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1
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINSCAMPUS UNIVERSITÁRIO DE PALMAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS DO AMBIENTE
WEILAN GOMES DA PAIXÃO MELO
DISTRIBUIÇÃO BIOGEOGRÁFICA DE LEVEDURAS ASSOCIADAS
A EXSUDADOS DE CALOPHYLLUM BRASILIENSE (CLUSIACEAE),
EM ÁREAS DE ECÓTONO DA PLANÍCIE DO ARAGUAIA -TO
PALMAS-TO
2009
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WEILAN GOMES DA PAIXÃO MELO
DISTRIBUIÇÃO BIOGEOGRÁFICA DE LEVEDURAS ASSOCIADAS
A EXSUDADOS DE CALOPHYLLUM BRASILIENSE (CLUSIACEAE),
EM ÁREAS DE ECÓTONO DA PLANÍCIE DO ARAGUAIA -TO
PALMAS-TO
2009
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências do Ambiente da Universidade Federal do Tocantins, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências do Ambiente.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Paula Benevides deMorais
ii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)Biblioteca da Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Palmas
Bibliotecário: Paulo Roberto Moreira de AlmeidaCRB-2 / 1118
TODOS OS DIREITOS RESERVADOS – A reprodução total ou parcial, de qualquer forma ou por qualquer meio deste documento é autorizado desde que citada a fonte. A violação dos direitos do autor (Lei nº 9.610/98) é crime estabelecido pelo artigo 184 do Código Penal.
M528d Melo, Weilan Gomes Paixão
Distribuição Biogeográfica de Leveduras Associadas a Exsudados de Calophyllum brasiliense (Clusiaceae), em Áreas de Ecótono da Planície do Araguaia – TO/Weilan Gomes da Paixão Melo –Palmas, 2009. 72 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Tocantins, Curso de Pós-Graduação em Ciências do Ambiente, 2009.
Orientadora: Profª. Drª. Paula Benevides de Morais.
1. Biogeografia 2. Leveduras 3. Planície do Araguaia. I. Título.
CDD 628
iii
TERMO DE APROVAÇÃO
WEILAN GOMES DA PAIXÃO MELO
DISTRIBUIÇÃO BIOGEOGRÁFICA DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A EXSUDADOS DE CALOPHYLLUM BRASILIENSE (CLUSIACEAE), EM ÁREAS
DE ECÓTONO DA PLANÍCIE DO ARAGUAIA –TO
Dissertação apresentada e aprovada ao Programa de Pós-graduação em Ciências do Ambiente da Fundação Universidade Federal do Tocantins – PGCIAMB/UFT, como requisito parcial para obtenção do título de mestre, pela seguinte banca examinadora:
Prof.ª Dr.ª Paula Benevides de Morais – OrientadoraUniversidade Federal do Tocantins – UFT
Prof. Dr. Luiz Henrique RosaUniversidade Federal de Minas Gerais – UFMG
Prof. Dr. Raphael Sanzio PimentaUniversidade Federal do Tocantins – UFT
Palmas, 23 de Março de 2009
iv
À minha mãe Marineide, minhas irmãs Wilma e Wélita, pelo amor, confiança e incentivo.
Dedico
v
AGRADECIMENTOS
À Deus por me iluminar em todos os dias da minha vida;
À Drª. Paula Benevides de Morais, pela orientação, oportunidade, apoio, amizade carinho e
ensinamentos durante todos esses anos;
Ao Prof. Dr. Carlos Rosa, que tão gentilmente nos ajudou com a identificação dos
microrganismos;
Ao Dr. Raphael Pimenta e a Drª. Ana Kleiber pelos ensinamentos e apoio em diversas
ocasiões;
Ao Dr. Waldesse Piragé e Msc. Rodney Viana, pela contribuição em algumas análises;
À Cristiane Martins, técnica do Laboratório, mas principalmente amiga, que não mediu
esforços na execução deste trabalho;
À minha mãe e minhas irmãs que, mesmo de longe, me deram força e determinação para
que eu não desistisse em nenhum momento;
Às minhas queridas amigas, que são a extensão da minha família: Denise, Laciene, Fran e
Zenilde. E em especial a Denise por tão sincera amizade, pelo companheirismo, pela
atenção, preocupação, pelas trocas de idéias;
À todos os meus amigos do LAMBIO: Fran, Laciene, Denise, Deusiano, Cristiane, João
Vitor, Renata, Fabrício, Amaraina, Thalyne, Bruna, Camila, Gabriel, Clesio, Gisele,
Thiago, Licia, Anelise, Alexandre, Daiane, Jil-Vanny, Danielle, Luciano, Gustavo, Francis.
Por tornar os trabalhos tão agradáveis e descontraídos, meu muito obrigado;
À meu amigo e motorista da universidade, Alberico Rocha. Obrigada pela paciência e
experiência nas coletas;
vi
À todos que contribuíram com as coletas de microrganismos: Cristiano, João, Eduardo,
Alberico, Silvia, Tatiana, Clesio, Samir, Vicente, Jil, Dani, Fran, Ana, Renata,
Thalyne...Obrigada pela colaboração;
Ao curso de mestrado em Ciências do Ambiente por me proporcionar esta chance de
crescimento;
Aos professores do Mestrado em Ciências do Ambiente, pelos conhecimentos passados;
Aos colegas de mestrado, fica aqui a saudade da nossa convivência;
Ao DAAD, Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico, pela concessão da bolsa de estudo;
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
“Ser irmão é entrelaçar os destinos e ouvir a voz do semelhante que chama, que pede, que
reclama e que chora. Ser irmão é ser feliz com a felicidade do outro, é rir com as alegrias
do próximo e ser solidário nas boas e nas más horas da vida”. A vocês, meus
irmãos/amigos, minha gratidão de coração!
vii
"É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar;
é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver ..."
Martin Luther King
viii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................x
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................x
LISTA DE ANEXOS.......................................................................................................xi
LISTA DE SÍMBOLOS..................................................................................................xi
RESUMO........................................................................................................................xii
ABSTRACT..................................................................................................................xiii
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
2 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................3
2.1 BIOGEOGRAFIA........................................................................................................3
2.2 FRAGMENTAÇAO FLORESTAL.............................................................................4
2.3 IPUCAS........................................................................................................................5
2.4 CALOPHYLLUM BRASILIENSE CAMBESS.............................................................6
2.5 EXSUDADO VEGETAL.............................................................................................9
2.6 LEVEDURAS.............................................................................................................10
2.7 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)..........................................................14
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................17
3.1 Localização da área de estudo ....................................................................................17
3.2 Estimativa do padrão de distribuição espacial para C. brasiliense e comunidades de
leveduras...........................................................................................................................18
3.3 Coleta das amostras.....................................................................................................19
3.4 Isolamento de leveduras, descrição morfológica e purificação...................................19
3.5 Armazenamento...........................................................................................................20
3.6 Caracterização fisiológica e identificação dos isolados...............................................20
3.6.1 Assimilação de Carboidratos.....................................................................................21
3.6.2 Assimilação de Compostos Nitrogenados.................................................................21
3.6.3 Assimilação de Compostos Amilóides e Osmotolerância.........................................21
3.6.4 Teste para Diferenciação de Basidiomicetos (DBB).................................................22
3.6.5 Produção de Ácidos...................................................................................................22
3.6.6 Teste de Fermentação................................................................................................22
ix
3.6.7 Tolerância a altas temperaturas.................................................................................23
3.7 Utilização da técnica de RAPD-PCR...........................................................................24
3.8 Sequenciamento do rDNA...........................................................................................25
3.9 Comparação das comunidades de leveduras................................................................25
3.10 Índice de diversidade de leveduras de C. brasiliense................................................25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................26
4.1 Distribuição espacial do C. brasiliense Camb. e comunidades de leveduras..............26
4.2 Inventario taxonômico das leveduras associadas a exsudados de C. brasiliense........28
4.3 Perfil fisiológico das leveduras de exsudado de C. brasiliense...................................34
4.4 Identificação presuntiva dos isolados de leveduras.....................................................39
4.5 Utilização da técnica de RAPD....................................................................................41
4.6 Diversidade de leveduras.............................................................................................45
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................49
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................51
ANEXOS...........................................................................................................................64
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Número de amostras e isolados de leveduras de exsudado de Calophyllum brasiliense na área de estudo................................................................................................. 28
Tabela 02 - Leveduras isoladas de exsudados de Calophyllum brasiliense em três áreas da Planície do Araguaia- TO. ..................................................................................................... 32
Tabela 03 - Perfil fisiológico de cada comunidade de leveduras de exsudado de C. brasiliense nas áreas estudadas ............................................................................................. 34
Tabela 04 - Perfil de assimilação (%) de todas as espécies de leveduras de exsudado de C. brasiliense nas três áreas. ...................................................................................................... 36
Tabela 05 - Espécies de leveduras agrupadas em clusters e números de isolados por cluster............................................................................................................................................... 44
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fragmento florestal natural – Ipuca: A – Ipuca em Campo limpo; B – Ipuca em área de pastagem...................................................................................................................... 6
Figura 2- A: Árvore de Calophyllum brasiliense; B: Calophyllum brasiliense em floração.. 7
Figura 3 – Exsudado vegetal liberado de algumas plantas.................................................... 10
Figura 4: Mapa de localização das áreas estudadas............................................................... 17
Figura 5: Parcelas marcadas entre as árvores de Calophyllum brasiliense ........................... 18
Figura 6: A: Árvores de C. brasiliense marcadas e numeradas, B: coleta dos exsudados .... 19
Figura 7: Características morfológicas das leveduras ........................................................... 20
Figura 8: Assimilação de carboidratos. Metodologia da Réplica platting. ........................... 21
Figura 9: Formação de halo de hidrólise (seta) ..................................................................... 22
Figura 10: Exemplo de fermentação, gás capturado nos tubos de Durhan (seta).................. 23
Figura 11: Cartão de Wickerham - Escala de avaliação de concentração celular, indicando a forma comparativa (TOSTA, 2004). ..................................................................................... 24
Figura 12. Distribuição de Calophyllum brasiliense e comunidades de leveduras nas três áreas estudadas (Pi 1,0 - distribuição aleatória; 1,0 Pi 1,5 - tendência ao agrupamento; e Pi 1,5 – distribuição agrupada). ...................................................................................... 27
xi
Figura 13: Porcentagem de gêneros de leveduras isolados de Calophyllum brasiliense ...... 29
Figura 14 – Distribuição das espécies de leveduras de exsudado de Calophyllum brasiliensepor área de ocorrência............................................................................................................ 39
Figura 15 - Dendrograma gerado a partir dos dados de similaridade genética de isolados de leveduras de C. brasiliense por meio de marcadores RAPD................................................. 43
Figura 16 – Índice de diversidade de espécies de leveduras de Calophyllum brasiliense. ... 46
Figura 17 - Área 01: A- Borda da Ipuca, B- Interior e C- Varjão sujo e campo de murundus............................................................................................................................................... 47
LISTA DE ANEXOS
Anexo A – Meios de cultura utilizados..................................................................................64
Anexo B - Listagem com a identificação das leveduras ascomicéticas de exsudados de C.
brasiliense, área de isolamento e árvore em que foi obtido o isolado....................................69
Anexo C - Listagem com a identificação das leveduras basidiomicéticas de exsudados de C.
brasiliense, área de isolamento e árvore em que foi obtido o isolado....................................71
LISTA DE SÍMBOLOS
% - Porcentagem (por cento)m - Metrom2 - Metro quadradomm - milímetros °C - Graus Celsiusµl - microlitrosml - MililitromM - milimolarµg - Microgramaμm - MicrometrosL - Litromg - Miligrama mg/L - Miligrama por litrog - Gramash. - Horap/v - Peso por volumepH - Potencial HidrogeniônicoKm - Quilômetros
xii
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo verificar a biogeografia da comunidade de leveduras associadas a exsudados da espécie vegetal Calophyllum brasiliense (Clusiaceae) em três áreas no mosaico ecotonal da Planície do Araguaia – Tocantins. Foram realizadas quatro coletas entre os meses de março a junho de 2008 em que foram obtidos 156 amostras e 173 isolados de leveduras. Os isolados foram submetidos a identificação polifásica que incluiu testes fisiológicos e morfologia celular, RAPD e confirmação de identidade por sequenciamento do domínio variável D1/D2 da subunidade maior do rDNA e a região espaçadora interna de transcrição gene 5.8S. A distribuição das leveduras ocorreu de forma agregada em todas as áreas, enquanto C. brasiliense apresentou distribuição aleatória na Área 01, um fragmento florestal natural – Ipuca, limitado por áreas de varjão (campo) limpo e sujo e considerada área nativa com baixa perturbação; aleatória na Área 02, uma Ipuca ainda em formação com poucos indivíduos adultos e muitos jovens, limitada por áreas de pastagens. E com tendência ao agregamento na Área 03, um fragmento que está em formação, possui pouca interferência antrópica com médias semelhantes de jovens e adultose encontra-se relativamente isolado. Entre 173 isolados pertencentes a 62 espécies as mais freqüentes nas três áreas foram Candida parapsilosis, C. naeodendra, Kodamaea ohmeri ePichia guilliermondii, sendo que C. naeodendra, Cr. laurentii e P. guilliermondii foram mais freqüentes na Área 01; C. guilliermondii var. guilliermondii, C. naeodendra, C. parapsilosis e K. ohmeri na Área 02 e C. guilliermondii var. membranifaciens, C. parapsilosis, C. silvanorum e K. ohmeri na Área 03. As espécies C. homilentoma, C. maltosa, C. melibiosica, C. mogii, C. valdiviana, Cr. albidus, Kluyveromyces thermotolerans, P. anomala e P. triangularis, só foram encontradas na Área 01. Enquanto Aureobasidium pullulans, C. bertae, C. butyri, C. blankii, C. derdronema, C. famata, C. saitoana, C. tenuis, Cr. amylolentus, Cr. skinneri, Cr. terreus, Debaryomyces coudertii, P. sydowiorum, Sporopachydermia quercuum e Torulaspora delbrueckii foram encontradas apenas na Área 02. As espécies C. bombicola, C. guilliermondii var. membranifaciens, C. oregonensis, C. paludigena, C. peltata, Deb. yamada, e P. hampshirensis- similar, só foram encontradas na Área 03. A diversidade de leveduras associadas ao exsudado de C. brasiliense nas três áreas foi alta, em que a Área 01 obteve um índice de diversidade de 21.75, provavelmente porque representa um fragmento florestal natural - Ipuca situado em área de baixa perturbação, circundado por vegetação natural. Os valores para as demais áreas, 12.72 para a Área 03 e 9.2 para a Área 02, foram notavelmente menores, mas ainda são considerados elevados para florestas nativas. O perfil fisiológico dos isolados apresentou variabilidade, com respostas dissimilares da descrição da espécie, sendo utilizada técnica de RAPD para agrupamento por similaridade molecular. Esta técnica revelou a alta diversidade genética dos isolados da comunidade de C. brasiliense nas três áreas, inclusive com diversidade intra-específica de espécies.
Palavras – chave: Biogeografia, leveduras, Planície do Araguaia.
xiii
ABSTRACT
This study aimed to determine the biogeography of the community of yeasts associated with exudates of plant species Calophyllum brasiliense (Clusiaceae) in three areas in the mosaic of ecotone Araguaia Plain - Tocantins. Four samples were taken between the months March to June of 2008 in which 156 samples were collected and 173 strains of yeast. Isolates were submitted to identification polyphase which included physiological tests and cell morphology, RAPD and confirmation of identity by sequencing the D1/D2 variable domain of the largest subunit of the rDNA spacer region and internal 5.8S gene transcription. The distribution of yeasts occurred in the aggregate in all areas, while C. brasiliense showed random distribution in Area 01, a fragment natural - IPUCA, limited by areas of varjão (field) and as clean and dirty area with native low disturbance; random Area 02, a IPUCAstill training with few adults and many young people, limited by areas of grassland. And with the aggregate trend in Area 03, a fragment that is in training, has little human interference with similar means for young people and adults and is relatively isolated. Among 173 isolates belonging to 62 species the most frequent in the three areas were Candida parapsilosis, C. naeodendra, Kodamaea ohmeri and Pichia guilliermondii, with C. naeodendra, Cr. laurentii and P. guilliermondii were more frequent in Area 01; C. guilliermondii var. guilliermondii, C. naeodendra, C. parapsilosis and K. ohmeri Area 02 and C. guilliermondii var. membranifaciens, C. parapsilosis, C. silvanorum and K. ohmeriArea 03. The species C. homilentoma, C. maltose, C. Melibiose, C. Mogi, C. valdiviana, Cr. albidus, Kluyveromyces thermotolerans, P. anomala and P. triangularis were only found in Area 01. While Aureobasidium pullulans, C. bertae, C. butyri, C. blankii, C. derdronema, C. famata, C. saitoana, C. tenuis, Cr. amylolentus, Cr. skinneri, Cr. terreus, Debaryomyces coudertii, P. sydowiorum, Sporopachydermia quercuum and Torulaspora delbrueckii were found only in Area 02. The species C. bombicola, C. guilliermondii var. membranifaciens, C. oregonensis, C. paludigena, C. peltata, Deb. Yamada, and P. hampshirensis-like, were only found in Area 03. The diversity of yeasts associated with exudates of C. brasiliense in the three areas was high in the area 01 received a diversity index of 21.75, probably because it represents a remnant natural forest - IPUCA located in an area of low disturbance, surrounded by natural vegetation. The values for the other areas, 12.72 for the Area 03 and Area 02 to 9.2, were noticeably smaller, but are still considered high for native forests. The physiological profile of the isolates showed variability, dissimilar answers to the description of the species, being used for technique of RAPD molecular grouping by similarity. This technique revealed a high genetic diversity of the community isolates of C. brasiliense in the three areas, including intra-specific diversity of species.
