formulÁrio para pedido de autorizaÇÃo de projeto de … · 2020. 8. 21. · largo da academia...

____________________________________________________________________________ LARGO DA ACADEMIA NACIONAL DE BELAS ARTES, 2 – 1249-105 LISBOA TLF. 21 323 95 00 FAX 21 323 95 65

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FORMULÁRIO PARA PEDIDO DE AUTORIZAÇÃO

DE PROJETO DE UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS PARA FINS CIENTÍFICOS Este formulário inclui sete secções:

● Secção 1: Detalhes administrativos sobre o projeto, pessoas e estabelecimentos envolvidos ● Secção 2: Informações sobre o projeto ● Secção 3: Objetivos e benefícios potenciais do projeto ● Secção 4: Informações sobre os animais ● Secção 5: Informações sobre os procedimentos e o desenho experimental ● Secção 6: Resumo não técnico do projeto ● Secção 7: Declaração de responsabilidades

Todas as questões têm que ser respondidas, mesmo que a sua resposta seja “Não Aplicável” ou os campos do formulário que não serão utilizados para resposta, são devidamente rasurados. As respostas têm que ser redigidas com texto bem legível e em português.

SECÇÃO 1: DETALHES ADMINISTRATIVOS SOBRE O PROJETO, PESSOAS E ESTABELECIMENTOS ENVOLVIDOS

REFERÊNCIA DO PROJETO 1.1. Título do projeto de utilização de animais: Esquecer o medo: impacto do stress agudo na plasticidade sináptica da amígdala

1.2. Nome do investigador responsável pela realização do projeto: Rosalina Maria Regada Carvalho Fonseca Alvarez

ENTIDADE E ESTABELECIMENTO/LOCAL 1.3. Entidade. Indicar a entidade que levará a cabo o projeto de utilização de animais: CEDOC – Centro de Estudos de Doenças Crónicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa

1.4. Este projeto envolve a colaboração com outras entidades? Se sim, forneça o nome das entidades envolvidas e detalhes da colaboração. Não se aplica

1.5. Utilizador. Indicar o nome do utilizador que levará a cabo o projeto de utilização de animais: Sr. Director da NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas


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1.6. Estabelecimento(s) onde os animais serão alojados e onde serão realizados procedimentos: CEDOC, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.

1.7. No caso de a realização dos procedimentos se pretender fazer num local diferente de um estabelecimento de um utilizador, indique qual e forneça uma justificação científica para isso acontecer. Não aplicável

PESSOAS 1.8. Investigador responsável: Nome: Rosalina Maria Regada Carvalho Fonseca Alvarez Qualificações académicas: Licenciatura em Biologia, Mestrado em Medicina,

Doutoramento em Neurociências Funções desempenhadas na entidade referida em 1.3.:

Investigador Principal

Entidade/Departamento onde trabalha: Neurobiologia Celular e de Sistemas, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.

Morada: Rua Câmara Pestana, 6 Telefone: +351 218 803 101 Telefax: +351 218 851 920 Endereço email: [email protected] Tem/teve algum projeto autorizado nos últimos 5 anos? Se sim, qual a designação e data de autorização:

Sim. Título: Plasticidade sináptica na amígdala, mecanismos celulares de plasticidade heterosináptica no núcleo lateral da amígdala Autorizado a 3.09.2010, ofício 18831 Titulo: Associação entre memórias: papel do citoesqueleto de actina na cooperação/competição entre sinapses. Autorizado a 20.04.2017 referencia 0421/000/000/2017

Refira se tem formação em “ciência de animais de laboratório” e, se sim, liste os cursos que frequentou (com referência à data e local de realização):

Sim. Curso de experimentação animal, Instituto Gulbenkian de Ciência, 2008

Refira a data de autorização emitida pela DGAV como pessoa para executar determinadas funções (por exemplo, conceção de procedimentos e projetos, realização de procedimentos em animais, etc):

11.05.2012. Investigadora-Coordenadora, Categoria C FELASA (concepção de procedimentos e projectos).


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1.9. Pessoa responsável pela realização de procedimentos nos animais: Nome: Rosalina Maria Regada Carvalho Fonseca Alvarez Qualificações académicas: Licenciatura em Biologia, Mestrado em Medicina,

Doutoramento em Neurociências Funções desempenhadas no projeto de utilização de animais (por exemplo, realização de procedimentos em animais, prestação de cuidados a animais):

Estudos de comportamento Anestesia e eutanásia. Obtenção de tecidos post-mortem

Se fôr estudante, indicar o estatuto: (ex, sem licenciatura/mestrado/PhD/outros)

Não aplicável

Entidade/Departamento onde trabalha/estuda: Neurobiologia Celular e de Sistemas, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.

Morada: Rua Câmara Pestana 6 – Lisboa Telefone: +351 218 803 101 Telefax: +351 218 851 920 Endereço email: [email protected] Descreva a sua experiência e competência na manipulação e/ou envolvimento na utilização de animais:

16 anos de experiência laboratorial em Neurobiologia envolvendo a manipulação de roedores.


Sim. Curso de experimentação animal, Instituto Gulbenkian de Ciência, 2008


11.05.2012. Investigadora-Coordenadora, Categoria C FELASA (concepção de procedimentos e projectos).

1.10. Outras pessoas envolvidas: Nome: Natália Madeira Qualificações académicas: Licenciatura em Biologia, Mestrado em

Neurociências Funções desempenhadas no projeto de utilização de animais (por exemplo, realização de procedimentos em animais, prestação de cuidados a animais):

Estudos de comportamento. Anestesia e eutanásia.


