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Programa de Pós Graduação Stricto Sensu
Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Campus Rio de Janeiro
Luzimar da Silva de Mattos do Nascimento
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS
EM FRUTOS DE Eugenia brasiliensis, Lam.
RIO DE JANEIRO – RJ
2015
Luzimar da Silva de Mattos do Nascimento
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS
EM FRUTOS DE Eugenia brasiliensis, Lam.
Orientador: Dr. Ronoel Luiz de Oliveira Godoy
Coorientadora: Dra. Edna Maria Morais Oliveira
RIO DE JANEIRO – RJ
2015
Dissertação submetida como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciência
e Tecnologia de Alimentos, no Programa de
Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Área de Concentração em
Tecnologia de Alimentos.
A meus pais, esposo e filho.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter-me permitido concluir este trabalho apesar das dificuldades e por toda graça a
mim concedida, por colocar na minha vida pessoas especiais tanto na vida profissional como
na pessoal.
Ao programa de pós-graduação do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia – RJ e
a todos os professores pela dedicação por oferecer um curso de qualidade.
À Embrapa Agroindústria de Alimentos, por toda a infra-estrutura e apoio técnico fornecidos.
Ao D.Sc. Ronoel Luiz de Oliveira Godoy pela orientação, amizade, por compartilhar seu
conhecimento e pela confiança no meu trabalho.
À D.Sc. Edna Maria Morais Oliveira pela orientação, sugestões e contribuição para o
enriquecimento do trabalho.
À D.Sc Renata Galhardo Borguini pelo incentivo, apoio e troca de conhecimentos desde
o período do processo seletivo para este curso.
Aos integrantes da banca, por toda a atenção dada ao trabalho final.
Aos amigos do Laboratório de Cromatografia Líquida, Sidney Pacheco e Manuela Santiago,
por todo apoio, conhecimento transmitido, pela amizade construída e acolhimento na equipe
do laboratório.
Aos estagiários do laboratório de Cromatografia Líquida: Karen Mazza, Jéssica Rocha, Igor
Julião, por toda contribuição ao longo dos estudos.
Aos bolsistas: Elaine Braga, Víctor de Carvalho e Carolina Passos pelo incentivo, opiniões e
contribuição neste trabalho e no laboratório. Pela amizade construída e por entenderem as
broncas também.
Aos meus pais (Luzinete e Gilson) pelo incentivo aos estudos durante toda a vida.
Aos meus irmãos por todo incentivo e por me verem como um exemplo.
Ao meu marido Fábio Bazani pelo apoio e por compartilhar os cuidados com nosso filho, nos
momentos de ausência, apesar de também estar cursando mestrado (Não somos loucos!). Sem
você, isso não seria possível.
Ao meu filho Miguel por ser um filho maravilhoso e entender quando mamãe estava
estudando.
A todos os amigos da turma de mestrado 2014, pelo companheirismo, pelas experiências
compartilhadas e por todo incentivo e cumplicidade. As aulas se tornaram muito mais
prazerosas com a companhia de vocês.
Enfim, a todos que colaboraram direta ou indiretamente, para a conclusão deste trabalho.
―Ninguém poderá jamais aperfeiçoar-se,
se não tiver o mundo como mestre.
A experiência se adquire na prática.‖
William Shakespeare
NASCIMENTO, L.S.M. Identificação e quantificação de compostos bioativos em frutos
de Eugenia brasiliensis, Lam. 2015. 83 páginas. Dissertação (Mestrado Profissional em
Ciência e Tecnologia de Alimentos). Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ),
Campus Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2015.
RESUMO
A biodiversidade é uma das propriedades fundamentais da natureza e fonte de imenso
potencial de uso econômico. O potencial de utilização da biodiversidade é fruto da adequada
combinação entre disponibilidade de matéria-prima, tecnologia e mercado. O Brasil é
considerado um dos países com biomas mais ricos e importantes do planeta. A domesticação
de plantas nativas, incluindo aquelas já conhecidas e utilizadas por populações locais ou
regionais, porém sem penetração no mercado nacional ou internacional, é a grande
oportunidade que se oferece aos países ricos em recursos genéticos. Neste contexto, o
presente trabalho avaliou frutos de Eugenia brasiliensis, Lam. (Grumixama), realizando-se
uma investigação com a finalidade de identificar componentes com propriedades
antioxidantes. Foram realizadas análises dos seguintes compostos bioativos: ácido ascórbico
(Vitamina C), carotenoides, antocianinas, flavonoides e ácidos fenólicos. Os açúcares também
foram analisados, uma vez que interferem diretamente sobre a aceitação de produtos. A
técnica de técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foi empregada em todas as
análises de bioativos realizadas. Foi encontrada no fruto a quantidade de 23,07 mg/100g de
vitamina C, o que classifica este alimento como rico neste bioativo, baseando-se na
Resolução RDC nº 269, de 22 de setembro de 2005, que regulamenta a ingestão diária
recomendada deste bioativo. Foram identificados e quantificados oito carotenoides, sendo a β-
criptoxantina, a majoritária, com 28,55 μg/g na parte comestível do fruto. O fruto com este
resultado é, considerado fonte deste carotenoide. Cerca de 4,8% de antocianinas foram obtidas
nas cascas liofilizadas dos frutos, sendo detectadas sete antocianinas, das quais as duas
antocianinas majoritárias: delfinidina3-O-glicosídeo e cianidina 3-O-glicosídeo,
representavam 96% do total. Além disto, foram identificados dez compostos fenólicos nas
cascas de grumixama, nove na polpa e sete nas sementes. Com estes resultados, verificou-se
serem os frutos de grumixama, promissores para futura exploração e utilização em produtos
inovadores.
Palavras chave: Myrtaceae, Eugenia brasiliensis, Bioativos.
NASCIMENTO, LSM. Identification and quantification of bioactive compounds in fruits
of Eugenia brasiliensis, Lam. 83 pages. Dissertation. Graduate Program in Food Science and
Technology, Federal Institute of Education, Science and Technology of Rio de Janeiro (IFRJ),
Campus Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2015.
ABSTRACT
Biodiversity is one of the fundamental properties of nature and source of immense economic
potential. The potential use of biodiversity is the result of the appropriate combination of
availability of raw materials, technology and market. Brazil is considered one of the countries
with the richest and more important biomes on the planet. The domestication of native plants,
including those already known and used by local or regional populations, but without
penetration at the national or international market, is the great opportunity offered to the
countries rich in genetic resources. In this context, the present study evaluated the fruits of
Eugenia brasiliensis Lam. (Grumixama), by carrying out an investigation in order to identify
components with antioxidant properties. Analyzes of the following bioactive compounds were
performed: ascorbic acid (Vitamin C), carotenoids, anthocyanins, phenolic acids and
flavonoids. The sugars were analyzed since they interfere directly on the acceptance of
products. High Performance Liquid Chromatography was used in all analyzes of bioactive
compounds. It was found in the fruit the amount of 23.07 mg / 100 g of vitamin C, which
classifies this as food rich in this bioactive, based on the RDC Resolution No. 269 of 22
September 2005, which regulates the recommended daily intake of this bioactive. Eight
carotenoids were identified and quantified, and the β-cryptoxanthin was the majority one
with 28.55 mg / g in the edible part of the fruit. The fruit with this content is considered
source of this carotenoid. About 4.8% of anthocyanins were obtained in lyophilized fruit
shells, where seven anthocyanins were detected. The two major anthocyanins were the
delphinidin 3-O-glucoside and cyanidin-3-O-glycoside, both representing 96% of the total
monomeric anthocyanins. Furthermore, ten phenolic compounds were identified in the
grumixama peel, nine in the pulp and seven in the seeds. According to these results, the fruits
of grumixama can be considered promising for future exploration and use in innovative
products.
Keywords: Myrtaceae, Eugenia brasiliensis, Bioactive.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 2.1: Características de Grumixama. 1 A - Flores da espécie e 1 B - Fruto grumixama.
15
Figura 4.1: Estruturas químicas dos ácidos fenólicos comumente encontrados na natureza.
20
Figura 4.2: Estrutura química das cumarinas. 21
Figura 4.3: Estrutura química dos grupos mais encontrados em alimentos. 22
Figura 4.4: Principais antocianinas encontradas em alimentos. 24
Figura 4.5: Estruturas químicas de carotenoides observados a nível plasmático. 25
Figura 4.6: Estrutura do ácido ascórbico. 27
Figura 4.7: Esquema básico de um sistema cromatográfico. 29
Figura 4.8: Espectrofotômetro Shimadzu UV-1800 do laboratório de Cromatografia Líquida
da Embrapa. 30
Figura 4.9: Modelo de espectrômetro de massas do laboratório de Cromatografia Líquida da
Embrapa Agroindústria de Alimentos. 31
Figura 4.10: Representação dos três setores do espectrômetro de massas QToF. 31
Figura 6.1: Partes do fruto de grumixama. 34
Figura 6.2: Porcentagem das partes do fruto (base úmida). 34
Figura 6.3: Fluxograma de preparação de amostra . 35
Figura 6.4: Fase etérea (amarela) da extração de carotenoides totais. 37
Figura 6.5: Liofilizador de bancada utilizado (A) e pó obtido após o processo de liofilização
(B). 40
Figura 7.1: Cromatograma da análise de carotenoides da semente de grumixama sem
saponificação. 44
Figura 7.2: Espectros de UV/VIS de Clorofila 44
Figura 7.3: Cromatograma da análise de carotenoides do extrato saponificado da semente de
grumixama. 45
Figura 7.4: A - Cromatograma da análise de carotenoides do extrato de polpa de grumixama
(antes da saponificação) e B - Cromatograma da análise de carotenoides do extrato de casca
de grumixama antes da saponificação. 46
Figura 7.5: Perfil cromatográfico da análise de carotenoides do extrato da polpa de
grumixama. 47
Figura 7.6: Perfil cromatográfico de dos extratos da casca de grumixama após saponificação.
47
Figura 7.7: Espectros UV/Vis dos carotenoides identificados nas frações polpa e casca do
fruto grumixama. 48
Figura 7.8: Extrato da análise de carotenoides totais da casca de grumixama. 50
Figura 7.9: Cromatograma da análise de vitamina C do extrato da parte comestível (polpa e a
casca) e semente do fruto grumixama. 52
Figura 7.10: Espectro na região UV/Vis da vitamina C. 52
Figura 7.11: Análise de vitamina C - cromatograma da análise de vitamina C do extrato da
casca de grumixama com adição padrão de ácido ascórbico. 52
Figura 7.12: Análise de açúcares - cromatograma do extrato aquoso da semente de
grumixama. 53
Figura 7.13: Análise de açúcares – cromatograma do extrato aquoso da polpa do fruto
grumixama. 54
Figura 7.14: Análise de açúcares - cromatograma do extrato aquoso da casca do fruto
grumixama. 54
Figura 7.15: Extração de antocianinas do pó da casca do fruto de grumixama. A - Extração da
amostra com solução ácido fórmico/metanol. B - coloração incolor do sobrenadante. C -
Sobrenadante no balão volumétrico após a extração. D - Extrato após centrifugação. 55
Figura 7.16: Cromatograma obtido por CLAE-DAD do extrato antociânico da casca de
grumixama. Espectro A - pico 1 (delfinidina-3-O-glicosídeo) e espectro B - pico 3 (cianidina-
3-O-glicosídeo). 56
Figura 7.17: Espectros de Massas da Antocianina 1 da casca de grumixama. 57
Figura 7.18: Espectros de Massa Sequencial do Íon Molecular m/z 465 u e Detecção da
Aglicona Delfinidina (m/z aproximado 303). 58
Figura 7.19: Espectro Espectros de Massas da Antocianina 3 da casca de grumixama.
