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Funções não-catalíticas das Proteínas

Armazenamento e transporte de O2

Interações imunológicas

Algumas considerações...• Ligante: molécula/íon que se liga reversivelmente

a uma proteína;– A reversibilidade é importante para que o organismo

possa responder à mudanças ambientais e metabólicas;

– Um segundo ligante pode interferir na ligação doprimeiro ligante, devido à mudança na estruturatridimensional;

Ex: reguladores enzimáticos (ativação/inibição)

• As proteínas não são estáticas....• Flexibilidade: mudanças sutis (respirações) na

conformação das proteínas;– Devido à vibrações moleculares e pequenos movimentos

de resíduos de aminoácidos (rotação em torno dasligações simples com o Cα);

– O desempenho da função das proteínas comumentedepende da flexibilidade;

• Ajuste induzido: flexibilização de uma proteína paraajustar o sítio de ligação ao ligante, proporcionandomaior estabilidade na ligação;

• Em proteínas multiméricas: a mudança deconformação em uma subunidade afeta a conformaçãodas outras subunidades;

Transporte e armazenamento de oxigênio: importância do grupo prostético heme

• O oxigênio não possui alta solubilidade em soluçõesaquosas (ex: plasma sanguíneo);– A difusão do oxigênio entre os tecidos não ultrapassa distâncias maiores que

alguns milímitros;

• Metais de transição, especialmente o ferro, possui fortetendência de se ligar ao oxigênio;

• O ferro não pode ficar livre, pois, promove a formação deespécies de oxigênio altamente reativas;– O ferro é incorporado em um grupo prostético no interior de proteínas,

chamado de grupo “heme”;

• Mioglobina: armazena oxigênio nos músculos;• Hemoglobina: transporta oxigênio e gás carbônico

através da corrente sanguínea;

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- O átomo de ferro possui 6 ligações coordenadas, 4 a átomos de N do grupo planar,e 2 no grupo perpendicular (1 ao N da cadeia lateral de um aminoácido Histidina / 1ligação aberta, onde pode ligar-se ao O2);- Os átomos de N coordenados, possuem caráter doador de elétrons, ajudando aimpedir a oxidação do estado ferroso (Fe2+) em estado férrico (Fe3+), o estadoférrico não liga ao oxigênio;

Grupo prostético Heme

* L. coordenadas: tipo de ligação covalente em que opar de elétrons compartilhado entre dois átomosprovém de apenas um dos átomos.

- Protoporfirina: estrutura orgânicacomplexa, em anel;- A esta estrutura liga-se um único átomode ferro, em estado ferroso (Fe2+);- Cada átomo de N contém uma par deelétrons livres no centro do anel =>formação de ligações coordenadas com oFerro;

• O monóxido de carbono (CO) é uma molécula pequenaque coordena o ferro do grupo heme com maiorafinidade que o O2;– CO liga-se a moléculas do heme 20.000 vezes melhor que o

O2, ou seja, sua Kd (constante de dissociação) é 20.000 vezesmenor que para oxigênio;

– Se o CO liga-se ao grupo heme, exclui o sítio de ligação do O2 asfixia.

• Mas... quando o heme está inserido em uma globina,esse número diminui drasticamente;

• O que ocasiona esta redução?– O fato de o grupo heme estar dentro de uma proteína...

• As globinas adquirem uma conformação tal, que favorece a ligação com o O2 e desfavorece com o CO;

MIOGLOBINA

HisF8: histidina da hélice F que se liga o grupo heme (histidina proximal);

HisE7: histidina da hélice E que fica a uma pequena distância do grupo heme (histidina distal);

Quando o O2 se liga ao ferro há uma pequena mudança no ângulo entre a estrutura planar e a histidina proximal (flexão : respiração)

• O O2 realiza uma ligação angularcom o ferro. Ocorre uma pequena“flexão” do grupo heme,possibilitando uma aproximaçãodo O2 à histidina distal. Resultado:formação de uma ligação de Hcom a His distal (estabiliza);

• O CO tem uma ligação linear como ferro, sendo forçado a uma leveinclinação na formação da pontede H, o que enfraquece sualigação com o grupo heme;

• Ou seja, a conformação daproteína atua seletivamente,favorecendo a ligação com o O2e desfavorecendo com o CO;

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Hemácias e Hemoglobina

• Os eritrócitos (hemácias) perdem algumasorganelas internas em seu processo dematuração; O espaço antes ocupado por taisorganelas passa a ser preenchido pormoléculas de hemoglobina;

• Aproximadamente 34% do peso de umahemácia é composto por hemoglobina;

• Tempo de vida de uma hemácia: 120 dias;

Conformação estrutural da hemoglobina• Ocorrem duas principais conformações:

– Estado R (relaxado): maior afinidade ao O2 (oxi-hemoglobina);– Estado T (tenso): menor afinidade ao O2 (desoxi-hemoglobina);

