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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO DO CÉREBRO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
Herdabilidade do comportamento social e alterações na
composição neuronal do córtex pré-frontal em um modelo animal
de autismo
Aluna: Juliana Alves Brandão Medeiros de Sousa
Orientador: Prof. Dr. Marcos Romualdo Costa
Co-orientador: Prof. Dr. Rodrigo Neves Romcy-Pereira
NATAL – RN
2018
Juliana Alves Brandão Medeiros de Sousa
Herdabilidade do comportamento social e alterações na
composição neuronal do córtex pré-frontal em um modelo animal
de autismo
Natal – RN
2018
- 3 -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE
Sousa, Juliana Alves Brandao Medeiros de.
Herdabilidade do comportamento social e alterações na
composição neuronal do córtex pré-frontal em um modelo animal de autismo / Juliana Alves Brandao Medeiros de Sousa. - Natal,
2018.
140f.: il.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do
Cérebro, Neurociências. Orientador: Marcos Romualdo Costa.
Coorientador: Rodrigo Neves Romcy-Pereira.
1. Autismo. 2. VPA. 3. Comportamento social. 4. Parvalbumina.
5. Herança epigenética. I. Costa, Marcos Romualdo. II. Romcy-
Pereira, Rodrigo Neves. III. Título.
RN/UF/BSICe CDU 612.8
Elaborado por DEBORA COSTA ARAUJO DI GIACOMO KOSHIYAMA - CRB-15-
284
- 4 -
JULIANA ALVES BRANDÃO M. DE SOUSA
Herdabilidade do comportamento social e alterações na
composição neuronal do córtex pré-frontal em um modelo animal
de autismo
Apresentada em 10 de Agosto de 2018
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Cecília Hedin Pereira Fundação Oswaldo Cruz
Prof. Dr. Cleiton Lopes Aguiar Universidade Federal de Minas Gerais
Profa. Dra. Emelie Katarina Svahn Leão Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof. Dr. Eduardo Bouth Sequerra Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof. Dr. Rodrigo Neves Romcy-Pereira Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Prof. Dr. Marcos Romualdo Costa Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Natal – RN
2018
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte como pré-requisito para obtenção do título de
Doutora em Neurociências.
Aos homens e mulheres da minha vida:
Breno, Lucca, Emanoel, Vitória e Marília.
- 6 -
―O preço de qualquer coisa é a quantidade
de vida que você troca por isso‖
Henry David Thoreau
AGRADECIMENTOS
À minha família, por todo o suporte, por todo amor, apoio, orações, carinho e compreensão que me
deram ao longo de toda essa jornada. Obrigada por entenderem o quanto tudo isso significa pra mim.
Sem vocês tudo teria sido muito mais difícil. Foram vocês que me estimularam a não desistir nunca.
Ao professor Marcos Costa, o meu muito obrigada por ter me aceitado em seu laboratório, por todos
os ensinamentos passados para orientação e para a vida, desde o meu ingresso no ICe. Sua paixão
pela ciência e seu olhar sempre positivo, enxergando o melhor no trabalho com certeza tornaram
esse fim de doutorado possível de ser alcançado. Obrigada pela confiança.
Ao professor Rodrigo Pereira, agradeço imensamente por ter aberto as portas do ICe para minha
entrada ainda em 2011, e por ter me permitido participar desse projeto pelo qual sou apaixonada.
Obrigada por todo conhecimento transmitido desde então. Com certeza você foi fundamental no meu
crescimento nesses últimos anos. Me encontrei profissionalmente e pessoalmente nessa casa
chamada ICe.
Ao comitê de acompanhamento (Profa. Cecília e Prof. Tarciso) e banca avaliadora (Profa. Cecília –
novamente, Prof. Cleiton, Profa. Kia e Prof. Eduardo), obrigada pelo empenho e pela disponibilidade
em colaborar com esse trabalho. Cada um de vocês tem uma paixão pelo que fazem que é
inspiradora e linda de se ver. O Brasil tem muita sorte de ter vocês fazendo ciência de tão alta
qualidade aqui.
Ao corpo técnico, agradeço o trabalho diário nos bastidores para manter o ICe em constante
funcionamento, e por sempre tentarem facilitar o trabalho de quem está na bancada. Em especial a
Ana Cristina, Sérgio e Joelson.
Aos amigos do Neurocell e Laboratório de Plasticidade e Circuitos Neurais, aos que foram e ainda
estão. Muito obrigada pelo companheirismo, amizade e apoio diário.
Às meninas@neuro. Vocês são incríveis.
À família ICe, aos que permanecem em Natal e aos que já voaram para mais longe. Tenho muito
orgulho dos grandes amigos criados ao longo desses anos de pós graduação, e que estão brilhando
ao redor do mundo.
Aos amigos que a biomedicina me deu, os melhores que poderia ter.
RESUMO
O autismo compreende um grupo heterogêneo de desordens caracterizado por déficits sensoriais, motores, de linguagem e principalmente sociais ainda no início da infância. Fatores genéticos, epigenéticos e ambientais estão fortemente envolvidos na predisposição ao autismo. Estudos em modelos animais da doença sugerem que estes mesmos fatores podem alterar o desenvolvimento do sistema nervoso central, modificando padrões de diferenciação e maturação neuronal, gerando uma circuitaria cerebral disfuncional. O modelo animal induzido através de administração de VPA em ratas grávidas foi previamente caracterizado pelo nosso grupo. Nós demonstramos que animais expostos ao VPA durante a gestação (F1VPA) apresentaram comportamentos ―tipo-autista‖ na vida pós-natal, tais como hiperlocomoção, estereotipia prolongada e redução da interação social. Histologicamente, detectamos uma redução no número de interneurônios parvalbumina (PV)+ no córtex pré-frontal medial (CPFm) destes animais em comparação aos controles. Considerando os efeitos do VPA sobre a estrutura da cromatina e metilação do DNA, levantamos a hipótese de que alterações comportamentais e histológicas observadas em animais F1VPA seriam transmissíveis para a geração seguinte, independente de novas exposições ao VPA. Neste trabalho, analisamos o comportamento e a histologia do CPFm na progênie dos animais F1VPA, doravante denominados F2. Observamos que estes animais apresentaram significativa redução na interação social e na frequência de levantamentos exploratórios quando comparados aos animais controle. Esta redução na preferência social, no entanto, foi intermediária entre aquela apresentada por animais controle e animais F1VPA, sendo que nestes últimos os prejuízos no comportamento social foram mais intensos. Por outro lado, não observamos hiperlocomoção, nem alterações no comportamento exploratório ou no padrão de estereotipias em animais F2 quando comparados aos controles, uma vez que seus perfis foram normalizados com relação aos animais F1VPA. A fim de testar se os prejuízos comportamentais na F2 ocorriam em resposta aos cuidados parentais de mães VPA e mães controle sobre seus filhotes, realizamos experimentos de adoção cruzada. Nós observamos que animais F2 cuidados por mães controle apresentam baixos índices de sociabilidade quando comparados a animais controle cuidados por mães controle, o que corrobora a interpretação de que as alterações observadas nestes animais são devido à herança parental. A avaliação histológica do tecido cortical revelou alterações na proporção de interneurônios PV+ no CPFm em animais F1VPA. Também foi observado um discreto aumento do número total de neurônios no CPFm em animais F1VPA e F2, sugerindo que alterações distintas na organização da circuitaria neuronal podem estar presentes nos dois grupos de animais. Portanto, os dados apresentados indicam que a exposição pré-natal ao VPA induz alterações comportamentais e histológicas em ratos, e que estas podem ser parcialmente transmitidas aos seus descendentes. No entanto, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os déficits sociais e alterações celulares, demonstrando que diferentes alterações na circuitaria podem produzir os efeitos comportamentais similares. Este modelo poderá contribuir no futuro para a identificação de assinaturas genéticas associadas com as alterações comportamentais e histológicas observadas no autismo.
Palavras-chave: autismo, VPA, comportamento social, parvalbumina, herança
epigenética.
ABSTRACT
Autism comprises a heterogeneous group of disorders characterized by sensory, motor, language and mainly social deficits in early childhood. Genetic, epigenetic and environmental factors are strongly involved in the predisposition to autism. Studies in animal models of the disease suggest that these same factors can alter the development of the central nervous system, modifying patterns of differentiation and neuronal maturation and generating a dysfunctional brain circuitry. Our group previously characterized the animal model induced by administration of VPA in pregnant rats. We demonstrated that VPA-exposed animals during pregnancy (F1VPA) exhibit "autistic" behaviors in postnatal life, such as hyperlocomotion, prolonged stereotypy, and reduced social interaction. Histologically, we detected a reduction in the number of parvalbumin (PV)+ interneurons in the medial prefrontal cortex (mPFC) of these animals compared to controls. Considering the effects of VPA on chromatin structure and DNA methylation, we hypothesized that behavioral and histological changes observed in F1VPA animals would be transmissible for the next generation, independent of new VPA exposures. In this work, we analyzed the behavior and histology of mPFC in F1VPA progeny, hereafter referred to as F2. We observed that these animals present a significant reduction in social interaction and in the frequency of exploratory surveys when compared to control animals. This reduction in social preference, however, was intermediate between that presented by control animals and F1VPA animals, and in the latter the losses in social behavior were more intense. On the other hand, we did not observe hyperlocomotion, nor alterations in the exploratory behavior or stereotyped patterns in F2 animals when compared to the controls, once their profiles were normalized with respect to F1VPA animals. In order to test whether behavioral impairments in F2 stemmed from differences in parental care of VPA mothers and control mothers on their offspring, we performed cross-fostering experiments. We observed that F2 animals cared for by control mothers presented low rates of sociability when compared to control animals cared for by control mothers, which corroborates the interpretation that the observed changes in F2 animals are due to parental inherance. Histological evaluation of cortical tissue reveals changes in the proportion of PV+ interneurons in the mPFC of F1VPA animals. We also observed a slight increase in the total number of neurons in the CPFm of both F1VPA and F2 animals, suggesting that distinct alterations in the organization of neuronal circuitry may be present in both groups of animals. Therefore, our data indicate that prenatal exposure to VPA induces behavioral and histological changes in rats, and that these can be partially transmitted to their offspring. However, we cannot establish a direct correlation between social deficits and cellular changes in the mPFC, demonstrating that different changes in the circuitry can produce the same behavioral effects. This model may contribute in the future to the identification of genetic signatures associated with the behavioral and histological changes observed in autism.
Keywords: autism, VPA, social behavior, parvalbumin, epigenetic inheritance.
LISTA DE ABREVIATURAS
AP: Anteroposterior
5-HT: 5-hidroxitriptamina
CEUA: Comitê de Ética para Uso de Animais
Cg: Córtex Cingulado
CNTNAP2: Proteína Associada a Conectina Tipo-2
CPFm: Córtex Pré-frontal Medial
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
DSM-V: Manual Diagnóstico e Estatístico de Doenças Mentais V
EEG: Eletroencefalograma
GABA: Ácido gama-aminobutírico
GAD65: glutamato descarboxilase 65kDa
GAD67: glutamato descarboxilase 67kDa
HAC: Histona Acetilase
HCl: Ácido Clorídrico
HDAC: Histona Desacetilase
IL: Córtex Infralímbico
IRM: Imagem por Ressonância Magnética
NaCl: Cloreto de Sódio
NGS: Soro Normal de Cabra
NMDA: N-Metil D-Aspartato
PARV: Parvalbumina
PB: Tampão Fosfato
PBS: Tampão Fosfato Salina
PFA: Paraformaldeído
P0: Dia pós-natal 0
PL: Córtex pré-límbico
RNA: Ácido Ribonucleico
TEA: Transtorno do Espectro Autista
VPA: Ácido Valpróico
PUBLICAÇÕES DURANTE O PERÍODO DE DOUTORAMENTO
I. BRANDÃO, JULIANA A.; ROMCY-PEREIRA, RODRIGO N. . Interplay of
environmental signals and progenitor diversity on fate specification of
cortical GABAergic neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience, v. 9, p.
149, 2015.
Citações Web of Science: 10
II. ANOMAL, RENATA FIGUEIREDO ; DE VILLERS-SIDANI, ETIENNE ;
BRANDÃO, JULIANA ALVES ; DINIZ, REBECCA ; COSTA, MARCOS R. ;
ROMCY-PEREIRA, RODRIGO N. . Impaired Processing in the Primary
Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Frontiers in Systems
Neuroscience, v. 9, p. 158, 2015.
Citações Web of Science: 8
SUMÁRIO
1. Introdução ...................................................................................................................................... 14
1.1 - AUTISMO ...................................................................................................................................... 15
1.2 –EPIGENÉTICA E AUTISMO ......................................................................................................... 16
1.2.1 – Modulação Epigenética ..................................................................................................... 16
1.2.2 – Transmissão Não-Genética e Fatores Ambientais ........................................................... 17
1.2.3 - Cuidado Materno ................................................................................................................ 18
1.3 – ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE CRIANÇAS COM
AUTISMO .............................................................................................................................................. 20
1.3.1 - Alterações no córtex frontal ............................................................................................... 20
1.3.2 - Alterações nas sinapses e neurotransmissores na microcircuitaria cortical ..................... 22
1.4 – ALTERAÇÕES NO DESENVOLVIMENTO DO SNC E AUTISMO .............................................. 24
1.4.1 –Papel dos Interneurônios na Circuitaria Neuronal ............................................................. 27
1.5 - MODELOS EXPERIMENTAIS DE AUTISMO .............................................................................. 32
1.5.1 – Modelo de Exposição Pré-Natal ao Ácido Valpróico ........................................................ 33
2. Justificativa .................................................................................................................................... 39
3. Objetivos .......................................................................................................................................... 41
3.1- OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................ 42
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 42
4. Materiais e Métodos ...................................................................................................................... 43
4.1- MODELO ANIMAL DE AUTISMO .................................................................................................. 44
4.2 – MODELO ANIMAL F2 POR ADOÇÃO CRUZADA ...................................................................... 45
4.3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL ................................................................ 46
4.4 – AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS ......................................................................................... 46
4.4.1 – Avaliação da Atividade Exploratória .................................................................................. 47
4.4.2 – Avaliação da Auto-limpeza (ou grooming) ........................................................................ 48
4.4.3 – Avaliação da Interação Social ........................................................................................... 48
4.5 – AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA ................................................................................................... 50
4.5.1 – Perfusão e Preparação do Tecido .................................................................................... 50
4.5.2 – Imunofluorescência ........................................................................................................... 51
4.5.3 – Contagem e Distribuição Celular....................................................................................... 51
4.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................ 53
5. Resultados ....................................................................................................................................... 54
5.1 – ACASALAMENTO DE ANIMAIS F1VPA ........................................................................................ 55
5.2 - DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL ............................................................................................. 55
5.3- TESTES COMPORTAMENTAIS ................................................................................................... 57
5.3.1 – Atividade Locomotora Exploratória ................................................................................... 57
- 13 -
5.3.2- Interação Social .................................................................................................................. 63
5.4 – ADOÇÃO CRUZADA ................................................................................................................... 67
5.4.1 – Peso .................................................................................................................................. 68
5.4.2 – Abertura dos olhos ............................................................................................................ 69
5.4.3 – Locomoção ........................................................................................................................ 70
5.4.4 – Interação Social ................................................................................................................. 71
5.5 – ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS NO CÓRTEX PRE-FRONTAL ................................................ 76
5.5.1 – Celularidade Total (DAPI) ................................................................................................. 77
5.5.2 – População Neuronal (NeuN) ............................................................................................. 79
5.5.3 – Interneurônios GABAérgicos Expressando Parvalbumina ............................................... 80
6. Discussão ......................................................................................................................................... 85
7. Conclusão ...................................................................................................................................... 100
8. Referências ................................................................................................................................... 102
9. Anexos ........................................................................................................................................... 116
14
1. Introdução
INTRODUÇÃO
15
1.1 - AUTISMO
O autismo é uma neuropatologia descrita inicialmente por Leo Kanner e Hans
Asperger em meados da década de 40, na qual crianças ainda no início da infância
apresentaram sintomas como déficit de linguagem verbal e não-verbal,
hiperatividade e déficit de interação social (Kanner, 1943). Em 2013, a Sociedade
Americana de Psiquiatria, em nova revisão do tradicional Manual Diagnóstico e
Estatístico de Doenças Mentais (DSM V), categorizou o autismo em uma única
categoria – o transtorno do espectro autista (TEA) – incorporando à essa
classificação o grau de severidade do transtorno, que é determinado a partir dos
níveis de déficit de comunicação e no comportamento repetitivo. (American
Psychiatric Association, 2013).
Os dados epidemiológicos revelam uma alta prevalência de TEA em países
desenvolvidos quando comparados com países latino-americanos, por exemplo
(Lyall et al., 2017a). Nos Estados Unidos, de acordo com o último levantamento feito
pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), 1 em cada 59 crianças
com idade de até 8 anos foram diagnosticadas com autismo (Baio et al., 2018) No
Brasil, o único dado epidemiológico refere-se a um estudo piloto realizado na cidade
de Atibaia, no estado de São Paulo, onde foi encontrada uma prevalência de apenas
0,3% de TEA na população (Paula et al., 2011). Independente dos índices
encontrados nos países, a incidência de autismo é mais elevada em meninos, que
são 4,5x mais afetados que as meninas (Christensen et al., 2016).
Há uma estimativa de que a taxa de herdabilidade nos EUA e Europa varie
entre 50 e 95%, com risco de recorrência entre irmãos de 3 a 18% (Lyall et al.,
2017a), sendo essa concordância entre gêmeos monozigóticos mais elevada,
podendo chegar a 80% (Geschwind, 2011). Por isso, a predisposição ao autismo
tem sido ligada a inúmeros genes. Inclusive, muitos dos fenótipos encontrados no
TEA também podem ser detectados em síndromes genéticas já bem descritas na
literatura, como é o caso da Síndrome do X Frágil, Síndrome de Rett, Síndrome de
Angelman e Esclerose Tuberosa (Pardo and Eberhart, 2007a).
INTRODUÇÃO
16
A utilização de fármacos durante o período gestacional também tem se mostrado
um importante fator no aumento da incidência do autismo (Lyall et al., 2017a) . Em
estudo epidemiológico realizado na Dinamarca, foi observado que a utilização de
ácido valpróico (VPA) - uma droga antiepiléptica - em mulheres grávidas elevou em
4,4% o risco desses filhos serem diagnosticados com autismo. Além disso,
observou-se que nesse caso de exposição ao VPA ainda no período embrionário, é
encontrada a mesma proporção de chance de meninos e meninas desenvolverem a
patologia . A dose e o período de exposição pré-natal à droga também influenciaram
nos índices obtidos nesse estudo. É interessante observar que a utilização de outros
fármacos antiepilépticos, como oxcarbazepina, por exemplo, não aumentou o risco
de desenvolvimento de TEA nos filhos dessas pacientes (Christensen et al., 2013).
1.2 –EPIGENÉTICA E AUTISMO
1.2.1 – Modulação Epigenética
O termo epigenética foi introduzido no início da década de 40 e vem sendo
definido atualmente como sendo o estudo das modificações que ocorrem na
estrutura de um gene sem que ocorram alteração na sequência de DNA (Dupond et
al., 2009). Entre as principais modificações epigenéticas caracterizadas estão as
metilações/acetilações que permitem modular os níveis de compactação da
cromatina, assim como modificações na estrutura das histonas
Alterações epigenéticas durante o desenvolvimento também têm sido
fortemente relacionadas como causa primária do autismo (Ladd-Acosta et al., 2014).
Inclusive, algumas patologias que dividem sintomatologias semelhantes às
encontradas no autismo, como Síndrome de Rett, Síndrome do X Frágil e Síndrome
de Angelmann, podem ser desencadeadas por desregulação nos níveis de
compactação da cromatina.