Key-words: Biogeography, yeast, Araguaia Plain.
1
1 INTRODUÇÃO
A biogeografia num contexto de conservação trabalha descrevendo os padrões de
distribuição de espécies, identificando áreas com riqueza de espécies e de endemismos,
comparando a composição biológica de diferentes áreas e ainda identificando as bases
genéticas e evolutivas para manutenção da diversidade (CRISCI et al. 2003).
Freqüentemente, comunidades são descritas a partir de sua composição de espécies, cuja
análise comparativa pode revelar padrões espaço-temporais e relacioná-los com diferentes
fatores ou processos (PILLAR, 2004).
Barker et al. (1987) estudaram a variação temporal e espacial na estrutura da
comunidade de leveduras associadas a cactos do gênero Opuntia em deterioração e
demonstraram que diferenças em recursos disponíveis e qualidade desses recursos
contribuem para as diferenças em comunidades de leveduras entre localidades. Lachance et
al. (2001) estudaram a biogeografia de leveduras de flores efêmeras e seus insetos nas
regiões Neotropical, Neártica e Australiana, e verificaram que os fatores que afetam o
padrão espacial de riqueza de espécies incluem idade, latitude, elevação, temperatura e
precipitação. E que a área, latitude e elevação em particular, influenciaram a diversidade,
distribuição e abundancia de espécies de leveduras. Estudos mostram que, na natureza,
quase todas as leveduras ou grupos de espécies têm habitats altamente especializados, sendo
possível isolar leveduras específicas, provenientes de substratos apropriados e em áreas
geográficas particulares (PHAFF e STARMER, 1987). Algumas espécies de leveduras
ocorrem em diferentes substratos, enquanto outras são encontradas associadas a fontes
específicas. Por exemplo, Pichia kluyver Bedford e P. fermentans Lodder são
freqüentemente isoladas de várias fontes e podem ser consideradas espécies cosmopolitas
(ABRANCHES et al., 1997). Em contraste, Candida amapa Morais et al. só foi encontrada
em frutos de amapá (Parahancornia amapa) e Drosophila associadas (MORAIS et al.,
1995a). P. cactophila Starmer et al. ocorre apenas em tecidos necróticos de cacto, em toda a
área geográfica das Américas (PHAFF e STARMER, 1987).
Em exsudados vegetais pouco se conhece sobre a comunidade de leveduras
associada. Na área de Conservação Guanacaste na Costa Rica, foi estudada a comunidade de
leveduras de exsudado da espécie vegetal Maclura tinctoria e foram encontradas espécies
que diferem consideravelmente em sua nutrição (LACHANCE, 2001). Trabalhos recentes
acerca desse substrato vegetal vem descrevendo espécies novas de leveduras. Peter et al.
(2003) descreveram a espécie Pichia trehaloabstinens Péter et al. isolada na Hungária.
2
Morais et al. (2004) isolaram a espécie Ogataea falcaomoraisii Morais et al. em fragmentos
florestais naturais – Ipucas.
A partir desses embasamentos, esta dissertação teve como objetivo verificar a
distribuição biogeográfica da comunidade de leveduras associadas a exsudados da espécie
vegetal Calophyllum brasiliense em três áreas no mosaico ecotonal da Planície do Araguaia
- Tocantins; assim como realizar o inventário da biodiversidade de leveduras associadas a
exsudados de C. brasiliense; verificar a distribuição espacial de C. brasiliense nas áreas
estudadas; verificar a distribuição espacial das espécies de leveduras nas três áreas e
incrementar a coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia Ambiental e
Biotecnologia (LAMBIO).
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 BIOGEOGRAFIA
A biogeografia estuda a distribuição dos seres vivos no espaço e no tempo e, ao
reconhecer padrões de distribuição, propõe hipóteses sobre os processos que os causaram e
proporcionaram um sistema de regionalização biótica do planeta (NELSON, 1985). A
compreensão da dimensão espacial dos seres vivos, a partir da análise de suas distribuições
geográficas, é um pré-requisito para os estudos evolutivos, visto que a geografia é o
substrato sobre o qual ocorre a história da vida (MORRONE, 2004).
A biogeografia clássica considera grupamentos característicos de indivíduos, em
nível de gêneros e famílias, em seis regiões biogeográficas básicas: Austráliana, Neártica,
Neotropical, Etiópica, Oriental e Paleártica (WELL e BRANDON, 1993). Estas regiões
encontram-se separadas por barreiras físicas (cordilheiras, desertos, oceanos e mares
interiores) que impedem a dispersão de plantas e animais. O entendimento das respostas
ecológicas e evolutivas, como as amplitudes de nicho de várias espécies componentes de
uma dada comunidade em função da presença ou ausência de outras espécies requer
experimentos ecológicos em sistemas naturais. Os ambientes de ilhas oceânicas funcionam
como um laboratório natural para esses estudos (SIMBERLOFF, 1976). O conceito de
“ilha” foi estendido para paisagem terrestre onde, uma área de floresta separada por uma
massa de árvores maior pode ser considerada como uma ilha de habitats. Consequências
ambientais da fragmentação florestal podem ser explicadas a partir da Teoria de
Biogeografia de Ilhas de MacArthur e Wilson (1967), que foi desenvolvida para explicar a
relação entre a área e o número de espécies, como produto de taxas de imigração e extinção.
A sua fundamentação teórica foi tomada a partir de estudos em que fragmentos isolados de
florestas foram comparados a ilhas oceânicas (MACARTHUR e WILSON, 1967). A sua
adoção deve-se ao raciocínio de que o número de espécies aumenta com a área da ilha, o que
será aproximadamente constante no tempo, devido ao equilíbrio entre os processos de
colonização e extinção e à mudança marcada da composição das espécies (FOWLER e
DELABIE, 1994).
Em termos de aplicações práticas da teoria de biogeografia de ilhas podem ser
citadas as propostas relacionadas à determinação do tamanho mínimo crítico bem como,
quanto ao formato das áreas de conservação. Estas perspectivas são de grande importância
para a conservação das comunidades bióticas, além do monitoramento da taxa e do grau de
insularização (DIAMOND, 1976). As consequências da fragmentação e do isolamento têm
4
implicações ecológicas e genéticas, tais como: extinção (tamanho das populações e
dispersão de espécies); perda da heterogeneidade de habitats; aumento do número de
espécies invasoras; e consanguinidade (aumento de variações recessivas com menor
variabilidade genética para que a população possa adaptar-se as mudanças ambientais)
(PRIMACK, 1993).
2.2 FRAGMENTAÇÃO FLORESTAL
Grandes extensões territoriais de paisagens “naturais” sofreram transformações
significativas, especialmente no último século, devido à substituição de grandes áreas de
florestas nativas por outros ecossistemas isolados, formando manchas, com consequências
negativas para a maioria da biota florestal (ZAÚ, 1998). A causa primária do declínio da
diversidade de espécies da floresta tropical úmida é a perda de habitat (EHRLICH, 1988). A
destruição de habitats resulta na sua fragmentação, que aumenta a perda de habitats
originais, reduz o tamanho e aumenta o isolamento das manchas de habitat (ANDRÉN,
1994). Os fragmentos florestais remanescentes podem diferir na forma, tamanho,
microclima, regime de luminosidade, solo e grau de isolamento (SAUNDERS et al., 1991).
Consequentemente, a fragmentação da floresta pode influenciar os padrões locais e
regionais de biodiversidade devido à perda de microhabitats únicos, isolamento do habitat,
mudanças nos padrões de dispersão e migração e erosão do solo (SOULÉ e KOHM, 1989).
Adicionalmente, os efeitos de borda, que podem alterar a distribuição, comportamento e
sobrevivência de espécies de plantas e animais serão magnificados em áreas de alta
intensidade de fragmentação florestal (KAPOS, 1989; MURCIA, 1995). O planejamento e
manejo de reservas naturais deve necessariamente considerar os efeitos da fragmentação da
floresta relacionados à persistência das espécies e dos mecanismos ecológicos. Se a área de
uma reserva natural está abaixo do tamanho mínimo necessário para que seja mantida a
população de uma espécie, então a espécie estará em risco de extinção nessa reserva
(SCARIOT, 1996).
Dois pontos principais devem ser considerados quando se avalia a capacidade de
uma espécie nativa de sobreviver em uma determinada reserva. Primeiro, cada espécie tem
um tamanho mínimo viável de população abaixo do qual torna-se difícil encontrar parceiros
para o acasalamento, produzir prole geneticamente viável (em espécies de reprodução
cruzada), sobreviver a flutuações aleatórias no tamanho, e produzir novas populações
colonizadoras em longo prazo. Segundo, populações pequenas e isoladas tenderão a ter
5
níveis de heterozigose mais baixos que as populações grandes e extensas (ELLSTRAND e
ELAM, 1993).
A área mínima necessária para a persistência em longo prazo de uma espécie deve
ser suficientemente grande para minimizar a probabilidade de ocorrência de gargalos
genéticos. Esta área dependerá da densidade populacional da espécie-alvo, o que difere
grandemente entre taxa. Apesar do debate do tamanho mínimo e da distribuição espacial
ótima das reservas naturais (GILPIN, 1988), está claro que os efeitos da fragmentação da
floresta serão magnificados em reservas relativamente pequenas, onde há maior
probabilidade de existir menos espécies que as reservas grandes. Isto parece favorecer o
desenho de reservas extensas.
Estudos detalhados da composição, diversidade e demografia que documentem os
efeitos da fragmentação florestal na abundância de espécies, diversidade, e sobrevivência de
plantas são raros na Amazônia (FERREIRA e LAURANCE, 1997). Embora haja escassez
de informações, é importante entender-se a dinâmica de fragmentos pequenos, grandes e das
florestas contínuas para orientar o desenho e manejo de reservas naturais e para subsidiar a
política de conservação.
2.3 IPUCAS
Ipucas são fragmentos florestais naturais de diferentes tamanhos e formatos que
surgem na região de ecótono entre o Cerrado e a Floresta Amazônica, nos estados do
Tocantins e Mato Grosso, nas proximidades da Ilha do Bananal. Constituem uma das mais
interessantes e peculiares paisagens da Depressão do Médio Araguaia, sendo constituídas
por fragmentos florestais descontínuos, possuindo características fitofisionômicas
semelhantes às dos ambientes florestais inundáveis da Amazônia (MARTINS et al., 2006).
São formações identificadas como “Florestas Estacionais Semideciduais Aluviais” e ocupam
as acumulações fluviais quaternárias, sendo a sua estrutura fisionômica semelhante à da
floresta de galeria, da qual diferem apenas floristicamente (MARTINS, 2004). Estes
fragmentos geralmente localizam-se em dois ambientes dominantes: o varjão sujo e o varjão
limpo. Ambas as áreas estão localizadas nas partes mais baixas do terreno e sujeitas às
inundações periódicas. Nos varjões predominam as espécies herbáceas, sendo que o varjão
sujo diferencia-se do varjão limpo por apresentar espécies arbóreas/arbustivas típicas do
Cerrado, em geral na forma de “ilhas” - os murundus, que se localizam sobre pequenos
amontoados de terra (MARTINS, 1999; MARTINS et al., 2001) (Fig. 1).
6
Figura 1 – Fragmento florestal natural – Ipuca: A – Ipuca em Campo limpo; B – Ipuca em área de pastagem
As Ipucas, em geral, destacam-se pela ocorrência de agrupamentos de indivíduos da
mesma espécie, principalmente nos interiores, onde se verifica a dominância de elementos
florestais homogêneos. As espécies de maior destaque são: landi (Calophyllum brasiliense),
canjirana (Vochysia sp.), carvoeiro (Sclerolobium sp.), entre outras (MARTINS et al., 2001).
As Ipucas localizam-se em meio a extensas planícies, periodicamente inundadas
pelas cheias dos rios que drenam a depressão do Araguaia. Constitui essa planície uma vasta
superfície rebaixada, com altimetria que varia de 180 a 220 m, drenada pela Bacia do
Araguaia, com influência da Bacia do Xingu na parte noroeste, por meio da atuação de
vários de seus afluentes (BRASIL, 1981). Regionalmente, situa-se entre o Planalto do
Interflúvio Araguaia–Tocantins, os Patamares do Interflúvio Araguaia–Tocantins e o rio
Araguaia (BRASIL, 1981). Do ponto de vista ecológico, as Ipucas são florestas de natureza
aluvial, sob um regime climático estacional de cinco a seis meses secos. As Ipucas são
elementos importantes na drenagem regional da planície, uma vez que no período de cheias
estabelecem a ligação entre os vários rios, córregos e lagoas. A precipitação média anual da
região estudada é de 1.750 mm, concentrada entre os meses de outubro a abril. A
temperatura média é de 24 ºC, e a umidade relativa do ar permanece em torno de 80 a 85%
ao longo do ano (BRASIL, 1994). Martins (1999) defende que por serem consideradas de
rara ocorrência, as Ipucas devem ser estudadas sob a ótica da preservação e conservação.
2.4 CALOPHYLLUM BRASILIENSE CAMBESS
Calophyllum brasiliense Cambess. conhecido popularmente como landi, landim,
guanandi, guarandi ou jacareúba (NOLDIN et al., 2006), é a espécie do gênero mais
A B
7
abundante na América Latina (MESÍA-VELA et al., 2001). Está presente nas florestas
atlântica e amazônica, desde a América Central até o litoral norte de Santa Catarina. É muito
freqüente em vários ambientes ribeirinhos do sudeste do Brasil e também em outros tipos de
ambientes neotropicais, onde o solo é permanentemente ou periodicamente inundado
(MARQUES e JOLY, 2000), a exemplo de mangues (SANTOS et al., 2000). Ocorre
geralmente em grandes agrupamentos (LORENZI, 1998), e são susceptíveis a geadas
(VIEIRA et al., 2003) (Fig. 2).
Figura 2- A: Árvore de Calophyllum brasiliense; B: Calophyllum brasiliense em floração
As árvores de C. brasiliense medem entre 20 e 30 m de altura, com tronco de 40 a 60
cm de diâmetro. A casca do caule é amarelo-avermelhada, de aproximadamente 2 cm de
espessura, dura, fibrosa, de sabor doce e com aroma de mel. As folhas são opostas, simples,
coriáceas, pecioladas, e com 10 a 13 cm de comprimento por 5 ou 6 cm de largura. A forma
pode ser elípticolanceolada ou oblonga e a nervação é geralmente peninervada, com as
nervuras secundárias formando praticamente um ângulo reto com a central. As flores são
brancas, pequenas, aromáticas de 2 sépalas e 10 estames, dispostas em racemos axilares e
terminais. Os frutos são do tipo drupa globosa e oleaginosa, consumidos por vários animais
(CORRÊA, 1984; LORENZI, 1998).
A produção de mudas é feita a partir dos frutos quando caem espontaneamente da
árvore, semeados mesmo sem a despolpação para a obtenção da semente, ocorrendo a
emergência em 40 a 60 dias (LORENZI, 1998). A germinação ocorre após 16 semanas,
sendo que os frutos sem o endocarpo germinam em 8 semanas (ZENTSCH e DIAZ, 1977).
Estudos de reflorestamento demonstram uma importante capacidade de desenvolvimento da
espécie em áreas degradadas (PIOTTO et al., 2003).
A B
8
A árvore é ornamental e pode ser aplicada no paisagismo (LORENZI, 1998). O
tronco é forte e durável, com utilidade na indústria moveleira e na construção civil e naval
(METCALFE e CHALK, 1950), sendo as cascas empregadas na calafetagem de pequenas
embarcações. No Brasil, durante o período do Império, o guanandi foi considerado madeira
de lei (CORRÊA, 1984).
A análise fitoquímica qualitativa de C. brasiliense revela a presença de flavonas,
flavonóis, triterpenóides, esteróides e xantonas, e a ausência de alcalóides, quinonas e
saponinas (SARTORI et al., 1999). Dentre os compostos químicos isolados da espécie,
destacam-se as xantonas brasixantona A, guanandina, jacareubina e 6-desoxijacareubina, e
as cumarinas denominadas de calanolídeos A, soulatrolídeo e mammea A/BA (SARTORI et
al., 1999; SILVA et al., 2001).
