Hemoglobinúria Paroxística NoturnaDiagnóstico e Tratamento

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Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica

Hemoglobinúria Paroxística NoturnaDiagnóstico por Citometria de Fluxo

• Doença HPN• HAM x Citometria de Fluxo• Antígenos envolvidos• Tamanhos de clones HPN na HPN• Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica)

Clones HPN em Desordens medulares: MDS(Anemia Refratária), Mielopatias (Mielofibrose/ LMC)

• Experiência do HIAE e Conclusão

A Doença: Hemoglobinúria Paroxística Noturna

• Expansão clonal adquirida, não maligna de células-tronco hematopoéticas

• Hemoglobinúria noturna, icterícia, hemosiderinúria• Mutação somática adquirida do gene PIG-A• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de

proteínas de superfície• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:

CD55 e CD59 , ambas proteínas inibidoras do complemento e, associadas à patogênese da doença clínica.

A Doença: Hemoglobinúria Paroxística Noturna

• Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia• Prevalência: < 1/100.000 (rara)• Sobrevida: 10 a 15 anos • Morte: trombose ou citopenias progressivas

raramente transformação leucêmica (<5%)• Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e

alguns evoluem para remissão espontânea. • Hemólise intravascular crônica com exacerbações. • Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de

ferro.• A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas

(S.Budd Chiari). • Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem

menor probabilidade de trombose.

Quadro laboratorial• Sangue Periférico

– Anemia, Reticulocitose– Leucopenia e granulocitopenia– Deficiência de ferro

• Medula óssea– hiperplasia eritróide– aplasia

• Urina– Hemoglobinúria– Hemossiderinúria

Scottish Charles - 1794 (cirurgião)Strübing Paul - 1882 (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose. Defeito no G.V.)Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegaliae hemoglobinúria e hemosiderinúria)

Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects of the haemolytic mechanism with special reference to serum complement.

J Clin Invest 1939;18:657–72.

GV com HPN são susceptíveis à lise com complemento

37°C / HCL / pH Medida colorimétrica da Hb livreHPN: lise de 5% a 80% dos G.V.

Teste de HAM

• Não existe Falso (-)• Existe Falso (+)Diseritropoese congênita tipo II , mas não se

o soro do paciente for utilizado ou se os globulos vermelhos do paciente já foram lisados com anticorpo à frio. Portanto o Teste de Coombs deve ser realizado em paralelo e se (+) invalida o teste de Ham.

AHAI > HPN

Teste de HAM

Âncora Glicosil Fosfatidil InositolGPI

âncoraGPI

1980. Low et cols.

proteína ancorada

etanolamina

glican

inositolfosfato

glucosamina

membrana celular1,2 diacilglicerol

C-terminal

NH2

âncora através da

qual um peptídeo se

fixa àsuperfície

das células

Normal HPN

A deficiência da âncora GPI resulta na perda de várias proteínas da superfície da célula.

camada bilipídica

Mutação de gene PIG-A defeito na

acetilglucosaminil

transferase

Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol

Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPI

EnzimasAcetilcolinesteraseFosfatase Alcalina LeucocitáriaADP-ribosil transferase

Moléculas de adesãoAntígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58CD66b

Proteínas de superfície reguladoras de complemento Decay accelerating factor - DAF - ou CD55Homologous Restriction Factor HRFMembrance inhibitor of reactive lysis MIRL ou CD59

Proteínas que se ligam a membrana celular através da âncora GPI

ReceptoresFc-γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16) Antígeno de diferenciação monocitária (CD14)

Antígenos eritrocitáriosYt antigens (AchE) Holley Gregory antigen

Antígenos neutrofílicosNB1/NB2

Outras proteínas de superfície de função desconhecidaCAMPATH-1 antigen (CDw52) CD24 GP500

CD55 - DAFDecay Accelerating Factor

Participa do controle da ativação do Complemento na superfície da célula

Reduz a ação do complexo C4bC2a impedindoa ativação de C3

Sua deficiência isoladamente não justifica o quadro clínico

CD59- MIRL MembraneInhibitor of Reactive Lysis

Inibe a formação de C9 cujo complexo resultana lise da célula

Inibe a interação com C8 e C9

Sua inibição resulta em hemólise

Sua reintrodução restaura a resistência aoComplemento

CD14 - Receptor da proteina que se liga à endotoxina

O LPS (lipopolissacaride da parede bacteriana) ligada à uma proteina séricaespecífica se liga à superfície de monócitos e macrófagos através deste receptor.

Este complexo resulta na liberação de citoquinas TNF-α, IL-4 e IL-6.

(+)(+)(+)(+)(+)Proteina Prion

(+)(+) - linf TCD 90

(+)(+)CD 52

Outros

(+) - linf T(+)(+)CD 87 (u-PAR)

(+) - linf B(+)CD 16 (Fc�RIII)

(+)CD 14

Receptores

(+)(+)CD 157

(+)Fosfatase Alc.Leucocitária

(+)Acetilcolinesterase

Enzimas

(+)CD66b e CD66c

(+)CD 58 (LFA-3)

(+)(+)(+)CD 48

Moléculas de Adesão

(+)(+)(+)(+)(+)(+)CD 59 (MIRL)

(+)(+)(+)(+)(+)CD 55 (DAF)

ReguladorasComplemento

HSCLinfocitosPltsMonocitosPMNG.V.

MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA

Hoffbrand A. V.;Catovsky D.; Tuddenham E.G.D. Postgraduate Haematology –2005 5a Ed. Blackwell Publishing

Citometria de Fluxo

Van der Schoot, 1990

EritrócitosGranulócitosMonócitosLinfócitosPlaquetas

CD55 DAF

CD59 MIRL

Fotomultiplicadores

Digitalização

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45 FITC ->

Modos de Apresentação

Citometria de Fluxo

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Sistema Hidrodinâmico

FL2

Injeção daamostra

Detectores

FSC

SSC

FL1

FL3Impulsos Elétricos

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Citometria de Fluxo de células HPN com anti CD59 em eritrócitos

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Tipo I : NormalCélulas HPN Tipo II

Células HPN Tipo III

anti-CD59 Eritrócitos

Hall e Rosse, 1996

Controle isotipo

(b) Células de HPN l e HPN III (c) Discreta população de CélulasHPN I, HPN II e HPN III (d) Discreta população de CélulasHPN I e HPN II (transiçãoindistinta)(e) Células HPN III(f) Células HPN II indistintas das

Células HPN I e HPN III

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CD55 e CD59 em Granulócitos

Controle isotipo CD 59 CD 55

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CD55 e CD59 em Eritrócitos

Controle isotipo

CD 59 CD 55

CD14 em Monócitos������ �����

��������Controle isotipo

Atenção !

Interessante

• Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitosCD55/CD59 negativos devido à hemólise.

• Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida médiamaior do que os eritrócitos com CD 59 negativos.

• A severidade da anemia por hemólise e hipoplasia nãoestá correlacionada com o percentual de CD59 positivos

Fujioka 1994

Diagnóstico por Citometria de Fluxo

Gold Standart

Praticidade

Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)

Eritrócitos: interferentes na avaliação do clonemeia-vida diminuídatransfusões

Detecção de pequenos clones

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Células HPN na HPNExpressão variável de antígenos ligados através do GPI em 3 linhagens celulares

Sharon 1996

Pacientes com menos de 20% de células anormais raramente apresentam hemoglobinúria mas podem ter hemólise e hemossiderinúria.

Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5% de glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia hemolítica.

Clone de células HPN III maior que 60%, apresentam hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por razões desconhecidas

Interessante

Indicação de Pesquisa de célulasHPN

Pancitopenias sem causa definida,principalmentese apresentar reticulocitose

Tromboses de repetição sem causa definida

Hemólise intravascular sem causa definida

Clone de células HPN em síndromes defalência medular

Anemia AplasticaHPN Mielodisplasia

11/29 pacientes com Anemia Aplástica (38%) com presença de células HPN.Schubert J, 1994

Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%)

.574 / 65 (6.2)0 / 21 (0)Progressão para SMD avançada ou LMA (%)

.0020 / 8 (0)7 / 9 (77.8)Resposta terapêutica a ciclosporina (%).0191 (9-126)31 (4-121)Contagem de plaquetas (x 103/µL)

.0121 / 64 (32.8)1 / 21 (4.8)Anormalidades cariotípicas (%)

PAR

HPN (-)AR

HPN (+)

Wang H, 2002 Blood

Pesquisar células HPN em todos os pacientes com falência de medula óssea antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica.

• Relação entre HPN e AAA• Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode

evoluir para AA• AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por

linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC• HPN-Expansão de clone de célula T anormal• Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN• HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao

stem cell e mutação somática do gene PIG-A• Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população

normal em 10/1.000.000

Clone de células HPN em sindromes de falência medular

Pesquisa de HPN• Exames realizados desde 19/01/2004;

• Até 29/03/2007: 107 solicitações;• 5 casos positivos (4,7%).

• Técnica• CD 55 – PE / CD59 – FITC (Immunotech)• CD 14 (clone My4) – PE (Coulter)• CD 64 – FITC (Immunotech)• CD13 – PE (B.D.)• Glicoforina A (CD235) – PE (Dako)

Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223-23342: 234-238 – Aug 15, 2000

Pratical Haematology – Dacie JV., Lewis SM

Controle de Qualidade• Proficiência através dos interlaboratoriais

• CAP - desde Abril/2006; -média de 51 laboratórios participantes.CD55/CD59

• UKNEQAS - desde Novembro/2004;média de 65 laboratórios participantesCD55/CD59/CD14CD16 / CD24 / CD66b

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Hemácias

Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5%

Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) = 100,0%

Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 - Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)

RTS, 16 anos – 16/05/2006 Hemácias -não realizado, pois recebeu

transfusão. Neutrófilos:

Controle normal: CD55(+) = 99,0%

Ausência de expressão de CD55 em 5,7% dos neutrófilos

RTS, 16 anos – 16/05/2006 - Neutrófilos

Controle normal: CD59(+) = 99,3%Ausência de expressão do CD59 em 6,1% das células CD13 (+).

RTS, 16 anos – 16/05/2006 – Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99,0% Ausência de expressão do CD14 em 14,3% das células CD64+.

HPN – Acompanhamento e Terapêutica

• Tratamento de suporte: Ácido fólico, ferro suplementar se necessárioTransfusãoCorticóide – controversoprofilaxia com anticoagulante em caso de tromboseterapia trombolítica (tPA)

• Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina• Eculizumab – inibe a ativação do complemento (C5)

reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e diminui a necessidade de transfusão

Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): 59-62 -2000.Hillmen P., Hall C., Marsh JC. New England Journal of Medicine 350: 552-9 2004

Conclusões

O estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico de HPN devido à maior sensibilidade.

As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos.

A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de células com deficiência parcial ou total das proteínas dependentes de GPI,

Mesmo após crises hemolíticas severas, pode-se analisar a ausência de expressão na população de leucócitos.

• EQUIPE •• Ana Claudia M. Brito

João Carlos C Guerra• Nydia Strachman Bacal• Alexandra M.Cavalcante• Ruth Hissae Kanayama• Sonia Tsukasa Nozawa

• Obrigada !

• nsbacal@einstein.br• hemato@chsp.org

Gene PIG-A

Miyata, 1993 Science

Localizado no braço curto do cromossomo X

Xp22