A Síndrome de Rett, por exemplo, esteve incluída dentro das patologias
presentes no TEA, passando posteriormente a ser caracterizada como uma
síndrome genética, uma vez que todo o quadro clínico apresentado nos seus
pacientes é oriundo da mutação no gene que codifica a proteína MeCP2 (methyl-
INTRODUÇÃO
17
CpG-binding protein 2), que se liga ao DNA metilado, promovendo a compactação
da cromatina a partir da formação de um complexo com outras proteínas, ou
bloqueando diretamente os sítios para os fatores de transcrição (Amir et al., 1999). A
perda dessa proteína desencadeia diversas desordens, que vão desde atraso no
processo de maturação neuronal e na formação de sinapse, acompanhado de
redução no número de espinhas dendríticas e do tamanho do soma. Com isso, há
um comprometimento direto na formação e refinamento da circuitaria neuronal, com
consequente descontrole nos níveis de excitação e inibição nos pacientes afetados
com essa síndrome (Ip et al., 2018).
Esse é apenas um exemplo dentro de um amplo campo de pesquisas
envolvendo a influência da modulação epigenética em patologias do
desenvolvimento neural. É importante esclarecer que os casos acima citados são
modificações genéticas transmitidas para os descendentes e que envolvem
alteração na conformação da cromatina. Porém, as modificações epigenéticas
também podem ocorrer por influência ambiental, assunto abordado no tópico
seguinte.
1.2.2 – Transmissão Não-Genética e Fatores Ambientais
A exposição materna à fatores ambientais como infecções que desencadeiam
processo inflamatório associado à resposta imune materna (como rubéola, por
exemplo), a utilização de drogas, como talidomida, etanol e ácido valpróico (Arndt et
al., 2005) - principalmente no primeiro trimestre de gestação (Christensen et al.,
2013) e até própria poluição do ar, tem sido considerados como aumento do risco
em desenvolvimento do autismo. A exposição a pelo menos um desses fatores pode
desencadear mudanças da assinatura epigenética na linhagem germinativa, sendo
assim transmitida para as gerações seguintes. Além disso, a exposição a diferentes
hormônios, citocinas e microrganismos também tem sido associadas à transmissão
de fenótipos sociais e comportamentais (Toth, 2015).
Diversos estudos já demonstraram que ocorrência de estresse durante a
gravidez leva ao aumento nos níveis de glicocorticoides na mãe, podendo atingir o
INTRODUÇÃO
18
feto e desequilibrar o funcionamento do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) (Liu
et al., 1997) Essa desregulação pode levar a modificações comportamentais na
prole que vão desde aumento nos níveis de ansiedade, alteração nos padrões de
locomoção até prejuízos no aprendizado de memória espacial (revisado por Toth,
2015).
A indução de processo infeccioso, por sua vez, pode levar a aumento nos
níveos de citocinas e desencadear alterações comportamentais. Em experimentos
com fêmeas grávidas com inflamação sistêmica induzida por ácido
poliinosinico:policitidílico - poli(I:C), os filhotes descendentes apresentaram baixos
níveis de vocalização associados a redução de sociabilidade e aumento de
movimentos estereotipados (Meyer and Feldon, 2012). Esse perfil comportamental é
bastante semelhante aos desenvolvidos em pacientes com autismo (Malkova et al.,
2013). A indução da inflamação foi realizada próxima ao período de fechamento do
tubo neural e início da neurogênese em roedores, o que pode justificar o forte efeito
do tratamento na prole (Malkova et al., 2013).
1.2.3 - Cuidado Materno
Durante suas descrições iniciais sobre TEA na década de 40, Leo Kanner
também reportou o comportamento parental com seus filhos com autismo,
justificando que as mães tinham pouco ou nenhum contato afetivo com os filhos, e
mães (Kanner, 1948). A partir daí, a hipótese ―mãe geladeira” passou a ser utilizada
como uma possível explicação para a etiologia do autismo, e permaneceu forte por
muitas décadas até o surgimento do primeiro trabalho, já no final da década de 70,
caracterizando casos de autismo em gêmeos, mostrando uma forte base genética
nessa patologia (Folstein and Rutter, 1977). Com isso, a hipótese proposta por
Kanner foi entrando em desuso para dar espaço às teorias atuais que envolvem
alterações celulares e moleculares no desencadeamento da sintomatologia do
autismo.
Porém, apesar do termo ―mãe geladeira‖ não ser mais usada como no
passado, diversos estudos experimentais já demonstraram que a privação do
contato materno em roedores provoca prejuízos cognitivos nas proles estudadas,
INTRODUÇÃO
19
principalmente quando a separação ocorre nos primeiros dias pós-natais. O
contrário também é válido: animais criados por mães mais cuidadosas (maior
número de eventos de ―lambidas‖ e movimentos de autolimpeza (ou grooming)
apresentaram melhora no aprendizado, memória e comportamento social
(Champagne et al., 2003).
É interessante observar que o cuidado materno também pode ser transmitido
para geração seguinte através dos mecanismos epigenéticos (Liu et al., 1997). O
ambiente também exerce função essencial na transmissão desse padrão
comportamental. Fêmeas que durante a vida pós-natal foram expostas a pouco
cuidado materno, apresentam o mesmo perfil de cuidado com sua própria prole
(Caldji et al., 1998). Porém, se a mesma for exposta à um ambiente enriquecido logo
após o desmame, o efeito do cuidado parental consegue ser revertido e as mesmas
passam a apresentar altas taxas de ―lambidas‖ e autolimpeza com seus filhotes. Da
mesma forma, fêmeas que foram bem cuidadas durante sua vida pós-natal, após
ficarem em isolamento, passam a apresentar baixos níveis de cuidado com os seus
próprios filhotes, confirmando assim que o ambiente está influenciando no fenótipo
transmitido para a geração seguinte (Champagne and Meaney, 2007).
Os altos níveis de cuidado materno também se mostraram determinantes na
melhor resposta ao estresse pelos filhotes já na fase adulta, apresentando redução
nos níveis de corticosterona e ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) (Liu et al.,
1997), associado ao maior desempenho em atividade exploratória. Além do melhor
desempenho exploratório, o cuidado materno também promoveu modificações na
expressão gênica nos animais, aumentando a expressão do receptor de
glicocorticoide (GR), principalmente em CA1 e no giro denteado (Francis et al.,
1999).
O aumento na expressão de GR também tem sido associado à redução nos
níveis de metilação no promotor desse gene. Com isso, o fator de transcrição egr1
passa a se ligar mais facilmente na região promotora, aumentando os níveis de de
mRNA do GR. A infusão de um inibidor de histona deacetilase (tricostatina A - TSA)
foi capaz de reverter o efeito desencadeado pelo cuidado materno, modificando os
níveis de compactação da cromatina e reduzindo a taxa de transcrição do gene
(Weaver et al., 2004).
INTRODUÇÃO
20
1.3 – ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE
CRIANÇAS COM AUTISMO
A caracterização das alterações morfológica e celulares presentes no autismo
são de fundamental importância para esclarecer os mecanismos envolvidos com a
sintomatologia da doença e para desenvolvimento de terapias que sejam mais
eficazes no tratamento desse transtorno.
Os encéfalos desses pacientes possuem padrões morfológicos bem
caracterizados, com diversas áreas podendo sofrer alterações ao longo da vida,
como o córtex pré-frontal (CPF), cerebelo, amigdala e hipocampo (Casanova et al.,
2002a; Fatemi et al., 2012; Lai et al., 2012). As alterações nessas estruturas vão
desde alteração no volume da região estudada, aumento ou redução do número de
neurônios, entre outros (Schultz, 2005).
Os estudos neuropatológicos do cerebelo apresentam resultados ainda pouco
conclusivos. Análises post-mortem de indivíduos autistas utilizando coloração de
Nissl revelaram redução no tamanho das células de Purkinje (Fatemi et al., 2002a),
inclusive em análises estereológicas que descreveram uma redução de 25% no
número total desse subtipo neuronal (Wegiel et al., 2014). Porém, apesar dessa forte
evidência encontrada no TEA, existem pesquisas que fazem algumas ressalvas. Um
estudo estereológico realizado por Whitney e colaboradores, que marcaram as
células de Purkinje através de imunocitoquímica com o anticorpo para Calbindina-
D28k, revelou que a redução desse tipo neuronal no cerebelo não é observado de
maneira consistente nos pacientes com autismo. Das amostras avaliadas, metade
apresentou redução no número de células, mas de forma geral a diferença
encontrada entre os grupos não foi significativa (Whitney et al., 2008). Essa
discrepância nas informações pode ser justificada pela heterogeneidade encontrada
no transtorno, que desencadeiam quadros distintos dentro da mesma patologia.
1.3.1 - Alterações no córtex frontal
O córtex frontal, em particular a sua região medial, apresenta papel
fundamental na sintomatologia do TEA, uma vez que ele participa diretamente do no
processamento de informações cognitivas, sociais, de linguagem, assim como
INTRODUÇÃO
21
emocionais (Courchesne and Pierce, 2005; Amodio and Frith, 2006). Por isso, essa
é uma das áreas corticais visivelmente mais afetadas em pacientes com TEA.
A avaliação do volume dessa área cortical revela um aumento no encéfalo de
paciente com autismo, sendo o córtex pré-frontal (CPF) uma das principais áreas
afetadas. É observado um rápido crescimento logo no início da vida pós-natal,
acompanhado de uma segunda fase de crescimento no início da infância. Em alguns
casos, uma terceira fase pode ser observada em regiões cerebrais de pré-
adolescentes, caracterizada por um processo de degeneração neuronal e
consequente normalização do volume encefálico (Courchesne et al., 2007).
A análise de amostras post-mortem realizada por Courchesne e
colaboradores, por sua vez, revelaram um aumento de mais de 60% no número
global de neurônios no CPF, chegando a 79% de incremento na sua região
dorsolateral. Os autores sugerem que, uma vez que o processo de neurogênese
ocorre majoritariamente durante a fase embrionária, indivíduos com autismo podem
estar sujeitos a sofrer alterações em mecanismos reguladores do ciclo celular e
falhas nos mecanismos de apoptose, induzindo assim o aumento no número de
neurônios corticais presente nos pacientes com TEA (Courchesne et al., 2011).
O padrão de organização cortical também é outro parâmetro modificado no
TEA. Estudos iniciais realizados por Casanova e colaboradores observaram
alterações na distribuição celular na camada III do CPF dorsolateral desses
pacientes, acompanhado de um aumento na densidade neuronal de até 23%
quando comparados com a densidade celular em indivíduos controle (Casanova et
al., 2002b)
Avaliações através de hibridização in situ também revelaram a presença de
regiões de laminação cortical anormal no CPF e córtex temporal em crianças entre
2 e 15 anos diagnosticados com autismo (Stoner et al., 2014). Essas áreas foram
identificadas como regiões pontuais que apresentaram expressão reduzida em
marcadores utilizados para delimitar as camadas corticais (Figura 1). Foram usados
CALB1 para delimitar as camadas 2/3, RORB para camada 4, PCP4 para camada 5,
e CTGF, marcador específico para camada 6b. Foram encontradas alterações na
laminação nas camadas IV e V em 10 dos 11 casos estudados
INTRODUÇÃO
22
O padrão de desorganização laminar observado pode ser consequência de
defeitos de proliferação ou migração durante o desenvolvimento neuronal, assim
como também podem ser fruto de modificações epigenéticas que desencadeiem
expressão gênica diferenciada em progenitores neuronais possivelmente afetados
nesse distúrbio.
Figura 1: Alterações na citoarquitetura laminar cortical em pacientes com autismo, acompanhadas de ausência de expressão de marcadores das camadas 2/3, 4 e 5 (CALB1, RORB e PCP4). O marcador CTGF, específico para camada 6b não parece ser afetado (Adaptado de Stoner et al., 2014).
Além das alterações na laminação cortical e no número de neurônios, a
análise em cérebros humanos post-mortem de pacientes com TEA através da
coloração de Golgi revelaram um aumento na densidade de espinhas nos dendritos
apicais de neurônios piramidais da camada II do córtex frontal, temporal e parietal
(Hutsler and Zhang, 2010).
1.3.2 - Alterações nas sinapses e neurotransmissores na microcircuitaria
cortical
As propriedades de funcionamento dos microcircuitos cerebrais têm fornecido
a base conceitual para hipóteses acerca das disfunções observadas no autismo. Os
primeiros estudos buscaram propor a sintomatologia do autismo como consequência
da hipo-funcionalidade ou diminuição na atividade de estruturas como o CPF e
INTRODUÇÃO
23
amígdala, regiões diretamente envolvidas com comportamentos de interação social,
medo, funções executivas, linguagem e emoções (revisado por Markram et al.,
2007).
Entretanto, a atual teoria de que o autismo seria desencadeado por uma
hiperfunção cortical vem sendo reforçada por resultados obtidos em modelos
animais. Markram e colaboradores propuseram a hipótese de que a sintomatologia
do autismo é desencadeada pelo excesso de processamento e informação neuronal
nas circuitarias locais do cérebro, desencadeando hiper-funcionalidade em regiões
como o CPFm, córtex somatossensorial e amigdala. Uma possível causa para
ocorrência desse fenômeno poderia ser o aumento da plasticidade em circuitos
neurais, ou mesmo modificações na composição química das sinapses durante o
desenvolvimento e maturação da circuitaria neuronal, que desencadeariam uma
percepção sensorial exagerada nesses pacientes (Markram et al., 2007a).
Sabe-se que, à nível protéico, existe um desbalanço na expressão de
proteínas que participam da síntese de neurotransmissores, Estudos realizados por
Fatemi e colaboradores revelaram a presença de uma redução em cerca de 50%
nos níveis proteicos das enzimas GAD65 e GAD67 nos córtices parietal e cerebelar
de pacientes com autismo (Fatemi et al., 2002b). Outros grupos também relataram
uma diminuição nos níveis de glutamato descarboxilase em tecido cerebelar post-
mortem desses pacientes, indicando que uma possível alteração na produção de
GABA teria implicações na sintomatologia autista (Yip et al., 2007).
Em paralelo às disfunções na neurotransmissão GABAérgicas acima
descritas, Fatemi propôs em 2008 que a fisiopatologia encontradas no autismo
poderia ser fruto dos altos níveis séricos de glutamato presente nesses pacientes.
Esse aumento provavelmente estaria sendo desencadeados pela deficiência na
conversão do glutamato em GABA, assim como pelo aumento da gliose reativa, que
desencadearia uma maior biodisponibilidade do neurotransmissor para a célula
(Fatemi, 2008)
Além da participação do glutamato nos mecanismos de alteração de
excitabilidade neural no TEA, outros neurotransmissores também encontram-se
alterados. O aumento nos níveis plasmáticos de serotonina (5-HT), por exemplo, foi
INTRODUÇÃO
24
um dos primeiros biomarcadores descritos, e está presente em aproximadamente
1/3 dos pacientes com autismo (Anderson, 2015), A depleção de 5-HT subsequente
a redução na disponibilidade de triptofano leva a um agravamento no quadro autista,
sugerindo que o aumento dos níveis plasmáticos de 5-HT podem ser uma resposta
compensatória do organismo. Acompanhado desse aumento plasmáticos, análises
de tecidos post-mortem revelaram uma redução na expressão de receptores 5-HT1A
e 5-HT2A no córtex cingulado e giro fusiforme de pacientes com autismo (Oblak et
al., 2013). Recentemente, modelos animais de autismo induzido por ácido valpróico
(VPA) revelaram uma diminuição de 46% nos níveis de 5-HT no hipocampo de ratos
adultos, fato que não foi observado no córtex ou cerebelo (Dufour-Rainfray et al.,
2010).
1.4 – ALTERAÇÕES NO DESENVOLVIMENTO DO SNC E AUTISMO
O desenvolvimento inicial do sistema nervoso se dá a partir da sincronização
de diversas etapas. Os processos de proliferação celular, diferenciação neuronal e
formação de conexões sinápticas são eventos críticos modulados por influências
genéticas e ambientais, tais como a ativação de fatores de transcrição, sinalização
celular, modificação do padrão de expressão gênica, entre outros (De La Torre-
Ubieta et al., 2016) (Figura 2). Quaisquer modificações nessas etapas podem alterar
o desenvolvimento dos circuitos neurais, favorecendo o surgimento de patologias
neurológicas, como é o caso do autismo.
Figura 2: Linha temporal demonstrando as etapas do desenvolvimento cortical, desde a formação da placa cortical (PC) e zona subventricular (SVZ), ainda na fase embrionária, até a finalização e refinamento das conexões corticais já na vida pós natal. (Adaptado de De La Torre-Ubieta et al., 2016).
INTRODUÇÃO
25
Ao longo da última década, diversos genes tem se mostrado alterados em
pacientes com autismo. Entre eles, muitos implicados com o desenvolvimento do
SNC. Nesse grupo estão incluídos genes que codificam proteínas envolvidas em
processos de especificação neuronal (T-box brain 1, TBR1), proliferação,
diferenciação, regulação de cromatina (Chromodomain-helicase-DNA-binding protein
8, CHD8), adesão celular (neuroligin-3, NLG-3 e neurexin-1, NRX-1) e morfogênese
de espinhas dendríticas (SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3, Shank3)
(Durand et al., 2007, 2012; Südhof, 2008; Glessner et al., 2009; Willsey et al., 2013;
Platt et al., 2017). Apesar deste importante componente genético, nenhum gene
específico foi classificado como suficiente para desencadear o transtorno. De fato,
apenas 20% dos casos de TEA são oriundos de alguma alteração genética
conhecida (mutações, variações no número de cópias, duplicações/deleções
cromossômicas) (Abrahams and Geschwind, 2008), enquanto o restante parece
estar associado às alterações ambientais e/ou epigenéticas durante o
desenvolvimento neural (Lyall et al., 2017).
Nos casos de TEA com forte associação genética, são comuns as mutações
em genes que codificam proteínas associadas com a morfogênese das espinhas
dendríticas, estruturas altamente dinâmicas aonde a maior parte da comunicação
sináptica entre neurônios acontece (Nimchinsky et al., 2002). Proteínas de adesão
celular envolvidas na estabilização da conexão entre neurônios pré- e pós-
sinápticos, como a NLG-3 e NRX-1, estão envolvidas com o desenvolvimento de
alterações neurais no autismo (Soderstrom and Giros, 2003; Gauthier et al., 2011).
Mutações nos genes codificadores das neuroliguinas levam à um aumento no
número de sinapses excitatórias em neurônios hipocampais, enquanto reduções de
NRX-1, seu ligante pré-sináptico, diminui a extensão dos dendritos e o número total
de espinhas dendríticas no córtex (Südhof, 2008).
Durand e colaboradores demonstraram que mutações no gene Shank3,
envolvido com a regulação da organização estrutural das espinhas dendríticas,
podem desencadear desordens de comunicação social e linguagem, o que torna
esse gene um forte candidato para o desenvolvimento de modelos animais de
autismo (Durand et al., 2007). Além disso, mutações em Shank3 podem
desencadear redução da transmissão sináptica em neurônios já maduros,
INTRODUÇÃO
26
acompanhado de ocorrência de inibição da motilidade do cone de crescimento,
função que está diretamente relacionada com a proteína codificada pelo gene em
questão (Durand et al., 2012).
Além das sinapses, alterações na mielina também estão associadas ao
autismo (Pierce and Courchesne, 2001; Zikopoulos and Barbas, 2010). A partir de
estudos desenvolvidos em um modelo animal de autismo, em recente trabalho
desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, demonstramos a redução na expressão
dos genes Mobp (Myelin-Associated Oligodendrocyte Basic Protein) e Mag (Myelin-
associated glycoprotein) - envolvidos no processo de mielinização - no córtex frontal
desses animais ainda em idade pós-natal (P15). Essa redução foi acompanhada de
uma discreta redução na densidade de mielina apenas no córtex cingulado em
animais adultos (P60). As demais áreas analisadas não revelaram diferença na
quantificação (Araujo-Sousa, 2017).
Além das alterações sinápticas encontradas em modelos animais do autismo,
outras modificações na organização geral dos circuitos, tais como alteração da
distribuição neuronal, também tem sido associadas ao desenvolvimento do TEA
(Figura 3). A seguir, discutiremos em maiores detalhes o possível papel dos
interneurônios GABAérgicos neste transtorno.
