1. INTRODUÇÃO

Existem vários métodos para a quantificação da massa de células e para a determinação do número de células presentes em uma suspensão. Estes métodos podem ser diretos ou indiretos.

Entre os métodos diretos podemos citar:1.1.Gravimetria: Técnica que efetua a secagem e a pesagem de um determinado volume

de suspensão até a obtenção de peso constante.

1.2.Contagem com câmara de Neubauer: Procede-se a contagem de cada célula presente em uma lamínula com o auxílio de um microscópio, e posteriormente, realiza-se uma estimativa do número total de células.

Figura 1 – Câmara de Neubauer

Figura 2 – Esquema da Câmara de Neubauer

Já entre os métodos indiretos:1.3.Turbidimetria: Este método é uma adaptação da espectrofotometria da química analítica

para a utilização na quantificação de células. Ele utiliza os princípios da absorção e da transmissão de luz, para relacionar o valor absorvido com a concentração de células.

Neste estudo, fizemos uso da Saccharomyces cerevisiae (Figura 3), que é um fungo eucariote unicelular muito utilizado na fermentação de pães e de cerveja, além de ser usada para a produção de etanol.

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Figura 3 - Saccharomyces cerevisiae

Esse fungo é utilizado como fermento biológico, por liberar dióxido de carbono, por exemplo, na massa de pão, fazendo-a crescer. No caso das bebidas alcoólicas produzidas pelo processo de fermentação, como os vinhos e a cerveja, o Saccharomyces cerevisiae auxilia na transformação do açúcar em álcool etílico.

É um organismo utilizado como modelo no estudo da Bioquímica, Genética e Biologia Celular de eucariotas, pois é de fácil manutenção em laboratório e não representa risco a quem o esta utilizando.

PRÁTICA 1 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR GRAVIMETRIA

2. OBJETIVO

Utilizar a técnica da gravimetria para determinar a massa de levedura presente em uma suspensão.

3. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES

3.1.Pipeta graduada de 10,0 mL;3.2.Balança Analítica FA – 2104N da BIOPRECISA;3.3.Pesa – Filtro de forma baixa;3.4.Erlenmeyer de 125 mL;3.5.Estufa Quimis;3.6.Suspensão de levedura (Saccharomyces Cerevisiae) 2% p/v.

4. METODOLOGIA

4.1.Pipetou-se 10,0 mL de uma suspensão de levedura para um pesa – filtro de forma baixa, previamente tarado.

4.2.Em seguida, efetuou-se a pesagem da suspensão pipetada, e anotou-se o valor encontrado (1ª Pesagem).

4.3.Levou-se este pesa – filtro para uma estufa, pré-aquecida a 105°C para a secagem da suspensão.

4.4.Após um determinado tempo dentro da estufa, procedeu-se o resfriamento do pesa – filtro em um dessecador.

4.5.Realizou-se uma nova pesagem (2ª Pesagem).

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4.6.Estes procedimentos foram realizados em triplicata.

5. RESULTADOS

As massas referentes às pesagens realizadas em cada uma das triplicatas encontram-se na tabela a seguir:

Tabela 1 – Massas das PesagensTara do Pesa – Filtro 1ª Pesagem 2ª Pesagem

P2 61,9695 g 71,7435 g 62,1448 gP3 60,4487g 70,3022 g 60,6259 gP4 58,8677 g 68,6748 g 59,0392 g

5.1.Massa inicial:m0=1 ª Pesagem−TaraPesa−Filtro

P2: m0=71,7435−61,9695=9,7740gP3:m0=70,3022−60,4487=9,8535gP4:m0=68,6748−58,8677=9,8071g

5.2.Média da massa inicial:

x=∑i=1

3

x i

n

x=9,7740+9,8535+9,80713

=9,8115 g

5.3.Massa Seca:m=2 ª Pesagem−TaraPesa−Filtro

P2: m=62,1448−61,9695=0,1753gP3:m=60,6259−60,4487=0,1772gP4:m=59,0392−58,8677=0,1715g

5.4.Média da massa seca:

x=∑i=1

3

x i

n

x=0,1753+0,1772+0,17153

=0,1747 g

5.5.Percentual de massa seca:

%massa seca= mm0×100

%massa seca=0,17479,8115

×100=1,78%

5.6.Percentual de umidade:

%umidade=(m0−m)m0

×100

3

%umidade=9,8115−0,17479,8115

×100=98,22%

6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

A amostra utilizada nesta prática foi uma suspensão de levedura, que tende a formar uma deposição no fundo do recipiente ao qual está armazenado, no caso um erlenmeyer. Para diminuir o erro causado por este fato, realizou-se a análise em triplicata, para assim obter-se uma média que foi utilizada nos cálculos de percentual de massa seca e de umidade. Também procedeu a agitação da amostra antes da retirada das alíquotas, para que houvesse a ressuspensão da levedura depositada ao fundo.