Estudante de Doutoramento, Neurobiologia Celular e de Sistemas, CEDOC, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.


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Entidade/Departamento onde trabalha/estuda: Neurobiologia Celular e de Sistemas, CEDOC, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.


Estudos de comportamento, eutanásia e colheita de tecido.


Sim. Curso de experimentação animal (Teórico e prático), Instituto Gulbenkian de Ciência, 2016.


Licença da DGAV para realização de procedimentos em animais, FELASA categoria B, emitida a 21.02.2017

Nome: Júlia Pinho Qualificações académicas: Licenciatura em Biologia, Mestrado em

Neurociências, Doutoramento em Neurociências Funções desempenhadas no projeto de utilização de animais (por exemplo, realização de procedimentos em animais, prestação de cuidados a animais):

Estudos de comportamento Anestesia e eutanásia.


Investigadora Pós-doutoral, Neurobiologia Celular e de Sistemas, CEDOC, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.

Entidade/Departamento onde trabalha/estuda: Neurobiologia Celular e de Sistemas, CEDOC, Centro de Estudos de Doenças Crónicas, Faculdade de Ciências Médicas Universidade Nova de Lisboa.


Estudos de comportamento, explantes de tecido

Refira se tem formação em “ciência de animais de laboratório” e, se sim, liste os cursos que

Sim. Curso de experimentação animal (Teórico e prático), Instituto Gulbenkian de Ciência.


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frequentou (com referência à data e local de realização): Refira a data de autorização emitida pela DGAV como pessoa para executar determinadas funções (por exemplo, conceção de procedimentos e projetos, realização de procedimentos em animais, etc):

Licença da DGAV para realização de procedimentos em animais, FELASA categoria B, de 01.07.2014.


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SECÇÃO 2: INFORMAÇÕES SOBRE O PROJETO CONTINUAÇÃO DE PROJETO/UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS 2.1. Continuação de projeto/utilização de animais. Se pretende obter uma autorização para continuar o trabalho desenvolvido noutro projeto/utilização de animais previamente autorizado, refira a designação do mesmo(a), a data de autorização e a data de término. Não aplicável.

DATAS DO PROJETO 2.2. Datas do projeto: Especifique a duração requerida para a autorização do projeto/utilização de animais(1):

60 meses

Data proposta para o início: 01.01.2018 Data prevista para o término: 31.12.2022

(1) De notar que, de acordo com o nº 3, do artigoº 46º do Decreto-Lei, a duração máxima permitida para a realização de um projeto é de cinco anos.

SUBMISSÃO DO PROJETO AO ÓRGÃO RESPONSÁVEL PELO BEM-ESTAR DOS ANIMAIS 2.3. O projeto foi previamente submetido ao Órgão responsável pelo bem-estar dos animais (ORBEA) do estabelecimento onde os animais vão estar alojados? Se sim, anexe, ao presente pedido de autorização, o parecer não vinculativo emitido pelo ORBEA sobre o projeto em apreço. Sim

FINANCIAMENTO E RECURSOS PARA A REALIZAÇÃO DO PROJETO 2.4. Financiamento e recursos para realização do projeto. Indique se dispõe de financiamento e de recursos adequados (por ex., instalações, equipamento, staff, conhecimento adequado, etc) para realização deste projeto e descreva sumariamente. Se dispõe de financiamento, indique qual a entidade financiadora. O grupo de trabalho dispõe de todas as condições para a realização do plano de trabalhos proposto. O financiamento para este projecto é feito através da Fundação para a Investigação do Cérebro e Comportamento, sediada em Nova Iorque, USA (Brain and Behavior Research Foundation) e pela Fundação para a Ciencia e Tecnologia.


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RISCOS DE SAÚDE E/OU SEGURANÇA PARA OUTROS ANIMAIS, PESSOAS OU PARA A COMUNIDADE 2.5. O projeto envolve riscos de saúde e/ou de segurança para outros animais alojados nas instalações, pessoas ou para a comunidade? SIM Se sim, indique quais dos seguintes riscos de saúde e/ou de segurança estão envolvidos com o projeto, forneça detalhes e refira que medidas foram tomadas para minimizar esses riscos. Gases anestésicos Uso de isoflurano em Hotte quimica com extração de

ar em contínuo. Exposição para o ambiente muito reduzida.

Carcinogénios ou teratogénios Não aplicável Material químico perigoso ou substâncias

citotóxicas (não incluindo os gases anestésicos)

Anisomicina (Inhibidor da síntese proteica - Toxicidade aguda, oral, dérmica e de inalação, categoria 1,2,3); AM281 (inhibidor dos receptores de endocannabinoides - toxicidade aguda oral, dérmica e de inalação, categoria 1,2,3). Verapamil (inhibidor dos canais de calcio sensiveis à voltagem; toxicidade aguda, categoria 3). Todas as drogas serão utilizadas exclusivamente em tecidos post-mortem (Stocks preparados em hotte no Edificio do Biotério; utilização em Laboratório fora do edificio do Biotério), e de acordo com as regras de Biossegurança institucionais e autorizadas pelo Biotério.

Organismos ou materiais biologicamente perigosos (por exemplo, vírus, bactérias, fungos, etc). Especifique que grau de risco biológico está associado ao organismo.