Figura 3: Exposição a fatores ambientais ou alterações na expressão gênica durante o período de neurogênese podem afetar a maturação de redes neurais e a organização sináptica cortical. Em conjunto, estes eventos podem acarretar em desenvolvimento motor e comportamentos característicos de indivíduos com autismo. (Adaptado de Pardo et al., 2007)
INTRODUÇÃO
27
1.4.1 –Papel dos Interneurônios na Circuitaria Neuronal
Os interneurônios GABAérgicos exercem um papel essencial no equilíbrio
entre as sinapses excitatórias e inibitórias, modulando a atividade neuronal através
de mecanismos de inibição lateral, impedindo assim uma super-excitabilidade na
circuitaria neuronal (Kepecs and Fishell, 2014). A população neuronal GABAérgica
se encontra distribuída ao longo de praticamente todas as camadas corticais,
estabelecendo sinapses específicas de acordo com a sua subclasse, podendo ser
agrupados a partir de características morfológicas, tipo de arborização axonal,
propriedades eletrofisiológicas intrínsecas, além da expressão de proteínas
ligadoras de Ca2+ ou outros marcadores moleculares (Ascoli et al., 2008).
Os progenitores de interneurônios GABAérgicos do córtex cerebral possuem
origem telencefálica, mais especificamente nas eminências ganglionares medial
(MGE), lateral (LGE), caudal (CGE), além da área pré-óptica (POA) do telencéfalo
ventral (Kepecs and Fishell, 2014; Brandão and Romcy-Pereira, 2015). Cada região
dessas possui células progenitoras neurais caracterizadas pela expressão de
diferentes fatores de transcrição, contribuindo para gerar as diversas sub-classes de
interneurônios GABAérgicos encontrados no córtex cerebral adulto (Figura 4).
Progenitores localizados na MGE, por exemplo, expressam os fatores de
transcrição Nkx2.1, Dlx5/6, Lhx6, entre outros, e originam aproximadamente 60% de
todos os neurônios inibitórios corticais, sendo esses em sua grande maioria
interneurônios que expressam as proteínas ligadoras de Ca2+ parvalbumina (PV),
somatostatina (SST) e calretinina (CR) (Kepecs and Fishell, 2014; Tremblay et al.,
2016). Já os progenitores presentes na CGE expressam os fatores de transcrição
Nkx2.1 e Gsh2, entre outros, e originam cerca de 30% dos interneurônios corticais,
entre os quais neurônios caracterizados pela expressão de reelina, VIP
(Vasointestine Peptide) ou NPY (Neuropeptide Y). Os interneurônios derivados da
POA complementam a formação da população cortical GABAérgica, originando uma
INTRODUÇÃO
28
pequena parcela dos subtipos neuronais predominantemente gerados na MGE e
CGE (Kepecs and Fishell, 2014; Brandão and Romcy-Pereira, 2015).
Figura 4: Esquema do telencéfalo de roedores em desenvolvimento mostrando a localização dos progenitores (indicados em verde, vermelho, amarelo e azul) responsáveis pela geração dos diferentes subtipos de interneurônios GABAérgicos do córtex cerebral. Fatores de transcrição associados aos diferentes tipos de progenitores são indicados nas mesmas cores, assim como os subtipos neuronais. LGE: lateral ganglionic eminence; dMGE: dorsal medial ganglionic eminence; vMGE: ventral medial ganglionic eminence; CGE: caudal ganglionic eminence; POA: pre-optic área; PV: parvalbumin; RLN: reelin; CR: calretinin; SST: somatostatin; VIP: vasointestinal active peptide; NPY: neuropeptide Y; 5-HT3R: serotonin receptor type 3 (Brandão & Romcy-Pereira, 2015).
Apesar desta correlação entre a expressão de determinados fatores de
transcrição nas células progenitoras e seu potencial para gerar subclasses de
interneurônios GABAérgicos, é importante salientar a importância de fatores
extrínsecos presentes no ambiente na determinação fenotípica das células neurais.
De fato, diversos fatores ambientais são capazes de modular a potência dos
INTRODUÇÃO
29
progenitores neurais no telencéfalo ventral ou alterar a especificação fenotípica dos
interneurônios GABAérgicos pós-mitóticos (Brandão and Romcy-Pereira, 2015).
Desta forma, o fenótipo final dos interneurônios corticais é o resultado de uma
intricada relação entre fatores extra e intracelulares atuando desde os progenitores
no telencéfalo ventral até os neurônios em diferenciação no córtex cerebral,
passando pelos neuroblastos em migração para esta região (Wamsley and Fishell,
2017).
A migração dos interneurônios GABAérgicos, diferentemente dos neurônios
piramidais corticais, ocorre tangencialmente em direção ao córtex (Marín and
Rubenstein, 2001). Estudos realizados por Wichterle e colaboradores (2001)
mapearam as vias migratórias dos progenitores presentes na MGE e LGE a partir de
embriões com 13,5 dias, e demonstraram que, enquanto as células da LGE
ocuparam em sua grande maioria neurônios de projeção para o estriado, núcleo
accumbens e bulbo olfatório, os progenitores derivados da MGE migram
tangencialmente para o neocórtex através da zona marginal (MZ) e zona
subventricular (SVZ) (Wichterle et al., 2001).
Estas duas rotas migratórias parecem influenciar na decisão fenotípica dos
interneurônios GABAérgicos (Lim et al., 2018), Células Martinotti que expressam
somatostatina (SST+) que possuem axônios distribuídos ao longo das camadas do
córtex, migram preferencialmente através da zona marginal. Deleção de Mafb, um
gene particularmente enriquecido na população de células Martinotti, reduz a fração
de neurônios que migram pela MZ e, por consequência, diminui o número de células
de Martinotti com arborização axonal na camada I, reduz a inibição dos neurônios
piramidais das camadas II/III, e interfere na resposta neuronal à estímulos visuais
(Lim L et al., 2018),
A distribuição e maturação dos subtipos neuronais também podem ser
modificados por alterações epigenéticas. Enzimas, como a DNA metil-transferase I
(DNMT1), uma enzima que calaliza a transferência de grupos metil para regiões
CpG do DNA, podem promover modificações epigenéticas e têm participação direta
na especificação neuronal, uma vez que o aumento/diminuição nos níveis de
compactação da cromatina afetarão diretamente os fatores de transcrição que
participam na diferenciação neuronal até os primeiros dias pós-natais (Pensold and
INTRODUÇÃO
30
Zimmer, 2018). Processos inflamatórios desencadeados por aumento do estresse
oxidativo também podem promover modificação na densidade de interneurônios
PV+, com perda desse tipo neuronal nas regiões de CA1 e CA3 do hipocampo,
acompanhado de redução na densidade de PSD-95 (Ji et al., 2015).
O desenvolvimento dos fenótipos neuronais específicos pode ser induzido
também pela atividade elétrica. Neurônios derivados da CGE, por exemplo,
requerem que ocorra despolarização para que, a partir desse evento, as células
passem a expressar seus marcadores (nesse caso, CR e reelina). Na ausência
desse fenômeno, podem ocorrer erros no posicionamento, localização e integração
desses neurônios à circuitaria cortical (De Marco García et al., 2011).
Uma vez que os interneurônios passem pelo período de migração e estejam
devidamente posicionados nas camadas corticais, ocorre o ajuste e refinamento da
circuitaria. Esse refinamento ocorre principalmente a partir do processo de morte
celular programada (Bartolini et al., 2013). Após atingirem seu pico em P5, cerca de
40% dos interneurônios corticais em desenvolvimento são eliminados entre P7 e
P11, aproximadamente 18 dias após o nascimento dos progenitores, ainda no
período embrionário, a partir de mecanismos de apoptose dependente do complexo
Bax-Bcl2 (Southwell et al., 2012). Os níveis de atividade neuronal dentro da
circuitaria cortical, assim como os inputs sinápticos excitatórios são fatores que
também se mostram capazes de modular essa poda dos interneurônios no início da
vida (Wong et al., 2018). Vale salientar que o mecanismo de refinamento é uma
importante ferramenta no equilíbrio dos níveis de excitação e inibição cortical,
contribuindo para minimizar possíveis desbalanços da circuitaria neuronal,
característica presente em diversas desordens psiquiátricas, como pode ser
observado no autismo (Markram et al., 2007b).
Dentro das diversas subclasses de neurônios inibitórios, as células PV+
corticais compreendem até 40%, dependendo da região cortical, e desempenham
um papel fundamental no controle da excitabilidade e geração de padrões
oscilatórios corticais (Gonchar, 2008; Sohal et al., 2009). Uma importante
característica destes neurônios é que seu campo de projeção axonal está
concentrado em torno do corpo celular e dendritos proximais dos neurônios-alvo
(células em cesto - ou basket cells) ou do segmento inicial do axônio (células em
INTRODUÇÃO
31
candelabro – ou chandelier cells), promovendo forte ação inibitória (Figura 5). Além
disso, os neurônios PV+ são eletrofisiologicamente caracterizados como células de
disparo rápido e de baixa taxa de habituação (“fast-spiking non-accomodating”). Já
existem trabalhos utilizando modelos animais de TEA os autores nos quais é
possível observar uma redução desse tipo celular no córtex somatossensorial
(Gogolla et al., 2009).
Durante a última década, alterações na densidade e na distribuição dos
interneurônios ao longo das regiões corticais foram descritas em indivíduos com
diferentes desordens neuropsiquiátricas, tais como esquizofrenia, depressão e
autismo (Marín, 2012). A partir destas observações, sugeriu-se que alterações na
produção, diferenciação ou sobrevivência de interneurônios GABAérgicos poderiam
contribuir para gerar circuitos corticais hiperexcitáveis e, desta forma, influenciar no
surgimento de desordens neuropsiquiátricas (Figura 5).
Figura 5: Esquema ilustrativo representando os campos de projeção axonal dos neurônios GABAérgicos que expressam PV sobre neurônios piramidais do córtex, acompanhado dos marcos anatômicos encontrados no autismo. Padrões de conectividade local das células em cesto (basket cells) e células em candelabro (chandelier cells). Adaptado de Marín, 2012).
INTRODUÇÃO
32
As alterações na regulação desse balanço excitação-inibição no autismo
podem justificar a alta correlação entre a patologia e a epilepsia. Estudos de
comorbidade indicam que de 5 a 40% dos pacientes com autismo podem
desenvolver algum quadro epiléptico no decorrer da vida (Turk et al., 2009),
podendo chegar a até 60% em casos de autismo mais severos. Em geral o
aparecimento de crises epilépticas se agrupa mais comumente em dois momentos:
durante infância (antes dos 5 anos) e no período de adolescência (depois dos 10
anos) (Tuchman and Cuccaro, 2011).
Como será discutido a seguir, diversos modelos animais utilizados para o
estudo dos mecanismos do autismo encontram evidências de alterações nos
números de neurônios excitatórios e inibitórios, assim como na atividade elétrica e
sináptica destas células. No entanto, uma caracterização sistemática dos circuitos
neuronais em diferentes modelos animais do TEA e o estabelecimento de relações
causais claras entre alterações histológicas e comportamentais permanecem
objetivos distantes.
1.5 - MODELOS EXPERIMENTAIS DE AUTISMO
Nas últimas décadas, vários modelos experimentais vem sendo propostos
para caracterizar as bases neurofisiológicas do autismo. Entre os principais estão (1)
a utilização de animais knockout para genes que codificam proteínas responsáveis
pela regulação da transcrição (Fmr1), moléculas de adesão sináptica (CNTNAP2,
neurexina-1, neuroligina-3), proteínas de ancoragem sináptica (Shank3), entre
outros; (2) os modelos baseados em lesões de estruturas límbicas como a amígdala
e o hipocampo ventral, e (3) os modelos baseados na exposição pré-natal a agentes
tóxicos, como o ácido valpróico (VPA), álcool e talidomida (Klauck and Poustka,
2006).
Entre os modelos genéticos, o camundongo knockout CNTNAP2 tem sido
amplamente utilizado no estudo do autismo. O gene CNTNAP2 é considerado um
dos genes de susceptibilidade ao desenvolvimento da patologia em humanos, sendo
responsável por codificar a proteína pertencente à família das neurexinas, e que
INTRODUÇÃO
33
está envolvida nas interações entre neurônio e glia. Estes animais apresentam
déficit de interação social, assim como comportamento repetitivo e hiperatividade
Além disso, os animais desse modelo possuem comprometimento no processo de
migração neuronal, assim como redução no número de interneurônios GABAérgicos
expressando GAD1, PV, NPY ou calbindina (Peñagarikano et al., 2011).
Shank3, proteína de densidade pós-sináptica, possui papel essencial no
recrutamento de vesículas para funcionamento das sinapses inibitórias e excitatórias
(Pardo and Eberhart, 2007b). Com isso, animais com perda de função do gene
Shank3 apresentam desbalanço na circuitaria neuronal por redução na amplitude de
correntes pós-sinápticas, associados a um déficit de interação social (Bozdagi et al.,
2010).
Apesar de bastante eficaz na demonstração do fenótipo descrito na patologia
do TEA, esses modelos são limitados, uma vez que não se trata de uma doença
monogenética, assim como há uma enorme cascata de genes envolvidos e que
ainda não foram completamente descritos na literatura.
Modelos animais induzidos por lesões também apresentam sua importância
no estudo do autismo. Lesões bilaterais na amígdala de primatas não-humanos têm
mostrado o aparecimento de traços comportamentais ―tipo-autismo nestes animais,
que passam a apresentar deficiências de interação social, falta de expressão facial,
além de ausência de comportamento emocional, agressividade e movimentos
repetitivos (Sweeten et al., 2002). Em experimentos com roedores, Wolternick e
colaboradores mostraram que lesões do núcleo basolateral e central da amígdala
induzidas no 7º dia pós-natal também foram capazes de desencadear distúrbios
comportamentais nos animais semelhantes aos observados em pacientes com
autismo (Wolterink et al., 2001). Da mesma forma que os modelos genéticos, os
modelos por lesão apresentam uma grande limitação no estudo do autismo, uma vez
que diferentes regiões são afetadas, como descrito anteriormente nesse texto.
1.5.1 – Modelo de Exposição Pré-Natal ao Ácido Valpróico
O modelo por exposição pré-natal a VPA em roedores vem, por sua vez,
buscar aumentar a abrangência dos efeitos desencadeados pela droga nos
INTRODUÇÃO
34
roedores. É um modelo que apresenta validade de face, pois reproduz aspectos
comportamentais e histopatológicos característicos do quadro humano de autismo.
Neste modelo podemos observar alterações histológicas no tronco encefálico e
cerebelo semelhantes às encontradas em tecidos post-mortem de pacientes com
autismo (Rodier et al., 1996). Também se observa déficits em comportamentos
sociais e de resposta sensorial que reproduzem sintomas com autismo (Schneider
and Przewłocki, 2005; Brandão, 2013). Os períodos de sensibilidade à droga e os
processos de má-formação durante a embriogênese, incluindo principalmente
alterações no tubo neural, levaram à hipótese de que o autismo possa refletir um
distúrbio durante o desenvolvimento embrionário. Atualmente, esta hipótese também
inclui a exposição a agentes patogênicos (p.ex. vírus) durante a gestação com
consequente resposta imune materna ao patógeno. Uma vez que neste modelo o
VPA é injetado na fêmea grávida durante o período de fechamento do tubo neural
(E12), este fármaco pode promover alterações sistêmicas nos animais ainda durante
esta fase. Desta forma, as características observadas neste modelo podem decorrer
da interação entre a exposição à droga e o background genético dos animais.
O VPA é uma droga amplamente utilizada na clínica para o tratamento de
epilepsia desde a década de 60 (Rosenberg, 2007), se mostrando eficiente no
controle de crises convulsivas em adultos e especialmente na infância. Além disso,
ele também é utilizado no tratamento de enxaqueca e transtorno bipolar (Nalivaeva
et al., 2009).
Os primeiros relatos sobre o mecanismo de ação do VPA tratam o fármaco
como responsável por aumentar a neurotransmissão GABAérgica a partir da inibição
da enzima responsável por degradar o GABA. Além disso, existe um efeito direto no
bloqueio de canais de Na+ voltagem-dependente, que por consequência
desencadeia uma supressão nas taxas de disparo nos neurônios de alta frequência,
levando todo o sistema a reduzir a atividade elétrica (Rosenberg, 2007).
Além do efeito na atividade elétrica, o VPA também pode atuar alterando
expressão gênica através de controle epigenético. O fármaco pertence à classe de
inibidores da enzima histona desacetilase (HDAC) (Figura 6). A regulação da
acetilação de lisinas na porção C-terminal das moléculas de histonas presentes nos
nucleossomos altera o estado de compactação e a estrutura da cromatina
INTRODUÇÃO
35
(Kazantsev and Thompson, 2008). O aumento da acetilação de histonas produz
descompactação do DNA, aumentando o acesso da RNA polimerase II e proteínas
acessórias necessárias à transcrição. O efeito é observado através do aumento da
expressão de genes comumente silenciados (Göttlicher et al., 2001).
Figura 6: Mecanismo de compactação e relaxamento da cromatina e sítio de ação do VPA sobre o controle da transcrição gênica. (A) Reações de acetilação (Ac) e desacetilação, mediadas por histonas aceitlases (HACs) e desacetilases (HDACs), modulam a conformação da cromatina para ocorrência da transcrição gênica. (B) Ao bloquear a desacetilação, os inibidores de HDAC (VPA, por exemplo), tornam o material genético mais acessível e promovem um aumento nos níveis de transcrição que estão ocorrendo na célula. (Adaptado de Kazantsev & Thompson (2008).
Assim, o equilíbrio entre as funções das enzimas HDAC e histona acetilase
(HAC), além das DNA metil-transferases, que controlam o grau reestruturação da
cromatina e o nível de transcrição de regiões cromossômicas específicas, fica
comprometido. A exposição de uma droga com alto poder de regulação da
expressão gênica, principalmente durante o período de neurogênese, pode levar
então a uma modificação nos padrões de expressão de genes relacionados ao
desenvolvimento. A inibição das HDACs induzidas pelo VPA também tem se
mostrado importante na sobrevivência de neurônios corticais, aumentando a
viabilidade dessas células in vitro (Jeong et al., 2003).
Apesar da sua eficácia terapêutica, o VPA possui também um forte efeito
teratogênico quando administrado em altas doses durante um período crítico da
gestação (Robert and Guibaud, 1982). A utilização deste fármaco durante o primeiro
INTRODUÇÃO
36
trimestre levou ao nascimento de muitas crianças com problemas cognitivos e com
alguns tipos de má formações, como baixo crescimento, microcefalia, além de
problemas cardíacos. Esse conjunto de sinais e sintomas ficou conhecido como
Síndrome do Valproato Fetal (Ardinger et al., 1988). Porém, em estudo preliminar,
Christianson e colaboradores observaram que algumas dessas crianças
apresentavam diagnóstico para o autismo (Christianson et al., 1994; Williams et al.,
2001), o que levou à suspensão da utilização desse fármaco durante a gravidez.
Com base nesses achados clínicos, Rodier e colaboradores propuseram um
modelo animal para estudo das alterações de espectro autista, no qual é realizada a
injeção de VPA em fêmeas grávidas, em dose única, durante o período de
fechamento do tubo neural (E12) dos embriões (Rodier et al., 1996). Os autores
observaram que, na dose de 350mg/kg de VPA, os animais apresentaram uma série
de efeitos morfológicos e comportamentais que se assemelham aos observados nos
pacientes com autismo, como grande redução no número de células nos núcleos
cerebelares e na oliva superior, acompanhado de um encurtamento do tronco
encefálico entre o corpo trapezóide e a oliva inferior (Rodier et al., 1996). Ao
contrário de drogas, como a talidomida, que que não reproduzem as mesmas lesões
em humanos e roedores, o VPA tem mostrado grande reprodutibilidade,
demonstrando resultados semelhante aos encontrados em pacientes com TEA,
sendo por isso um modelo bastante validado na literatura para a compreensão da
patologia. Foram relatadas também alterações nos núcleos dos nervos cranianos
semelhantes às observadas em amostras post-mortem desses pacientes, assim
como diminuição no número de células de Purkinje (Rodier et al., 1996).