Estudos etnofarmacológicos revelam o uso da espécie no tratamento de dores,
inflamações, diabetes, hipertensão, herpes, reumatismo e distúrbios do trato gastrointestinal
(REYES-CHILPA et al., 2006). O exsudado obtido do tronco é empregado na medicina
popular como anti-reumático, em tumores e contra úlceras crônicas, mas por ser fortemente
irritante e produzir manchas escuras na pele, possui maior aplicação na medicina veterinária
(CORRÊA, 1984; RIZZINI e MORS, 1995).
O extrato de C. brasiliense é efetivo contra o vírus HIV-1 (HUERTA-REYES et al.,
2004a). Piranocumarinas (soulatrolídeo e calanolídeos A e B) isoladas do extrato hexânico,
apresentam alta atividade inibitória contra o mesmo vírus e propriedades citotóxicas. O
calanolídeo C possui capacidade inibitória moderada sobre o HIV-1. De acordo com Kuster
e Rocha (2000), os calanolídeos A e B impedem a replicação do HIV-1 in vitro,
provavelmente por inibição da atividade enzimática da DNA-polimerase dependente de
DNA e da DNA-polimerase dependente de RNA presentes no vírus.
A fração diclorometano tem efeito gastroprotetor em razão da ação antisecretora,
antiúlcera e citoprotetora (SARTORI et al., 1999). Reyes-Chilpa et al. (2006) demonstram a
ação inibitória de algumas xantonas [6 - desoxijacareubina, jacareubina, 1,3,5,6-tetraidroxi-
2-(3-hidroxi-3-metilbutil)- xantona, 1-hidroxi-3,5,6-tri-O-acetil-2-(3,3-dimetilalil)-xantona]
e cumarinas [mammea A/BA e mammea C/AO isoladas de C. brasiliense sobre a liberação
de ácido estomacal.
Estudos revelam a atividade antiespasmódica das espécies C. brasiliense e Cynara
scolymus L. (alcachofra), por inibição da contração induzida pela acetilcolina em íleo de
cobaias e duodeno de ratos (EMENDORFER et al., 2005). Algumas cumarinas isoladas de
C. brasiliense são consideradas potentes inibidores in vitro de sulfotransferases, enzimas
9
envolvidas no metabolismo de compostos endógenos como esteróides (MESÍA-VELA et al.,
2001). Frações de extrato da espécie e alguns compostos isolados demonstram significativo
efeito antinociceptivo (SILVA et al., 2001; ISAIAS et al., 2004). Algumas brasixantonas
identificadas do extrato de caule possuem significativa atividade antineoplásica (ITO et al.,
2003). Alguns constituintes identificados das folhas de C. brasiliense possuem atividade
contra o parasita Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (ABE et al.,
2004). O extrato bruto de ramos da espécie impede o crescimento de moluscos
(GASPAROTTO-JÚNIOR et al., 2005a). Os compostos ácido brasiliênsico, ácido gálico,
epicatequina, ácido protocatéquico, friedelina e 1,5-diidroxixantona, isolados de extratos de
vários órgãos de C. brasiliense apresentam atividade antibacteriana (PRETTO et al., 2004).
Yasunaka et al. (2005) demonstram atividade do extrato dessa espécie frente aos
microrganismos Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Alguns ácidos cromanônicos
isolados de casca de caule possuem atividade contra Bacillus cereus e Staphylococcus
epidermidis (COTTIGLIA et al., 2004). O extrato de casca de caule da espécie e a xantona
jacareubina, isolada da mesma, são efetivos contra o crescimento do fungo Postia placenta
Larsen e Lombard (REYES-CHILPA, 1997).
2.5 EXSUDADO VEGETAL
O exsudado vegetal é um líquido com elevado teor de proteínas, secretado das partes
internas das plantas, cuja composição rica em açúcares proporciona condições atrativas para
colonização de microrganismos (MORAIS et al., 2005) (Fig. 3).
Figura 3 – Exsudado vegetal liberado de algumas plantas
10
Constitui uma fonte importante de carboidratos, contendo ainda elementos minerais
como cálcio e magnésio. Representa fonte de água, embora o percentual hídrico seja
variável entre espécies vegetais (NASH, 1986).
Nash (1986) classifica exsudado de plantas em quatro modalidades: seiva, goma,
látex, resina e são obtidos do tronco de árvores como resposta do mecanismo de proteção da
planta como defesa contra predadores ou ferimentos. A liberação do exsudado ocorre de
forma espontânea ou exploratória, como é o caso do látex da seringueira. Condições
climáticas desfavoráveis e solos pobres também estimulam esta produção. No entanto, a
formação de exsudado pode também ser causada pela indução de agentes químicos, como o
óxido de etileno e derivados de ácido benzóico (EIRAS et al., 2007).
Interessantes considerações foram efetuadas por Armbruster (1984) quanto ao papel
de exsudados na polinização de angiospermas. O autor sugere que secreções de resinas em
estruturas florais podem ter se originado como uma defesa contra herbívoros e que
secundariamente tais secreções se transformaram em objetos de recompensa para
polinizadores. O exsudado pode ser um recurso importante para certas abelhas, as quais, em
contrapartida, se tornam os principais polinizadores de muitas espécies de plantas tropicais.
Dentre os grupos de abelhas que utilizam resinas vegetais estão os meliponíneos. Estas
abelhas eussociais empregam as resinas para a confecção de estruturas de seus ninhos
(NOGUEIRA-NETO, 1997).
Diversas espécies arbóreas produzem exsudado como subproduto de atividades
metabólicas. A copaíba produz um óleo-resina muito utilizado popularmente devido suas
propriedades medicinais e de interesse para a indústria química (cosméticos) e farmacêutica
(SAMPAIO, 2000). O C. brasiliense produz um látex ou uma resina do tronco (exsudado
odorífero), de cor amarela que é exsudado pela casca. Esta seiva é conhecida por ter
poderosas capacidades medicinais, chamado de bálsamo-de-landim, que é vesicante e
energizante, sendo também indicado como anti-reumático e, mesmo no tratamento de
tumores e úlceras crônicas (PASA et al., 2000), como anti-séptico, em decocção para uso
externo (BRANDÃO, 1991).
2.6 LEVEDURAS
Leveduras são microrganismos predominantemente unicelulares e sem motilidade,
congregam um grupo funcional de organismos heterotróficos colonizadores de substratos
contendo fonte orgânica de carbono e mesofílicos, crescendo preferencialmente entre 18 e
45ºC. Podem ser definidas como fungos que se reproduzem assexuadamente por brotamento
11
ou divisão binária e que não formam estruturas reprodutivas em corpos de frutificação.
Taxonomicamente pertencem a cem gêneros entre as classes Ascomycetes e
Basidiomycetes. Quando apresentam formas de reprodução sexuada descrita são
denominados teleomorfos, e de anamorfos, aqueles que não apresentam fase sexual
observada (KURTZMAN e FELL, 1998; MORAIS e ROSA 2000).
Segundo Van der Walt (1980), o primeiro conceito de espécie de levedura surgiu
com os estudos de Hansen (1888), que classificou culturas puras baseada na morfologia
celular, ascósporos, característica de crescimento em meio líquido, temperatura ótima e
fermentação de diferentes açúcares, iniciando assim as bases da caracterização fenotípica de
espécies. Com o surgimento de táxons diferentes, outros taxonomistas passaram a considerar
outras características fenotípicas, como reprodução vegetativa, formação de ascos, diploidia
da fase vegetativa, pigmentação, utilização oxidativa de diversas fontes de carbono e
nitrogênio, tolerância a altas concentrações de açúcares e sais e resistência a cicloheximida.
Posteriormente além das características fenotípicas, passou-se também a estudar os aspectos
relacionados à composição de bases do DNA nuclear, como a porcentagem molar de
guanina-citosina (mol % G+C) (KURTZMAN e FELL, 1998).
Lopes et al. (1998) relataram que as leveduras, filogeneticamente, são um grupo
diversificado de fungos unicelulares. O termo levedura está sempre associado à capacidade
fermentativa que este grupo de microrganismos possui quando em contato com substratos
ricos em açúcares. As leveduras são fungos que se distinguem dos fungos filamentosos por
se apresentarem essencialmente na forma unicelular. Suas células podem ter forma
arredondada, alongada, apiculada, cilíndrica, baciliforme e triangular; a forma da célula
pode refletir o modo de reprodução e em alguns casos são características de gêneros ou
espécies. O crescimento vegetativo forma colônias cujo tamanho e forma variam muito. As
colônias variam de lisas a rugosas e de secas a um aspecto mucóide. A cor varia do branco
ao bege, alaranjado e róseo e algumas espécies de organismos, de difícil caracterização
produzem pigmento tipo melanina e são denominadas leveduras negras (YARROW, 1998).
Segundo Rose e Harrison (1987), todos os aspectos relacionados à morfologia, a fisiologia e
a genética das espécies, há que considerar também as suas características ecológicas, ou
seja, a maneira como as leveduras vivem e se propagam na natureza. Leveduras não ocorrem
ao acaso na biosfera, elas formam comunidades de espécies, cada comunidade pode ser
definida por habitat e pelo nicho de componentes de espécies. O nicho consiste das
características que fazem com que uma levedura seja capaz de compartilhar um habitat com
os membros da comunidade (YARROW, 1998).
12
Trabulsi (1986) definiu as leveduras como fungos ubíquos, encontrando-se no solo,
água, nos vegetais e animais, no homem e em detritos, em geral. Algumas espécies fazem
parte da microbiota normal do organismo, mas também podem causar muitas enfermidades,
sendo muitas delas consideradas como patógenos oportunistas. Estudos mostram que, na
natureza, quase todas as leveduras ou grupos de espécies têm habitats altamente
especializados, sendo possível isolar leveduras específicas, provenientes de substratos
apropriados e em áreas geográficas particulares (PHAFF e STARMER, 1987).
Morais et al. (1995b) em estudos anteriores relatam que o conhecimento da
biodiversidade pressupõe o inventário taxonômico das espécies, a determinação dos nichos
ecológicos de linhagens de interesse e o entendimento do papel das espécies na estrutura da
comunidade. A distribuição e especificidade destas comunidades dependem amplamente da
quantificação e composição de nutrientes presentes no substrato para alimentação e
ovoposição de insetos (GANTER, 1988; MORAIS e ROSA, 2000), bem como das
interações microrganismo-microrganismo, sendo estas interações representadas por
predação, mutualismo, competição, amensalismo, entre outros (LACHANCE e STARMER,
1998; ABRANCHES et al., 1997).
Plantas que servem de habitat para leveduras são sítios de interações ecológicas, e as
características fisiológicas e habilidades metabólicas das leveduras mostram padrão que
acompanha a história evolutiva dos substratos (STARMER, 1981; LACHANCE e
STARMER, 1982).
Comunidades de leveduras têm sido descritas como especificas para uma grande
variedade de microhabitats de plantas como tecidos em decomposição, flores, néctar, frutos
e seiva de árvores (PHAFF e STARMER, 1987; ROSA et al., 1994). Superfícies vegetais
sadias, incluindo flores e frutos imaturos são normalmente dominados por espécies não
fermentativas disseminadas prevalentemente por correntes de ar. Estas comunidades são
dominadas por leveduras basidiomicéticas e seus anamorfos, especialmente Cryptococcus e
Rhodotorula, e o fungo ascomiceto Aureobasidium pullulans Arnaud (HAGLER et al.,
1995).
Comunidades de leveduras dependem dos insetos para sua dispersão, e a
especialização de habitats de leveduras descrevem seus respectivos insetos vetores
(GILBERT, 1980; PHAFF e STARMER, 1987). A heterogeneidade de habitats em um
ecossistema pode permitir que diferentes comunidades sejam estabelecidas, cada uma
ocupando um microambiente diferente e sendo influenciada para distribuição e
13
especificidade de insetos vetores e uma variedade de fatores bióticos e abióticos
(LACHANCE et al., 1989).
Uma grande variedade de novas espécies são descritas quando ocorrem isolamento
de leveduras em substratos provenientes de áreas tropicais (MORAIS et al., 1995b;
LACHANCE et al., 1998a; LACHANCE et al., 1998b LACHANCE et al., 1998c; ROSA et
al., 1999a; ROSA et al., 1999b.), que é evidenciado pelo vasto número de descrições nos
recentes inventários de leveduras associadas a exsudados vegetais (MORAIS et al., 2004),
abelhas (TEIXEIRA et al., 2003; LACHANCE et al., 2001a; ROSA et al., 1999) e a
formigas (PAGNOCCA et al., 2000; CARREIRO et al., 2002) no Brasil.
A microbiota de leveduras associada a exsudados de espécies vegetais e insetos tem
sido um modelo para estudos de ecologia de comunidades (MORAIS et al., 1996;
STARMER et al., 1990). Leveduras associadas a exsudados vegetais na Costa Rica e
México mostrou a presença desses microrganismos assimiladores de metanol, incluindo
espécies novas como Candida galis Lachance et al. e C. ortonii Lachance et al.
(LACHANCE et al, 2001). Kluyveromyces bacillisporus Lachance et al. foi isolada pela
primeira vez em exsudado vegetal de Quercus emoryi no Arizona (LACHANCE et al.
1998). E nas Ipucas, uma nova espécie de levedura, Ogataea falcaomoraisii Morais et al.
(MORAIS et al., 2004) foi isolada indicando que o habitat exsudado vegetal parece ser
propício à colonização por leveduras.
A capacidade fisiológica de uma comunidade de leveduras pode ser usada para
caracterizar o habitat daquela comunidade (STRAMER, 1981). E as características
fisiológicas das leveduras podem indicar a estratégia de cada comunidade em ocupar um
microhabitat especifico (ROSA et al., 1995).
A identificação de leveduras envolve a análise de características morfológicas e
fisiológicas de cada linhagem. As análises morfológicas permitem caracterizar e dividir as
leveduras em seus morfotipos, com o auxílio da microscopia óptica. As análises fisiológicas
caracterizam as similaridades a partir de testes adequados, para o estudo de comunidades em
particular, oferecendo descrições multivariadas de informações, como as taxas de
freqüência, propriedades numéricas, e taxas de assimilações ou assimetrias, contribuindo
assim para a análise dos hábitos comportamentais das leveduras com determinados meios
específicos que envolvem a capacidade de assimilação de diferentes fontes de carbono e
nitrogênio, fermentação e osmotolerância a qual estão sujeitas. Com base nas características,
é feita a identificação das linhagens comparando os resultados aos perfis já descritos para as
espécies catalogadas (STARMER, 1982).
14
Com o advento da biologia molecular e sua utilização como ferramenta da taxonomia
tem-se a oportunidade de determinar a segurança desses métodos padrões para a resolução
de gêneros e espécies, sendo que as análises moleculares permitem a descrição de novas
espécies, a partir de técnicas como RAPD-PCR e seqüenciamento do DNA microbiano. A
taxonomia convencional e molecular não precisam ser exclusivas, mas devem complementar
uma a outra num processo chamado taxonomia polifásica (KURTZMAN e FELL, 1998).
2.7 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
O advento da técnica de PCR (polymerase chain rection) (MULLIS E FALOONA,
1987) e seus posteriores avanços, utilizando uma enzima de DNA polimerase termoestável e
termocicladores programáveis com elevada capacidade de processamento, imprimiram
grande automatização à síntese in vitro de DNA. A técnica de PCR consiste na síntese
enzimática in vitro de um segmento de DNA, delimitado por um par de primers de
seqüências especificas de nucleotídeos de fita simples. Primers são seqüências curtas de
DNA (oligonucleotídeos), que pareiam com o DNA-molde e servem de iniciadores para a
síntese de uma nova fita de DNA, as reações ocorrem em ciclos alternados de temperatura,
sendo que cada ciclo da PCR envolve três etapas. Na primeira, ocorre a desnaturação da fita
dupla de DNA, posteriormente, os primers se anelam as seqüências complementares
especificas que flanqueiam o gene alvo, e então a nova fita de DNA é sintetizada a partir das
extremidades 5’ – OH livres dos primers, por meio da enzima DNA polimerase. Como cada
ciclo é repetitivo varias vezes, a amplificação do DNA-alvo ocorre em progressão
geométrica, requerendo uma quantidade muito pequena de DNA-molde (MATIENZO,
2002).
A técnica de PCR consiste de uma reação de polimerização em cadeia para
amplificação de seqüência de DNA por uma reação enzimática primer dirigida (FERREIRA
e GRATTAPAGLIA, 1998). Sendo assim, através da PCR, pode-se obter in vitro um
aumento da quantidade de uma determinada seqüência de DNA, representando então um
grande recurso para o estudo destas seqüências, permitindo uma serie de aplicações nas mais
diferentes áreas da ciência. Em microrganismos, a PCR vem sendo aplicada na determinação
de grupos taxonômicos. Entre os marcadores moleculares, o RAPD tem sido usado no
estudo da variabilidade entre espécies e em nível de população (MOLNÁR, et al., 1996).