Não aplicável

Risco de radiação Não aplicável Potenciais zoonoses Não aplicável Outros Não aplicável


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SECÇÃO 3: OBJECTIVOS E BENEFÍCIOS POTENCIAIS DO PROJETO 3.1. O artigo 5º do Decreto-Lei requer que um programa de trabalho utilizando animais seja realizado para os seguintes fins. Para o efeito, deverá selecionar o que se aplicar ao projeto proposto: X a) Investigação fundamental X b) Investigação translacional ou aplicada, tendo em vista um dos seguintes fins: X i. A prevenção, a profilaxia, o diagnóstico ou o tratamento de doenças, de problemas de

saúde ou de outras situações anormais ou dos seus efeitos nos seres humanos, nos animais ou nas plantas;

ii. A avaliação, a deteção, a regulação ou a alteração das condições fisiológicas nos seres humanos, nos animais ou nas plantas;

iii. O bem-estar dos animais e a melhoria das condições de produção dos animais criados para fins agrícolas;

c) Desenvolvimento, produção ou controlo da qualidade, da eficácia e da segurança de medicamentos, géneros alimentícios, alimentos para animais e outras substâncias ou produtos, para um dos objetivos mencionados na alínea b);

d) Proteção do ambiente natural no interesse da saúde ou do bem-estar do homem ou dos animais; e) Investigação destinada à conservação das espécies; f) Ensino superior ou formação para aquisição, manutenção ou melhoria das qualificações

profissionais; g) Inquéritos no domínio da medicina legal.

3.2. Faça uma descrição do contexto global do projeto selecionando uma de entre as seguintes hipóteses e respondendo às questões: X Para investigação: Qual é a posição atual do projeto na área de trabalho e de que modo o mesmo

irá ajudar a acrescentar conhecimento, progresso ou colmatar uma necessidade clínica, por exemplo, relativamente ao estado atualmente existente? O presente projecto visa perceber o impacto do stress agudo na plasticidade sináptica da amígdala. O núcleo da amígdala, presente no lobo temporal e em associação próxima com o hipocampo, é um núcleo cerebral envolvido na codificação do contexto emocional das memórias. Enquanto que uma reação ao stress é importante para a sobrevivência do indivíduo, uma reação exacerbada ou demasiado intensa a um estímulo neutro é muito desvantajosa. Com este projecto, estamos interessados em entender como a plasticidade sináptica na amígdala é alterada num modelo de stress pós-traumático e se é possível reverter essas alterações. Desta forma, podemos contribuir para a prevenção do desenvolvimento de doenças de ansiedade e permitir o tratamento de doentes com stress pós-traumático.

Para satisfazer requisitos regulamentares: Quais são os requisitos ou as guidelines regulamentares relevantes? Não aplicável


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Para fins de produção ou diagnóstico: Quais são os prováveis pedidos que justifiquem a necessidade do produto ou do serviço durante o tempo da autorização do projeto? Não aplicável

Para ensino: Quais são as necessidades de formação subjacentes ao pedido de utilização de animais? Não aplicável

3.3. Faça uma descrição dos objetivos do projeto. O que é proposto alcançar, descobrir ou produzir com a realização deste projeto? Os objetivos devem ser específicos para o projeto em apreço, realistas e alcançáveis. A capacidade de formar memórias é um mecanismo cerebral fundamental à sobrevivência do indivíduo. Em particular, reconhecer potenciais situações de stress ou ameaçadoras é particularmente importante. No entanto, formar e manter memórias que levem o indivíduo a reagir de forma emocional a situações neutras é altamente disruptivo. Está amplamente aceite que as memórias passam por um processo de consolidação, em que memórias instáveis e recentes, são convertidas em memórias de longa duração. Se não forem reativadas, ou seja, lembradas, estas memórias permanecem. No entanto, a sua reativação leva a que passem para um estado ativo durante o qual podem ser modificadas ou perdidas. Este mecanismo de up-date constante das memórias é extremamente importante para o indivíduo ir adequando a informação que é armazenada face a um ambiente mutável. No contexto das memórias traumáticas, a formação de uma memória traumática leva a uma disfunção deste mecanismo. Os doentes com stress pós-traumático tem lembranças recorrentes do evento, sem atenuação da resposta emocional e com frequente generalização a eventos neutros. O tratamento atualmente disponível para estes doentes é largamente insuficiente com taxas de sucesso baixas e altas incidência de recidivas. Para tentar perceber o impacto do stress agudo na dinâmica das memórias, iremos utilizar um modelo animal, bem estabelecido, de stress pós traumático e vamos analisar as alterações na plasticidade sináptica da amígdala. O objetivo deste projeto é:

1) Utilizar vários testes comportamentais para obter um perfil comportamental de cada animal antes e depois do evento de stress agudo.

2) Avaliar as alterações na plasticidade sináptica das vias aferentes da amígdala. O nosso projeto tem uma vertente integrativa, usando uma combinação de caracterização comportamental e fisiológica.

3) Definir novos alvos terapêuticos que permitam uma melhor intervenção em doente com stress pós-traumático.

3.4. Refira quais são os benefícios prováveis deste projeto e a razão por que valerão a pena para contrabalançar o sofrimento e efeitos adversos infligidos aos animais a envolver no projeto? O desenvolvimento deste projeto irá permitir :

1) elaborar modelos conceptuais que nos permitam perceber como as memórias evoluem ao longo do tempo, permitindo prever e prevenir a formação de memórias disfuncionais.

2) Definir novos alvos terapêuticos para a patologia de stress pós-traumático O conhecimento obtido através da investigação usando modelos animais já contribuiu de forma significativa para a compreensão de várias doenças do sistema nervoso central bem como para o


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desenvolvimento de novas terapias aplicáveis a humanos e animais. Adicionalmente, tem vindo a contribuir para um melhor conhecimento da condição humana.