Além dos marcos anatômicos clássicos acima descritos, o VPA também tem
se mostrado teratogênico em outras espécies, como a Xenopus laevis. Estudos
realizados por Sequerra e colaboradores demonstraram que a exposição à droga
durante o período de fechamento do tubo neural, na concentração de 1mM, levam a
alterações na via de sinalização mediadas por glutamato, com consequente perda
de função dos receptores NMDA. Com isso, ocorre um aumento na taxa de
proliferação celular, modifica o processo de migração celular e, consequentemente,
desencadeia o aparecimento de defeitos no fechamento do tubo neural em
praticamente todos os embriões expostos à droga (Sequerra et al., 2018).
INTRODUÇÃO
37
Em roedores, o VPA vem sendo amplamente utilizado para o estudo do
autismo. Na década passada, Schneider e colaboradores realizaram uma bateria de
testes comportamentais para avaliar o desenvolvimento pós-natal de animais
expostos ao VPA durante o período embrionário em comparação com animais
controle. Seus resultados revelam que os animais VPA apresentam alterações no
desenvolvimento pós-natal, seguido de menor sensibilidade à dor, menor atividade
exploratória, hiperatividade locomotora e comportamento repetitivo. Além disso, os
animais apresentaram maior aversão social medida pela diminuição no tempo de
interação com outros animais. Esses resultados demonstram que o modelo animal
de VPA apresenta características comportamentais que se assemelham aos
fenótipos observados em humanos (Schneider and Przewłocki, 2005).
Também já existem na literatura dados que demonstram que as alterações
comportamentais encontradas nos animais VPA estão associadas a distúrbios em
circuitos neurais específicos: animais VPA adultos apresentaram memórias
aversivas amplificadas e bloqueio do processamento cortical de informações visuais
(Rinaldi et al., 2008; Pohl-Guimaraes et al., 2011), enquanto a eletrofisiologia em
fatias cerebrais de animais VPA revelaram um aumento da neurotransmissão
mediada por receptores NMDA, hiper-conectividade e aumento de plasticidade no
CPFm (Rinaldi et al., 2007, 2008; Markram and Markram, 2010). A análise da
expressão de proteínas no hipocampo de ratos expostos ao VPA durante o período
pré-natal revelou que há um aumento nos níveis de recaptação de glutamato pelos
astrócitos em animais VPA adultos (Bristot Silvestrin et al., 2013), fatores que em
conjunto ajudam a compreender a neuropatologia do autismo.
Alterações na morfologia e distribuição celular também vem sendo descritas,
assim como redução no número de espinhas dendríticas no CPFm, acompanhado
também do menor número de células identificadas a partir da coloração de Nissl
(Hara et al., 2012) e redução dos interneurônios PV+ nos córtices parietal e occipital
(Gogolla et al., 2009). A distribuição de interneurônios PV+, por sua vez, não se
mostrou alterada no córtex auditivo primário desses animais, apesar de ser
encontrada uma maior resposta neuronal à estímulos de alta frequência,
acompanhado de uma clara modificação no mapa tonotópico dessa região (Anomal
et al., 2015)
INTRODUÇÃO
38
Nós demonstramos em trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso
laboratório que ratos F1 nascidos de fêmeas expostas ao VPA (F1VPA), em idade
pré-pubere, apresentam comportamentos ―tipo-autista‖, semelhante aos previamente
descritos na literatura, como hiperlocomoção, estereotipia prolongada e redução da
interação social. Associado à essas modificações comportamentais, a análise
histológica revelou uma redução no número de interneurônios parvalbumina (PV)+
no córtex pré-frontal medial (CPFm) desses animais F1VPA (Brandão, 2013).
Estudos realizados pelo nosso grupo também demonstraram alteração na
atividade eletrofisiológica no córtex somatosensirial em resposta à estímulos de alta
frequência, além de detecção de atividade epileptiforme, em animais expostos ao
VPA durante o período embrionário (Maciel, 2017).
Apesar da grande quantidade de estudos na área, os mecanismos precisos
através dos quais o VPA afeta o desenvolvimento do SNC e contribui para as
alterações comportamentais observadas em animais expostos a esta droga
permanecem desconhecidos. Uma vez que o VPA promove modificação no padrão
de compactação da cromatina ainda no período embrionário, uma possibilidade é
que a exposição ao fármaco promova alterações epigenéticas que seriam
responsáveis por modificar o padrão normal de desenvolvimento neural. Estas
alterações epigenéticas, por sua vez, poderiam ser herdadas por gerações futuras,
levando a modificações comportamentais independentes de novas exposições ao
VPA (Choi et al., 2016).
Para avaliar estas possibilidades, utilizamos o modelo de administração de
VPA em ratas grávidas para avaliar o efeito desta droga sobre a distribuição de
neurônios no CPF. Em especial, avaliamos a população de interneurônios
GABAérgicos PV+ na região do CPFm. Em paralelo, realizamos testes
comportamentais como forma de investigar a possibilidade de transmissão
hereditária dos achados comportamentais e histológicos encontrados no modelo
VPA, independentemente de nova exposição ao fármaco. VPA capazes de produzir
as mesmas alterações histológicas e comportamentais correlacionamos para buscar
entender os possíveis mecanismos celulares responsáveis pela doença.
39
2. Justificativa
JUSTIFICATIVA
40
O autismo se enquadra em um grupo de desordens que apresenta elevada
prevalência na população mundial. Porém, apesar da grande atenção que o tema
recebe na atualidade, as pesquisas que vem sendo desenvolvidas ainda não
identificaram todos os fatores biológicos capazes de interferir com o
desenvolvimento neural e desencadear as disfunções de circuitos neurais
responsáveis pelos sinais e sintomas presentes no TEA. Uma vez que estes
transtornos possuem elevada herdabilidade, e que genes responsáveis pelo controle
epigenético tem se mostrado envolvidos na patologia (como é o caso dos genes
MeCP2, UBE3A, FMR1 e CHD8) (Tordjman et al., 2014), existe uma forte corrente
sugerindo que elementos de herança epigenética podem ser responsáveis por
traços comportamentais autistas.
Dados prévios obtidos em nosso laboratório caracterizaram o modelo animal
de autismo induzido pelo VPA em ratos (Brandão et al., 2013). Os resultados obtidos
revelaram alterações no desenvolvimento pós-natal de ratos nascidos de fêmeas
tratadas com VPA no dia gestacional E12, denominados F1VPA. Além disso, testes
comportamentais em animais pré-puberes revelaram hiperlocomoção, estereotipia
prolongada e redução da interação social em animais F1VPA quando comparados
com animais controle. Histologicamente, foi observada uma redução significativa no
número de interneurônios parvalbumina (PV)+ no córtex pré-frontal medial (CPFm)
dos animais F1VPA quando comparados aos controles.
3. Objetivos
OBJETIVOS
42
3.1- OBJETIVO GERAL
Avaliar a ocorrência de herança comportamental nos animais descendentes
de pais expostos ao VPA (grupo F2) durante o período pré-natal em tarefas
comportamentais de caráter exploratório, cognitivo e social em ratos pré-puberes
(P30-35). Caracterizar também a organização cortical neuronal no córtex pré-frontal
no modelo animal de autismo induzido por ácido valpróico (F1VPA) durante a
gestação de ratas Wistar.
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar o desenvolvimento pós-natal de filhotes de pais F1VPA (prole F2),
através da curva de peso e idade para abertura dos olhos;
2. Avaliar e comparar o desempenho comportamental de animais F2 com
animais controle (F1VPA e CTL) nos seguintes domínios: locomoção, exploração,
estereotipias e interação social;
3. Avaliar o desenvolvimento pós-natal e o desempenho comportamental nos
domínios descritos acima em animais F2 criados por mães adotivas controle através
de experimento de adoção cruzada);
4. Caracterizar a distribuição da população neuronal e GABAérgica no CPFm
em animais controle, VPA e F2.
43
4. Materiais e Métodos
MATERIAIS E MÉTODOS
44
4.1- MODELO ANIMAL DE AUTISMO
Para o modelo de autismo utilizado nesse trabalho, foram manipulados ratos
Wistar mantidos no biotério do Instituto do Cérebro da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN). Fêmeas com ciclos de fertilidade controlados, acasalaram
com machos não relacionados consanguineamente durante o período noturno (ou
período de atividade). Na manhã seguinte ao acasalamento, a fecundação e a
determinação do primeiro dia gestacional (E0) foi confirmada pela combinação de
pelo menos um dos seguintes critérios: presença do tampão vaginal, presença de
espermatozóides na lavagem vaginal e a estabilização do ciclo estral em diestro na
semana que seguir ao acasalamento (Figura 7). Passados 12 dias da fertilização
(E12), correspondendo ao final do fechamento do tubo neural nestes embriões, as
fêmeas receberam uma injeção intraperitoneal de valproato de sódio (VPA, 500
mg/kg, i.p.; Sigma) dissolvido em solução salina na concentração de 250 mg/mL. A
dosagem utilizada de 500 mg/mL já é bem estabelecida na literatura por atingir
níveis séricos máximos da ordem de 900 g/mL em menos de 1 h, com meia-vida de
eliminação plasmática de 2.3 h (Binkerd et al., 1998). Os animais controle receberam
uma injeção de salina também no dia gestacional E12.
Figura 7: Presença de espermatozoides (seta) em esfregaço vaginal confirmando o dia gestacional
E0 em uma rata F1VPA.
MATERIAIS E MÉTODOS
45
Para geração do modelo F2, foram utilizados animais (machos e fêmeas)
previamente expostos ao VPA – agora denominados F1VPA - durante o período
embrionário. Após atingirem a maturidade sexual, fêmeas F1VPA com ciclos de
fertilidade controlados, acasalaram com machos F1VPA, não relacionados
consanguineamente. A fecundação foi confirmada conforme descrito previamente
para os grupos anteriores.
Nesses grupos experimentais, a prole permaneceu com a mãe por 21 dias
durante a amamentação. Após este período, os animais foram separados de suas
mães, e acomodados em grupos de 4-6 animais de cada sexo por caixa. Todos os
animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno (414 x 344 x 168 mm3) com
raspa de madeira no assoalho numa sala com temperatura (23 2 °C), umidade e
ciclo de claro-escuro (de 12-12h; ligado às 6:00h e desligado às 18:00h) controlados
com livre acesso à comida e água. Todos os procedimentos experimentais
realizados com os animais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no
Uso de Animais em Pesquisa (CEUA) do Centro de Biociências da UFRN.
4.2 – MODELO ANIMAL F2 POR ADOÇÃO CRUZADA
Para realização da adoção cruzada para a prole F2, fêmeas controle e VPA
tiveram inicialmente o ciclo estral pareado para posteriormente acasalarem com
seus respectivos machos (Fêmea controle x macho controle, e fêmea F1VPA x macho
F1VPA), de forma que a idade gestacional dos filhotes fosse o mais próximo possível
entre os grupos experimentais. Confirmada a gestação, as fêmeas permaneceram
isoladas em suas gaiolas. Considerando o nascimento como dia pós natal P0, no dia
seguinte (P1), as fêmeas tiveram seus filhotes substituídos: as ninhadas foram
reduzidas para 8 filhotes, dos quais 4 foram previamente higienizados com salina e
gaze antes de serem acomodados na gaiola da mãe adotiva. Os outro 4 filhotes
foram transferidos de gaiola sem higienização. Toda a caixa estava forrada com
maravalha e papel toalha limpos.
Foram formados 4 grupos experimentais: CmC (filhotes controle criados por
mãe controle); CmV (filhotes controle criados por mãe F1VPA); VmV (filhotes F2
criados por mãe F1VPA) e VmC (filhotes F2 criados por mãe controle) (Figura 8).
MATERIAIS E MÉTODOS
46
Figura 8: Esquema representativo da formação dos grupos experimentais da adoção cruzada (Adaptado de Corneluis Gross & Rene Hen, 2004)
Todos os filhotes, independente do grupo experimental, foram separados das
mães após os 21 dias de desmame ficaram mantidos nas condições padrão,
conforme descrito no tópico anterior.
4.3 – AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL
O desenvolvimento pós-natal, do nascimento até o desmame, foi avaliado
através do acompanhamento do ganho de peso e da data de abertura dos olhos
tanto dos filhotes F1VPA e F2 quanto dos filhotes controle. Durante os primeiros 21
dias de vida, os filhotes tiveram o acompanhamento da abertura dos olhos entre os
dias pós-natais (P) P12 e P16. Os seus pesos foram monitorados em amostragens
obtidas nos P7, P14, P21, P28 e P35. Todo o levantamento de dados foi realizado
com o mínimo de manipulação nos animais durante esse período pós-natal, a fim de
não estressar as ratas-mães.
4.4 – AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS
MATERIAIS E MÉTODOS
47
Foram realizadas avaliações comportamentais destinadas a investigar a prole
descendente dos animais modelo animal de VPA (prole F2). Os experimentos
comportamentais ocorreram durante a fase pré-pubere (P30-35). Os animais foram
previamente habituados aos experimentadores 5 dias antes do início dos testes
comportamentais. Os protocolos experimentais foram adaptados de Schneider e
Przewlocki (2005), e todos os testes comportamentais foram gravados para posterior
análise offline através do softwares Any-Maze (Stoelting Co.).
4.4.1 – Avaliação da Atividade Exploratória
O teste de atividade exploratória leva em consideração a tendência natural
dos roedores de explorar ambientes novos, e tem como interesse principal avaliar o
estado motivacional dos animais experimentais expostos a um novo ambiente, assim
como avaliar seu desempenho motor. O teste foi realizado em uma arena retangular
(66 x 57 x 40 cm), confeccionada de madeira com assoalho preto. Para estimular a
exploração dos animais, as paredes continham 6 orifícios (paredes maiores) e 4
orifícios (paredes menores) de 2 cm de diâmetro igualmente distribuídos em duas
fileiras com orifícios nas paredes espaçados igualmente (Figura 9). Todo o ambiente
foi provido pela iluminação de baixa intensidade, para evitar que os animais fiquem
estressados. Para isto, uma lâmpada vermelha de 40W foi posicionada próximo ao
aparato, de forma garantir uma penumbra. Na semana anterior ao teste, os animais
foram habituados ao experimentador através do manuseio diário. No dia do
experimento, cada animal foi levado à arena e será deixado explorar por um período
de 5 minutos. Todas as sessões foram filmadas para posterior análise offline. Foram
avaliados três parâmetros durante a sessão do teste: (1) o número de
comportamentos de levantamento, (2) o número de inserções do focinho nos
orifícios, e (3) a distância total percorrida durante a tarefa. Após o teste, os animais
retornaram às suas caixas de origem e foram levados ao biotério.
MATERIAIS E MÉTODOS
48
Figura 9: A Esquema do aparato utilizado no teste de atividade locomotora e exploratória; B Animal
em livre movimento durante o teste em campo aberto.
4.4.2 – Avaliação da Auto-limpeza (ou grooming)
O comportamento de autolimpeza em roedores é um comportamento inato e
modulado intensamente pelo estado de ansiedade do animal (McFarlane et al.,
2008). Ele consiste de movimentos onde o animal lambe as patas anteriores, a
barriga e o dorso numa progressão estereotipada anteroposterior. A avaliação do
comportamento de autolimpeza tem como objetivo principal verificar a ocorrência de
estereotipias e sua repetitividade, fenótipos comumente observados no autismo.
Para avaliação do comportamento de autolimpeza, utilizamos os vídeos obtidos a
partir do teste de atividade locomotora e exploratória, e quantificamos a frequência
do comportamento de autolimpeza e a duração média de cada evento.
4.4.3 – Avaliação da Interação Social
O objetivo principal do teste de interação social é de analisar a preferência do
animal em interagir com outro animal em vez de interagir com um objeto. Para
realização do teste, os animais foram previamente habituados aos experimentadores
durante uma semana. A habituação ao aparato experimental ocorreu em P33 em 2
sessões de 5 minutos cada. O aparato consiste em uma caixa com 105 x 60 x 35
cm³ confeccionada em madeira com assoalho pintado de preto e dividida
internamente em 3 compartimentos vazios iguais de 35 x 60 x 35 cm³ (Figura 10). No
MATERIAIS E MÉTODOS
49
dia do experimento (P34), um animal isolado foi posicionado no interior da gaiola no
compartimento da esquerda e um objeto (gaiola vazia) no compartimento da direita.
O compartimento central permaneceu vazio durante todo o experimento, e o animal
teste foi posicionado no aparato nesse compartimento, ficando livre para explorar
todos os ambientes durante 10 minutos. Uma lâmpada vermelha de 40W foi utilizada
para criar penumbra. As sessões foram filmadas para posterior análise. Os animais
retornaram ao biotério ao fim do teste.
Foram quantificados no teste os seguintes parâmetros: (1) duração e
frequência da exploração social, (2) duração e frequência da exploração do objeto e
(3) distância percorrida. Foram excluídos das análises aqueles animais que não
frequentaram todas as zonas do aparato experimental ou que permaneceram por um
período menor que 1% do tempo total (6 segundos) em algum dos compartimentos
do aparato.
Figura 10: Imagem de um animal experimental durante o teste de interação social. No compartimento da direita encontra-se o animal não-familiar isolado por uma gaiola, enquanto na esquerda há uma gaiola vazia
Também foram avaliados o índice de discriminação social para esse teste,
que consiste na razão entre a diferença do tempo de interação social e interação
como o objeto pelo tempo total de permanência das duas zonas.
MATERIAIS E MÉTODOS
50
Valores próximos a 1 representam animais que tiveram preferência pela zona
de interação social, enquanto valores próximos a -1 representam animais que tem
preferência pela zona de interação com o objeto.
4.5 – AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
4.5.1 – Perfusão e Preparação do Tecido
Os animais foram anestesiados profundamente com tiopental sódico
(80mg/kg, i.p.) e posteriormente sacrificados por perfusão transcardíaca, que
consiste em abrir a caixa torácica do animal para exposição do coração, e posterior
punção do ventrículo esquerdo com uma agulha de gavagem, por onde bombeamos
o perfusato. Este líquido foi drenado através de um corte realizado no átrio direito.
Cada animal será perfundido inicialmente com tampão fosfato salina (PB: tampão
fosfato de sódio 50 mM pH 7.4 + salina: NaCl 150 mM à temperatura ambiente,
seguido de solução gelada de paraformaldeído (PFA) 4% dissolvido em PB. Os
volumes de perfusão foram 35 mL/Kg e 90 mL/Kg de rato, respectivamente.
Terminada a perfusão, os encéfalos foram retirados da caixa craniana e
armazenados em solução de PFA 4% gelada por 12 h a 4°C. Passado esse período,
os encéfalos foram então lavados em PB 0,1M gelado por 4h sob agitação e
transferidos para uma solução de sacarose 30% em PB 0,1M. Após o congelamento
a -40°C com isopentano e gelo seco, os encéfalos foram cortados de forma seriada
no criostato, em secções de 20-40 µm de espessura e coletados em lâminas e em
placas de cultura de células contendo solução crioprotetora. As lâminas ficaram
estocadas a -80ºC, enquanto as secções permaneceram estocadas em solução
crioprotetora a -20°C até a realização da imunofluorescência.
Í𝒏𝒅𝒊𝒄𝒆 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒔𝒄𝒓𝒊𝒎𝒊𝒏𝒂çã𝒐 = 𝒕𝒆𝒎𝒑𝒐 𝑰𝒏𝒕𝒆𝒓𝒂çã𝒐 𝑺𝒐𝒄𝒊𝒂𝒍 − 𝒕𝒆𝒎𝒑𝒐 𝑰𝒏𝒕𝒆𝒓𝒂çã𝒐 𝑶𝒃𝒋𝒆𝒕𝒐
𝒕𝒆𝒎𝒑𝒐 𝑰𝒏𝒕𝒆𝒓𝒂çã𝒐 𝑺𝒐𝒄𝒊𝒂𝒍 + 𝒕𝒆𝒎𝒑𝒐 𝑰𝒏𝒕𝒆𝒓𝒂çã𝒐 𝑶𝒃𝒋𝒆𝒕𝒐
MATERIAIS E MÉTODOS
51
4.5.2 – Imunofluorescência
Antes de iniciar o protocolo de imunofluorescência, os tecidos foram retirados
o freezer -80ºC e lavados em PBS por 10 minutos sob agitação. Eles foram então
incubados com tampão de bloqueio (PBS 10mM + 0.5% Triton-X + 5% NGS) por 60
min. Posteriormente, as lâminas foram transferidas para câmara úmida e o tecido foi
incubado com a solução anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio, a 4°C,
por 12-14h. Esse período de incubação foi ajustado de acordo com o anticorpo
primário utilizado na imunofluorescência . Passado o período de incubação, os
tecidos foram lavados em PBS e incubados com solução de anticorpo secundário
diluído em tampão de bloqueio por 2 horas, à temperatura ambiente, protegido da
luz. Após três lavagens em PBS, incubamos o tecido com solução do marcador
nuclear (DAPI; Sigma D9542) por 5 minutos e em seguida, as lâminas foram
montadas com meio anti-fading (Aqua-Poly/mount, Polisciences cat 18606) e
estocadas a 4ºC para posterior análise por microscopia de fluorescência.
