgico central llevan a

modificaciones en la descarga simpática que contribuyen al desarrollo de hipertensión y

falla cardíaca, no solo en humanos sino que también en distintos modelos animales de

experimentación [14,32,33,46,234–240]. En este sentido, advertimos que el daño al sistema

catecolaminérgico en ciertos puntos del SNC atenúa esta patología. Además, se demostró

que sustancias que disminuyen la PA modulan el funcionamiento de neuronas

noradrenérgicas a nivel central. Asimismo, distintas situaciones patológicas, que incluyen la

HTA, alteran la función catecolaminérgica modificando la expresión del ARNm y/o la

actividad de la TH [195–199,204–206,241]. Sin embargo, a pesar de los numerosos estudios

realizados, el papel del sistema catecolaminérgico central en la regulación crónica de la PA

y su implicancia en la HTA aún es poco claro.

1.7. El sistema endotelinérgico.

1.7.1. Las endotelinas.

Las ETs son las sustancias vasoconstrictoras más potentes conocidas, componen una

familia de isopéptidos de 21 aminoácidos y en su estado maduro se las clasifica en ET-1, ET-

2 y ET-3 (Figuras 6 y 7) [242,243]. Cada variante proviene de un gen diferente, y son producto

de una serie de procesamientos enzimáticos desde su estado inicial como pre-pro-

~ 22 ~

endotelina hasta su estado maduro luego de ser modificadas por la enzima convertidora de

endotelinas (ECE) (Figura 6) [244,245]. Las ETs están distribuidas a lo largo de todo el

organismo, incluyendo el SNC [113,244–246]. La ET-1 es considerada la de mayor respuesta

vasoconstrictora y fue identificada periféricamente en células endoteliales, cardiomiocitos,

células musculares vasculares de la aorta, células epiteliales y mesangiales renales, células

de Sertoli, entre otras. Además, en el SNC está presente en terminales neurosecretoras de

la neurohipófisis, en somas de neuronas y astrocitos de áreas como el hipotálamo y el BO

entre otras [113,169,242,244,247–252]. La ET-2 se encuentra principalmente en el

endotelio vascular y en otros tejidos como el riñón, intestino, miocardio, placenta y útero

[248,250]. Por su parte, la ET-3 a nivel periférico se encuentra en el epitelio pulmonar,

intestinal y renal entre otros tejidos, mientras que actúa regulando la proliferación y

desarrollo de neuronas y astrocitos en diferentes áreas del SNC [169,248–251].

Figura 6. Biosíntesis de endotelinas. Se detallan los distintos pasos de la síntesis de endotelinas tomando como ejemplo la ET-1. Modificado de Kohan y col; 2011 [244].

~ 23 ~

1.7.2. Los receptores de las endotelinas.

Las ETs median sus acciones biológicas a través de dos tipos de receptores, ETA y ETB

(Figura 7). Estos receptores se expresan en la membrana plasmática de diferentes tipos

celulares y pertenecen a la familia de receptores acoplados a la proteína G (GPCRs, de su

nombre en inglés G-protein coupled receptors) [113,244,245,247,250,252–255]. Las

distintas ETs difieren en la afinidad por el receptor ETA. Por un lado, la ET-1 es la que

presenta mayor afinidad por el receptor ETA, seguida de la ET-2 y luego la ET-3 (Figura 7).

Por otro lado, no se encontraron diferencias de afinidad entre las ETs respecto del receptor

ETB (Figura 7) [113,244,247,250,252,256,257]. Asimismo, las afinidades de ETA y ETB por ET-

1 son muy similares. Cabe destacar que existe un tercer tipo de receptor denominado ETC

descubierto en Xenopus laevis que tendría homología estructural con ETA y ETB [258]. Sin

embargo, aún no se ha demostrado su presencia en mamíferos. Por otra parte, diversos

autores sustentan la existencia de otros receptores de ETs denominados atípicos o no

convencionales (ETAX y ETBX). Esta idea surge de la observación de respuestas fisiológicas y

farmacológicas atípicas frente a los agonistas y antagonistas que definen a los clásicos

receptores [211,212,247,250,253,259–266]. Una explicación alternativa plantea que los

clásicos receptores ETA y ETB podrían formar homo o heterodímeros [267,268]. Además,

teniendo en cuenta que el ARNm del receptor ETA puede ser procesado mediante splicing

alternativo [245,269], existe la posibilidad de que estas variantes también puedan ser parte

de las combinaciones heterodiméricas.

Existen diversos agonistas y antagonistas útiles para identificar ambos receptores de

ETs con importantes funciones farmacológicas en distintas enfermedades, entre ellas la HTA

(Figura 7) [270–277]. Entre los antagonistas específicos para el receptor ETA se encuentran:

BQ-610, BQ-123, FR139317, PD156707. Sin embargo, no existe hasta el momento un

agonista selectivo para ETA. Por otro lado, el antagonista principal para el receptor ETB es

BQ-788. Mientras que la lista de agonistas para este receptor está compuesta por: IRL-1620,

Sarafotoxina 6c (S6c) y BQ-3020 [245,253,278].

Los receptores de las ETs se expresan en una gran variedad de tejidos, entre ellos se

encuentran el musculo liso vascular, cardiomiocitos, fibroblastos y neuronas [279,280]. La

activación estos receptores desencadena múltiples cascadas de señalización intracelular

proporcionando un amplio abanico de efectos biológicos. Estos efectos se dan

principalmente a nivel de la fisiología endócrina y neuroendocrina, la regulación del

~ 24 ~

crecimiento y proliferación celular, la regulación de la excreción de electrolitos y la fisiología

cardiovascular y renal [113,244,245,247,252,256,281,282].

Figura 7. Las endotelinas y sus receptores. Esquema de las endotelinas (ET-1, ET-2 y ET-3) y sus afinidades relativas por el receptor ETA (flechas azules) y ETB (flechas verdes). En la parte inferior se detallan los distintos agonistas (en rojo) y antagonistas (en azul) de los receptores de endotelinas. Modificado de Kohan y col; 2011 y Davenport y col; 2016 [244,245].

Las vías de señalización activadas por las ETs son muy complejas y muchas veces

interconectadas. Los mecanismos activados dependerán del tipo receptor (ETA o ETB), de la

proteína G que se estimule (Gs, Gq, Go, Gi), del tipo celular, tejido y de los niveles de ETs

circulante [113,253,280,283–285]. La variedad de vías que activan los receptores de ETs y

sus múltiples efectos sustentan su clasificación como receptores promiscuos. Entre los

diferentes mecanismos encontramos: la fosfolipasa C (PLC) que lleva a la activación de la

CAMK y la CAMKII; la vía PKC; la vía de la adenilato ciclasa (AC) que activa la PKA y en

~ 25 ~

particular, el receptor ETB activa la vía de GMPc y de la óxido nítrico sintasa (NOS)

[69,113,211,247,282–284,286–303].

1.7.3. Endotelinas centrales, el sistema catecolaminérgico y la

fisiología cardiovascular.

Las ETs y sus receptores se expresan en regiones y áreas del SNC relacionadas con la

regulación de la actividad simpática, el control de la fisiología cardiovascular y el balance

hidrosalino [113,244,304–306]. Se demostró la presencia del sistema endotelinérgico en

estructuras como: el NPV, el bulbo raquídeo, el núcleo supraóptico, núcleos hipotalámicos

ventromediales, el HA, el HP y en el BO [113,128,265,305]. Es importante resaltar que todas

estas regiones presentan a su vez un importante número de neuronas y terminales

catecolaminérgicas [113]. Además, en el BO no sólo se ha demostrado la presencia de ETs

sino también de sus receptores y otros péptidos reguladores como las angiotensinas y los

péptidos natriuréticos, sin embargo, no se conoce aún el papel que todos ellos ejercen es

esa región [128,129,131,307]. Trabajos realizados en nuestro laboratorio demostraron que

a nivel del SNC las ETs producen cambios en los diferentes pasos de la transmisión

catecolaminérgica, avalando su posible papel como neuropéptidos moduladores

[113,161,162,211,212,259–261,266,286,287,308]. En este sentido, se demostró que las ETs

se encuentran en mayor concentración en el LCR que en el plasma y en la corteza estimulan

la liberación de catecolaminas [33,68,123]. Además, la administración de ETs a nivel central

produce un marcado incremento de la PA, y aumenta los niveles plasmáticos de

catecolaminas y VP [113,304,309–316]. Asimismo, la inyección tanto ICV como la

administración tópica de ETs induce cambios en el patrón cardiorrespiratorio, acompañado

de alteraciones en la actividad de neuronas vasomotoras y respiratorias [113]. Nuestro

grupo demostró que las ETs modulan la liberación de NA en el HA a través de la activación

del receptor ETB y la vía del ON [282,286], y que también producen cambios en el HP [286].

Otras publicaciones muestran que la administración de ET-1 en el ventrículo lateral del

cerebro o en el área postrema produce una importante respuesta vasopresora

[113,281,317,318]. Por otra parte, la inyección de ET-3 en el tercer ventrículo del cerebro

induce una respuesta inhibitoria en la ingesta de agua en ratas sometidas a estímulos

exógenos o endógenos, sugiriendo un posible papel de las ETs en la regulación del balance

hidrosalino [319]. Incluso, se observó un aumento de la actividad simpática producido por

las ETs administradas centralmente. Este efecto se revierte al realizar un bloqueo a nivel

~ 26 ~

ganglionar pero no así por el uso de antagonistas de la Ang-II y la VP [113]. Diversos autores

proponen que las ETs modulan a largo plazo el tono vascular tanto en condiciones

fisiológicas como fisiopatológicas [169,281,294,320]. Además, todas estas publicaciones

sugieren que las ETs administradas centralmente mediarían sus efectos sobre la

vasoconstricción y la PA a través de un aumento de la actividad simpática [33,113,128,304].

Muchos trabajos avalan la idea de que en patologías como la HTA (y en otras no

vasculares también) el sistema endotelinérgico podría estar alterado [33,244,245,257]. A

nivel periférico, la activación del receptor ETA produce vasoconstricción y se ha demostrado

mediante su inhibición que está implicado en la generación de HTA experimental en

diferentes modelos animales [154,168,244,321]. Por otro lado, estudios de nuestro

laboratorio muestran que ambas ETs aumentan la actividad de la isoforma neuronal de la

NOS (nNOS), a través de la activación del receptor ETB en el HA de ratas [282].

Periféricamente, el receptor ETB presenta un rol dual sobre la regulación del tono vascular,

por un lado actúa a nivel endotelial incrementando la producción de ON y prostaglandinas

que son las responsables de su efecto vasodilatador, y por otro produce vasoconstricción

actuando directamente sobre la musculatura vascular lisa [244,247]. Sin embargo, a pesar

de todo lo expuesto, aún no se conocen los mecanismos por los cuales el sistema

endotelinérgico central actuaría en la regulación de la función cardiovascular, tanto en

estados normales como patológicos [113,161,162,211,212,259–261,266,286,287,308].

1.8. Asimetrías funcionales.

Se han realizado muchos estudios con el objetivo de comprender la importancia de

las asimetrías anatómicas y funcionales en el sistema nervioso. Estas desigualdades están

presentes en todos los animales y cada vez es más habitual encontrar que un hemisferio del

cerebro presenta un papel preponderante para ciertas funciones fisiológicas, mientras que

el otro hemisferio lo tiene para otras.

Se observó que frecuentemente estas asimetrías bilaterales están involucradas en la

modulación neuroendocrina y la transmisión neuronal [322–324]. Se reportaron

desigualdades en importantes áreas del cerebro de rata y de ratón como el hipocampo, la

corteza, el hipotálamo y el BO [101,322,325–329]. En este sentido, los receptores de

mineralocorticoides en el hipocampo de ratón presentan una distribución donde la

hemiporción derecha es la predominante [322]. Una tendencia similar se ha descripto

respecto de los niveles de NA en el hipotálamo de distintos animales [330]. En relación a la

~ 27 ~

HTA, varios trabajos muestran que la región derecha del cerebro está más relacionada con

el control de la función cardiovascular que la izquierda [323,331]. Se demostró la existencia

de una vía descendente asimétrica en el hipotálamo dorsomedial relacionada con la

regulación cardiovascular. Allí se observó que la activación de la porción derecha causaba

una taquicardia mayor en comparación con la izquierda [323]. Además, los autores

encontraron que cada hemiporción hipotalámica modulaba de manera diferencial la PA, la

FC y la actividad simpática renal [323]. Asimismo, se vio que pacientes con HTA esencial

muestran una mayor liberación de NA en la vena yugular derecha que en la izquierda y que

la estimulación del nodo sinoatrial derecho, comparado con el izquierdo, produce un mayor

aumento de la FC [332–334]. Por su parte, Heine y col. encontraron una asimetría anatómica

entre las dos hemiporciones del BO siendo la derecha más grande que la izquierda [101].

Estos hallazgos se repiten para otros mamíferos en otras áreas, en las cuales la región

derecha es más grande que su contraparte izquierda [325]. Nuestro laboratorio fue el

primero en reportar un comportamiento asimétrico entre las hemiporciones derecha e

izquierda tanto en el HA como en el BO de ratas DOCA-sal [161].

Por otro lado, también se observaron respuestas simpáticas asimétricas en la corteza

insular de ratas Sprague-Dawley y monos Macaca fascicularis, hallándose que la porción

derecha evoca una respuesta mayor que la izquierda [67,331,335]. Este estudio apoya la

idea de que la regulación de la PA y la FC poseen una dependencia mayor del lóbulo derecho

del cerebro donde se encuentran neuronas implicadas en el control del barorreflejo

[330,331,335]. Otro trabajo demostró que la inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos

produce una mayor simpatoexcitación debido a la liberación de NA en la rama derecha del

sistema nervioso simpático [336]. Algunos estudios sugieren que en todas las formas de HTA

la NA es mayor en áreas derechas del cerebro, apoyando la idea de que el control central de

la función cardiovascular es asimétrico. Estos antecedentes reportan una amplia variedad

de casos de asimetrías funcionales y anatómicas en el cerebro, incluyendo áreas como el

hipotálamo y el BO. Muchas de estas asimetrías están relacionadas con la actividad

catecolaminérgica y la fisiología cardiovascular, sin embargo, su relevancia fisiológica aún es

desconocida.

1.9. Antecedentes de nuestro laboratorio.

Nuestro laboratorio estudia los efectos de las ETs sobre el sistema catecolaminérgico

central y sus consecuencias sobre el sistema cardiovascular en situaciones fisiológicas y

~ 28 ~

patológicas como la HTA. Inicialmente hemos investigado el papel de las ETs a corto y

mediano plazo en la modulación del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo y el BO de

animales normotensos de la cepa Sprague-Dawley. Luego, analizamos la importancia de

estos sistemas en un modelo de HTA como el DOCA-sal. En los últimos años, decidimos

indagar sobre los efectos de la modulación aguda de los receptores de las ETs sobre el

sistema catecolaminérgico central y sobre parámetros hemodinámicos como la PA tanto de

animales normotensos como DOCA-sal. A continuación, se describen los principales

hallazgos logrados por nuestro grupo de investigación:

1.9.1. Modulación del sistema catecolaminérgico por endotelinas

en el hipotálamo.

✓ El hipotálamo en animales normotensos: A través del trabajo de di Nunzio y col.

en 2002, hemos observado que en el HA de animales normotensos la administración

ex-vivo (tejido aislado) de ET-1 y ET-3 disminuye la liberación de NA a través de un

mecanismo que involucra la participación del receptor ETB [286]. Estos resultados

mostraron la activación de la cascada de señales que involucra la vía ON-GMPc-PKG

y el receptor GABA-A. Además, fruto del trabajo de Morgazo y col. en 2005 y

Perfume y col. en 2008, vimos que, a través del mecanismo mencionado

anteriormente, las ETs reducen la actividad a corto plazo de la TH, disminuyendo en

el mediano plazo también su expresión y fosforilación [211,287]. En el trabajo

publicado por Hope y col., demostramos que la administración de ET-1 reduce la

captación de NA por disminución en la actividad su transportador neuronal (NET, de

su nombre en inglés: norepinephrine transporter) de manera dependiente de la

concentración, mientras que ET-3 produce el efecto contrario [308]. Esto muestra

que existe una modulación endotelinérgica de la captación de NA a través del NET

que depende del tipo de ET que actúe. Los resultados sugieren que las ETs, mediante

una menor activación de la TH, disminuyen la producción y liberación de

catecolaminas en el HA. Esto podría proporcionar una menor respuesta

simpatoinhibitoria sobre otras regiones moduladas por esta área [211,259,287].

En el HP encontramos que la ET-1 y la ET-3 incrementan la liberación de NA en el

corto plazo [266]. Las ETs también disminuyeron la recaptación de esta amina de

manera dependiente de la concentración aplicada [261,308]. Además, vimos que

ambas ETs incrementan todas las variantes fosforiladas de la TH. En este caso se

~ 29 ~

observó la implicancia de la vía ON-GMPc-PKG, así como también la CaMKII

[259,287]. Por otra parte, a largo plazo las ETs aumentaron la transcripción del

ARNm de la TH, así como también su expresión proteica, fosforilación y actividad

enzimática. Esto requirió de la activación de AC y la CaMKII [211]. Los resultados

sugieren que las ETs, mediante una mayor activación de la TH, incrementa la

producción y liberación de catecolaminas en el HP. Esto induciría una mayor

respuesta simpatoexcitatoria sobre otras regiones moduladas por esta área.

✓ El hipotálamo en animales DOCA-sal: Abramoff y col. realizaron experimentos ex-

vivo, en el hipotálamo y el BO de ratas DOCA-sal [161,162]. Se observó que la

expresión, fosforilación y actividad de la TH estaba disminuida en el HA de estos

animales hipertensos al ser comparado con animales normotensos (Abramoff et al.,

resultados no publicados). Además, se encontró una disminución de la descarga

noradrenérgica acompañada de un aumento en la captación de dicho

neurotransmisor. Estos resultados muestran una menor actividad catecolaminérgica

en esta región simpatoinhibitoria en el modelo DOCA-sal. Por el contrario, la

estimulación a corto plazo del HA con ETs produjo un aumento de la expresión y

actividad de la TH. Sin embargo, esto fue acompañado por una disminución en la

liberación de NA y de la actividad su transportador. Esto parece indicar que el

estímulo endotelinérgico lleva a la acumulación de NA en los terminales

noradrenérgicos del HA sin influir en su liberación. Cabe recordar que, a su vez, el

aumento en la concentración de catecolaminas puede producir la inhibición de la TH

por producto final.

Por otra parte, el HP de los animales DOCA-sal mostró una mayor expresión,

fosforilación y actividad de la TH. También se observó un incremento de la liberación

de NA y en los niveles y actividad del NET [162]. La incubación del HP con ETs mostró

un aumento en la fosforilación de las serinas 31 y 40 de la TH y un consecuente

incremento de su actividad enzimática. Esto fue seguido de una mayor liberación de

NA y expresión del NET que condujo a una mayor recaptación [162]. Así, los

resultados sugieren que en el corto plazo, el estímulo endotelinérgico exacerbaría

aún más la descarga noradrenérgica de esta región simpatoexcitatoria en las ratas

DOCA-sal [162].

Resultados más recientes, correspondientes al trabajo de la Dra. Guil ([337], Tesis

Doctoral, 2017; Guil et al., en proceso), muestran que en animales DOCA-sal la

~ 30 ~

administración ICV, aguda (1 hora), de un antagonista ETA o un agonista ETB

disminuyen la actividad de la TH en el HP, teniendo como consecuencia una

disminución de la PA. También se observó que en esta área hay una mayor expresión

del receptor ETA respecto del ETB, sugiriendo que la respuesta observada sería

primordialmente a través del primero. Además, se encontró que estos receptores

colocalizan con neuronas catecolaminérgicas a nivel de área hipotalámica posterior.

Esto permite sugerir que, si la modulación del sistema endotelinérgico lleva a un

aumento en la actividad catecolaminérgica y a una mayor simpatoexcitación, los

cambios en la PA podrían ser explicados, al menos en parte, por este mecanismo.

Por otro lado, no se observaron alteraciones en la respuesta del HA frente a los

tratamientos a corto plazo de los receptores ETA y ETB. Tampoco se vieron

diferencias en las cantidades relativas de estos receptores que, además al ser

comparado con el HP, no mostraron una colocalización significativa con neuronas

catecolaminérgicas.

1.9.2. Modulación del sistema catecolaminérgico por endotelinas

en el bulbo olfatorio.

✓ El Bulbo olfatorio en animales normotensos. La incubación a corto plazo del BO de

ratas normotensas tanto con ET-1 como con ET-3 aumentan la fosforilación de la TH

en las serinas 19 y 40, llevando a un incremento de su actividad. Esto ocurrió a través

de la activación de los receptores ETA y ETB e involucraron la participación de las vías

CAMKII, PCK y PKA [260]. Además, el tratamiento con ETs a largo plazo llevó,

mediante la activación del receptor ETA, a un incremento del ARNm de la TH, de su

expresión proteica, su fosforilación y en consecuencia también de su actividad [212].

✓ El Bulbo olfatorio en animales DOCA-sal: Los animales hipertensos presentaron

niveles de expresión, fosforilación y actividad superiores a los animales

normotensos [161]. En particular, se encontró una asimetría funcional entre ambas

hemiporciones del BO en estos animales, siendo la región derecha la que exhibió

mayores cambios. Por otro lado, la incubación a corto plazo del BO con ETs produjo

una disminución de la expresión, fosforilación y actividad de la TH [161]. Más

recientemente, los resultados correspondientes al trabajo de Tesis Doctoral de la

Dra. Guil [337], muestran que en los animales DOCA-sal hay una mayor expresión

del receptor ETA al ser comparado con los normotensos. Además, se demostró que

~ 31 ~

tanto ETA como ETB colocalizan con neuronas catecolaminérgicas. Se observó

también que la administración ICV del antagonista ETA (BQ-610) o del agonista ETB

(IRL1620) por el plazo de una hora en los animales hipertensos reduce

significativamente la actividad de la TH. Estos resultados se vieron acompañados por

una disminución de la PA. De manera similar a lo observado en el HP, los efectos en

el BO de los animales DOCA-sal mostraron una actividad catecolaminérgica

aumentada que, junto con los resultados hallados mediante el bloqueo agudo ETA o

la activación ETB sobre la PA, apoyan la hipótesis de que esta región telencefálica

podría ser un factor importante tanto en la modulación de la función cardiovascular

como de la génesis, mantenimiento y/o desarrollo de la HTA. Estos resultados se ven

sustentados con datos recientemente obtenidos en el laboratorio en donde la

bulbectomía bilateral en animales hipertensos DOCA-sal produjo una disminución

de la PA.

~ 32 ~

2. Hipótesis y objetivos

A lo largo de la introducción de este trabajo de tesis se puso en evidencia la

importancia de una enfermedad de evolución crónica como la HTA. Hemos descripto sus

características y la multiplicidad de factores que interactúan en el desarrollo de esta

patología, así como también sus efectos sobre los órganos blanco. Realizamos un repaso de

las estadísticas disponibles hasta la fecha, basándonos en datos epidemiológicos tanto

nacionales como internacionales que hablan de lo silenciosa y peligrosa que es esta

enfermedad de alcance mundial. Ha quedado claro que se trata de un grave problema para

el sistema de salud. Esto no sólo tiene consecuencias económicas sobre los países, por tener

que desarrollar programas de concientización, prevención y tratamiento, sino también a

nivel humanitario dada la alta tasa de morbilidad y mortalidad que los efectos derivados de

la HTA tienen sobre las personas. A pesar de todos los esfuerzos realizados por los distintos

grupos de investigación, los mecanismos que actúan en el origen, desarrollo y

mantenimiento de la hipertensión son poco claros y en ciertos casos desconocidos. Hemos

puesto un especial énfasis en la importancia del consumo desmedido de sal en la dieta y su

contribución al incremento de la PA y las enfermedades cardiovasculares.

Describimos también los distintos mecanismos involucrados en la regulación de la PA,

tanto en condiciones fisiológicas como patológicas, en el corto y en el largo plazo.

Resaltamos el papel de los componentes centrales y sus consecuencias sobre el sistema

nervioso simpático y parasimpático sin dejar de lado las vías humorales y locales. En este

sentido, destacamos el papel de dos áreas importantes del sistema nervioso central: el

hipotálamo y el BO. Definimos las características anatómicas y fisiológicas del HA, el HP y el

BO, siempre en relación con sus implicancias en la regulación de la función cardiovascular y

la HTA. Por un lado, subrayamos la importancia del HA y el HP en relación con el control

hemodinámico y la modulación del balance autonómico. Por otro lado, en el BO, si bien la

relación y dependencia con la función cardiovascular es más distante y muy poco estudiada,

se demostró que su integridad resulta fundamental para el correcto control de respuestas

cardiovasculares. Estudiando estas áreas nos enfocamos en dos sistemas centrales de gran

relevancia para este trabajo de tesis: el sistema catecolaminérgico y el sistema

endotelinérgico cuyos componentes principales fueron analizados en detalle. Vimos cómo

las catecolaminas centrales son fundamentales (principalmente la NA) en la modulación

~ 33 ~

tanto a corto como largo plazo de la PA y en la hipetensión, probablemente mediante la

modulación de la descarga simpática. En este sentido, los antecedentes de nuestro

laboratorio mostraron la existencia de una interacción entre el sistema endotelinérgico y la

transmisión noradrenérgica en el HA, HP y el BO de animales normotensos, así como

también en el modelo de HTA DOCA-sal. Las características de este modelo animal de

experimentación animal fueron expuestas en detalle, remarcando su importancia en el

estudio de la HTA sal dependiente con un componente neuroendocrino en su génesis y

desarrollo. Asimismo, en experimentos de tejido aislado demostramos de qué manera las

ETs modulan diferencialmente la transcripción del ARNm de la TH, así como su expresión,

fosforilación y actividad enzimática. Esto fue realizado primero en tejidos de ratas

normotensas y posteriormente en tejidos de ratas DOCA-sal. Los últimos descubrimientos

del laboratorio fueron en relación con la implicancia a corto plazo de los receptores de las

ETs sobre la modulación del sistema catecolaminérgico en las regiones centrales antes

nombradas y sus consecuencias sobre la PA. Encontramos que el bloqueo central y agudo

(1 hora) de los receptores ETA o la activación de los receptores ETB disminuye la actividad de

la TH en el HP y en el BO de las ratas DOCA-sal, sin presentarse cambios en el HA. Estos

experimentos fueron realizados in-vivo y tuvieron como consecuencia una disminución

significativa de la PA. Además, la distribución y colocalización de los receptores de las ETs

con neuronas TH positivas en esas áreas, sugieren que las respuestas observadas serían

principalmente a través del receptor ETA.