A detecção e exploração de seqüências de polimorfismos de DNA ocorridos
naturalmente representam um dos mais significativos desenvolvimentos na biologia
15
molecular. O método RAPD tem sido bastante utilizado principalmente pela vantagem de
ser simples e rápido (TAVARES et al., 1992).
Segundo Bered et al. (1997), os marcadores genéticos poderão auxiliar na
identificação de microrganismos através de suas diferenças genéticas. Estes marcadores
podem ser divididos em morfológicos e moleculares (enzimáticos e de DNA). Os
marcadores de DNA como RFLP e o RAPD poderão contribuir através do mapeamento de
espécies de interesse, a sua eficiência em caracterizar e agrupar genótipos diferentes de
varias espécies com bastante precisão.
Fenótipos moleculares gerados por RAPD, podem servir para diagnosticar diferentes
níveis taxonômicos. Considerando-se um determinado primer, os produtos de amplificação
via RAPD, podem ser classificados em dois grupos: variáveis (polimórficos) e constantes
(não-polimórficos). Perfis de RAPD de representantes de vários gêneros podem conter
bandas comuns a um outro gênero, enquanto outras bandas podem ser exclusivas. Se várias
espécies pertencentes a esse gênero forem analisadas e uma das bandas exclusivas do gênero
estiver presente em todas elas pode se concluir que esta banda é um marcador exclusivo do
gênero (MATIENZO, 2002). Da mesma forma, quando se tem um perfil de RAPD de
espécies de um mesmo gênero, algumas bandas poderão ser compartilhadas por algumas
espécies, enquanto outras podem ser exclusivas de uma dada espécie. Se vários indivíduos
dessa espécie forem analisados e essa banda estiver presente em todos eles, pode se concluir
que é um marcador exclusivo da espécie (FUNGARO e VIEIRA, 1998). Assim, os
marcadores de RAPD podem ser utilizados para diagnóstico molecular de diferentes níveis
taxonômicos. Fragmentos polimórficos detectados entre indivíduos de uma população
também podem ser utilizados para se determinar o que se chama de identidade clonal, o que
normalmente é requerido em estudos envolvendo organismos de reprodução assexual
(marcadores clone - específico) (MATIENZO, 2002).
Em leveduras, RAPD e cariotipagem eletroforética foram utilizados para a
caracterização de produtos de fusão de protoplastos e seus segregantes, detectando-se uma
banda cromossomal nos produtos de fusão, presentes nas linhagens parentais e segregantes
(MARTINS et al., 1998).
A tecnologia de PCR tem gerado diversas classes de marcadores moleculares que
podem ser aplicados no estudo do DNA inteiro ou fragmento. Um desses métodos foi
denominado de RAPD (WILLIAN et al., 1990) e é caracterizado pela polimerização de
cadeia utilizando primers arbitrários. Estes métodos propõem que os oligonucleotídeos
escolhidos ao acaso em uma seqüência de DNA, misturados com DNA genômico e DNA
16
polimerase termoestável, submetidos a ciclos de temperaturas controláveis como os
descritos por PCR, iniciassem a amplificação do DNA. Ou seja, os componentes necessários
à reação de polimerização eram os mesmos descritos pela PCR. Os fragmentos amplificados
podiam ser visualizados em gel de agarose revelado com brometo de etídio (WILLIAN et
al., 1990) ou por meio da utilização de desoxiribonucleotidios (dNTPs) marcados
radioativamente.
O RAPD é interessante porque requer uma pequena quantidade de DNA que revela
um grande número de marcas polimórficas, é rápido e automatizado. O uso de marcadores
RAPD tem se mostrado útil nos estudos de microrganismos onde não se tem muita
informação genética. A técnica é baseada na amplificação de fragmentos não específicos de
DNA, em reações sucessivas de polimerização. Como descrito por Willian et al. (1990), os
oligonucleotídeos são construídos com seqüências aleatórias, revelando polimorfismos em
toda a extensão do genoma. Tais polimorfismos são reconhecidos pela presença de um
fragmento amplificado em um dos genomas em relação à ausência deste mesmo fragmento
em outro.
O desenvolvimento da técnica de RAPD representou um marco na caracterização
molecular de diversos microrganismos, especialmente para identificação de espécies
microbianas, quando pequenas seqüências genômicas são avaliadas (ERGON e GÜLAY,
2004; PINTO et al., 2004).
17
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização da área de estudo
Este estudo foi conduzido na triangulação correspondente a fazenda Lago Verde
entre as coordenadas aproximadas UTM 0640625x8798218 (Área 01) e fazenda Ipuca da
Onça entre as coordenadas UTM 0637570x8821144 (Área 02) no município de Lagoa da
Confusão-TO, área de concentração de fragmentos florestais naturais Ipucas, e no município
de Pium-TO, coordenadas UTM 0649382x8886600 (Área 03) que são áreas de ecótono
entre o Cerrado e a Floresta Amazônica no Estado do Tocantins (Fig. 4).
Figura 4: Mapa de localização das áreas estudadas
Ilh
a d
o B
anan
al
●Área 03
●Área 02
●Área 01
23 Km
88 Km66 Km
18
A distância entre as Áreas 1 e 2 é de 23 Km, entre as áreas 2 e 3 é de 66 Km e entre
as Áreas 1 e 3 é de 88 Km. Nestas áreas, por meio do mapeamento, foram definidos pontos
amostrais, em que foram determinadas parcelas de 10x10m (100m2) cada (Fig. 5),
distribuídas sistematicamente para perfazer 0,5 ha (5.000 m2) para cada ponto, de acodo com
Muller-Dumbois e Ellemberg (1974).
Figura 5: Parcelas marcadas entre as árvores de Calophyllum brasiliense
3.2 Estimativa do padrão de distribuição espacial para C. brasiliense e comunidades de
leveduras
Com base nos valores de Densidade e Freqüência foi calculada a distribuição
espacial do C. brasiliense e das comunidades de leveduras por meio da Razão
Variância/Média, também conhecida como índice de PAYANDEH, usado por Caldato
(1998):
Segundo esse autor, o índice de agregação (P) é expresso:
P = V/M
Sendo: P = índice de agregação.
V = variância do número de plantas ou leveduras por quadrado.
M = média do número de plantas ou leveduras por quadrado.
19
Os valores de P, menores que 1,0, indicam a inexistência de agrupamento (distribuição
aleatória). Valores de P entre 1,0 e 1,5 indicam tendência ao agrupamento, e os valores
maiores que 1,5 indicam agrupamento.
3.3 Coleta das amostras
Nas parcelas definidas nos pontos amostrais foram marcadas e numeradas árvores de
C. brasiliense para coleta dos exsudados (Fig. 6). As coletas foram realizadas mensalmente
no período de março a junho de 2008. As árvores de C. brasiliense foram lesionadas e após
colonização dos microrganismos foram coletadas amostras de exsudados com bisturi ou
estilete desinfetados em álcool 70% e transferidos para tubos contendo meio de cultura
caldo YMA, e em seguida levados ao laboratório. O material permaneceu em estufa B.O.D.
(Biochemical Oxygen Demand) à 25ºC, e incubado por 24h até 72 horas, podendo ser
armazenado em até 5 dias, mas não mais que 7 dias. Após o período de incubação, os tubos
em que foi observada turvação do meio foram semeados por uma alçada na superfície de
meio de cultura sólido YMA adicionado de cloranfenicol.
Figura 6: A: Árvores de C. brasiliense marcadas e numeradas, B: coleta dos exsudados
3.4 Isolamento de leveduras, descrição morfológica e purificação
O isolamento das leveduras foi feito a partir das placas de Petri inoculadas e
mantidas por 3 a 5 dias em estufa a 25 ± 3°C. Cada morfotipo diferente de levedura foi
contado, repicado e purificado. A purificação foi feita em Agar Sabouraud, onde foram
feitos semeadura por esgotamento com alça de platina. A descrição morfológica das
leveduras foi baseada em características macroscópicas e microscópicas das colônias. As
A B
20
observações macroscópicas foram baseadas em características como o tamanho, elevação,
bordas, cor e aspecto da colônia (Fig. 7). Já as observações microscópicas foram realizadas
por meio de lâminas a fresco, sendo observadas características como a formação de esporos
de reprodução sexuada, brotamento, e a forma vegetativa predominante. Todas os isolados
de leveduras foram isoladas e identificadas de acordo com o protocolo do Laboratório de
Microbiologia e Biotecnologia (LAMBIO), de acordo com métodos descritos por Yarrow
(1998) e as chaves taxonômicas presentes em Kurtzman e Fell (1998).
Figura 7: Características morfológicas das leveduras
3.5 Armazenamento
As colônias puras foram estocadas em geladeira a cerca de 4ºC e em freezer a -80ºC.
Para o armazenamento em geladeira, uma colônia de cada isolado foi inoculada em tubo
contendo meio GYMP inclinado. Após 24 horas foi acrescentada uma camada de óleo
mineral esterilizado e as leveduras foram estocadas em geladeira. Para o armazenamento a -
80ºC, após serem purificadas, uma colônia de cada isolado foi inoculada em caldo GYMP e
incubada a 25ºC. Após 24 horas, em criotubos esterilizados de 2 ml, foram adicionados 0,8
ml da cultura, 0,2 ml de glicerol estéril e as amostras foram estocadas em freezer a -80ºC.
3.6 Caracterização fisiológica e identificação das leveduras
A caracterização fisiológica das leveduras foi realizada a partir da utilização de testes
de assimilação de compostos de carbono, entre açúcares e outros carboidratos, compostos
nitrogenados, assimilação de compostos amilóides e osmotolerância, teste para
21
diferenciação de basidiomicetos (DBB), produção de ácidos, fermentação de glicose e
crescimento em diversas temperaturas. A técnica utilizada foi a de replica plating, em que as
linhagens foram submetidas a métodos auxanográficos em meio sólido, onde se utiliza um
replicador manual com 25 poços (Fig. 8).
Figura 8: Assimilação de carboidratos. Metodologia da Réplica Plating.
3.6.1 Assimilação de fontes de Carbono
Durante 21 dias foi observado o crescimento das linhagens de leveduras em
compostos de carbono: Glicose, Galactose, L-sorbose, Maltose, Sacarose, Celobiose,
Trealose, Lactose, Melibiose, Rafinose, Melezitose, Inulina, Amido solúvel, D-xilose, L-
arabinose, D-arabinose, Ribose, L-ramnose, Etanol, Glicerol, Eritritol, Ribitol, Galactitol, D-
manitol, D-Glucitol, Alfa-metil-D glucosideo, Salicina, Glu-lactona, Gluconato, DL-lactato,
Succinato, Citrato, M-inositol, Metanol, Hexadecano, D-glicosamina, Xilitol, Acetona,
Etilacetato, Isopropanol, N-glucosamina.
3.6.2 Assimilação de Compostos Nitrogenados
Foi observado o crescimento das linhagens em compostos nitrogenados: nitrato,
nitrito, lisina, cadaverina, etilamina.
3.6.3 Assimilação de Compostos Amilóides e Osmotolerância
Foi testada a habilidade de crescimento das linhagens de leveduras em compostos
amilóides e em concentração osmótica elevadas de 10% NaCl e a 50% Glicose. O teste de
osmotolerância serve para verificar a tolerância das leveduras a diferentes pressões
22
osmóticas. Também foi observado se as leveduras possuem resistência ao acido acético,
resistência em cicloheximida e liquefação da gelatina.
3.6.4 Teste para Diferenciação de Basidiomicetos (DBB)
Aplicou-se o teste para diferenciação de basidiomicetos: Diazônio Blue B (DBB)
obtido incubando-se em BOD à 25°C por 24-48 horas até 7 dias em meio ágar sabouraud.
Decorrido este período, as culturas foram transferidas para estufa a 55-60°C por 16 horas.
Aplicou-se duas gotas do reagente DBB na superfície das colônias.A reação é positiva se as
mesmas tomam a cor vermelho-escuro ou vermelho-violeta.
3.6.5 Produção de Ácidos
Foi verificada a capacidade de produção de ácido. Ao redor das colônias positivas
(colônias que hidrolisaram o substrato), formaram-se halos translúcidos (Fig. 9). A formação
de halo pequeno foi considerada (w) fraca, e a não formação do halo foi considerada (-)
negativa.
Figura 9: Formação de halo de hidrólise (seta)
3.6.6 Teste de Fermentação
O perfil fermentativo foi testado a partir da fermentação da glicose, galactose,
maltose, sacarose, rafinose e trealose. Todas as culturas foram inoculadas em tubos de
ensaio contendo tubos de Durham invertidos, com 2 mL de caldo peptonado autoclavado e
adicionado 1 mL de solução a 6% do açúcar a ser testado, esterilizado por filtração em
Halo
23
membrana de celulose de 0,22µm de porosidade (MILLIPORE). As leituras foram
realizadas de 24, 48 e 72 horas e 7, 14 dias. Foram considerados positivos os tubos que
apresentaram a formação de gás no interior dos tubos de Durhan, segundo a seguinte escala:
fraco (w) quando poucas bolhas de gás foram observadas; (+1) quando cerca de 1/3 do tubo
foi ocupado pelo gás; (+2) quando 1/2 do tubo foi ocupado pelo gás; e (+3) quando o tubo
estiver com mais de sua metade preenchida pelo gás (Fig. 10).
Figura 10: Exemplo de fermentação, gás capturado nos tubos de Durhan (seta).
3.6.7 Tolerância a altas temperaturas
Foi testada a tolerância das colônias a altas temperaturas, verificando-se a habilidade
de seu crescimento em temperaturas de 37°C e 40°C. As leituras foram feitas através de
cartão de Wickerham (Kreeger van Rij, 1984) em 24, 48 e 72h de incubação, e considerados
positivos aqueles cuja densidade fosse equivalente a 2+ ou 3+. O cartão de Whickerham é
composto de três linhas pretas que servem de referência na estimativa da concentração
celular da suspensão de células. A avaliação é feita de forma comparativa numa escala de 0
até 3, sendo considerados como crescimento (0) com poucas células, linhas pretas
totalmente visíveis; (1) densidade fraca, linhas visíveis, pouco embaçadas; (2) densidade
média, linhas embaçadas e difusas; e (3) densidade forte, não se pode ver as linhas pretas
(Fig. 11).
Produção de gás
24
Figura 11: Cartão de Wickerham - Escala de avaliação de concentração celular, indicando a forma comparativa (TOSTA, 2004).
3.7 Utilização da técnica de RAPD-PCR
Isolados de leveduras cuja identificação não foi possível pelas técnicas usuais de
Yarrow (1998), foram submetidas à técnica de RAPD-PCR para realizar o agrupamento das
mesmas. A extração do DNA de leveduras foi feita por meio da homogeneização de uma
alçada de cultura pura em 500L de H2O Mili-Q estéril em tubo eppendorf de 2 mL. Em
seguida, os tubos foram resfriados durante 20 minutos em freezer a -80º C e depois fervidos
durante 10minutos.
Para a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), foi adotado o Iniciador
EI1 (5’-CTG GCT TGG TGT ATG -3’). As amplificações foram feitas em volume de 20 µL
contendo 0,2 U/μL de Taq DNA polimerase, solução tampão da Taq à 1X, MgCl2 à 1,0 mM,
desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs) à 0,3 mM, 10 pmols do Iniciadorr (EI1) além de
2,0μL de DNA de cada isolado e água de injeção para um volume final.
As reações foram realizadas em termociclador (PxE 0.2 Thermal Cycler – Thermo
Electron Corporation) com 1 ciclo inicial a 92ºC por 3 minutos; 40 ciclos de desnaturação a
92ºC por 1 minuto; anelamento do primer a 35ºC por 1 minuto, e extensão a 72ºC por
1minuto e 30 segundos, seguidos de um ciclo final de 72ºC por 10 minutos. Por fim os
amplicons foram desenvolvidos por eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5% (m/v)
por cerca de 1 hora a 90 volts, corados com brometo de etídio (0,2μg/mL) e visualizados sob
luz UV em câmara de transluminação.
Os dados de RAPD foram transformados em variáveis binárias, ou seja, o número
zero significou ausência da banda e o numero 1 significou presença da banda. A construção
do dendograma foi realizada por meio do software TREECON for Windows versão 1.3. O
dendograma agrupou os isolados, mostrando o nível de similaridade genética entre eles.
25
3.8 Seqüenciamento do rDNA
Cinqüenta e quatro isolados foram submetidas ao seqüenciamento do domínio
variável D1/D2 da subunidade maior do rDNA e a região espaçadora interna de transcrição
gene 5.8S. Foram amplificadas pela reação em cadeia da polimerase a partir de células
íntegras de acordo com os protocolos de Marinoni e Lachance (2004). O DNA foi
seqüenciado e as seqüências editadas usando o programa DNAMAN versão 4.0. As
seqüências de espécies já descritas foram obtidas do GenBank. Todo este procedimento foi
realizado com a colaboração do Dr. Carlos Rosa (Instituto de Ciências Biológicas - Depto.
Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG).