Para marcação de alguns antígenos específicos, foi realizada a recuperação
antigênica através de pré-tratamento com tampão citrato de sódio 10mM, por 30
minutos a 80ºC . Passado esse período, os cortes foram lavados com PBS por 30
minutos e após isso foi dado continuidade ao protocolo inicial.
Foram utilizados os seguintes anticorpos primários em concentrações
determinadas experimentalmente após titulação: camundongo anti-NeuN (1:1000;
Millipore, MAB353), camundongo anti-parvalbumina (anti-PARV; 1:500; Sigma,
p3088), coelho anti-GABA (1:1000; Sigma, a2052). Os anticorpos secundários
utilizados foram Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo (1:1000; Invitrogen,
A11001) e Alexa Fluor 546 cabra anti-coelho (1:1000; Invitrogen, A11010). O DAPI
(1:1000) foi utilizado para marcação nuclear. As lâminas foram visualizadas e
fotografadas no microscópio Zeiss Imager M.2 ApoTome2 e, analisadas com o
software StereoInvestigator.
4.5.3 – Contagem e Distribuição Celular
A contagem de células foi realizada no córtex pré-frontal (CPFm - cingulado
anterior, pré-límbica e infra-límbica), correspondendo as coordenadas antero-
posterior (AP) de +3.7 a +2.7 mm, com relação ao Bregma (Paxinos and Watson,
MATERIAIS E MÉTODOS
52
2007). Para delimitar as sub-regiões do CPFm quantificadas, utilizamos marcos
anatômicos dessa região cortical previamente descritos (Heidbreder and
Groenewegen, 2003). Tendo como referência a porção inicial do corpo caloso e a
linha inter-hemisférica, dividimos essa última em três partes iguais, sendo o córtex
cingulado (Cg) representado a partir da porção superior do corpo caloso até a borda
do córtex, o córtex infralímbico (IL) delimitado pela borda inferior do corpo caloso e,
por fim, o córtex pré-limbico (PL) se posicionando entre essas duas regiões, como
representado na figura 11. As camadas corticais foram delimitadas pela diferença na
densidade de células, sendo a camada I facilmente identificada pela zona marginal e
com presença de pouquíssimas células. As camadas II/III possuem uma maior
densidade de células, podendo ser visualizada pela marcação com DAPI.
Finalizadas essas camadas, seguem as camadas V e VI até o limite da borda do
corpo caloso.
Foram contabilizados neurônios positivos para NeuN, GABA e PV nas
camadas I, II/III, V e VI do CPFm (Van De Werd et al., 2010) em 4 secções do CPFm
por animal.. Foram incluídos na contagem apenas perfis nucleares arredondados e
densamente corados. Utilizamos o método duplo cego em todas as análises
histológicas: as lâminas foram codificadas e só foi possível o acesso à chave de
codificação ao término das contagens. Para auxiliar a quantificação de células
DAPI+ e NeuN+, utilizamos a ferramenta ―Optical fractionator‖ do software
StereoInvestigator (MBF Bioscience), enquanto para a quantificação de neurônios
PV+, contamos o número total de células marcadas na região. Todas as análises
foram realizadas utilizando microscópio Zeiss Imager M.2 ApoTome2.
MATERIAIS E MÉTODOS
53
Figura 11: Esquema ilustrativo do córtex pré-frontal medial (CPFm; Bregma +3,7 a +2,7mm). Imunofluorescência para Parvalbumina (anti-PV, Sigma p3088; verde, e DAPI, pseudo-colorido em vermelho.
4.6- ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do software
Graphpad Prism 5.0, através de testes paramétricos ou não paramétricos, conforme
a distribuição das medidas a partir do teste de normalidade de D’agostino e Pearson.
Para grupos com uma variável independente, foram feitas análises através do teste
ANOVA de uma via (para amostras com distribuição paramétrica) ou teste de
Kruskall-Walys (para amostras com distribuição não paramétrica). Já para as
análises com duas variáveis, foi utilizado o ANOVA de duas vias com pós-teste de
Bonferroni. Para análise da abertura dos olhos, foi realizado o teste Qui-Quadrado.
O intervalo de confiança adotado neste trabalho é de 95% (* p<0.05; ** p<0.01;
***p<0.001).
54
5. Resultados
RESULTADOS
55
5.1 – ACASALAMENTO DE ANIMAIS F1VPA
Para obtenção dos animais experimentais F2, fêmeas F1VPA com ciclos de
fertilidade controlados, acasalaram com machos F1VPA, não relacionados
consanguineamente com as mesmas. A fecundação foi confirmada a partir da
presença de espermatozoides no esfregaço vaginal, ou pela estabilização do ciclo
estral no diestro.
5.2 - DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL
Ao contrário do que observamos em animais F1VPA, nascidos de mães
tratadas com VPA durante a gravidez (Brandão et al., 2013), os animais gerados a
partir do cruzamento de pais oriundos desta F1VPA mas sem o tratamento com VPA
no período gestacional, doravante denominados F2, não apresentou o padrão da
cauda com dobra, característico nos animais F1VPA (Brandão et al., 2013; Sonoda et
al., 1990). Em todas as idades, os animais F2 apresentam a cauda sem nenhum
tipo de modificação (Figura 12). Essa característica se confirmou em todas as 06
ninhadas F2 utilizadas nesse trabalho e sugere que o defeito na cauda observado na
F1VPA é causada pela exposição ao VPA durante a embriogênese, inexistente nos
animais da F2.
Figura 12: (A) Animais F1VPA apresentando a característica cauda quebrada no dia pós-natal 7 (P7) e
em P35. A geração descendente (F2) não apresentou o fenótipo em nenhuma das idades.
F1VPA
F2
RESULTADOS
56
A fim de verificar se existe algum comprometimento no desenvolvimento pós-
natal nos animais descendentes F2, foi realizado o acompanhamento de peso e de
abertura dos olhos durante as primeiras semanas de vida dos animais F1VPA, F2 e
controle.
O acompanhamento de peso ocorreu no dia pós-natal (P)7, P14, P21, P28 e
P35. Os dados coletados dos animais F2 demonstraram que o grupo apresenta
crescimento equivalente ao grupo controle, não tendo sida observada nenhuma
perda de peso nesses animais, da forma como é observada nos animais F1VPA
(Figura 13). A redução de peso no grupo F1VPA comparado com os grupos controle e
F2 foi significativa (ANOVA de duas vias; F(2,131) = 5,91, p=0,0035), com teste post-
hoc significativo em P28 (CTLxF1VPA e F2xF1VPA p<0,001) e em P35 (CTLxF1VPA
p<0,001 e F2xF1VPA P<0,01).
Figura 13: Acompanhamento de peso (Controle: n=50; F1VPA: n=48; F2: n=29). Dados foram
analisados por teste ANOVA de duas vias e representam a média ± erro padrão. **p<0,01,
***p<0,001.
A curva de abertura dos olhos foi feita a partir da observação dos filhotes
entre os dias P12 até P16. Enquanto os animais controle finalizavam a abertura dos
olhos em P14, os grupos experimentais F1VPA e F2 abriram os olhos até P15 (Mantel
Cox Long-Rank, Qui-quadrado:10,13, p=0,0063) (Figura 14).
RESULTADOS
57
Figura 14: Curva de abertura dos olhos entre os dias pós-natais 12 e 16 (P12-P16) (Controle: n=5 ninhadas; F1VPA: n=7 ninhadas; F2: n=4 ninhadas). Dados foram analisados por teste Mantel-Cox Long-Rank e representam a média ± erro padrão.
5.3- TESTES COMPORTAMENTAIS
5.3.1 – Atividade Locomotora Exploratória
Os testes de atividade locomotora e exploratória foram realizados nos grupos
experimentais em P30. O primeiro parâmetro avaliado foi a distância percorrida
pelos animais durante os 5 minutos de teste. Nós observamos que os animais do
grupo F1VPA apresentaram um aumento na distância percorrida (ANOVA de uma via;
F(2,96)= 10,95), o que não foi observado nos animais do grupo F2 (Figura 15).
A partir desse teste também foi possível identificar a presença de um perfil
tipo-ansioso nos animais testados ao quantificar a distância percorrida pelo animal
no centro e periferia da arena (Bailey and Crawley, 2009). Feita essa análise, o
grupo F2 permaneceu sem apresentar diferença em relação aos outros grupos,
demonstrando um perfil comportamental mais semelhante ao dos animais do grupo
controle (ANOVA de uma via; F(2,96)= 4,64). O teste post-hoc foi significativo entre o
grupo F1VPA e controle (p=0,01). A distância percorrida pelos animais na zona central
do aparato não foi significativamente diferente entre os grupos (ANOVA de uma via;
F(2,96)=1,87) (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29) (Figura 15).
11 12 13 14 15 160
20
40
60
80
100
120 Controle
F1VPA
F2
Dia pós-natal
% O
lho
s a
be
rto
s
RESULTADOS
58
Figura 15: Análise do comportamento locomotor, exploratório e de autolimpeza durante realização do teste (5 minutos). (A) O aumento da locomoção foi notório no grupo F1VPA, principalmente na periferia do aparato experimental (B), ficando ausente na prole descendente (F2) (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29). Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. **p<0.01.
Como forma de avaliar se o sexo poderia influenciar no perfil de locomoção
apresentado pelos animais, os dados foram analisados separadamente para machos
e fêmeas. Os resultados revelaram um discreto aumento na locomoção nos machos
F1VPA comparado com os grupos controle e F2, porém não sendo significativa
(ANOVA de uma via F(2,46) = 23,36; p=0.052) (Figura 16). Nas fêmeas, o grupo F1VPA
apresentou aumento da locomoção comparado com os grupos controle e F2
(ANOVA de uma via; F(2,47) = 25,92), com teste post-hoc foi significativo entre o
grupo F1VPA e controle (p<0,001) e F1VPA e F2 (p<0,001). Esse percurso foi realizado
principalmente na periferia (ANOVA de uma via; F(2,47) = 17,61), com teste post-hoc
significativo entre o grupo F1VPA e controle (p<0,01) e F1VPA e F2 (p<0,001). Nos
machos não foram observadas alterações no perfil de locomoção no centro (ANOVA
de uma via; F(2,46) = 1,67, p=0,70) e periferia (ANOVA de uma via; F(2,46) = 22,95,
p=0,25) para os três grupos experimentais estudados (Machos controle: n=23,
F1VPA: n=13, F2: n=13 e fêmeas controle: n=18, F1VPA: n=16, F2: n=16).
Contr
ole
F1 VPA F2
0
10
20
30
40
***
Dis
tân
cia
(m
)
Contr
ole
F1 VPA F2
0
5
10
15
20
25
**
Contr
ole
F1 VPA F2
0
1
2
3
4
Controle
F1VPA
F2
TOTAL PERIFERIA CENTRO
RESULTADOS
59
Figura 16: Análise da atividade locomotora em machos e fêmeas durante os 5 minutos de teste. No caso dos machos não houve diferença entre os grupos para distância total (p= 0.052), periferia e area central do aparato comportamental (Machos Controle: N=23; F1VPA: N=13; F2: N=13). Para as fêmeas o aumento de locomoção ocorreu no grupo F1VPA comparados com os grupos controle e F2. Essa diferença continuou presente na distância percorrida pelo grupo F1VPA na periferia (Fêmeas Controle: N=18; F1VPA: N=16; F2: N=16). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam média ± erro padrão. **p<0,01, ***p<0,001.
O mapeamento de locomoção também foi capaz de representar a preferência
pela periferia do aparato comportamental característico no grupo F1VPA, enquanto os
animais F2 demonstraram um perfil de locomoção mais semelhante ao grupo
controle (Figura 17).
Figura 17: Mapeamento do trajeto percorrido pelos animais durante o teste de atividade exploratória e locomotora (5 minutos), mostrando a maior presença dos animais na periferia do aparato experimental.
Para analisar a capacidade dos animais em explorar o novo ambiente,
quantificamos o número de eventos de farejadas, assim como o número de
Controle
F1VPA
F2
RESULTADOS
60
Total
Contr
ole
F1 VPA F2
0
10
20
30
40
***
Periferia
Contr
ole
F1 VPA F2
0
5
10
15
20
25
**
Centro
Contr
ole
F1 VPA F2
0
1
2
3
4Controle
F1VPA
F2
levantamentos realizados durante os 5 minutos de teste (conforme descrito por
Schneider, 2005). Os resultados mostram que os animais do grupo F2 apresentaram
uma grande redução no número de ―levantamentos‖, comparado com o grupo F1VPA
e controle (ANOVA de uma via; F(2,96) = 17,22). O teste post-hoc foi significativo entre
os grupos F1VPA e F2 (p<0,01), assim como Controle e F2 (p<0,001). Já o número
de farejadas não apresentou diferença entre os grupos (ANOVA de uma via; F(2,96) =
2,97, p=0,056) (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29) (Figura 18).
Figura 18: Análise do comportamento exploratório durante a realização do teste (5 minutos). O comportamento de ―levantamento‖ esteve reduzido nos animais F2, enquanto o comportamento de farejadas não apresentou diferença significativa entre os grupos. (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29). Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. **p<0.01, ***p<0.001.
A análise em separado para machos e fêmeas mostrou que, para a
quantificação do número de ―levantamentos‖, houve diferença significativa apenas
quando foram comparados os grupos controle e F2, tanto para machos (ANOVA de
uma via; F(2,46) = 249,7) quanto para fêmeas (ANOVA de uma via; F(2,47) = 232,3). O
teste post-hoc foi significativo entre o grupo Controle e F2 nos machos (p<0,05) e
nas fêmeas (p<0,01) (Machos controle: n=23, F1VPA: n=13, F2: n=13 e fêmeas
controle: n=18, F1VPA: n=16, F2: n=16) (Figura 19).
(A) LEVANTAMENTOS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
20
40
60
*****
Nú
me
ro d
e e
ve
nto
s
(B) FAREJADAS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
10
20
30
40
RESULTADOS
61
Figura 19: Quantificação do número de levantamentos em machos e fêmeas durante os 5 minutos de teste. Foi observada uma redução no número de evento nos animais referentes ao grupo F2 (Machos Controle: N=23; F1VPA: N=13; F2: N=13). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam média ± erro padrão. **p<0,01, ***p<0,001.
Já a quantificação do número de farejadas continuou sem apresentar
diferença entre os grupos analisados. Machos (ANOVA de uma via; F(2,46) = 84,86,
p=0,40) e fêmeas (ANOVA de uma via; F(2,47) = 70,60, p=0,14) exibiram semelhança
no desempenho da tarefa (Machos controle: n=23, F1VPA: n=13, F2: n=13 e Fêmeas
Controle: n=18, F1VPA: n=16, F2: n=16) (Figura 20).
Figura 20: Análise do número de farejadas durante teste de atividade exploratória em machos e fêmeas não demonstrou diferença no número de eventos entre os grupos. (Machos Controle: N=23; F1VPA: N=13; F2: N=13, Fêmeas Controle: N=18; F1VPA: N=16; F2: N=16). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam média ± erro padrão. **p<0,01, ***p<0,001.
Uma das características encontradas em pacientes com autismo é a presença
de movimentos repetitivos e estereotipados. Por isso, a utilização da atividade de
MACHOS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
20
40
60
*
Nú
me
ro d
e e
ve
nto
s
FÊMEAS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
20
40
60
**
Controle
F1VPA
F2
Nú
me
ro d
e e
ve
nto
s
MACHOS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
10
20
30
40
Nú
me
ro d
e e
ve
nto
s
FÊMEAS
Contr
ole
F1 VPA F2
0
10
20
30
40
Controle
F1VPA
F2
RESULTADOS
62
autolimpeza como uma ferramenta capaz de avaliar estereotipia em roedores é de
extrema importante para caracterizar os modelos animais de autismo. Avaliando
este parâmetro, nós observamos que os animais F1VPA apresentaram um ligeiro
aumento na duração dos eventos de autolimpeza, comparado com o grupo controle
e grupo F2 (ANOVA de uma via; F(2,96) = 4,24). O teste post-hoc foi significativo entre
o grupo Controle (p<0,05) e F2 (p<0,05) (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29)
(Figura 21).
Figura 21: Análise do comportamento de autolimpeza durante os 5 minutos de teste. Os animais F2 realizaram eventos de autolimpeza menos prolongados que os demais grupos experimentais. (Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29).
A análise em separado de machos e fêmeas demonstrou que os eventos de
autolimpeza não são afetados no animais do grupo F2. Essa diferença é encontrada
principalmente ao analisar as fêmeas F1VPA, que possui eventos de autolimpeza
aumentados apenas em relação ao grupo controle (ANOVA de uma via; F(2,47) =
0,48), com teste post-hoc significativo (p<0,05). Nos machos, essa diferença entre
os grupos não se tornou significativa (Machos controle: n=23, F1VPA: n=13, F2: n=13
e fêmeas controle: n=18, F1VPA: n=16, F2: n=16) (Figura 22).
Contr
ol
VPA
VPA-V
PA
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 * *Controle
F1VPA
F2
Tem
po
de
ev
en
tos
de a
uto
-lim
pe
za
RESULTADOS
63
Figura 22: Análise do comportamento de autolimpeza durante a realização do teste (5 minutos). .
(Controle: n=41; F1VPA: n=29; F2: n=29).
Em conjunto, os dados de locomoção e movimentos repetitivos indicam que a
geração F2 apresentam um perfil comportamental semelhante aos apresentados
pelo grupo controle, tanto machos quanto fêmeas. A única diferença foi registrada na
quantificação no número de ―levantamentos‖, sugerindo que esses animais têm um
perfil de exploração do aparato comportamental reduzido quando comparado com os
grupos controle e F1VPA.
5.3.2- Interação Social
A atividade de interação social é uma ferramenta essencial para validação
dos modelos animais de autismo estudados. Sabe-se que o déficit de interação
social é um dos principais sintomas detectados em pacientes com TEA, sendo
inclusive critério de diagnóstico da patologia, de acordo com o DSM V (American
Psychiatric Association, 2013).
Uma vez que o autismo tem forte carga genética, nós decidimos avaliar se
animais F2 apresentam algum déficit social, assim como é observado na linhagem
parental. Para isso, realizamos o teste de interação social. O experimento teve
duração de 10 minutos, e durante esse período a análise consistiu em quantificar o
tempo de permanência do animal teste nas zona de interação social, zona neutra e
de interação com o objeto.
MACHOS
Contr
ol
VPA
VPA/V
PA
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Te
mp
o d
e e
ve
nto
s
de
au
to-l
imp
eza
FÊMEAS
Contr
ol
VPA
VPA/V
PA
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5*
Controle
F1VPA
F2
RESULTADOS
64
Os resultados revelam a presença de um perfil intermediário do grupo F2
comparado com os grupos Controle e F1VPA (Figura 23), com efeito de grupo e efeito
de zona significativo. A prole descendente F2 permaneceu mais tempo na zona
social comparado com o grupo F1VPA. No entanto, comparado com o grupo controle,
esse tempo ficou bastante reduzido (ANOVA de duas vias; F(2,201) = 0,57). O teste
post-hoc foi significativo para todas as comparações realizadas na zona social
(p<0,001).
Na zona neutra foi observado um discreto aumento no tempo de permanência
apenas no grupo F1VPA comparado com o controle, com teste post-hoc significativo
(p<0.05). E, na zona de interação com o objeto, houve novamente o surgimento de
características comportamentais medianas pelo grupo F2, que ficou mais tempo na
zona comparado com o grupo controle e menos tempo que o grupo F1VPA. O teste
post-hoc foi significativo para todas as comparações realizadas na zona do objeto
(p<0,001) (Controle: n=24; F1VPA: n=18; F2: n=28).