Sobre la base de todo lo expuesto, dado que observamos que las ETs centrales

modulan rápidamente el comportamiento del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo

y el BO con consecuencias sobre el sistema cardiovascular del modelo DOCA-sal y teniendo

en cuenta las diferencias en la regulación a corto y largo plazo de la PA, nos preguntamos si

las interacciones observadas de manera aguda se ven modificadas a lo largo de un

tratamiento crónico. Por ello planteamos como hipótesis que:

“El sistema endotelinérgico endógeno central regula el comportamiento a largo

plazo de la transmisión noradrenérgica y esta interacción estaría involucrada en

el mantenimiento y desarrollo de la hipertensión arterial en el modelo DOCA-sal”

~ 34 ~

En este contexto, definimos como objetivo general:

“Investigar la participación del sistema endotelinérgico endógeno central en la

regulación a largo plazo de la expresión y actividad de la tirosina hidroxilasa en

el hipotálamo anterior, posterior y los bulbos olfatorios de ratas normotensas e

hipertensas DOCA-sal. Asimismo, estudiar la correlación de estos efectos sobre

la presión arterial y la frecuencia cardiaca”

El abordaje experimental adoptó los siguientes objetivos específicos:

1) Inhibición crónica del receptor ETA in-vivo: Administración ICV de un antagonista

específico (BQ-610) durante 7 días, tanto en ratas normotensas como hipertensas

DOCA-sal.

a. Medición de la PAS y la FC para analizar los efectos del bloqueo crónico ETA

sobre estos parámetros hemodinámicos.

b. Evaluación del estado del sistema catecolaminérgico mediante el estudio de

la actividad de la TH en el HA, HP, el BO izquierdo y derecho.

c. Estudio de la expresión y estado de fosforilación de la TH en el HA, HP, el BO

izquierdo y derecho.

d. Evaluación de los niveles de expresión del ARNm de la TH en el HA, HP, el BO


2) Activación crónica del receptor ETB in-vivo: Administración ICV de un agonista

específico (IRL1620) durante 7 días, tanto en ratas normotensas como hipertensas

DOCA-sal.

a. Medición de la PAS y la FC para analizar los efectos la activación crónica ETB

sobre estos parámetros hemodinámicos.

b. Evaluación del estado del sistema catecolaminérgico mediante el estudio de

la actividad de la TH en el HA, HP, el BO izquierdo y derecho.

c. Estudio de la expresión y estado de fosforilación de la TH en el HA, HP, el BO


d. Evaluación de los niveles de expresión del ARNm de la TH en el HA, HP, el BO


~ 35 ~

3. Materiales y métodos

3.1. Animales.

Se utilizaron ratas machos de la cepa Sprague-Dawley (outbread Crl:CD) con un peso

corporal aproximado de 150 g provenientes del Bioterio Central de la Facultad Farmacia y

Bioquímica (FFyB), de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Los mismos contaban con los

certificados de análisis microbiológicos que aseguraba la calidad para el trabajo

experimental. Los animales fueron alojados en el Bioterio de la Cátedra de Fisiología (FFyB-

UBA) y el Instituto de la Química y Metabolismo del Fármaco (IQUIMEFA-UBA-CONICET)

bajo la supervisión de dos técnicos profesionales en Bioterio. Se colocó un máximo de dos

animales por jaulas de acrílico, bajo condiciones constantes de temperatura (22±2 °C) y

humedad (45-55 %), con ciclos alternados de luz/oscuridad de 12hs, con acceso al agua y

comida ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las

recomendaciones de la Guía internacional de principios para la investigación biomédica

utilizando animales de laboratorio [338] y la Guía para el cuidado y uso de animales de

laboratorio [339]. Además, los procedimientos experimentales fueron aprobados por el

Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la FFyB-UBA

(CICUAL-FFyB-UBA, Nota: 031013-5; Exp-FYB N ° 56106/2013). Se realizaron todos los

esfuerzos posibles para minimizar el número de ratas utilizadas y el estrés causado en los

procedimientos. A continuación, se describen los distintos pasos del protocolo experimental

detallado en el esquema de la Figura 8.

~ 36 ~

Figura 8. Esquema del protocolo experimental. Ratas de la cepa Sprague-Dawley fueron separadas en dos grupos, uno normotenso (Nt) y otro DOCA-sal. El grupo DOCA-sal recibió dos veces por semana una dosis de 15mg/kg de DOCA y bebió agua con 1% NaCl. En la mitad de la cuarta semana se realizó la cirugía para la colocación de la bomba osmótica (recuadro gris) y se conformaron los distintos grupos experimentales para los tratamientos crónicos (7 días) con BQ-610 e IRL1620. En el centro de la figura se indican los días de medición de la PAS y la FC previo al tratamiento (en negro) y durante el tratamiento (en rojo, marcado como horas de tratamiento). Finalmente, a las 168hs de tratamiento se sacrificaron los animales (en azul).

3.2. Desarrollo del modelo DOCA-sal.

Los animales con un peso aproximado de 150 ± 20 g fueron divididos al azar en dos

grupos, uno normotenso (Nt) y otro al cual se le realizó el tratamiento DOCA-sal (Figura 8).

Todas las ratas fueron pesadas dos veces por semana y se registró el volumen de agua

consumido. El grupo normotenso fue provisto de agua y el DOCA-sal de agua con 1% de

NaCl. El grupo DOCA-sal fue inyectado subcutáneamente dos veces por semana con acetato

de 11-deoxicorticosterona (DOCA, Sigma-Aldrich Inc., San Luis, MI, USA) (Figura 8). La dosis

fue ajustada de acuerdo con el peso corporal (PC) del animal en una relación de 15mg

DOCA/kg (se utilizó aceite de sésamo como vehículo, 1ml/15mg DOCA). La suspensión de la

droga se preparó siempre el día anterior a la inyección de cada animal dejándola en

agitación toda la noche y cubierta con papel aluminio [161,162]. El modelo DOCA-sal fue

desarrollado durante 4 semanas y media. Con el objetivo de controlar el correcto desarrollo

~ 37 ~

del modelo de HTA se evaluó dos veces por semana la PAS y la FC tanto en los animales Nt

como los DOCA-sal mediante el método plestimografía de cola, controlador NIBP

(ADInstruments NIBP model 125 Sydney, Australia) y adquisición de datos PowerLab 8/30

(ADInstruments Model ML 870, Sydney, Australia) utilizando un transductor de pulso para

ratas (Modelo 5160R, Panlab/Harvard Apparatus, Barcelona, España). Este procedimiento

se describe más adelante en el apartado 3.3.4. Al final del experimento cuando los animales

fueron sacrificados, se extrajo el corazón para calcular el índice de hipertrofia del ventrículo

izquierdo (IHVI). Para esto se utilizó el peso del ventrículo izquierdo (VI) y el PC del animal

el mismo día del sacrificio, teniendo en cuenta que no haya diferencias entre el peso de los

animales Nt y DOCA-sal. EL IHVI se calculó como la relación de peso del VI respecto de peso

total del animal (PC), IHVI = VI/PC [340]. A continuación, se describen los parámetros

estudiados para la caracterización del modelo experimental.

3.2.1. Caracterización del modelo DOCA-sal.

El modelo DOCA-sal desarrolla una HTA progresiva dentro de las primeras 5

semanas de tratamiento. Esto se ve acompañado por otros marcadores derivados del

aumento de la PA como por ejemplo el desarrollo de hipertrofia del VI [149,161,162].

Como se mencionó anteriormente, lo largo de todo el procedimiento experimental se

evaluó el PC, el consumo de agua, la PAS, la FC y el IHVI como parámetros para

evidenciar el correcto desarrollo del modelo DOCA-sal.

La curva de crecimiento (Figura 9) mostró que no hubo diferencias entre los

grupos estudiados (Tabla 4)y que los valores estuvieron de acuerdo a lo esperado

según el estándar para las ratas macho de la cepa Sprague-Dawley [341,342]. Al día 1

del experimento los animales tuvieron un PC que varió entre 127-170 g (con un

promedio global de 149 g). Al momento de la cirugía (día 24) los animales pesaron

aproximadamente 300-340 g y fueron sacrificados (día 31) con un PC 320-365g

(promedio global de 344 g) (Figura 9).

Por otra parte, se observó un mayor consumo de agua en los animales DOCA-

sal comparados con los animales Nt (Figura 10). Esto es de esperar dado que los

primeros consumen agua al 1% NaCl y fueron inyectados con DOCA que, como se

mencionó anteriormente, actuaría aumentando la sensibilidad del SNC al sodio,

potenciando el apetito por la sal [149,177–180]. El volumen calculado fue ponderado

por cada 100g de PC del animal para independizarse de esta variable.

~ 38 ~

Figura 9. Curva de crecimiento. Se describe el crecimiento de las ratas macho de la cepa Sprague-Dawley utilizadas en el presente trabajo de tesis desde 4 días antes del inicio del experimento hasta finalizado el tratamiento crónico con el agonista ETA o el antagonista ETB. No se observaron diferencias significativas entre los distintos tratamientos. Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamientos BQ-610/IRL1620).

Figura 10. Consumo de agua. Se describe el consumo de agua diario de las ratas macho de la cepa Sprague-Dawley utilizadas en el presente trabajo de tesis desde 3 días antes del inicio del experimento hasta finalizado el tratamiento crónico con el agonista ETA o el antagonista ETB. Las ratas DOCA-sal consumieron agua con NaCl al 1% y las Nt consumieron agua sin agregado de sal. Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamientos BQ-610/IRL1620).

~ 39 ~

Figura 11. Presión arterial sistólica durante el desarrollo del modelo DOCA-sal. a. Se describen los valores de la PAS (mmHg) en función del tiempo (días y semanas) para los animales normotensos (Nt) y los que recibieron el tratamiento DOCA-sal. Se realizaron dos mediciones semanales desde el día 1 al día 22. b. Valores de PAS al día 22 (semana 4), los animales DOCA-sal tuvieron un aumento de la PAS de 38 mmHg comparado con el grupo Nt. Estos resultados son utilizados como referencia del estado previo (48hs antes) al tratamiento crónico con BQ-610 o IRL1620. *** p < 0,001 vs Nt. Número total de animales: 111.

~ 40 ~

Figura 12. Frecuencia cardiaca durante el desarrollo del modelo DOCA-sal. a. Se describen los valores de la FC (BPM) en función del tiempo (días y semanas) para los animales normotensos (Nt) y los que recibieron el tratamiento DOCA-sal. Se realizaron dos mediciones semanales desde el día 1 al día 22. b. Valores de FC al día 22 (semana 4), no se encontraron diferencias entre los animales DOCA-sal y el grupo Nt. Estos resultados son utilizados como referencia del estado previo (48hs antes) al tratamiento crónico con BQ-610 o IRL1620. Número total de animales: 111.

El registro de la PAS durante los primeros 22 días del protocolo mostró que, a

partir de la segunda mitad de la semana 2 (día 11), las ratas DOCA-sal se despegaron

de los controles Nt de manera gradual, llegando al día 22 (48hs antes de la cirugía)

con una HTA evidente (Figura 11.a). Para ese momento, los animales Nt tuvieron una

PAS de 120 ± 1 mmHg mientras que los DOCA-sal alcanzaron los 158 ± 1 mmHg (Figura

11.b). A su vez, no hubo variaciones significativas entre ambos grupos en cuanto a los

valores de FC durante estas semanas (Figura 12.a). De esta forma, los animales Nt

~ 41 ~

tuvieron una FC de 367 ± 3 mmHg mientras que los DOCA-sal de 366 ± 4 mmHg (Figura

12.b). Estos valores concuerdan con el desarrollo del modelo DOCA-sal y la diferencia

de PAS nos permitió evaluar posteriormente los efectos de los tratamientos crónicos

(bloqueo del receptor ETA o la activación del receptor ETB) sobre estos parámetros.

Adicionalmente, se realizó el cálculo del IHVI para ambos grupos controles. Al

final del protocolo DOCA-sal (día 31) los animales fueron pesados y sacrificados. En

ese momento se extrajo el corazón y se obtuvo el peso del VI para calcular la relación

VI/PC y obtener así el IHVI. Para poder utilizar este parámetro es importante que no

haya diferencias significativas entre los PC de ambos grupos. Efectivamente, no hubo

diferencias en el PC (Figura 13.a) y el IHVI mostró un aumento del 42% en las ratas

Control DOCA-sal (Figura 13.b).

Finalmente, y a la vista de los resultados, el análisis de todos estos factores

ratificó el apropiado desarrollo del modelo DOCA-sal.

Figura 13. Índice de hipertrofia del ventrículo izquierdo en el modelo DOCA-sal. a. Se describe el

peso corporal de los controles normotensos (Control Nt) y DOCA-sal (Control DOCA-sal) una vez finalizado el experimento. No se encontraron diferencias entre ambos grupos. La igualdad en el peso corporal permite evaluar la relación entre el peso del VI y el peso total del animal. b. Índice de hipertrofia del ventrículo izquierdo (IHVI). Se observó un incremento del 41% en el IHVI de los animales DOCA-sal. *** p < 0,001 vs Control Nt. Número total de animales: 41.

3.3. Cirugías y procedimientos experimentales.

Durante la mitad de la cuarta semana (el día 24 del experimento), los animales fueron

sometidos a una cirugía de acuerdo con el manual de técnicas experimentales y quirúrgicas

en animales de laboratorio [343]. En esta cirugía se realizó la colocación de una bomba de

microinfusión osmótica cargada con el antagonista ETA (BQ-610) o bien con el agonista ETB

~ 42 ~

(IRL1620) (Figura 8). Se utilizaron dos posibles dosis para cada droga según se detalla en la

tabla 4. A continuación se describen los grupos experimentales, el armado y colocación de

las bombas osmóticas, el protocolo de medición de la PAS/FC y la obtención de los tejidos

de interés (HA, HP, BO izquierdo, BO derecho y corazón).

3.3.1. Grupos experimentales.

Las ratas Nt y DOCA-sal fueron divididas en diferentes grupos según el

tratamiento asignado durante la semana final del experimento (Figura 8). Para realizar

la administración central crónica de BQ-610, de IRL1620 o vehículo (líquido

cefalorraquídeo artificial, LCRa), los animales que componen los grupos Nt y DOCA-sal

fueron distribuidos como indica la tabla 4.

GRUPOS EXPERIMENTALES

Controles Vehículo Dosis/hora

Nt LCRa - DOCA-sal LCRa -

Bloqueo crónico ETA Antagonista ETA Dosis/hora

Nt + BQ610 (12ng/h) BQ610 12ng/h Nt + BQ610 (24ng/h) BQ610 24ng/h DOCA + BQ610 (12ng/h) BQ610 12ng/h DOCA + BQ610 (24ng/h) BQ610 24ng/h

Bloqueo crónico ETB Antagonista ETB Dosis/hora

Nt + IRL1620 (45ng/h) IRL1620 45ng/h Nt + IRL1620 (90ng/h) IRL1620 90ng/h DOCA + IRL1620 (45ng/h) IRL1620 45ng/h DOCA + IRL1620 (90ng/h) IRL1620 90ng/h

Tabla 4. Grupos experimentales. En las filas superiores se describen los controles normotensos (Nt) e hipertensos (DOCA-sal). En las filas centrales se observan los grupos que recibieron la inhibición crónica ETA tanto para los animales normotensos como hipertensos, divididos a su vez en las dos posibles dosis del antagonista (12 o 24ng/h). En las filas inferiores se detallan los grupos que recibieron la activación crónica ETB tanto para los animales normotensos como hipertensos, divididos a su vez en las dos posibles dosis del agonista (45 o 90ng/h).

3.3.2. Preparación de BQ-610, IRL1620 y las bombas osmóticas.

Se utilizó el antagonista específico ETA (BQ-610) o el agonista específico ETB

(IRL1620) para realizar el tratamiento crónico. Tanto el BQ-610 como el IRL1620 son

péptidos hidrofílicos que no atraviesan la barrera hematoencefálica [344–348]. Por

esta razón, la aplicación periférica no es útil para evaluar los efectos centrales directos

de estas drogas. Por lo tanto, se realizó la administración directamente en el

ventrículo lateral del cerebro a través de la colocación de una cánula (ICV). Esta vía es

~ 43 ~

ampliamente utilizada para el ensayo de fármacos o compuestos con potencial

actividad en distintos mecanismos, entre ellos la regulación central de la función

cardiovascular. De hecho, esta técnica permitió demostrar que las ETs podían ser

consideradas como posibles neurotransmisores [349]. Por otro lado, para realizar la

administración de manera crónica, durante 7 días y sin fluctuaciones significativas en la

concentración utilizamos bombas de microinfusión osmóticas (Figura 14).

Figura 14. Bomba de microinfusión osmótica. a. Esquema de una bomba osmótica y sus distintos componentes. Por diferencia osmótica el agua en el líquido intersticial pasa a través de la membrana semipermeable y se acumula en capa osmótica y de esa forma expulsa la droga (en este caso, BQ-610 o IRL1620) hacía el catéter. b. Esquema del modelo armado para realizar la infusión intracerebral. La droga expulsada por la bomba circula por el catéter y sale por la cánula en el extremo opuesto. c. Esquema de una rata con la bomba osmótica colocada. La droga es descargada por la cánula en el ventrículo lateral del cerebro de la rata. Modificado del manual de canulación intracerebral, ALZET-DUREC ©.

~ 44 ~

Para el tratamiento con el antagonista ETA las bombas osmóticas fueron

cargadas con BQ-610 en dos concentraciones: 100ng/ul o 200ng/ul con el objetivo de

detectar alguna posible dosis-dependencia de los distintos parámetros analizados.

Basado en el flujo de la bomba osmótica (0,12ul/h) se realizó la conversión de las dosis

en función de los nanogramos de la droga por hora. Por lo tanto, las dosis de BQ-610

aplicadas fueron de 12ng/h o 24ng/h respectivamente (Tabla 4) [345–347]. Por su

parte, para el tratamiento crónico con el agonista ETB, las bombas fueron cargadas

con otras dos posibles concentraciones: 375ng/ul o 750ng/ul. Quedando las mismas

como 45ng/h y 90ng/h respectivamente (Tabla 4) [344,348]. Se utilizó líquido

cefalorraquídeo artificial (LCRa) como vehículo, según la composición recomendada

por ALZET, DURECT Co., CA, USA (cada 100ml: 866 mg NaCl; 23 mg KCl; 21 mg CaCl2 ·

2H2O; 16 mg MgCl2 · 6H2O; 11 mg Na2HPO4; 2 mg NaH2PO4; llevado a volumen con

H2O libre de pirógenos).

Las bombas de microinfusión osmótica se armaron según el manual del

fabricante (modelo ALZET 1004, DURECT Co., CA, USA) y su funcionamiento se

describe en la Figura 14. Una vez cargadas con la droga se las conectó a un kit de

infusión cerebral modelo 1 (Brain infusion kit 1, DURECT Co., CA, USA).

Inmediatamente, fueron incubadas en solución fisiológica a 37°C durante las 48hs

previas a la cirugía. Esto permitió que al momento de ser colocadas no se produzcan

variaciones en la velocidad del flujo debido a cambios de temperatura.

3.3.3. Colocación de la bomba osmótica y la cánula ICV.

Con el objetivo de colocar la bomba osmótica y la cánula de infusión cerebral

en los animales, durante la mitad de la cuarta semana de tratamiento (día 24 del

experimento) las ratas fueron anestesiadas con una mezcla de ketamina/xilazina

(50/10 mg/Kg, intraperitoneal, IP). Una hora antes de la cirugía y 48 horas después, se

administró oralmente a todos los animales una mezcla adecuada de analgésico

(ibuprofeno 50 mg/Kg/día) y antibiótico (Amoxicilina 100 mg/Kg/día) [343]. Los

animales anestesiados fueron colocados en un aparato estereotáxico (David Kopf

Mod. 900, CA, USA). La bomba osmótica fue colocada subcutáneamente en la región

escapular media de la rata y la cánula de infusión fue ubicada en el ventrículo lateral

del cerebro según las coordenadas obtenidas del atlas de Paxinos y Watson (-1,9mm;

-0,7mm; -3,0mm en los ejes x; y; z respectivamente) [79]. Las bombas osmóticas

~ 45 ~

administraron de manera crónica, a flujo constante e ininterrumpido el antagonista

ETA o el agonista ETB durante 7 días. Se realizó el seguimiento de la PAS y la FC de

todos los animales mediante plestimografía de cola a las 24hs, 48hs, 72hs, 120hs y

144hs (Figura 8), así como también se registró el PC y el consumo de agua. A las 168hs

de tratamiento los animales fueron sacrificados.

3.3.4. Registros de presión arterial sistólica y frecuencia cardiaca.

Como se mencionó anteriormente, se obtuvieron los registros de la PAS y la FC

de las ratas a lo largo de todo el experimento. Cada animal fue evaluado 2 veces por

semana hasta el momento de la cirugía, con la intención de confirmar el correcto

desarrollo del modelo DOCA-sal (Figuras 11 y 12). Durante la semana de tratamiento

crónico, la PAS y la FC fue evaluada a las 24hs, 48hs, 72hs, 120hs y 144hs post-

colocación de la bomba osmótica para realizar el seguimiento detallado de estos

parámetros durante la etapa final del experimento (Figura 8). El método de tail-cuff

es una técnica tradicional y de una amplia utilización para la medición de la PA y la FC

de manera indirecta [350–354]. La semana anterior al comienzo de experimento se

realizaron varias simulaciones para acostumbrar a las ratas tanto al ambiente como al

procedimiento siguiendo las recomendaciones bibliográficas [355,356]. Para

optimizar las condiciones se trabajó en una habitación silenciosa, con la temperatura

controlada, entre las 10 a.m. y 2 p.m. para evitar efectos circadianos [357]. Además,

no se usaron cepos de restricción, dado que esto aumenta los niveles de estrés de los

animales, simplemente se los cubrió con una manta [355]. Es importante tener en

cuenta que a pesar de todos estos recaudos y de que los animales están familiarizados

con el operador, no están exentos de cambios en los olores dentro de la habitación,

pudiendo esto generar cierto estrés. Sin embargo, todos los animales fueron

sometidos a las mismas variables y los registros de PAS y FC, tanto para las ratas

normotensas como las DOCA-sal. Además, los valores de PAS y FC registrados

estuvieron de acuerdo con los obtenidos por otros grupos de laboratorio utilizando

este y otros métodos [163,183,358–361]. En estas condiciones, los animales fueron

manipulados pacientemente, se esperó el tiempo necesario para que estén relajados

y luego se colocó el sensor en el extremo anterior de la cola buscando la posición de

contacto más cercana a la arteria caudal. En cada sesión se realizaron entre 3-8

mediciones por animal [355] y los registros fueron analizados mediante el programa

~ 46 ~

LabChart 6.0 provisto por AD Instrument. Los resultados se presentaron como la

media de la PAS (mmHg) ± SEM y la media de la FC (BPM) ± SEM.

3.3.5. Obtención y procesamiento de las muestras.

Una vez cumplidos los 7 días de tratamiento crónico (168hs) las ratas fueron

pesadas y sacrificadas por decapitación. Los cerebros fueron removidos y

rápidamente colocados en frío. Se verificó que la cánula haya alcanzado el ventrículo

lateral y rápidamente se extrajo el HA, HP, BO izquierdo y derecho de acuerdo al atlas

de Palkovits & Browstein [54]. También se extrajo el corazón de cada animal para

obtener el peso del VI [340].

Según el caso, las muestras de los distintos tejidos fueron procesadas para

extracción de ARN y proteínas totales o para medición de la actividad enzimática de

la TH. La extracción de ARN y proteínas totales fue realizada mediante el kit

TRIreagent según el protocolo del fabricante (TRIreagent, Molecular Research Center

Inc., Cincinnati, OH, USA). Brevemente, los homogenatos en TRIreagent fueron

centrifugados para obtener una separación de las fases orgánica y acuosa, separadas

por una interfase anfipática. La fase acuosa fue utilizada para obtener el ARN total y

la fase orgánica (junto con la interfase) para obtener las proteínas totales. En ambos

casos la purificación se basó en un paso de precipitación, otro de centrifugación y

lavados, y un paso final del resuspensión. Es importante destacar que para mejorar el

rendimiento de las proteínas se realizó un paso adicional utilizando urea 9,5M + 2%

buffer CHAPS al final del protocolo con el agregado de inhibidores de proteasas. Por

otro lado, para la medición de la actividad de la TH, las muestras fueron colocadas

inmediatamente en un buffer de lisis adecuado. Este protocolo es detallado más

adelante.

~ 47 ~

3.4. Drogas y reactivos.

Las drogas y reactivos utilizados en este trabajo se encuentran listados en la tabla 5.

El resto de las soluciones y reactivos empleados no listados fueron de calidad analítica o

biología molecular.

DROGAS Y REACTIVOS

Reactivos Marca Lugar de origen

Bomba de infusión osmótica ALZET 1004 ALZET DURECT CO California, USA

Brain infusion kit 1 ALZET ALZET DURECT CO California, USA

DOCA SIGMA Missouri, USA

BQ-610 American Peptide Company California, USA

IRL1620 American Peptide Company California, USA

TRIreagent Molecular Research Center Inc. Ohio, USA

Urea Biopack Buenos Aires, Argentina

CHAPS Thermo Fischer Scientific Illinois, USA

Catalasa SIGMA Missouri, USA

Tetrahidrobiopterina SIGMA Missouri, USA

L-tirosina SIGMA Missouri, USA 3H-L-tirosina Perkin-Elmer Massachusetts, USA

Liquido de centelleo ECOLITE+TM MP Biomedicals, LLC Ohio, USA

Inhibidores de proteasas SIGMA Missouri, USA

Marcador peso molecular (10-170 kDa) Thermo Scientific Illinois, USA

Ac. anti-β-actina (ratón) SIGMA Missouri, USA

Ac. anti-TH total (ratón) SIGMA Missouri, USA

Ac. anti-THser19p (conejo) Chemicon EDM Millipore California, USA



Ac. anti-conejo-HRP (cabra) Chemicon EDM Millipore California, USA

Ac. anti-ratón-HRP (cabra) Santa Cruz California, USA

Membrana PVDF GE Healthcare Buckinghamshire, UK

Reactivo quimioluminiscente Biolumina Kalium Technologies Buenos Aires, Argentina

Placas radiográficas T-MAT G/RA Carestream Dental Connecticut, USA

RNAsin (inhibidor RNasas) Genbiotech Buenos Aires, Argentina

DNasa RQ1 kit Promega Wisconsin, USA

RT-MMLV kit Genbiotech Buenos Aires, Argentina

Oligo-dT IDT California, USA

Primers TH y β-actina IDT California, USA

Go-Taq polimerasa Promega Wisconsin, USA

Taq polimerasa Pegasus Productos-Bio-lógicos Buenos Aires, Argentina

Eva Green 20X Biotium California, USA

MgCl2 (50mM) Productos-Bio-lógicos Buenos Aires, Argentina

dNTPs Productos-Bio-lógicos Buenos Aires, Argentina

Marcador de peso molecular (50pb) Productos-Bio-lógicos Buenos Aires, Argentina

Tabla 5. Drogas y reactivos empleados en el presente trabajo de tesis doctoral.