58
Figura 7.20: Espectro de Massa Sequencial da Antocianina 3 e Confirmação da Aglicona
Cianidina. 58
Figura 7.21: Sobreposição do cromatograma de análise de antocianinas do extrato das cascas
de grumixama x Cromatograma de análise de antocianinas do extrato das cascas de
jabuticaba. 60
Figura 7.22: Sobreposição dos cromatogramas de análise de antocianinas do extrato das
cascas de grumixama (preto) x Cromatograma de análise de antocianinas do extrato da das
cascas de uva (vinho). 60
Figura 7.23: Espectros na região UV/Vis das antocianinas 2, 4 e 6. 61
Figura 7.24: Espectros na região UV/Vis das antocianinas 5 e 7. 61
Figura 7.25: A - Cromatograma de extratos da polpa de grumixama para análise de fenólicos
hidrolisáveis e B - Cromatograma de extratos da polpa de grumixama para análise de
fenólicos livres 64
Figura 7.26: A - Cromatograma de extratos da casca para análise de fenólicos livres, B -
Cromatograma de extratos da casca para análise de fenólicos hidrolisáveis. 65
Figura 7.27: A - Cromatograma de extrato de sementes para fenólicos livres; B: Cromatograma
de extrato de sementes para fenólicos hidrolisáveis. 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 6.1: Gradiente de eluição das fases móveis para separação dos carotenoides. 38
Tabela 6.2: Gradiente de eluição das fases móveis para separação das antocianinas. 41
Tabela 6.3: Gradiente de eluição das fases móveis para separação dos ácidos fenólicos. 42
Tabela 7.1: Caracterização dos frutos. 43
Tabela 7.2: Umidade do fruto de grumixama. 43
Tabela 7.3: Média dos carotenoides totais na polpa e na casca do extrato não saponificado. 46
Tabela 7.4: Média dos carotenoides totais na polpa e na casca do extrato saponificado. 49
Tabela 7.5: Média da concentração de vitamina C nos frutos de grumixama 51
Tabela 7.6: Média dos açúcares identificados no fruto de grumixama. 54
Tabela 7.7: Parâmetros Operacionais do Espectrômetro de Massas. 57
Tabela 7.8: Resultados Obtidos por EM. 59
Tabela 7.9: Equação da reta e coeficiente de determinação das curvas analíticas para
antocianinas. 61
Tabela 7.10: Concentração das antocianinas encontradas nas cascas liofilizadas do fruto de
grumixama. 62
Tabela 7.11: Fenólicos livres identificados nos frutos de grumixama. 63
Tabela 7.12: Fenólicos hidrolisados identificados nos frutos de grumixama. 63
Tabela 7.13: Concentração média de fenólicos encontrados em frutos de grumixama. 66
Tabela 7.14: Curvas analíticas e coeficiente de determinação de fenólicos. 66
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................... 8
ABSTRACT ............................................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13
2 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 15
3 OBJETIVO ............................................................................................................................ 16
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 16
4 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 17
4.1 MIRTÁCEAS ..................................................................................................................... 17
4.1.1 Eugenia brasiliensis ......................................................................................................... 17
4.2 COMPOSTOS COM PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES .......................................... 18
4.2.1 Compostos Fenólicos ....................................................................................................... 19
4.2.1.1 Ácidos fenólicos ........................................................................................................... 20
4.2.1.2 Flavonoides ................................................................................................................... 21
4.2.1.2.1 Antocianinas .............................................................................................................. 22
4.2.2 Carotenoides .................................................................................................................... 24
4.4 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO UV-VISÍVEL 29
4.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS (MS-MS) ................................................................. 30
5 MATERIAL .......................................................................................................................... 32
5.1SOLVENTES E REAGENTES........................................................................................... 32
5.2 EQUIPAMENTOS ............................................................................................................. 33
6 METODOLOGIA .................................................................................................................. 34
6.1 COLETA DE AMOSTRAS ............................................................................................... 34
6.1.1 Teste de caracterização dos frutos ................................................................................... 36
6.2 ANÁLISE DE UMIDADE ................................................................................................. 36
6.3 ANÁLISE DE CAROTENOIDES ..................................................................................... 37
6.3.1 Extração de carotenoides ................................................................................................. 37
6.4 ANÁLISE DE ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C) .................................................... 39
6.6 ANÁLISE DE ANTOCIANINAS ..................................................................................... 39
6.7 ANÁLISE DE FLAVONOIDES E ÁCIDOS FENÓLICOS ............................................. 41
7 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................... 43
7.1 CARACTERIZAÇÃO DOS FRUTOS .............................................................................. 43
7.3ANÁLISE DE CAROTENOIDES ...................................................................................... 44
7.3.1 Sementes .......................................................................................................................... 44
7.3.2 Polpa e casca .................................................................................................................... 45
7.4 VITAMINA C .................................................................................................................... 50
7.5 AÇÚCARES ....................................................................................................................... 53
7.6 ANTOCIANINAS .............................................................................................................. 55
7.7 FLAVONOIDES E ÁCIDOS FENÓLICOS ...................................................................... 62
8 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 68
9 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 69
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 70
13
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é considerado o país de maior diversidade de vida do planeta, o que o torna
alvo de cobiça e infindáveis discussões sobre a forma de sua utilização econômica. A
biodiversidade tomou notória importância com os estudos do biólogo Wilson, E.O. (1997).
Com 15% a 20% do número total de espécies e com a mais diversa flora do mundo, o país
conta também com alguns dos biomas mais ricos do planeta em número de espécies vegetais:
a Amazônia, a Mata Atlântica e o Cerrado. O Brasil contém também em seu território uma
rica flora, além dos maiores remanescentes de ecossistemas tropicais. Apesar dessa riqueza e
do potencial que ela representa, a biodiversidade brasileira é ainda pouco conhecida e sua
utilização tem sido negligenciada.
Myrtaceae constitui uma das mais importantes famílias de Angiospermae no Brasil. É
conhecida por sua elevada riqueza de espécies e por seu importante papel na fitossociologia
das Florestas do Sul e Sudeste do Brasil (KURTZ e ARAÚJO, 2000; ROMAGNOLO e
SOUZA, 2004), sendo um dos grupos predominantes do componente arbóreo da Mata
Atlântica (LOMBARDI e GONÇALVES, 2000; LIMA e GUEDES-BRUNI, 1997).
As mirtáceas brasileiras geralmente não produzem madeiras valiosas, restringindo-se
ao fornecimento de lenha, à utilização em pequenas peças ou objetos e outras formas de uso
local (MARCHIORI e SOBRAL, 1997). Por outro lado, existem numerosas espécies
frutíferas, algumas exploradas comercialmente: a goiabeira, Psidium guajava L., a
jabuticabeira, Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg, e a pitangueira, Eugenia uniflora L. Essas
espécies representam apenas uma pequena fração do grande potencial econômico da família,
tendo em vista o grande número de frutos comestíveis produzidos por espécies não
comerciais: como a Myrciaria glazioviana (cabeludinha) e a Neomitrantes obscura (pitanga
de cachorro) e a Eugenia brasiliensis, Lam. (grumixama) (LANDRUM e KAWASAKI,
1997).
Compostos bioativos são substâncias oriundas do metabolismo secundário dos
vegetais, possuindo um papel relevante na qualidade dos alimentos e contribuem na
prevenção de doenças (DEWICK, 2009). Compreendem diferentes classes de substâncias com
atividade antioxidante, dentre as quais se destacam os carotenoides, ácido ascórbico e os
compostos fenólicos (flavonoides e ácidos fenólicos). (DEWICK, 2009; CABRAL et al.;
2009; BRAGA et al., 2010).
O presente trabalho visa contribuir para uma melhor identificação do valor funcional
de frutos de uma espécie de mirtácea pouco explorada, a Eugenia brasiliensis, Lam.,
14
conhecida como Grumixama, identificando e quantificando substâncias com potencial
antioxidante.
15
2 JUSTIFICATIVA
O atual cenário mundial, onde as pessoas estão buscando cada vez mais opções
saudáveis para sua alimentação, foi o agente impulsionador desse trabalho. O presente
trabalho está estrategicamente alinhado ao Portfólio de Projetos da Embrapa, Alimentos,
Nutrição e Saúde (AliNutriS), principalmente no que se refere ao desenvolvimento de
metodologias e instrumentos para prospecção e avaliação in vitro e in vivo da segurança e de
propriedades benéficas de alimentos e seus componentes à saúde humana. Adicionalmente, a
exploração de novas espécies está em alinhamento ao Portfolio Química e Tecnologia de
Biomassa, que visa à valorização da biomassa nacional.
A família das mirtáceas, apesar de sua importância, apresenta poucas espécies com
frutos explorados. Com o desmatamento da mata atlântica durante vários anos, o número real
de espécies desta família poderá nunca ser conhecido. Neste contexto, torna-se interessante o
estudo de espécies preservadas, com a caracterização de seus compostos bioativos. A
investigação de tais compostos pode propiciar o consumo de novas frutas, introduzindo-as na
alimentação da população e até sua domesticação.
Os frutos de grumixama (Eugenia brasiliensis, Lam.) (FIGURA 2.1), foram pouco
estudados até hoje e uma identificação de compostos bioativos presentes em seus frutos é
importante diante da possibilidade de descoberta de novas fontes de nutrientes, além de poder
despertar o interesse de sua comercialização e utilização em produtos inovadores associada à
preservação da biodiversidade.
Figura 1.1: Características de grumixama. 1 A- Flores da espécie 1 B- Fruto grumixama.
FOTO: Autora.
A B
16
3 OBJETIVO
Identificação e quantificação de compostos bioativos em frutos Eugenia brasiliensis
Lam., por cromatografia líquida.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar e quantificar carotenoides, flavonoides, ácidos fenólicos, vitamina C;
Identificar e quantificar açúcares;
Identificar e quantificar antocianinas e confirmar por massa acurada, as
antocianinas majoritárias presentes nas cascas dos frutos de Eugenia brasiliensis,
Lam.
17
4 REVISÃO DA LITERATURA
4.1 MIRTÁCEAS
A família Myrtaceae é composta por cerca de 130 gêneros e 5671 espécies
(GOVAERTSet al., 2008). Destacando-se, com mais de uma centena de espécies, os gêneros
Eugenia, Myrcia e Calyptranthes, enquanto o restante dos gêneros possui menos de 60
espécies brasileiras (BARROSO e PERÓN, 1994; LANDRUM e KAWASAKI, 1997).
Muitas destas espécies possuem alto potencial alimentar e são comercializadas in
natura para aplicação na produção de sorvetes, sucos, geleias e outros produtos
manufaturados (PEREIRA et al., 2012; SOBRAL et al., 2013).
Algumas espécies estão desaparecendo da natureza antes mesmo que se tenha
conhecimento básico de sua biologia (LANDRUM e KAWASAKI, 1997), como pode ser
visto pelas listas de espécies de Myrtaceae ameaçadas no Brasil, divulgadas recentemente.
(BIODIVERSITAS, 2006).
4.1.1 Eugenia brasiliensis
A espécie Eugenia brasiliensis Lamarck, é conhecida popularmente como grumixama,
grumixameira, grumixaba, itapoiroti e cumbixaba. Na medicina popular, o uso da espécie na
forma de infusão das folhas, foi relatado para o tratamento de artrite e reumatismo, e como
diurético. Os frutos maduros são usados como alimento e para a preparação de bebidas
fermentadas. Devido ao seu alto teor de taninos, o que lhe confere ação adstringente, as cascas
eram usadas na indústria de couro, como tanantes. Os frutos de E. brasiliensis, Lam. são
comestíveis e apresentam coloração variável, sendo reconhecida três variedades: a vermelha,
a roxa e a amarela ou branca (MORENO et al., 2007). Possui uma polpa espessa de cor clara,
bastante suculenta e doce, que normalmente derrete na boca, lembrando certamente um sabor
muito semelhante aos das cerejas, sendo por isso também chamada de cereja do Brasil. A
árvore quando é cultivada costuma atingir em torno de 6 a 7 metros de altura em ambientes
abertos, porém existem registros de que foram encontrados exemplares com mais de 20
metros de altura.
Nativa da Mata Atlântica, a Grumixama é uma árvore de porte médio, altamente
resistente à variação climática, que ocorre do sul da Bahia até Santa Catarina.
É uma árvore com flores brancas de muito perfume, dotada de copa densa e estreita. Ela
floresce a partir do final do mês de setembro até novembro, e seus frutos costumam
amadurecer até os meses de novembro e dezembro. Produzem grande quantidade de frutos
18
todos os anos, porém não existem maiores dados de sua produtividade, por não terem objetivo
comercial.
Em um estudo realizado por Reynertson et al. (2008), foram encontradas na variedade
de frutos roxos, duas antocianinas: cianidina-3-O-glicosídeo e delfinidina-3-O-glicosídeo,
sendo identificados também ácido elágico e flavonoides como miricetina, quercetina,
quercitrina e rutina. Os pesquisadores concluíram que os taninos elágicos e os flavonoides são
os responsáveis pela forte atividade antioxidante do extrato destes frutos. Na literatura, pode
ser encontrado também um estudo feito por Flores (2012), que identificou nove antocianinas
nos frutos de Eugenia brasiliensis: cianidina-3-O-glicosídeo, cianidina-3-O-galactosídeo,
cianidina-3-O-arabnosídeo, delfinidina-3-O-pentosídeo, cianidina-3-O-xilosídeo, malvidina-
3-O-glicosídeo, delfinidina-3-O-glicosídeo, cianidina e delfinidina.
4.2 COMPOSTOS COM PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES
Um antioxidante é qualquer substância capaz de retardar ou impedir danos devidos à
oxidação (como rancificação e formação de off-flavors em alimentos) estando presente em
pequenas concentrações, quando em comparação com o agente oxidante. As substâncias
antioxidantes podem apresentar diferentes propriedades protetoras e agir em diversas etapas
do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos e são, portanto, classificadas
em duas categorias principais: antioxidantes primários e secundários. São considerados
primários os compostos de ação antioxidante capazes de inibir ou retardar a oxidação por
inativação de radicais livres graças à doação de átomos de hidrogênio ou de elétrons o que
transforma os radicais em substâncias estáveis. Os antioxidantes secundários apresentam uma
grande variedade de modos de ação: ligação de íons metálicos (alteração de valência);
inativação de espécies reativas de oxigênio (ERO), conversão de hidroperóxidos em espécies
não-radicalares ou absorção de radiação UV (MAISUTHISAKUL et al., 2007).
Inúmeros fatores afetam a qualidade de vida moderna, de modo que a população deve
ter consciência da importância de alimentos contendo componentes que auxiliam a promoção
da saúde, melhorando seu estado nutricional. A incidência de morte por acidentes
cardiovasculares, câncer, acidente vascular cerebral, arteriosclerose, enfermidades hepáticas,
dentre outras doenças, pode ser minimizada através de bons hábitos alimentares. As
recomendações nutricionais sugerem que sejam ingeridas cinco porções de frutas e verduras
(cerca de 80 gramas) por dia para ter-se uma alimentação saudável (HE et al.,1996).
A busca por antioxidantes naturais para produtos alimentícios, cosméticos e
farmacêuticos vem representando um importante desafio para a pesquisa industrial nos
últimos 20 anos (LAGUERRE et al., 2007).
19
Os principais antioxidantes nos vegetais são as vitaminas C e E, os carotenoides e os
compostos fenólicos, especialmente os flavonoides. Esses antioxidantes absorvem radicais
livres e inibem a cadeia de iniciação ou interrompem a cadeia de propagação das reações
oxidativas promovidas pelos radicais (PODSEDEK, 2007). Além da ingestão de frutas e
vegetais, que são recomendados como fontes de compostos antioxidantes, acredita-se que a
suplementação da dieta com ervas, contendo altas concentrações de compostos capazes de
desativar radicais livres, tenha também efeitos benéficos à saúde. (CAPECKA et al., 2004).