No estado T a Hb é estabilizada por um grande nº de pares de iônicos nas interfaces αβ; Quando o O2 se liga ao estado T, a conformação da hemoglobina muda para o estado R;

Alguns pares iônicos são desfeitos e outros são formados promovendo umdeslizamento entre os pares αβ e, uma rotação, estreitando o bolsão (espaço) entre assubunidades β;

Na mioglobinaNa Hb estado R

Na hemoglobina (estado T)

Na conformação T da hemoglobina o Ferronão se encontra suficientemente próximo àHisF8 para forma a ligação coordenadacom este aminoácido. Isso só ocorre após aligação com o O2 (conformação R) =>porfirina adquire conformação mais planaraproximando o Fe da HisF8;

A hemoglobina precisa ter afinidade o suficiente para se ligar ao O2 nos alvéolos pulmonares, mas

essa afinidade não pode ser tão grande a ponto de impedir a liberação do O2 nos tecidos...

• Isso em parte é resolvido pela pressão de O2, que nos alvéolos ébem maior que nos tecidos;

• Outra parte, deve-se à transição entre estado T e R, à medidaem que as moléculas de O2 vão sendo ligadas;

• A ligação do O2 à subunidades individuais da hemoglobina écapaz de alterar a afinidade de subunidades adjacentes;– Tal propriedade é chamada de “Alosteria” (a ligação de um ligante a um sítio

afeta as propriedades de ligação em outro sítio na mesma proteína); A primeiramolécula de O2 que interage com a desoxi-Hb (estado T), leva a alterações deconformação (estado R) que são comunicadas às outras subunidades, tornandomais fácil a ligação de O2 aos 3 demais grupos heme da hemoglobina;

• Por último, a influência do pH...

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• A hemoglobina também transporta H e CO2, provenientes darespiração celular (mitocôndrias nas células dos tecidos);

• Ainda nos tecidos, parte do CO2 é hidratado formandobicarbonato e difunde para o sangue, pois, a forma gasosa épouco solúvel em solução aquosa e bolhas poderiam serformadas (embolia);

• Esta reação reversível catalisada pela enzima anidrasecarbônica, resulta também na liberação de H => diminui o pHdos tecidos;

Influência dos produtos da respiração celular Trocas O2 / CO2 nos tecidos e pulmões• O CO2 ainda presente nos tecidos na forma gasosa, liga-se a sítios de ligação na

Hb diferentes do sítio de ligação do O2 (a reação de ligação do CO2 libera H,diminui do pH no sangue);

• Nas hemácias também há a presença da enzima anidrase carbônica, queconverte CO2 à bicarbonato e H (diminui pH sanguíneo);– Tal diminuição de pH nos tecidos e no sangue, promove alterações na estrutura

tridimensional da Hb, enfraquecendo a ligação com o O2 => liberação de O2 nos tecidos;

• O bicarbonato difunde para o plasma e posteriormente para os rins (isso ocorrecom cerca de 75% do C liberado pelos tecidos);

• Cerca de 25% do C permanece na forma de CO2 ligado à Hb e é transportadoaté os pulmões para liberação na expiração (por diferença de pressão - difusãosimples);

• Os H livres na Hb, ligam-se a qualquer um dos aminoácidos da proteína (Hbprotonada). Os H que estavam livres, não estão mais => eleva o pH do sangue;

• Com a elevação do pH a Hb volta a ter afinidade ao O2 => o O2 que entrou nosalvéolos (inspiração) difunde para as Hb das hemácias e é transportado para ostecidos;

e o ciclo continua...

A combinação entre os efeitos do pH e da

concentração de CO2 sobre a ligação/liberação do O2, chama-se efeito de Bohr.

2,3 bifosfoglicerato (BPG)

• Composto presente nas hemácias, formado apartir de um intermediário do metabolismo decarboidratos;

• Importante na regulação da oxigenação dostecidos em casos de mudança de altitude edesenvolvimento fetal;

• BPG reduz a afinidade da Hb pelo O2, através desua ligação a um sítio de ligação diferente do sítiode ligação do O2 ;

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Com BPG – maior estabilidade no estado T Menor afinidade ao O2

Sem BPG – maior facilidade em adquirir o estado RMaior afinidade ao O2

O sítio de ligação para BPG fica na

cavidade entre as subunidades β,

distante dos grupos heme;

- A cavidade é revestida por aminoácidos com cargaspositivas, os quais interagem com as cargas negativasdo BPG;- A ligação de BPG estabiliza o estado T, por isso,diminui a afinidade com o O2;- Na ausência de BPG, a Hb é convertida ao estado R;

Oxigenação em relação à altitude• Ao nível do mar: 40% do oxigênio carregado pelo

sangue é repassado para os tecidos;