~ 48 ~

3.5. Actividad de la tirosina hidroxilasa.

La actividad de la TH fue determinada mediante el método radioenzimático descripto

por Reinhard y col. [362]. La reacción se basa en la capacidad de esta enzima de convertir L-

tirosina en L-DOPA (utilizando una molécula de O2 y tetrahidrobiopterina como cofactor).

Cada conversión de una molécula de L-tirosina culmina con la liberación de una molécula de

H2O (en relación 1:1). Por lo tanto, utilizando L-tirosina marcada con tritio (3H-L-tirosina), al

final de la reacción esa marca es transferida a la molécula de agua (3H2O) (Figura 15).

Durante el ensayo se recupera el agua de la reacción, separándola del resto de los

componentes mediante carbón activado y centrifugación. El 3H2O se cuantifica en un

contador de centelleo para determinar finalmente los niveles de actividad de TH.

Figura 15. Fundamento de la determinación de la actividad de la TH. Conversión de L-tirosina en L-DOPA que incluye la liberación (1:1) de una molécula de agua. La marca de tritio en la L-tirosina es transferida a la molécula de agua liberada durante la reacción. El agua marcada es cuantificada en un contador de centelleo para determinar la actividad de la enzima.

Los tejidos fueron homogeneizados en 150ul (HA o HP) o 200ul (BO izquierdo o

derecho) de buffer de lisis frío (5mM KH2PO4 y 0,2% Tritón 100X, pH 7.0). Los restos celulares

fueron removidos por centrifugación a 12.500 rpm durante 10 minutos a 4°C. Una alícuota

del sobrenadante fue apartada y guardada para medir la cantidad de proteínas totales

mediante el método colorimétrico de Bradford [363]. En paralelo, se preparó un mix

compuesto por 50ul del sobrenadante remanente y 50ul de una solución de reacción (HEPES

50mM, pH 7.0; 15nmol de L-tirosina [0,5uCi 3H-L-tirosina], β-mercaptoethanol 420mM, 6-

metil-tetrahidrobiopterina 0,75mM y 1000u de catalasa). La reacción se llevó a cabo

incubando este mix durante 20 minutos a 37°C y fue detenida en hielo. Luego, se tomaron

25ul y se colocaron en 1ml de HCL 1N mezclado con carbón activado (7,5% P/V), esto se

realizó por triplicado. Se vortexeó la muestra y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10

minutos a 4°C. Finalmente, se recuperaron 400ul del sobrenadante para colocarlos en 3ml

de líquido de centelleo. El 3H2O resultante de la reacción fue cuantificada por centellografía

~ 49 ~

líquida en un contador de centelleo utilizando un estándar externo (WinSpectral 1414

counter, Perkin Elmer / Wallac). Los datos fueron obtenidos en desintegraciones por minuto

(DPM) y fueron normalizados respecto de la cantidad de proteínas totales presentes en cada

muestra. Los resultados obtenidos en DPM/ug proteína fueron expresados finalmente como

porcentaje vs Control Nt ± SEM.

3.6. Expresión de la tirosina hidroxilasa total y fosforilada.

Se evaluaron los niveles de expresión y el estado de fosforilación de la TH mediante

western blot (WB) en el HA, HP, BO izquierdo y derecho de todos los animales. Una alícuota

de las proteínas totales purificadas fue utilizada para su cuantificación mediante la técnica

colorimétrica de Bradford [363] mientras que el volumen restante fue resguardado a -20°C

para su posterior uso en el WB.

Se tomaron 80ug de proteínas de cada muestra y se colocaron en buffer Laemmli (Tris-

Cl 62.5mM, pH 6.8; SDS 2%; β-mercaptoetanol al 5%; glicerol 10% y azul de bromofenol 4%).

Se incubó durante 5 minutos a 100°C en un baño seco (AccuBlock TM, Baño seco digital,

Labnet Interational Inc.). Las muestras fueron sembradas en un gel de poliacrilamida al 10%

y separadas según su peso molecular mediante una electroforesis en condiciones

desnaturalizantes (SDS-PAGE). Se utilizó un marcador de peso molecular (10-170kda) y las

condiciones de corrida fueron: 100V (500mA) durante 2:30hs. Las proteínas del gel fueron

transferidas a una membrana de PVDF. Las condiciones de transferencia fueron: 150V

(400mA) durante 1:20hs en frío. Para controlar la eficiencia de la transferencia los geles

fueron teñidos en una solución de azul de Coomasie (Coomasie Brilliant Blue 0,25% en

metanol; ácido acético glacial y agua, 45 : 7 : 48 v/v respectivamente). Por su parte, las

membranas fueron controladas con rojo Ponceau (rojo Ponceau 0.05% en solución de ácido

acético al 0,1%). Las membranas fueron lavadas con H2Od y luego colocadas en TBS-T hasta

el momento del bloqueo.

Las membranas fueron bloqueadas durante 60 minutos a temperatura ambiente en

un agitador orbital siendo colocadas en una solución de leche descremada al 5% en TBS-T

(Tris 0.05M; NaCl 0.2M y Tween-20 0.1%; pH 7.4). Posteriormente, se realizaron 3 lavados

consecutivos en TBS-T durante 10, 5, y 5 minutos respectivamente, también en agitación a

temperatura ambiente. Luego, las membranas fueron incubadas durante toda la noche a

4°C con el anticuerpo primario correspondiente a la proteína de interés (disueltos en 1%

leche descremada TBS-T) (Tabla 6). Al día siguiente, se realizaron 3 lavados consecutivos en

~ 50 ~

TBS-T durante 10, 5, y 5 minutos respectivamente en agitación a temperatura ambiente.

Luego, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con HRP

(disueltos en 1% leche descremada TBS-T) (Tabla 6) durante 1:00h también en agitación a

temperatura ambiente. Luego de 3 nuevos lavados con TBS-T (10, 5, y 5 minutos) se realizó

el revelado.

La exposición de las membranas se hizo utilizando un reactivo quimioluminiscente

Biolumina y placas radiográficas fotosensibles T-MAT G/RA. Se trató de evitar la saturación

o subexposición de las bandas obtenidas para su posterior cuantificación. Finalmente, las

bandas de interés fueron escaneadas (Scanjet G3110, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA),

analizadas mediante densitometría (Software ImageJ, herramienta: geles) y normalizadas

respecto de la expresión de β-actina (control de carga). Los resultados fueron expresados

como densidad relativa vs Control Nt ± SEM [161,162,198,211–213].

WESTERN BLOT: ANTICUERPOS

Anticuerpo primario Especie Tipo de Anticuerpo Dilución

Anti β-actina ratón monoclonal 1:2000 Anti TH total ratón monoclonal 1:2000

Anti THser19p conejo policlonal 1:2000 Anti THser31p conejo policlonal 1:750 Anti THser40p conejo policlonal 1:2000

Anticuerpo secundario Especie Tipo de Anticuerpo Dilución

Anti ratón (para β-actina) cabra monoclonal 1:4000 Anti ratón (para TH total) cabra monoclonal 1:5000

Anti conejo (para THser19p) cabra policlonal 1:5000 Anti conejo (para THser31p) cabra policlonal 1:1000 Anti conejo (para THser40p) cabra policlonal 1:5000

Tabla 6. Anticuerpos primarios y secundarios. Detalle de los anticuerpos utilizados para los ensayos de western blot. Todos los anticuerpos secundarios están conjugados con HRP.

3.7. Expresión del ARNm de la tirosina hidroxilasa.

Se determinaron los niveles de expresión del ARNm de la TH mediante RT-PCR en

tiempo real. El protocolo fue realizado según lo descripto por Nabhen y col. con

modificaciones menores [212]. El ADN residual se eliminó tratando las muestras con DNasa

durante 40-60 minutos a 37°C. La efectividad del tratamiento fue constatada a través de una

PCR de punto final (convencional) (MJ MiniTM termal cycler, Bio Rad Laboratories, Hercules,

CA, USA) utilizando primers de β-actina y no obteniéndose producto alguno excepto en el

control positivo. La concentración de ARN total fue determinada por espectrofotometría

(relación de absorbancias A260nm/A280nm) y la calidad mediante electroforesis en gel de

agarosa al 1,5% con bromuro de etidio a 80V durante 20 minutos. El gel fue analizado en un

~ 51 ~

transiluminador UV observándose las bandas correspondientes a las distintas subunidades

del ARN ribosomal (Transilluminator M-20, California, USA).

Se emplearon 2ug de ARN total para la retrotranscripción a ADNc utilizando en la

reacción: 200U de transcriptasa reversa MMLV, 25U de inhibidor de RNasas, dNTPs 10mM,

1,08ug de primers oligo-dT. Los productos fueron constatados mediante una PCR

convencional y verificando mediante un gel de agarosa la existencia de una sola banda

acorde al par de primers utilizados.

PRIMERS PARA RT-PCR EN TIEMPO REAL.

ADNc de interés Orientación del primer Secuencia

Tirosina Hidroxilasa Sentido (Forward) 5'-AGGGCTGCTGTCTTCCTAC-3 '

Antisentido (Reverse) 5'-GCTGTGTCTGGGTCAAAGG-3'

β-actina Sentido (Forward) 5'-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3'

Antisentido (Reverse) 5'-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3'

Tabla 7. Secuencias de los primers. Secuencias de primers utilizadas en las RT-PCR en tiempo real para la amplificación del ADNc de TH y β-actina.

PROGRAMAS PARA LAS RT-PCR EN TIEMPO REAL

ADNc de interés Programa Temperatura Tiempo

Tirosina Hidroxilasa

Desnaturalización inicial 94°C 5 minutos

Ciclos 35-40

Desnaturalización 94°C 15 segundos

Apareamiento 54°C 45 segundos

Extensión 72°C 30 segundos

Rampa de melting 77-94°C (0,15°C/seg)

β-actina

Desnaturalización inicial 94°C 5 minutos

Ciclos 30-35

Desnaturalización 94°C 15 segundos

Apareamiento 54°C 45 segundos

Extensión 72°C 30 segundos

Rampa de melting 77-94°C (0,15°C/seg)

Tabla 8. Programas para la RT-PCR en tiempo real. Configuraciones de corrida utilizadas en las RT-PCR en tiempo real para la amplificación del ADNc de TH y β-actina. La fluorescencia proveniente de cada tubo fue medida una vez por ciclo al final del paso de extensión, a lo largo de todo el proceso.

Se evaluaron los niveles de expresión del mRNA de la TH y de β-actina (como

normalizador housekeeping) utilizando un termociclador en tiempo real RotorGene Q-series

(QUIAGEN, Hilden, Alemania). Las secuencias de oligonucleótidos utilizados como primers

se describen en la Tabla 7. Cada reacción se hizo en un volumen final de 20ul conteniendo:

1ul de cDNA, 1ul de Eva Green como fluoróforo (Biotium, San Francisco, USA), 1ul de primers

específicos (TH o β-actina) 10mM, 0,6ul de MgCl2 50mM, 0,4ul dNTPs 10mM, 0,3ul de GoTaq

polimerasa, 4ul de GoTaq Buffer 5X y 11,7ul de H2O calidad PCR. Primero se realizaron curvas

de calibración estándar de entre 5 a 8 puntos para cada par de primers mediante diluciones

seriadas utilizando un pool de muestras. Las rectas aceptadas tuvieron un R2 ≥ 0,98 y una

~ 52 ~

eficiencia de 1,0 ± 0,2. Además, la especificidad de los productos se corroboró mediante las

temperaturas de melting (Tm), donde se obtuvo un solo pico por encima del valor umbral

de referencia (excepto para el control negativo, sin templado) y a través de un gel de agarosa

2% observándose una sola banda del peso molecular correspondiente al fragmento

amplificado. Todas las muestras se corrieron por duplicado bajo las condiciones

especificadas en la Tabla 8 y los productos de amplificación se describen en la Tabla 9. Los

resultados obtenidos fueron normalizados respecto de β-actina y presentados como

porcentaje vs Control Nt ± SEM.

PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN

ADNc de interés Longitud Temperatura de melting

Tirosina Hidroxilasa 81pb 85,5 ± 0,3

β-actina 69pb 82,4 ± 0,3

Tabla 9. Características de los productos de amplificación. Longitud y temperaturas de melting de los productos de amplificación de la TH y β-actina obtenidos mediante RT-PCR en tiempo real.

3.8. Análisis estadístico.

El análisis estadístico se realizó empleando los programas Graph-Pad Prism 5.0 e

Infostat 2016. Todos los resultados son presentados, según el caso, como la media, densidad

relativa o porcentaje vs Control Nt ± SEM. Para comparar dos grupos experimentales

respecto de una variable se realizó una prueba T, utilizando una corrección de Welch cuando

las varianzas en los tratamientos fueron diferentes. Cuando se compararon más de dos

grupos experimentales se realizó ANOVA de 1 factor seguido de un post-test de Newman-

Keuls. Para comparar los efectos crónicos del antagonista ETA o el agonista ETB sobre la PAS

o la FC a lo largo de una semana en animales normotensos y DOCA-sal se realizó ANOVA de

2 factores con post-test de Bonferroni [364]. Los resultados cuyo valor p fue menor o igual

a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

~ 53 ~

4. Resultados

4.1. Bloqueo crónico del receptor ETA.

Se estudió la implicancia del receptor ETA sobre la modulación a largo plazo de la

transmisión noradrenérgica y el papel de esta interacción en el desarrollo y mantenimiento

de la HTA en el modelo DOCA-sal. Para ello se realizó el bloqueo central crónico de estos

receptores durante 7 días y se evaluó la respuesta del sistema catecolaminérgico en el HA,

HP, BO izquierdo y derecho. En estos tejidos se determinó la expresión, fosforilación y

actividad de la TH, así como también los niveles de su ARNm. Además, se analizaron los

efectos de este tratamiento (en dos diferentes dosis) sobre la PAS y la FC tanto para los

animales Nt como DOCA-sal.

4.1.1. Parámetros hemodinámicos.

Se realizó el seguimiento de los valores de PAS y la FC entre las 24hs y las 144hs de

inhibición crónica de los receptores ETA centrales. Tomando como referencia los valores de

PAS de los animales previo a la administración de BQ-610 (Figura 16. - 48hs, círculo verde),

no encontramos variaciones significativas a lo largo de las 144hs de tratamiento entre los

controles Nt y los animales Nt + BQ-610 (12ng/h o 24ng/h) (Figura 16).

Por su parte, los controles DOCA-sal, que partieron 38 mmHg por encima los Nt (Figura

16. - 48hs, círculo rojo), continuaron incrementando su PAS a lo largo de la semana,

alcanzando un máximo de 173 mmHg a las 144hs (Figura 16).

La inhibición crónica del receptor ETA produjo una importante disminución de la PAS

en los animales DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h). Esta reducción fue más pronunciada durante

las primeras 72hs alcanzando un mínimo de 133 mmHg (a las 24hs) y finalizando el

tratamiento en 142 mmHg (Figura 16). El efecto del antagonista parecería ser dosis

dependiente ya que la administración del doble de la dosis de BQ-610 (24ng/h) incrementa

la disminución de la PAS. Si bien las diferencias con el grupo anterior no fueron significativas

en todos los puntos estudiados (a excepción de las 120hs), los animales DOCA-sal + BQ-610

(24ng/h) tuvieron valores promedio de PAS menores que los DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h).

Además, se observó que durante las primeras 48hs el grupo DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) no

presentó diferencias estadísticas con los ninguno de los animales Nt. Así, las ratas DOCA-sal

~ 54 ~

+ BQ-610 (24ng/h) alcanzaron una PAS mínima de 124 mmHg a las 24hs y finalizaron las

144hs de infusión en 133 mmHg (Figura 16).

Figura 16. Modulación de la presión arterial sistólica debido al bloqueo crónico del receptor ETA. Se grafican los valores de la PAS (mmHg) en función del tiempo desde las 24hs hasta las 144hs de infusión crónica del antagonista ETA (BQ-610). Los valores de PAS durante las 48hs previas al tratamiento sirven de referencia del punto de partida de todos los grupos experimentales. ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal; ‡‡ p < 0,01 vs DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h). Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamiento BQ-610).

Figura 17. Presión arterial sistólica media durante el bloqueo crónico del receptor ETA. Se describe el comportamiento general de la PAS (mmHg) durante el tratamiento con el antagonista BQ-610 mediante el análisis del área bajo la curva entre las 24hs y las 144hs (figura 16). *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal; ‡‡‡ p < 0,001 vs DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h). Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamiento BQ-610).

~ 55 ~

Analizando el área bajo la curva de los valores de PAS entre las 24hs y las 144hs, como

una manera de observar el comportamiento general de este parámetro, determinamos que

no hubo modificaciones entre los distintos grupos de animales Nt tratados y no tratados, los

controles DOCA-sal tuvieron una PAS promedio a lo largo de esa semana de 169 mmHg y

debido al tratamiento con el antagonista ETA se produjo una disminución de la PAS en ambos

grupos hipertensos (Figura 17). Respecto de este último punto, las ratas DOCA-sal + BQ-610

(12ng/h) tuvieron una PAS promedio de 140 mmHg y las DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) de

129 mmHg (Figura 17).

Por otro lado, no encontramos diferencias significativas en la FC a lo largo de las 144hs

de infusión de BQ-610 entre los distintos tratamientos, ya sea en animales Nt como

hipertensos DOCA-sal (Figura 18). En este sentido, la inhibición crónica del receptor ETA

tampoco produjo cambios en la FC debido a las diferentes dosis de BQ-610 aplicadas (Figura

18). Si analizamos el área bajo la curva de los datos de FC entre las 24hs y las 144hs

observamos que los valores promedio a lo largo de esa semana estuvieron entre los 350 ± 2

BPM y los 364 ± 3 BPM (Figura 19). Estos valores están dentro del rango de FC considerado

normal en las ratas Sprague-Dawley [365,366].

Figura 18. Modulación de la frecuencia cardiaca durante el bloqueo crónico del receptor ETA. Se grafican los valores de la FC (BPM) en función del tiempo desde las 24hs hasta las 144hs de infusión crónica del antagonista ETA (BQ-610). Los valores de FC durante las 48hs previas al tratamiento sirven de referencia del punto de partida de todos los grupos experimentales. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos grupos estudiados. Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamiento BQ-610).

~ 56 ~

Figura 19. Frecuencia cardiaca media durante el bloqueo crónico del receptor ETA. Se describe el comportamiento general de la FC (BPM) durante el tratamiento con el antagonista BQ-610 mediante el análisis del área bajo la curva entre las 24hs y las 144hs (figura 18). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos grupos estudiados. Número de animales: 18-20 (controles), 7-10 (tratamiento BQ-610).

Estos resultados sugieren que de alguna manera los receptores ETA centrales podrían

modular en el largo plazo la PA, sin efectos importantes sobre la FC. Es importante destacar

que esto ocurre de manera selectiva en los animales DOCA-sal, sin modificar el

comportamiento de la PAS o la FC en las ratas Nt. Además, en los animales hipertensos los

cambios observados parecen, al menos en parte, dependiente de la dosis de BQ-610.

4.1.2. Hipotálamo anterior y posterior.

Hemos destacado la importancia del hipotálamo en la regulación de la homeostasis

de distintos parámetros fisiológicos. Además, resaltamos las características del HA y el HP

como moduladores de la actividad simpática. En este sentido, mencionamos que el HA es

una región simpatoinhibitoria mientras que el posterior simpatoexcitatoria. Elegimos

estudiar estas áreas ya que uno de los objetivos del trabajo es evaluar las implicancias del

receptor ETA en la interacción a largo plazo con el sistema catecolaminérgico central.

Además, sabemos que el hipotálamo cumple un papel importante en la regulación central

de la función cardiovascular, lo cual nos resulta de utilidad para evaluar su participación en

este modelo de HTA sal dependiente.

~ 57 ~

4.1.2.1. Actividad de la tirosina hidroxilasa.

Se estudió si el bloqueo de los receptores ETA centrales modifica el funcionamiento

del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal. Se

evaluaron los niveles de actividad de la TH en estas regiones del SNC mediante el ensayo

radioenzimático descripto en Materiales y Métodos.

En el HA los resultados mostraron que no hubo cambios en la actividad de la TH en los

distintos grupos de animales Nt, ya sea con o sin la administración de BQ-610 (Figura 20.a).

Mientras que se encontró una disminución del 25% de la actividad enzimática en los

controles DOCA-sal. Esta reducción se vio revertida debido a la inhibición crónica ETA, tanto

para el grupo DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h) como para el DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) (Figura

20.a).

Figura 20. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la actividad de la TH en el hipotálamo anterior y posterior. a. Se grafican los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el hipotálamo anterior de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el hipotálamo posterior. ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt; † p < 0,05; †† p < 0,01; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 3-5.

Por otro lado, se observó un efecto opuesto en el HP. Si bien los resultados mostraron

que no hubo cambios en la actividad de la TH en los distintos grupos de animales Nt (al igual

que en el HA) (Figura 20.b), se encontró un aumento del 57% de la actividad enzimática en

el HP de los controles DOCA-sal. Asimismo, este incremento se vio revertido por la

~ 58 ~

administración de BQ-610, tanto para dosis de 12ng/h como para dosis de 24ng/h (Figura

20.b).

Estos resultados muestran una actividad de la TH disminuida en el HA y aumentada

en el HP de los animales DOCA-sal que, en ambos casos, la inhibición crónica del receptor

ETA tiende a llevar estos valores a lo del control Nt. Estos datos sugieren que el sistema

catecolaminérgico en el hipotálamo es modulado en el largo plazo a través de la

participación del receptor ETA.

4.1.2.2. Expresión de la tirosina hidroxilasa total y fosforilada.

Otra forma de estudiar si el bloqueo a largo plazo del receptor ETA modifica el

funcionamiento del sistema catecolaminérgico (en particular de la TH) en el hipotálamo de

ratas Nt e hipertensas DOCA-sal es evaluar los niveles de expresión de esta enzima y su

estado de fosforilación mediante WB. Estos experimentos fueron realizados en el HA y el HP

por separado según el protocolo descripto en Materiales y Métodos.

En el HA de los animales Nt, la administración de BQ-610 no produjo modificaciones

en la expresión de TH total, así como tampoco en los niveles de fosforilación en Ser 19, 31 y

40 (Figura 21). Por su parte, los niveles totales de la enzima disminuyeron un 68% en los

controles DOCA-sal. Esto se vio acompañado de un estado de fosforilación disminuido en

todas las variantes analizadas. El tratamiento de los animales hipertensos con las diferentes

dosis del antagonista revirtió la expresión de la TH total y de las variantes fosforiladas en Ser

19 y 40, sin que afecte a la Ser 31 (Figura 21).

Por otro lado, el HP los resultados mostraron que no hubo cambios en la expresión y

fosforilación de la enzima en los controles Nt (Figura 22). Sin embargo, se encontró un

aumento del 81% en los niveles totales de la TH en los controles DOCA-sal que se vio

acompañado en el mismo sentido en los niveles de fosforilación de la enzima. La

administración de BQ-610, tanto para la dosis de 12ng/h como para dosis de 24ng/h,

también revirtió completamente el incremento de la TH total y de las diferentes variantes

fosforiladas en los animales hipertensos (Figura 22).

Estos resultados muestran una expresión de la TH disminuida en el HA y aumentada

en el HP en los animales DOCA-sal, acompañada por cambios en el estado de fosforilación.

Estas situaciones, se vieron contrarrestadas en ambas áreas por la inhibición crónica de los

receptores ETA centrales. Esto apoya la idea que el sistema catecolaminérgico en esta región

~ 59 ~

se encuentra alterado en los animales DOCA-sal y se destaca que este mecanismo también

se modula a el largo plazo a través de la regulación del receptor ETA.

Figura 21. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la fosforilación y expresión de la TH en el hipotálamo anterior. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el hipotálamo anterior. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01 vs Control Nt; † p < 0,05; †† p < 0,01; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 4-7.

~ 60 ~

Figura 22. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la fosforilación y expresión de la TH en el hipotálamo posterior. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el hipotálamo posterior. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01 vs Control Nt; † p < 0,05; †† p < 0,01; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 4-7.

~ 61 ~

4.1.2.3. Expresión del ARNm de la tirosina hidroxilasa.

Se evaluó si el bloqueo crónico del receptor ETA modifica la expresión del ARNm de la

enzima en el hipotálamo de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal. Estos experimentos fueron

realizados en el HA y el HP por separado, mediante RT-PCR en tiempo real según el protocolo

descripto en Materiales y Métodos.

Los resultados mostraron que no hubo cambios en la expresión del ARNm de la TH en

los animales Nt tratados y no tratados con BQ-610 (Figura 23.a). Sin embargo, se encontró

una disminución del 69% en los controles DOCA-sal. Sin embargo, la inhibición a largo plazo

del receptor ETA no modificó la expresión del mensajero en los grupos DOCA-sal + BQ-610

(12ng/h) y DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) manteniéndose en ambos casos un 70% por debajo

respecto del Control Nt (Figura 23.a).