Através dos resultados apresentados acima, podemos perceber que da alíquota de 10,0 mL da amostra que tem massa total de 9,8115 g apenas 0,1747 g são provenientes de leveduras, ou de algum outro material que esteja ali presente, tais como, polissacarídeos e proteínas, o que representa um percentual de 1,78 % de massa seca e de 98,22 % de água presente na suspensão.

Este método apresenta algumas limitações que o torna pouco operacional, como por exemplo: O tempo de demora para a obtenção do resultado que corresponde ao tempo de secagem do material na estufa; a incapacidade de diferenciar as células viáveis das células mortas e o fato de quantificar em sua massa seca qualquer outro material que esteja ali presente como citado posteriormente.

7. CONCLUSÃO

Em virtude do exposto, podemos concluir que apesar de ser um método de simples realização, ele não fornece resultados com uma grande confiabilidade e tão pouco atende a demanda de uma grande indústria que requer resultados cada vez mais rápidos, porém, dependendo do uso que se dê ele atende com satisfação a uma rotina em laboratório.

PRÁTICA 2 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR TURBIDIMETRIA

8. OBJETIVO

Determinar a massa de levedura presente em uma suspensão de concentração desconhecida através da utilização do espectrofotômetro.

9. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES

9.1. Pipeta graduada de 2,0 mL;9.2. Balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250 e 500 mL;9.3. Pró-pipete;9.4. Tubos de ensaio com tampa;9.5. Espectrofotômetro Unicam 5625 UV/VIS Spectrometer;9.6. Suspensão de levedura 2% p/v.

10.METODOLOGIA

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10.1. De acordo com a tabela a seguir, com o auxílio de uma pipeta graduada prepararam-se padrões de diferentes concentrações a partir de uma suspensão – mãe de levedura a 2% p/v (base úmida).

Tabela 2 – Preparo dos Padrões

Tubo Diluição Preparo Concentração (Base Úmida)1 1/25 1 mL em Balão Volumétrico de 25 mL 800 ppm2 1/50 1 mL em Balão Volumétrico de 50 mL 400 ppm3 1/100 1 mL em Balão Volumétrico de 100 mL 200 ppm4 1/200 1 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 100 ppm5 1/400 0,5 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 50 ppm6 1/800 0,25 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 25 ppm7 1/1000 0,5 mL em Balão Volumétrico de 500 mL 20 ppm

10.2. Com o auxílio de uma pipeta graduada, diluiu-se a amostra (suspensão de levedura) de concentração desconhecida a 1/250 mL.

10.3. Após uma intensa homogeneização, transferiu-se cerca de 10 mL de cada uma das soluções preparadas, incluindo a amostra, para tubos de ensaio com tampa, previamente identificados.

10.4. Mantendo-se a agitação de cada tubo, procedeu-se a leitura das absorbâncias dos padrões e da amostra no comprimento de onda de 570 nm, com a utilização de água como branco.

11.RESULTADOS

11.1. Cálculo da concentração, em ppm, de levedura em base seca: Para realizar estes cálculos, foi utilizado o valor de 0,1747 g referente a massa seca de levedura em 10,0 mL de suspensão.