3.9 Comparação das comunidades de leveduras
A comparação entre as comunidades de leveduras das três áreas estudadas foi
baseada no perfil fisiológico dos isolados que formam a comunidade de leveduras associada
a C. brasiliense em cada área. Este perfil foi construído para cada espécie, a partir de
compostos utilizados pelas leveduras durante os testes de assimilação (41 carboidratos),
fermentação de glicose, termotolerância e osmotolerância de acordo com Heed et al. (1976)
e Starmer (1981). Estes valores foram multiplicados pela proporção representativa de cada
espécie na comunidade de leveduras de acordo com Rosa et al. (1995). A análise de
similaridade entre as comunidades foi calculada pelo coeficiente de correlação de Bray-
Curtis com auxilio do Software Past versão 1.34 (HAMMER et. al., 2001).
3.10 – Índice de diversidade de leveduras associadas a C. brasiliense
A diversidade de espécies de leveduras foi calculada por cada área. Para esta medida
foi utilizado o índice de diversidade (OD), em que OD = (∑ip²j)-1-1, também usado por
Morais et al. (1995) e tem a seguinte interpretação: OD = probabilidade de dois indivíduos
selecionados ao acaso da amostra serem de diferentes espécies, onde:
P = corresponde à proporção de uma dada espécie i em uma amostra j, calculada como a
freqüência de ocorrência de i/freqüência total de n espécies na amostra j.
Este índice foi modificado do popular índice de Simpson, sendo usado como medida
alternativa de diversidade usando o conceito de probabilidade estatística.
26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Distribuição espacial do C. brasiliense e comunidades de leveduras
A espécie C. brasiliense Camb. (Clusiaceae), além de ocorrer em florestas higrófilas,
distribui-se, também, em determinados locais do domínio do cerrado, sempre condicionada à
condição de umidade do solo. Nos fragmentos florestais inundáveis - Ipucas, é uma das
espécies predominantes, e apresentou o segundo maior valor de cobertura (BRITO, 2005).
Essa espécie está sempre condicionada à umidade do solo e tende a ocorrer nas áreas mais
úmidas nas florestas de galerias, e tolera inundações, sendo comum nas várzeas amazônicas.
Por meio do índice de Payandeh, foi realizada a estimativa do padrão de distribuição
espacial para C. brasiliense nas três áreas estudadas. O padrão de distribuição espacial de
uma espécie é representado por sua distribuição na área em estudo, em termos de freqüência
de ocorrência dentro das unidades amostrais coletadas (JANKAUSKIS, 1990). Na Área 01,
a distribuição espacial ocorreu de forma aleatória (P= 0,25). Nesta área, os indivíduos de C.
brasiliense são adultos, com cerca de 30 m de altura e encontram-se em área remanescente
com pouca interferência antrópica. Para Nascimento (2001), espécies vegetais de grande
porte apresentam esse padrão aleatório, com baixa densidade de indivíduos, pois podem
aproximar-se de sua distribuição natural na floresta, por serem espécies de maior
longevidade. As árvores, com maiores diâmetros e alturas, muitas vezes, são representadas
por indivíduos em senescência natural e com um maior espaçamento entre os indivíduos que
apresentam uma baixa densidade na vegetação e uma distribuição aleatória de seus
indivíduos adultos na comunidade vegetal.
Na Área 02, a distribuição ocorreu de forma agregada (P= 16,07). A densidade de
indivíduos para esta área foi alta em relação às demais, e isso se deve ao fato de que os
indivíduos de C. brasiliense nesta área são jovens, encontrando-se próximos uns aos outros.
A Área 02 corresponde a uma Ipuca ainda em formação com poucos indivíduos adultos e
muitos jovens. Foram encontrados muitos indivíduos de Birsonima sp. (murici), que indica
que este fragmento está em processo de formação (MARTINS, 1999). Verificou-se também
a presença de lianas, indicador de perturbações ambientais e uma forte interferência
antrópica por meio de pastagens. O grau de agregação pode apresentar diferentes valores,
com as plantas das menores classes de tamanho apresentando maior tendência ao
agrupamento (CARVALHO, 1983).
27
Na Área 03 a distribuição também ocorreu de forma agregada (P= 3,51). É um
fragmento que está em formação, porém há pouca interferência antrópica. Nesta área, os
indivíduos de C. brasiliense ocorrem em pequeno número, com médias semelhantes de
jovens e adultos. O índice de agregação nesta área foi baixo em relação à Área 02. Por
apresentarem médias semelhantes de jovens e adultos, a agregação pode está relacionada
apenas aos indivíduos jovens que permanecem mais próximos.
Nas três áreas estudadas, duas apresentaram os valores obtidos da Razão
Variância/Média superiores a 1, destacando que os indivíduos de C. brasiliense apresentam
uma distribuição espacial agregada ou, tendendo à agregação na vegetação. Essa tendência
também foi observada por Marques e Joly (2000) em que reconheceram diferentes
intensidades de agrupamentos de plantas de C. brasiliense, indicando a distribuição
agregada dos indivíduos em todas as classes de tamanho, principalmente jovens e
subadultos.
O padrão de distribuição espacial das comunidades de leveduras foi estimado e
comparado com o padrão de distribuição espacial da população de C. brasiliense nas três
áreas (Fig. 12). Este padrão foi calculado como P = Variância do número de isolados por
quadrado/média do número de isolados por quadrado.
Figura 12. Distribuição de Calophyllum brasiliense e comunidades de leveduras nas três áreas estudadas (Pi 1,0 - distribuição aleatória; 1,0 Pi 1,5 - tendência ao agrupamento;
e Pi 1,5 – distribuição agrupada).
Na Área 01, a distribuição da comunidade de leveduras ocorreu de forma agregada
(P= 1,62), diferindo da distribuição de C. brasiliense que ocorreu de forma aleatória.
28
Starmer (1981) apud Rosa et al. (1995) afirmam que os fatores ecológicos que determinam a
distribuição de leveduras podem estar relacionados à distribuição de habitat ao longo de um
gradiente local e a insetos que vetorizam esses locais. A distribuição agregada no habitat é
esperada tendo em vista que poucos ambientes são homogêneos, e os vetores são
provavelmente específicos. É conhecido o fato de que Insecta tem tendência a distribuição
agregada no ambiente (SOUTHWOOD, 1978). Mesmo nas áreas em que os indivíduos de C.
brasiliense se distribuem aleatoriamente, a distribuição de leveduras depende da existência
do substrato específico, o exsudado, e sua agregação pode estar relacionada ao estagio de
desenvolvimento deste substrato preferido (KAINOH et al., 1980; FOSTER et al., 1989).
Na Área 02, a distribuição das leveduras ocorreu de forma agregada (P=6,95)
acompanhando a distribuição de C. brasiliense que também ocorreu de forma agregada. E
isso pode está relacionado com a exsudação maior de C. brasiliense nesta área, que
consequentemente é mais visitado por insetos e colonizado pelas leveduras. Na Área 03, a
distribuição da comunidade de leveduras tende ao agrupamento (P=1,34) diferindo da
distribuição de C. brasiliense que ocorreu de forma agregada.
4.2 Inventário taxonômico das leveduras associadas a exsudados de C. brasiliense
Nas três áreas estudadas foram obtidas 156 amostras de exsudados de C. brasiliense
e 173 isolados de leveduras. Dos 173 isolados, 45 foram obtidos na Área 01, na Área 02
foram obtidos 81 isolados e na Área 03, 47 isolados de leveduras (Tab. 1). Na Área 01
foram identificadas 30 espécies, sendo 14 encontradas apenas nesta área. Na Área 02 foram
identificadas 36 espécies, com 17 encontradas somente nesta área. E na Área 03 foram
identificadas 22 espécies, sendo 11 encontradas apenas nesta área.
Tabela 01-Número de amostras e isolados de leveduras de exsudado de Calophyllumbrasiliense na área de estudoLocalidade Nº. de amostras Nº. de isolados Nº. de espécies
Área 01 42 45 30 -14
Área 02 74 81 36 - 17
Área 03 40 47 22 - 11
Total 156 173 62
As leveduras ascomicéticas e seus anamorfos representaram (91,3%) dos isolados,
uma predominância que também foi detectada em outros estudos. Leveduras com afinidade
ascomicética são freqüentes em Drosophila (MORAIS et al., 1992) e insetos que estão em
29
íntima associação com frutos. A predominância de gêneros ascomicéticos também foi
demonstrada por Lachance et al. (2001) em estudos com flores efêmeras. Rosa et al. (1995)
também observaram essa predominância de leveduras ascomicéticas associadas a cactos de
restinga no sudeste do Brasil. As leveduras basidiomicéticas representaram apenas (8,6%)
do total de isolados. Foram identificados 9 gêneros ascomicéticos e 3 basidiomicéticos.
Candida foi o gênero mais freqüentemente encontrado (58,1%) seguido do gênero
Pichia (11,3%) e Cryptococcus (8,1%) (Fig. 13). Os demais gêneros encontrados foram:
Aureobasidium, Clavispora, Debaryomuces, Kluyveromyces, Kodamaea, Sporopachydermia
e Torulaspora, entre os gêneros ascomicéticos e Kwoniella e Rhodotorula entre os
basidiomicéticos.
Figura 13: Porcentagem de gêneros de leveduras isolados de Calophyllumbrasiliense
Dos 173 isolados de leveduras, foram identificadas 62 espécies. A maioria das
espécies pertenciam ao gênero Candida (36), sendo encontrado em todas as áreas de coleta
(Tab. 2). Prada e Pagnocca (1997), estudando a presença de leveduras ascomicéticas em
frutos de ocorrência natural em uma Floresta Tropical, observaram que a maioria das
espécies de leveduras isoladas pertencia ao gênero Candida. Este resultado também foi
observado por Morais et al. (1995) em sucessão de leveduras do fruto Parahancornia
amapa.
As espécies mais frequentes em exsudado de C. brasiliense nas três áreas, (53,1% do
total de isolados) foram: Candida parapsilosis Langeron e Talice (26), C. naeodendra Van
30
der Walt et al. (10), C. guilliermondii var. guilliermondii Langeron e Guerra (7),
Cryptococcus laurentii Skinner (6), Kodamaea ohmeri Yamada et al. (30), Kluyveromyces
lactis var. drosophilarum Shehata et al. (6) e Pichia guilliermondii Wickerham (7). Candida
parapsilosis e K. ohmeri, juntas representaram 30,6% do total dos isolados coletados. A
espécie C. parapsilosis foi encontrada como importante espécie de levedura associada a
Drosophila na Floresta Atlântica (MORAIS et al., 1995). Também foi encontrada em
trabalhos de diversidade de leveduras com plantas e insetos em três diferentes ecossistemas
no Brasil (MORAIS et al., 2006). O clado Kodamaea parece relativamente recente, e K.
ohmeri, em virtude de sua menor especialidade ecológica e da posição na filogenia do
rDNA, pode representar uma forma ancestral. Isso é coerente com o isolamento de K.
ohmeri a partir de um número de diferentes substratos, incluindo alimentos e espécimes
clínicos (ROSA et al., 1999). A distribuição de K. ohmeri, encontradas em trabalhos de
leveduras em algumas abelhas, é menos compreendida. Tem sido isolado por ocasião em
flores e também de besouros nitidulídeos encontrados em flores e pode não ser uma espécie
transitória do filoplano (ROSA et al., 2003).
Na Área 01, C. naeodendra (3), Cryptococcus laurentii (3) e P. guilliermondii (6)
foram as espécies predominantes. Cr. Laurentii e Aureobasidium pullulans foram as
espécies de leveduras prevalentes em nectários extraflorais de Senna australis e S.
bicapsularis em ecossistemas de restinga (ROSA et al., 1995). Na Área 02, as espécies que
predominaram foram C. guilliermondii var. guilliermondii (3), C. naeodendra (5), C.
parapsilosis (22), K. ohmeri (14) e P. sydowiorum Scott e Van der Walt (3). Na Área 03, C.
guilliermondii var. membranifaciens Lodder e Kreger (3), C. parapsilosis (3), C. silvanorum
Van der Walt et al. (3) e K. ohmeri (14) foram as mais ocorrentes. Candida guilliermondii
var. membranifaciens foi encontrada associada a frutos de diferentes espécies de
angiospermas (PRADA e PAGNOCCA, 1997) e C. silvanorum foi isolada pela primeira
vez de uma árvore infestada por besouros na África do Sul e foi descrita com apenas 1
isolado (VAN DER WALT, 1971 apud KURTZMAN e FELL, 1998). A maioria das
espécies foram representadas por apenas 1 isolado (71,6%). As espécies C. homilentoma
Van der Walt e Nakase, C. maltosa Komag et al., C. melibiosica Buckley e Uden, C. mogii
Vidal-Leiria, C. valdiviana Grinbergs e Yarrow, Candida sp.3, Candida sp.6, Candida sp.7,
Candida sp.9, Candida sp.13, Cr. Albidus Skinner, K. thermotolerans Yarrow, P. anomala
Kurtzman e P. triangularis Smith et al., foram encontradas apenas na Área 01 (Fig. 14).
Enquanto Aureobasidium pullulans, C. bertae Ramírez e González, C. butyri Nakase, C.
blankii Buckley e Uden, C. dendronema (Van der Walt et al, C. famata Yarrow e Meyer, C.
31
saitoana Nakase e Suzuki, C. tenuis Diddens e Lodder, Candida sp.1, Candida sp.4,
Candida sp.11, Candida sp.12, Cr. Amylolentus (Van der Walt et al, Cr. Skinneri Phaff e
Carmo Souza, Cr. Terreus Di Menna, Debaryomyces coudertii Saëz, P. sydowiorum Scott,
Van der Walt, Sporopachydermia quercuum Lachance e Torulaspora delbrueckii Lindner,
foram encontradas apenas na Área 02. As espécies C. bombicola (Spencer et al., C.
guilliermondii var membranifaciens, C. oregonensis Phaff e Carmo Souza, C. paludigena
Golubev e Blagodatskaja, C. peltata Yarrow, Candida sp.2, Candida sp.5, Candida sp.8,
Candida sp.10, Deb. Yamada Van der Walt e Johannsen, e P. hampshirensis- similar, só
foram encontradas na Área 03. A espécie P. hampshirensis – similar (Lag 703) foi
seqüenciada e se trata provavelmente de uma espécie nova.
Figura 14 – Distribuição das espécies de leveduras de exsudado de Calophyllum brasiliensepor área de ocorrência.
Candida homilentoma,C. maltosa, C. melibiosica, C. mogii, , C. valdiviana,
Área 01 Área 02
Área 03
Cryptococcus albidus, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia anomala e P. triangulares,
Aureobasidium pullulans, Candida bertae, C. butyri, C. blankii, C. derdronema, C. famata, C. saitoana, C. tenuis,
Debaryomyces coudertii, Pichia sydowiorum, Sporopachydermia quercuume Torulaspora delbrueckii,
Candida bombicola, C. guilliermondii var. membranifaciens, C. oregonensis, C. paludigena C. peltata, Candida sp.2, Candida sp.5, Candida sp.8, Candida sp.10, Debaryomyces yamada, e Pichia hampshirensis- similar,
Candida guilliermondii var. guilliermondii, C. insectorum,C. naeodendra,C. parapsilosis,C. silvanorum,Cryptococcus Laurentii,Kodamaea ohmeri,Kluyveromyces lactis var drosophilarum
Candida lusitaniaeClavispora lusitaniaeDebaryomyces vanrijiae var. vanrijiaeKluyveromyces lactis var lactisKwoniella mangroviensisPichia guilliermondii0
Pichia toletana Candida saitoanaDebaryomyces. vanrijiae var yarrowii
Candida sp.3, Candida sp.6, Candida sp.7, Candida sp.9, Candida sp.13
Candida sp.1, Candida sp.4, Candida sp.11, Candida sp.12, Cryptococcus amylolentus, Cr. skinneri, Cr. terreus,
32
Treze isolados não foram identificados em nível de espécie, sendo identificados em
nível de gênero. Todas as espécies não identificadas foram classificadas como Candida sp.
O gênero Candida é bastante heterogêneo, possuindo uma definição muito abrangente, e
praticamente qualquer levedura ascomicética de reprodução assexuada que não preenche os
critérios para ser classificada em outro gênero é definida como Candida.
Tabela 02 - Leveduras isoladas de exsudados de Calophyllum brasiliense em três áreas da Planície do Araguaia- TO.