Por otro lado, el tratamiento con BQ-610 (12ng/h o 24ng/h) no modificó la expresión

del ARNm de la TH en el HP de controles Nt (Figura 23.b). Sin embargo, en esta región

hipotalámica se observó aumento del 370% en los animales DOCA-sal. El tratamiento de los

animales hipertensos con BQ-610 indujo una marcada disminución de los niveles de ARNm

de TH. Este efecto no fue una reversión completa dado que, a pesar de la disminución

provocada por el tratamiento en ambos casos, la expresión del ARNm de la TH siguió siendo

significativamente superior que la del Control Nt (186% y 118%; BQ-610 12ng/h o 24ng/h,

respectivamente) (Figura 23.b).

Los resultados en el hipotálamo de las ratas DOCA-sal muestran niveles del ARNm de

la TH disminuidos en la región anterior y aumentados en la posterior al ser comparados con

los controles Nt. Además, no hubo efectos en el HA de los animales DOCA-sal debido al

tratamiento con el antagonista ETA, pero si en el HP. En este último caso, la expresión del

mensajero disminuyó parcialmente sin alcanzar los valores encontrados en los animales Nt.

Estos resultados parecen indicar que los niveles del ARNm de la TH en el HP parecieran estar

modulado en el largo plazo por el receptor ETA.

~ 62 ~

Figura 23. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la expresión del ARNm de la TH en el hipotálamo anterior y posterior. a. Se grafican los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el hipotálamo anterior de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el hipotálamo posterior. c y d. Ejemplos de las rectas de calibración, el perfil del ciclado y la temperatura de melting tanto para β-actina como para la TH. c. Parámetros hipotálamo anterior. Recta de β-actina: CT = -2,97*log[conc] + 18,37; eficiencia = 1,17; R2 = 0,995. Recta de TH: CT = - 3,02*log[conc] + 26,67; eficiencia = 1,15; R2 = 0,992. d. Parámetros hipotálamo posterior. Recta de β-actina: CT = - 3,05*log[conc] + 17,40; eficiencia = 1,13; R2 = 0,991. Recta de TH: CT = - 3,20*log[conc] + 27,71; eficiencia = 1,05; R2 = 0,988. * p < 0,05; *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 4.

4.1.3. Bulbos olfatorios.

Existen pocos estudios que muestran la relación del BO con la regulación central de la

función cardiovascular. Sin embargo, se comentaron diferentes trabajos que parecen

vincularlos. Por otra parte, en trabajos previos mostramos que en esta región existe una

~ 63 ~

modulación de la actividad catecolaminérgica modulada por el sistema endotelinérgico

[161,212,260,337].

Basado en estos antecedentes decidimos estudiar en el BO de ratas hipertensas

DOCA-sal y la relación con la interacción entre el sistema catecolaminérgico y

endotelinérgico central y la regulación de la función cardiovascular.


Al igual que en el hipotálamo, se estudió si el bloqueo a largo plazo de los receptores

ETA centrales modifica el funcionamiento del sistema catecolaminérgico esta vez en el BO

de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal. Se evaluó la actividad de la TH en el BO izquierdo y

derecho por separado, mediante el ensayo radioenzimático descripto en Materiales y

Métodos.

Figura 24. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la actividad de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo y derecho. a. Se grafican los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el bulbo olfatorio izquierdo de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el bulbo olfatorio derecho. *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 3-5.

El bloqueo ETA no produjo cambios en la actividad de la TH en el BO izquierdo tanto

de animales controles como hipertensos DOCA-sal (Figura 24.a), ni en el BO derecho de ratas

Nt tratadas y no tratadas con BQ-610 (Figura 24.b). Sin embargo, en BO derecho controles

DOCA-sal tuvieron un aumento de la actividad enzimática del 45% respecto del control Nt.

~ 64 ~

Este incremento se revirtió por administración de las diferentes dosis de BQ-610 estudiadas

(12ng/h y 24ng/h) (Figura 24.b).

Estos resultados sugieren que en los animales DOCA-sal la actividad del sistema

catecolaminérgico del BO derecho está aumentada y este estaría modulado por la

administración crónica del antagonista del receptor ETA.


Se evaluaron los niveles de expresión de TH total y los niveles de fosforilación en el

BO de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal para estudiar si el bloqueo a largo plazo de los

receptores ETA centrales modifica este mecanismo de regulación de la biosíntesis de

catecolaminas. Estos experimentos se realizaron en el BO izquierdo y derecho según el

protocolo descripto en Materiales y Métodos.

En concordancia con lo observado respecto de la actividad de la TH en el BO izquierdo,

el bloqueo a largo plazo del receptor ETA no modificó los niveles de expresión de TH total ni

de la fosforilación de esta enzima en ninguno de los grupos estudiados (Figura 25).

Por su parte, el BO derecho de los animales DOCA-sal fue el que presentó los cambios

más importantes. Los controles hipertensos mostraron un aumento del 132% en los niveles

totales de la TH. Asimismo, este incremento se vio acompañado en igual sentido por todos

los sitios de fosforilación de la enzima estudiados, excepto los niveles de fosforilación de la

serina 31 en los animales DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h). Allí, si bien se observa una tendencia

hacia la disminución no resulta estadísticamente diferente respecto de su control

hipertenso (Figura 26).

Por lo tanto, en el BO tenemos un aumento en la expresión de TH total en la

hemiporción derecha de los animales DOCA-sal, que se acompaña por cambios similares en

los diferentes niveles de fosforilación. Por su parte el BO izquierdo de los animales

hipertensos no mostró cambios. Además, el bloqueo crónico ETA solo afectó a la

hemiporción derecha, poniendo de manifiesto nuevamente el comportamiento asimétrico

del BO. Asimismo, estos datos sugieren que la expresión y el estado de fosforilación de la

TH (al menos en el BO derecho) se encontraría aumentada en los animales DOCA-sal y que

la modulación a largo plazo de los receptores ETA centrales modifica este escenario.

~ 65 ~

Figura 25. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la fosforilación y expresión de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). No se observaron diferencias significativas en las distintas fosforilaciones ni en la expresión total de la TH bajo ninguno de los tratamientos. Número de animales: 4-7.

~ 66 ~

Figura 26. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la fosforilación y expresión de la TH en el bulbo olfatorio derecho. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el bulbo olfatorio derecho. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt; † p < 0,05; †† p < 0,01; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 4-7.

~ 67 ~


Se realizaron ensayos de RT-PCR en tiempo real para establecer si la inhibición a largo

plazo de los receptores ETA centrales actúa sobre los niveles del ARNm de la TH en el BO

izquierdo y derecho de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal.

De la misma forma que en los experimentos de actividad y expresión de la TH, no hubo

cambios en la expresión del ARNm de esta enzima en ninguno de los grupos evaluados en

el BO izquierdo (Figura 27.a).

Por su parte, el tratamiento con BQ-610 (12ng/h o 24ng/h) no modificó la expresión

del ARNm de la TH en el BO derecho de los animales Nt (Figura 27.b). No obstante, se

encontró un 126% de aumento en los controles DOCA-sal, siendo este incremento revertido

por administración de BQ-610, tanto para dosis de 12ng/h como para dosis de 24ng/h

(Figura 27.b).

La expresión del ARNm de TH en el BO de las ratas DOCA-sal muestra valores

aumentados en la hemiporción derecha, sin observarse cambios en la izquierda. El

tratamiento con BQ-610 no modificó la expresión del mensajero en el BO izquierdo, pero si

revirtió los valores encontrados en el derecho. Nuevamente se pone en evidencia el

comportamiento asimétrico del BO. Estos resultados también manifiestan que, a nivel

transcripcional, el sistema catecolaminérgico del BO derecho se encontraría alterado en los

animales DOCA-sal y que la modulación a largo plazo del receptor ETA es capaz de modificar

~ 68 ~

esta situación.

Figura 27. Efectos del bloqueo crónico ETA sobre la expresión del ARNm de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo y derecho. a. Se grafican los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el bulbo olfatorio izquierdo de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el antagonista BQ-610 (dosis crónica: 12ng/h o 24ng/h) en el bulbo olfatorio derecho. c y d. Ejemplos de las rectas de calibración, el perfil del ciclado y la temperatura de melting tanto para β-actina como para la TH. c. Parámetros bulbo olfatorio izquierdo. Recta de β-actina: CT = -3,19*log[conc] + 16,34; eficiencia = 1,06; R2 = 0,991. Recta de TH: CT = - 3,31*log[conc] + 24,68; eficiencia = 1,00; R2 = 0,983. d. Parámetros bulbo olfatorio derecho. Recta de β-actina: CT = - 2,95*log[conc] + 16,93; eficiencia = 1,19; R2 = 0,995. Recta de TH: CT = - 3,03*log[conc] + 22,56; eficiencia = 1,14; R2 = 0,992. *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 4.

4.1.4. Resumen: Bloqueo crónico del receptor ETA.

Los resultados de la inhibición central crónica del receptor ETA en animales Nt y DOCA-

sal conscientes se resumen en la tabla 10. Por un lado, podemos decir que este tratamiento

no manifestó cambios observables en los parámetros hemodinámicos estudiados en los

~ 69 ~

animales Nt (Figuras 16-19). En estos grupos, tampoco se vio alterado el sistema

catecolaminérgico en el hipotálamo o el BO debido al tratamiento (Figuras 20-27). Esto

indicaría que el bloqueo ETA no modifica el comportamiento de estos componentes,

sugiriendo que este antagonista específico BQ-610 no tendría un efecto per sé sobre

animales en condiciones fisiológicas normales.

En los controles DOCA-sal los registros hemodinámicos resultaron como era de

esperar, encontrándose un significativo aumento de la PAS sin cambios en la FC (Figuras 16-

19). En estos animales, el sistema catecolaminérgico respondió, en líneas generales tanto

en el hipotálamo como en el BO, de manera acorde a lo observado en trabajos anteriores

[161,162,337].

Por un lado, el HA mostró una reducción en la actividad de la TH en los animales

hipertensos (Figura 20.a). Este efecto se vio respaldado por una menor expresión del ARNm,

de la enzima y por un estado de fosforilación disminuido respecto del Control Nt (Figuras 21

y 23.a). Distinto fue el caso del HP que reveló un significativo aumento en la actividad

enzimática, así como también en su expresión y fosforilación (Figuras 20.b y 22). Además,

los niveles del ARNm también se vieron incrementados (Figura 23.b). Estos resultados en el

hipotálamo de las ratas DOCA-sal muestran una menor activación de un área

simpatoinhibitoria como el HA y una mayor activación de un área simpatoexcitatoria como

el HP. En este contexto, el estado general del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo

favorecería un aumento de la descarga simpática en este modelo de HTA.

Por su parte, la inhibición crónica de los receptores ETA centrales en los animales

DOCA-sal produjo una reversión casi completa de los parámetros de la TH estudiados tanto

en el HA como en el HP llegando a valores similares a los observados en los animales Nt

(Figuras 20-23). Esta reversión tuvo como excepciones en el HA la fosforilación en la serina

31 (Figura 21) y los niveles del ARNm de la TH (Figura 23.a). Es importante destacar que lo

observado debido al bloqueo ETA a largo plazo en el HA difiere de lo advertido bajo el mismo

tratamiento realizado de manera aguda, donde el antagonista ETA no produjo

modificaciones en esta área [337]. Los resultados sugieren que existe una fuerte influencia

de los receptores ETA centrales sobre la modulación a largo plazo del sistema

catecolaminérgico del hipotálamo en condiciones patológicas como las del modelo DOCA-

sal.

~ 70 ~

EFECTOS DEL BLOQUEO CRÓNICO DEL RECEPTOR ETA

Elementos estudiados > Parámetros

Hemodinámicos Regulación de la Tirosina hidroxilasa

Tratamientos ˅

PAS FC Actividad Expresión Fosforilación

ARNm 19 31 40

HIPOTÁLAMO ANTERIOR

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (12ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (24ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓↓↓

DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h) ↓D ⁓ ↑ D ↑ D ↑ D ⁓ ↑ D ↓↓↓

DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) ↓↓D ⁓ ↑ D ↑ D ↑ D ⁓ ↑ D ↓↓↓

HIPOTÁLAMO POSTERIOR

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (12ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (24ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h) ↓D ⁓ ↓↓D ↓D ↓D ↓D ↓D ↓↓D

DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) ↓↓D ⁓ ↓↓D ↓D ↓D ↓D ↓D ↓↓D

BULBO OLFATORIO IZQUIERDO

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (12ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (24ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h) ↓D ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) ↓↓D ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

BULBO OLFATORIO DERECHO

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (12ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + BQ-610 (24ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + BQ-610 (12ng/h) ↓D ⁓ ↓↓D ↓D ↓D ⁓ ↓D ↓↓↓D

DOCA-sal + BQ-610 (24ng/h) ↓↓D ⁓ ↓↓D ↓D ↓D ↓D ↓D ↓↓↓D

Tabla 10. Resumen de los efectos del bloqueo crónico del receptor ETA. Se describen los cambios producidos debido al tratamiento a largo plazo con BQ-610 en el HA, HP, BO izquierdo y derecho de los animales Nt y DOCA-sal. Los factores estudiados son representados indicando si no hubo diferencias significativas respecto del Control Nt (⁓) o bien, si se produjeron aumentos (↑) o disminuciones (↓). La cantidad de flechas dan una idea de la amplitud del cambio observado y el subíndice D indica que la comparación es versus el Control DOCA-sal.

Por otro lado, el BO de los animales hipertensos mostró una respuesta asimétrica,

siendo la hemiporción derecha la que presentó grandes cambios, sin observarse variaciones

importantes en la izquierda. En el BO derecho se observó un aumento de todas las variables

estudiadas respecto de la regulación de la TH. El tratamiento con el antagonista ETA revirtió

este escenario a niveles similares a los hallados en los animales Nt (Figuras 24-27). Esta

respuesta asimétrica sugiere una fuerte participación de los receptores ETA centrales sobre

la modulación del sistema catecolaminérgico en el BO derecho en el modelo DOCA-sal.

~ 71 ~

Además, esto insinúa que esta área podría cumplir un papel importante en los efectos

observados en los animales hipertensos.

Conjuntamente, los efectos centrales observados en los animales hipertensos debido

a la infusión crónica de BQ-610 fueron acompañados de modificaciones en la PAS (Figuras

16 y 17). Los animales tratados durante 7 días con 12ng/h del antagonista ETA mostraron

una clara, sostenida y significativa disminución de la PAS. Además, estos valores decrecieron

aún más al duplicarse la dosis (Figuras 16 y 17). En conjunto, estos hallazgos indicarían que

los efectos centrales del bloqueo de los receptores ETA repercuten en el mantenimiento de

la PAS aumentada en el modelo DOCA-sal.

4.2. Activación crónica del receptor ETB.

Basado en los resultados obtenidos inhibiendo el receptor ETA, pensamos que la ETs

endógenas pueden estar siendo desplazadas hacia el receptor ETB y este efecto podría estar

justificando los resultados encontrados hasta aquí. De esta manera y con el objeto de

responder esta hipótesis fue que se estudió los efectos de la activación ETB sobre la

modulación a largo plazo de la transmisión noradrenérgica y el papel de esta interacción en

el desarrollo y mantenimiento de la HTA en el modelo DOCA-sal. Así, se realizó la activación

crónica ETB (IRL1620) a nivel central durante 7 días y se evaluó la respuesta del sistema

catecolaminérgico en el HA, HP, BO izquierdo y BO derecho. De igual manera que en los

experimentos de inhibición ETA, se determinó la expresión, fosforilación y actividad de la TH,

así como también los niveles de su ARNm. Además, se analizaron los efectos de la activación

ETB sobre la PAS y la FC tanto en animales Nt como DOCA-sal.

4.2.1. Parámetros hemodinámicos.

Se tomaron registros de la PAS y la FC entre las 24hs y las 144hs de activación crónica

de los receptores ETB. Se usaron como referencia los valores de PAS previo a la

administración de IRL1620 (Figura 28. - 48hs, círculo verde para los Nt, círculo rojo para los

DOCA-sal). En las ratas Nt no se encontraron diferencias significativas a lo largo de las 144hs

debido al tratamiento con el agonista (45ng/h o 90ng/h) (Figura 28). Además, como se

describió anteriormente en los resultados de inhibición ETA, los controles DOCA-sal

continuaron incrementando su PAS a lo largo de la semana alcanzando un máximo de 173

mmHg a las 144hs (Figura 28).

~ 72 ~

La activación crónica del receptor ETB produjo una importante disminución de la PAS

en los animales hipertensos. En las ratas DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) esta reducción fue

más acentuada durante las primeras 48hs, alcanzando un mínimo de 138 mmHg (a las 24hs)

y finalizando el tratamiento en 165 mmHg (Figura 28). La intensidad del efecto no se

modificó sustancialmente al administrarse el doble de la dosis de IRL1620 (90ng/h). De esta

manera no se encontraron diferencias significativas con el grupo anterior. Es así como los

animales DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) alcanzaron una PAS mínima también de 138 mmHg

a las 24hs y finalizaron las 144hs de infusión en 164 mmHg (Figura 28).

Figura 28. Modulación de la presión arterial sistólica debido a la activación crónica del receptor ETB. Se grafican los valores de la PAS (mmHg) en función del tiempo desde las 24hs hasta las 144hs de infusión crónica del agonista ETB (IRL1620). Los valores de PAS durante las 48hs previas al tratamiento sirven de referencia del punto de partida de todos los grupos experimentales. *** p < 0,001 vs Control Nt; †† p < 0,01; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 18-20 (controles), 8-10 (tratamiento IRL1620).

Analizando el área bajo la curva de los valores de PAS entre las 24hs y las 144hs, como

una manera de ver el comportamiento general de este parámetro, observamos que no hubo

modificaciones importantes entre los distintos grupos de animales Nt. Por su parte, los

controles DOCA-sal tuvieron una PAS promedio a lo largo de esa semana de 169 mmHg y

debido al tratamiento con el agonista ETB se produjo una disminución de la PAS en ambos

grupos hipertensos tratados (Figura 29). Respecto de este último punto, las ratas DOCA-sal

+ IRL1620 (45ng/h) tuvieron una PAS promedio de 150 mmHg al igual que las DOCA-sal +

IRL1620 (90ng/h). Por lo tanto, el comportamiento general de la PAS durante la semana de

tratamiento mostró una disminución de 19 mmHg en ambos grupos hipertensos que

~ 73 ~

recibieron el tratamiento comparados con el Control DOCA-sal (Figura 29). No obstante, se

encontraron algunas diferencias respecto de lo observado durante el bloqueo crónico ETA.

Por un lado, el IRL1620 produjo un descenso menor de la PAS durante toda la semana en

comparación con la inhibición con BQ-610. Además, durante la activación ETB, estas

disminuciones fueron a lo largo del tiempo cada vez más pequeñas, llegando a los últimos

días de tratamiento con valores similares a los del Control DOCA-sal. Por otro lado, cabe

remarcar que no hubo diferencias en la amplitud de la reducción de la PAS entre los dos

grupos hipertensos tratados, por lo que en principio no habría en este caso una dependencia

de la dosis (Figuras 28 y 29).

Figura 29. Presión arterial sistólica media durante la activación crónica del receptor ETB. Se describe el comportamiento general de la PAS (mmHg) durante el tratamiento con el agonista IRL1620 mediante el análisis del área bajo la curva entre las 24hs y las 144hs (figura 28). *** p < 0,001 vs Control Nt; ††† p < 0,001 vs Control DOCA-sal. Número de animales: 18-20 (controles), 8-10 (tratamiento IRL1620).

En cuanto a la FC, no se encontraron diferencias significativas a lo largo de las 144hs

de activación ETB entre los distintos tratamientos, ya sea en animales Nt como hipertensos

DOCA-sal (Figura 30). Asimismo, la activación crónica del receptor ETB tampoco produjo

cambios en la FC debido a las distintas dosis de IRL1620 aplicadas (Figura 30). Analizando el

área bajo la curva de los datos de FC entre las 24hs y las 144hs los valores promedio

estuvieron entre los 356 ± 4 BPM y los 369 ± 4 BPM (Figura 31), estando dentro del rango

de normalidad para las ratas Sprague-Dawley [365,366]. Al igual que mediante el bloqueo

ETA, la activación ETB a largo plazo no afecta el comportamiento de la FC.

~ 74 ~

Figura 30. Modulación de la frecuencia cardiaca durante la activación crónica del receptor ETB. Se grafican los valores de la FC (BPM) en función del tiempo desde las 24hs hasta las 144hs de infusión crónica del agonista ETB (IRL1620). Los valores de FC durante las 48hs previas al tratamiento sirven de referencia del punto de partida de todos los grupos experimentales. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos grupos estudiados. Número de animales: 18-20 (controles), 8-10 (tratamiento IRL1620).

Figura 31. Frecuencia cardiaca media durante la activación crónica del receptor ETB. Se describe el comportamiento general de la FC (BPM) durante el tratamiento con el agonista IRL1620 mediante el análisis del área bajo la curva entre las 24hs y las 144hs (figura 30). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos grupos estudiados. Número de animales: 18-20 (controles), 8-10 (tratamiento IRL1620).

~ 75 ~

En resumen, los datos hemodinámicos sugieren que de alguna manera los receptores

ETB centrales pueden modular en el largo plazo la PAS, sin consecuencias sobre la FC. Sin

embargo, esto ocurre de una forma menos marcada que lo observado mediante el bloqueo

crónico de los receptores ETA. Aquí también los efectos ocurren de manera selectiva en los

animales DOCA-sal, sin modificar el comportamiento de la PAS o la FC en las ratas Nt. Por lo

que, en su conjunto el sistema endotelinérgico central pareciera estar implicado en el

mantenimiento a largo plazo de la PA en este modelo de hipertensión.



Con el objetivo de estudiar los efectos de la activación a largo plazo de los receptores

ETB centrales sobre el sistema catecolaminérgico se evaluó la actividad de TH. Al igual que

durante el bloqueo crónico ETA, estos experimentos fueron realizados en el HA y el HP de

ratas Nt e hipertensas DOCA-sal, mediante el ensayo radioenzimático descripto en

Materiales y Métodos.

No hubo cambios en la actividad de la TH en el HA de los distintos grupos de animales

Nt, ya sea con o sin la administración de IRL1620 (Figura 32.a). Por el contrario, se encontró

una disminución del 42% de la actividad enzimática en los controles DOCA-sal. Esta

reducción no se modificó debido a la activación crónica ETB. Tanto para el grupo DOCA-sal +

IRL1620 (45ng/h) como para el DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) la actividad de la TH se mantuvo

un 46% y 44% por debajo de los controles Nt, respectivamente (Figura 32.a).

Al igual que en el HA, no hubo cambios en la actividad de la TH en el HP de los distintos

grupos de animales Nt. En cambio, se encontró un aumento del 56% de la actividad

enzimática en las ratas controles DOCA-sal (Figura 32.b). La administración crónica de

IRL1620 en cualquiera de sus dosis no modificó estos valores en los animales hipertensos.

El incremento respecto del Control Nt fue de 52% y 40% respectivamente (Figura 32.b).

Estos resultados muestran que la actividad de la TH está disminuida en el HA y

aumentada en el HP de los animales hipertensos. De manera preliminar, estos resultados

sugieren que el agonista ETB no ejercerían efecto alguno en el largo plazo sobre la

modulación de la actividad de la TH en animales normotensos e hipertensos DOCA-sal.

~ 76 ~

Figura 32. Efectos de la activación crónica ETB sobre la actividad de la TH en el hipotálamo anterior y posterior. a. Se grafican los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el hipotálamo anterior de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el hipotálamo posterior. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt. Número de animales: 3-5.


Se evaluaron los niveles de expresión y el estado de fosforilación de la TH mediante

WB, para estudiar si la activación a largo plazo del receptor ETB modifica este mecanismo

regulatorio del sistema catecolaminérgico. Esto se determinó en el HA y el HP de ratas Nt e

hipertensas DOCA-sal, siguiendo el protocolo de WB descripto en Materiales y Métodos.

La administración de IRL1620 en el HA de los animales Nt no alteró los niveles de

expresión de la TH total, así como tampoco sus distintas formas fosforiladas (Figura 33). En

cambio, los niveles totales de la enzima disminuyeron un 38% en los controles DOCA-sal.

Esto fue acompañado en el mismo sentido por todas las variantes fosforiladas de TH

analizadas. Además, la activación crónica ETB, no indujo cambios en los grupos DOCA-sal +

IRL1620 (45ng/h) y DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h), al ser comparados con los controles Nt

(Figura 33).

~ 77 ~

Figura 33. Efectos de la activación crónica ETB sobre la fosforilación y expresión de la TH en el hipotálamo anterior. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el hipotálamo anterior. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt. Número de animales: 5.

~ 78 ~

Figura 34. Efectos de la activación crónica ETB sobre la fosforilación y expresión de la TH en el hipotálamo posterior. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el hipotálamo posterior. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt. Número de animales: 5.

Por otro lado, los resultados en el HP también mostraron que el agonista ETB no

modificó la expresión y fosforilación de la enzima en los distintos grupos de animales Nt

~ 79 ~

(Figura 34). Sin embargo, de manera opuesta a lo observado en el HA, se encontró un

aumento del 97% en los niveles totales de la TH en los controles DOCA-sal. Por su parte, la

fosforilación en serinas 19 y 40 se incrementaron, en tanto la serina 31 no se modificó. Por

su parte, la administración de IRL1620 en los animales DOCA-sal (45ng/h o 90ng/h), no

modificó este patrón (Figura 34).

Estos resultados muestran una expresión de la TH disminuida en el HA y aumentada

en el HP de los animales DOCA-sal, acompañada por cambios acordes en el estado de

fosforilación. El tratamiento a largo plazo con el agonista ETB no alteró este comportamiento

en los animales hipertensos. Estos datos sugieren que el agonista ETB no ejercería efecto

alguno en el largo plazo sobre la regulación de la expresión y fosforilación de TH en animales

normotensos, así como tampoco en el modelo DOCA-sal.


Se evaluó si la activación crónica del receptor ETB es capaz de modificar la expresión

del ARNm de la TH en el hipotálamo de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal. Estos experimentos

fueron realizados en el HA y el HP mediante RT-PCR en tiempo real según el protocolo

descripto en Materiales y Métodos.

Los resultados mostraron que no hubo cambios en la expresión del ARNm de la TH en

los animales Nt tratados con IRL1620 al ser comparados con los controles Nt (Figura 35.a).