Diluição 1/25:0,1747 g −¿10,0mLx −¿1,0mL

x=0,1747×1,010,0

=0,01747g=17,5mg

17,5mg −¿25,00mLy −¿1000,00mL

y=17,5×1000,0025,00

=700,0 ppm

Diluição 1/50:0,1747 g −¿10,0mLx −¿1,0mL

x=0,1747×1,010,0

=0,01747g=17,5mg

17,5mg −¿50,00mLy −¿1000,00mL

y=17,5×1000,0050,00

=350,0 ppm

5

Diluição 1/100:0,1747 g −¿10,0mLx −¿1,0mL

x=0,1747×1,010,0

=0,01747g=17,5mg

17,5mg −¿100,00mLy −¿1000,00mL

y=17,5×1000,00100,00

=175,0 ppm

Diluição 1/200:0,1747 g −¿10,0mLx −¿1,0mL

x=0,1747×1,010,0

=0,01747g=17,5mg

17,5mg −¿200,00mLy −¿1000,00mL

y=17,5×1000,00200,00

=87,5 ppm

Diluição 1/400:0,1747 g −¿10,0mLx −¿0,5mL

x=0,1747×0,510,0

=0,0087 g=8,7mg

8,7mg −¿200,00mLy −¿1000,00mL

y=8,7×1000,00200,00

=43,5 ppm

Diluição 1/800:0,1747 g −¿10,0mLx −¿0,25mL

x=0,1747×0,2510,0

=0,0087g=4,4mg

4,4mg −¿200,00mLy −¿1000,00mL

y= 4,4×1000,00200,00

=22,0 ppm

Diluição 1/1000:0,1747 g −¿10,0mLx −¿0,5mL

x=0,1747×0,510,0

=0,0087 g=8,7mg

6

8,7mg −¿500,00mLy −¿1000,00mL

y=8,7×1000,00500,00

=17,4 ppm

Resumindo:

Tabela 3 – Resumo dos Resultados das Concentrações em Base Seca

Tubo Diluição Concentração (Base Seca)1 1/25 700,0 ppm2 1/50 350,0 ppm3 1/100 175,0 ppm4 1/200 87,5 ppm5 1/400 43,5 ppm6 1/800 22,0 ppm7 1/1000 17,4 ppm

11.2. Curvas Padrões:

Tabela 4 – Dados da Curva PadrãoTubo Concentração (Base Seca) Absorbância (570 nm)

1 700,0 ppm 1,2682 350,0 ppm 0,9073 175,0 ppm 0,4894 87,5 ppm 0,2975 43,5 ppm 0,1536 22,0 ppm 0,0847 17,4 ppm 0,069

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 7500

0.10.20.30.40.50.60.70.80.9

11.11.21.31.4

f(x) = 0.00179874355285308 x + 0.10814760662126R² = 0.957416646395276

Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura

Curva PadrãoLinear (Curva Padrão)

Concentração dos Padrões em Base Seca (ppm)

Abso

rbân

cia (5

70 n

m)

Gráfico 1 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Este gráfico apresenta o padrão com diluição 1/25, colocado somente para estudo.

Aplicando-se as fórmulas do Coeficiente Angular e do Coeficiente Linear, pode-se verificar que estes valores para o gráfico 1, são:

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Coef. Ang.= 0,001798744Coef. Linear = 0,108147607

0 50 100 150 200 250 300 350 4000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

f(x) = 0.00249847942517444 x + 0.0435929012889486R² = 0.996266614606685

Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura

Curva PadrãoLinear (Curva Padrão)

Concentração dos Padrões em Base Seca (ppm)

Abso

rbân

cia (5

70 n

m)

Gráfico 2 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Gráfico utilizado para a quantificação, pois não apresenta o padrão com diluição 1/25.

Aplicando-se as mesmas fórmulas do Coeficiente Angular e do Coeficiente Linear, pode-se verificar que estes valores para o gráfico 2, são:

Coef. Ang.= 0,002498479Coef. Linear = 0,043592901

11.3. Concentração de levedura na Amostra: A absorbância da amostra foi 0,222.y⏟A

= a⏟ε× b

×x⏟C

0,222=0,002498479×C+0,043592901C=71,41 ppm

12.DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Com a utilização dos resultados obtidos na prática apresentada anteriormente, pode-se calcular a concentração de levedura em base seca e assim construir uma curva padrão que atendesse ao objetivo desta prática.

Através da equação da reta desta curva, chegamos ao resultado da concentração de levedura que foi de 71,41 ppm, um valor que, como o esperado, sem encontra dentro da curva, o que nos permite ter uma maior confiança nesse valor encontrado.

Foram colocados acima dois gráficos, um contendo um ponto que representa uma diluição de 1/25 (Gráfico 1) e outro que efetivamente foi utilizado nos cálculos que não apresenta este ponto (Gráfico 2). Estes gráficos foram colocados para realizar uma comparação e exemplificar uma das limitações deste método, que é a falta de linearidade que ocorre em soluções pouco diluídas, devido a um desvio que ocorre na Lei de Beer. Em soluções muito concentradas passam a ocorrer aglutinações entre as células, isto acaba alterando a absortividade e conseqüentemente, aumentando o valor da absorbância lida,

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levando este valor para a parte do gráfico que não corresponde à faixa linear do mesmo, causando assim erros grosseiros na leitura e nos cálculos.

Este método possui algumas limitações, como, não ser muito eficiente para soluções muito concentradas, como foi explicado acima, e não conseguir distinguir células viáveis de células não-viáveis e tão pouco de outros materiais que possam estar presentes junto das células.