4.2.1 Compostos Fenólicos
As plantas sintetizam uma diversidade de compostos orgânicos que são
tradicionalmente classificados como metabólitos primários e secundários. Metabólitos
primários são compostos produzidos por todas as plantas e que desempenham funções
essenciais, tais como a fotossíntese, a respiração, o crescimento e o desenvolvimento. Em
contrapartida, os metabólitos secundários são estruturalmente diversos e muitos são
distribuídos em um número limitado de espécies no reino vegetal (TAIZ e ZEIGER, 2004).
Os compostos do metabolismo secundário têm funções ecológicas importantes nos vegetais
contra ataque de patógenos, herbívoros e radiação ultravioleta; atuam também na sinalização e
na atração de insetos polinizadores e dispersores de semente, bem como agentes na
competição planta–planta (PICHERSKY e GANG, 2000).
A presença dos compostos fenólicos em plantas tem sido muito estudada por estes
apresentarem atividades farmacológica e antinutricional e também por inibirem a oxidação
lipídica e a proliferação de fungos (NAGEM et al., 1992; GAMACHE et al., 1993;
IVANOVA et al., 1997; AZIZ et al., 1998; FERNANDEZ et al., 1998; HOLLMAN e
KATAN, 1998), além de participarem de processos responsáveis pela cor, adstringência e
aroma em vários alimentos (PELEG et al., 1998).
Os compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas na Natureza, tendo
sido 8000 compostos já detectados em plantas (DREOSTI, 2000). Podem ser pigmentos, que
dão a aparência colorida aos alimentos, ou produtos do metabolismo secundário, derivados de
reações de defesa das plantas contra agressões do ambiente. Esses compostos agem como
antioxidantes, não somente pela sua habilidade em doar hidrogênio ou elétrons, mas também
em virtude de seus radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de vários
ingredientes do alimento, particularmente de lipídios (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
Esta classe de compostos apresenta uma grande diversidade e divide-se em
flavonoides e não-flavonoides. Os átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes
(orto-difenóis), localizados em várias posições dos anéis A, B e C, as duplas ligações dos
20
anéis benzênicos e a dupla ligação da função oxo (-C=O) de algumas moléculas de
flavonoides garantem a esses compostos sua alta atividade antioxidante (HRAZDINA et al.,
1970; RICE-EVANS et al., 1996).
4.2.1.1 Ácidos fenólicos
Os ácidos fenólicos são algumas das substâncias que constituem o grupo dos
compostos fenólicos. Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupamento
carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na molécula, conferindo
propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para o organismo (KERRY e
ABBEY, 1997; BRAVO, 1998; CROFT, 1998; FERGUSON e HARRIS, 1999).
Os ácidos fenólicos são divididos em três grupos. O primeiro é composto pelos ácidos
benzóicos, que possuem sete átomos de carbono (C6-C1) e são os ácidos fenólicos mais
simples encontrados na natureza. O segundo é formado pelos ácidos cinâmicos, que possuem
nove átomos de carbono (C6-C3), sendo sete: ácido cinâmico, ácido o-cumárico, ácido m-
cumárico, ácido p-cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico e ácido sinápico, os mais
comumente encontrados no reino vegetal. Suas fórmulas gerais e denominações estão
representadas na Figura 4.1.
COOH
R1O
R2
R3
R1
R2
R3
COOH
Ácido GálicoÁcido VanílicoÁcido Siríngico
R1 R2 R3
H
CH3
CH3
OH
OH
H
OH
H
OCH3
Ácido p-cumárico
Ácido Caféico
Ácido Ferúlico
Ácido Sinápico
R1 R2 R3
H
OH
OCH3
OCH3
OH
OH
OH
OH
H
H
H
OCH3 Figura 4.1: Estruturas químicas dos ácidos fenólicos comumente encontrados na natureza.
Ácido benzóico Ácido cinâmico
21
As cumarinas são derivadas do ácido cinâmico por ciclização da cadeia lateral do
ácido o-cumárico (FIGURA 4.2).
Figura 4.2: Estrutura química das cumarinas.
Os ácidos fenólicos, além de se apresentarem sob sua forma natural, podem também se
ligar entre si ou com outros compostos. (SOARES, 2002).
Diversos autores realizaram estudos visando verificar o potencial antioxidante dos
ácidos fenólicos, com o objetivo de substituir os antioxidantes sintéticos, largamente
utilizados na conservação de alimentos lipídicos por chegarem a aumentar a vida útil de
muitos produtos entre 15 e 200% (DURÁN e PADILLA, 1993).
4.2.1.2 Flavonoides
Os flavonoides estão amplamente distribuídos no reino vegetal e constituem uma parte
importante da dieta humana, compreendem um grupo de compostos fenólicos amplamente
distribuídos nas frutas e nos vegetais, apresentando-se sob muitas variações Suas principais
fontes em alimentos, segundo a literatura, são: café, cebola, maçã, uva cerveja, vinho tinto e
especialmente chá, que contém, sobretudo, catequinas em sua composição (GRAHAM, 1992;
VAN ACKER, S.A. et al., 1996). A ingestão destes compostos está associada com a
longevidade e redução na incidência de doenças cardiovasculares, devido suas propriedades
benéficas à saúde humana, tais como atividade antioxidante, anti-inflamatória, anti-tumoral e
anticoagulante (VOLP et al., 2008).
A estrutura básica dos flavonoides apresenta uma formação de 15 átomos de carbono
na formação C6-C3-C6, composta por dois anéis aromáticos ligados por três carbonos e um
átomo de oxigênio formando um anel heterocíclico oxigenado, denominado anel C
(DEWICK, 2009). As principais subclasses comumente encontrada em alimentos são as
22
antocianidinas, as catequinas, as flavonas, os flavonols, as flavanonas, as isoflavonas, entre
outros (FIGURA 4.3).
Figura 4.3: Estrutura química dos grupos mais encontrados em alimentos.
4.2.1.2.1 Antocianinas
As antocianinas compõem o maior grupo de pigmentos naturais solúveis em água do
reino vegetal e são especialmente característicos das angiospermas, as quais proveem uma
grande fonte de alimentos, ocorrendo ao menos em 27 famílias, 73 gêneros e em inúmeras
espécies (BRIDLE e TIMBERLAKE, 1997).
As antocianinas (do grego anthos=flores e kianos=azul) são metabólitos secundários e
constituem o maior grupo de flavonoides responsáveis pelas cores rosa, vermelho, violeta e
azul encontradas em muitas flores, frutos e folhas (FIGURA 4.4). Algumas vezes, estão
presentes em raízes, tubérculos e caules. Nas plantas servem como atrativos para pássaros e
insetos responsáveis pela polinização, protegem contra raios ultravioleta, herbívoros e
infecções fungopatogênicas. (CHANDRA et al., 1992; MESKIN et al., 2004; BRIDLE e
TIMBERLAKE, 1996; RENAULT et al., 1997; ALCALDE-EON et al., 2004; EINBOND et
al., 2004; ANDERSEN e MARKHAM, 2006; MARÇO et al., 2008; CHARRON et al., 2009).
São derivadas do benzopirano. As funções desempenhadas pelas antocianinas nas plantas são
variadas: antioxidantes, proteção à ação da luz, mecanismo de defesa e função ecológica. As
cores vivas e intensas que elas produzem têm um papel importante em vários mecanismos
reprodutores das plantas, tais como: polinização e dispersão de sementes.
23
Recentemente, maior atenção tem sido dada aos possíveis benefícios para a saúde
destes compostos na prevenção de doenças crônicas e degenerativas incluindo doenças
cardíacas e câncer (LIM et al, 2011;. ZIBERNA et al., 2010).
Atualmente são utilizados inúmeros corantes artificiais na indústria, com objetivo
único de conferir cor aos alimentos, não possuindo nenhum valor nutritivo. Segundo a
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), estudos toxicológicos mostram que
corantes não fazem mal à saúde se usados nos limites definidos pela legislação. Mas existem
controvérsias quanto aos seus malefícios. Alguns estudos recentes mostram que os corantes
artificiais podem ser cancerígenos, causar dermatite alérgica e irritação da pele (GODOY e
PRADO, 2003). Por este motivo, muitos produtores de alimentos estão se voltando para o uso
de corantes de origem natural.
Uma das desvantagens das antocianinas diante de corantes sintéticos é devido à
mudança de cor devido a reações químicas dos produtos alimentícios. Durante a estocagem,
as antocianinas sofrem modificações devido à sua sensibilidade ao efeito da temperatura,
oxigênio, luz e ação enzimática (JACKMAN et al., 1987; FRANCIS, 1989). Um problema
particular é a influência do pH em seu comportamento, devido às diferentes estruturas que as
antocianinas apresentam em equilíbrio aquoso, assim como a descoloração das antocianinas
devido à adição de bissulfito (IACOBUCCI e SWEENY, 1983).
24
O
R1
R2
R3
OH
HO
OH
R1 R2 R3
Cianidina (Cy) OH OH H
Delfinidina (Dp) OH OH OH
Malvidina (Mv) OMe OH OMe
Pelargonidina (Pg) H OH H
Peonidina (Pn) OMe OH H
Petunidina (Pt) OMe OH OH
Figura 4.4: Principais antocianinas encontradas em alimentos.
4.2.2 Carotenoides
Carotenoides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza. São
lipossolúveis e apresentam coloração que vai do amarelo ao vermelho, presentes em muitas
frutas e vegetais. Em plantas superiores, estão localizados em organelas subcelulares
(cloroplastos e cromoplastos). Nos cloroplastos encontram-se associados principalmente a
proteínas e são, normalmente, mascarados pela presença de outros pigmentos clorofílicos
dominantes. Atuam como pigmentos fotoprotetores na fotossíntese e como estabilizadores de
membranas. (KURZ, 2008).
Existem, aproximadamente, 700 carotenoides na natureza, destes apenas 40 podem ser
absorvidos, metabolizados e utilizados pelo organismo humano, onde apenas 6 dentre os 40
são observados a nível plasmático, o β-caroteno, α-caroteno, licopeno, β-criptoxantina,
zeaxantina e a luteína (FIGURA 4.5) (FERNÁNDEZ-GARCÍA et al., 2012). Processos de
ciclização, hidrogenação, desidrogenação, migração de duplas ligações, encurtamento ou
alongamento de cadeia, rearranjo, isomerização, introdução de funções com oxigênio ou a
25
combinação destes processos resultam nesta grande diversidade de estrutura dos carotenoides
(DIAS et al., 2008).
Figura 4.5: Estruturas químicas de carotenoides observados a nível plasmático.
Estruturalmente os carotenoides são tetraterpenoides de 40 carbonos unidos por
ligação cauda-cauda no centro da molécula. Esta cadeia pode ter de 3 a 15 ligações
conjugadas que determinam o espectro de absorção e, assim, a cor da molécula de carotenoide
(FRASER e BRAMLEY, 2004; STAHL e SIES, 2005). Este espectro na região UV/Vis é
uma ferramenta importante para a análise de carotenoides, já que é consequência da presença
da longa cadeia com duplas ligações conjugadas, sendo possível obter diversas informações
sobre a estrutura da molécula (MELÉNDEZ-MARTÍNEZ et al., 2007).
Os carotenoides podem ser classificados em dois grupos, os carotenos e as xantofilas.
Os carotenos são carotenoides compostos apenas por carbono e hidrogênio, já as xantofilas
apresentam grupos substituintes com oxigênio. β-caroteno, α-caroteno e licopeno são
importantes membros do grupo dos carotenos, enquanto luteína, zeaxantina e, α e β-
criptoxantina, são das xantofilas (STAHL e SIES, 2005).
Alguns dos carotenoides apresentam a estrutura cíclica β-ionona em suas moléculas
sendo, portanto, precursores de vitamina A (ex. α, β e γ-caroteno e β-criptoxantina). A
deficiência de vitamina A (retinol) é o maior problema nutricional em populações
subdesenvolvidas e suas consequências são: cegueira, morte prematura especialmente em
crianças e xeroftalmia ou olho seco, que é uma doença caracterizada pela não produção de
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3CH3 CH3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3CH3 CH3
CH3CH3
CH3CH3
CH3 CH3 CH3 CH3
CH3CH3CH3CH3
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3CH3 CH3
CH3CH3OH
OH
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3CH3 CH3
CH3CH3OH
OH
CH3
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3CH3 CH3
CH3CH3OH
-caroteno
-caroteno
Licopeno
Luteína
Zeaxantina
-criptoxantina
26
lágrimas e dificuldades de visão. A vitamina A é também importante na manutenção do
crescimento, na eficiência reprodutiva, na manutenção dos tecidos epiteliais e na prevenção
de queratinização, além de uma importante ação na resposta imunológica.
O problema nas populações subdesenvolvidas e carentes resulta da ingestão deficiente
de vitamina A pré-formada em fontes animais, devido ao baixo consumo de carnes, ovos, leite
e derivados. Nesses casos, a fonte primária de vitamina A é a pró-vitamina A na forma de
carotenoides, vindos da ingestão de frutas e vegetais (SCOTT e RODRIGUEZ-AMAYA,
2000).
A recomendação diária de ingestão de frutas e vegetais é de cinco ou mais porções, o
que é suficiente para prover de 3 a 6mg/dia de b-caroteno (IOM, 2000). Os carotenoides
dividem-se em dois grupos, os precursores de vitamina A e os que não podem ser usados na
síntese do retinol.