Sin embargo, se encontró una disminución del 73% en los controles DOCA-sal. Al igual que

en los experimentos anteriores, la activación a largo plazo de los receptores ETB centrales

no modificó la expresión del mensajero en los grupos DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) y DOCA-

sal + IRL1620 (90ng/h), manteniéndose ambos en un 75% y 66% por debajo del Control Nt,

respectivamente (Figura 35.a).

Por otro lado, el tratamiento con IRL1620 (45ng/h o 90ng/h) no modificó la expresión

del ARNm de la TH en el HP de los animales Nt al ser comparado con su control (Figura 35.b).

Además, se encontró un 241% de aumento en los controles DOCA-sal, y al igual que en el

HA de estos animales, los tratamientos con el agonista ETB no modificaron este parámetro

(Figura 35.b).

De esta manera, la expresión del ARNm de la TH en el hipotálamo de las ratas DOCA-

estuvo disminuida en la región anterior y aumentada en la posterior al ser comparados en

cada caso con los controles Nt. Al mismo tiempo, no hubo efectos debido al tratamiento con

el agonista ETB en ambas regiones hipotalámicas de los animales DOCA-sal. En principio,

~ 80 ~

estos resultados parecen indicar que la activación central crónica ETB no alteraría el

funcionamiento de este mecanismo de regulación a largo plazo de la TH.

Figura 35. Efectos de la activación crónica ETB sobre la expresión del ARNm de la TH en el hipotálamo anterior y posterior. a. Se grafican los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el hipotálamo anterior de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el hipotálamo posterior. c y d. Ejemplos de las rectas de calibración, el perfil del ciclado y la temperatura de melting tanto para β-actina como para la TH. c. Parámetros hipotálamo anterior. Recta de β-actina: CT = -2,94*log[conc] + 22,15; eficiencia = 1,19; R2 = 0,987. Recta de TH: CT = - 3,57*log[conc] + 25,53; eficiencia = 0,91; R2 = 0,989. d. Parámetros hipotálamo posterior. Recta de β-actina: CT = -2,94*log[conc] + 22,15; eficiencia = 1,19; R2 = 0,987. Recta de TH: CT = - 3,57*log[conc] + 25,53; eficiencia = 0,91; R2 = 0,989. * p < 0,05; ** p < 0,01 vs Control Nt. Número de animales: 3-4.

~ 81 ~

4.2.3. Bulbos olfatorios.


Al igual que en el hipotálamo, se investigó si la activación a largo plazo del receptor

ETB es capaz de modificar el funcionamiento del sistema catecolaminérgico en el BO de ratas

Nt e hipertensas DOCA-sal. Se evaluó la actividad de la TH en el BO izquierdo y derecho

mediante el ensayo radioenzimático descripto en Materiales y Métodos.

Por un lado, la infusión crónica de IRL1620 no produjo cambios en la actividad de la

TH en el BO izquierdo de ninguno de los grupos estudiados (Figura 36.a). De igual manera,

tampoco hubo cambios en la actividad de la TH en el BO derecho entre los grupos Nt (control

y tratados) (Figura 36.b). Sin embargo, aquí los controles DOCA-sal tuvieron un aumento de

la actividad enzimática del 40%. Asimismo, este incremento en los animales hipertensos no

se vio modificado debido a la administración del agonista ETB bajo ninguna de las dosis

(Figura 36.b).

Figura 36. Efectos de la activación crónica ETB sobre la actividad de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo y derecho. a. Se grafican los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el bulbo olfatorio izquierdo de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la actividad de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el bulbo olfatorio derecho. ** p < 0,01 vs Control Nt. Número de animales: 3-5.

Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, en los animales DOCA-sal la actividad

de la TH no se ve alterada en el BO izquierdo y se encuentra aumentada en el derecho.

~ 82 ~

Además, la activación crónica de los receptores ETB centrales no modularía la actividad a

largo plazo de la TH tanto en las ratas Nt como DOCA-sal.


Se evaluaron los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el BO de ratas Nt e

hipertensas DOCA-sal para estudiar si la activación a largo plazo del receptor ETB modifica

este mecanismo de regulación catecolaminérgica. Estos experimentos se realizaron en el BO

izquierdo y derecho por separado según el protocolo de WB descripto en Materiales y

Métodos.

La activación a largo plazo de los receptores ETB centrales no modificó los niveles de

expresión ni fosforilación de la TH en el BO izquierdo de ninguno de los grupos estudiados

(Figura 37).

Por el contrario, el BO derecho de los controles DOCA-sal mostró un aumento del 72%

en los niveles totales de la TH. Asimismo, este incremento se vio acompañado en igual

sentido por todas las fosforilaciones. En estos animales, la activación crónica ETB no tuvo

efectos sobre los valores totales de la TH ni de sus variantes fosforiladas (Figura 38).

En el BO existe una expresión de la TH aumentada en la hemiporción derecha de los

animales DOCA-sal, acompañada por cambios en el estado de fosforilación de la enzima. Por

su parte, este mecanismo de regulación de la TH en el BO izquierdo, a diferencia del derecho,

parece no responder al tratamiento DOCA-sal. Además, como se vio anteriormente y de

manera preliminar, parece que la activación a largo plazo de los receptores ETB centrales no

modularía este componente regulatorio en el BO en general.

~ 83 ~

Figura 37. Efectos de la activación crónica ETB sobre la fosforilación y expresión de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). No se observaron diferencias significativas en las distintas fosforilaciones ni en la expresión total de la TH bajo ninguno de los tratamientos. Número de animales: 5.

~ 84 ~

Figura 38. Efectos de la activación crónica ETB sobre la fosforilación y expresión de la TH en el bulbo olfatorio derecho. a. Inmunoblots representativos obtenidos mediante western blot de los niveles de expresión y fosforilación de la TH en el bulbo olfatorio derecho. Se utilizó β-actina como control de carga. b. Arriba se grafican los niveles de fosforilación en las serinas 19 (izquierda) y 31 (derecha), mientras que abajo se observa el nivel de fosforilación en la serina 40 (izquierda) y la expresión total de la enzima (derecha). * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 vs Control Nt. Número de animales: 5.

~ 85 ~


Se realizaron ensayos de RT-PCR en tiempo real para establecer si la activación a largo

plazo de los receptores ETB centrales modifica los niveles del ARNm de la TH en el BO

izquierdo y derecho de ratas Nt e hipertensas DOCA-sal.

De igual manera que en los experimentos de actividad y expresión de la TH, no hubo

cambios en la expresión del ARNm de esta enzima en el BO izquierdo de ninguno de los

grupos evaluados (Figura 39.a).

Por otro lado, si bien el tratamiento con IRL1620 (45ng/h o 90ng/h) no modificó la

expresión del ARNm de la TH en el BO derecho de los animales Nt, sí se produjo un

importante aumento del 308% en el Control DOCA-sal. De manera interesante, este

incremento se vio revertido solamente por la administración de IRL1620 en la dosis de

90ng/h (Figura 39.b).

Como era de esperar, la expresión del ARNm de la TH en el BO de las ratas DOCA-sal

muestra valores aumentados en la hemiporción derecha, al ser comparado con el Control

Nt, sin cambios en la región izquierda. El tratamiento con IRL1620 no modificó la expresión

del mensajero en el BO izquierdo, pero llamativamente, sí logró revertir los valores

encontrados en el BO derecho de estos animales. Esto ocurrió sólo al administrarse una

dosis de 90ng/h. Estos resultados muestran que, a nivel transcripcional, el sistema

catecolaminérgico del BO derecho se encontraría alterado en los animales DOCA-sal.

Asimismo, sugieren que, bajo ciertas condiciones, la modulación a largo plazo de los

receptores ETB centrales podría modificar este parámetro.

~ 86 ~

Figura 39. Efectos de la activación crónica ETB sobre la expresión del ARNm de la TH en el bulbo olfatorio izquierdo y derecho. a. Se grafican los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el bulbo olfatorio izquierdo de animales normotensos e hipertensos DOCA-sal. b. Se observan los cambios en la expresión del ARNm de la TH debido al tratamiento con el agonista IRL1620 (dosis crónica: 45ng/h o 90ng/h) en el bulbo olfatorio derecho. c y d. Ejemplos de las rectas de calibración, el perfil del ciclado y la temperatura de melting tanto para β-actina como para la TH. c. Parámetros bulbo olfatorio izquierdo. Recta de β-actina: CT = -2,95*log[conc] + 17,69; eficiencia = 1,18; R2 = 0,995. Recta de TH: CT = - 2,98*log[conc] + 25,02; eficiencia = 1,17; R2 = 0,989. d. Parámetros bulbo olfatorio derecho. Recta de β-actina: CT = -2,95*log[conc] + 17,69; eficiencia = 1,18; R2 = 0,995. Recta de TH: CT = - 2,98*log[conc] + 25,02; eficiencia = 1,17; R2 = 0,989. * p < 0,05 vs Control Nt; † p < 0,05 vs Control DOCA-sal; ‡ p < 0,05 vs DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h). Número de animales: 3-4.

4.2.4. Resumen: Activación crónica del receptor ETB.

Los resultados de la activación central crónica de los receptores ETB en animales Nt y

DOCA-sal conscientes se resumen en la tabla 11. Podemos decir que los animales Nt no

muestran cambios en los parámetros hemodinámicos estudiados debido a este tratamiento

~ 87 ~

(Figuras 28-31). En estos grupos, tampoco se vio alterado el sistema catecolaminérgico en

el hipotálamo o el BO debido al tratamiento (Figuras 32-39). Esto indica que la

administración a largo plazo de IRL1620 no alteraría el comportamiento de estos

mecanismos, sugiriendo que este agonista específico ETB (al igual que el bloqueo ETA) no

tendría un efecto per sé sobre animales normotensos.

En los controles DOCA-sal se encontró un aumento de la PAS sin cambios en la FC

(Figuras 28-31). El tratamiento crónico con IRL1620 produjo una reducción global de la PAS

en los animales DOCA, sin afectar la FC.

El HA y el HP de los animales DOCA-sal respondió de forma similar a lo observado en

los experimentos crónicos con el antagonista ETA. Sin embargo, la activación crónica de los

receptores ETB centrales en estos animales hipertensos no modificó los parámetros de la TH

estudiados tanto en el HA como en el HP manteniéndose en valores similares a los

observados en los controles hipertensos (Figuras 32-35). Es importante destacar que lo

observado debido a la activación ETB a largo plazo en el HA concuerda con lo demostrado

bajo el mismo tratamiento realizado de manera aguda, donde el agonista ETB tampoco

produjo modificaciones en esta área de los animales DOCA-sal [337]. Hasta el momento, los

resultados sugieren que en condiciones patológicas como las del modelo DOCA-sal, el

sistema catecolaminérgico hipotalámico estaría influenciado en el largo plazo en mayor

medida por el receptor ETA. Mientras tanto, los efectos de la activación crónica de los

receptores ETB centrales no son claros.

Por otro lado, el BO de los animales hipertensos mostró la misma respuesta asimétrica

descripta anteriormente. En el BO derecho de las ratas DOCA-sal se observó un aumento de

todas las variables estudiadas respecto de la regulación de la TH, pero el tratamiento con el

agonista ETB no modificó esta situación (Figuras 36-39). La única excepción se presentó en

el estudio de los niveles del ARNm de la TH, allí la activación a largo plazo mediante del

receptor ETB (IRL1620 90ng/h) disminuyó los niveles aumentados en el BO derecho. Sin

embargo, al igual que en el hipotálamo, hasta el momento podemos decir que la ausencia

de respuesta durante la activación crónica ETB parece indicar que sería el receptor ETA quien

tiene un papel preponderante en la modulación del sistema catecolaminérgico en el BO

derecho de las ratas DOCA-sal.

Los animales tratados durante 7 días con cualquiera de las dosis de IRL1620 tuvieron

una significativa disminución de la PAS (sin cambios en la FC), pero por algún motivo esta

situación no se sostuvo en el tiempo (Figuras 28 y 29). Aun así, esto muestra que la

~ 88 ~

activación de los receptores ETB centrales tiene un efecto en la modulación de la PAS en el

modelo DOCA-sal.

EFECTOS DEL BLOQUEO CRÓNICO DEL RECEPTOR ETB

Elementos estudiados > Parámetros

Hemodinámicos Regulación de la Tirosina hidroxilasa

Tratamientos ˅

PAS FC Actividad Expresión Fosforilación

ARNm 19 31 40

HIPOTÁLAMO ANTERIOR

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (45ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (90ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↓↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓↓↓

DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↓↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓↓↓

DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↓↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓↓↓

HIPOTÁLAMO POSTERIOR

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (45ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (90ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ⁓ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ⁓ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ⁓ ↑ ↑↑↑

BULBO OLFATORIO IZQUIERDO

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (45ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (90ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

BULBO OLFATORIO DERECHO

Control Nt ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (45ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Nt + IRL1620 (90ng/h) ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓ ⁓

Control DOCA-sal ↑↑↑ ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + IRL1620 (45ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑↑

DOCA-sal + IRL1620 (90ng/h) ↓/⁓ D ⁓ ↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓↓↓D

Tabla 11. Resumen de los efectos de la activación crónica del receptor ETB. Se describen los cambios producidos debido al tratamiento a largo plazo con IRL1620 en el HA, HP, BO izquierdo y derecho de los animales Nt y DOCA-sal. Los factores estudiados son representados indicando si no hubo diferencias significativas respecto del Control Nt (⁓) o bien, si se produjeron aumentos (↑) o disminuciones (↓). La cantidad de flechas dan una idea de la amplitud del cambio observado y el subíndice D indica que la comparación es versus el Control DOCA-sal. En los animales DOCA-sal tratados con IRL1620 se indica que hubo una disminución de la PAS, pero que al final del tratamiento los valores obtenidos fueron similares a los del control DOCA-sal.

~ 89 ~

5. Discusión

Durante la introducción al presente trabajo de tesis doctoral hemos descripto las

características y la importancia de la HTA. Su elevada prevalencia a escala global junto con

su avance progresivo y silencioso, que se manifiesta mediante el daño ocasionado a largo

plazo en los órganos blanco, son los factores claves que mantienen una alta tasa de

mortalidad. Estas muertes ocurren principalmente por accidentes cerebrovasculares,

renales o cardiovasculares. Esta enfermedad puede originarse a través de múltiples factores

interrelacionados lo cual la convierte en una patología muy compleja para su estudio,

prevención y tratamiento. Si bien la HTA es estudiada desde hace muchas décadas por una

gran cantidad de grupos de investigación, aún los mecanismos subyacentes a su génesis,

desarrollo y mantenimiento siguen siendo poco claros. Desde hace casi 20 años nuestro

laboratorio viene investigando el papel del sistema endotelinérgico central en la regulación

de la fisiología cardiovascular y en la HTA. Como hemos visto, mediante experimentos ex-

vivo encontramos que este sistema interactúa con el catecolaminérgico en tejidos

fuertemente relacionados con la regulación central de la PA como el HA y el HP, así como

también en el BO de ratas normotensas [211,212,259–261,266,286,287,308].

Posteriormente, esta interacción fue evaluada en un modelo de HTA sal dependiente como

el DOCA-sal [161,162]. En esa oportunidad, nuestro laboratorio encontró diferencias

importantes en los distintos pasos de la transmisión noradrenérgica en estas áreas del SNC,

al ser comparadas con las de animales normotensos. Durante los últimos años, a través del

trabajo de la Dra. Julia Guil [337], se investigó el papel de la interacción entre sistema

endotelinérgico endógeno central y el catecolaminérgico en relación con el desarrollo de

HTA. De esta forma, mediante la administración aguda ICV del antagonista ETA BQ-610 o del

agonista ETB IRL1620 en ratas anestesiadas se estudió la participación de estos receptores

tanto en animales normotensos como DOCA-sal. Por un lado, se evaluó la distribución de

ambos receptores y los efectos agudos de los tratamientos sobre el sistema

catecolaminérgico en el HA, HP y el BO. En paralelo, se indagó sobre las consecuencias de

estos manipuleos experimentales sobre la PA y la FC. Los experimentos a corto plazo

sentaron las bases para poder realizar los experimentos crónicos, en animales conscientes,

presentados en este trabajo de tesis. Los estudios a largo plazo nos permiten investigar las

implicancias de los receptores de las ETs sobre la regulación del sistema catecolaminérgico

~ 90 ~

en estas importantes áreas del SNC. Además, podemos evaluar comparativamente si el

bloqueo ETA o la activación ETB de manera crónica presenta diferencias con lo observado a

corto plazo. A su vez, sirven para estudiar las consecuencias de estos tratamientos sobre la

regulación central de la PA en la hipertensión DOCA-sal.

A continuación, discutiremos este modelo de HTA sal dependiente en comparación con

estados fisiológicos normales en cuanto a sus consecuencias sobre la PA y el estado basal del

sistema catecolaminérgico en el HA, HP y el BO. Posteriormente, nos adentraremos en las

implicancias de los receptores de las ETs y los efectos a largo plazo de los tratamientos.

5.1. El modelo DOCA-sal.

El modelo DOCA-sal fue llevado a cabo mediante la administración subcutánea de

DOCA y el agregado de 1 NaCl en el agua de bebida. Como se mencionó en la introducción,

el modelo sería dependiente de la sal desde el comienzo del tratamiento y la DOCA actuaría

aumentando el apetito del animal por el sodio facilitando el aumento de la PA [149,177–

180]. En este modelo, se demostró que los niveles de sodio plasmáticos y en el LCR se

encuentran aumentados [157,158]. Además, el bloqueo central de canales de este catión

reduce la PA en estos animales hipertensos [181]. Es importante destacar que la ET-3

modula la sensibilidad de estos canales en el órgano circunventricular, una de las regiones

del SNC más relacionadas con la detección de sodio, lo cual de alguna manera sugiere la

participación del sistema endotelinérgico [182]. Además, se vio que para mantener la

sensibilidad a la sal en este modelo de HTA se requiere también de una menor actividad de

neuronas catecolaminérgicas en el HA [189].

Relacionándolo con la HTA en humanos, hemos mencionado que el consumo elevado

de sodio es uno de los factores importantes para el desarrollo de HTA, destacando que gran

parte de la población mundial supera por amplio margen el consumo diario recomendado

[1,21–23]. Se estima que el 26% de la población normotensa y el 51% de la población

hipertensa es sensible a la sal, lo que indica que este elemento podría ser un indicador clave

en las personas que están predispuestas al desarrollo de HTA [149]. Se demostró que dietas

reducidas en sodio, acompañadas de un plan alimentación acorde, disminuyen la PA tanto

en pacientes normotensos como hipertensos [24–27]. Por el contrario, la ingesta elevada de

este ion y el consecuente aumento de la PA irían acompañados de alteraciones a nivel

noradrenérgico [30,31]. En el modelo DOCA-sal el incremento de los niveles de sodio

conlleva a la retención de agua y esto a un aumento de la volemia con consecuencias sobre

~ 91 ~

los valores de PA. Cabe mencionar que en estos animales la retención de sodio se ve

facilitada por un tono simpático renal exacerbado [184]. Estas son algunas de las razones

por lo cual elegimos estudiar los mecanismos implicados en el aumento de la PA en este

modelo, ya que es justamente la descarga simpática uno de los factores que podrían tener

mayor relevancia en el desarrollo y mantenimiento de la HTA sal dependiente.

En este sentido, hemos visto que la regulación rápida de la PA por parte del sistema

nervioso depende de los mecanismos de feedback (como por ejemplo el barorreflejo) y

anticipación (comandos centrales superiores) teniendo como sistema efector el balance

autonómico [36]. La resultante del accionar de estos mecanismos se observa en la

modulación de la descarga simpática y/o parasimpática. Se ha reportado una descarga

simpática aumentada en el modelo DOCA-sal donde la actividad del sistema

catecolaminérgico a nivel periférico también se vio incrementada principalmente debido a

un aumento de la ET-1 circulante [75,184,185]. A nivel central, se describió que el área AV3V

de Brody es necesaria para el mantenimiento de los valores elevados de PA en este modelo

[53,72,186,187] y la activación del LC los incrementa aún más [93]. Asimismo, se reportó

que el hipotálamo también aumentaría la descarga simpática y la respuesta vasopresora a

nivel periférico lo que sería indispensable para el aumento de la PA [188].

El aumento de la PA en el modelo DOCA-sal ocurre en dos fases. Durante los primeros

días ocurre un aumento inicial y luego un segundo incremento que se mantiene durante

semanas [149]. Durante la primera parte de la tercera semana de tratamiento los animales

presentan una PA significativamente superior pudiendo ser considerados como hipertensos

[53,154,157,184,340,367,368]. En nuestro laboratorio el tratamiento durante 5 semanas

permitió alcanzar valores de PAS cercanos a los 160mmHg [161,162] y en el presente trabajo

los controles DOCA-sal alcanzaron un máximo de 173 mmHg al final del tratamiento.

En cuanto a la FC, los trabajos publicados son contradictorios. Por un lado algunos

autores indican que no hay diferencias en la FC de las ratas DOCA-sal al ser comparadas con

las normotensas [157,340,368], mientras que otros aseguran que existe un aumento leve,

pero significativo en favor de los hipertensos [369]. En este aspecto, nosotros no

encontramos diferencias sustanciales entre los controles Nt y DOCA-sal a lo largo de todo el

tratamiento. Es importante destacar que en el modelo DOCA-sal el barorreflejo se

encuentra alterado, inclusive antes del aumento de la PAS pudiendo ser esto una de las

razones de la falta de respuestas significativas en la FC [149,370–373].

~ 92 ~

El modelo también se caracteriza por el desarrollo de hipertrofia del VI. El IHVI en

trabajos publicados anteriormente marca un incremento del 25-36% en los animales DOCA-

sal comparados con los normotensos [161,162,340,368]. Nuestros resultados están de

acuerdo con esto, dado que obtuvimos un 42% de aumento en las ratas hipertensas.

Como hemos mencionado anteriormente, otro factor importante en este modelo de

hipertensión sal dependiente son las ETs y sus receptores. La distribución del sistema

endotelinérgico a lo largo de todo el cuerpo, incluido el SNC le confiere la capacidad

participar en la regulación muchas funciones fisiológicas [113,244–246,304–306]. A nivel

periférico, una de las principales es la de la regulación del tono vascular. Allí pueden

provocar vasoconstricción mediante la activación de ETA/ETB en las células de la musculatura

vascular o vasodilatación mediante ETB en las células endoteliales [154,168,244,247,321].

En el modelo DOCA-sal se observó que la ET-1 circulante está aumentada, así como también

la actividad de ambos receptores demostrando que juegan un papel relevante en el tono

vascular y el aumento de la PA de manera crónica en este modelo [33,150,152,167–169]. En

virtud de ello se ha reportado que la inhibición periférica de los receptores de las ETs

disminuye la PA [53,149,150,152,169,170,281,294,320].

Por su parte, a nivel del SNC el sistema endotelinérgico se encuentra presente en

diversas áreas, entre ellas las estudiadas en el presente trabajo de tesis

[113,128,129,131,265,305,307]. Muchos trabajos avalan el papel de las ETs como moléculas

neuromoduladoras, poniendo especial énfasis en su interacción con la transmisión

catecolaminérgica a través del accionar tanto de ETA como de ETB

[33,68,113,123,161,162,211,212,259–261,266,286,287,308]. Por lo tanto, no sería ilógico

pensar que los cambios a nivel cardiovascular tal vez ocurran a través de este mecanismo.

En este sentido, se reportó que la administración central de ETs produce un aumento de la

descarga simpática, de los niveles plasmáticos de las catecolaminas, de la respuesta

vasopresora y de la de PA [113,281,304,309–318]. Además, estos efectos pudieron ser

revertidos mediante la inhibición ganglionar [113] o de los receptores ETA en el área

periacueductal [171]. Como hemos anticipado anteriormente, nuestro grupo ha

demostrado que las ETs centrales modulan los distintos pasos de la transmisión

noradrenérgica en el HA, HP y el BO de ratas normotensas e hipertensas DOCA-sal,

principalmente a través de los receptores ETA y ETB [161,162,211,212,259–

261,266,282,286,287,308]. No obstante, antes de adentrarnos en el rol del sistema

~ 93 ~

endotelinérgico endógeno central, es importante entender el estado basal de la actividad

catecolaminérgica del hipotálamo y el BO en los animales DOCA-sal.

5.1.1. El sistema catecolaminérgico hipotalámico.

Previamente describimos al hipotálamo como una de las regiones del SNC

fundamentales para la regulación de la función cardiovascular y que además presenta

grandes cambios funcionales y neuroquímicos en animales hipertensos

[14,33,34,47,53,67,86,94–96]. También se ha demostrado que el hipotálamo es

crucial en la modulación central de la descarga simpática ante la ingesta crónica de

cantidades elevadas de sal [98]. Por estas razones fue elegido como una de las áreas

de estudio en nuestro laboratorio.

Hace algunos años encontramos que el HA de las ratas DOCA-sal presenta una

actividad catecolaminérgica disminuida en comparación con la misma área en

animales normotensos (Abramoff, resultados no publicados). Los resultados hallados

en el presente trabajo de tesis pudieron corroborar esta situación mostrando una

disminución de la actividad enzimática de la TH, respaldada por una menor expresión

y fosforilación. A esto podemos sumarle que los niveles del ARNm de la TH también

son menores en los animales DOCA-sal en comparación con los controles Nt. Estas

evidencias indican claramente una alteración del sistema catecolaminérgico en el HA,

sugiriendo una menor actividad simpatoinhibitoria de esta área, lo cual podría

contribuir a una descarga simpática aumentada en este modelo de hipertensión sal

dependiente.

Por otro lado, nuestro laboratorio también demostró una mayor actividad

catecolaminérgica en el HP de las ratas DOCA-sal comparadas con las normotensas

[162]. Además, esto tuvo consecuencias sobre la transmisión noradrenérgica dado

que se halló una mayor liberación y captación de NA acompañada por un aumento en

la expresión y actividad del NET [162]. Es así como los resultados en el presente

trabajo también concuerdan con este escenario en el HP de los controles hipertensos.

De modo que, hallamos un aumento en la expresión y los niveles de fosforilación de

la TH en esta área, acompañadas por una mayor actividad enzimática. Al mismo

tiempo, y en concordancia con lo encontrado anteriormente [337], también

observamos que allí los niveles de expresión del ARNm de la TH estaban

incrementados. Esto pone en evidencia una alteración del sistema catecolaminérgico,

~ 94 ~

ahora en el HP, sugiriendo que habría una mayor actividad simpatoexcitatoria de esta

área lo cual, junto con lo observado en el HA, podría contribuir a una descarga

simpática aumentada en la hipertensión DOCA-sal.