Espécies de leveduras Área 01 Área 02 Área 03 Total(n=42) (n=74) (n=40) (n =156)
01 Aureobasidium pullulans Arnaud 1 1
02 Candida bertae Ramírez e González 2 2
03 C. bombicola Spencer et al. 1 1
04 C. blankii Buckley e Uden 2 2
05 C. butyri Nakase 1 1
06 C. dendronema Van der Walt et al. 1 1
07 C. famata Yarrow e Meyer 1 1
08 C. guilliermondii var guilliermondii Langeron e Guerra 2 3 2 7
09 C. guilliermondii var. membranifaciens Lodder e Kreger 3 3
10 C. homilentoma Van der Walt e Nakase 1 1
11 C. insectorum Scott et al. 1 1 2 4
12 C. lusitaniae Uden e Carmo Souza 1 1 1
13 C. maltosa Komag et al. 1 1
14 C. melibiosica Buckley e Uden 1 1
15 C. mogii Vidal-Leiria 1 1
16 C. naeodendra Van der Walt et al 3 5 2 10
17 C. oregonensis Phaff e Carmo Souza 1 1
18 C. paludigena Golubev e Blagodatskaja 1 1
19 C. parapsilosis Langeron e Talice 1 22 3 26
20 C. peltata Yarrow 1 1
21 C. saitoana Nakase e Suzuki 1 2 3
22 C. silvanorum Van der Walt et al. 1 1 3 5
23 C. tenuis Diddens e Lodder 2 2
24 C. valdiviana Grinbergs e Yarrow 1 1
25 Candida sp.1 1 1
26 Candida sp.2 1 1
27 Candida sp.3 1 1
28 Candida sp.4 1 1
29 Candida sp.5 1 1
33
Cont.
Espécies de leveduras Área 01 Área 02 Área 03 Total(n=42) (n=74) (n=40) (n =156)
30 Candida sp.6 1 1
31 Candida sp.7 1 1
32 Candida sp.8 1 1
33 Candida sp.9 1 1
34 Candida sp.10 1 1
35 Candida sp.11 1 1
36 Candida sp.12 1 1
37 Candida sp.13 1 1
38 Clavispora lusitaniae Rodrigues de Miranda 2 1 3
39 Cryptococcus albidus Skinner 1 1
40 Cr. Amylolentus Van der Walt et al. 1 1
41 Cr. Laurentii Skinner 3 1 2 6
42 Cr. Skinneri Phaff e Carmo Souza 1 1
43 Cr. Terreus Di Menna 1 1
44 Debaryomyces coudertii Saëz 1 1
45 Deb. vanrijiae var. vanrijiae (Abadie et al. 2 1 3
46 Deb. vanrijiae var. yarrowii Santa María e García 1 1 2
47 Deb. Yamadae Van der Walt e Johannsen 1 1
48 Kodamaea ohmeri (Yamada et al. 2 14 14 30
49 Kluyveromyces lactis var. lactis Van der Walt 1 1 2
50 K. lactis var. drosophilarum (Shehata et al. 2 2 2 6
51 K. thermotolerans Yarrow 1 1
52 Kwoniella mangroviensis (Statzell-Tallman et al. 1 1 2
53 Pichia anomala Kurtzman 1 1
54 P. guilliermondii Wickerham 6 1 7
55 Pichia hampshirensis- similar 1 1
56 P. lynferdii Van der Walt e Johannsen 1 1
57 P. sydowiorum Scott, Van der Walt 3 3
58 P.toletana Kreger-van Rij 2 1 3
59 P. triangularis Smith e Batenburg-van der Vegte 1 1
60 Rhodotorula mucilaginosa Jörgensen 1 1 2
61 Sporopachydermia quercuum Lachance 1 1
62 Torulaspora delbrueckii Lindner 1 1
Total de isolados 45 81 47 173
N= número de amostras
34
4.3 Perfil fisiológico das leveduras de exsudado de C. brasiliense
Segundo Lachance e Starmer (1986) a maioria das populações de leveduras
associadas a algum tipo de substrato deve refletir a fonte de carbono disponível. A
identificação de leveduras é baseada em seu perfil fisiológico e comportamento bioquímico
(KURTZMAN e FELL, 1998). Deste modo, é possível fazer inferências acerca dos
substratos ocupados por uma comunidade de leveduras por meio do estudo de seu perfil
fisiológico. O procedimento básico para definição do perfil fisiológico foi realizado com
173 isolados (Tab.03).
Tabela 03 - Perfil fisiológico de cada comunidade de leveduras de exsudado de C. brasiliense nas áreas estudadas
Assimilação Área 01 Área 02 Área 03Galactose 43 78 46L-sorbose 29 59 32Maltose 44 76 47Sacarose 41 74 46Celobiose 34 49 40Trealose 72 73 46Lactose 6 10 7Melibiose 20 21 10Rafinose 26 29 27Melezitose 38 59 24Inulina 0 1 1Amido 3 3 2D-xilose 37 63 25L-arabinose 26 58 24D-arabinose 18 22 8D-ribose 22 24 24L-ramnose 20 25 18Etanol 38 69 45Glicerol 40 67 44Eritritol 14 30 13Ribitol 39 70 42Galactitol 22 24 9D-manitol 43 55 47D-glucitol 39 74 45AM-Glicosideo 39 77 44Salicina 21 35 34DL-lactato 16 23 8Succinato 42 71 45Citrato 37 68 41M-inositol 7 15 6Metanol 2 12 0Hexadecano 1 10 9D-glucosamina 19 31 17Xilitol 31 37 19Acetona 11 6 2Etil acetato 17 35 16Isopropanol 3 5 4Gluconato 26 56 29N - glucosamina 38 70 42Nitrato 2 18 2
35
Cont.
Assimilação Área 01 Área 02 Área 03Nitrito 3 17 6L- lisina 41 76 48Cadaverina 45 78 48Etilamina 32 63 33Crescimento em 10% NaCl 31 63 3250% Glicose 25 57 35Acido Acético 45 79 47Carbonato Cálcio 15 42 25Gelatina 8 29 23Cicloheximida 37 62 30TEMPERATURA 37ºC 42 63 4640ºC 29 49 33FERMENTAÇÃO Glicose 36 60 34Galactose 17 27 10Maltose 1 7 5Sacarose 18 21 24Lactose 0 0 0Rafinose 6 0 2Trealose 26 34 11
A maioria das leveduras possui um perfil assimilatório largo, com diversidade de
substratos utilizáveis. Para os açúcares glicose, galactose, maltose, sacarose e trealose houve
uma assimilação acima de 90% das leveduras associadas aos exsudados. A assimilação de
galactose foi de 96,5% , maltose 96,5%, sacarose 93,0%, e trealose 93,0% dos isolados que
também assimilam glicose. L-sorbose, celobiose e melezitose, também são assimilados pelas
leveduras em mais de 60% (Tab. 04). Na assimilação de pentoses, obteve-se 93,6 % de
assimilação de D-xilose, 62,4% de L-arabinose, 40,5% de D-ribose e 36,4% L-ramnose. A
maioria desses compostos são difundidos em plantas (STARMER, 1981). Na assimilação de
álcoois, 87,8% assimilaram etanol e 39,3% assimilaram etilacetato. Dos polióis testados,
87,3% das leveduras assimilaram glicerol, 87,3% assimilaram ribitol, 83,8% D-manitol e
91,3% D-glucitol, enquanto 32,9% assimilaram eritritol, 31,8% galactitol e 16,2% M-
inositol. Na utilização de ácidos, 91,3% assimilaram succinato e 84,4% citrato, e apenas
27,2% assimilaram DL-lactato. A comunidade de leveduras de exsudados de C. brasiliense
possui uma extensiva habilidade fisiológica, utilizando compostos comumente encontrados
em plantas na forma livre ou combinada. Estes resultados também foram observados por
Starmer (1981) em leveduras de exsudados de árvores e caules de Pisonia sp. Rosa et al.
(1995) em trabalho semelhante de caracterização de comunidades de leveduras de flores de
cactos, observou que a comunidade de leveduras utilizou açucares hexoses, α e β -
Glicosídeos (exceto trealose), alguns polióis e citrato.
36
Tabela 04 - Perfil de assimilação (%) de todas as espécies de leveduras de exsudado de C.
brasiliense nas três áreas.
Assimilação %
Glicose 100Galactose 96,5L-sorbose 69,4Maltose 96,5Sacarose 93,0Celobiose 71,0Trealose 93,0Lactose 13,3Melibiose 29,5Rafinose 47,4Melezitose 69,9Inulina 1,2Amido 4,6D-xilose 93,6L-arabinose 62,4D-arabinose 27,7D-ribose 40,5L-ramnose 36,4Etanol 87,9Glicerol 87,3Eritritol 32,9Ribitol 87,3Galactitol 31,8D-manitol 83,8D-glucitol 91,3AM-Glicosideo 92,5Salicina 52,0DL-lactato 27,2Succinato 91,3Citrato 84,4M-inositol 16,2Metanol 8,1Hexadecano 11,6D-glucosamina 38,7Xilitol 50,3Acetona 10,9Etil acetato 39,3Isopropanol 6,9Gluconato 64,2N - glucosamina 86,7Nitrato 12,7Nitrito 15,0L- lisina 95,4Cadaverina 98,8Etilamina 73,9Crescimento em 10% NaCl 72,850% Glicose 67,6
37
Cont.
Assimilação %
Acido Acético 98,8Carbonato Cálcio 47,4Gelatina 34,7Cicloheximida 74,6TEMPERATURA 37ºC 87,340ºC 64,2FERMENTAÇÃO Glicose 75,1Galactose 41,5Maltose 10,0Sacarose 48,5Lactose 0,0Rafinose 6,2Trealose 54,6
O perfil fermentativo das leveduras indicou alta ocorrência de fermentadores de
glicose (75,1% do total). Assim como Morais et al. (1995), observaram em estudo sobre a
sucessão de leveduras em fruto Parahancornia amapa, em que 82% dos isolados
apresentaram habilidade fermentativa. Este perfil fisiológico é característico de leveduras
associadas com frutas e outros substratos com alto conteúdo de açúcar (PHAFF et al. 1978;
MORAIS et al. 1992). Em geral, Phaff (1987) descreve que leveduras associadas a flores e
frutos terão perfil fermentativo, mas as leveduras de superfície de folhas e caules serão mais
oxidativas. Assim, esta freqüência de isolados fermentadores indica que o exsudado
assemelha-se a outros substratos açucarados.
A espécie que fermenta um determinado carboidrato, obrigatoriamente deve
assimilá-lo, entretanto, ela pode assimilar e não fermentar o mesmo carboidrato
(MARIANO, 2006). As leveduras que fermentaram glicose foram submetidas a testes de
fermentação de galactose, maltose, sacarose, lactose, rafinose e trealose. As leveduras que
fermentaram galactose representaram 41,5% das leveduras fermentadoras de glicose, 48,5%
sacarose, 54,6% trealose, 10% fermentaram maltose, 6,2% rafinose e nenhuma levedura
fermentou lactose.
O crescimento positivo em concentração osmótica elevada (50% de glicose) foi
67,6%. A osmotolerância também foi observada em comunidades de leveduras de nectários
extraflorais de Senna australis e S. bicapsularis devido à produção de néctar contendo alta
concentração de açúcar, fazendo este habitat seletivo para leveduras osmotolerantes (ROSA
et al.,1995). Spencer et al. (1996) isolou leveduras de exsudado de Prosopis spp. na
38
Argentina e observou que a maioria das espécies de leveduras são osmotolerante e afirmou
que o alto teor de açúcar no exsudado influencia a natureza da comunidade de leveduras
presentes nesse substrato. Em concentração osmótica de 10% de NaCl, 72,8% dos isolados
apresentaram crescimento positivo.
A capacidade de crescer em altas temperaturas resultou em crescimento positivo em
87,3% das leveduras a 37°C e 64,2% a 40ºC. Não foram capazes de crescer acima de 35ºC
apenas 12,7% das leveduras isoladas.
Na assimilação de compostos como n-glucosamina, obteve-se 86,7% de assimilação,
enquanto que em d-glucosamina apenas 38,7% das leveduras assimilaram esse composto.
Nos compostos nitrogenados, 98,8% das leveduras assimilaram cadaverina, 95,4%
assimilaram l-lisina, 73,9% assimilaram etilamina, e apenas 12,7% assimilaram nitrato e
15,0% assimilaram nitrito. A resistência a cicloheximida pelas leveduras de exsudado de C.
brasiliense também foi alta com uma taxa de 74,6%.
O grau de similaridade fisiológica das comunidades de leveduras de exsudado de C.
brasiliense nas três áreas estudadas está representada na figura 14, e nos mostra que há um
alto grau de similaridade no conjunto de características fisiológicas das leveduras associadas
a exsudados de C. brasiliense. Este substrato, por sua especificidade, parece atrair uma
comunidade de leveduras especifica, pelo menos no que concerne às exigências nutricionais.
Os perfis fisiológicos das comunidades de leveduras da Área 01 e Área 03 mostraram
similaridade em torno de 90%, evidenciando uma maior semelhança entre as leveduras
dessas duas áreas do que com as leveduras da Área 02. Isto pode se dever a fatores
relacionados à composição do substrato, isto é, a fatores edáficos, climáticos e fisiológicos
das árvores que influenciam na composição do exsudado. Os indivíduos de C. brasiliense
encontrados na Área 02 representam um conjunto de árvores jovens, e o ambiente
colonizado é uma pastagem degradada, que podem ser fatores relevantes para a
diferenciação notada.
39
Figura 14 - Dendograma representativo da similaridade entre os perfis fisiológicos das comunidades de leveduras de exsudado de C. brasiliense nas três áreas estudadas.
4.4 Identificação presuntiva dos isolados de leveduras
A identificação presuntiva dos isolados de leveduras mostrou que alguns diferem da
linhagem tipo e entre si na assimilação a alguns compostos aos quais foram submetidos para
verificação do comportamento bioquímico. O isolado identificado como P. anomala (Lag
583) diferiu da linhagem tipo nos testes de celobiose e melezitose, com resultados negativo
e positivo, respectivamente. O isolado de P. triangulares (Lag 582) diferiu da linhagem tipo
na assimilação de salicina e crescimento em temperatura a 37ºC com resultado positivo para
os dois parâmetros. O isolado de P. toletana (Lag 754) foi diferente apenas em rafinose com
resultado positivo sendo que na linhagem tipo o resultado é negativo. O isolado de P.
sydowiorum (Lag 590) foi diferente apenas em L-sorbose da linhagem tipo com resultado
negativo. O isolado de P. guilliermondii (Lag 577) diferiu da linhagem tipo em inulina, D-
ribose, salicina, M-inositol com resultado negativo para os três primeiros compostos e
positivo para o último. Os isolados de P. guilliermondii (Lag 630 e Lag 676) diferem do
isolado Lag 577 em melibiose, rafinose e melezitose com resultados negativos para Lag 630
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
0,72
0,75
0,78
0,81
0,84
0,87
0,9
0,93
0,96
0,99
Área03 Área01 Área02
40
e 676 e positivo para Lag 577. Lag 626 e Lag 627 diferiram entre si em melibiose, rafinose,
d-arabinose e l-arabinose com resultados negativos para Lag 627 e positivos para Lag 626.
Os isolados de K. ohmeri (Lag 699, Lag 736, Lag 737, Lag 702, Lag 694, Lag 686,
Lag 687, Lag740, Lag 738, Lag 689, Lag 695 e Lag 698) não assimilam lactose, melibiose,
rafinose, melezitose, inulina amido, d-xilose, d-arabinose, d-ribose e l-ramnose. Os isolados
Lag 645, Lag 655, Lag 632, Lag 634, Lag 660, Lag 733 e Lag 654 diferiram apenas em
rafinose dos isolados citados anteriormente com resultado positivo para este teste. Os
isolados Lag 724, Lag 747 e Lag 661 tiveram resultado positivo para melezitose e negativo
para os testes citados acima. Os isolados Lag 648 e Lag 649 diferiram em rafinose e
melezitose das demais, com resultado positivo. Os isolados Lag 622 e Lag 651 tiveram
resultados positivos em melezitose, d-xilose e l-arabinose, deferindo dos isolados anteriores
que não crescem nestes compostos.
O isolado de K. lactis var lactis (Lag 588) diferiu da linhagem tipo em rafinose em
que obteve resultado positivo no teste e na linhagem tipo é negativo. O isolado de K. lactis
var drosophilarum (Lag 658) difere da linhagem tipo em lactose e melezitose com resultado
negativo e na linhagem tipo o resultado é positivo; difere ainda em melibiose em que obteve
resultado positivo e a linhagem tipo não cresce neste composto. O isolado Lag 659 difere do
isolado Lag 658 em l-arabinose com resultado positivo. Lag 596 também difere de Lag 658
em rafinose com resultado negativo. Lag 675 cresceu em d-ribose e em Lag 658 o resultado
é negativo. Lag 717 é positivo em l-arabinose e d-ribose, sendo que no isolado Lag 658 foi
negativo.
O isolado de D. coudertii (Lag 756), não cresceu em amido, D-ribose, e L-ramnose,
diferindo da linhagem tipo e cresceu em AM-glicosídeo, sendo que na linhagem tipo o
resultado é negativo. O isolado de D. vanrijae var vanrijae (Lag 636) foi negativo em
amido, D-arabinose, D-ribose, L-ramnose e galactitol, sendo que na linhagem tipo ocorre
assimilação destes compostos. Este isolado foi o único que apresentou maior numero de
compostos diferindo da linhagem tipo. Lag 637 diferiu de Lag 636 em celobiose com
resultado negativo. Lag 700 não cresceu em celobiose e glicerol, com crescimento positivo
em Lag 636.