Estudos apontam que a função antioxidante dos carotenoides desempenha um papel
importante na redução do risco de câncer, catarata, ateriosclerose e no processo de
envelhecimento (FENNEMA, 2008). Dentre os carotenoides mais amplamente estudados o
que possui maior atividade antioxidante é o licopeno (DIAS et al., 2008; UENOJO et al.,
2007).
4.2.3 Ácido Ascórbico
Vitamina C é o nome comum dado ao ácido 2,3-enediol-L-gulônico que é um
poderoso antioxidante, pois impede a oxidação, isto é, a perda de elétrons. As moléculas do
ácido ascórbico (vitamina C) sofrem oxidação antes que outras moléculas se oxidem,
impedindo e protegendo essas outras moléculas da oxidação.
O nome "ascórbico" provêm do prefixo a- (que significa "não") e da palavra latina
scorbuticus (escorbuto), uma doença causada pela deficiência de vitamina C.
O ácido-L-ascórbico, nomenclatura definida pela IUPAC (International Union of
Pureand Applied Chemistry), é uma vitamina hidrossolúvel amplamente encontrada em frutas
e vegetais (CARDOSO et al., 2011).
Estruturalmente, o ácido ascórbico é formado por um anel ɣ lactona quase planar com
dois centros quirais nas posições 5 e 6 (FIGURA 4.6), determinando dois pares de
estereoisomêros: os ácidos L e D ascórbico, e os ácidos D e L isoascórbicos. O ácido L-
ascórbico é o que possui maior atividade vitamínica, o ácido D-ascórbico apresenta apenas
5% desta atividade, enquanto os ácidos D e L isoascórbicos não apresentam atividade
vitamínica (ROSA et al., 2007)
27
Figura 4.6: Estrutura do ácido ascórbico.
O ácido ascórbico é um dos ácidos orgânicos mais importantes da dieta humana
(MELÉNDEZ et al., 2004).Os efeitos benéficos da vitamina C estão relacionados com a sua
participação em diversos processos metabólicos, como a formação de colágeno e síntese de
epinefrina, corticoesteróides e ácidos biliares. Além de atuar como cofator enzimático e
participar de processos de óxido-redução, aumentado à absorção de ferro (ARANHA et al.,
2000).
A vitamina C funciona como agente conservante em alimentos. Para evitar a ação do
tempo nos alimentos, as indústrias se valem de agentes que preservam a integridade do
produto, aumentando a sua vida útil (STADLER, 1999).
Nos alimentos o controle do processo oxidativo é feito através do emprego de
substâncias que apresentam a propriedade de retardar a oxidação lipídica, denominadas
antioxidantes, e são normalmente utilizadas no processamento de óleos e gorduras e em
alimentos que os contêm (PEREIRA, 2008).
O ácido ascórbico age também como um potente antioxidante através da captura de
ânions superóxido (-O2·) auxiliando assim no tratamento e redução do risco de
desenvolvimento de varias patologias causadas por estresse oxidativo, tais como câncer,
aterosclerose, cardiopatias e algumas doenças degenerativas (HEAD, 1998; PINNELL, 2003;
MANELA-AZULAY et al., 2003; VALDÉS, 2006).Os seres humanos não são capazes de
sintetizar ácido ascórbico, devido à ausência da enzima L-gulonalactona oxidase, enzima a
qual catalisa a etapa final da síntese deste ácido a partir da glicose do sangue (STONE, 1984).
Sendo assim os seres humanos adquirem esta vitamina através de sua alimentação, pelo
consumo de frutas e vegetais.
4.3 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE
A cromatografia líquida é um método físico-químico de separação de espécies
químicas que ocupa um lugar de destaque entre os métodos analíticos modernos. Através
deste método é possível facilmente separar, assim como identificar e quantificar espécies
quando há a presença de padrões externos (RUTZ, 2009). Este método físico-químico
fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido
O
OH OH
O
OH
OH
28
a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, uma fase estacionária, que tem uma grande
área superficial de contato, e um fluido, que se move através da fase estacionária, chamada de
fase móvel (DEGANI et al., 1998).
Nos últimos 40 anos, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi a técnica
analítica mais desenvolvida, difundida e empregada em laboratórios de análise de indústrias
químicas e farmacêuticas, em áreas médicas e em muitos outros campos da ciência.
(MALDANER e JARDIM, 2009). Seu diferencial está na utilização de colunas com um
reduzido diâmetro partículas (2-10μm), o que promove uma maior eficiência de análise e
permite a diminuição do tamanho da coluna levando a um menor tempo de análise. Possui um
sistema de bombeamento de pressão, responsável por bombear a fase móvel líquida que elui
sobre a fase estacionária que está no interior da coluna, assim, os solutos com maior afinidade
com a fase móvel serão eluídos primeiro e posteriormente os que têm maior afinidade com a
fase estacionária. Partículas menores que 2μm promovem uma maior eficiência, porém
elevam a pressão do sistema, permitindo que este tamanho de partícula seja utilizado,
normalmente, na Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência- CLUE (MALDANER e
JARDIM, 2009; RUTZ, 2009).
A separação de analitos por CLAE pode ser realizada por diferentes mecanismos,
podendo esta ser por partição, adsorção, troca iônica ou exclusão de tamanho. Modificações
ainda podem ser realizadas em relação ao tipo de fase utilizada, podendo a separação ser
efetuada em fase normal, fase estacionária polar e fase móvel apolar, ou em fase reversa, fase
estacionária apolar e fase móvel polar. Um sistema de CLAE (FIGURA 4.7) é dotado de
abastecimento de solvente e programadores da fase móvel, bombas; injetor; coluna; e
detectores, sendo o registro dos dados feito por um registrador, integrador ou mesmo um
microcomputador, que também é utilizado na programação de todas as etapas do processo
(RUTZ, 2009).
29
Figura 4.7: Esquema básico de um sistema cromatográfico.
FONTE: ROSA, 2007.
4.4 ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO UV-VISÍVEL
A espectrofotometria visível e ultravioleta (FIGURA 4.8) é um dos métodos analíticos
mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas. É aplicada para determinações de
compostos orgânicos e inorgânicos, como, por exemplo, na identificação do princípio ativo de
fármacos.
A espectroscopia de absorção molecular é valiosa para a identificação dos grupos
funcionais na molécula. Mais importante, entretanto, são as aplicações da espectroscopia de
absorção visível/ ultravioleta para a determinação quantitativa de compostos contendo grupos
absorventes (SKOOG et al., 2006).
30
Figura 4.8: Espectrofotômetro Shimadzu UV-1800do laboratório de Cromatografia Líquida da Embrapa
Agroindústria de Alimentos
A região ultravioleta do espectro é geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm,
e a região do visível entre 400 a 800 nm. É fundamentada na lei de Lambert-Beer, que é a
base matemática para medidas de absorção de radiação por amostras no estado sólido, líquido,
sólido ou gasoso, nas regiões ultravioleta, visível e infravermelho do espectro eletromagnético
(SILVERSTEIN, 1994).
4.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS (MS-MS)
Técnica analítica utilizada para identificar compostos desconhecidos, elucidar as
propriedades químicas e estruturais de moléculas; pode ser realizada com quantidades bem
pequenas (ao nível do picograma) e a concentrações bem baixas em misturas quimicamente
complexas (ppt).
Um espectrômetro de massas (FIGURA 4.9) consiste em três principais setores,
esquematizados na figura 4.10: fonte (etapa de ionização), analisador (etapas de seleção,
fragmentação e separação para determinação da massa) e detector (etapa de contagem dos
íons) (SMITH, 2004).
31
Figura 4.9: Modelo de espectrômetro de massas do laboratório de Cromatografia Líquida da Embrapa
Agroindústria de Alimentos.
FONTE: arquivo pessoal.
Figura 4.10: Representação dos três setores do espectrômetro de massas QToF.
FONTE: adaptado de Waters Corporation (2010).
A solução contendo o composto de interesse é injetada em um espectrômetro (injeção
direta) ou através de um cromatógrafo acoplado ao mesmo. Após injeção, a solução é
ionizada, ocorrendo a separação de íons pela razão massa (m/z) e o número de íons que
corresponde a cada ―unidade‖ de massa/carga é registrado na forma de um espectro
(ABDELNUR, 2010).
32
5 MATERIAL
5.1 SOLVENTES E REAGENTES
água Milli-Q (ultrapura);
acetato de etila (C4H8O2) grau HPLC (Tedia);
acetonitrila (C2H3N) grau HPLC/ Spectrum (Tedia);
acetona (C3H6O) grau HPLC (Tedia);
ácido acético (C2H4O2) grau HPLC (Tedia);
ácido fórmico (CH2O2) ACS (Emsure);
éter de petróleo grau HPLC (Tedia)
éter etílico (C4H10O) grau CG (Tedia);
éter metil terc-butílico (C5H12O) grau HPLC (Tedia);
metanol (CH4O) grau HPLC/ Spectro (Tedia);
ácido clorídrico (HCl) grau PA (Tedia);
ácido fosfórico (H3PO4) grau PA (Tedia);
ácido sulfúrico (H2SO4) grau PA (Tedia);
celite 545 (Tedia);
hidróxido de sódio (NaOH) PA (Vetec);
butilato de hidroxitolueno -BHT (C15H24O) (Spectrum);
cloreto de sódio (NaCl) (Vetec);
sulfato de sódio anidro (Na2SO4) (Vetec);
Padrões analíticos Sigma Aldrich® nas análises de:
glicose (pureza de 99,5%);
frutose (99%);
ácido ascórbico (99%);
flavonoides (padrões de pureza acima de 90%);
ácidos fenólicos (pureza acima de 95%);
Para análise de sacarose, empregou-se um padrão Spectrum® com pureza de 99%.
Para as análises de antocianinas (pureza superior a 90%) e carotenoides (pureza
superior a 90%) empregaram-se padrões analíticos obtidos segundo as metodologias descritas
por Gouvêa et al. (2012) e Pacheco (2009) respectivamente.
33
5.2 EQUIPAMENTOS
agitador tipo vórtex modelo Genie 2 – Scientific Industries
balança analítica com resolução de quatro casas decimais (AY220, Marte Shimadzu);
banho de ultrassom modelo Branson modelo 2210
banho-maria com agitação (929, GyromaxTM
);
bécher de 100 mL;
centrífuga Thermo (Electron Corporation Sorvall Biofuge Stratos)
coluna amino (Amino 30cm x 4,6mm, High Performance Carbohydrate);
coluna de troca iônica HPX 87 H BIO RAD
7,8 cm x 300 mm);
coluna C18 (Thermo BDS Hypersil, 100mmx4,6mm, 2,4μm);
colunaC30 (YCM Carotenoid S-3; 4,6 x 250mm);
coluna Thermo ODS HYPERSIL C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm)
cromatógrafo líquido com forno para colunas e injetor automático (Alliance® 2695,
Waters);
cromatógrafo líquido modelo Modular W 600 Waters®
injetor automático 717 plus
detector de arranjo de fotodiodos Waters® modelo 996
detector de arranjo de fotodiodos UV/Vis (2996, Waters);
espectrofotômetro Modelo UV-1800 – Shimadzu®;
espectrômetro de massas Q-TOF (SYNAPT massespectrometry, Waters);
estufa modelo WTB - Binder®;
detector índice de refração (IR 2410, Waters®);
liofilizador (L101, Líotop).
microcentrífuga (Hsiangtai);
moinho analítico IKA modelo A-11;
pipeta volumétrica de 10mL;
pipetadores automáticos com capacidade para 10 a 100 L, de 100 a 1000 L e de 0,5
a 5 mL Brand
refratômetro Digital, Atago modelo PAL-1;
sistema de aquisição de dados software Empower;
sistema de purificação de água Milli-Q (A10, Milipore);
titulador automático Metrohm modelo 785 DMP Titrino.
34
6 METODOLOGIA
6.1 COLETA DE AMOSTRAS
Os frutos de grumixama, de maturação aproximada, foram coletados no Condomínio
Cidade Jardim – Barra da Tijuca – Rio de Janeiro. A identificação botânica foi realizada pelo
D.Sc. Marcelo da Costa Souza, professor e pesquisador do Instituto de botânica da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
6.2 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Os frutos foram lavados e separados de suas sementes, utilizando-se estiletes
(FIGURA 6.1). Polpa, casca e sementes foram triturados e pesados em triplicata, para as
análises de teor de água, carotenoides, açúcares, ácido ascórbico (vitamina C), flavonoides e
ácidos fenólicos. Na figura 6.2, pode ser observada a porcentagem das partes do fruto de
grumixama.
Figura 6.1: Partes do fruto de grumixama.
A- Semente, B- Polpa, C- casca.
Foto: Autora.
Figura 6.2: Porcentagem das partes do fruto (base úmida).
A B C
% das partes do fruto (base úmida)
35
Os frutos foram pesados em balança semi-analítica e armazenados em frasco âmbar de
40 mL. Todos foram devidamente identificados por nome da análise e número da replicata, e
congelados, conforme o fluxograma (FIGURA 6.3).
Figura 6.3: Fluxograma de preparação de amostra.
COLETA DOS FRUTOS – realizada colheita manual com o objetivo de preservar a
integridade física dos frutos.
SELEÇÃO DOS FRUTOS – os frutos foram selecionados de acordo com a coloração de suas
cascas, que deveriam estar totalmente escuras (pretas), sem problemas de podridão ou de falta
de uniformidade na maturação.
LAVAGEM DOS FRUTOS – lavagem dos frutos selecionados em água corrente para retirada
de sujidades.
SEPARAÇÃO DAS PARTES DOS FRUTOS – realizada separação das frações casca, polpa
e semente, com o auxílio de estiletes.
PESAGEM DOS FRUTOS – após homogeneização das frações dos frutos, os mesmos foram
pesados em triplicata para cada análise realizada.