5.1.2. El sistema catecolaminérgico en el bulbo olfatorio.

A pesar de presentar numerosas conexiones con áreas del SNC implicadas en la

regulación de la función cardiovascular el BO ha sido una región poco estudiada en

este aspecto [105,110,112–115]. Trabajos previos nos llevan a plantear que el BO

podría tener un papel relevante en situaciones donde la función cardiovascular está

alterada, como es el caso de la HTA. Por estas razones en nuestro laboratorio

decidimos estudiar el BO como una probable área relacionada con el desarrollo y

mantenimiento de la HTA en el modelo DOCA-sal.

Hemos mencionado que una publicación de nuestro grupo de investigación

demostró que en el BO de los animales DOCA-sal existe un comportamiento

asimétrico entre la hemiporción izquierda y derecha, siendo esta la razón principal

por la cual en este trabajo de Tesis Doctoral se los estudió por separado. De modo

que, en los animales normotensos se observó que el BO izquierdo y derecho no

presentan diferencias en cuanto a la expresión, fosforilación y actividad de la TH, así

como tampoco en la liberación de NA [161]. En contraste, la hipertensión DOCA-sal

provocó un aumento de la actividad catecolaminérgica en el BO derecho [161]. Estos

resultados fueron reconfirmados posteriormente en nuestro laboratorio a través de

los trabajos de la Dra. Guil [337], a los cuales se le sumó un dato adicional que fue un

aumento en los niveles de expresión del ARNm de la TH en las ratas hipertensas. No

obstante, es importante remarcar que en estos últimos experimentos el BO fue

estudiado entero, como un tejido único, por lo tanto no podemos saber si los

resultados obtenidos presentaron diferencias entre ambas hemiporciones [337].

Todos estos hallazgos coinciden con lo mostrado en el presente trabajo de tesis,

donde encontramos que en el BO derecho de los animales DOCA-sal se produjo un

aumento de la expresión de la TH, su fosforilación en todas las serinas estudiadas y

consecuentemente en su actividad enzimática. Asimismo, también obtuvimos un

aumento de los niveles transcripcionales de ARNm de la TH. Por el contrario, todas

estas variables no se vieron modificadas debido al tratamiento DOCA-sal en el BO

~ 95 ~

izquierdo, volviendo a poner en evidencia la asimetría funcional observada en trabajos

anteriores.

Por lo tanto, estas evidencias exponen una alteración del sistema

catecolaminérgico en el BO de los animales hipertensos, principalmente en la región

derecha. Teniendo en cuenta las relaciones que esta área tiene con los distintos

núcleos del SNC antes nombrados, podemos pensar que el BO también podría

contribuir al desbalance autonómico a favor de una descarga simpática incrementada

en la hipertensión DOCA-sal.

Hasta aquí, hemos delimitado las diferencias entre las ratas en condiciones fisiológicas

normales y las alteraciones producidas por la hipertensión DOCA-sal, tanto a nivel

hemodinámico como en las regiones estudiadas del SNC. En conjunto y de manera

resumida, dijimos que este modelo de HTA sal dependiente provoca un aumento sostenido

de la PAS, sin cambios en la FC, junto con el desarrollo de hipertrofia del VI. Además,

modifica el estado del sistema catecolaminérgico central, al menos en el HA, HP y el BO

derecho de estos animales. En principio, podríamos decir que existe un aumento de la

actividad noradrenérgica en el HP y el BO derecho, acompañado de una disminución en el

HA. Esta situación llevaría a una descarga simpática aumentada lo cual sería un factor crucial

en el mantenimiento de la PAS en las ratas DOCA-sal.

Es pertinente decir que estos resultados no son novedosos, dado que como se

describió a lo largo del texto fueron estudiados con anterioridad, principalmente en nuestro

laboratorio. Sin embargo, la confirmación de estos nos sirve como bases sólidas para

analizar las consecuencias derivadas del bloqueo central de los receptores ETA o la activación

ETB a largo plazo. De esta manera, podremos obtener conclusiones interesantes respecto de

la implicancia del sistema endotelinérgico central en el desarrollo y mantenimiento de la

HTA DOCA-sal.

5.2. Implicancias de los receptores de las endotelinas.

Hemos repasado diversos trabajos avalando la hipótesis de que en patologías como

la HTA el sistema endotelinérgico podría estar alterado [33,244,245,257]. Es interesante

remarcar que se observó que en diferentes modelos animales de hipertensión (DOCA-sal,

SHR-SP, Dahl sensibles, Goldblatt 1, inducido por angiotensina) este sistema está up-

regulado, mientras que en otros no (SHR, Goldblatt II o inducida por L-NAME) [374–380].

~ 96 ~

Además, como mencionamos anteriormente, la administración central de ETs produce

cambios en la descarga simpática, incrementan los niveles plasmáticos de catecolaminas,

inducen vasoconstricción y aumentan la PA [113,281,304,309–318]. Asimismo, algunos

autores sugieren que las ETs modulan el tono vascular tanto en condiciones fisiológicas

como fisiopatológicas también a largo plazo [169,281,294,320]. En este sentido, el papel

neuromodulador de las ETs centrales parece ser ejercido, al menos en parte, mediante la

interacción con el sistema catecolaminérgico en áreas como el HA, HP y el BO. Por eso

resulta interesante pensar que los cambios a nivel cardiovascular observados en la

hipertensión DOCA-sal probablemente podrían ser desarrollados y mantenidos a lo largo del

tiempo a través de la interacción entre estos sistemas a nivel central.

Durante los últimos años nos abocamos a investigar el papel de los receptores ETA y

ETB en este modelo de HTA sal dependiente. Como explicamos en la introducción estos

receptores desencadenan múltiples cascadas de señalización con efectos principalmente en

la fisiología endocrina, neuroendocrina, el balance hidrosalino y la fisiología cardiovascular

y renal [113,244,245,247,252,256,281,282]. Sin embargo, aún no se conocen las

implicancias a largo plazo de la modulación central de ETA y ETB en la regulación de la función

cardiovascular, tanto en estados normales como patológicos. Por estas razones, y además

teniendo en cuenta que la mayoría de nuestros trabajos fueron realizados ex-vivo,

decidimos investigar los efectos de la inhibición de los receptores ETA centrales de manera

crónica en ratas normotensas e hipertensas DOCA-sal conscientes. Asimismo, evaluamos si

la activación de los receptores ETB centrales presentan un comportamiento similar a la de

los receptores ETA. A continuación, se describen las consecuencias de estos tratamientos

sobre el sistema catecolaminérgico en el hipotálamo y el BO, así como también sus efectos

sobre la PAS y la FC.


Inicialmente decidimos administrar de manera crónica un antagonista del receptor

ETA (BQ-610) dado que, de acuerdo a la bibliografía, sería el que presenta mayor relevancia

en la respuesta presora producida por las ETs centrales [171,381–384]. Esto surge de

diferentes publicaciones donde se investigaron los efectos de administrar, tanto central

como periféricamente, antagonistas específicos ETA [171,349,385–387]. Así, se demostró

que un bloqueante ETA, el FR139317, infundido en el área gris periacueductal de ratas

hipertensas DOCA-sal disminuye la PA [171]. Lo mismo se logró con un antagonista mixto

~ 97 ~

(ETA/ETB) pero no por uno específico ETB (BQ-788), lo cual llevó a pensar que los receptores

ETA resultaban esenciales en este modelo de HTA [171]. También se comprobó que la

administración de ET-1 en esta área elevaba la PA a través de un mecanismo dependiente

del sistema catecolaminérgico [388]. En otros estudios se vio que la administración de un

antagonista ETA junto con ET-1 en la misma región no ejercía respuesta presora, lo que

demostraba que este efecto dependía de la estimulación del receptor ETA [349,389].

Asimismo, se observó que la infusión de ET-1 en el NPV estimulaba el receptor ETA y llevaba

a un aumento de la PA junto con una mayor actividad de la descarga simpática renal [390].

Además, se demostró que la administración ICV de Sarafotoxina 6b (potente agonista

mixto), produce un aumento transitorio de la PA a través de la activación del sistema

nervioso simpático [391,392]. Estos estudios demuestran que la activación central del

receptor ETA es esencial en modelos de HTA que dependen de la elevación de ET-1 o cuando

se aumenta la PA por la administración de ETs [393].

En el presente trabajo encontramos una importante respuesta al bloqueante BQ-610

en el largo plazo, principalmente en los animales DOCA-sal. Recordemos que los primeros

indicios de una participación del sistema endotelinérgico central en la modulación

catecolaminérgica y en la hipertensión DOCA-sal fueron reportados por nuestro laboratorio.

Allí observamos que la incubación del HA de animales normotensos con ETs (ET-1 y ET-3) a

corto y mediano/largo plazo (30 minutos y 360 minutos respectivamente) disminuye la

actividad, expresión y fosforilación en las serinas 19 y 40 (sin cambios en la serina 31) de la

TH [259,287]. Estos efectos fueron acompañados por una menor liberación y mayor

recaptación de NA [286,287,308]. De manera interesante, esos resultados en el HA de

animales normotensos fueron similares a los observados en los animales DOCA-sal sin la

aplicación exógena de ETs (Abramoff y col, resultados no publicados), sugiriendo que este

mecanismo podría participar en el origen de la HTA en este modelo. Así, la inhibición crónica

de los receptores ETA centrales de alguna manera concuerda con este comportamiento, ya

que en el HA de los animales hipertensos tratados con BQ-610 (12ng/h o 24ng/h) hay una

reversión en la expresión total de la TH y la fosforilación en las serinas 19 y 40 respecto de

la disminución encontrada en los controles DOCA-sal. Esta reversión permitió alcanzar

valores similares a los hallados en los controles Nt. Como se mencionó anteriormente, un

aumento de estas modificaciones postraduccionales son indicadores de una mayor

actividad enzimática. De hecho, también se encontró una reversión en la actividad de la TH

en estos experimentos. Estos resultados coinciden con los observados previamente

~ 98 ~

mediante el bloqueo agudo del receptor ETA (1 hora), donde se vio que los valores de estos

parámetros en los animales tratados tuvieron niveles comparables con los controles Nt

[337]. No obstante, diferente es lo que sucede con los niveles del ARNm de TH, dado que

ninguno de los tratamientos crónicos modificó la baja expresión encontrada en los animales

DOCA-sal. De acuerdo con esto, en el corto plazo tampoco hubo efectos del tratamiento con

BQ-610 sobre el estado del mensajero de TH en estos animales [337], sugiriendo que los

receptores ETA centrales no alterarían el sistema catecolaminérgico en el HA a nivel

transcripcional.

De manera complementaria y dado que se ha descripto que los receptores ETA y ETB

suelen presentar efectos antagónicos [244], decidimos estudiar los efectos de la activación

de los receptores ETB centrales mediante la infusión crónica de IRL1620. En virtud de ello,

nos propusimos determinar si este agonista puede ejercer una respuesta similar al bloqueo

ETA. Además, es pertinente remarcar que no utilizamos un agonista específico ETA porque

hasta el momento no existe. Tampoco usamos un antagonista ETB dado que, si el objetivo

último sería buscar alguna utilidad terapéutica para el uso de estas drogas en una patología

como la HTA, en principio no tendría sentido utilizar un agente que puede resultar en un

aumento de la PA adicional en los animales hipertensos.

En 1995 Rebello y col. demostraron que la administración ICV de IRL1620 durante 30

minutos en animales normotensos no generaba cambios en la PA o la FC sugiriendo que no

habría un efecto propio de la droga cuando es aplicada en condiciones fisiológicas normales

[391]. Además, se describió que el uso de agonistas específicos ETB podrían presentar

efectos beneficiosos en el tratamiento de algunas patologías [245,254,394]. En este sentido,

algunos trabajos han demostrado que son útiles en la regeneración neuronal y vascular en

casos como el infarto isquémico cerebral [348,395,396]. Asimismo, se encontró que el

IRL1620 mejoraría las habilidades cognitivas en algunos modelos animales de enfermedades

neurodegenerativas como por ejemplo el Alzheimer [348,396]. También se vio que la

estimulación de los receptores ETB periféricos en animales hipertensos producen una

respuesta vasodilatadora mediada por el ON facilitando la eliminación renal de sodio.

Contábamos con que nuestro laboratorio había demostrado que la aplicación ex-vivo

y a corto plazo de ETs en el HA de ratas normotensas disminuye la liberación de NA, así como

también la expresión, fosforilación y actividad de la TH a través del receptor ETB y activando

las vías del ON, la PKG y al receptor GABA-A [211,259,282,286,287]. De manera similar,

vimos que el HA de las ratas DOCA-sal también presentaba una leve disminución de estos

~ 99 ~

componentes en comparación con los animales normotensos (Abramoff, resultados no

publicados). Por su parte, el tratamiento agudo con IRL1620 en los animales hipertensos

solamente había mostrado un incremento en la fosforilación de la serina 40 de la TH, pero

esto no afectó su actividad enzimática [337]. Sin embargo, la activación crónica ETB (45ng/h

o 90ng/h) parece no provocar cambios en ninguno de los parámetros estudiados de la TH,

dado que el tratamiento a largo plazo no alteró las disminuciones observadas en el HA de

los animales hipertensos.

En conjunto, todos estos resultados podrían indicar que a través de los receptores ETA

centrales se modularía el sistema catecolaminérgico en el HA de los animales hipertensos

en el largo plazo, alterando la expresión y fosforilación de la TH lo que induciría cambios en

su actividad enzimática. Sin embargo, ninguno de los receptores parece tener influencia a

nivel transcripcional en esta área. De esta forma el mantenimiento a largo plazo de una

menor actividad simpatoinhibitoria del HA en la HTA DOCA-sal se debería principalmente a

la activación central del receptor ETA. Por su parte, el estímulo ETB reactivaría levemente

esta área simpatoinhibitoria de manera aguda, mientras que no así a largo plazo.

Por otro lado, en el HP las evidencias marcan un comportamiento completamente

diferente. Previamente reportamos que la incubación ex-vivo del HP de animales

normotensos con ETs a corto plazo (30 minutos) provoca una disminución temporal en la

fosforilación y actividad de la TH, sin cambios en la expresión de esta. Sin embargo, a los 360

minutos este fenómeno se revertía culminando en un aumento de la expresión y

fosforilación de la enzima a través de mecanismos que involucraban a los receptores ETA y

ETB [211,259]. Esto también producía una mayor liberación y menor recaptación de NA

debido a la incubación con ETs mediante la participación del receptor ETB, lo cual indicaba

por un lado una mayor descarga noradrenérgica en esta área y por el otro una menor

inhibición por feedback negativo de la TH [266,308]. Estos resultados en el HP de animales

normotensos también fueron similares a los observados endógenamente en los animales

DOCA-sal sin la aplicación exógena de ETs [162]. Es más, cuando se incubó el HP de los

animales hipertensos con estos neuropéptidos se logró un incremento aún mayor de la

actividad catecolaminérgica en general y un aumento de la descarga noradrenérgica [162].

En el presente trabajo, los resultados obtenidos mediante la inhibición a largo plazo

del receptor ETA de alguna manera también concuerdan con este comportamiento, ya que

en el HP de los animales hipertensos tratados con BQ-610 (12ng/h o 24ng/h) hay una

reversión en la expresión total de la TH y la fosforilación en las serinas 19, 31 y 40 respecto

~ 100 ~

del aumento observado en los controles DOCA-sal llegando a valores comparables con los

controles Nt. También esto se vio reflejado como una reversión en la actividad de la TH,

coincidiendo parcialmente con lo observado mediante el bloqueo ETA de manera aguda (1

hora), donde se observó que estos parámetros también disminuyeron respecto del control

DOCA-sal. Además, en ese caso esto correlacionaba con un incremento en la expresión del

receptor ETA y con una mayor colocalización ETA/TH [337]. Sin embargo, los niveles de

expresión de la TH en el HP de los animales hipertensos solamente pudieron ser revertidos

mediante el bloqueo del receptor ETA a largo plazo, ya que a corto plazo se mantuvieron

aumentados [337]. Además, debido al tratamiento crónico con el antagonista ETA (12ng/h o

24ng/h) se observó una disminución significativa de la expresión del ARNm de la TH que sin

embargo no alcanzó para ser equiparada con la encontrada en los controles Nt. Este

resultado también fue similar a lo observado a corto plazo donde los niveles del mensajero

estuvieron en un valor intermedio entre los hallados en animales normotensos y DOCA-sal

sin tratar [337].

En cuanto a la activación crónica ETB en el HP, al igual que en el HA, no produjo

cambios en ninguno los parámetros estudiados de la TH, dado que el tratamiento a largo

plazo no alteró los incrementos observados en el HP de los animales hipertensos. Esto

resulta de alguna manera interesante ya que, bajo el tratamiento agudo con IRL1620, las

ratas DOCA-sal habían mostrado por un lado una disminución del ARNm de la TH y por el

otro un incremento en la fosforilación de las serinas 19 y 31 sin cambios en la 40 o la

expresión total de la enzima [337]. Si bien en ese caso no hubo consecuencias sobre su

actividad enzimática, de alguna manera se pone en evidencia que a corto plazo existiría una

reacción del sistema catecolaminérgico en el HP dependiente del receptor ETB que pareciera

perderse a largo plazo.

Estos resultados sugieren que a través de los receptores ETA centrales se modularía el

sistema catecolaminérgico en el largo plazo también en el HP de los animales hipertensos,

alterando la expresión y fosforilación de la TH lo que induciría cambios en su actividad. Los

tratamientos crónicos también muestran efectos sobre los niveles del ARNm de la TH, cosa

que no sucedió en el HA. Además, es importante destacar que si bien hay una mayor

expresión de receptores ETA en el HP de los animales DOCA-sal comparados con los

normotensos [162,337], como veremos más adelante, esto no implica necesariamente que

la respuesta observada mediante el bloqueo crónico sea por un efecto directo en este

núcleo. Adicionalmente, pudimos observar un posible papel del receptor ETB en la

~ 101 ~

modulación del sistema catecolaminérgico en los animales hipertensos en tiempos cortos,

pero esto no se vio reflejado a largo plazo. De esta forma el mantenimiento de una mayor

actividad simpatoexcitatoria del HP en la HTA DOCA-sal pareciera depender mayormente

de la activación central del receptor ETA. En este sentido, el receptor ETB parece responder

de manera aguda, pero su activación aquí tampoco logra sostener un efecto a largo plazo.

En cuanto a los animales Nt, la administración crónica de BQ-610 tanto como la de

IRL1620 no produjo alteraciones sobre los distintos factores estudiados de la TH en el HA de

estas ratas al ser comparadas con sus respectivos controles. Lo mismo se observó en el HP

de los animales Nt tratados. De acuerdo con esto, contábamos con trabajos anteriores

donde se demostró que la incubación a corto y mediano plazo tanto del HA como del HP

con BQ-610 en ratas normotensas no produjo ningún efecto sobre la liberación y

recaptación de NA así como tampoco en actividad de la TH [211,259,261,266,286]. Esto

también fue validado in-vivo mediante la administración ICV de BQ-610 de manera aguda

en ratas normotensas, donde no hubo modificaciones en las fosforilaciones de la TH así

como tampoco en la expresión de su ARNm [337]. Sin embargo, la incubación ex-vivo del HA

a corto plazo con IRL1620 llevó a una disminución de la actividad de la TH, sin mostrar

cambios en el HP [211,287]. A esto podemos sumarle que la infusión ICV a corto plazo de

este agonista ETB aumentó la expresión de la TH y su fosforilación en la serina 31 pero

disminuyó los niveles del ARNm en el HA de las ratas normotensas. Además, en el HP de

estos animales el tratamiento agudo produjo una disminución en la fosforilación de la serina

31 de la TH y un aumento significativo de los niveles de su ARNm [337].

Las diferencias observadas en el hipotálamo debido a la incubación ex-vivo o bajo la

administración ICV de forma aguda de BQ-610 o IRL1620, en comparación con la infusión

crónica en animales conscientes, muestran algunas conclusiones interesantes. Por un lado,

que el antagonista BQ-610 no tendría un efecto per se en la modulación a largo plazo del

sistema catecolaminérgico hipotalámico de los animales en condiciones fisiológicas

normales. Por otro lado, que el agonista IRL1620 provocaría una respuesta dual sobre el

hipotálamo de las ratas normotensas, dado que en tiempos cortos se observan algunas

alteraciones de los distintos parámetros estudiados de la TH y en el largo plazo esta

respuesta parece perderse. Esto resulta similar a lo observado en las ratas DOCA-sal,

sugiriendo que independientemente que sea un animal Nt o hipertenso el efecto del

IRL1620 se manifiesta de manera aguda pero no se sostendría en periodos de tiempo

prolongados.

~ 102 ~

En resumen, en los animales normotensos el antagonista BQ-610 no tendría un efecto

sobre la modulación del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo, mientras que el

agonista IRL1620 solamente muestra un efecto en el corto plazo. Por otro lado, en el modelo

DOCA-sal se observa un aumento de la actividad catecolaminérgica en el HP y una

disminución en el HA que se correspondería con una mayor descarga simpática. Esta

respuesta parece ser mediada en el corto plazo por los receptores ETA y ETB centrales. Sin

embargo, para mantener este estado a lo largo tiempo, sería fundamental la activación ETA.

Además, la activación central ETB no parece emular los efectos observados mediante el

bloqueo ETA, al menos en el largo plazo.

5.2.2. El bulbo olfatorio.

En el BO también encontramos una importante respuesta al bloqueante ETA en el

largo plazo, principalmente en los animales DOCA-sal, mientras que la activación crónica ETB

parece no tener un efecto prolongado.

Las primeras evidencias de una participación del sistema endotelinérgico en la

modulación catecolaminérgica del BO y en la hipertensión DOCA-sal fueron reportadas por

nuestro laboratorio. Como bien mencionamos anteriormente, la incubación del BO de

animales normotensos con ETs a corto y mediano plazo (30 minutos y 240 minutos

respectivamente) provocó un aumento de la actividad de la TH. Esto está respaldado por un

incremento en los niveles de expresión y fosforilación de la enzima, con la participación de

los receptores ETA y ETB, involucrando las vías CAMK-II, PKC y PKA [212,260]. Estos

tratamientos también indujeron una mayor liberación de NA y a nivel transcripcional

provocaron un aumento de la expresión del ARNm de la TH [212,260]. Estos resultados

coincidieron con lo encontrado en los animales DOCA-sal, demostrando que en este modelo

de HTA el sistema catecolaminérgico del BO estaría modulado por el sistema

endotelinérgico central. Además habíamos destacado que los animales hipertensos

presentan un comportamiento asimétrico entre las hemiporciones derecha e izquierda

[161]. Esta respuesta fue confirmada a través de los distintos tratamientos realizados en el

presente trabajo, mostrando que sería la hemiporción derecha la que participa en la

modulación del sistema catecolaminérgico del BO. Mediante los hallazgos anteriores y a

través de esta tesis remarcamos que existe un aumento de la actividad catecolaminérgica

en el BO derecho de las ratas DOCA-sal [161,337]. Además, esto es acompañado por un

~ 103 ~

incremento en los niveles de mensajero de la TH [161,337]. Asimismo, se destaca que el BO

izquierdo no presentó modificaciones en ninguno de estos casos.

En este contexto, la inhibición crónica ETA (12ng/h o 24ng/h) mostró una reversión

significativa de la expresión y la fosforilación en las serinas 19, 31 y 40 de la TH en el BO

derecho de los animales DOCA-sal. Como consecuencia, también disminuyó la actividad

enzimática a valores comparables con los animales Nt. Además, los niveles de expresión del

ARNm de la TH también fueron revertidos en esta hemiporción del BO de las ratas

hipertensas. Estos datos a largo plazo coinciden con los observados mediante el bloqueo

agudo del receptor ETA, donde las reversiones en estos parámetros también alcanzaron

valores similares a los del control Nt. Esos tratamientos también habían mostrado un

incremento en la expresión del receptor ETA y una mayor colocalización ETA/TH a nivel de

los glomérulos olfatorios. Como mencionamos anteriormente, siempre hay que tener en

cuenta que los ensayos de carácter agudo fueron realizados sin diferenciar las

hemiporciones, por lo tanto no podemos saber si este efecto observado a corto plazo es

proporcionado exclusivamente por una de ellas o por ambas a la vez [337].

Por otro lado, la activación crónica ETB no provocó alteraciones en el sistema

catecolaminérgico del BO derecho de los animales DOCA-sal, dado que el tratamiento a

largo plazo con IRL1620 (45ng/h o 90ng/h) no alteró los incrementos observados en los

distintos parámetros estudiados de la TH. Por el contrario, el tratamiento agudo con el

agonista había provocado una menor expresión de la TH, acompañada en el mismo sentido

por las fosforilaciones de las serinas 19 y 40 en el BO de los animales DOCA-sal. Como

consecuencia también había disminuido su actividad enzimática [337]. En cuanto a los

niveles de expresión del ARNm de la TH, el tratamiento a corto plazo había provocado una

disminución significativa de este parámetro en el BO debido a la activación ETB [337]. Este

fue el único punto de coincidencia entre el tratamiento agudo y el crónico, ya que en el

presente trabajo de tesis también encontramos que el IRL1620 provocó un decrecimiento

de este parámetro en el BO derecho. Es más, también observamos que la dosis de 90ng/h

tuvo un efecto mayor que la de 45ng/h. Si bien nos sirve como referencia, debemos tener

en cuenta dos consideraciones, por un lado, que los efectos agudos son una combinación

de ambas hemiporciones, dado que el tejido no fue discriminado en izquierdo y derecho

[337]. Por otro lado, estos tratamientos a corto plazo son los únicos antecedentes en este

sentido, por lo tanto, y con las precauciones del caso, también serán utilizados para la

comparación temporal en el BO izquierdo. A este respecto, el BO izquierdo de los animales

~ 104 ~

DOCA-sal no mostró ningún cambio en el sistema catecolaminérgico debido al bloqueo

crónico ETA o la activación ETB.