13.CONCLUSÃO

Podemos concluir que este método de quantificação é de grande rapidez e de fácil utilização, pois não requer nada além de simples diluições para a preparação dos padrões e da amostra, e de um espectrofotômetro. É um método que apresenta resultados satisfatórios, mesmo com as suas limitações.

PRÁTICA 3 – CONTAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA EM CÂMARA DE NEUBAUER

14.OBJETIVO

Através de um instrumento chamado Câmara de Neubauer, proceder à contagem e realizar uma estimativa do número de células presentes na suspensão.

15.EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES

15.1. Câmara de Neubauer;15.2. Microscópio;15.3. Pipeta de 1,0 mL;15.4. Balão Volumétrico de 250,00 mL;15.5. Suspensão de Levedura 5% p/v.

16.METODOLOGIA

16.1. Pipetou-se 1,0 mL de uma suspensão de levedura previamente preparada, para um balão volumétrico de 250,00 mL, completando o seu volume com água destilada até o traço de aferição.

16.2. Transferiram-se algumas gotas desta solução para uma Câmara de Neubauer.

16.3. Colocou-se a Câmara de Neubauer em um microscópio e com a utilização do mesmo, procedeu-se a contagem do número de células presentes na suspensão.

17.RESULTADOS

17.1. Quantidade de células encontradas nas quadrículas:

Quadrícula A1: 33, 33, 34 →x=33+33+343

=33,33

Quadrícula A5: 24, 24, 24 →x=24+24+243

=24

Quadrícula C3: 26, 22, 22 →x=26+22+223

=23,33

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Quadrícula D4: 18, 18, 18 →x=18+18+183

=18

Quadrícula E1: 27, 27 →x=27+272

=27

17.2. Estimativa do número de células de levedura:nº de células /mL=x ×25×FD×104

Onde: x é a o somatório do número de células contadas dividas pelo número de quadrados

contados (∑i=15

xi

n¿;

25 é o número total de quadrados no centro da câmara; FD é o fator de diluição usado na preparação da amostra; 104 é o fator de conversão de cm3 para mL.

nº de células /mL=33,33+24+23,33+18+275

×25×250×104

nº decélulasmL

=1,57×109células /mL

18.DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Através do método da contagem com o uso da câmara de Neubauer, determinou-se a presença de 1,57x109 células por mL de suspensão. Para padronizar esta contagem utilizou-se da regra do “L”, que convenciona a contagem das células que estão sob a linha tripla, como na forma de um L, assim quando as células estão naquela região pertencem ao quadrado a que se está contando e quando as células estão sob o L invertido (outro lado do quadrado) pertence ao quadrado subseqüente.

Devido à falta de agitação em um equipamento específico, pode-se perceber a formação de grumos, ou seja, aglutinações entre as células de leveduras, causando assim alguns equívocos na contagem de quadrículas. Este fato pode ser encarado como uma das limitações deste método.

Como nos outros métodos, as limitações de não distinguir células viáveis de células não-viáveis e de outros materiais que possam estar presentes junto das células também se aplicam neste método. Porém o problema das células viáveis e das não-viáveis pode ser resolvido com a adição de azul de metileno. Esta técnica consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) ficaram coloridas de azul (Figura 3).

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Figura 4 – Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.19.CONCLUSÃO

A partir do que foi apresentado acima, concluímos que este método apresenta ótimos resultados na determinação do número de células, porém, apresenta um grau de dificuldade mais elevado que os métodos anteriores, devido ao uso do microscópio e da dificuldade de contagem das células.

20.REFERÊNCIAS

CONTAGEM DE CÉLULAS EM CÂMARA DE NEUBAUER. Disponível em: <http://www.icb.usp.br/~bmm/materiais/P3a%20%20Contagem%20de%20celulas%20em%20camara%20de%20Neubauer.pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 14h23min.

MÉTODOS DE ANÁLISES E MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO EM LABORATÓRIO DE DESTILARIA. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS. AUTORA: SANDRA REGINA CECCATO ANTONINI. Disponível em: <http://www.cca.ufscar.br/lamam/download/apostila_monitoramento_microbiologico.pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 15h07min.

A. OLIVEIRA LIMA, J. BENJAMIM SOARES, J. B. GRECO, J. GALIZZI, J. ROMEU CANÇADO. MÉTODOS DE LABORATÓRIO APLICADOS À CLÍNICA. 5ª Ed. – 1977. Editora Guanabara Koogan.

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