Coleta dos frutos
Lavagem
Separação das partes do fruto
(casca, polpa e semente)
Armazenamento
Pesagem dos frutos (carotenoides, vitamina c (ácido ascórbico), flavonoides,
ácidos fenólicos e açúcares)
Seleção
Corte
36
ARMAZENAMENTO A -18°C – congelamento em freezer para preservação das
características químicas, nutricionais e organolépticas.
6.1.1 Teste de caracterização dos frutos
Preparo da Amostra: Separaram-se dez frutos por amostra em frascos de vidro, identificando-
as como amostras A, B e C. Procedeu-se a separação das partes dos frutos. A fração
comestível (casca + polpa) dos frutos foi homogeneizada para realização dos testes de sólidos
solúveis e Acidez total.
6.1.1.1 Análise de sólidos solúveis:
O teor de sólidos solúveis foi realizado pela leitura direta em refratômetro Digital
Atago modelo PAL-1 das três amostras em refratômetro, sendo realizada uma leitura por
amostra, com escala em graus Brix, segundo método 932.14 da A.O.A.C. (2000).
6.1.1.2 Acidez total:
Foram pesados cerca de 5g de cada amostra em bécher de 100 mL. Adicionou-se 20
mL de água ultrapura ao bécher. Verificou-se o pH inicial das amostras, A amostra foi
submetida à agitação e titulada em titulador automático Metrohm modelo 785 DMP Titrino,
com Hidróxido de Sódio 0,1 N até pH 8,1., segundo a metodologia 942.15 da A.O.A.C
(2000).
6.2 ANÁLISE DE UMIDADE
A análise de umidade foi realizada por gravimetria, conforme AOAC (2010).
Inicialmente, as partes dos frutos in natura foram homogeneizadas e pesadas em frascos
previamente secos. Em seguida foram deixados em estufa à 105ºC durante 3 horas e, após
esfriarem em dessecador, foram pesados. Este procedimento foi repetido até se obter peso
constante. O resultado foi expresso segundo a equação 6.1:
100100umidade %
Ma
mM= (6.1)
Onde,
M = Massa do frasco de vidro mais amostra secos;
m = Massa do frasco de vidro;
Ma = Massa da amostra.
37
6.3 ANÁLISE DE CAROTENOIDES
O método de análise baseia-se na extração dos carotenoides com solvente orgânico,
concentração e posterior determinação por espectroscopia na região do visível e
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência utilizando método de padronização externa.
6.3.1 Extração de carotenoides
As amostras dos frutos foram transferidas para um gral de porcelana, sendo
adicionados 3g de celite. Em seguida, adicionou-se o solvente (acetona), com um volume
suficiente para cobrir toda a mistura celite/amostra e seguiu-se a maceração com o pistilo.
Após, a mistura obtida foi filtrada em funil de vidro com placa porosa sinterizada conectado a
kitassato de 500 mL. Retornou-se o sólido retido no funil para graal para prosseguir com uma
nova extração. Este processo foi repetido até que não houvesse mais percepção da cor
característica de carotenoide.
Após, transferiu-se o filtrado recolhido no kitassato, quantitativamente, para um funil
de separação de 500 mL já contendo aproximadamente 30 mL de éter de petróleo. Adicionou-
se, lentamente, água ultrapura para a lavagem. Procedeu-se sucessivas lavagens até que a
coloração da fase aquosa estivesse límpida, sendo então desprezada (FIGURA 6.4).
A solução etérea que permaneceu no funil de separação foi transferida para um balão
volumétrico de 25 mL com o auxílio de um funil com sulfato de sódio anidro e lã de vidro.
Por fim, avolumou-se, o mesmo balão com éter de petróleo e prosseguiu-se com a leitura em
espectrofotômetro na absorvância de 450 nm.
Figura 6.2: Fase etérea (amarela) da extração de carotenoides totais.
O teor de carotenoides totais foi calculado através da Equação 6.2.
38
M
VfABS=gg
000.10)100/( Totais esCarotenoid (6.2)
Onde,
ABS =Absorvância;
Vf = Volume final;
M = Massa da amostra
ε = 2592 (Coeficiente de absortividade do β-caroteno em éter de petróleo)
Posteriormente à leitura, retirou-se uma alíquota de 2 mL do extrato e evaporou-se em
frasco âmbar sob fluxo de nitrogênio. Após a secura, dissolveu-se o resíduo com 200 µL de
acetona e transferiu-se para vial âmbar com redutor de volume.
A análise cromatográfica foi realizada segundo Pacheco (2014) em Cromatógrafo
Líquido de Alta Eficiência Waters® Modular composto por bomba 600, injetor automático
717 plus, com detector de arranjo de fotodiodos Waters® modelo 996, software Empower®,
coluna YCM Carotenoid S-3 (4,6 x 250mm), temperatura da coluna: 33ºC, modo de eluição
gradiente (TABELA 6.1), fase móvel: metanol (Fase A) e éter metil-terc-butílico (Fase B)
com fluxo de 0,8mL.min-1
, o volume de injeção foi 15µL e o tempo de corrida de 28 minutos.
A concentração de cada carotenoide foi calculado através de utilização de curva
analítica. Os compostos foram identificados por comparação do tempo de retenção e dos
espectros de na região UV/VIS dos padrões.
Tabela 6.1: Gradiente de eluição das fases móveis para separação dos carotenoides.
Tempo Fase A (%) Fase B (%)
0,00 80,0 20,0
0,50 75,0 25,0
15,00 15,0 85,0
15,05 10,0 90,0
16,50 10,0 90,0
16,55 80,0 20,0
28,00 80,0 20,0
39
6.4 ANÁLISE DE ÁCIDO ASCÓRBICO (VITAMINA C)
O método empregado na análise de ácido ascórbico foi realizado segundo metodologia
de Rosa et al. (2007), com quantificação por padronização externa.
A amostra já pesada foi extraída com 10 mL de H2SO4 0,05 M em banho ultrassônico
por 10 minutos. Após, uma alíquota é filtrada com o auxílio de um papel de filtro, sendo
transferida para vial de 1,5 mL.
O método de análise cromatográfica foi realizado sob as seguintes condições:
cromatógrafo líquido de alta eficiência Waters®
Alliance 2690/5, detector de arranjo de
fotodiodos Waters®
2996, coluna de troca iônica (HPX 87 H BIO RAD : 7,8 x 300mm), fluxo
de 0,7mL.min-1
., volume de injeção de 20µL, modo de eluição isocrático com solução aquosa
de ácido sulfúrico 0,05 M e tempo de corrida de 10 minutos.
6.5 ANÁLISE DE AÇÚCARES
A análise de açúcares (glicose, frutose e sacarose) foi realizada segundo a metodologia
descrita por Macrae (1998). Os açúcares foram extraídos da amostra com 10 mL de água
Milli-Q (água ultrapura) em ultrassom por 20 minutos, a amostra foi então, filtrada e
submetida à análise por CLAE com detector de Índice de Refração. A quantificação foi
realizada por padronização externa.
A análise cromatográfica foi realizada por CLAE-IR e os açúcares identificados por
comparação do tempo de retenção dos padrões. O método baseia-se na separação
cromatográfica em coluna amino (Amino 30cm x 4,6mm, High Performance Carbohydrate) à
temperatura ambiente em modo de eluição isocrático de acetonitrila 75% em água Milli-Q
(água ultrapura) com fluxo de 1,4mL.min-1
, o volume de injeção foi 20µL, o tempo de corrida
de 20 minutos e a temperatura interna do detector de 45ºC.
6.6 ANÁLISE DE ANTOCIANINAS
Para a análise de antocianinas, utilizou-se somente as cascas liofilizadas dos frutos,
pois somente estas tinham coloração que correspondiam a esta substância, segundo a literatura
e avaliação visual. As cascas secas foram moídas em Moinho analítico para obtenção de um
pó (FIGURA 6.5).
40
Figura 6.3: Liofilizador de bancada utilizado (A) e pó obtido após o processo de liofilização (B).
A extração das antocianinas foi realizada segundo a metodologia adaptada de Santiago
et al. (2010). Pesou-se cerca de 0,020 g de amostra liofilizada, transferiu-se a amostra para um
tubo de Falcon de 20 mL, adicionou-se 2,0mL de solução ácido fórmico/metanol (10:90, v/v),
agitou-se em vórtex durante 1 minuto, colocou-se em ultrassom por 10 minutos e centrifugou-
se a 6000 rpm por um período de 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um balão
volumétrico de 10 mL. Repetiu-se a extração até que não se observasse mais alteração da
coloração do sobrenadante, transferindo o volume para o mesmo balão volumétrico.
Microcentrifugou-se 1 mL do extrato (14000rpm por 5 minutos). Secou-se 400 µL do
centrifugado sob fluxo de ar comprimido filtrado (Millipore Millex-GV 0,22µm) e
posteriormente ressuspendeu-se em 100 µL de solução para injeção (5% de ácido Fórmico em
água Milli-Q®: metanol (90:10, v/v), sendo o material transferido para vial do injetor
automático.
A análise cromatográfica foi realizada em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
Waters® Alliance modelo 2690/5, com detector de arranjo de fotodiodos Waters® modelo
2996 (varredura 210 a 600 nm com quantificação em 520nm), software Empower®, coluna
Thermo BDS HYPERSIL C18 (100 x 4,6mm; 2,4μm) à 40ºC. Modo de eluição gradiente
(TABELA 6.2) de ácido fórmico 5% (Fase A) e acetonitrila (Fase B) com fluxo de 1,0
mL.min-1
, o volume de injeção foi 20µL e o tempo de corrida de 20 minutos.
A identificação foi realizada utilizando comparação dos tempos de retenção e
espectros de UV e massa acurada somente para os picos majoritários. A quantificação foi
realizada por padronização externa.
A B
41
Tabela 6.2: Gradiente de eluição das fases móveis para separação das antocianinas.
Tempo
Fase A
(%)
Fase B
(%)
0,00 95 5
15,00 87 13
16,50 86 14
18,00 95 5
20,00 95 5
6.7 ANÁLISE DE FLAVONOIDES E ÁCIDOS FENÓLICOS
Para a primeira etapa de extração das amostras foi utilizada metodologia descrita por
Pérez-Jimenéz (2008), onde a amostra é extraída com solventes polares e apolares para
garantir a detecção de compostos fenólicos com diferentes polaridades.
A amostra, previamente pesada, foi transferida para tubo centrífuga de 50 mL, onde
foram adicionados 4 mL de metanol:água (50:50; v/v; pH2). Logo após foi levado à agitação
em agitador magnético à temperatura ambiente por 1h. O tubo foi centrifugado a 5000 g por
10 minutos, a 4 oC. Recolheu-se o sobrenadante 1 e reservou-se.
Adicionou-se 4 mL de acetona:água (70:30; v/v) ao precipitado e repetiu-se as etapas
de agitação e centrifugação. Recolheu-se o sobrenadante 2, reservando-o. Foram misturados 3
mL de cada sobrenadante e transferiu-se a mistura para vial de 1,5 mL para posterior injeção
em cromatógrafo.
Com o resíduo obtido, procedeu-se a extração dos fenólicos hidrolisáveis, utilizando-
se método adaptado de Frighetto e Baccan (2012).
Adicionou-se uma mistura de 5 mL da solução NaOH 2M contendo 1% de ácido ascórbico e
10 mM de EDTA e em seguida procedeu-se à hidrólise básica por 60 minutos a 61- 63°C.
Sem resfriar a solução, acidificou-se com 1,5 mL de HCl 6M, submeteu-se a agitação em
vórtex por 10 segundos e deixou-se resfriando até a temperatura ambiente. Posteriormente,
centrifugou-se por 10 minutos a 2700 rpm. O sobrenadante com alíquota de 6,5 mL de acetato
de etila. Primeiramente no vórtex por 30 segundos, seguida de 5 minutos no ultrassom. Foram
adicionadas 5 gotas de solução saturada de NaCl (solução aquosa de NaCl~30%), devido à
emulsão formada. Separou-se a fase orgânica e repetiu-se este procedimento de extração com
acetato de etila. As fases orgânicas foram combinadas e evaporadas até a secura sob
nitrogênio. O resíduo foi retomado em 2 mL da mistura metanol:água (80:20), levado ao
42
ultrassom por 5 minutos e filtrado através de membrana filtrante de 0,45 µm, acoplada a uma
seringa.
Procedeu-se a análise cromatográfica para ambos os extratos, sendo a quantificação
realizada por padronização externa e identificação através de comparação de tempo de
retenção e espectros de UV/VIS, sendo realizada em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
Waters® Alliance modelo 2690/5, com detector de arranjo de fotodiodos Waters® modelo
2996 (varredura 210 a 600 nm com quantificação em 270nm), software Empower®, coluna
Thermo BDS HYPERSIL C18 (100x4,6mm; 2,4μm). Temperatura da coluna: 30ºC. Detector
em modo de eluição gradiente (TABELA 6.3) de ácido fosfórico 1,5 mL/L em água (Fase A)
e acetonitrila (Fase B) com fluxo de 1,0 à 1,2 mL.min-1
, o volume de injeção foi 10µL e o
tempo de corrida de 28 minutos.
Tabela 6.3: Gradiente de eluição das fases móveis para separação dos ácidos fenólicos.