Candida blankii (Lag 722) cresceu em melibiose e na linhagem tipo este resultado é
negativo. Os compostos: amido, d-glucitol e salicina não cresceram neste isolado sendo que
na linhagem tipo todos são positivos. O isolado de C. oregonensis (Lag 746) cresceu em
galactose e glicerol e não crescem na linhagem tipo. O isolado de C. melibiosica (Lag 711)
obteve resultado negativo para melibiose e melezitose e este resultado é positivo para a
41
linhagem tipo. O isolado de C. valdiviana (Lag 714) cresceu em melibiose inositol e N-
glucosamina, diferindo da linhagem tipo que não cresce nesses compostos. O isolado de C.
peltata (Lag 652) não cresceu em L-sorbose, D-arabinose e D-ribose, enquanto na linhagem
tipo o resultado é positivo. C. dendronema (Lag 623) obteve resultado negativo em
melezitose, D-arabinose e galactitol, diferindo da linhagem tipo. C. bertae (Lag 690) não
cresceu em d-ribose e hexadecano, com resultado positivo na linhagem tipo. O isolado de C.
insectorum (Lag 669) não cresceu em l-arabinose, d-arabinose e hexadecano, sendo todos
positivos na linhagem tipo. O isolado de C. naeodendra (Lag 729) não foi capaz de crescer
em l-sorbose, amido, e xilitol, diferentemente da linhagem tipo que cresce nestes compostos.
O isolado de C. naeodendra (Lag 633) não cresceu em d-arabinose diferindo de Lag 729, e
Lag 607 não cresceu em D-ribose, diferindo do isolado Lag 729. O isolado de C.
parapsilosis (Lag 611) não assimilou melezitose, D-xilose e L-arabinose e assimilou
celobiose. A linhagem tipo desta espécie assimila os três primeiros compostos e não assimila
o ultimo. O isolado de C. parapsilosis (Lag 565) diferiu de Lag 611 em rafinose e D-
arabinose com crescimento positivo. O isolado Lag 672 foi positivo em celobiose, melibiose
e rafinose diferindo de Lag 611. Os isolados Lag 589, Lag 579, Lag 720, Lag 570 e Lag 743
são todos iguais e diferiram da linhagem Lag 611 apenas na rafinose com resultado positivo.
O isolado Lag 643 obteve crescimento positivo em D-xilose e D-arabinose, diferindo do
isolado Lag 611. A maioria dos isolados diferiram das linhagens tipo em dois ou três
compostos, o que é esperado para estes procedimentos identificatórios, e que estimulou a
introdução de metodologias moleculares para identificação de microrganismos, num sistema
polifásico.
4.5 Utilização da técnica de RAPD
As pressões seletivas diferem entre ambientes geográficos, substratos e mesmo sob
condições variáveis de interações ecológicas entre as leveduras pertencentes à comunidade,
e com outros organismos como seus vetores. Assim, é esperado que linhagens de uma
mesma espécie, quando isoladas de regiões geográficas diferentes, em substratos diferentes,
apresentem variações em seu perfil fisiológico.
É importante notar que a utilização do RAPD como instrumento para identificação
dos isolados mostrou-se bastante limitado. Linhagens de uma mesma espécie, provenientes
de exsudados de árvores da mesma área foram agrupadas em “clusters” separados (Fig. 12).
Por exemplo, K. ohmeri que apresentou 30 isolados, dos quais 19 foram submetidos ao
42
sequenciamento do domínio variável D1/D2 da subunidade maior do rDNA e a região
espaçadora interna de transcrição gene 5.8S, foi agrupada pelo RAPD em cinco clusters
diferentes, dos quais dois agruparam leveduras da mesma área, e três agruparam leveduras
de áreas distintas. Isto mostra que esta técnica é refinada o bastante para separar linhagens
da mesma espécie, mas é limitada para marcar identidade específica em uma comunidade.
Assim, a comunidade de leveduras associadas ao exsudado de C. brasiliense pode
ser considerada de alta diversidade intra-específica, o que pode ser evidenciado pelo
pequeno número de clusters formados na comparação dos resultados do RAPD (Fig. 15).
Tosta (2004) estudando a biotipagem de leveduras industriais por meio do sistema “killer”,
com a utilização de cinco iniciadores, mostrou que a técnica de RAPD é satisfatória na
diferenciação de linhagens de Saccharomyces cerevisiae, até mesmo em nível intra-
específico. Xufre et al. (2000) obteve a diferenciação de seis linhagens de Saccharomyces
spp. através da técnica de RAPD. Matienzo (2002) utilizando marcadores moleculares na
identificação de leveduras observou que a reação de RAPD é um método sensível e eficiente
na identificação de linhagens muito semelhantes.
Dentre as espécies prevalentes, os isolados de C. parapsilosis foram agrupados em
seis clusters, sendo um cluster com seis isolados, dois clusters com quatro isolados, um
cluster com três isolados e dois clusters com dois isolados (Tab. 5). Pode-se afirmar que esta
espécie apresenta variações intra-específicas na comunidade associada aos exsudados de C.
brasiliense. Duas linhagens mantiveram-se em separado, sendo uma da Área 02 e uma da
Área 03. Dois clusters agruparam isolados de áreas diferentes: das Áreas 02 e 03 e das Áreas
01 e 02, o que pode sugerir que há uma fonte comum desta espécie para as diferentes áreas
geográficas estudadas e o exsudado é um ambiente de diferenciação, ou que vetores
transitam entre as áreas dispersando as diferentes linhagens da espécie. Os isolados da Área
02 foram agrupados em quatro clusters, e cada um deles tinha isolados seqüenciados de C.
parapsilosis, talvez apoiando a primeira hipótese de que ocorre diferenciação genética no
exsudado. Dentre 27 isolados, dez foram seqüenciados, confirmando a correta identificação
da espécie.
43
Figura 15 - Dendrograma gerado a partir dos dados de similaridade genética de isolados de leveduras de C. brasiliense por meio de marcadores RAPD
44
Kodamaea ohmeri teve isolados agrupados em cinco clusters, sendo um cluster com
cinco isolados, e dois clusters com três e com dois isolados, cada. Duas linhagens se
mantiveram em separado, pertencentes à Área 02 e Área 03. Dois clusters agruparam
isolados da Área 02, um cluster agrupou isolados da Área 03 e um cluster agrupou isolados
das Áreas 01 e 03. Isto pode ser evidencia de fonte comum de leveduras para as diferentes
áreas ou que vetores sejam responsáveis pela disseminação das linhagens entre essas
diferentes áreas.
Isolados de P. guilliermondii foram agrupadas em dois clusters contendo 3 e 2
isolados cada, todos obtidos da mesma área de coleta. Uma linhagem manteve-se separada.
Isto pode ser devido à hipótese de diferenciação no exsudado, e pode fornecer suporte à
proposição de um modelo de metapopulações no ambiente transitório que é o exsudado de
C. brasiliense. Seis isolados, dentre os sete obtidos, foram seqüenciados, confirmando a
identidade taxonômica.
Tabela 05 - Espécies de leveduras agrupadas em clusters e números de isolados por cluster
Espécies de leveduras Número de clusters Número de isolados por cluster
43
6 642
Candida parapsilosis
2
23
5 32
Kodamaea ohmeri
5
2 3Pichia guilliermondii2
Sendo estas espécies as mais freqüentes, pode-se hipotetizar que a alta diversidade
intra-específica pode estar ligada a fenômenos relacionados a divergência evolutiva e
especiação por isolamento geográfico entre as áreas ou por barreiras existentes à dispersão
pelos insetos vetores, ou ainda a pressões de coexistência.
Marinoni e Lachance (2004) estudaram as barreiras reprodutivas entre espécies do
clado Metschnikowia por seleção prototrófica de recombinantes, cariotipagem eletroforética,
análise de restrição de DNA mitocondrial e sequenciamento. A existência de ascósporos
45
inviáveis entre duas variedades de uma mesma espécie, Metschnikowia continentalis
Lachance et al., mostrou que fenômenos de especiação podem ocorrer em alguns clados de
leveduras associadas a substratos efêmeros. O surgimento de recombinantes prototróficos
entre linhagens mutantes de diferentes espécies, M. borealis Lachance et al., M.
continentalis, M. lochheadii Lachance, Metschnikowia sp. (UWO(PS)00-154.1), e C.
ipomoeae Lachance et al., mostra o potencial de trocas gênicas interespécies. As filogenias
obtidas a partir da análise de seqüências de diferentes regiões do DNA não se mostraram
congruentes, evidenciando que a hibridização pode ter ocorrido na natureza, durante o
processo de divergência evolutiva do ancestral comum a este clado.
Outra hipótese plausível é que as metapopulações de leveduras dos exsudados
possam apresentar polimorfismos em seu comportamento assimilativo, talvez por pressões
em direção à coexistência em substrato efêmero. Metapopulação é reconhecida como uma
unidade maior contendo um grupo de subpopulações (populações locais de uma espécie),
ocorrendo em uma determinada região (HANSKI e SIMBERLOFF, 1997). A dinâmica de
metapopulações oferece uma explicação plausível para a manutenção de polimorfismos em
diferentes populações e sistemas, incluindo-se os sistemas killer em leveduras (CZÁRÁN e
HOEKSTRA, 2003). Segundo os autores, um leve trade-off entre produção de toxina e
crescimento populacional é suficiente para manter a coexistência regional de linhagens
matadoras e sensíveis, se a ação matadora é um fenômeno local restrito a algumas manchas
do habitat e populações locais regularmente são extintas e renovadas via recolonização de
manchas vizinhas. A formação de padrões em escala regional não tem participação
importante neste mecanismo, mas interações locais são decisivas. É possível que o
exsudado, também um substrato efêmero e aparentemente rico em carboidratos facilmente
assimiláveis, seja um ambiente onde interações metapopulacionais, baseadas em diferentes
comportamentos assimilativos facilitando a coexistência ou sucessão ocorram.
4.6 Diversidade de leveduras
Os índices de diversidade de espécies relatam o número de espécies e a importância
relativa individual das mesmas na comunidade a que pertencem. As leveduras associadas ao
exsudado de C. brasiliense congregam um grupo de espécies bastante amplo, conforme se
verifica na listagem da Tabela 02, que resultou em um total de 62 espécies distribuídas entre
173 isolados, sendo que 71,6% das espécies foi representada uma única vez, indicando que
são raras no habitat, ou mesmo possivelmente transitórias e contaminantes.
46
Os índices de diversidade OD calculados para o habitat exsudado de C. brasiliense
variaram entre OD = 21,75 para a Área 01, OD = 12,72 para a Área 03 e OD = 9,2 para a
Área 02, o valor mais baixo encontrado (Fig. 16).
Figura 16 – Índice de diversidade de espécies de leveduras de Calophyllumbrasiliense.
Comparação entre habitats tem mostrado que a diversidade de leveduras é alta em
locais preservados, provavelmente como resultado de uma maior diversidade de fontes de
alimentos em florestas primárias do que em áreas perturbadas, onde o habitat é mais
homogêneo (MORAIS et al., 2006). Neste caso, o exsudado de C. brasiliense é o habitat e
substrato das leveduras, e a variação nos valores do índice de diversidade pode associar-se a
alguns fatores como a diversidade de insetos vetores de leveduras visitando os exsudados, e
a diversidade de fontes de inoculo nas três áreas. Assim, a Área 01 apresentou o maior
índice de diversidade provavelmente porque representa um fragmento florestal natural -
Ipuca situado em área de baixa perturbação, circundado por vegetação natural – e não
pastagens, como é o caso da Área 02; e próximo a vários outros fragmentos de estrutura
similar – e não relativamente isolado, como é a Área 03.
A Área 01 situa-se em área de vegetação nativa de campo limpo (varjão limpo) e
sujo (varjão sujo e campo de murundus) em meio ao cerrado senso estrito e distante das
perturbações circunvizinhas, que são áreas de agricultura (Fig. 17). Nesta área, a diversidade
de leveduras deve corresponder a maior diversidade de insetos que visitam o exsudado,
vindos não apenas da própria Ipuca (Área 01), mas de Ipucas vizinhas e dos campos limpos
47
e sujos adjacentes. Estes vetores também podem visitar uma grande diversidade de
substratos, que incluem a vegetação das Ipucas e do mosaico dos campos.
Figura 17 - Área 01: A- Borda da Ipuca, B- Interior e C- Varjão sujo e campo de murundus
A Área 03, tendo apresentado diversidade maior que a Área 02, representa uma área
de vegetação preservada, no entanto com uma distribuição de feições de Ipucas mais
esparsa, ou seja, estes fragmentos apresentam maiores distâncias que na Área 01. Neste
caso, a entomofauna vetora pode estar mais restrita à área delimitada pela Ipuca, e pela
ocorrência de C. brasiliense, e ainda, possivelmente limitada em relação à diversidade de
substratos visitados. É notável que, diferente da Área 01, há uma alta freqüência de
isolamento de K. ohmeri como espécie de levedura prevalente no exsudado, o que pode ter
interferido com os valores do índice OD.
Kodamaea ohmeri também apresenta alta freqüência de ocorrência nos exsudados da
Área 02, que apresentou o menor valor do índice de diversidade. Mais interferente pode ser
a alta freqüência de isolamento de C. parapsilosis nesta área, que em conjunto com K
ohmeri pode ter influenciado no valor de OD. Como discutido acima, as duas áreas 01 e 03
possuem maior similaridade da comunidade, em termos fisiológicos, que a Área 02. Mas há
forte similaridade entre as três áreas, e quando comparadas as listagens de espécies, notamos
que as Áreas 02 e 03 possuem alta ocorrência de K. ohmeri, indicando que esta levedura
pode estar associada ao exsudado de C. brasiliense. Assim como na Área 03, na Área 02, há
menor diversidade de substratos para visitação dos insetos, e maior distancia de fragmentos
florestais semelhantes, separados entre si por pastagens degradadas. Outro fator importante
que pode ter influenciado nos menores valores de OD na Área 02 é a presença de manchas
extensas de Byrsonima próximas à Ipuca com os indivíduos de C. brasiliense amostrados,
que podem ser uma prevalente fonte de inóculos.
A B C
48
Apesar dos índices de diversidade serem menores nas Áreas 02 e 03, esses valores
são consideravelmente altos, comparados com trabalhos realizados por Morais et al. (1995)
em que usaram o mesmo índice e observaram que a diversidade de leveduras de frutos de
Parahancornia amapa em Mocambo, uma reserva florestal situada no estado do Pará, foi de
(OD = 11,7) considerado alto, pois é uma área protegida com alta diversidade de espécies de
plantas, e a diversidade é mais heterogênea nesses locais com alta diversidade do que em
locais homogêneos com baixa diversidade de plantas. Morais et al. (1992) também relatou
que a alta diversidade de recursos de alimentos é também apoiados pelo extensivo perfil
fisiológico de comunidades de leveduras associadas com espécies de Drosophila que
prevalece em locais não perturbados.
Não foram consideradas, neste estudo, variáveis como idade do exsudado, que pode
influenciar na disponibilidade de compostos assimiláveis e levar a uma sucessão de
comunidades/metapopulações de leveduras no habitat; visitantes que possivelmente são
vetores de microrganismos e podem seletivamente alimentar-se em mosaicos colonizados
por algumas espécies preferidas como item alimentar, causando extinções locais, ou podem
vetorizar seletivamente algumas espécies de leveduras em detrimento de outras; e
fenômenos interativos entre espécies da comunidade como é o caso da produção de toxinas
killer. Estes fenômenos poderão, no futuro, revelar detalhes da estrutura de tais
comunidades, e da distribuição das espécies entre áreas geográficas, especialmente barreiras
que podem ajudar a entender a diversidade genética das espécies K. ohmeri, P.
guilliermondii e C. parapsilosis.
49
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A distribuição espacial de leveduras de exsudados de C. brasiliense ocorreu de forma
agregada nas três áreas estudadas, e não acompanhou a distribuição de C. brasiliense, que
ocorreu de forma agregada em uma área, com tendência ao agregamento e aleatória nas
outras duas. Mesmo nas áreas em que os indivíduos de C. brasiliense se distribuem
aleatoriamente, a distribuição de leveduras depende da existência do substrato específico, o
exsudado, e sua agregação pode estar relacionada ao estágio de desenvolvimento deste
substrato preferido.
O exsudado de C. brasiliense é um habitat favorável para o desenvolvimento de
leveduras, apresentando uma grande diversidade de espécies e linhagens associadas. O
maior índice de diversidade foi encontrado na Área 01 que possui baixo nível de
perturbação. As áreas 02 e 03, mesmo com perturbação notável em seu entorno, possuem,
ainda assim, alta diversidade.