3.5. Liste algumas referências bibliográficas e/ou guidelines regulamentares que suportem a necessidade do projeto e/ou os benefícios prováveis indicados para o mesmo, assim como de quaisquer modelos específicos propostos para serem utilizados nos procedimentos a realizar. Referências de suporte ao projeto Definição do perfil comportamental: Este artigo introduz o procedimento a utilizar para a definição do perfil comportamental Ardi Z, Albrecht A, Richter-Levin A, Saha R, Richter-Levin G (2016) Behavioral profiling as a translational approach in an animal model of posttraumatic stress disorder. Neurobiol Dis. doi:10.1016/j.nbd.2016.01.012. Necessidade de uma melhor definição da patologia do stress pós traumático: este artigo demonstra a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos associados ao desenvolvimento desta patologia, recorrendo a modelos animais Richter-Levin G, Stork O, Schmidt M V. (2018) Animal models of PTSD: a challenge to be met. Mol Psychiatry. doi:10.1038/s41380-018-0272-5. Descrição da metodologia a utilizar para a obtenção dos registos eletrofisiológicos: este artigo do nosso grupo descreve a metodologia a usar na obtenção dos registos neuronais em explantes cerebrais. Fonseca R (2013) Asymmetrical synaptic cooperation between cortical and thalamic inputs to the amygdale. Neuropsychopharmacology 38(13):2675–87.


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SECÇÃO 4: INFORMAÇÕES SOBRE OS ANIMAIS APLICAÇÃO DOS 3Rs REPLACEMENT (SUBSTITUIÇÃO) 4.1. Explique por que não é possível alcançar os objetivos do projeto através da utilização de métodos alternativos que não utilizem animais e indique que fontes e referências bibliográficas consultou para encontrar possíveis alternativas:

O estudo das conexões do sistema nervoso central requer uma análise das redes neuronais que não pode ser analisada em modelos de linhas celulares. Assim, torna-se absolutamente necessário a obtenção de tecido cujo processo de maturação e desenvolvimento foi realizado num órgão intacto.

Referencias bibliográficas de suporte para o uso experimental de animais https://www.sfn.org/advocacy/policy-positions/policies-on-the-use-of-animals-and-humans-in-research https://www.apa.org/science/leadership/care/care-animal-guidelines.pdf https://www.elsevier.com/__data/promis_misc/ASAB2006.pdf

4.2. Que alternativas (totais ou parciais) considerou e irão ser utilizadas para alcançar os objetivos do projeto? Indique as fontes consultadas. Para o projeto em questão não existem alternativas viáveis.

REDUCTION (REDUÇÃO) 4.3. Número de animais a serem utilizados. Ao longo do projeto estimamos utilizar 180 animais experimentais.

4.4. Forneça justificação sobre o número de animais a ser utilizado, especificando os princípios do desenho experimental usados para calcular o número de animais a incluir em cada grupo experimental ou de tratamento, incluindo grupos controlo, de cada um dos procedimentos que farão parte do projeto. Indique quais as fontes de aconselhamento consultadas para esse efeito. Projeto experimental: O presente projeto visa examinar o efeito do stress agudo na plasticidade sináptica da amígdala. Para isso iremos caracterizar, do ponto de vista comportamental os animais antes e depois do stress agudo. De seguida, os animais serão utilizados para registos eletrofisiológicos. Caracterização do perfil comportamental: todos os animais incluídos no estudo serão caracterizados, do ponto de vista comportamental, antes e depois do stress agudo. Para a caracterização comportamental iremos usar três testes que visam testar a componente anxiogénica, um teste que visa analisar a componente depressiva e dois relacionados com memoria executiva. Todos os animais serão manuseados previamente pelos investigadores envolvidos no projeto. O manuseamento inclui retirar os animais da sua gaiola durante 15 a 20 minutos, todos os dias durante 5 dias (handling).

https://www.sfn.org/advocacy/policy-positions/policies-on-the-use-of-animals-and-humans-in-research