Figura 23: Tempo de permanência do animal nas zonas do aparato experimental durante 10 minutos 2de teste. Animais F1VPA permaneceram menos tempo na zona social e mais tempo nas zonas neutra e do objeto, enquanto a apresentou um comportamento intermediário entre este grupo e o controle. (Controle: n=24; F1VPA: n=18; F2: n=28). Dados foram analisados por ANOVA de duas vias e representam a média ± erro padrão. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
A análise comparativa pelo sexo demonstrou que os machos apresentaram
um perfil de interação social muito semelhante ao grupo misto (ANOVA de duas
vias; F(2,93) = 0,01). Machos F2 tiveram mais tempo de permanência na zona social
comparado ao grupo F1VPA e menos tempo em relação ao grupo controle (post-hoc
Social Neutra Objeto0
100
200
300
400
500
Controle
F1VPA
F2
***
*** ***
***
*** ***
*
Tem
po
(s
eg
)
RESULTADOS
65
significativo p<0,001). Na zona do objeto novamente o comportamento foi
semelhante ao encontrado na figura anterior, com os grupos F1VPA e F2
permanecendo mais tempo nessa zona, com teste post-hoc significativo entre os
grupos controle x F2, controle x F1VPA e F1VPA x F2 ( p<0,001) (Machos controle:
n=13; F1VPA: n=9; F2: n=12) (Figura 24).
Figure 24: Tarefa de Interação Social está reduzida nos grupos experimentais durante os 10 minutos de teste. Os machos F2 apresentaram comportamento intermediário entre os grupos controle e F1VPA (Machos Controle: N=13; F1VPA: N=9; F2: N=12). Os dados foram analisados por ANOVA de Duas Vias e representam a média ± erro padrão. **p<0,01, ***p<0,001.
Já as fêmeas F2 apresentaram um comportamento semelhante às fêmeas
F1VPA na zona de interação social, com menor tempo de permanência comparado
com o grupo Controle (ANOVA de duas vias; F(2,96) = 1,27). O teste post-hoc foi
significativo nessa zona no comparativo entre os grupos controle x F1VPA e controle x
F2 (p<0,001). Na zona de interação com objeto, as fêmeas F2 tiveram, juntamente
com o grupo controle, redução no tempo de permanência em relação ao grupo F1VPA
(post-hoc significativo p<0,001 controle x F1VPA e p<0,01 F1VPA x F2) (Fêmeas
Controle: n=11; F1VPA: n=9; F2: n=15) (Figura 25).
Social Neutra Objeto0
100
200
300
400
500
Controle
F1VPA
F2*** ***
**
*** ******
Te
mp
o (
se
g)
MACHOS
RESULTADOS
66
Figure 25: Teste de Interação Social em Fêmeas. As fêmeas F2 apresentaram tempo reduzido na zona de interação social, semelhante às fêmeas F1VPA, e tempo intermediário entre os grupos controle e F1VPA na zona de interação com objeto (Fêmeas Controle: N=11; F1VPA: N=9; F2: N=15). Dados foram analisados por ANOVA de duas vias, e representam média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
O Índice de Discriminação foi utilizado para avaliar a preferência do animal, se
é pelo animal presente na zona social (valores próximos a 1) ou se é pelo objeto
(valores próximos a -1). Os cálculos indicaram que, enquanto o grupo controle
apresentou índices de discriminação próximos a 1, os animais do grupo F2 exibiram
índices de discriminação intermediários entre este e o grupo F1VPA (ANOVA de uma
via; F(2,66) = 31,02). O teste post-hoc foi significativo para todas as comparações
realizadas: controle x F1VPA (p<0.001), controle x F2 (p<0.01) e, F1VPA x F2
(p<0.001) (Controle: n=24; F1VPA: n=18; F2: n=28) (Figura 26).
Figura 26: Índice de discriminação reforçando a diminuição na preferência social nos grupos experimentais F1VPA e F2. (Controle: n=24; F1VPA: n=18; F2: n=28). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
Social Neutra Objeto0
100
200
300
400
500
Controle
F1VPA
F2**
***
*
*** **
*
Te
mp
o (
se
g)
Contr
ol
VPA
VPA/V
PA
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0***
***** Controle
F1VPA
F2
Índ
ice
de
Dis
cri
min
açã
o
FÊMEAS
RESULTADOS
67
A análise diferenciada entre machos e fêmeas evidencia que a maior redução
no índice de discriminação nos animais do grupo F1VPA, com machos chegando a
valores negativos. Para eles, no grupo F2, os índices foram semelhantes e
intermediários entre os grupos controle e F1VPA (ANOVA de uma via; F(2,31) = 0,10).
O teste post-hoc foi significativo para todas as comparações realizadas: controle x
F1VPA (p<0.001), controle x F2 (p<0.01) e F1VPA x F2 (p<0.001) (Machos Controle:
n=13; F1VPA: n=9; F2: n=12). As fêmeas, por sua vez, apresentaram índices que
levam ao mesmo padrão de resultado, porém com os resultados no grupo F1VPA
acima de zero, como pode ser observado na figura X(B) (ANOVA de uma via; F(2,31)
= 0,10) (Fêmeas Controle: n=11; F1VPA: n=9; F2: n=15) (Figura 27).
Figure 27: Índice de discriminação em machos e fêmeas, reforçando a redução do comportamento social nos grupos experimentais F1VPA e intermediário nos grupos F2 (Machos Controle: n=13; F1VPA: n=9; F2: n=12) (Fêmeas Controle: n=11; F1VPA: n=9; F2: n=15). Os dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Baseado nos resultados apresentados até o momento, foi possível observar
que os animais da prole F2, descendente de pais expostos ao F1VPA durante o
período embrionário, demonstraram um perfil de interação social reduzido quando
comparado a animais controle, com índices de discriminação também baixos.
5.4 – ADOÇÃO CRUZADA
MACHOS
Contr
ol
VPA
VPA/V
PA
-0.5
0.0
0.5
1.0*** ***
**
Índ
ice
de
Dis
cri
min
aç
ão
FÊMEAS
Contr
ol
VPA
VPA/V
PA
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
***
**
Controle
F1VPA
F2
RESULTADOS
68
A partir do exposto acima, fica o questionamento se o perfil social
apresentados pelos animais F2 é oriundo das alterações genéticas já encontradas e
descritas nos animais F1VPA, ou se o que está ocorrendo é alguma forma de
―aprendizado‖ comportamental adquirido por esses filhotes, uma vez que os mesmos
receberam cuidados maternos de fêmeas que sabidamente possuíam déficit
comportamental.
Para responder à essa questão, foram realizados experimentos de adoção
cruzada, na qual animais F2 puderam ser cuidados por mães adotivas controle,
enquanto animais controle receberam cuidados de mães F1VPA adotivas.
Os grupos experimentais foram nomeados como CmC (filhotes controle
criados pela própria mãe controle); CmV (filhotes controle criados por mãe adotiva
F1VPA); VmV (filhotes F2 criados pela própria mãe F1VPA); e VmC (filhotes F2 criados
por mãe adotiva controle).
O n experimental utilizado nos resultados refere-se ao número de animais
acompanhados durante o desenvolvimento pós-natal e testes comportamentais,
sendo cada grupo derivado de, no mínimo, 3 proles distintas (CmC: 5 proles; CmV: 4
proles; VmV: 7 proles; VmC: 4 proles).
5.4.1 – Peso
Como forma de observar se houve comprometimento no desenvolvimento dos
animais, os filhotes tiveram o peso acompanhado durante os dias P7, P14, P21, P28
e P35. Foi observado uma redução no peso dos animais que foram submetidos ao
processo de adoção cruzada (CmV e VmC), sendo esse aumento no peso
significativo apenas em P35 (ANOVA de duas vias; F(3,751) = 3,11), com teste post-
hoc significativo (p=0,02) (Figura 28). As demais medidas de peso realizadas
durante o período pós-natal não apresentaram diferença significativa entre os
grupos.
RESULTADOS
69
Figura 28: Efeito da adoção cruzada na curva de crescimento dos animais controle e experimentais durante os dias pós-natais (P) 7, 14, 21, 28 e 35 (CmC: 40, CmV: 32, VmV: 52, VmC: 32). Dados foram analisados por teste ANOVA de duas vias e representam a média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
5.4.2 – Abertura dos olhos
A abertura dos olhos também auxiliou no acompanhamento pós-natal entre
P12 e P16. Curiosamente, os animais F2 adotados pela mãe Controle (VmC), assim
como os animais adotados pela mãe F1VPA (CmV), tiveram um pequeno atraso na
abertura dos olhos, comparado com os demais grupos (Mantel Cox Long-Rank, Qui-
quadrado: 44,36, p<0,001) (Figura 29).
Figura 29: Curva de abertura dos olhos entre os dias pós-natais 12 e 16 (P12-P16) (CmC: 40, CmV:
32, VmV: 52, VmC: 32). Dados foram analisados por Mantel-Cox Long-Rank test.
0 25 50 75 100 125
7
14
21
28
35
VmC
CmV
VmV
CmC
****
Peso (g)
Dia
pó
s-n
ata
l
11 12 13 14 15 160
25
50
75
100CmC
CmV
VmV
VmC
Dia pós-natal
% O
lho
s a
bert
os
RESULTADOS
70
5.4.3 – Locomoção
O teste de atividade locomotora foi realizado em campo aberto, em livre
movimento, durante 5 minutos. Os resultados revelaram um aumento na locomoção
apenas no grupo VmV, diferindo significativamente em relação aos demais grupos.
(ANOVA de uma via; F(3,160) = 13,28, p<0,001), com teste post-hoc significativo CmC
x VmV (p<0,001); CmV x VmV (p<0,001); VmV x VmC (p<0,01) (CmC: n=47; CmV:
n=32; VmV: n=53; VmC: n=32) (Figura 30).
Figura 30: Distância percorrida pelos animais durante os 5 minutos de teste de atividade locomotora. Não foi observada diferença entre os grupos experimentais (CmC: 47 n=32; VmV: n=53; VmC: n=32). Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Essa observação se manteve quando os grupos foram avaliados por sexo.
Existe uma maior locomoção tanto nos grupos de fêmeas VmV em relação aos
grupos controle (ANOVA de uma via; F(3,66) = 11,87, p<0,001), com post-hoc
significativo CmC x VmV (p<0,001), e CmV x VmV (p<0,01) (CmC: n=21; CmV:
n=15; VmV: n=22; VmC: n=12) (Figura Xa), assim como nos machos VmV relativo
aos grupos controle (ANOVA de uma via; F(3,89) = 14,35; p<0,001), com post-hoc
significativo também entre os grupos CmC x VmV e CmV x VmV (p<0,01) (CmC:
n=26; CmV: n=17; VmV: n=30; VmC: n=20) (Figura 31).
RESULTADOS
71
Figura 31: Distância percorrida pelos animais (A) machos e (B) fêmeas durante os 5 minutos de teste de atividade locomotora. Foi observado um aumento na locomoção em machos e fêmeas do grupo VmV, quando comparado com os grupos controle CmC e CmV. Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão
O mapeamento da locomoção teve como objetivo observar o perfil de
deslocamento do animal durante a execução do teste de atividade locomotora e
exploratória, buscando a ocorrência de um padrão associativo entre os grupos
experimentais. Pode ser observada uma grande semelhança entre o perfil dos
animais Controle (CmC e CmV), sendo esse perfil diferente do encontrado nos
grupos F2 (VmV e VmC) (Figura 32).
Figura 32: Mapemento dos do trajeto realizado pelos animais experimentais durante os 5 minutos de
tarefa comportamental.
5.4.4 – Interação Social
RESULTADOS
72
O teste de interação social foi realizado nos animais dos 4 grupos incluídos na
adoção cruzada (CmC, CmV, VmV e VmC). O teste foi realizado com o mesmo
protocolo do utilizado nos animais F2, com duração de 10 minutos. Foram excluídos
dessa análise todos animais que permaneceram menos que 1% do tempo total do
teste (6 segundos) em alguma das zonas do aparato experimental.
A análise quantitativa dos vídeos revelou que, assim como nos dados
anteriores, os animais F2 descendentes de mães F1VPA apresentaram uma redução
no tempo permanecido na zona social (Figura 33). Já a zona do objeto foi mais
visitada por todos os animais experimentais, quando comparadas com o grupo CmC
(ANOVA de duas vias, F(3,450) = 0,00). O teste post-hoc foi significativo na zona social
(VmC x CmC p<0,001; VmC x VmV p<0,05; VmV x CmC p<0,001; CmV x CmC
p<0,001) e na zona do objeto (VmC x CmC p<0,001; VmV x CmC p<0,01; CmV x
CmC p<0,001) (CmC: 47, CmV: 31, VmV: 52, VmC: 27).
Figura 33: Teste de interação social durante 10 minutos de teste. Os animais dos grupos experimentais tiveram tempo reduzido na zona de interação social, e maior tempo de permanência na zona de interação com objeto, quando comparados ao grupo controle (CmC). Não foi observada diferença entre os grupos experimentais na zona neutra (CmC: 47, CmV: 31, VmV: 52, VmC: 27). Dados foram analisados por teste ANOVA de duas via e representam a média ± erro padrão. **p<0,01, ***p<0,001.
Os machos e fêmeas ao serem analisados em separado, demonstraram uma
ligeira diferença no perfil de exploração apresentado. De maneira geral, os machos
tiveram redução no tempo de interação social nos grupos experimentais e em
Social Neutra Objeto0
100
200
300
400
500
CmC
CmV
VmV
VmC
***
***
***
***
**
***
Te
mp
o (
se
g)
*
RESULTADOS
73
paralelo aumentaram a permanência na zona de interação com objeto, quando
comparados com o grupo controle CmC (Figura 34) (ANOVA de duas vias, F(3,243) =
0,01). O teste post-hoc foi significativo na zona social (VmC x CmC p<0,001; VmC x
VmV p<0,001; CmV x CmC p<0,01) e na zona do objeto (VmC x CmC p<0,001; VmV
x CmC p<0,01; CmV x CmC p<0,05) (N: CmC: 25, CmV: 16, VmV: 28, VmC: 13).
Os dados referente às fêmeas, por sua vez, revelaram uma discreta diferença
entre o grupo CmC e os grupos F2 (VmV e VmC) na zona social (ANOVA de duas
vias, F(3,222) = 0,27), com teste post-hoc significativo entre os grupos CmC x VmV
(p<0,05) e CmC x VmC (p<0,01). Não houve diferença estatística entre os grupos
nas demais zonas do aparato (Figura 35) (N: CmC: 24, CmV: 15, VmV: 25, VmC:
14).
Figura 34: Teste de interação social durante 10 minutos de teste. Os machos dos grupos experimentais tiveram tempo reduzido na zona de interação social (IS) , e maior tempo de permanência na zona de interação com objeto (IO), quando comparados ao grupo controle (CmC). Não foi observada diferença entre os grupos experimentais na zona neutra (ZN) (CmC: 25, CmV: 16, VmV: 28, VmC: 13). Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
MACHOS
RESULTADOS
74
Figura 35: Teste de interação social durante 10 minutos de teste. As fêmeas dos grupos experimentais tiveram tempo reduzido na zona de interação social (IS), e maior tempo de permanência na zona de interação com objeto (IO), quando comparados ao grupo controle (CmC). Não foi observada diferença entre os grupos experimentais na zona neutra (ZN) (CmC: 24, CmV: 15, VmV: 25, VmC: 14). Dados foram analisados por teste ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
O índice de discriminação reforça que a preferência social encontra-se
reduzida nos grupos experimentais quando comparados com o controle CmC
(Kruskal Walis teste 24,19; p<0,001), com teste post-hoc significativo entre os
grupos CmC x CmV (p<0,01), CmC x VmV (p<0,01) e CmC x VmC (p<0,001) (CmC:
49, CmV: 24, VmV: 53, VmC: 23) (Figura 36).
Figura 36: Índice de discriminação reforçando a diminuição na preferência social nos grupos experimentais (CmC: 44, CmV: 23, VmV: 50, VmC: 20). Dados foram analisados por (A) ANOVA de duas vias e (B) de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
Social Neutra Objeto0
100
200
300
400
500
CmC
CmV
VmV
VmC
**
*
Te
mp
o (
se
g)
CmC CmV VmV VmC0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
***
**
**
Índ
ice
de
Dis
cri
min
aç
ão
FÊMEAS
RESULTADOS
75
Os dados quantitativos levando em consideração o sexo do animal
confirmaram novamente que machos e fêmeas, assim como mostrado no gráfico de
tempo de interação social, apresentam perfis comportamentais discretamente
diferentes. Nos machos a diferença entre os grupos foi observada entre os animais
controle em relação aos grupos experimentais F2 (VmV e VmC) (ANOVA de uma
via; F(3,80) = 0,13; p<0,001), enquanto as fêmeas tiveram uma ligeira redução no
índice de discriminação apenas entre os grupos CmC e CmV (ANOVA de uma via,
F(3,74) = 0,14; p<0,001) (Figura 37).
Figura 37: Índice de discriminação reforçando a diminuição na preferência social nos grupos experimentais (CmC: 44, CmV: 23, VmV: 50, VmC: 20). Dados foram analisados por (A) ANOVA de duas vias e (B) de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
Os gráficos de correlação abaixo demonstraram uma moderada correlação
negativa entre a locomoção e o índice de interação social nos grupos CmC e CmV.
Além disso, é possível esclarecer por esses gráficos como está a distribuição dos
animais de uma forma mais ampla. Como pode ser observado, o grupo VmC
apresentou uma grande variabilidade entre os dados para as 3 proles utilizadas nos
testes comportamentais (Figura 38).
RESULTADOS
76
Figura 38: Gráficos de correlação entre o tempo de locomoção durante o teste de interação social e o
―social index‖. É observada uma correlação negativa para os fatores apenas nos animais CmC e
CmV, não sendo observado diferença significativa nas demais condições. Os dados foram analisados
a partir da correlação não-paramétrica de Spearman.
Em resumo, a análise dos dados da adoção cruzada revelaram que
parâmetros como a locomoção em campo aberto não foram influenciados pela
descendência dos animais F1VPA, assim como pelo tipo de cuidado materno os
animais F2 receberam no período pós natal. Já o teste de interação social fortaleceu
a hipótese de que a prole F2 apresenta alterações comportamentais que poderiam
estar sendo herdadas dos seus pais F1VPA.
5.5 – ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS NO CÓRTEX PRE-FRONTAL
Uma vez que diversas pesquisas vem demonstrando alteração na distribuição
celular e neuronal, tanto em amostras de tecidos post-mortem de pacientes com
RESULTADOS
77
TEA como em modelos animais, foi de interesse desse estudo caracterizar a
organização cortical encontrada nos animais F1VPA, assim como em sua prole
descendente F2. Para isso, foram quantificados o número de células coradas pelo
DAPI (celularidade total), assim como a população neuronal, a partir da identificação
dos neurônios pela expressão de a proteína NeuN no CPFm e em suas subdivisões
(córtex cingulado anterior – Cg; córtex pré-limbico – PL, e córtex infra-límbico – IL).
Figura 39: Cortex prefrontal medial e suas camadas corticais. No detalhe, uma representação da
janela de contagem utilizada nas contagens celulares para DAPI (azul) e NeuN (verde).
5.5.1 – Celularidade Total (DAPI)
Os resultados preliminares indicam que não há diferença estatística
significativa entre o número total de células positivas para DAPI+ no CPFm dos
animais estudados, como mostrado na figura 40 (ANOVA de uma via F(2,10) = 1,97,
p=0,20), (Controle: n=5; F1VPA: n= 3; F2: n= 3).
RESULTADOS
78
Figura 40: Densidade de células DAPI-positivas no CPFm não apresentou diferença significativa
entre os grupos (controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3).
A densidade de células por subárea também não encontrou uma diferença
significativa entre os grupos. A análise estatística foi realizada com ANOVA de uma
via (Cg: F(2,10) = 2,14, p=0,17; PL: F(2,10) = 2,05 , p=0,19; IL: F(2,10) = 1,40, p=0,30)
(Figura 41).