Candida parapsilosis e K. ohmeri, juntas representaram 30,6% do total dos isolados
coletados e também foram encontradas em trabalhos de diversidade de leveduras com
plantas e insetos em diferentes ecossistemas no Brasil. Além destas, C. naeodendra, C.
guilliermondii e P. guilliermondii foram também freqüentes. A espécie K. ohmeri foi
prevalente no exsudado, com 30 isolados obtidos principalmente das Áreas 02 e 03.
Candida parapsilosis foi prevalente na Área 02, tendo sido rara nas outras duas áreas
amostrais. Treze linhagens não foram identificadas, e estão notadas como Candida sp.,
sendo possível que representem novas espécies. A linhagem identificada como Pichia
hampshirensis-similar (Lag 703), é provavelmente uma nova espécie, de acordo com os
resultados do seqüenciamento do domínio variável D1/D2 da subunidade maior do rDNA e
a região espaçadora interna de transcrição gene 5.8S.
As espécies prevalentes mostraram diversidade intra-específica, com diferentes
linhagens, tanto fenotípica quanto genotipicamente diferenciadas, ocorrendo em exsudados
da mesma área, e em áreas diferentes. É possível que a diferenciação ocorra como
mecanismo de coexistência neste substrato efêmero, indicando possível fenômeno de
dinâmica de metapopulações entre as leveduras da comunidade.
O perfil fisiológico dos isolados apresenta-se principalmente fermentativo, com alta
freqüência de isolados resistentes a altas temperaturas e concentrações osmóticas elevadas.
Este perfil mostrou que há um alto grau de similaridade no conjunto de características
fisiológicas das leveduras associadas a exsudados de C. brasiliense. A análise de
50
similaridade dos perfis fisiológicos das comunidades mostrou similaridade em torno de 90%
entre as Áreas 01 e 03, evidenciando uma maior semelhança destas comunidades do que
com as leveduras da Área 02. Ainda assim, o alto grau de similaridade fisiológica indica que
o exsudado representa um conjunto de pressões seletivas de leveduras de amplo perfil,
fermentadoras e resistentes a condições de osmolaridade elevada e temperaturas altas. Neste
habitat, as pressões de coexistência entre espécies podem levar a variações intra-específicas
e sucessão, bem como pode ser que mecanismos de competição como o fenômeno “killer”
possam ser detectados.
A análise molecular por RAPD mostrou também alta diversidade genética das
leveduras, indicando possíveis variações intra-específicas na comunidade de leveduras de C.
brasiliense. Diferentes clusters de isolados de uma mesma espécie indicam que esta técnica
de RAPD não foi satisfatória como parte da identificação polifásica, pois linhagens da
mesma espécie, provenientes de exsudados de árvores da mesma área foram agrupadas em
separado, mostrando que esta técnica é refinada o bastante para separar linhagens da mesma
espécie, mas é limitada para marcar identidade específica em uma comunidade.
51
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ANEXOS
Anexo A - Meios de cultura utilizados
CALDO YMA: isolamento direto de qualquer substrato.
- Extrato de levedura 0,3 g
- Peptona 0,5 g
- Glicose 2,0 g
- Extrato de Malte 0,3 g
- Cloranfenicol 10 mg
- Água destilada 100 ml
MEIO ÁGAR YMA: isolamento direto de qualquer substrato.
- Extrato de levedura 0,3 g
- Peptona 0,5 g
- Glicose 2,0 g
- Extrato de Malte 0,3 g
- Ágar 2,0 g
- Cloranfenicol 10 mg
- Água destilada 100 ml
MEIO ÁGAR SABOURAUD: purificação de leveduras após o isolamento.
- Extrato de levedura 0,5 g
- Peptona 1,0 g
- Glicose 1,0 g
- Ágar 2,0 g
- Cloranfenicol 10 mg
65
- Água destilada 100 ml
MEIO GYMP: armazenamento de leveduras.
- Extrato de levedura 0,1 g
- Peptona 0,5 g
- Glicose 1,0 g
- Ágar 2,0 g
- Fosfato de potássio monobásico 0,02 g
-Fosfato de potássio dibásico 0,02g
- Água destilada 100 ml
Não adicionado cloranfenicol
CALDO GYMP: usado para o crescimento de leveduras, e em conjunto com glicerol é
usado para armazenamento de leveduras.
-Extrato de leveduras 0,1g
-Peptona 0,5g
-Glicose 1,0g
-Fosfato de potássio monobásico 0,02g
-Fosfato de potássio dibásico 0,02g
-Àgua destilada 100ml
CALDO PEPTONADO: meio utilizado para fermentação de carboidratos com finalidade de
identificação de leveduras.
-Extrato de Levedura 0,45g
-Peptona 0,75g
-Àgua destilada 100ml
Carboidrato usado para os testes de fermentação:
66
-Carboidrato* 6,0g
-Àgua deionizada 100ml
*Exceto Rafinose= 12%
SOLUÇÃO SALINA: solução diluidora de leveduras para vários experimentos.
-Cloreto de sódio 0,85g
-Água destilada 100ml
MEIO YNB: meio basal para testes com carboidratos.
-YNB 0,67g
-Ágar 2,0g
-Carboidrato 0,5g
-Água destilada 100ml
MÉTODOS AUXANOGRÁFICOS EM MEIO SÓLIDO: teste utilizado para identificar leveduras fermentadoras e o perfil de assimilação nos carboidratos.
BR somente 10 mL de água
1GLICOSE
0,5g
1 GLICOSE (para YNB w/o aa) 0,5g2 GALACTOSE 0,5g3 L-SORBOSE 0,5g4 MALTOSE 0,5g5 SACAROSE 0,5g6 CELOBIOSE 0,5g7 TREALOSE 0,5g8 LACTOSE 0,5g9 MELIBIOSE 0,5g10 RAFINOSE 0,5g11 MELEZITOSE 0,5g12 INULINA 0,5g13 AMIDO 0,5g14 D-XILOSE 0,5g15 L-ARABINOSE 0,5g16 D-ARABINOSE 0,5g17 D-RIBOSE 0,5g18 L-RAMNOSE 0,5g
67
19 ETANOLSomente água
20 GLICEROL 0,5g (como é líquido, adicionar 0,5 mL do açúcar e 9,5 mL de água)
21 ERITRITOL 0,5g22 RIBITOL 0,5g23 GALACTITOL 0,5g24 D-MANITOL 0,5g25 D-GLUCITOL 0,5g26 A-M-GLICOSIDEO 0,5g27 SALICINA 0,5g28 GLU- δ-LACTONA 0,5g29 2-K-GLUCONATO 0,5g30 5-K-GLUCONATO 0,5g31 DL-LACTATO 0,5g32 SUCCINATO 0,5g33 CITRATO 0,5g34 M-INOSITOL 0,5g35 METANOL Somente água: 9 mL36 HEXADECANO 0,5g37 GLUCOSAMINA 0,5g38 XILITOL 0,5g39 ACETONA Somente água40 ETILACETATO Somente água41 ISOPROPANOL Somente água42 GLUCONATO 0,5g43 NGLUCOSAMINA 0,5g
MEIO YCB: meio basal para testes com compostos de nitrogênio.
-YCB 1,67g
-Ágar 2,0g
-Água destilada 100ml
COMPOSTO DE NYCB-BR 100 mL de águaN1 NITRATO 0,78 g + 100 mL de águaN2 NITRITO 0,26 g + 100 mL de águaN3 LISINA 0,56 g + 100 mL de águaCADAVERINA 0,68 g + 100 mL de águaETILAMINA 0,64 g adicionar somente após autoclavar a tubo contendo
9,5 mL de água esterilizada. Após autoclavar o YCB + 90 mL de água, adicionar a etilamina diluída
OSMOTOLERÂNCIA A 50% GLICOSE: crescimento das linhagens de leveduras em
concentração osmótica elevada.
- Glicose 50g
-Extrato de leveduras 1g
68
-Ágar Agar 3g
-Àgua destilada 50ml
OSMOTOLERÂNCIA A 10% NaCl:
-Glicose 5g
-Cloreto de sódio 10g
-Agar Agar 2g
-Àgua destilada 90ml
PRODUÇÃO DE ÁCIDO:
-Glicose 5g
-Extrato de leveduras 0,5g
-Carbonato de Cálcio 0,5g
-Agar Agar 2g
-Àgua destilada 50ml
PRODUÇÃO DE COMPOSTOS AMILÓIDE:
-Glicose 2g
-Sulfato de amônio 0,2g
-Fosfato de hidrogênio K 0,2g
-Sulfato de magnésio heptahidratado 0,1g
-Agar Agar 2g
-Àgua destilada 100ml
DIASÔNIO BLUE B (DBB) test color : teste para diferenciação de basidiomicetos
Agar Sabouraud enriquecido com 4% de Glicose
-Peptona 1,0g
-Extrato de leveduras 0,5g
-Glicose 4,0g
-Agar 2,0g
-Àgua destilada 100ml
Diazonium Blue B (DBB) (% [p/v] ):
-DBB 15mg
-Tris-pH 7.0 15ml
69
TESTE DE TOLERÂNCIA A ALTAS TEMPERATURAS: Caldo Sabouraud.
-Extrato de leveduras 0,1g
-Peptona 0,5g
-Glicose 1,0g
-Àgua destilada 100ml
Anexo B - Listagem com a identificação das leveduras ascomicéticas de exsudados de C. brasiliense, código dos isolados, área de isolamento e árvore em que foi obtido o isolado
Espécies de leveduras ascomicéticas
Área 01 Área 02 Área 03
Aureobasidium pullulans LAG 739 (Cal. 30)*
Candida bertae LAG 610 (Cal. 22) LAG 690 (Cal. 47)
C. bombicola LAG 646 (Cal. 10)
C. blankii LAG 691 (Cal.11) LAG 722 (Cal.02)
C. butyri LAG 603 (Cal. 15)
C. derdronema LAG 623 (Cal.44)
C. famata LAG 667 (Cal.07)
C. guilliermondii var
guilliermondii
LAG 709 (Cal.09) LAG 718 (Cal.28)
LAG 671 (Cal.26) LAG 693 (Cal.36) LAG 730 (Cal.26)
LAG 750 (Cal.33) LAG 752 (Cal.23)
C. guilliermondii var membranifaciens
LAG 657 (Cal.19) LAG 664 (Cal.33) LAG 665 (Cal.34)
C. homilentoma LAG 725 (Cal. 32)
C. insectorum LAG 677 (Cal. 16) LAG 669 (Cal. 18) LAG 741 (Cal. 31) LAG 749 (Cal. 07)
C. lusitaniae LAG 679 (Cal. 28)
C. maltosa LAG 629 (Cal. 08)
C. melibiosica LAG 711 (Cal. 29)
C. mogii LAG 716 (Cal. 02)
C. naeodendra LAG 633 (Cal.11) LAG 678 (Cal.49) LAG 682 (Cal.01)
LAG 598 (Cal.10) LAG 609 (Cal.20) LAG 612 (Cal.27) LAG 729 (Cal.48) LAG 757 (Cal.37)
LAG 701 (Cal.03) LAG 707 (Cal.29)
C. oregonensis LAG 746 (Cal.26)
C. paludigena LAG 705 (Cal.18)
C. parapsilosis LAG 579 (Cal.09) LAG 565 (Cal. 22) LAG 570 (Cal. 22) LAG 586 (Cal. 03) LAG 589 (Cal. 01) LAG 602 (Cal. 14) LAG 611 (Cal. 27)
LAG 643 (Cal. 05) LAG 706 (Cal. 32) LAG 744 (Cal. 04)
70
LAG 614 (Cal. 30) LAG 615 (Cal. 29) LAG 616 (Cal. 31) LAG 618 (Cal. 32) LAG 625 (Cal. 51) LAG 668 (Cal. 08) LAG 672 (Cal. 41) LAG 673 (Cal. 46) LAG 685 (Cal. 09) LAG 688 (Cal. 18) LAG 692 (Cal. 11) LAG 697 (Cal. 16) LAG 720 (Cal. 23) LAG 727 (Cal. 51) LAG 734 (Cal. 15) LAG 743 (Cal. 11).
C. peltata LAG 652 (Cal. 14)
C. saitoana LAG 624 (Cal. 45) LAG 647 (Cal. 10) LAG 653 (Cal. 14)
C. silvanorum LAG 638 (Cal. 23) LAG 584 (Cal. 28) LAG 662 (Cal. 29) LAG 663 (Cal. 32) LAG 593 (Cal. 04)
C. tenuis LAG 605 (Cal. 16) LAG 606 (Cal. 18)
C. valdiviana LAG 714 (Cal. 22)
Candida sp. 1 LAG 564 (Cal. 23)
Candida sp. 2 LAG 753 (Cal. 14)
Candida sp. 3 LAG 759 (Cal. 24)
Candida sp. 4 LAG 601 (Cal. 09)
Candida sp. 5 LAG 751 (Cal. 34)
Candida sp. 6 LAG 631 (Cal. 10)
Candida sp. 7 LAG 628 (Cal. 05)
Candida sp. 8 LAG 761 (Cal. 10)
Candida sp. 9 LAG 683 (Cal. 23)
Candida sp. 10 LAG 708 (Cal. 29)
Candida sp. 11 LAG 592 (Cal. 03)
Candida sp. 12 LAG 735 (Cal. 04)
Candida sp. 13 LAG 680 (Cal. 34)
Clavispora lusitaniae LAG 760 (Cal. 36) LAG 696 (Cal. 42) LAG 721 (Cal. 31)
Debaryomyces coudertii LAG 756 (Cal. 07)
Deb. vanrijiae var vanrijiae LAG 636 (Cal. 18) LAG 637 (Cal. 19)
LAG 700 (Cal. 03)
Deb. vanrijiae var yarrowii LAG 594 (Cal. 04) LAG 573 (Cal. 10)
Deb. yamadae LAG 644 (Cal. 07)
Kodamaea ohmeri LAG 632 (Cal. 11) LAG 634 (Cal. 12)
LAG 613 (Cal. 28) LAG 620 (Cal. 37) LAG 699 (Cal. 17) LAG 733 (Cal. 47)
LAG 645 (Cal. 16) LAG 648(Cal. 11) LAG 649 (Cal. 19) LAG 650 (Cal. 11) LAG 651
71
LAG 737 (Cal. 25) LAG 739 (Cal. 30)
(Cal. 17) LAG 654 (Cal. 26) LAG 655 (Cal. 24) LAG 660 (Cal. 17) LAG 661 (Cal. 07) LAG 686 (Cal. 31) LAG 687 (Cal. 47) LAG 689 (Cal. 20) LAG 694 (Cal. 07) LAG 695 (Cal. 19) LAG 698 (Cal. 11) LAG 702 (Cal. 10) LAG 724 (Cal. 26) LAG 726 (Cal. 47) LAG 738 (Cal. 47) LAG 740 (Cal. 12) LAG 747 (Cal. 08) LAG 755 (Cal. 24)
Kluyveromyces lactis var
drosophilarum
LAG 675 (Cal. 27) LAG 717 (Cal. 41)
LAG 596 (Cal. 06) LAG 604 (Cal. 15)
LAG 658 (Cal. 20) LAG 659 (Cal. 21)
K. lactis var lactis LAG 715 (Cal. 02) LAG 588 (Cal. 01)
K. thermotolerans LAG 642 (Cal. 47)
Pichia anomala LAG 583 (Cal.45)
P. guilliermondii LAG 577 (Cal.01) LAG 626 (Cal.01) LAG 674 (Cal.26) LAG 630 (Cal.09) LAG 676 (Cal.28) LAG 627 (Cal.02)
LAG 656 (Cal.13)
P. lynferdii LAG 595 (Cal.06)
P.toletana LAG 712 (Cal.37) LAG 719 (Cal.26)
LAG 754 (Cal.07)
P. triangulares LAG 582 (Cal.40)
P. hampshirensis -similar LAG 703 (Cal.24)
P. sydowiorum LAG 590 (Cal.02) LAG 621 (Cal.40) LAG 622 (Cal.43)
Rhodotorula mucilaginosa LAG 580 (Cal.39) LAG 591 (Cal.02)
Torulaspora delbrueckii LAG 745 (Cal.50)
Cal= número do Calophyllum em que foi obtido o isolado
Anexo C - Listagem com a identificação das leveduras basidiomicéticas de exsudados de C. brasiliense, código dos isolados, área de isolamento e árvore em que foi obtido o isolado
Espécies de leveduras
basidiomicéticas
Área 01 Área Área 03
Cryptococcus albidus LAG 713 (Cal.22)*
Cr. amylolentus LAG 732 (Cal.47)
Cr. laurentii LAG 585 (Cal.45) LAG 681 (Cal.01) LAG 710 (Cal.15)
LAG 728 (Cal.48) LAG 704 (Cal.18) LAG 742 (Cal.16)
72
Cr. skinneri LAG 574 (Cal.02)
Cr. terreus LAG 731 (Cal.26)
Kwoniella mangroviensis LAG 684 (Cal.17) LAG 666 (Cal.39)
Sporopachydermia quercuum LAG 723 (Cal.50)
Cal= número do Calophyllum em que foi obtido o isolado
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