En principio estos resultados sugieren que la activación de los receptores ETA centrales

podría modular a largo plazo el sistema catecolaminérgico en el BO derecho de los animales

DOCA-sal, sin alterar el estado de dicho sistema en la hemiporción izquierda. Esta

modulación ocurriría a nivel de la expresión, fosforilación y actividad de la TH, así como

también mediante los niveles de su ARNm. Dado que los estudios agudos fueron realizados

en el BO completo, sin subdividirlo en izquierdo y derecho, el estudio comparativo entre el

corto y largo plazo de ambos receptores se hace muy complejo, lo cual nos priva de un

análisis más profundo al respecto. A pesar de ello, la activación aguda del receptor ETB

induce cambios en el BO que no se observan a tiempos más largos en ninguna de las

hemiporciones (excepto en la expresión del ARNm de la TH en el BO derecho).

Previamente mencionamos que el BO se vincula, directa o indirectamente, con

centros simpáticos y vasomotores en regiones diencefálicas y del tronco encefálico

[16,33,34,397] y que la estimulación de esta área (o lesión) correlaciona con una

desregulación de la descarga simpática, en algunos casos impactando sobre la PA

[16,57,127]. Teniendo en cuenta que el modelo DOCA-sal presenta un tono simpático

aumentado y la PA elevada, es posible que el BO (al menos la hemiporción derecha) podría

participar de forma activa en el mantenimiento de una mayor descarga simpatoexcitatoria

general en estos animales. Al igual que en el HP, los resultados actuales muestran que se

requeriría necesariamente de la activación central de los receptores ETA. Mientras que el

estímulo ETB parece tener efectos modulatorios de manera aguda pero no así a largo plazo.

Por otro lado, por trabajos anteriores contábamos con que no había diferencias entre

el BO izquierdo y derecho de los animales normotensos en cuanto a la expresión,

fosforilación y actividad de la TH, así como tampoco en la liberación de NA [161]. En el

presente trabajo, la administración crónica de BQ-610 tanto como la de IRL1620 tampoco

produjo alteraciones sobre los distintos factores de la TH estudiados en el BO (izquierdo o

derecho) de las ratas Nt al ser comparadas con sus respectivos controles.

En resumen, la infusión crónica en animales conscientes muestra que el antagonista

BQ-610 o el agonista IRL1620 no tendrían un efecto per se en la modulación del sistema

catecolaminérgico del BO de los animales en condiciones fisiológicas normales. Por otro

lado, en el modelo DOCA-sal no se observaron cambios en el BO izquierdo, pero sí un

importante aumento de la actividad catecolaminérgica en el derecho, lo que podría

~ 105 ~

contribuir a una mayor descarga simpática. Esta respuesta parece ser mediada en el corto

plazo por los receptores ETA y ETB centrales. Sin embargo, para mantener este estado a lo

largo tiempo, sería fundamental la activación ETA. Por su parte, la activación central ETB no

parece emular los efectos observados mediante el bloqueo ETA, al menos en el largo plazo.

5.2.3. Parámetros cardiovasculares.

Como observamos, los receptores endotelinérgicos endógenos centrales inducen

cambios a nivel del sistema catecolaminérgico, al menos en el HA, HP y el BO derecho de las

ratas DOCA-sal. También mencionamos que una descarga simpática exacerbada podría

llevar al aumento sostenido de la PAS. Por lo tanto, esta interacción entre estos dos sistemas

sería un factor crucial en el mantenimiento de la hipertensión en el modelo DOCA-sal. Por

estas razones, analizaremos los resultados obtenidos mediante el bloqueo a crónico ETA y la

activación ETB central sobre la regulación de la PA y la FC.

Si bien el bloqueo central agudo de los receptores ETA en los animales normotensos

provocó una leve disminución de la PAS [337], no se observaron alteraciones en este

parámetro debido al tratamiento a largo plazo. Lo mismo ocurrió al comparar la activación

crónica y aguda del receptor ETB [337]. Estos resultados indican que en animales

normotensos tanto el BQ-610 como el IRL1620 administrados centralmente tendrían un leve

efecto hipotensor a corto plazo que no se observa en tratamientos crónicos.

Por otra parte, la administración a largo plazo de BQ-610 redujo significativamente la

PAS de manera sostenida en los animales DOCA-sal. En promedio, esta reducción fue de 29

mmHg a lo largo de la semana. Esto de alguna manera concuerda con lo observado durante

los experimentos de infusión aguda, ya que allí también se había observado una disminución

importante de la PAS [337]. Llamativamente, se encontraron signos de que este efecto

podría ser dependiente de la dosis del antagonista ETA, ya que al duplicar la concentración

administrada de la droga (24ng/h) la reducción fue aún mayor. En ese caso, la disminución

promedió los 40 mmHg, mostrando una diferencia de 11 mmHg en comparación con el

tratamiento anterior. Esto resulta interesante dado que el mismo tratamiento no mostró

evidencias de una dosis-dependencia en la modulación del sistema catecolaminérgico en

ninguna de las áreas centrales estudiadas. Por lo tanto, se podría pensar que existirían otros

factores involucrados a nivel SNC de las ratas DOCA-sal que responden al estímulo

endotelinérgico provocado. Si esto fuese así, la regulación central de la PAS en estos

animales hipertensos también dependería otras variables, que hasta el momento no

~ 106 ~

podemos identificar y cuya respuesta sería diferente según la concentración de BQ-610

administrada. Posteriormente analizaremos este punto en mayor detalle imaginando cuáles

podrían ser las causas de este efecto.

Por otro lado, el presente trabajo de tesis muestra que la activación crónica de los

receptores ETB centrales también reduce la PAS en los animales hipertensos. En promedio a

lo largo de la semana, tanto para las dosis de 45ng/h como para la de 90ng/h la disminución

fue de 19 mmHg. Esto concuerda con lo observado a corto plazo mediante la administración

aguda de IRL1620 ya que en esos experimentos la PAS también descendió significativamente

[337]. Asimismo, es importante destacar que debido al tratamiento a largo plazo utilizando

45ng/h o 90ng/h no parece haber una dependencia de la dosis. Además, la disminución de

la PAS observada en los animales DOCA-sal debido a la activación ETB no se mantuvo a lo

largo del tiempo, dado que los valores alcanzados al final de la semana de tratamiento

fueron similares a los de los controles hipertensos. Este dato resulta particularmente

interesante ya que, al igual que lo observado en el hipotálamo y el BO de estas ratas DOCA-

sal, la activación ETB parece tener efectos modulatorios de manera aguda, pero los mismos

dejan de evidenciarse en el largo plazo. Entonces, nos preguntamos: ¿la PAS depende de la

modulación ejercida por parte de los receptores ETB centrales? La respuesta pareciera ser

que sí, dado que vemos una disminución importante de este parámetro hemodinámico

debido al tratamiento, con lo cual podríamos decir que tiene un efecto hipotensor emulando

parcialmente la inhibición ETA. Sin embargo, con estos resultados no podemos deducir por

qué esta modulación no se sostiene a lo largo del tiempo. Aun así, las alteraciones en la PAS

provocadas por la activación ETB podrían ser, al menos en parte, a través de modulación del

sistema catecolaminérgico de las áreas estudiadas en el presente trabajo, dado que a corto

plazo también se observan alteraciones mediante la activación ETB que no se encuentra a

largo plazo.

En cuanto a la FC, previamente encontramos que la infusión ICV aguda de BQ-610

produce un leve descenso de este parámetro dentro de la hora de tratamiento tanto en

animales normotensos como hipertensos DOCA-sal [337]. Sin embargo, este efecto no se

observa a largo plazo en ninguno de los grupos experimentales estudiados. Tanto es así que

no hubo diferencias significativas en la FC debido a los tratamientos a largo plazo con BQ-

610 (12ng/h o 24ng/h) al ser comparados con sus respectivos controles Nt. Asimismo, a

corto plazo la infusión ICV de IRL1620 también había disminuido la FC de los animales

normotensos dentro de la hora de tratamiento, sin consecuencias sobre las ratas DOCA-sal

~ 107 ~

[337]. En cambio, a largo plazo la activación ETB no alteró este parámetro en ninguno de los

grupos. Los valores de FC obtenidos en todos los grupos experimentales, ya sea con o sin la

administración crónica de BQ-610 o IRL1620, sean normotensos o DOCA-sal, estuvieron

dentro del rango de FC considerado normal en las ratas Sprague-Dawley [365,366]. Sería

lógico pensar que ante un aumento de la PAS exista en contraposición, al menos en

condiciones de normotensión, una respuesta de la FC modulada a través del mecanismo del

barorreflejo llevando a una disminución de este parámetro. En las ratas DOCA-sal

observamos un aumento sostenido de la PAS que no parece tener consecuencias sobre la

FC, tal vez esto esté relacionado con que se demostró que en este modelo de HTA el

mecanismo barorreflejo se encuentra alterado y que esta alteración precede al aumento de

la PAS [149,370–373]. Asimismo, se reportó que las ETs podrían modular el barorreflejo

atenuando su sensibilidad ante los cambios hemodinámicos [244,398]. Con lo cual sería

posible no observar una respuesta de este factor debido al tratamiento DOCA-sal.

En resumen, los receptores ETA y ETB centrales no modularían el comportamiento a

largo plazo de la FC tanto en animales normotensos como hipertensos. En cambio, ambos

receptores estarían implicados en el mantenimiento de la PAS elevada en el modelo de HTA

DOCA-sal, sin alterar a largo plazo este parámetro en las ratas normotensas. El

funcionamiento del receptor ETA parece ser imprescindible en este sentido, dado que su

inhibición disminuye la PAS de manera sostenida. Además, observamos que la PAS podría

estar ligada a la dosis empleada del antagonista y que la regulación central de este

parámetro hemodinámico dependería solo en parte de la interacción con el sistema

catecolaminérgico del hipotálamo y el BO. Esto surge de que no se encontraron diferencias

entre la administración central de 12ng/h de BQ-610 comparada con la de 24ng/h respecto

de los distintos componentes de la TH estudiados, pero sí sobre la PAS. Esto implicaría que

los efectos observados sobre este parámetro hemodinámico serían el resultado de un

mecanismo más complejo, involucrando la participación de otros factores hasta ahora

desconocidos. Por su parte el receptor ETB también tendría el mismo efecto hipotensor,

pero la disminución de la PAS no es tan pronunciada como mediante el bloqueo ETA.

Además, no parece ser dependiente de la dosis de IRL1620 y no se mantiene a largo plazo

volviendo al estado encontrado en los animales hipertensos no tratados.

~ 108 ~

5.3. Discusión general.

A lo largo del presente trabajo de tesis hemos descripto y analizado los diferentes

aspectos que conciernen al desarrollo y mantenimiento del modelo DOCA-sal. También

evaluamos las respuestas de la inhibición central de los receptores ETA y la activación ETB a

largo plazo sobre la regulación del sistema catecolaminérgico en el hipotálamo y el BO de

ratas conscientes. Como vimos, esto fue realizado tanto en animales normotensos como

hipertensos, siempre en comparación con antecedentes de nuestro y otros laboratorios. En

este apartado discutiremos los puntos que fueron quedando pendientes durante el

desarrollo de la tesis, así como también las consideraciones y limitaciones que hay que tener

en cuenta a la hora de obtener conclusiones definitivas. Además, pondremos en contexto

los hallazgos obtenidos en un panorama más amplio.

A través de nuestros resultados, los antecedentes de nuestro laboratorio y la

bibliografía presentada, hemos visto que la HTA generada a través del modelo DOCA-sal

produce un aumento sostenido de la PAS que parece no provocar cambios en la FC. Estas

consecuencias correlacionan a su vez con el desarrollo de hipertrofia en el VI y con un

aumento de ET-1 circulante. Además, como observamos en reiteradas oportunidades, el

sistema catecolaminérgico en el HA, HP y el BO derecho de los animales hipertensos se

encuentra alterado de manera diferencial. Por un lado, encontramos que los distintos

mecanismos de regulación de la TH, así como su propia actividad enzimática, se encuentran

disminuidos en el HA en la HTA, lo cual sería un indicador de una menor actividad

simpatoinhibitoria de esta región. Por el contrario, tanto en el HP como en el BO derecho se

observa una actividad noradrenérgica exacerbada indicando que ambas áreas evocarían una

respuesta simpatoexcitatoria. De esta manera, el balance general produciría una descarga

simpática aumentada y todas estas condiciones serían fundamentales en el mantenimiento

a largo plazo de la PAS en modelo DOCA-sal.

Para entender el papel de los receptores de las ETs en la modulación a largo plazo del

sistema catecolaminérgico en estas áreas centrales y sus implicancias en el mantenimiento

de la hipertensión DOCA-sal realizamos los experimentos crónicos de inhibición ETA con BQ-

610 y activación ETB con IRL1620 en ratas conscientes tal y como fueron analizados

anteriormente. Allí observamos que el BQ-610 y el IRL1620 no tendrían un efecto per se a

largo plazo sobre el sistema catecolaminérgico de las áreas estudiadas en los animales en

condiciones fisiológicas normales. La administración crónica de estas drogas tampoco

~ 109 ~

afectaría la PAS y la FC. Por el contrario, en los animales DOCA-sal la actividad

catecolaminérgica aumentada en el HP y el BO, y disminuida en el HA, parece depender de

la activación de los receptores ETA centrales, dado que el bloqueo durante 7 días revirtió

estos parámetros a valores similares a los encontrados en los animales normotensos.

Además, el mantenimiento de la PAS también parece estar ligado directamente a la

actividad del receptor ETA, ya que se produjo una significativa y sostenida disminución

debido al bloqueo crónico de este receptor.

Llamativamente, encontramos indicios de que la respuesta al BQ-610 podría variar

según la dosis crónica administrada. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una de las

importantes limitaciones del presente trabajo es la forma de administración tanto del

antagonista ETA como del agonista ETB. En nuestros experimentos a largo plazo el BQ-610

(al igual que el IRL1620) fue infundido en el ventrículo lateral del cerebro actuando en

aquellas áreas que presenten el receptor ETA (y ETB en el caso del IRL1620). Por un lado,

sabemos que el HA, el HP y el BO expresan ambos receptores y que además la extensión del

ventrículo alcanza estas regiones [79,128,337]. Asimismo, a lo largo de los 7 días de

tratamiento es factible que las drogas alcancen estas áreas debido a que pueden ser

distribuidas libremente mediante la microcirculación ventricular [399]. Se ha descripto que

el LCR en la rata tiene un volumen aproximado de 300ul y un flujo circulatorio cercano a los

130ul/h. Así, el volumen completo del ventrículo lateral (⁓ 50ul) es reemplazado casi 3 veces

en ese lapso de tiempo y además esta difusión podría ser asistida por el flujo ocasionado

por la bomba osmótica que alcanza los 0,12ul/h [399]. En este contexto, decimos que esta

es una de las principales limitaciones del trabajo, dado que no podemos asegurar que tanto

el BQ-610 como el IRL160 actúen directamente en el HA, HP y el BO. Teniendo en cuenta las

complejas conexiones entre las distintas regiones del cerebro no es ilógico pensar que el

sistema catecolaminérgico en estas áreas pueda ser modulado por un efecto combinatorio

con otras regiones centrales con las cuales compartan proyecciones eferentes y aferentes.

En efecto, esto también pone de manifiesto que las consecuencias observadas a nivel

hemodinámico seguramente son la resultante del accionar del HA, HP y el BO, así como

también de otras áreas regulatorias. Por ejemplo, es posible que los resultados descriptos

para el BO se hayan debido en parte a una respuesta a nivel del LC, el cual a su vez proyecta

directamente a esta región telencefálica. Para poder saber si la respuesta es propia del BO

o bien validar estas suposiciones sería ideal poder administrar localmente el BQ-610 o el

IRL1620. Sin embargo, no hay que olvidar los resultados obtenidos en estudios previos en

~ 110 ~

donde demostramos un efecto directo sobre el BO en un modelo ex-vivo y que tanto el HP

como el BO presentan una alta colocalización de los receptores de las ETs en neuronas TH

positivas [212,260]. Esto último sugiere que tal vez la modulación del sistema

catecolaminérgico central pueda ser directa, pero teniendo en cuenta la complejidad del

SNC, las consecuencias sobre la PAS podrían ser más bien un efecto combinatorio. También

hemos mencionado que el hipotálamo se encuentra altamente conectado con otras

regiones y núcleos relacionados con la regulación central de la función cardiovascular, lo

cual propicia el escenario para una respuesta concertada entre varias regiones. Estas

suposiciones podrían explicar la respuesta dosis-dependiente de la PAS observada en los

animales DOCA-sal debido al tratamiento con el antagonista ETA, donde pareciera que este

parámetro no depende exclusivamente de la interacción entre el sistema endotelinérgico

central y el catecolaminérgico de las regiones estudiadas, sino que las variaciones

observadas implicarían la participación de otros factores. En todo caso, lo que si podemos

afirmar es que directa o indirectamente, el receptor ETA modula el comportamiento del

sistema catecolaminérgico en el HA, HP y el BO de las ratas DOCA-sal. Además, ya sea

también de forma directa a través de las áreas estudiadas o indirecta por la participación de

otras regiones o mecanismos centrales, la participación del receptor ETA es fundamental

para el mantenimiento a largo plazo de la PAS elevada, al menos, en este modelo de

hipertensión sal dependiente.

Por otro lado, la activación central crónica de los receptores ETB nos permitió emular

transitoriamente los resultados obtenidos mediante la inhibición ETA. Si bien el tratamiento

a largo plazo con IRL1620 logró disminuir la PAS de los animales DOCA-sal (sin cambios en

la FC) esta reducción fue menor que con BQ-610. Además, en estos experimentos los

efectos de la activación crónica ETB se pierden al final de la semana de tratamiento,

reestableciéndose la PAS a valores similares a los de los controles DOCA-sal. Asimismo, el

sistema catecolaminérgico en el HA, HP y el BO de estos animales no parece responder en

el largo plazo de manera importante. Esta observación surge de no haber encontrado

diferencias significativas en los diferentes mecanismos regulatorios de la TH debido al

tratamiento a largo plazo con IRL1620. La única excepción ocurrió en el BO derecho donde

los niveles del ARNm mostraron una disminución, pero solamente debido a una dosis

crónica de 90ng/h del agonista. Es pertinente detenerse en este punto para analizar otra de

las limitaciones del presente trabajo, la cual es desconocer el estado del sistema

catecolaminérgico de las áreas centrales estudiadas en los estados intermedios entre las

~ 111 ~

24hs y las 144hs de tratamiento crónico, ya sea con BQ-610 o IRL1620. Esto resulta

particularmente importante en relación con la implicancia del receptor ETB en este estudio,

dado que permitiría explicar si la ausencia de cambios en la PAS de los animales DOCA-sal a

las 144hs de tratamiento se debe (directa o indirectamente) a la falta de respuesta del

sistema catecolaminérgico en ese momento. Sería interesante poder conocer el estado del

sistema catecolaminérgico en el HA, HP y el BO al menos entre las primeras 24-48hs, que es

dónde la disminución de la PAS fue más pronunciada. Si pensamos más allá de los límites

del trabajo, si en ese momento los distintos factores estudiados de la TH reaccionaran de

similar manera a lo observado a través del bloqueo ETA podríamos suponer que el receptor

ETB estaría actuando de manera contrapuesta al primero implicando que ambos receptores

estarían fuertemente involucrados en el mantenimiento de la PA en el modelo DOCA-sal.

No obstante, estas suposiciones deberán ser tenidas en cuenta para experimentos futuros.

Por el momento deberemos respaldarnos en las diferencias encontradas mediante el

cotejo con los experimentos a corto plazo ex-vivo y agudos in-vivo. Anteriormente pudimos

ver que debido a la activación aguda ETB se producen algunas alteraciones de manera

diferencial en las distintas áreas estudiadas. Sin embargo, estos cambios no logran

observarse al final de los experimentos crónicos. Los tratamientos agudos también

provocaron la disminución de la PAS. Esto de alguna manera deja entrever que la activación

ETB emula parcialmente la respuesta encontrada mediante el bloqueo ETA, dado que en

ambos casos disminuye la PAS y al menos basados en los datos a corto plazo modula el

comportamiento del sistema catecolaminérgico en las regiones centrales estudiadas. En

estas circunstancias, lo máximo que podemos afirmar es que, por lo visto a corto plazo, el

receptor ETB modularía (directa o indirectamente) el comportamiento del sistema

catecolaminérgico en el HA, HP y el BO de las ratas DOCA-sal. Además, podríamos decir que

la activación del receptor ETB repercute en el mantenimiento de la PAS elevada este modelo

de hipertensión sal dependiente. Sin embargo, los efectos que este receptor ejerce sobre

todos los parámetros estudiados parecen perderse a largo plazo. Ante esta situación nos

planteamos la siguiente pregunta: ¿cuál es el motivo para que esta situación no se sostenga

crónicamente y/o qué mecanismos compensatorios estarían actuando para aplacar la

respuesta de activación ETB?

Ante este interrogante podríamos pensar que tal vez, que de alguna forma la

activación crónica lleve a que los receptores ETB se desensibilicen y/o internalicen. Aunque

~ 112 ~

no contamos con evidencias propias para afirmar ninguna de estas suposiciones, algunos

reportes sustentarían la idea de desensibilización y/o internalización de los receptores.

Si bien hasta el momento no hemos encontrado publicaciones que refieran casos de

desensibilización o internalización debido a una sobreactivación de los receptores ETB a nivel

SNC, este fenómeno no es algo fuera de lo común, especialmente en los receptores

acoplados a la proteína G [400]. En general estos eventos llevan a una disminución de hasta

el 80% de las respuestas y en algunos casos a la inhibición de las mismas [400]. Al respecto,

se ha demostrado que la activación crónica mediante agonistas de esta familia de

receptores desencadena mecanismos de feedback que llevan a una desensibilización e

internalización de la respuesta mediante el desacople de la proteína G por fosforilación

[400,401]. Además, se ha demostrado que este fenómeno también ocurre a nivel del SNC,

aunque como mencionamos recién, no sabemos si esto le ocurre específicamente al

receptor ETB [402]. Aun así, el sistema endotelinérgico no escapa a esta situación, ya que se

reportó que este mecanismo también afecta a los receptores ETA y ETB tanto en cultivo de

células humanas como en tejidos de ratas [403–405]. Al respecto, se demostró que ETA y

ETB median respuestas cronotrópicas negativas y positivas, respectivamente, en la aurícula

derecha de ratas y que la administración repetitiva de ET-1 lleva a la desensibilización de los

receptores y a la perdida de estos efectos [405]. Interesantemente, varios trabajos

publicados por Cramer y col. muestran que la estimulación de ETA con ET-1 lleva una

activación parcialmente sostenida de este receptor, mientras que el receptor ETB se

desensibiliza rápidamente perdiendo el 80% de su actividad luego de la aplicación del

agonista [406,407]. En estos trabajos se demostró que la inactivación ETB ocurre mediante

un subtipo de fosforilación que no se da en ETA y que esto no afecta la cinética de

internalización siendo similar entre ambos receptores [406,407]. El primero de los trabajos

culmina sugiriendo que la modulación subtipo-específica de los receptores de ETs podría

explicar los efectos hipotensores agudos de las ETs a través de la actividad a corto plazo de

los receptores de ETB y los efectos hipertensivos de larga duración debido a la activación

sostenida de ETA [406]. En el trabajo posterior proponen que en el sistema cardiovascular

de la rata, la ET-1 provoca respuestas fisiológicas prolongadas a través del receptor ETA,

mientras que los efectos mediados por el ETB son transitorios [407]. Por lo tanto, apoyados

en estos datos bibliográficos no podemos descartar la posibilidad de que la activación a largo

plazo de los receptores ETB centrales lleve a una desensibilización de estos, y tal vez también

~ 113 ~

a su internalización, lo que de alguna manera explicaría los efectos encontrados en los

tratamientos crónicos con IRL1620.

Desde otro ángulo, pero en el mismo sentido, en nuestro laboratorio postulamos la

hipótesis de que podría existir un efecto de desplazamiento de las ETs centrales circulantes

debido a los tratamientos con el antagonista ETA o el agonista ETB. Esta idea plantea que

ante el bloqueo central de los receptores ETA, las ETs solo podrían actuar a través de los

receptores ETB provocando la activación de estos últimos, lo que en definitiva llevaría a los

efectos observados en el sistema catecolaminérgico, la descarga simpática y las

consecuencias sobre la PAS. Si esto fuese así, en el mantenimiento de la PA elevada en los

animales DOCA-sal se requeriría tanto de la activación ETA como de una actividad ETB

disminuida (o al menos basal). Este tipo de efectos no es algo inusual, dado que se ha

reportado que el bloqueo ETA en la pituitaria anterior aumentaría las ETs a nivel paracrino

pudiendo de esta manera unirse al ETB libre [408]. Esta idea de desplazamiento del ligando

hacia el otro receptor por administración de un bloqueante se sustenta entonces en este

tipo de antecedentes y en las afinidades de los receptores por las ETs. En este sentido, se ha

visto que tanto ETA como ETB presentan afinidades similares por ET-1 [409].

Si nuestra hipótesis fuese correcta, podría suceder algo similar durante la activación

crónica ETB. En este caso las ETs circulantes se verían desplazadas hacia los receptores ETA

quedando de esta manera ambos activados. Mas aun, está posibilidad podría provocar una

sobreactivación ETA. Inicialmente esta situación podría explicar los efectos de la activación

con IRL1620 sobre en el sistema catecolaminérgico a corto plazo y en la disminución (de

menor amplitud) de la PAS. Suponiendo que, si de alguna manera la activación ETB dejase

de tener efecto, por ejemplo, como mencionamos antes, por algún mecanismo de

desensibilización de estos receptores, las ETs centrales circulantes continuarían actuando

solamente sobre ETA. Esto podría dar una idea de por qué a largo plazo no se observan

alteraciones sobre el sistema catecolaminérgico de las áreas estudiadas, así como tampoco

sobre la PAS. Claramente estas deducciones están por fuera de los límites del presente

trabajo y hasta el momento no tenemos evidencias contundentes que las respalden. Sin

embargo, estas conjeturas permiten sugerir nuevas hipótesis para poder investigar en el

futuro la naturaleza de este comportamiento irregular del receptor ETB.