Figura 41: Distribuição celular nas subáreas do Cg, PL e IL (Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3)
Da mesma forma, a laminação cortical também não apresentou alterações na
densidade celular ao longo das camadas. Esse padrão foi observada em todas as
sub-regiões do CPFm avaliadas (ANOVA de duas vias; Cg: F(2,24) = 2,47, p=0,28; PL:
F(2,24) = 4,25, p=0,02; IL: F(2,24) = 1,61, p=0,22 (Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3)
(Figura 42).
Contr
ole
F1 VPA F2
0
50
100
150
200
250
Controle
F1VPA
F2
Nº
de
cé
lula
s/0
,1m
m²
Cg PL IL0
100
200
300
Controle
F1VPA
F2
Nº
de
cé
lula
s/0
,1m
m²
RESULTADOS
79
Figura 42: Densidade celular está inalterada nas camadas corticais do CPFm. (Controle: n=5; F1VPA:
n=3; F2: n=3).
5.5.2 – População Neuronal (NeuN)
Como forma de investigar se há modificação na distribuição neuronal,
quantificamos também células imunorreativas para NeuN, proteína nuclear presente
em todos os tipos neuronais (Mullen et al., 1992). Os primeiros resultados revelam
que, assim como na distribuição celular, também não são observadas alterações no
número de neurônios do CPFm nos animais experimentais (ANOVA de uma via
F(2,10) = 0,87 , p=0,45), como mostrado na figura abaixo (Controle: n=5; F1VPA: n=3;
F2: n=3) (Figura 43).
Figura 43: Densidade de células NeuN-positivas no CPFm (Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3). .
A distribuição neuronal entre as subáreas também não sofreu alterações nos
grupos experimentais. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via (Cg: F(2,10)
= 1,11, p=0,37; PL: F(2,10) = 0,83, p=0,47; IL: F(2,10) = 0,43, p=0,66). (Figura 44).
0 100 200 300
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Nº de células/0,1mm²
Cg
0 100 200 300 400
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Nº de células/0,1mm²
PL
0 100 200 300
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Controle
F1VPA
F2
Nº de células/0,1mm²
IL
Contr
ole
F1 VPA F2
0
50
100
150Controle
F1VPA
F2
Nº
de c
élu
las
/0,1
mm
²
RESULTADOS
80
Figura 44: Densidade neuronal nas sub-regiões do CPFm permanece inalterada nos grupos
experimentais (Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3) .
A densidade neuronal distribuída ao longo das camadas revela um discreto
aumento na densidade nos animais F1VPA e F2. Porém, esse dado só se mostrou
significatico na camada II/III no córtex prélimbico do CFPm, como pode ser
observado abaixo. As análises foram feitas com ANOVA de duas vias ANOVA de
duas vias (Cg: F(2,24)=1,50; p=0,24, com teste post-hoc significativo - camada II/III:
F1VPA x Controle p<0,05; PL: F(2,24) = 0,90, p=0,42; IL: F(2,24) = 0,46, p=0,63)
(Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3) (Figura 45).
Figura 45: Distribuição neuronal nas camadas corticais do CPFm (controle: n=3; F1VPA: n=3; F2: n=1). Dados foram analisados por ANOVA de duas vias e representam média ± erro padrão. *p<0,05
5.5.3 – Interneurônios GABAérgicos Expressando Parvalbumina
Uma vez que os animais F1VPA já foram previamente caracterizados com uma
redução na densidade de interneurônios parvalbumina positivos (PV+) no córtex pré-
frontal medial (CPFm) e em suas subdivisões, foi realizada também a quantificação
Cg PL IL0
50
100
150
Controle
F1VPA
F2
Nº
de
cé
lula
s/0
,1m
m²
0 50 100 150 200
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
*
Nº de células/0,1mm²
Cg
0 50 100 150 200
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Nº de células/0,1mm²
PL
0 50 100 150
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Controle
F1VPA
F2
Nº de células/0,1mm²
IL
RESULTADOS
81
desses neurônios nos animais da prole descendente F2. OS dados foram
subdivididos quanto a densidade neuronal por área, subáreas e por camadas (I, II/III
e V/VI). Foram consideradas células PV+ aquelas com o soma densamente
marcado, como mostrado abaixo (Figura 46).
Figura 46: Representação esquemática do mPFC com suas sub-areas delimitadas (Cg, PL and IL).
Os dados quantificados da densidade de PV+ em toda a área do CPFm
apresenta diferença entre os grupos avaliados. É possível observar que os animais
experimentais F1VPA possuem uma discreta redução de células PV+ quando
comparado com os demais grupos controle e F2 (Figura 47) (ANOVA de uma via
F(2,15) = 3,37, p=0,004).
Contr
ole
F1 VPA F2
0
1
2
3
4
5Controle
F1VPA
F2
Nº
de
cé
lula
s/0
,1m
m²
RESULTADOS
82
Figura 47: Densidade de células PV+ está reduzida nos animais F1VPA, enquanto na prole descendente F2 é observado um aumento nesse tipo neuronal. (Controle: n=6; F1VPA: n=6; F2: n=6). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão.
A densidade de células PV+ também foi quantificada nas subáreas do CPFm,
e os resultados mostraram que o aumento nesse tipo de interneurônio foi prevalente
no grupo F2 em todas as posições anatômicas analisadas nesse estudo. A análise
estatística foi significativa (ANOVA de uma via; Cg: F(2,10) = 1,35, p=0,29; PL: F(2,10) =
5,00 , p=0,02 com post-hoc significatico entre F1VPA x F2 p<0,05; IL: F(2,10) = 2,24,
p=0,14)(Figura 48).
Figura 48: A comparação entre as subáreas revela uma redução de células PV+ no PL dos animais F1VPAapenas em relação à F2 (Controle: n=6; F1VPA: n=6; F2: n=6). Dados foram analisados por ANOVA de uma via e representam a média ± erro padrão. *p<0.05.
A densidade de células PV+ por camada não revelou diferença significativa
entre os grupos ao longo do córtex cingulado, como pode ser observado na figura 49
(ANOVA de duas vias F(2,45)= 2,03, p=0,14) (Figura 49). Já no PL é possível observar
um aumento na densidade de PV+ na camada V/VI, estando a quantificação
discretamente aumentada na F2 quando comparado com o grupo controle (ANOVA
de duas vias F(2,45)= 6,34, p=0,003, com post-hoc significatico nas camadas V/VI
entre F1VPA x F2 p<0,05). Por fim, no IL não foi encontrada diferença entre os grupos
experimentais (ANOVA de duas vias F(2,45)= 3,56, p=0,036) (Figura 49).
Cg PL IL0
1
2
3
4
5
Controle
F1VPA
F2*
Nº
de
cé
lula
s/0
,1m
m²
RESULTADOS
83
Figura 49: A densidade de PV+ analisada por camada não demonstrou diferença estatística entre os
grupos no Cg (Controle: n=6; F1VPA: n=6; F2: n=6). Dados foram analisados por ANOVA de duas vias
ou de uma via e representam a média ± erro padrão.
Por fim, para avaliarmos a possibilidade dos neurônios PV+ estarem em
menor ou maior proporção no CPFm de animais F1VPA e F2, nós calculamos o
número de células PV+ e não-PV+ distribuído por mm² do CPFm. A partir desses
dados, realizamos o teste de Fischer, que foi significativo entre os grupos controle x
F1VPA (p=0,0371). Com isso, demonstramos que os animais experimentais do grupo
F1VPA apresentam uma redução proporcional no número de células PV+ nessa
região cortical.
Neurônios PV+ Outros neurônios Total
Controle 65 790 855
F1VPA 55 995 1050
F2 67 897 964
Total 187 2682 Tabela 1: Análise de contigência entre a distribuição de neurônios PV+ e não-PV+ no CPFm. (Controle: n=5; F1VPA: n=3; F2: n=3)
A partir dos dados apresentados, e considerando que as razões entre
neurônios excitatórios e inibitórios estão mantidas em animais dos 3 grupos
estudados, podemos sugerir que os animais F1VPA apresentem uma redução real do
número de interneurônios PV+ nas circuitarias neuronais do CPFm. No entanto,
algumas das análises realizadas apresenta uma potência estatística inferior a 0.95, o
que indica a necessidade de um maior número experimental para chegarmos a uma
conclusão mais definitiva. Uma vez que ainda estão sendo realizadas quantificações
0 2 4 6
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Nº de células/0,1mm²
Cg
0 2 4 6 8
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
*
Nº de células/0,1mm²
PL
0 2 4 6 8
Camada V/VI
Camada II/III
Camada I
Controle
F1VPA
F2
Nº de células/0,1mm²
IL
84
de celularidade total (DAPI) e neuronal (NeuN), o aumento do número amostral
poderá provocar discretas alterações nos dados expostos durante a apresentação
deste trabalho.
85
6. Discussão
DISCUSSÃO
86
O presente trabalho teve como principal papel investigar a geração F2
descendente do modelo animal de autismo induzido pelo ácido valpróico durante o
período embrionário, identificando traços comportamentais associados com modelos
animais transgênicos de autismo, assim como caracterizando seus perfis
histológicos na circuitaria neuronal no córtex pré-frontal medial. Também foram
avaliados a influência do cuidado materno no desenvolvimento pós-natal, cognitivo e
social desses animais, através de experimentos de adoção cruzada, com animais F2
recebendo cuidados maternos de mães controle, e de filhotes controle sendo
cuidados por mães previamente expostas ao VPA ainda no período embrionário.
Nossos resultados revelaram que o VPA é capaz de promover modificações
comportamentais e histológicas nos animais F2 descendentes daqueles expostos à
droga em E12. Porém, apenas o déficit social observado no modelo F1VPA também é
encontrado nos animais F2.
Inicialmente, A primeira característica que chamou a atenção nos filhotes F2
foi a ausência da quebra na cauda, fenótipo bastante presente nos animais expostos
ao VPA no período embrionário. Todos os animais experimentais F2 utilizados nesse
trabalho apresentaram a cauda sem nenhum tipo de quebra ou má formação, tendo
suas características morfológicas macroscópicas semelhante às encontradas nos
animais controle utilizados. A presença deste fenótipo em animais F1VPA, e a sua
não heritabilidade em F2, poderia ser explicada por ações momentâneas do VPA
sobre as células do tubo neural,. tais como alterações na comunicação
glutamatérgica mediada por receptores do tipo NMDA, que sabidamente afetam o
fechamento do tubo neural (Sequerra et al., 2018).
Com exceção deste traço fenotípico em animais F1VPA, nenhuma outra
alteração fenotípica óbvia foi observada nestes animais ou nos F2. No entanto, para
avaliarmos possíveis alterações no desenvolvimento pós-natal destes animais, nós
acompanhamos a curva de peso antes e após o desmame, e avaliamos a data de
abertura dos olhos. Enquanto os animais F1VPA apresentaram uma redução do peso
após o desmame (P28 e P35), os animais F2 apresentaram uma curva de peso com
médias semelhantes às encontradas no grupo controle. Esses resultados podem
sugerir que animais F1VPA e F2 são cuidados adequadamente por suas mães, e que
os primeiros teriam maior dificuldade para se alimentar nas primeiras semanas após
o desmame. Nossas observações na F2 estão de acordo com a literatura (Choi et
DISCUSSÃO
87
al., 2016b). Neste trabalho, animais experimentais foram gerados a partir do
cruzamento de camundongos machos VPA cruzados com fêmeas controle (F2) ou
destes animais com novas fêmeas controle (F3). A curva de peso foi realizada nas
primeiras 4 semanas após o nascimento, e não revelou diferença no peso dos
animais em relação ao grupo controle (Choi et al., 2016b).
Por outro lado, animais F1VPA e F2 demonstraram um atraso na abertura dos
olhos quando comparados aos controles, sugerindo que algumas das modificações
decorrentes da exposição pré-natal ao VPA podem estar sendo transmitidas para as
linhagens seguintes. Diversos trabalhos que utilizam o mesmo modelo animal
também tem indicado esse declínio na curva de abertura dos olhos, porém esses
estudos avaliaram apenas a geração diretamente exposta ao VPA (Schneider and
Przewłocki, 2005; Iijima et al., 2016)
Comportamentalmente, observamos não haver diferença no perfil locomotor
na geração F2 em comparação ao grupo controle, sem apresentar preferência pela
periferia, como foi observado no grupo F1VPA. O trabalho desenvolvido por Choi e
colaboradores (2016), por sua vez, relatou aumento na locomoção e presença de
traços de hiperatividade nos animais descendentes do VPA, sendo esse aumento
observado até a geração F3. O perfil de locomoção apresentado pelos animais
experimentais ocorreu principalmente no centro da arena, o que vai de encontro aos
resultados apresentados no nosso trabalho. Essa discrepância poderia ser explicada
por diferenças entre as espécies de animais utilizados: enquanto Choi et al (2016)
utilizaram camundongos C57Bl/6, animais que naturalmente apresentam maiores
índices de locomoção, nós utilizamos ratos Wistar..
A análise do comportamento de autolimpeza demonstraram que os animais
F2 tiveram comportamento semelhante ao apresentado pelo grupo controle, não
tendo sido encontrado aumento na duração dos eventos de autolimpeza,
comportamento característico desse grupo . Diversos modelos animais de autismo
têm mostrado o aumento na atividade de autolimpeza (McFarlane et al., 2008; Chao
et al., 2010; Peñagarikano et al., 2011), porém não existem relatos na literatura que
quantifiquem esses dados nas proles descendentes desses modelos animais.
É importante ressaltar que os dados referentes à autolimpeza foram
quantificados a partir dos vídeos da tarefa de atividade exploratória. Uma vez que os
animais estiveram em contato com um aparato comportamental que, além de ser
DISCUSSÃO
88
novo para eles, possuía atrativos exploratórios (orifícios nas paredes da caixa), é
possível que o tempo de autolimpeza esteja subestimado nessa análise. De maneira
ideal, o teste deveria ter sido realizado em um aparato experimental ao qual o animal
estivesse previamente habituado, sem a presença dos orifícios e, por fim, com um
tempo de duração maior que os 5 minutos utilizados na nossa tarefa. Com esses
ajustes, os efeitos presentes nos grupos experimentais poderiam ser melhor
avaliados.
O teste de interação social vem sendo utilizado como um parâmetro de
referência para estudos em modelos animais de autismo, uma vez que permite
validar um dos comportamentos mais clássicos encontrado no autismo (Nadler et al.,
2004; Schneider and Przewłocki, 2005; Page et al., 2009). A partir desse teste, é
possível avaliar a preferência do animal em permanecer em uma zona social em
companhia de um animal desconhecido ou em uma zona com um objeto.
Baseado nos dados apresentados, podemos sugerir a presença de um
padrão comportamental transmitido para a prole descendente dos animais F1VPA.
Mais especificamente, a transmissão desse comportamento social, uma vez que não
foram encontradas alterações no perfil locomotor e exploratório dos animais F2 em
relação ao grupo controle. Apesar de utilizar apenas machos VPA para geração da
sua prole F2, os resultados obtidos por Choi e colaboradores reforçam os descritos
nessa tese. Os animais apresentaram redução na sociabilidade, sendo observado
esse comportamento até a geração F3 (Choi et al., 2016b).
A transmissão de características comportamentais de origem parental já vem
sendo relatada na literatura durante a última década. Estudos em roedores
revelaram que proles submetidas a situações de estresse pós-natal podem
desenvolver traços tipo-depressivo nos animais, além de apresentarem maiores
níveis de ansiedade durante as tarefas executadas (Weiss et al., 2011). Além disso,
esse padrão comportamental pôde ser observado na geração F2 descendente das
fêmeas submetidas ao estresse pós-natal, reforçando a hipótese de que as
modificações no padrão de compactação da cromatina em resposta à um insulto
podem realmente ser herdadas e influenciar o perfil comportamental de gerações.
Uma vez que o processo de desmetilação dos gametas ocorre entre E8 e
E12.5 (Hackett et al., 2012; Seisenberger et al., 2012), exatamente no período de
injeção do VPA para obtermos os animais F1VPA, é possível que a linhagem
DISCUSSÃO
89
germinativa destes animais esteja sendo afetada, permitindo assim a transmissão
para as proles seguintes as modificações epigenéticas desencadeadas pela
exposição à droga. Alternativamente, alterações no comportamento de cuidados das
fêmeas F1VPA poderiam ser responsáveis pelas alterações comportamentais
observadas em F2 (McCarty, 2017). Apesar dos dados de curva de peso indicarem
que os filhotes F2 recebem cuidados maternos adequados durante o período pós-
natal, nós realizamos experimentos de adoção cruzada (ou cross-fostering) para
avaliar esta possibilidade.
Inicialmente, as curvas de peso dos animais mostram que não há variação
significativa do peso de animais durante a fase de amamentação, sugerindo que
tanto animais F2 cuidados por fêmeas controle como F1VPA recebem cuidados
similares. Apenas em P35 observamos uma pequena redução do peso de animais
F2 cuidados por mães F1VPA. Porém, é possível observar também que essa
diferença é encontrada basicamente nos filhotes que tiveram suas mães trocadas
por uma adotiva, o que poderia sugerir que o protocolo experimental pode estar
desencadeando alguma situação estressora e que só pode ser percebida já na fase
pré-púbere. Para eliminar esta possibilidade, novos experimentos serão necessários
para avaliar se a adoção cruzada, independente do VPA, pode afetar as curvas de
peso.
Os primeiros experimentos de adoção cruzada realizados por Barlow e
colaboradores, ainda na década de 70, acompanharam o desenvolvimento pós-natal
de filhotes Wistar que tiveram suas mães submetidas a situações de estresse
durante a gestação. Os grupos experimentais que utilizaram mães adotivas para
cuidar desses filhotes demonstraram que a adoção cruzada não foi um fator
determinante na diferença de peso, assim como no tempo de abertura dos olhos nos
animais estudados (Barlow et al., 1978). De maneira semelhante, Weiss e
colaboradores avaliaram o efeito do separação materna associado ao processo de
adoção cruzada em camundongos C57Bl/6J, e também relataram não haver
diferença no peso desses animais quando comparados com os controles cuidados
pelas suas próprias mães (Weiss et al., 2011).
Os testes comportamentais desenvolvidos nos grupos experimentais foram
realizados entre os dias P30 e P35. Os dados referentes ao teste de atividade
locomotora revelaram um aumento na locomoção apenas nos animais do grupo
DISCUSSÃO
90
VmV, quando comparados com os animais controle. É interessante observar que
esse aumento é encontrado da mesma forma nos machos e fêmeas. Esse resultado
vai de encontro aos dados previamente descritos para a F2, uma vez que esses
animais não apresentaram perfil de hiperlocomoção durante a execução da tarefa.
Uma possível justificativa para essa discrepância poderia ser o fato dos animais do
grupo controle utilizados nesse teste em específico terem apresentado um
desempenho de locomoção abaixo do esperado, quando comparado com resultados
obtidos para esse mesmo experimento em situações anteriores.
Análises da adoção cruzada sobre o comportamento exploratório em roedores
foram realizadas em camundongos da linhagem Swiss. Os resultados demonstraram
que animais que tiveram suas mães substituídas nas primeiras 24h após o
nascimento apresentaram um discreto aumento na locomoção, acompanhado de
redução na atividade exploratória (Bartolomucci et al., 2004). Os testes que
avaliaram presença de comportamento agressivo ou tipo-ansioso não apresentaram
diferença entre os grupos (Bartolomucci et al., 2004).
Por fim, o teste de interação social realizado nos animais controle e F2
submetidos à adoção cruzada, por sua vez, revelou dados bastante interessantes,
uma vez que houve redução no tempo de permanência dos na zona de interação
social em todos os grupos experimentais quando comparados com o grupo controle
CmC, incluindo os animais controle que foram adotados pela mãe F1VPA (CmV). Os
animais F2 também tiveram redução nesse parâmetro, e naqueles animais que
tiveram cuidado parental da mãe controle adotiva (VmC), essa queda foi ainda mais
significativa (Figura 32).