Tempo Fluxo (mL/min) Fase A(%) Fase B(%)
0,00 1,0 95,0 5,0
6,00 1,0 95,0 5,0
12,00 1,2 88,0 12,0
18,00 1,2 80,0 20,0
20,00 1,2 50,0 50,0
24,00 1,2 50,0 50,0
25,00 1,2 95,0 5,0
28,00 1,0 95,0 5,0
43
7 RESULTADOS E DISCUSSÕES
7.1 CARACTERIZAÇÃO DOS FRUTOS
A cor do da casca de um fruto pode indicar o estágio de maturação do mesmo, porém
não é indicativa da constituição química da polpa, quando se pretende saber, por exemplo,
qual é o teor de açúcar ou de acidez que uma determinada fruta pode conter. Um dos métodos
mais utilizados para uma confirmação objetiva do grau de maturação dos frutos é o teste de
determinação da relação acidez total/sólidos solúveis, conhecido como Ratio. Os resultados de
caracterização encontram-se na tabela 7.1:
Tabela 7.1: Caracterização dos frutos.
AMOSTRA pH inicial Acidez Total Acidez Total
Titulável (teor de
ácido cítrico)
Relação
STT/ATT (Ratio)
SST (° Brix) ±
DP
Fração
comestível
3,97 13,21 ± 0,2479 0,92 ±0,0174 14,1299 ± 0,2478 13,07 ± 0,1155
O resultado encontrado para o Ratio (14,12) foi similar ao encontrado por Lourosa,
G.V. (2012) que encontrou resultado de 15,17 em frutos de grumixama.
Os resultados de SST encontrados indicam um menor período de conservação pós-
colheita para os frutos de Grumixama, pois, de acordo com Barros et al. (1996), um valor alto
nesta análise pode estar relacionado com um incremento na velocidade de deterioração e
fermentação, diminuindo seu tempo de prateleira. Por outro lado, o pH inicial de 3,97
encontrado o caracteriza como um alimento ácido, reduzindo assim, os tipos de
microorganismos capazes de se desenvolver, garantindo-lhe um maior tempo de conservação
(FELLOWS, P. J., 2006). Ao mesmo tempo, esta acidez confere um sabor doce acidulado ao
fruto.
7.2UMIDADE
Após a análise de umidade, os seguintes resultados foram obtidos para as partes
dos frutos (TABELA 7.2):
Tabela 7.2: Umidade do fruto de grumixama.
PARTES DO FRUTO % MÉDIA DA UMIDADE
CASCA 88,4%
POLPA 90,7%
SEMENTE 49,9%
44
O teor de umidade na polpa (90,7%) e casca (88,4%), foi superior ao encontrado por
ARÉVALO et al.;(2012) (83,87% na polpa e 77,42% na casca) em frutos de Eugenia
brasiliensis, Lam., porém inferior aos estudos realizado em polpa camu-camu (92,4%)
(ARÉVALO, 2007) e em uvaia (94,42%) (KARWOWSKL, 2011) frutos que pertencem a
mesma família mirtácea.
A atividade de água é um dos parâmetros mais importante e utilizado na análise de
alimentos. O teor de umidade de um alimento está relacionado com sua estabilidade,
qualidade e composição, e pode afetar o armazenamento, embalagens e processamento
(CHAVES et al., 2004).
7.3ANÁLISE DE CAROTENOIDES
7.3.1 Sementes
O resultado de carotenoides totais obtido foi de 1728 µg/100g. Como não se conhecia
o perfil desta amostra, foi realizada a injeção em cromatógrafo líquido para verificar a
necessidade ou não de saponificação (FIGURA 7.1). Os espectros na região do UV/VIS dos
picos identificados encontram-se na figura 7.2. Foi realizada uma comparação destes
espectros com os reportados na literatura, conseguindo-se assim, uma correta identificação
das clorofilas A e B (BORRMAN, 2009).
Figura 7.1: Cromatograma da análise de carotenoides dos extratos da semente de grumixama sem saponificação.
Figura 4.2: Espectros de UV/VIS de Clorofila.
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
337,5
432,2
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
316,1 342,3 388,8
468,5
558,4
Clorofila B Clorofila A
Clorofila B
Clorofila A
45
Após a análise do cromatograma obtido foi verificado a presença de clorofila que
possui uma banda intensa de absorção energética centrada 450 nm, o que acaba por
superestimar o resultado de carotenoides das amostras. A saponificação foi realizada para
eliminação de toda clorofila, porém o resultado para carotenoides totais diminuiu bastante,
ficando em torno de 364 µg/100g. Portanto, o valor inicial se devia praticamente à clorofila.
Isto foi essencial para a decisão da não realização da análise para as demais replicatas. Foi
realizada a análise cromatográfica do extrato saponificado de semente de grumixama e apesar
da baixa concentração, foram observadas as presenças de luteína, β-criptoxantina, α-caroteno
e β-caroteno (FIGURA 7.3).
Figura 7.3: Cromatograma da análise de carotenoides do extrato saponificado da semente de grumixama.
7.3.2 Polpa e casca
Como não se conhecia o perfil, também foram realizadas análises prévias dos
carotenoides presentes na polpa e na casca da Grumixama, com a extração e injeção em
cromatógrafo das amostras, para verificação da necessidade de saponificação.
Foi verificada a presença de β-criptoxantina esterificada em ambas as frações do fruto
de grumixama, confirmando a necessidade da saponificação das amostras (FIGURA 7.4).
AU
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Lute
ína
Bet
a C
ripto
xant
ina
Alfa
Car
oten
o
Bet
a ca
rote
no
46
Figura 7.4: A - Cromatograma da análise de carotenoides do extrato de polpa de grumixama (antes da
saponificação) e B - Cromatograma da análise de carotenoides do extrato de casca de grumixama antes da
saponificação.
Foi realizada a quantificação de carotenoides totais antes da saponificação e os
resultados podem ser consultados na tabela 7.3:
Tabela 7.3: Média dos carotenoides totais na polpa e na casca do extrato não saponificado.
Amostra
Carotenoides Totais
Não Saponificado ± Desvio Padrão (µg/100g)
Casca 8840,54 ± 432,58
Polpa 1 5446,31 ± 714,53
Verificando o perfil cromatográfico antes e após o processo de saponificação, a
presença de carotenoides esterificados pode ser verificada. Durante a saponificação ocorre a
hidrólise dos ésteres dos carotenoides, liberando o carotenoide anteriormente ligado.
Através da análise do cromatograma, foi possível identificar oito carotenoides, tanto
na polpa, quanto na casca do fruto: Violaxantina, Luteína, Zeinoxantina, β-criptoxantina, 13-
cis β-caroteno, α-caroteno, β-caroteno e 9-cis β-caroteno (FIGURAS 7.5, 7.6 e 7.7).
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
A
B
Carotenoides
esterificados
Carotenoides
esterificados
47
Figura 7.5: Perfil cromatográfico da análise de carotenoides do extrato da polpa de grumixama.
Figura 7.6: Perfil cromatográfico dos extratos da casca de grumixama após saponificação.
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Vio
laxa
ntin
a
Lute
ína
Zei
noxa
ntin
a
Bet
a C
ripto
xant
ina
13 c
is b
etac
arot
eno
Alfa
Car
oten
o Bet
a ca
rote
no
9 ci
s be
taca
rote
no
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Vio
laxa
ntin
a
Lute
ína
Zei
noxa
ntin
a
Bet
a C
ripto
xant
ina
13 c
is b
etac
arot
eno
Alfa
Car
oten
o
Bet
a ca
rote
no
9 ci
s be
taca
rote
no
AU
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
328,0
438,2 468,5
535,3 560,9 580,4597,5
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
331,6
444,3
473,3
AU
0,000
0,002
0,004
0,006
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
311,3
446,7473,3
524,3 548,7 592,6
AU
0,00
0,10
0,20
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
450,3
478,2Zeinoxantina β-criptoxantina
Violaxantina
na Luteína
48
Figura 7.7: Espectros UV/Vis dos carotenoides identificados nas frações polpa e casca do fruto grumixama.
Após a etapa saponificação, prosseguiu-se com a análise, estando os resultados
dispostos na tabela 7.4:
AU
0,000
0,002
0,004
0,006
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
281,6
341,1
441,9
472,1
530,4590,2
AU
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
322,0 343,5
446,7473,3
529,2574,3 597,5
AU
0,00
0,05
0,10
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
451,5
478,2
AU
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
342,3
446,7
475,8
526,8 588,9
13-cis-β- Caroteno
cacaroteno
9-cis β-
caroteno
α-caroteno
β-caroteno
49
Tabela 7.4: Média dos carotenoides totais na polpa e na casca do extrato saponificado.
Polpa
Carotenoides Teor (µg/ 100 g) ± DP Equação R2
Totais 2654 ± 62,22 -
Violaxantina 8,86 ± 1,88 -
Luteína 40,84 ± 1,46 y = 237819x – 45893 0,9939
Zeaxantina 58,83 ± 4,89 y = 311706x - 5804,9 0,9987
β-criptoxantina 1746,94 ± 83,37 y = 280483x - 38237 0,9921
α-caroteno 21,23 ± 0,98 y = 263498x - 6948,5 0,9985
13 cis β-caroteno 23,34 ± 1,89 y = 293450x - 43762 0,9929
β-caroteno 412,35 ± 27,69 y = 283015x - 26561 0,9983
9 cis β-caroteno 47,02 ± 6,13 y = 356084x - 3201 0,9968
Casca
Carotenoides Teor (µg/ 100 g) ± DP Equação R2
Totais 5594,17 ± 185,07 -
Violaxantina 77,60 ± 8,41 -
Luteína 439,42 ± 50,94 y = 237819x - 45893 0,9939
Zeaxantina 105,99 ± 10,99 y = 311706x - 5804,9 0,9987
β-criptoxantina 3964,09 ± 134,79 y = 280483x - 38237 0,9921
α-caroteno 17,00 ± 2,92 y = 263498x - 6948,5 0,9985
13 cis β-caroteno 79,35 ± 2,12 y = 293450x - 43762 0,9929
β-caroteno 442,69 ± 5,34 y = 283015x - 26561 0,9983
9 cis β-caroteno 38,16 ± 1,96 y = 356084x - 3201 0,9968
Os dois carotenoides majoritários, β-criptoxantina e β-caroteno representam cerca de
71% e 8% dos carotenoides totais, respectivamente, nas cascas de grumixama e cerca de 66%
e 18% nas polpas do mesmo fruto. Ambos são precursores de vitamina A.
Poucos estudos evidenciam a presença de carotenoides em frutos de casca escura. Isto
pode ser devido à coloração escura de suas cascas que acabam por encobrir a cor
característica de carotenoides. Mas, é possível observar a separação das antocianinas durante
a extração de carotenoides na etapa de partição água:éter. A coloração roxa permanece na
água e carotenoides, que por sua característica apolar migram para a fase etérea (FIGURA
7.8).
50
Figura 7.8: Extrato da análise de carotenoides totais da casca de grumixama.
A quantificação de Violaxantina foi realizada por normalização interna, pela
indisponibilidade de matriz para preparo do padrão.
A parte comestível dos frutos de grumixama apresentou cerca de 41,24 μg/g de
carotenoides totais, sendo 28,55 μg/g de β-criptoxantina.
Em trabalho realizado por Rodrigues-Amaya e Kimura (1989), os autores encontraram
na composição do cajá as moléculas β-criptoxantina (17μg/g). Já no estudo realizado por
Oliveira et al. (2011) foram encontrados cerca de 38 μg/g de β-criptoxantina em mamão
formosa. Um fruto, para ser considerado fonte de carotenoides, deve conter pelo o menos
20µg/g de determinado carotenoide (RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; KIMURA, M., 2008).
Assim, podemos considerar a grumixama como uma nova fonte do carotenoide β-
criptoxantina, reforçando assim o valor desse fruto como fonte de antioxidante e de
provitamina A, uma vez que se trata de um carotenoide ativo.
Vale lembrar que a variação da concentração dos carotenoides nos alimentos é muito
grande, mesmo quando se tratando do mesmo tipo de alimento. Há alterações devido às
diferenças de variedades, estágio de maturação, condições climáticas, condições de cultivo,
tipo de processamento empregado, etc.
A eficiência da absorção dos carotenoides ainda é afetada pela quantidade ingerida do
carotenoide, tipo de processamento utilizado (cozimento, etc.), presença de outros
componentes que podem estimular (lipídios) ou inibir (fibras) a absorção, efeitos de matriz,
interações entre os carotenoides, características individuais, estado de saúde (infestação
parasitária), estado nutricional, etc.
7.4 VITAMINA C
A presença de vitamina C foi verificada após análise de todas as frações dos frutos de
grumixama (TABELA 7.5), sendo analisados o tempo de retenção (FIGURA 7.9) e o espectro
de UV/Vis (FIGURA 7.10) em comparação com o padrão.
51
Tabela 7.5: Média da concentração de vitamina C nos frutos de grumixama.
Equação da reta de Vitamina C utilizada na quantificação: y=1,10e+006x-1,19e+004 R2>
0,99.
Não existem dados na literatura quanto à quantificação de ácido ascórbico em Eugenia
brasiliensis por CLAE (FIGURA 26). Em estudo realizado por Lourosa, G.V. et al (2012),
encontraram 31,15 mg/100g em frutos de grumixama de casca escura, sendo utilizada análise
titulométrica. Comparando-se o valor obtido com a laranja, que contém cerca de 60mg/100g
de vitamina C (TACO, 2011), observa-se que a parte comestível dos frutos de Grumixama
apresentam 23,07 mg/100g, ou seja, aproximadamente 1/3 desta quantidade. Estudo realizado
por Oliveira et al. (2011) em goiaba vermelha (Psidium guajava var. Paluma) que também é
uma espécie de mirtácea, encontraram 85,9 mg/100g de vitamina C total. Paula, J.T. (2013)
encontrou uma média de 14,8 mg/100 g de vitamina C em tomates maduros. Sabendo-se que
a Organização Mundial de Saúde recomenda a ingestão diária de 45 mg de vitamina C (OMS,
2004), conclui-se que 100 g da parte comestível do fruto estudado correspondem a 51,26% da
IDR (Ingestão Diária Recomendada). Qualquer alimento que possua 10% ou mais do valor
diário de um nutriente, é considerado uma boa fonte deste nutriente; um nutriente que forneça
20% deste nutriente é considerado rico. Sendo assim, a grumixama pode ser considerada rica
em vitamina C (FAO, 1998; Brasil, 2005).