https://www.apa.org/science/leadership/care/care-animal-guidelines.pdf



https://www.elsevier.com/__data/promis_misc/ASAB2006.pdf


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Após a semana de handling, todos os animais serão caracterizados do ponto de vista comportamental: Iremos usar os seguintes testes comportamentais: Open field (OF arena de exploração); Elevated-plus maze (EPM Labirinto elevado em cruz) ; Sucrose-preference test (Sucrose -Teste de preferência de sacarose); Teste de preferencia Social (SP social preference test); Teste de reconhecimento de objetos (OR Object recognition task) e o Teste de reconhecimento espacial (DYM Delay-to-match Y maze). A caracterização comportamental dura 5 dias, sendo que os testes são feitos em sequencia em dias consecutivos - OF (Dia 6); EPM (Dia 7), SP (Dia 8) OR (Dia 9) e o DYM (Dia 10). No final do dia 10, os animais serão divididos em 2 grupos, um grupo será exposto ao paradigma de stress agudo enquanto que o segundo regressará à home-cage. Stress agudo/ Stress pós-traumático: este modelo consiste em expor os animais a um evento de stress agudo. Este evento consiste na submersão do animal durante 45 segundos numa tina de água dentro de uma grelha de contenção (labirinto de água). Estudos prévios demonstram que não existe impacto significativo deste protocolo no bem-estar animal. No entanto, os animais mantêm um condicionamento de stress, sob a forma de uma memória de longo-prazo à tina de água onde foram condicionados bem como desenvolvem a longo-prazo comportamentos anxiogénicos. O teste de Sucrose inicia no dia seguinte à exposição ao stress agudo (Dia 11). Este teste irá manter-se durante 25 dias, altura em que os animais serão novamente avaliados nos vários protocolos comportamentais. No dia 36 iniciam o perfil comportamental com o OF seguido dos outros testes em sequencia (EPM, dia 37 o SP, dia 38, o OR e dia 39 e o DYM dia 40). Após a caracterização comportamental, os animais serão eutanasiados para a realização dos registos eletrofisiológicos. Registos eletrofisiológicos (ex-vivo, mas efetuadas no biotério): Iremos testar as interações entre as vias aferente à amígdala, a via talâmica e a via cortical (3 protocolos distintos de estimulação). Todas estas condições serão feitas em animais sujeitos a stress agudo versus animais controlo. Assim, teremos doze (12) grupos experimentais (6 teste + 6 controlo); cada grupo terá, no mínimo, 10 experiências (120 experiências total). Dada a variabilidade dos dados obtidos em eletrofisiologia, e à análise estatística usada (análise paramétrica de variâncias -Repeated measures ANOVA - Statistica, Statsoft), o número mínimo de 10 experiências por grupo é necessário para se poderem verificar as condições de normalidade e de homogeneidade das populações subjacentes aos dados (Teste de Shapiro-Wilk, Statistica, StatSoft) de modo a que as diferenças que se detetem obtenham também significado estatístico. Estudos prévios do nosso laboratório e em conformidade com os dados da literatura, obtemos uma taxa de sucesso de cerca de 30% por experiência, fator este que triplica o número de experiências necessários para a conclusão do estudo (360 experiências). A taxa de sucesso, relativamente baixa, prende-se com o facto de executarmos experiências de electrofisiologia longas (cerca de 2 horas) em que fatores físicos do ambiente, bem como a viabilidade do tecido diminuem muito a obtenção de experiências. Dado que é possível realizar duas experiências de cada animal, iremos usar, no total 180 animais.

4.5. Foi considerada alguma colaboração com outro estabelecimento (interno ou externo) para reduzir o número de animais utilizados (utilização conjunta dos animais) (por exemplo, diferentes órgãos do mesmo animal são usados em mais de um laboratório)? Não.


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REFINEMENT (REFINAMENTO) 4.6. Forneça informações sobre a escolha da espécie animal, procedimento(s) e limites críticos e explique por que razão são os mais refinados para o objetivo requerido. Ao longo do projeto serão utilizados ratos pertencentes à estirpe Wistar/Sprague Dawley (wild-type). O sistema nervoso dos roedores, nomeadamente o dos ratos, apresenta muitas semelhanças com o sistema nervoso humano, o que permite abordar questões relevantes para a fisiologia humana. A escolha do modelo, em particular o rato, prende-se com uma superior facilidade em obter registos eletrofisiológicos estáveis, relativamente aos murganhos. Neste projeto utilizaremos somente machos com o intuito de evitar a influência dos ciclos hormonais. Estas flutuações hormonais poderão ter um impacto na homogeneidade da população em estudo e introduzir uma variabilidade adicional ao estudo. Os animais sujeitos ao procedimento experimental serão monitorizados diariamente para avaliar a dor e desconforto quer devido ao procedimento experimental quer devido a doença espontânea. Os limites críticos que serão utilizados para determinar a eutanásia do animal antes de concluído o estudo serão:

- posturas anormais de desconforto, flacidez ou rigidez muscular; - ausência de auto-cuidados (grooming) - perda significativa de peso analisada pela escala de condição corporal (valor limite BSC<2) - Incapacidade ou relutância em levantar-se que persista por mais de 24 horas - secreções lacrimais incluindo porfiria.

4.7. Para cada procedimento do projeto, forneça detalhes sobre como minimizar o sofrimento dos animais a envolver. Todos os animais serão manuseados pelos investigadores previamente a serem incluídos nos protocolos de comportamento. Isto permite diminuir o stress do animal ao ser manuseado pelo investigador. Quando forem realizados os registos eletrofisiológicos, os animais serão recolhidos do biotério, anestesiados com isoflurano e eutanasiados. Todo este procedimento será realizado com uma duração máxima de 15 minutos.

4.8. Para cada um dos procedimentos em que se preveja infligir uma severidade de grau Moderado ou Severo aos animais, justifique a razão para que a realização dos mesmos seja necessária. Não existem procedimentos que impliquem a recuperação do animal.

4.9. Uma vez iniciado o projeto, os animais vivos serão removidos da instalação onde estão alojados? Se sim, explique qual a razão, indique como será feito o transporte, para que local serão levados, por quanto tempo e se retomam para a instalação de origem ou para outra. Não

ANIMAIS 4.10. Espécie animal a utilizar no projeto. Rato


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4.11. Irão ser utilizadas formas fetais de mamíferos ou formas larvares de alimentação autónoma? Se sim, especifique. Não

4.12. Estirpe(s) a utilizar. Wistar/ Sprague Dawley

4.13. Estatuto genético dos animais a utilizar: X Tipo selvagem Geneticamente alterados sem fenótipo nocivo Geneticamente alterados com fenótipo nocivo.