Esse resultado corrobora a hipótese de que o déficit social encontrado em
animais da F2 estaria realmente sendo herdado dos animais F1VPA. No entanto, a
modificação do ambiente também parece ser um fator importante para determinar os
baixos valores de interação social observados. Isso pode ser comprovado pelo
comportamento dos animais cuidados por mães adotivas (VmC e CmV), nos quais
os dois grupos apresentaram redução no tempo de interação social: a presença de
uma mãe adotiva controle, sem déficit social, ainda assim interferiu negativamente
nesse parâmetro comportamental dos animais F2, reduzindo mais ainda a interação
social nesses animais. Os filhotes controle, por sua vez, mesmo sem apresentar
DISCUSSÃO
91
carga genética que justificasse redução da interação social, passaram a apresentar
esse comportamento ao ser cuidado por uma mãe adotiva F1VPA.
O cálculo do Índice de Discriminação reforçou esse déficit social encontrado
nos grupos experimentais, com redução na preferência social em todos eles quando
comparado com o grupo controle CmC. Correlacionamos esses dados com a
distribuição de peso dos animais em P35, idade na qual os animais executaram a
tarefa de interação social, e observamos se existe correlação entre o desempenho
na tarefa e o peso. Vale lembrar que os animais que tiveram a mãe trocada tiveram
apresentaram baixo peso apenas nessa idade.
No gráfico de correlação abaixo, cada ponto no gráfico representa um animal,
e as cores correspondem à ninhada que cada um deles pertence. Os dados plotados
nos gráficos abaixo ajudam a esclarecer que o peso não parece ser determinante no
desempenho, uma vez que vemos animais de baixo peso e com alto desempenho
na tarefa. Além disso, a variabilidade nos valores do índice de discriminação social
parece estar mais presente nos grupos das mães adotivas (VmC e CmV), como
mostrado na figura 50.
VmC
80 100 120 140-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
Peso (g)
So
cia
l In
de
x
VmV
80 100 120 140-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
Peso
So
cia
l In
de
x
CmV
0 50 100 150-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
Peso
So
cia
l In
de
x
CmC
80 100 120 140-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
Peso
So
cia
l In
de
x
DISCUSSÃO
92
Figura 50: Gráfico de correlação de peso x índice de discriminação social. Cada ponto plotado representa um animal, e cada cor é referente à ninhada do grupo experimental.
Seria interessante que novos grupos experimentais fossem adicionados aos
resultados para esclarecer os resultados comportamentais obtidos pela F2. Um
grupo de filhotes controle, adotados por uma mãe também controle, assim como um
grupo de filhotes F2 descendentes de VPA, adotados por uma mãe também VPA.
Com isso, o possível efeito da adoção cruzada ficaria mais evidente.
No final da década de 90, o grupo de pesquisa liderado por Michael Meaney
passou a desenvolver trabalhos com roedores nos quais se categorizava mães como
―boas‖ ou ―más‖ cuidadoras, baseado no tipo de cuidado materno dado por elas às
suas proles. O cuidado materno era basicamente mensurado pelas taxas de
autolimpeza e lambidas executados nos seus filhotes, entre outros comportamentos.
A partir disso, os animais foram então submetidos a testes comportamentais já na
fase adulta, e os dados revelaram que os animais expostos a altos níveis de cuidado
materno desenvolvem uma melhor resposta ao estresse, com redução dos níveis de
corticosterona e ACTH (hormônio adrenocorticotrófico) (Liu et al., 1997), assim como
também desenvolvem um maior desempenho durante exploração em campo aberto.
Em conjunto esses dados demonstram que essas características transmitidas
através do cuidado materno podem estar sendo herdadas pelos seus descendentes.
Além das modificações comportamentais acima citadas, é importante
acrescentar que as fêmeas que foram expostas à altas taxas de cuidado materno
durante o período pós-natal também desenvolveram o mesmo tipo de cuidado
parental com suas respectivas proles, desencadeando nesses os mesmos efeitos de
resposta ao estresse. E, em experimentos de adoção cruzada, animais que foram
expostos a baixos níveis de ―lambidas‖ e ―autolimpeza‖, quando passam a receber
cuidado materno de mães mais presentes, passam a apresentar o mesmo perfil
encontrado nos animais bem cuidados (Francis et al., 1999).
O cuidado materno também induziu modificações na expressão gênica
desses animais. Análise da expressão de mRNA no hipocampo das proles expostas
ao cuidado materno revelaram um aumento na expressão do receptor de
glicocorticoide (GR), principalmente em CA1 e no Giro Denteado, reforçando a
influência desse tipo de comportamento em resposta ao estresse (Francis et al.,
1999). O mesmo aumento na expressão dos receptores foi observado quando os
DISCUSSÃO
93
animais foram expostos à cuidado pós-natais de uma mãe adotiva que realizava
muitos eventos de ―lambidas‖ e ―autolimpeza‖ nesses filhotes.
Weaver e colaboradores demonstraram que essas modificações na
expressão de GR estão associadas a redução nos níveis de metilação no promotor
do gene. Com isso, o fator de transcrição egr1 passa a se ligar mais facilmente na
região promotora, aumentando os níveis de de mRNA do GR. A infusão de um
inibidor de histona desacetilase (tricostatina A - TSA) foi capaz de reverter o efeito
desencadeado pelo cuidado materno, modificando os níveis de compactação da
cromatina e reduzindo a taxa de transcrição do gene (Weaver et al., 2004).
Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que insultos ambientais
que ocorram ainda na vida embrionária podem induzir alterações comportamentais
que podem ser herdadas pelas proles descendentes. Esses insultos ambientais
pode ocorrer desde a exposição à toxinas, ao estresse, ou até ao tipo de
alimentação que estamos expostos (Champagne, 2018). Já sabe-se que essa
transmissão de modificações epigenéticas desencadeadas por insultos ambientais
pode ocorrer através de alterações nas linhagens germinativas (Toth, 2015).
Inúmeros trabalhos tem demonstrado o envolvimento materno na transmissão
epigenética, mas é importante também investigar a influência parental nesse tipo de
herança.
Em roedores, a formação das linhagens germinativas ocorre já em E7. A partir
dessa idade embrionária, é iniciado o processo de proliferação e migração celular,
para em E12,5 ocorrer a diferenciação sexual nesses embriões. Os períodos de
proliferação e maturação das células germinativas vão variar de acordo com a
diferenciação sexual: enquanto os machos possuem vários períodos de proliferação
e diferenciação de células germinativas, nas fêmeas a gametogênese consiste em
um único período de proliferação e vários períodos de maturação das células
germinativas não replicantes (Marchal et al., 2004). Esse é um ponto importante,
uma vez que é durante o período de proliferação que o material genético se
encontra mais vulnerável a sofrer modificações na cromatina. É importante ressaltar
que ocorre um forte processo de hipometilação nessas células germinativas entre
E12,5 e E13,5 (Ueda et al., 2000). Uma vez que ocorre a compactação da
cromatina, a maquinaria transcricional e epigenética passam a não serem capazes
DISCUSSÃO
94
de promover modificações nas células germinativas no seu período final de
maturação (Bale, 2015).
Estudos realizados em roedores por Mashood e colaboradores buscaram
investigar a contribuição independente dos efeitos maternos e da herança
germinativa na transmissão de fenótipos paternos para sua prole. Para isso, machos
foram submetidos à restrição alimentar e posteriormente direcionados para acasalar
com fêmeas selvagens. Os resultados evidenciaram que, ao acasalarem com
machos que haviam sido expostos à restrição alimentar, as fêmeas aumentavam os
níveis de cuidado materno e não foram observadas modificações comportamentais
na prole. Em um grupo paralelo, fêmeas receberam o implante de embriões
derivados de machos previamente submetidos ao insulto, e os resultados
comportamentais observados revelaram a presença de déficit no crescimento, de
traços tipo-depressivos, além de aumento na expressão de genes envolvidos na
resposta ao estresse. Em conjunto, esses dados revelam que ocorre transmissão de
características epigenéticas de origem paterna, mas que estas podem ser
moduladas pelo cuidado materno (Mashoodh et al., 2018).
Diante do exposto, sugerimos que possíveis modificações nos níveis de
compactação da cromatina induzidas pelo VPA durante o período embrionário
podem ser transmitidas para a geração descendente, uma vez que o comportamento
social permanece alterado em animais F2, mesmo quando submetidos ao cuidado
materno de uma mãe controle. No entanto, esta alteração comportamental em
animais F2 parece ser consequência de modificações no circuito límbico diferentes
daquelas observadas nos animais F1VPA. Estudos futuros deverão avaliar outros
aspectos da circuitaria, a fim de compreender como o aumento ou redução de
neurônios PV+ podem contribuir para explicar os déficits sociais nos animais modelo
de autismo.
Independentemente da herança do comportamento observada neste e em
outros trabalhos ser mediada por alterações epigenéticas ou comportamentais,
podemos supor que as estruturas cerebrais envolvidas no controle dos
comportamentos estudados estejam alteradas. Em particular, podemos destacar o
CPFm tanto pelo seu envolvimento na fisiopatologia do autismo, quanto pelas
diversas alterações morfológicas encontradas em tecidos post mortem de pacientes
com autismo, assim como nos modelos animais (Courchesne and Pierce, 2005;
DISCUSSÃO
95
Courchesne et al., 2007). De fato, em humanos, o córtex frontal e cingulado anterior
estão diretamente envolvidos no processamento de tarefas que envolvem
linguagem, memória de trabalho, além de participar processos de percepção e
reconhecimento social, juntamente com outras áreas subcorticais (Mundy, 2003).
Considerando também a hipótese de desbalanço excitação/inibição no córtex
cerebral como possível causa de distúrbios comportamentais (Southwell et al.,
2014), nós investigamos a distribuição celular e neuronal nos grupos experimentais
F1VPA e F2, de forma a desvendar se a exposição ao VPA em animais F1 poderia
estar provocando alterações na citoarquitetura do CPFm herdáveis por animais F2.
Para isso, quantificamos células marcadas com DAPI para avaliar o número totais de
células, e NeuN para identificar os neurônios totais também presentes nessa região.
Nossos resultados parciais não revelam uma diferença significativa entre os grupos,
porém é possível observar que os animais dos grupos experimentais (F1VPA e F2)
apresentam um discreto aumento no número de neurônios totais. Possivelmente o
aumento do número amostral poderá revelar uma melhor discriminação da diferença
entre os grupos estudados. O aumento no número total de neurônios observadas
em animais F1VPA e F2 poderia sugerir que estes animais apresentam um aumento
na geração de neurônios ou uma redução da morte neuronal encontrada na vida
pós-natal (Wong et al., 2018).
Apesar do número de interneurônios GABAérgicos ser influenciado pela
atividade elétrica de neurônios excitatórios (Wong et al., 2018), o que poderia sugerir
um mecanismo de controle pós-nascimento da relação excitação/inibição, diversos
modelos animais de autismo revelam algum desbalanço nesta relação (revisado por
Lee et al., 2017). Uma possibilidade é que, independente dos números absolutos de
interneurônios GABAérgicos, determinados subtipos neuronais estejam sub-
representados, em particular os interneurônios PV+, que tem sido associados a
diversas patologias, como esquizofrenia, autismo e défici intelectual (Marín, 2012;
Ferguson and Gao, 2018). Nossos resultados indicam que a densidade de
interneurônios PV+ no CPFm de animais F1VPA e F2 é similar aos controles, apesar
de uma discreta diminuição observada nos animais F1VPA.
O discreto aumento da densidade neuronal total associada à diminuição da
densidade de interneurônios PV+ no CPFm de animais F1VPA poderia indicar que a
circuitaria neuronal destes animais apresenta um desequilíbrio entre os elementos
DISCUSSÃO
96
excitatórios e inibitórios. De acordo com esta possibilidade, nós observamos uma
redução de quase 50% na proporção de células PV+ entre os neurônios totais.
Em recente pesquisa desenvolvida por Fontes-Dutra e colaboradores, os
autores também caracterizaram a distribuição neuronal através da marcação com
NeuN, e também de interneurônios PV+, no córtex somatossensorial primário e
amigdala em ratos expostos ao VPA durante o período embrionário. Os resultados
obtidos pelo grupo revelaram uma estabilidade do número total de neurônios nos
animais experimentais e controles. Porém pôde ser observado que há uma alteração
na distribuição de neurônios PV+ ao longo das camadas do córtex somatosensorial,
que se encontram reduzidos nas camadas IV/V, e aumentados nas camadas II/III.
Na amígdala, o efeito da perda de neurônios PV+ só é observada quando o dado é
normalizado pelo número de neurônios totais. Curiosamente, a utilização do
resveratrol, um fármaco antioxidante e anti-inflamatório foi capaz de reverter os
efeitos celulares observados nos animais VPA, conseguindo resgatar a densidade
de células PV+ nesse grupo experimental (Fontes-Dutra et al., 2018)
A distribuição de neurônios PV+ também tem sido caracterizada em outros
modelos animais de autismo, além do modelo VPA. Houve redução no número de
células desse subtipo neuronal nos córtex parietal e occipital, sendo o efeito
observado em animais do modelo VPA e em animais knockout para NLG-3 (Gogolla
et al., 2009). Análises realizadas nos córtices auditivo (Anomal et al., 2015) e
somatossensorial (Iijima et al., 2016) também não observaram diferença no número
de células PV+, apesar de ser descrita uma redução nos níveis proteicos de
parvalbumina nas amostras analisadas.
Em paralelo aos resultados obtidos em animais, um recente trabalho
desenvolvido por Hashemi e colaboradores descreveram a redução de neurônios
PV+ em análises de tecidos post-mortem no PFC de pacientes diagnosticados com
autismo (Hashemi et al., 2017), demonstrando a reprodutibilidade dos dados obtidos
em experimentação com os observados em humanos.
Apesar dos nossos resultados sugerirem uma menor proporção de
interneurônios PV+ na circuitaria neuronal do CPFm, outros trabalhos sugerem que
pode ocorrer uma redução da expressão de PV em modelos animais de autismo
(Shank) e que isso explicaria a redução do número de células PV+ identificadas por
imunohistoquímica (Filice et al., 2016). No entanto, mesmo considerando que a
DISCUSSÃO
97
proporção de interneurônios esteja mantida, uma menor expressão da proteína PV
provavelmente alteraria as propriedades elétricas destes interneurônios, o que
também poderia produzir alterações no funcionamento do circuito. Seguindo essa
mesma linha, Lauber e colaboradores utilzaram o modelo animais de autismo por
exposição ao VPA no período embrionário. Os resultados obtidos apontaram que o
fármaco induziu uma redução no número de células PV+, assim como redução nos
níveis de expressão de mRNA do gene Pvalb e nos níveis protéicos de PV apenas
no estriado desses animais, Não foram encontradas alterações no CPFm e córtex
somatosensorial nesse modelo (Lauber et al., 2016).
Para avaliar se o aumento de PV+ poderia estar relacionado com os
diferentes índices de discriminação social encontrados nos grupos experimentais,
nós correlacionamos estas duas variáveis utilizando dados dos animais que
passaram pelo teste comportamental e foram processados histologicamente (Figura
58).
Curiosamente, a comparação entre os dois fatores sugere que a proporção de
células PV+ no CPFm não influencia o índice de discriminação social, como
mostrado na figura 58. Em outras palavras, poderíamos inferir que a diminuição ou
aumento na proporção de interneurônios PV+ não possui relação com a piora ou
melhora, respectivamente, no desempenho social dos animais (Figura 51).
Figura 51: Análise de correlação entre o índice de Discriminação Social e a densidade de células PV+. Dados foram analisados com teste de Spearman (Controle: n=3; F1VPA: n=1; F2: n=6). * Dados
Índice de Discriminação x Distribuição PV/NeuN
0.00 0.02 0.04
0.0
0.5
1.0Controle
F1VPA
F2
F1VPA *
Número células PV+/NeuN+
Índ
ice
de D
isc
rim
ina
çã
o
DISCUSSÃO
98
estimativos de animais F1VPA que foram analisados histologicamente, mas não foram avaliados no teste de interação social. O valor do índice de discriminação utilizado corresponde à média do grupo.
No entanto, essas análises precisam ser confirmadas com um maior número
de animais avaliados comportamental e histologicamente. Como pode ser observada
na figura 58, apenas 6 animais dos nossos grupos tiveram tais análises, impedindo-
nos de fazer uma análise de correlação mais completa entre as alterações na
histologia cortical e no comportamento exploratorio e social dos animais utilizados
em nosso trabalho. No futuro, pretendemos selecionar os animais para quantificação
histológica a parir dos seus desempenhos comportamentais, a fim de melhor
representar animais com baixos e altos índices de discriminação social. Dessa forma
os resultados poderiam esclarecer melhor a relação e influência que a distribuição
neuronal tem no comportamento social. Além disso, propomos a utilização de
poucos animais provenientes de muitas ninhadas diferentes, aumentando assim a
variabilidade inerente às diferentes gestações e exposição ao VPA.
Uma vez que não foram encontradas alterações no número total de neurônios
no presente estudo, a redução de neurônios PV+ ainda pode estar sofrendo
compensação por outras subclasses de interneurônios GABAérgicos. Por isso, é de
fundamental importância quantificar a população total de neurônios inibitórios, para
que, dessa forma, possamos entender como o VPA influencia o balanço nos níveis
de inibição e excitação neuronal.
Nosso trabalho é o primeiro a caracterizar a citoarquitetura neuronal no córtex
pré-frontal em animais F2 descendentes de ratos expostos ao VPA no período
embrionário a partir da distribuição de neurônios totais e também interneurônios
PV+. Choi e colaboradores relataram uma redução na expressão das proteínas
sintetizadoras de GABA (GAD65 e GAD67), acompanhado de um aumento na
expressão de proteínas excitatórias pós-sinápticas (Choi et al., 2016b). Nossos
dados, por sua vez, não revelaram um desbalanço na prole F2, uma vez que o
aumento de PV+ parece estar acompanhado de um aumento na densidade
neuronal, anulando o possível efeito desse aumento na citoarquitetura do CPFm.
Diante do exposto, sugerimos que possíveis modificações nos níveis de
compactação da cromatina induzidas pelo VPA durante o período embrionário
podem ser transmitidas para a geração descendente, uma vez que o comportamento
social permanece alterado em animais F2, mesmo quando submetidos ao cuidado
DISCUSSÃO
99
materno de uma mãe controle. No entanto, esta alteração comportamental em
animais F2 parece ser consequência de modificações no circuito límbico diferentes
daquelas observadas nos animais F1VPA. Estudos futuros deverão avaliar outros
aspectos da circuitaria, a fim de compreender como o aumento ou redução de
neurônios PV+ podem contribuir para explicar os déficits sociais nos animais modelo
de autismo.
100
7. Conclusão
CONCLUSÃO
101
O presente trabalho buscou investigar pela primeira vezos efeitos
transgeracionais desencadeados pela exposição parental ao VPA ainda na vida
embrionária. Para isso, foram avaliados animais descendentes F2, através de
análises comportamentais e celulares. Os resultados demonstraram alterações no
desenvolvimento pós-natal, assim como redução na sociabilidade desses animais.
Esse efeito foi ainda mais intenso no grupo F2 cuidado por mães adotivas controle,
demonstrando que os cuidados por essas fêmeas não apenas foi insuficiente para
reverter os baixos níveis de interação social apresentado pelo animais F2, mas
também agravou esse déficit social nos animais. A análise histológica revelou
alterações na proporção de interneurônios PV+ no CPFm em animais F1VPA.
Também foi observadao um discreto aumento do número total de neurônios no
CPFm em animais F1VPA e F2, sugerindo que alterações distintas na organização da
circuitaria neuronal podem estar presentes nos dois grupos de animais. Os dados
apresentados indicam que a exposição pré-natal ao VPA induz alterações
comportamentais que podem ser transmitidas aos seus descendentes. Esses
resultados iniciais são importantes para o entendimento de como genoma e
ambiente contribuem na etiologia do autismo. No entanto, investigações adicionais
serão necessárias para identificar os mecanismos precisos da herdabilidade
observada no comportamento de animais F2. Estudos que investiguem modificações
na estrutura do genoma desses animais podem trazer mais informações que
contribuam no entendimento do funcionamento do cérebro no autismo.
102
8. Referências
REFERÊNCIAS
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