• Em grandes altitudes: a diminuição da pressão do O2faz com que esta porcentagem diminua para 30%;– Após algumas horas, ocorre aumento de BPG => diminui

afinidade da Hb pelo O2 => a porcentagem de liberaçãode O2 é re-estabelecida;

• A situação é invertida quando há retorno à baixaaltitude;

• Pessoas com problemas relacionados à deficiência respiratóriaou circulatória, normalmente produzem uma quantidade maiorde BPG;

Hemoglobina αϒ (fetal)

• A Hbαϒ (HbF) possui umaafinidade muito menor aoBPG, logo... possui maiorafinidade ao O2 emcomparação com a Hbαβ(HbA);

• Ao chegar na placenta, umambiente pobre em O2, aHb materna libera o gásque rapidamente é ligadoà Hb fetal;

Sistema Imunológico• Todos os vertebrados possuem um sistema

imunológico capaz de distinguir o “próprio” do “não-próprio” e, destruir o que é identificado como “não-próprio”;

• A resposta imunológica é constituída por um conjunto de interações, complexas e coordenadas, entre diversas classes de proteínas e outras moléculas, além de tipos celulares;

• Na resposta imunológica, um sistema bioquímico altamente sensível e específico é construído com base na interação entre ligantes e proteínas;

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SistemaS ImunológicoS

• Sistema humoral (humor = fluido): dirigido contra infecções extracelulares;

• Sistema celular: dirigido para infecções que ocorrem no interior de células (contra protozoários, helmintos e tecidos transplantados também);

– Anticorpos ou Imunoglobulinas : proteínas com função imunológica;

– Leucócitos: células com função imunológica;

Leucócitos• São originados na medula-óssea;• De maneira geral: percorrem a corrente sanguínea, reconhecem

possíveis invasores, produzem anticorpos que se ligam aos agentes estranhos (sinalizam a infecção => destruição);

Em geral, há pouca quantidade de leucócitos, eles proliferam rapidamente

quando há infecção.

Tc : libera perforina (forma poros na MP da célula-alvo, descontrole de entrada e saída de substâncias); Também induz apoptose (morte celular programada);

Imunoglobulinas (Ig)

• Constituem até 30% do total de proteínas do plasma;

• Produzidas pelos linfócitos B;

• Ligam-se aos invasores e os marcam para serem destruídos;

• Os seres humanos são capazes de produzir mais de 108 anticorpos com diferentes especificidades de ligação;

Antígenos

• Toda molécula ou patógeno capaz de induzir uma resposta imunológica é denominado de antígeno;– Cápsula viral, parede celular bacteriana, toxina, uma

molécula qualquer...

• O sítio de ligação onde o antígeno é ligado aoanticorpo ou a um receptor de um leucócito, échamado de determinante antigênico ou epítopo.– Um antígeno complexo pode ter diferentes

determinantes antigênicos, ou seja, pode interagir com diferentes anticorpos;

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PRINCIPAIS ANTÍGENOS

PRINCIPAIS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS

BACTÉRIASEXTRACELULARES

- Fagocitose (macrófagos);- Anticorpos (linfócitos B)

- Ativação do sistema complemento;- Neutralização de toxinas liberadas pelas

bactérias;

BACTÉRIAS INTRACELULARES(capacidade de sobreviver dentro dosmacrófagos)

- Sistema MHC II (células T e macrófagos);

VÍRUS(parasitas intracelulares – qualquer célula)

- Sistema MHC I e II (células T e B, macrófagos);

MHC – Complexo de Histocompatibilidade• As propriedades de ligação aos receptores das células T são

extremamente complexas;

• Tais receptores não reconhecem antígenos livres, apenas os queestão ligados à proteínas específicas da superfície celular(MHC);

• MHC: são proteínas transmembrana que se ligam à fragmentosde peptídeos de proteínas (ex: peptídeos provenientes dadigestão de vírus ou de componentes da própria célula) e osexpõe na superfície celular;

• Tais fragmentos ligados às proteínas MHC constituem osantígenos que os linfócitos T reconhecem como “não-próprio’;

• Há duas classes de proteínas MHC...

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MHC classe I• Acredita-se que são encontradas em todas as células dos

vertebrados;• Ligam-se à fragmentos de peptídeos resultantes da digestão de

proteínas que ocorrem ao acaso dentro das células (inclusive quesão provenientes da própria célula);

• Cada linfócito Tc possui receptores específicos para o complexoMHC I-peptídeo (assim qualquer complexo MHC I seria atacado,inclusive de células normais);

• Durante o processo de maturação (no timo), os linfócitos T sãoselecionados, havendo eliminação daqueles que reconheceriam ospeptídeos próprios ligados à MHC I e manutenção daqueles quereconhecem peptídeos estranhos associados às proteínas MHC I;

• Isso leva à destruição especialmente de células infectadas porvírus, além de constituir em um fator de rejeição em casos detransplante de órgãos;

As células T que foram selecionadas para maturação no timo,reconhecem apenas as proteínas MHC com peptídeos “não-próprios”.