En virtud de ello, previamente reportamos que los receptores ETB centrales, actuarían

activando la vía del ON con lo cual sería interesante indagar sobre el estado de la enzima

nNOS, comenzando por las áreas estudiadas. Por ejemplo, si durante inhibición crónica ETA

~ 114 ~

los niveles de la nNOS estuviesen aumentados tendríamos un primer indicador de que este

tratamiento llevaría a una activación paralela del receptor ETB, muy probablemente por las

ETs centrales circulantes. Asimismo, y dado que no existe un agonista específico ETA,

también sería útil realizar estos experimentos a largo plazo utilizando el BQ-610 en

combinación con el IRL1620, de esta forma activaríamos el receptor ETB mientras que las

ETs circulantes no podrían actuar sobre ETA. Creeríamos así, que la inhibición ETA y la

activación ETB también provocaría una disminución de la PAS y cambios acordes a los

observados en el sistema catecolaminérgico. Si los receptores ETB de alguna forma dejasen

de ser funcionales (por ejemplo: desensibilización) estaríamos ante una nueva situación

donde ambos receptores estarían ˵silenciados˶. En este caso no podríamos anticipar como

reaccionaria el sistema, pero con seguridad ofrecería resultados que podrían complementar

la información disponible hasta el momento. Así, como contrapartida también podríamos

usar dos antagonistas específicos combinados, por ejemplo, BQ-610 (para ETA) y BQ-788

(para ETB). Entonces, si la inhibición ETA llevase a la activación ETB por parte de las ETs

circulantes, esperaríamos que el doble bloqueo evite estas alteraciones. En definitiva, esto

nos permitiría confirmar que los cambios en el sistema catecolaminérgico observados en los

animales DOCA-sal dependerían tanto de la activación ETA como de mantener los niveles

basales o disminuidos de los ETB. De más está decir que todas estas posibilidades son parte

de las ideas que podrían llevarnos a encontrar una explicación de los resultados observados

respecto de la implicancia de los receptores ETB centrales en este trabajo de tesis doctoral.

En otro orden de ideas, en diferentes trabajos hemos propuesto que el BO podría

participar en la regulación central de la función cardiovascular como un área

simpatoexcitatoria a través de la modulación del sistema catecolaminérgico. Además,

observamos que también podría estar implicado en el mantenimiento de la PAS elevada en

la hipertensión del modelo DOCA-sal. Esta idea surge de las múltiples conexiones que esta

región telencefálica tiene con los distintos núcleos del SNC involucrados en los mecanismos

antes enumerados y de la creciente evidencia aportada por nuestro laboratorio en ese

sentido. De hecho, el presente estudio junto con los antecedentes anteriores, son los

primeros en presentar pruebas del papel del BO en la HTA DOCA-sal [161,337]. Además,

hemos dedicado una parte de la introducción a sustentar bibliográficamente la existencia

de asimetrías tanto anatómicas como funcionales en el SNC ya que volvimos a confirmar un

comportamiento desigual entre las hemiporciones derecha e izquierda del BO, esta vez en

experimentos llevados a cabo en animales conscientes. Los detalles de la respuesta fueron

~ 115 ~

explicados en reiteradas oportunidades, remarcando que fue la hemiporción derecha la que

presentó los cambios más importantes. Fundamentalmente, se observó que la activación de

los receptores ETA centrales es necesaria para mantener elevados todos los parámetros

estudiados de la TH en el BO derecho y que, de alguna manera, por todo lo explicado

anteriormente, el receptor ETB pareciera también estar implicado. En este contexto,

entendemos que hay apoyo en nuestros estudios y en la literatura para sugerir que el BO

puede contribuir a la elevación de la PA de manera crónica en este modelo animal de HTA,

lo que en definitiva nos permite hipotetizar que también podría desempeñar un papel en la

hipertensión humana.

Desde ese punto de vista, en principio, sería lógico pensar que el BO pueda tener una

importancia menor en los seres humanos que en las ratas. Sin embargo, y de acuerdo con

la literatura, el BO no juega un papel menos significativo en este sentido [410–414]. Estudios

exhaustivos sobre la morfología cerebral en diferentes especies han demostrado que, en

general, el tamaño de cualquier región del cerebro es proporcional la magnitud del cerebro

entero y aunque el volumen total puede explicar más del 96% de la varianza en el tamaño

de cada área individual, esto no aplica al BO. La dimensión del BO es independiente del

tamaño de la mayoría de las regiones cerebrales. Los teóricos evolutivos modernos

consideran esto como uno de los tres principios de escalado del cerebro: 1- alta correlación

de los volúmenes de las estructuras; 2- existencia de una escala alométrica diferente para

cada estructura; 3- independencia relativa del sistema olfativo-límbico del resto del cerebro.

Si bien el tamaño relativo del BO respecto del cerebro en primates, incluidos los humanos,

es del 0.01% y en roedores es del 2-4%, el tamaño absoluto del BO humano es

significativamente mayor (⁓ 60 mm3 en humanos vs ⁓ 27 mm3 en ratas). Además, se ha

demostrado que este volumen varía con la edad, en situaciones patológicas como la

hiposmia (reducción del ⁓ 25%) o en casos de personas que sufrieron abuso infantil

(reducción ⁓ 20%). También se ha comprobado que el sistema olfativo humano es altamente

sensible a una amplia variedad de olores y también puede ejercer una gran influencia en el

comportamiento, la fisiología y las emociones.

Los estudios en humanos sanos muestran que el BO no solo está involucrado en el

olfato, sino que también en otras funciones fisiológicas e incluso en diversas patologías. De

acuerdo con esto, se demostró que la pérdida de olfato en humanos se correlaciona con un

mayor consumo de sal, lo que aumenta el riesgo de HTA [415]. Estos pacientes refieren que

sienten deseos de comer alimentos salados. Uno podría pensar que está relacionado con la

~ 116 ~

imposibilidad de poder sentir el gusto de la comida, pero también se comprobó que el

aumento en el consumo de sal no está asociado con cambios en la detección del sabor [416].

Otros estudios muestran que la disfunción olfativa es una manifestación temprana de la

enfermedad de Parkinson y que esto estaba relacionado con la disfunción simpática y

parasimpática cardíaca y también con el deterioro simpático vascular [417]. Además,

también se ha observado que la disfunción olfativa tiene una fuerte presencia en otras

enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer o congénitas como el síndrome de

Kallmann [418–422].

Asimismo, muchos trabajos respaldan una estrecha relación entre las enfermedades

cardiovasculares y la depresión, y también entre la depresión y el BO [423,424]. Como

mencionamos en la introducción a este trabajo de tesis, la bulbectomía bilateral es utilizada

como un modelo animal de depresión que exhibe cambios significativos en la descarga

simpática y la función cardiovascular [127]. De hecho, en nuestro laboratorio hemos

encontrado que la ablación del BO impide la elevación de la PA en los animales DOCA-sal

(resultados no publicados). Asimismo, se demostró que los pacientes con depresión

presentan un BO de volumen reducido [425–427] y exhiben una menor sensibilidad olfativa,

sin afectar la capacidad de identificar y discriminar olores. También se observó que estos

pacientes son más propensos a desarrollar enfermedades cardiovasculares y tienen una tasa

de mortalidad más alta que la población general, no necesariamente relacionada con causas

como el suicidio [428]. Se estima que la prevalencia de depresión en pacientes con

enfermedades cardiovasculares oscila entre el 15 y el 20%. En este sentido, un estudio

mostró que la depresión predijo un aumento del 70% en la probabilidad de infarto agudo

de miocardio [130]. También se vio que el cuadro depresivo estaba presente en

aproximadamente el 20% de los pacientes con accidente cardiovascular y que esta situación

los coloca en un mayor riesgo de episodios futuros. No obstante, es importante señalar que

casi el 30% de estos pacientes fueron diagnosticados clínicamente como depresivos antes

del episodio cardiovascular. Los estudios etiológicos sugieren que la depresión podría

duplicar el riesgo de nuevas enfermedades cardiovasculares [429]. Además, se halló que la

prevalencia de depresión en pacientes hipertensos llega al 40%, y es más alta en mujeres

(63,4%) que en hombres (36,6%). Como se muestra en la literatura, en los últimos años la

relación entre la depresión y el BO ha adquirido mayor relevancia, así como también el

vínculo de ambos frente al riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares.

~ 117 ~

Por otro lado, previamente detallamos la complejidad e importancia de la HTA junto

con su elevada prevalencia, su avance progresivo y silencioso ocasionando a largo plazo

daño en los órganos blanco. También resaltamos su alta tasa de mortalidad derivada de

accidentes cerebrovasculares, renales o cardiovasculares. Asimismo, nos explayamos acerca

de la importancia del consumo elevado de sodio y otros múltiples factores intervinientes

que dificultan su estudio, prevención y tratamiento. En consecuencia, en función de lo

discutido hasta el momento y teniendo en cuenta que los receptores acoplados a la proteína

G han demostrado ser los más favorables como blancos de acción de fármacos en la

medicina moderna [402], podríamos pensar que drogas que tienen como objetivo los

receptores ETA y ETB podrían ser útiles agentes terapéuticos para el tratamiento de la HTA.

Un punto importante para tener en cuenta sería que tengan tropismo por el SNC para evitar

los efectos periféricos no deseados que estas drogas pudiesen ocasionar. Si bien podría

resultar prematuro plantear algún tipo de aplicación sin más estudios experimentales y

clínicos, se ha observado que tanto los antagonistas específicos ETA como lo mixtos (ETA/ETB)

reducen de manera eficaz la PA en modelos de HTA que van acompañados de incrementos

de ET-1 [430]. Es interesante recordar que el modelo DOCA-sal presenta esta endotelina

incrementada a nivel periférico [53,168,171] y además, sus efectos vasopresores parecen

depender del sodio ya que se observó que ET-1 sólo aumenta la PA cuando es acompañada

de una dieta elevada de sal [168,170,431].

La FDA (de su nombre en inglés: Food and drug administration) aprobó el uso

comercial de antagonistas ETA o mixtos ETA/ETB (Bosentan, Darusentan, Ambrisentan) para

tratamientos en HTA resistente (aquella que no responde a múltiples tratamientos

antihipertensivos) e hipertensión pulmonar. Sin embargo, ante la presencia de algunos

efectos adversos su uso quedó limitado a un rango más reducido de pacientes. Aun así, las

investigaciones apuntan a mejorar la administración de drogas cuyo blanco sea el receptor

ETA dado que hasta el momento presentaría los resultados más satisfactorios [432].

Si bien este es uno de los motivos por el cual resulta importante estudiar más en

detalle los mecanismos implicados en el mantenimiento de la HTA sal dependiente a través

de la implicancia de los receptores ETA centrales, no habría que dejar de lado los receptores

ETB. En este sentido, se han demostrado muchos efectos beneficiosos a través de la

estimulación de estos receptores. Por ejemplo, a nivel periférico su respuesta

vasodilatadora mediada por el ON tendría efectos benéficos en el tratamiento de la HTA, ya

que facilitaría la eliminación renal de sodio. Además, se ha observado que la estimulación

~ 118 ~

central de ETB con ET-3 potencia la sensibilidad de un canal de sodio a nivel del SFO, lo que

reduciría las concentraciones de dicho ion en el líquido extracelular y disminuiría el apetito

por la sal [182]. Por lo tanto, la administración central de agonistas ETB podría ser útil sobre

individuos hipertensos que presenten elevado consumo de sodio en la dieta.

Es importante destacar que se han realizados pocos estudios sobre el empleo de

agonistas ETB en el tratamiento de la HTA y que, además de los trabajos de infusión aguda,

no existen antecedentes bibliográficos donde se administre un agonista específico ETB

centralmente a animales hipertensos y se determinen parámetros hemodinámicos. Es por

esto que través del trabajo de la Dra. Guil que propusimos por primera vez que la

administración de agonistas ETB con blanco de acción en el SNC, podrían ser una alternativa

terapéutica en individuos con desregulación del sistema cardiovascular [337]. Claro está

que, antes de plantear esta posible aplicación, queda pendiente la necesidad de tratar de

comprender por qué la activación ETB tiene efectos agudos sobre la PAS que a largo plazo

parecen perderse.

De modo que, a la vista de los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis

Doctoral, de acuerdo con la bibliografía y los antecedentes de nuestro laboratorio,

proponemos que:

La HTA DOCA-sal sería mantenida a largo plazo, al menos en parte, por el sistema

endotelinérgico endógeno central. Este sistema potenciaría la actividad catecolaminérgica

en regiones como el HP y el BO derecho, y la disminuiría en el HA. En su conjunto esto

llevaría a una mayor descarga simpática lo cual sería uno de los factores clave en el

mantenimiento de la PAS elevada en este modelo sal dependiente.

Por todo lo discutido, consideramos que esta tesis aporta nuevos conocimientos

sobre la implicancia a largo plazo del sistema endotelinérgico en la HTA sal dependiente,

abriendo un nuevo campo de estudio sobre las posibles ventajas terapéuticas de encontrar

nuevos antagonistas ETA o agonistas ETB con acción específica en el SNC. Además, tanto por

lo demostrado en el presente trabajo como en estudios anteriores, es importante destacar

que nuestro grupo de investigación es de los primeros en encontrar una relación del BO con

la regulación central de la función cardiovascular en animales hipertensos. Asimismo,

destacamos que el BO actuaría de manera asimétrica, resaltando el papel de la hemiporción

derecha de dicha región telencefálica. De esta manera, no solo hemos podido desentrañar

algunas implicancias a largo plazo de los receptores endotelinérgicos, sino que también

agregamos un nuevo actor al complejo mecanismo de la regulación central de la función

~ 119 ~

cardiovascular con posibles implicancias tanto en condiciones normales como patológicas.

No obstante, aún queda mucho por investigar acerca de la fisiología cardiovascular y la HTA,

particularmente también para poder obtener mayor certeza acerca de los mecanismos

estudiados en la presente Tesis Doctoral.

~ 120 ~

6. Conclusiones

En el presente trabajo de tesis doctoral evidenciamos la importancia del sistema

endotelinérgico endógeno central en el mantenimiento de la PAS en las ratas DOCA-sal. Es

así como en estos animales el bloqueo a largo plazo del receptor ETA, utilizando el

antagonista específico BQ-610, llevó a un marcado y sostenido descenso de la PAS, sin

cambios en la FC. De una manera similar, la activación crónica de los receptores ETB

centrales, utilizando el agonista específico IRL1620, también produjo una disminución de la

PAS, aunque de menor intensidad y de manera transitoria. Esto contribuye al conocimiento

actual mostrando que a nivel central los receptores ETA tendrían una respuesta presora,

mientas que los ETB actuarían de forma contraria. Por otro lado, también es interesante

destacar que estas alteraciones ocurrieron exclusivamente en las ratas DOCA-sal, dado que

no se observaron cambios debido a los tratamientos crónicos en las normotensas, lo cual

también expuso la existencia de un tono basal exacerbado del sistema endotelinérgico

central en este modelo. Todo esto evidenció que la participación de los receptores ETA

centrales es fundamental en este sentido. Asimismo, es importante destacar que por

primera vez estos experimentos fueron realizados a largo plazo, durante 7 días y en animales

conscientes, lo cual nos permitió observar los efectos directos de las drogas en condiciones

fisiológicas y fisiopatológicas.

Como vimos, los hallazgos a nivel hemodinámico estuvieron ligados a los cambios

observados a nivel central. Esto surge de haber evaluado los distintos pasos de la regulación

de la TH, la enzima clave en la biosíntesis de catecolaminas, como marcador del estado del

sistema catecolaminérgico en diferentes áreas del SNC. En este sentido, elegimos el HA y el

HP dado que está demostrada la participación de ambas regiones en la modulación de la

descarga simpática con efectos sobre la fisiología cardiovascular. También decidimos incluir

en el estudio un área poco estudiada como el BO, dado que creemos que podría tener un

papel similar en este sentido. En efecto, encontramos una mayor activación del sistema

catecolaminérgico tanto en el HP como en el BO derecho, lo cual se vio acompañado de una

mayor actividad enzimática. También observamos que el tratamiento DOCA-sal aumenta los

niveles transcripcionales del mensajero de la TH en estas áreas. Por el contrario, el HA

respondió de manera opuesta. La importancia de los receptores ETA en la modulación del

sistema catecolaminérgico en estas regiones centrales quedó evidenciada durante el

~ 121 ~

tratamiento con su antagonista, dado que el bloqueo crónico logró revertir estos

parámetros, en líneas generales, a los niveles encontrados en los animales normotensos. En

su conjunto, estos resultados serían indicadores de una menor actividad simpatoinhibitoria

por parte de HA y una mayor actividad simpatoexcitatoria tanto en el HP como en el BO

derecho. Esto en definitiva propiciaría un aumento de la descarga simpática, lo que sería

fundamental para el mantenimiento a largo plazo de la PAS en el modelo DOCA-sal. Por su

parte la activación crónica de los receptores ETB parece no tener efectos a largo plazo sobre

el sistema catecolaminérgico en estas áreas. No obstante, hay que tener en cuenta nuestros

antecedentes en experimentos ex-vivo y los tratamientos agudos con el mismo agonista

dado que a corto plazo sí se observaron alteraciones significativas sobre la regulación de la

TH. Por un lado, hemos hipotetizado que debido a la activación continua de los receptores

ETB podría existir un efecto de desensibilización de estos. Por otro lado, también sugerimos

que habría un desplazamiento de las ETs durante los experimentos con IRL1620 y BQ-610.

Ambas inferencias podrían dar una explicación acerca del comportamiento irregular

observado durante la activación central de los receptores ETB. Por supuesto, para validar

estas hipótesis se requiere de la realización de nuevos experimentos que permitan entender

mejor los detalles de este mecanismo.

La elevada susceptibilidad de este modelo sal dependiente a los tratamientos crónicos

también lleva a pensar que el desarrollo de nuevos antagonistas ETA (más comúnmente

empleados) o agonistas ETB (poco estudiados), fármaco-modulados y con tropismo hacia el

SNC, podría tener importantes repercusiones a nivel terapéutico.

Por otra parte, a través de este trabajo y los antecedentes de nuestro laboratorio,

continuamos sumando evidencias que indican una participación del BO, al menos en parte

y de manera asimétrica, en la regulación central de la PA en los animales DOCA-sal,

agregando un nuevo actor a este complejo mecanismo.

Finalmente, somos conscientes de que aún resta mucho trabajo de investigación por

delante. Por esta razón, continuaremos trabajando en vistas de lograr nuevos avances en el

estudio de la interacción entre el sistema endotelinérgico endógeno central y la actividad

catecolaminérgica, así como también en sus consecuencias sobre la regulación de la

fisiología cardiovascular y en la hipertensión arterial.

~ 122 ~

7. Perspectivas

A lo largo de esta Tesis Doctoral fuimos mencionando distintas estrategias

experimentales que ayudarían a profundizar las conclusiones obtenidas hasta el momento.

Por un lado, remarcamos la necesidad de poder distinguir claramente a través de cuál

o cuáles receptores se logran las modificaciones observadas en el sistema catecolaminérgico

en las regiones centrales estudiadas. Esto surge ante la posibilidad de que debido al bloqueo

ETA ocurra un desplazamiento de las ETs circulantes que lleven a la activación de los

receptores ETB o, por el contrario, que la activación ETB lleve paralelamente a la activación

ETA. En virtud de ello nos preguntamos si los efectos observados eran a través de la

inhibición ETA, de la activación ETB o de una acción conjunta. De modo que creemos que

sería interesante poder analizar el estado de la nNOS (actividad y expresión) en las áreas

estudiadas, ya que como mencionamos anteriormente se ha reportado que, centralmente,

la activación de esta vía es mediante ETB. De esta forma, si durante el bloqueo ETA las ETs

circulantes activan ETB deberíamos encontrar un aumento en la actividad de la nNOS. Desde

otro punto de vista, también propusimos utilizar ambas drogas (BQ-610 e IRL1620) de

manera conjunta en experimentos crónicos y como contrapartida también hacerlo con dos

antagonistas específicos combinados como BQ-610 (para ETA) y BQ-788 (para ETB).

Entonces, esperaríamos que el doble bloqueo evite estas alteraciones. En definitiva, esto

nos permitiría saber si se requiere o no de una baja (o basal) actividad ETB para el

mantenimiento de la actividad catecolaminérgica alterada en los animales DOCA-sal.

Asimismo, se útil evaluar los niveles de expresión de los receptores ETA y ETB al final de los

distintos tratamientos crónicos para saber si hubo alguna alteración. Esta idea surgió a lo

largo del actual trabajo de tesis, pero por cuestiones de tiempo aún no se han llevado a

cabo.

Por otra parte, también mencionamos que al final de la activación a largo plazo de los

receptores ETB centrales no se observaron diferencias significativas en la PAS y en los

componentes estudiados de la TH en comparación con los controles DOCA-sal. Por lo tanto,

sería muy útil conocer el estado del sistema catecolaminérgico de estos animales a tiempos

intermedios (por ejemplo, entre las 24 y 48hs). Esto nos permitiría saber si la disminución

de la PAS a lo largo del experimento con IRL1620 correlaciona (directa o indirectamente)

con cambios en la expresión y actividad de la TH.

~ 123 ~

En otro orden de ideas, también debemos tener en cuenta que uno de los factores de

elevada importancia en el establecimiento de la HTA es el estado oxidativo y el proceso

inflamatorio, con lo recientemente hemos desarrollado una nueva línea de investigación al

respecto. En este aspecto, se sabe que las ETs incrementan las especies reactivas del oxígeno

(ROS) alterando el estado rédox de la célula [398]. Por otra parte, el NPV es un importante

centro coordinador y regulador de la respuesta autonómica. Asimismo, la actividad

simpática regulada por el NPV depende de un fino balance entre diferentes

neurotransmisores a nivel de dicha región. En este contexto, nos planteamos si el sistema

endotelinérgico central estaría regulando la PAS, y la hipertrofia cardíaca, a través de un

desbalance de neurotransmisores y de la activación del circuito entre moléculas

proinflamatorias y de las ROS a nivel del NPV en el modelo DOCA-sal. Actualmente, la Dra.

Guil lleva adelante esta línea de investigación como parte de su trabajo postdoctoral.

Finalmente, producto del presente trabajo de tesis, hemos encontrado algunos

resultados interesantes respecto del desarrollo de hipertrofia del VI en los animales DOCA-

sal. Sorprendentemente, debido al bloqueo a largo plazo de los receptores ETA centrales se

encontró que los valores del IHVI en los animales hipertensos tratados no diferían de los

hallados en los controles Nt y que además eran significativamente menores que en los

controles DOCA-sal. Por el contrario, la activación crónica ETB no tuvo efecto en este sentido.

A la vista de los resultados, no sabemos si los visto debido al bloqueo ETA podría tratarse de

una posible reversión o un impedimento del desarrollo de hipertrofia del VI. Además,

tampoco sabemos si esto sería un efecto directo del bloqueo ETA o de la disminución

sostenida de la PAS a lo largo de la semana de tratamiento. Como se puede observar son

muchos los interrogantes que surgieron a partir de estos novedosos resultados. Por esta

razón, a lo largo del trabajo de tesis se fueron realizando preparados de cortes de corazón

a la altura de los ventrículos para utilizarlos en microscopía. Esto fue realizado tanto para

los animales normotensos como para los hipertensos DOCA-sal, ya sean estos tratados, o

no, con BQ-610 o IRL1620. El objetivo es, por un lado, validar los resultados obtenidos

mediante el IHVI, dado que, si bien es un fuerte indicador, no es suficiente para asegurar

que lo observado sea efectivamente el desarrollo de hipertrofia. Por otro lado, investigar

esta nueva línea derivada de los resultados obtenidos en esta tesis doctoral. En

consecuencia, se realizaron preparados de microscopía con tinciones de hematoxilina-

eosina y sirius red para estudiar el diámetro de los miocitos y el contenido de colágeno como

marcadores de hipertrofia, respectivamente. Además, se reservaron cortes en parafina para

~ 124 ~

estudiar otros marcadores mediante inmunohistoquímica. Asimismo, sería interesante

conocer el estado del corazón en el momento previo al tratamiento crónico con el

antagonista ETA y el agonista ETB ya que de esa manera podríamos discriminar si los efectos

observados se tratan de una reversión o si se previene el desarrollo de la hipertrofia

cardiaca.

~ 125 ~

Abreviaturas

AC Adenilato ciclasa

AHA Área hipotalámica anterior

Ang-II Angiotensina II

AOB Bulbo olfatorio accesorio (accesory olfactory bulb)

BO Bulbo olfatorio

BPM Latidos por minuto (beats per minute)

BQ-610 Antagonista del receptor ETA

DOCA Acetato de 11-deoxicorticosterona

EPL Capa externa plexiforme (plexiform external layer)

ET-1 Endotelina 1

ET-2 Endotelina 2

ET-3 Endotelina 3

ETA Receptor de endotelinas tipo A

ETB Receptor de endotelinas tipo B

ETs Endotelinas

FC Frecuencia cardiaca

GABA Ácido γ-aminobutírico

GCL Capa de células granulocíticas (granulocytic cell layer)

GL Capa glomerular (glomerular layer)

HA Hipotálamo anterior

HP Hipotálamo posterior

HTA Hipertensión arterial

ICV Intracerebroventricular

IHVI Índice de hipertrofia del ventrículo izquierdo

IPL Capa interna plexiforme (inner plexiform layer)

IRL1620 Agonista del receptor ETB

LC Locus coeruleus

LCRa Líquido cefalorraquídeo artificial

MAO Monoamino oxidasa

MCL Capa de células mitrales (Mitral cell layer)

mmHg Milímetros de mercurio

MOB Bulbo olfatorio principal (main olfactory bulb)

NA Noradrenalina

NET Transportador de noradrenalina (norepinephrine transporter)

NOS Óxido nítrico sintasa

NPV Núcleo paraventricular

NSO Núcleo supraóptico

Nt Normotenso

NTS Núcleo del tracto solitario

ON Óxido nítrico

ONL Capa del nervio olfativo (olfatory nerve layer)

PA Presión arterial

PAD Presión arterial diastólica

~ 126 ~

PAM Presión arterial media

PAS Presión arterial sistólica

PC Peso corporal

ROS Especies reactivas del oxígeno

RTP Resistencia total periférica

SFO Órgano subfornical (subfornical organ)

SHR Ratas espontáneamente hipertensas

SNC Sistema nervioso central

SRA Sistema renina-angiotensina

SRAA Sistema renina-angiotensina-aldosterona

TH Tirosina hidroxilasa

THser19p Tirosina hidroxilasa fosforiladas en la serina 19



Tm Temperatura de melting

VI Ventrículo izquierdo

VM Volumen minuto (gasto cardiaco)

VP Vasopresina (hormona antidiurética, ADH)

VS Volumen sistólico

WB Western blot

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