4.14. Animais geneticamente alterados. Especifique se o projeto em apreço envolve: A utilização de animais geneticamente alterados de linhagens existentes e sem problemas

de bem-estar (sem fenótipo nocivo). - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Quais os efeitos adversos esperados e não esperados para os animais que serão submetidos aos procedimentos do projeto. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta a ocorrência desses efeitos adversos. Não aplicável

A utilização de animais geneticamente alterados de linhagens existentes e com problemas de bem-estar (com fenótipo nocivo). - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Descreva o impacto da alteração do genótipo no bem-estar do animal. - Quais os efeitos adversos esperados e não esperados para os animais que serão submetidos aos procedimentos do projeto. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta o fenótipo dos animais e/ou a ocorrência de efeitos adversos.

Não aplicável

Criação de uma nova linhagem de animais geneticamente alterados. - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Descreva o impacto esperado da alteração do genótipo no bem-estar do animal. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta o fenótipo esperado dos animais. Não aplicável


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4.15. Origem dos animais (estabelecimento, país, etc) Animais adquiridos do biotério da NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa ou adquiridos a Charles River Laboratories, France.

4.16. Os animais a serem utilizados neste projeto foram especificamente criados para serem utilizados para fins científicos? Se não, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais os animais a utilizar neste projeto não foram especificamente criados para fins científicos. Sim

4.17. Os animais a serem utilizados neste projeto foram capturados no meio selvagem? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais os animais precisam de ser capturados no meio selvagem. Não

Se sim, tem um parecer favorável emitido pelo Instituto da Conservação da Natureza e das Florestas para a captura dos animais? Em caso afirmativo, anexe a este pedido de autorização de projeto, cópia desse mesmo parecer. Não aplicável

4.18. Os animais a serem utilizados neste projeto são errantes ou assilvestrados de alguma espécie animal doméstica? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais um animal errante ou assilvestrado de uma espécie doméstica precisa de ser utilizado neste projeto. Não.

4.19. Os animais a serem utilizados neste projeto pertencem a alguma espécie ameaçada de extinção? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais é necessário utilizar uma espécie ameaçada de extinção neste projeto. Não.

CARACTERÍSTICAS DO MANEIO A PRESTAR AOS ANIMAIS 4.20. No caso de ser feito enriquecimento ambiental ao alojamento dos animais, descreva-o. O enriquecimento ambiental é realizado através da utilização de caixas de poliuretano, de cor vermelha, devidamente autoclavadas, que funcionam como abrigo. É adicionado material de ninho, e tocos de madeira para estimular comportamentos próprios da espécie.

4.21. Os animais a utilizar no projeto necessitam de condições de alojamento especiais? Se sim, especifique que condições e justifique a necessidade das mesmas terem que ser utilizadas. Não.


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4.22. Os animais a utilizar no projeto necessitam de dieta alimentar ou de abeberamento especiais? Se sim, especifique. Sim, é feito um suplemento adicional com sementes devidamente autoclavadas de modo a suplementar as necessidades energéticas dos animais a amamentar.

4.23. Os animais a utilizar no projeto necessitam de prestação de cuidados ou de atenção especiais? Se sim, especifique. Não

4.24. Os animais serão alojados individualmente? Se sim, forneça detalhes das circunstâncias, período de tempo e justificação para que se faça o alojamento individual. Não

REUTILIZAÇÃO DE ANIMAIS 4.25. Algum dos animais a utilizar neste projeto foi previamente usado num outro estudo/utilização para fins científicos? Se sim, em que condições? Justifique a necessidade de envolvimento do mesmo neste projeto. De notar que para um animal poder ser reutilizado, têm que estar satisfeitas as condições referidas nas alíneas a) a d), do ponto 1, do artigo 16º, do Decreto-Lei nº 113/2013. Assim, forneça informações sobre: o título do projeto prévio em que foi utilizado, a severidade efetiva do procedimento a que ficou sujeito, estado geral de saúde e de bem-estar do animal, parecer médico-veterinário sobre o envolvimento do animal num novo procedimento, tendo em conta a duração de vida do animal. Não


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SESSÃO 5: INFORMAÇÕES SOBRE OS PROCEDIMENTOS E O DESENHO EXPERIMENTAL

SEQUÊNCIA DE ACONTECIMENTOS 5.1. Faça uma descrição completa e exata, acompanhada por uma linha temporal, de todos os eventos e procedimentos (devidamente identificados e numerados) que irão acontecer a cada animal (ou grupo de animais), desde a altura em que são obtidos até à altura em que o projeto é finalizado. No caso de melhorar a clareza da descrição do plano do projeto, ilustre as diferentes etapas acima mencionadas com um fluxograma ou um esquema. 1. Os animais a utilizar ao longo deste projeto advêm de uma colónia estabelecida na NOVA Medical School/Faculdade de Ciências Medicas, Universidade Nova de Lisboa ou da Charles River, France. Se obtidos pela Charles River, France os animais serão mantidos no bioterio da NMS pelo menos uma semana antes do início da experiência para aclimatação. Os animais serão recolhidos desta colónia para a caracterização comportamental com 1.5 mês de idade (6 semanas). Serão mantidos em gaiolas de dois animais (pares) – dia 0 2. Durante 5 dias serão manuseados pelos investigadores por períodos de 15 a 20 minutos todos os dias – períodos de habituação (5 dias) – dia 1 a 5. 3. Findo o período de habituação serão caracterizados do ponto de vista comportamental nos testes descritos em cima (open field (Passo 1), elevated-plus maze (Passo 2), Social preference (Passo 3), Object-recognition (Passo 4) e Delay-to-Y Maze (passo 5)). Todos os animais serão testados nestes testes e será feito um teste por dia (5 dias) – dia 6 a 10. 4. No dia 10, após o DYM, os animais serão divididos em dois grupos; um regressará a home-cage, enquanto que o segundo grupo será sujeito ao stress agudo (Passo 6 Findo este passo, todos os animais regressam à sua gaiola onde permanecem durante 25 dias. 5. No dia 11, após o stress agudo, todos os animais iniciam o teste de sucrose preference (passo 7), que se mantem ate ao dia 25. 6. No dia 36, os animais voltam a ser caracterizados do ponto de vista comportamental, sendo que os testes decorrem com o mesmo esquema descrito anteriormente, OF no dia 36, EPM no dia 37, SP no dia 38, OR no dia 38 e DYM no dia 39. 7. Durante a semana subsequente, um animal por dia será eutanasiado e utilizado para registos eletrofisiológicos. No dia de realização das experiências de eletrofisiologia, os animais serão retirados da colónia, anestesiados com isoflurano e eutanasiados por decapitação, no laboratório (piso 1 do Biotério). O cérebro será seguidamente retirado, transportado para o Laboratório S0.Lab2 (Dep Imunologia) onde é processado (corte no vibrótomo) e utilizado para os estudos eletrofisiológicos ex vivo.