Interações moleculares na superfície celular

• Quando a presença de um antígeno é detectada, aspoucas células T e B precisam proliferar rapidamente eseletivamente;

• Exemplo: infecção viral– Uma vez que estejam dentro das células, as moléculas virais

são inacessíveis ao sistema imunológico humoral;– Proteínas MHC I (qualquer célula) podem expor peptídeos

provenientes das proteínas virais na superfície celular =>reconhecimento pelas células Tc;

– Proteínas MHC II presentes em macrófagos que ingerirampartículas virais, também podem expô-los =>reconhecimento por células TH e estímulo da proliferação dascélulas de defesa (e todo o processo conseqüente);

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CD8: co-receptor (intensifica as interações de ligação entre receptores de células Tc e MHC);

CD4: mesma função em TH;

Células TH secretam interleucinas, que são reconhecidas pelas células Tc e B, as quais respondem apresentando proliferação celular; *Estas interleucinas são específicas, induzem a proliferação apenas de células T e B que possuem receptores para elas => seleção clonal;

Células Tc destroem as células-alvo (porfirinas e apoptose);

Células B secretam anticorpos solúveis que se ligam aos antígenos no meio humoral (proteínas complemento, as quais danificam cápsulas virais e paredes bacterianas);

MHC classe II

• Ocorre na superfície de células especializadas em captarantígenos estranhos, os macrófagos e os linfócitos B;

• Esta classe não se liga à peptídeos derivados da digestãointracelular, mas à peptídeos derivados de proteínasexternas ingeridas pelas células;

• São então reconhecidas pelos linfócitos T (Tc e TH);– TH: estimula a produção de citocininas, as quais

estimulam a proliferação das células Tc;– Tc: atuam na destruição dos macrófagos infectados;

Memória Imunológica• Uma vez esgotado o antígeno (agente infeccioso),

a maioria das células imunológicas ativas morrem por apoptose;

• Algumas células B e T amadurecem e se tornam residentes permanentes no sangue;– Como elas já passaram pela seleção clonal (possuem os

receptores específicos para as interleucinas ativadas pelos antígenos), caso estes antígenos voltem a ocorrer no organismo, o desencadeamento da resposta imunológica será mais rápido.

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Classes de Imunoglobulinas• Cada classe possui particularidades em relação à estrutura

tridimensional da proteína, bem como, em relação à função;• IgM: primeiro anticorpo liberado pelas células B (importante

nos estágios iniciais de resposta imunológica primária);• IgG: é a mais abundante no plasma sangüíneo

– Principal anticorpo de resposta imunológica secundária (a partir de células B de memória);

– Ativa proteínas complemento e macrófagos;• IgA: encontradas em secreções (lágrimas, leite, saliva, etc);• IgD: presentes nos linfócitos B;• IgE: relacionada com respostas anti-alérgicas;

– Ativa liberação de histaminas (dilatação e aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos, facilitando a chegada das células e proteínas imunológicas no local da inflamação).

Especificidade antígeno-anticorpo• A especificidade é determinada

pelos aminoácidos presentes no domínio variável da cadeia da imunoglobulina;

• Complementariedade:– Forma, grupos com cargas,

apolaridade...– Manutenção do complexo

antígeno-anticorpo por várias interações fracas;

• Mudanças na conformação facilitam, por ex, a ligação de co-receptores => ajuste induzido;

Representação da cadeia de IgG

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Testes sorológicos• Devido à grande especificidade, os anticorpos são ótimos

reagentes analíticos;

• Para a realização de alguns testes sorológicos éimportante haverem preparações de anticorpos;

• Preparações Monoclonais de anticorpos:

– Através de culturas de células (linfócitos B) é possívelobter inúmeros anticorpos idênticos;

• A seguir: alguns princípios empregados em testessorológicos (e não todos os detalhes dos procedimentos) ...

Coluna cromatográfica de afinidade

• Um anticorpo selecionado é acoplado covalentemente a uma resina;

• A amostra é adicionada à coluna;

• Se houver o antígeno procurado, ele se ligará ao anticorpo presente na coluna;

• A coluna é lavada com uma solução: o antígeno fica retido na coluna e as demais proteínas são eluídas;

• Esta técnica é bastante usada para purificação de proteínas em geral;

Teste ELISA (enzyme-linkedimmunosorbent assay)

Immunoblot

• As proteínas são isoladas em gel através de eletroforese;

• São transferidas para uma membrana de nitrocelulose;

• A membrana passa por um processo de submissão aos anticorpos (semelhante ao teste ELISA);

• Revela-se coloração na proteína de interesse;

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