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
0,1
33
4,4
07
5,2
44
6,6
13
6,8
94
7,3
51
Vitam
ina C
- 8
,489
9,4
69
10,2
24
Frações Vitamina C ± DP
(mg/100g)
Casca 30,68 ± 0,96
Polpa 15,46 ± 2,42
Semente 29,63± 0,87
Casca
52
Figura 7.9: Cromatograma da análise de vitamina C do extrato da parte comestível (polpa e a casca) e semente
do fruto grumixama.
Figura 7.10: Espectro na região UV/Vis da vitamina C.
Realizou-se a adição de padrão de ácido ascórbico ao extrato das cascas de
grumixama. Esta adição resultou na sobreposição do pico identificado na amostra e no padrão,
conseguindo-se assim, uma melhor confirmação do pico de vitamina C (FIGURA 7.11).
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
5,2
22
6,6
28
6,9
12
7,3
72
Vitam
ina C
- 8
,501
9,5
00
10,2
45
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
5,2
26
Vitam
ina C
- 8
,483
10,2
18
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
nm 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
241,7
316,4 335,5 349,9 372,4 388,0
Polpa
Semente
53
Figura 7.11: Análise de vitamina C - cromatograma da análise de vitamina C do extrato da casca de grumixama
com adição padrão de ácido ascórbico.
7.5 AÇÚCARES
Foram encontrados os açúcares, frutose, glicose e sacarose nas sementes (FIGURA
7.12) e somente frutose e glicose na casca e polpa dos frutos de grumixama (FIGURA 7.13 e
7.14).
Figura 7.12: Análise de açúcares - cromatograma do extrato aquoso da semente de grumixama.
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
6,6
41
6,9
33
7,4
03
Vitam
ina C
- 8
,352
10,2
78
MV
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
Minutes
0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00
Fru
tose
- 4
,257
Glic
ose
- 4
,822
Saca
rose
- 6
,509
MV
-20,00
-10,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
Minutes
0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00
Fru
tose -
4,2
57
Glicose -
4,8
22
Sacaro
se -
6,5
09
54
Figura 7.13: Análise de açúcares - cromatograma do extrato aquoso da polpa do fruto grumixama.
Figura 7.14: Análise de açúcares - Cromatograma do extrato aquoso da casca do fruto grumixama.
Após a identificação dos açúcares presentes nas frações analisadas, foram realizadas
curvas analíticas a partir cujas equações da reta, encontram-se abaixo:
Frutose: y = 7,43e+0,003x
Glicose: y = 7,40e+0,003x
Sacarose: y = 7,18e+0,003x
Os açúcares foram quantificados através da curva padrão e os resultados encontram-se
na tabela 7.6.
Tabela 7.6: Média dos açúcares identificados no fruto de grumixama.
Frações
Açúcares ± desvio padrão
Frutose Glicose Sacarose TOTAIS
g/100g g/100g g/100g g/100g
Casca 4,18 ± 0,15 3,68 ± 0,17 ND 7,86
Polpa 3,13 ± 0,21 2,84 ± 0,21 ND 5,97
Semente 1,13 ± 0,04 1,01 ± 0,04 0,36 ± 0,05 2,50
Fruto integral 2,83 2,55 0,04 5,42
O teor de açúcares totais encontrados na parte comestível dos frutos de grumixama
(6,9 g/100g) ficou próximo ao encontrado em morangos (6,8g/100g), estando ainda o valor
abaixo do encontrado em pitanga (10,2g/100g) segundo a Tabela Brasileira de Composição de
MV
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
Minutes
0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00
Fru
tose -
4,2
54
Glicose -
4,8
20
MV
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
700,00
800,00
900,00
1000,00
Minutes
0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00
Fru
- 4,3
21
Gli
- 4,9
10
55
Alimentos- TACO (2011). O valor também é menor que o encontrado por Lourosa, G.V.
(2012) (10,72g/100g) em frutos de grumixama.
Em todas as frações, a concentração de frutose ficou acima da concentração de
glicose. A presença de açúcares redutores (frutose e glicose) é um fator de qualidade na
aceitação do fruto in natura ou processado (LAGO et al., 2006). De acordo com BURKET
(2003), o uso da frutose na alimentação humana, em comparação à glicose e à sacarose,
resulta em efeito glicêmico reduzido.
7.6 ANTOCIANINAS
Na figura 7.15 abaixo, pode ser verificada a etapa da extração de antocianinas das
cascas liofilizadas dos frutos de grumixama.
Figura 7.15: Extração de antocianinas do pó da casca do fruto grumixama. A - Extração da amostra com solução
ácido fórmico/metanol. B - coloração incolor do sobrenadante. C - Sobrenadante no balão volumétrico após a
extração. D – Extrato após centrifugação.
O método para extração de antocianinas por Santiago et al. (2010) foi empregado e,
através da análise cromatográfica, foi possível detectar duas antocianinas majoritárias
(FIGURA 7.16).
B
C
A
D
A
A
56
Figura 7.16: Cromatograma obtido por CLAE-DAD do extrato antociânico da casca de grumixama. Espectro A -
pico 1 (delfinidina-3-O-glicosídeo) e espectro B - pico 3 (cianidina-3-O-glicosídeo).
Por comparação dos espectros de absorção na região UV/Visível e do tempo de
retenção na análise cromatográfica com padrões analíticos isolados em laboratório, indica-se
que a antocianina 1 e a 3 podem ser respectivamente a delfinidina-3-O-glicosídeo e a
cianidina-3-O-glicosídeo.
Estas foram coletadas separadamente e injetadas no Espectrômetro de Massas nas
seguintes condições da Tabela 7.7 para a confirmação da identificação.
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
275,9
345,1
522,6 514,1
279,5
1
3
A B
2 6
5
5
7
4
57
Tabela 7.7: Parâmetros Operacionais do Espectrômetro de Massas.
Polaridade Positiva
Fluxo (μL) 5,00
Capilar (kV) 2,50
Cone de Amostra (V) 40
Cone de Extração (V) 4,0
Temperatura da Amostra (°C) 80
Temperatura de Dessolvatação (°C) 250
Fluxo do Gás do Cone (L/h) 25
Fluxo do Gás de Dessolvatação (L/h) 500
Energia de Colisão Trap (V) 4,0
Energia de Colisão Transfer (V) 4,0
Analisador Modo V
O espectro de massas obtido por EM da antocianina 1 (FIGURA 7.17) apresentou o
íon molecular de m/z 465 u, referente à delfinidina-3-glicosídeo, e a injeção em EM-EM (com
aumento das energias do Trap e Transfer para 6,0 V) indicou a presença da aglicona
delfinidina de m/z de 303 u (FIGURA 7.18).
Figura 7.17: Espectros de Massas da Antocianina 1 da casca de grumixama.
m/z250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650
%
0
100
F004_PICO1_27042015_3 216 (3.689) Cm (171:224) TOF MS ES+ 2.07e3
303.0520
301.1539413.2778
340.3628 465.1049
58
Figura 7.18: Espectros de Massa Sequencial do Íon Molecular m/z 465 u e Detecção da Aglicona Delfinidina
(m/z aproximado 303).
O espectro de massas obtido por EM da antocianina 3 (FIGURA 7.19) sugeriu que a
antocianina previamente isolada correspondia a cianidina-3-glicosídeo. A confirmação foi
realizada através de injeção em EM-EM, cuja seleção do íon de m/z 449 u, correspondente à
cianidina 3-glicosídeo, e aumento das energias do Trap e Transfer para 6,0 V favoreceu a
fragmentação da antocianina e a detecção da aglicona cianidina de m/z de 287 u (FIGURA
7.20), através da perda de uma molécula de açúcar.
Figura 7.19: Espectro Espectros de Massas da Antocianina 3 das cascas de grumixama.
Figura 7.20: Espectro de Massa Sequencial da Antocianina 3 e Confirmação da Aglicona Cianidina.
Os resultados obtidos indicam erros, em ppm, dentro de um limite aceitável (máximo
de 5 ppm), conforme Tabela 7.8.
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
%
0
100
F004_PICO1_27042015_MSMS465 346 (5.899) Cm (318:384) TOF MSMS 465.00ES+ 256303.0520
465.1049
304.0514467.3756
468.3777
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
%
0
100
F004_PICO2_27042015 87 (1.496) Cm (51:96) TOF MS ES+ 6.24e3287.0558
195.0896
138.0701 196.0923
449.1084288.0659
450.1219
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
%
0
100
F004_PICO2_27042015_MSMS449 330 (5.627) Cm (309:331) TOF MSMS 449.00ES+ 1.40e3287.0558
449.1084288.0659
450.1142
B
59
Tabela 7.8: Resultados Obtidos por EM.
m/z teórico (u) m/z observado (u) Erro (ppm) Erro (mDa)
Antocianina 1
Delfinidina 303.0504 303.052 5.13 1.56
Delfinidina-3-
glicosídeo 465.1032 465.1049 3.56 1.65
Antocianina 3
Cianidina 287.0555 287.0558 0.92 0.27
Cianidina-3-
glicosídeo 449.1083 449.1084 0.14 0.07
Observou-se que o cromatograma do extrato das cascas de grumixama apresentava
perfil semelhante ao cromatograma obtido com os extratos da casca de jabuticaba (Myrciaria
cauliflora, Berg) (FIGURA 7.21), sendo este mais um parâmetro de comparação, pois esta é
uma matriz já conhecida na literatura.
Foram detectadas mais cinco antocianinas, além das duas majoritárias identificadas,
sendo proposta a identificação de quatro delas em comparação com tempo de retenção e
espectros UV/Vis obtidos em cromatograma de extratos da casca da uva (FIGURA 7.22),
matriz também já descrita na literatura. Somente a antocianina 7, não foi identificada.
Antocianina 1 = delfinidina-3-O-glicosídeo (confirmado por comparação com tempo de
retenção e espectro UV/Vis com padrão isolado, extratos de cascas de jabuticaba e análise
em espectrômetro de massas).
Antocianina 2 = sugere-se cianidina-3-O-galactosídeo (comparação com o artigo de
FLORES et al., 2012 com a caracterização do mesmo fruto e comparação com espectro
UV/Vis (FIGURA 7.23) e tempo de retenção de cromatograma (FIGURA 7.22) obtido a
partir de extratos de casca da uva).
Antocianina 3 = cianidina-3-O-glicosídeo (confirmado por comparação com tempo de
retenção e espectro UV/Vis com padrão isolado, extratos de cascas de jabuticaba e análise
em espectrômetro de massas).
Antocianina 4 = sugere-se petunidina-3-O-glicosídeo (comparação com espectro
UV/Vis (FIGURA 7.23) e tempo de retenção de cromatograma (FIGURA 7.22) obtido a
partir de extratos de casca da uva).
Antocianina 5 = sugere-se derivado de pelargonidina (espectro com absorção máxima em
499). Espectro pode ser observado na figura 7.24.
Antocianina 6 = sugere-se peonidina-3-O-glicosídeo (comparação com espectro UV/Vis
60
(FIGURA 7.23) e tempo de retenção de cromatograma (FIGURA 7.22) obtido a partir de
extratos de casca da uva).
Antocianina 7 = não identificada. Espectro pode ser observado na figura 7.24.
Figura 7.22: Sobreposição dos cromatogramas de análise de antocianinas do extrato das cascas de grumixama
(preto) x Cromatograma de análise de antocianinas do extrato da das cascas de uva (vinho).
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
AU
-0,020
-0,010
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00
Figura 7.21: Sobreposição do cromatograma de análise de antocianinas do extrato da das cascas de
grumixama x Cromatograma de análise de antocianinas do extrato da das cascas de jabuticaba.
1
3
2
4 6
61
Figura 7.23: Espectros na região UV/Vis das antocianinas 2, 4 e 6.
Figura 7.24: Espectros na região UV/Vis das antocianinas 5 e 7.
Foram realizadas curvas analíticas (TABELA 7.9) a partir de padrões isolados no
laboratório, de acordo com Gouvêa el al. (2012), a partir das matrizes uva e jabuticaba.
Tabela 7.9: Equação da reta e coeficiente de determinação das curvas analíticas para antocianinas.
Analito Equação da reta R2
Delfinidina y=4,74*107x + 5,27*10
4 0,9977
Cianidina
y=6,34*107x + 1,8*10
3 0,9997 Petunidina
Peonidina
*Petunidina e peonidina foram feitas por equivalência à Cianidina-O-3-glicosídeo.
As concentrações das antocianinas detectadas (TABELA 7.10) foram calculadas
através destas equações.
AU
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
278,3
331,9373,6
517,7
AU
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
271,2
346,3
520,1
AU
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
280,7
328,3
516,5
AU
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
266,5
353,5
421,8
499,4
591,0
AU
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
nm
250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00
280,7 442,4
510,4
529,9
594,6
Antocianina 2 Antocianina 4 Antocianina 6
Antocianina 5 Antocianina 7
62
Tabela 7.10: Concentração das antocianinas encontradas nas cascas liofilizadas do fruto de grumixama.