DESENHO EXPERIMENTAL 5.2. Para cada um dos procedimentos que irão ser realizados a cada animal (ou grupo de animais), preencher a tabela em baixo, indicando e descrevendo cada item contido na mesma:


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Título do procedimento: Avaliação da performance comportamental em Open field (arena de exploração)

Nº do procedimento: Passo 1 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Objectivo: quantificar a actividade exploratória do animal. Os animais são colocados numa arena quadrada que poderão explorar durante 5 minutos. O seu comportamento será registado por vídeo. A distância percorrida bem como comportamentos de grooming (auto-limpeza) serão contabilizados.

Espécie animal: Rato Nº de animais a utilizar: 180 Técnica utilizada: Exploração da arena com gravação de vídeo

Duração do procedimento: 5 minutos Frequência do procedimento: Este procedimento será realizado por duas vezes, 1 antes da exposição

ao stress agudo e a segunda um mês depois. Anestesia associada?: Não.

Analgesia associada? Não Estabelecimento de limites críticos:

Não se aplica

Efeitos adversos do procedimento no bem-estar animal:

Não se aplica

Classificação de severidade do procedimento proposta (1):

Abaixo do limiar

Destino dos animais no final do procedimento:

Regressam à gaiola, sendo posteriormente submetidos a outro passo de procedimento (ver tabela 5.1)

Se o destino dos animais for a occisão, refira qual o método de occisão a utilizar (2):

Não se aplica

Título do procedimento: Avaliação da performance comportamental em Elevated-plus maze

(Labirinto elevado em cruz) Nº do procedimento: Passo 2 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Objectivo: quantificar a reactividade anxiogénica do animal. Este labirinto consiste em duas plataformas entre-cruzadas e elevadas do chão de um metro. Existe uma zona protegida com paredes laterais onde animais são colocados no início do teste. Um animal não anxiogénico explora igualmente as zonas protegidas e não protegidas.

Espécie animal: Rato Nº de animais a utilizar: 180


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Técnica utilizada: Colocação do animal no labirinto e gravação de vídeo

Duração do procedimento: 15 minutos Frequência do procedimento: Este procedimento será realizado por duas vezes, 1 antes da exposição

ao stress agudo e a segunda um mês depois. Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Abaixo do limiar




Não se aplica

Título do procedimento: Teste de Preferência Social Nº do procedimento: Passo 3 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Este procedimento consiste na exposição do animal teste a um outro animal (dummy) através de uma partição em acrílico

Espécie animal: Rato Nº de animais a utilizar: 180 Técnica utilizada: Gravação de vídeo

Duração do procedimento: 5 minutos Frequência do procedimento: Única Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Abaixo do limiar


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Não se aplica

Título do procedimento: Teste de reconhecimento de objectos Nº do procedimento: Passo 4 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Este procedimento consiste na exposição do animal a 2 objetos na arena do open field. Três e 24 horas depois o animal é recolocado na mesma arena com um objeto novo.


Duração do procedimento: 10 minutos Frequência do procedimento: Três exposições – tempo 0, tempo 3 horas, tempo 24 horas Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Abaixo do limiar




Não se aplica

Título do procedimento: Teste de reconhecimento espacial Nº do procedimento: Passo 5 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Este procedimento consiste na exploração de um labirinto em Y em dois tempos, tempo 0 e três horas depois.



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Duração do procedimento: 5 minutos Frequência do procedimento: Única Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Abaixo do limiar




Não se aplica

Título do procedimento: Indução de Stress Agudo - Labirinto de água Nº do procedimento: Passo 6 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Este procedimento consiste na submersão do animal durante 45 segundos numa tina de água dentro de uma grelha de contenção (labirinto de água).

Espécie animal: Rato Nº de animais a utilizar: 180 Técnica utilizada: Submersão em água. Gravação de vídeo

Duração do procedimento: 45 segundo Frequência do procedimento: Única Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Moderado, sendo este o grau de severidade cumulativa do procedimento.


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Regressam à gaiola, sendo eutanasiados cerca de um mês depois (ver tabela 5.1)


Anestesia com isoflurano seguida de decapitação.