Média de antocianinas ± desvio
padrão
Delfinidina-
3-gli
Antocianina
2
Cianidina-
3-
glicosídeo
Antocianina
4
Antocianina
5
Antocianina
6
Antocianina
7
Monoméricas
totais
mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g mg/100g
949,06 27,89 3729,50 22,02 9,09 91,36 8,30 4837,21
± 20,13 ± 0,77 ± 72,75 ± 1,06 ± 0,43 ± 1,30 ± 1,34 ± 91,43
O método utilizado é específico para antocianinas monoméricas, que são as
antocianinas que possuem mais relatos de efeito benéfico para a saúde. As duas antocianinas
majoritárias equivalem a mais de 96% das antocianinas totais, estando completa a
identificação de ambas.
Comparando os resultados de E. brasiliensis e jabuticaba (Myrciaria cauliflora
Berg),observa-se que o fruto possui um teor muito maior de antocianinas (4837,2 mg/ 100 g
em base seca) do que o encontrado por Leite-Legatti et al. (2012) na jabuticaba(Myrciaria
cauliflora, Berg) (2598,32 mg/100g em base seca) que é considerada rica nesse composto
fenólico. Assim, tal matriz pode ser considerada uma nova fonte de antocianinas, agregando
valor a este fruto ainda não explorado comercialmente.
7.7 FLAVONOIDES E ÁCIDOS FENÓLICOS
Os métodos de análise desses compostos, para terem aplicabilidade numa rotina de
laboratório, necessariamente, devem ser robustos e fornecer dados quantitativos (ROBBINS;
BEAN, 2004). Existem vários métodos disponíveis nas literaturas. O desafio na análise de
ácidos fenólicos é devido à complexidade estrutural em que esses compostos estão presentes,
isto é, na forma livre, esterificada, glicosilada ou polimerizada (ROBBINS, 2003), e ainda
podem coexistir formando complexos com proteínas, carboidratos, lipídeos ou outros
componentes do vegetal.
Os compostos fenólicos ocorrem principalmente como conjugados solúveis e
insolúveis, ligados covalentemente à açúcares ou componentes estruturais de parede celular
(Acosta-Estrada et al., 2014).
Primeiramente, foi realizada extração para ácidos fenólicos pela metodologia de
Mattila e Kumpulainen (2002) com modificações. Nesta análise, conseguiu-se a identificação
de Ácido Gálico, Ácido Protocatecuico e Ácido Elágico para as três frações dos frutos de
grumixama. Foi realizado também análise de flavonoides, segundo método AOAC (2005)
63
com adaptações, porém não conseguiu-se identificar nenhum flavonoide com esta
metodologia.
Diante destes desafios que a análise de fenólicos impõe, procurou-se um método
prático, rápido e eficiente para a extração. Utilizou-se somente a primeira parte da
metodologia de Pérez et al (2008) que utiliza-se de solventes com diferentes polaridades. Com
esta metodologia, conseguiu-se a identificação e posterior quantificação dos compostos
fenólicos que estavam livres na amostra.
Os fenólicos identificados com esta metodologia encontram-se listados na tabela 7.11:
Tabela 7.11: Fenólicos livres identificados nos frutos de grumixama.
Frações do Fruto Fenólicos
Casca Catequina, antocianinas, ácido elágico, rutina,
isoquercetina e quercetina.
Polpa Catequina, antocianinas, ácido elágico, rutina,
isoquercetina e quercetina.
Semente Ácido gálico, Ácido elágico, ácido siríngico, rutina,
catequina e Ácido p-hidroxibenzóico.
Para que se conseguisse uma avaliação mais completa, pesquisou-se na literatura por
mais um método que pudesse dar respostas satisfatórias quanto à identificação e quantificação
para que a caracterização de fenólicos fosse a mais completa possível. O método escolhido foi
o segundo Frighetto e Baccan (2012). Nesta metodologia, uma hidrólise básica é realizada,
liberando os ácidos fenólicos ligados através de ligação éster com a matriz, tornando-os assim
extraíveis e, posterior hidrólise ácida, utilizada para liberar os ácidos fenólicos ligados por
ligação éter com a matriz.
Os fenólicos identificados nesta etapa encontram-se na tabela 7.12:
Tabela 7.12: Fenólicos hidrolisados identificados nos frutos de grumixama.
Frações do Fruto Fenólicos
Casca
Ácido Gálico, Ácido protocatecuico, Ácido p-
hidroxibenzóico, Ácido Vanílico, Ácido Elágico,
Rutina e Isoquercetina.
Polpa Ácido Gálico, Ácido protocatecuico, Ácido p-
hidroxibenzóico, Ácido Elágico e Rutina.
Semente Ácido Gálico, Ácido protocatecuico, Ácido p-
hidroxibenzóico, Ácido Vanílico e Ácido Elágico.
64
Na figura 7.25, podem ser verificados todos os fenólicos identificados na polpa de
grumixama:
Figura 7.25: A - Cromatograma de extratos da polpa de grumixama para análise de fenólicos hidrolisáveis e B -
Cromatograma de extratos da polpa de grumixama para análise de fenólicos livres.
Na figura 7.26, podem ser verificados todos os fenólicos identificados na casca de
grumixama:
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Áci
do P
roto
cate
ico
Áci
do 4
-hid
roxi
benzó
ico
Áci
do V
anílic
o
Áci
do S
irín
gic
o
AU
-0,010
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
Minutes
8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00
Cate
quin
a
Rutina
Querc
etina
AU
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Cate
quin
a
Rutina
Querc
etina
Áci
do G
álic
o
Áci
do E
lágic
o
A
A
Áci
do E
lágic
o
Isoquercetina
Antocianinas
Rutina
B
Quer
ceti
na
Isoquer
ceti
na
Antocianinas
65
Figura 7.26: A - Cromatograma de extratos da casca de grumixama para análise de fenólicos livres; B -
Cromatograma de extratos da casca de grumixama para análise de fenólicos hidrolisáveis.
Na figura 7.27 encontram-se os fenólicos presentes nas sementes de grumixama:
Figura 7.27: A - Cromatograma de extrato de sementes de grumixama para a análise de fenólicos livres; B -
Cromatograma de extrato de sementes de grumixama para a análise de fenólicos hidrolisáveis.
A identificação de flavonoides e ácidos fenólicos foi realizada por comparação com
tempo de retenção do padrão comercial e análise do espectro de absorção a 270 nm.
Isoquercetina não foi quantificada, devido à indisponibilidade de quantidade de massa
suficiente para preparo de solução padrão. As concentrações encontram-se na tabela 7.13:
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Rutina
Querc
etina
AU
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Áci
do P
roto
cate
ico
Áci
do V
anílic
o
Áci
do S
irín
gic
o
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
Áci
do P
roto
cate
ico
Áci
do 4
-hid
roxi
benzó
ico
Áci
do V
anílic
o
Áci
do S
irín
gic
o
Áci
do G
álic
o
Ácido Elágico
A
Áci
do G
álic
o
B
Ácido
Elágico
Áci
do
Pro
toca
teic
o
Isoquer
ceti
na
Áci
do 4
-hid
roxib
enzó
ico
Áci
do V
aníl
ico
Ruti
na
Ácido Elágico
Quer
ceti
na
cate
quin
a
B
Áci
do
4-
hid
roxib
enzó
ico
66
Tabela 7.13: Concentração média de fenólicos encontrados em frutos de grumixama.
Frações Concentração de fenólicos (mg/g) média DP
Catequina Rutina Quercetina Ácido
Protocatecuico
Ácido 4-
hidroxibenzóico
Ácido
Vanílico
Ácido
Gálico
Ácido
Elágico
Ácido
Siríngico
Casca
(fração livre)
0,3210 ±
0,0905
2,0721 ±
0,0226
0,0171 ±
0,0043
ND ND ND ND 0,1906 ±
0,0139
ND
Casca
(hidrolisado)
ND 0,1629 ±
0,0401
0,0287 ±
0,0018
0,0496 ±
0,0033
0,0065 ±
0,0006
0,0067 ±
0,0006
0,195 ±
0,0091
0,0573 ±
0,0024
ND
Polpa
(hidrolisado)
ND 0,0044 ±
0,0008
0,0110 ±
0,0005
0,0115 ±
0,0001
0,0069 ±
0,0011
0,0098 ±
0,0002
0,1451 ±
0,0068
0,2670 ±
0,0185
ND
Polpa
(fração livre)
0,0288 ±
0,0017
0,0644 ±
0,0076
0,0046 ±
0,0002
ND ND ND ND 0,0468 ±
0,0009
ND
Semente
(hidrolisado)
ND ND ND 0,1115 ±
0,0041
0,0483 ±
0,0018
0,0168 ±
0,0018
1,2208 ±
0,1588
1,3185 ±
0,1652
0,0173 ±
0,0002
Semente
(fração livre)
0,2408 ±
0,0117
0,1652 ±
0,0045
ND 0,0115 ±
0,0005
0,0188 ±
0,0026
ND ND 0,2736 ±
0,0107
ND
ND – não detectado.
Esses resultados foram obtidos a partir das curvas analíticas descritas na tabela 7.14.
Tabela 7.14: Curvas analíticas e coeficiente de determinação de fenólicos.
Fenólicos Equação R2
Ácido Gálico y = 3,41e+004x - 1,02e+006 0,999963
Ácido Protocatecuico y = 2,29e+004x - 1,94e+004 0,999840
Catequina y = 3,54e+003x - 1,70e+002 0,999066
Ácido Elágico y = 3,20e+003x + 3,34e+004 0,999487
Rutina y = 9,23e+003x - 3,88e+003 0,999785
Quercetina
Ácido 4-hidroxibenzóico
y = 1,70e+004x - 5,76e+003 0,999622
y = 3,56e+004x - 3,96e+004 0,999666
Ácido Vanílico y = 2,40e+004x - 3,96e+004 0,999808
Ácido Siríngico y = 2,62e+004x- 3,92e+004 0,999842
Os valores encontrados para Ácido Elágico (0,14 mg/g) ficaram abaixo do encontrado
por Reynertson et al. (2008) (0,26mg/mg), porém praticamente a mesma concentração de
Quercetina (0,039 mg/g) foi encontrado neste mesmo estudo (0,04 mg/g). Rutina também foi
encontrada por Reynertson et al. (2008) (0,08mg/g), mas estes ficaram bem abaixo da
quantificação realizada (0,74mg/g) na parte comestível de grumixama.
67
RAMPAZZO et al. (2012) encontraram Ácido Gálico (0,0118mg/g) e Catequina
(0,064 mg/g) em morangos. Valores estes bem menores dos encontrados no presente estudo,
sendo 0,13 mg/g para Ácido Gálico e 0,19 mg/g de catequina presentes na parte comestível.
Foram detectados na polpa, além dos fenólicos encontrados, 39 picos que não foram
identificados, 31 picos não identificados nas sementes e 45 picos não identificados nas cascas
da grumixama. Todos os espectros UV/Vis destes picos apresentaram bandas de absorção
características de fenólicos, porém não conseguiu-se a identificação devido a ausência de
padrões que apresentassem o mesmo tempo de retenção destes picos. Os compostos fenólicos
são uma grande classe de substâncias, estando presentes nos vegetais na forma livre ou
ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas, mas também podem estar presentes sob a forma
de polímeros, na qual estão os taninos e as ligninas. A identificação poderá ser possível com o
isolamento e junção de outras técnicas como espectrometria de massas e RMN numa tentativa
de elucidação das estruturas destes compostos.
68
8 CONCLUSÃO
A grumixama foi identificada como uma nova fonte de carotenoides.
Foram realizadas a identificação e quantificação de oito carotenoides na parte
comestível de grumixama: Violaxantina, Luteína, Zeinoxantina, β-criptoxantina, 13-cis
β-caroteno, α-caroteno, β-caroteno e 9-cis β-caroteno. Sendo majoritários β-
criptoxantina e β-caroteno. A grumixama pode ser considerada uma boa fonte de β-
criptoxantina, carotenoide com atividade pró-vitamínica A.
Presença de vitamina C foi observada e quantificada em todas as partes do fruto. O fruto
pode ser considerado rico neste composto.
Foram obtidos 4837,2 mg/100g de antocianinas monoméricas totais. Foram detectadas e
quantificadas sete antocianinas nas cascas liofilizadas de Grumixama. Somente uma não
foi identificada.
Realizada identificação de dez compostos fenólicos nas cascas de grumixama:
(catequina, antocianinas, rutina, isoquercetina, quercetina, ácido gálico, ácido
protocatecuico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido vanílico, ácido elágico), nove fenólicos
na polpa (catequina, antocianinas, ácido elágico, rutina, isoquercetina, ácido gálico,
ácido protocatecuico, ácido p-hidroxibenzóico, ácido vanílico) e setenas sementes de
grumixama (ácido gálico, ácido elágico, ácido siríngico, rutina, ácido protocatecuico,
ácido p-hidroxibenzóico, ácido vanílico). Destes, somente a isoquercetina não foi
quantificada.
Além disso, foram detectados na polpa, 39 picos que não foram identificados, 31 picos
não identificados nas sementes e 45 picos não identificados nas cascas da grumixama.
A identificação poderá ser possível com o isolamento e utilização de outras técnicas em
conjunto como a espectrometria de massas e RMN numa tentativa de elucidação das
estruturas destes compostos.
O resultado para umidade ficou dentro do esperado para frutos.
69
9 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As cascas de grumixama apresentaram um excelente potencial para aproveitamento na
indústria de alimentos, sendo um ótimo aditivo para utilização em produtos que podem
promover possíveis benefícios para a saúde.
Com todas as informações obtidas e como tem se tornado cada vez mais evidente que
respostas de proteção não estão exclusivamente associadas a um único fator, mas a
presença de múltiplos fatores atuando de forma sinérgica, os frutos de grumixama podem
ser considerados como um excelente alimento com propriedades funcionais.
Os resultados visam ainda contribuir para um maior conhecimento de antioxidantes
presentes nos frutos de grumixama, sendo importante incentivar a sua utilização sua
domesticação.
70
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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