Título do procedimento: Avaliação da anhedonia através do Sucrose-preference test (Teste de

preferência de sacarose) Nº do procedimento: Passo 7 Justificação/relevância para a realização do procedimento:

Objectivo: quantificar a anhedonia. Neste teste os animais têm à sua disposição dois recipientes, um com água e outro com 30% de sacarose. Animais que estão deprimidos consomem igualmente dos dois recipientes enquanto que animais não deprimidos têm uma preferência para a água com sacarose. Este teste é feito na gaiola dos animais durante 25 dias.

Espécie animal: Rato Nº de animais a utilizar: 180 Técnica utilizada: Administração de solução de sacarose por ingestão voluntária.

Gravação de vídeo

Duração do procedimento: 25 dias Frequência do procedimento: Frequência Diária. Anestesia associada?: Não.


Não se aplica


Não se aplica


Abaixo do limiar


Procedimento realizado na gaiola do animal.


Não se aplica

(1) A classificação de severidade deverá ter em conta as categorias (Não recuperação, Ligeiro, Moderado e Severo) e

os critérios de atribuição dispostos no Anexo IV, do Decreto-Lei nº 113/2013, de 7 de Agosto. (2) A occisão dos animais deverá ser feita utilizando um método adequado referido no Anexo II do Decreto-Lei nº

113/2013, de 7 de Agosto. No caso de ser previsto outro método de occisão diferente, qual a justificação científica para isso ocorrer e que provas científicas tem que permitam concluir que o método proposto é, pelo menos, tão humano quanto os contidos no referido anexo.


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Procedimentos cirúrgicos. Quando forem realizados procedimentos cirúrgicos deverão também ser incluídas informações sobre os seguintes assuntos:

● Se a cirurgia implicará recobro dos animais ou não; ● Cuidados/procedimentos pré-cirúrgicos a realizar aos animais; ● Descrição dos procedimentos cirúrgicos, incluindo uma descrição sobre o local anatómico de

acesso; ● Cuidados pós-cirúrgicos a realizar aos animais; ● Medicação intra-operatória (que substância, dose, frequência e via de administração)

Não se aplica Quando o procedimento for a administração de uma substância, refira de que substância se trata, veículo (se necessário) e em que dose (mg/kg de peso vivo), volume, frequência e via será feita a sua administração. Não se aplica

Quando o procedimento for a administração de um produto biológico/agente infeccioso, refira de que produto/espécie/estirpe se trata e em que dose, frequência e local e via será feita a sua administração. Não se aplica

Quando o procedimento for a colheita de uma amostra biológica (incluindo para genotipagem), refira de que tecido ou fluído se trata e o volume, frequência, local e via de colheita que serão realizadas. Não se aplica


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SECÇÃO 6: RESUMO NÃO TÉCNICO DO PROJETO De notar que, de acordo com a alínea b), do artigo 43º do Decreto-Lei nº 113/2013, de 7 de Agosto, no pedido de autorização de um projeto deverá ser incluído um resumo não técnico do projeto, e considerou-se de utilidade que o mesmo faça parte da presente secção. O resumo deverá ser redigido claramente usando termos não técnicos, sempre que possível, por forma a poder ser facilmente entendido por um leigo. Para além disso, de acordo com o artigo 49º do Decreto-Lei, o projeto deverá ser explicado salvaguardando sempre a propriedade intelectual e as informações confidenciais que identifiquem quer as pessoas envolvidas no projeto quer o estabelecimento onde os animais serão alojados. O resumo não técnico será posteriormente publicitado no sítio da Internet da DGAV.

Modelo de Resumo não técnico de projeto experimental

Título do projeto Esquecer o medo: impacto do stress agudo na plasticidade sináptica da amígdala

Duração do projeto 36 meses Palavras-chave (máx. 5) Memória, stress pós-traumático, ansiedade Fim/objetivo do projeto

(de acordo com Artº 5º) (1)

Investigação fundamental Sim Investigação translacional ou aplicada Sim

Uso regulamentar e produção de rotina

Não

Proteção do ambiente natural no interesse da saúde ou do bem-estar do homem ou dos animais

Não

Investigação destinada à conservação das espécies;

Não

Ensino superior ou formação para aquisição, manutenção ou melhoria das qualificações profissionais

Não

Inquéritos no domínio da medicina legal Não

Manutenção de colónias de animais geneticamente alterados (2)

Não

Descreva os Objetivos do Projeto (ex., incógnitas científicas ou necessidades científicas/clínicas a serem abordadas, etc)

O presente projeto visa perceber o impacto do stress agudo na fisiologia do cérebro, nomeadamente na fisiologia da amígdala, um núcleo envolvido no contexto emocional das memórias.

Quais são os potenciais benefícios que possam derivar deste projeto

O principal objetivo é poder entender os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento de


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(como poderia a ciência avançar ou os seres humanos ou outros animais poderiam beneficiar com o projeto)?

doenças de ansiedade, nomeadamente no stress pós-traumático. Assim, permitir a identificação de novos alvos terapêuticos que possam contribuir para melhorar a vida quotidiana dos doentes com stress pós-traumático.

Que espécies animais e números aproximados de animais serão utilizados?

Iremos usar ratos da estirpe Wistar/Sprague Dawley. Estimamos o uso de 180 animais durante toda a realização do projeto.

No contexto do que é proposto fazer-se aos animais, quais são os efeitos adversos esperados e o grau provável/esperado de severidade? O que acontecerá aos animais no final da realização do projeto?

Todos os procedimentos utilizados neste projeto foram previamente testados e nenhum impacto significativo no bem estar animal foi detetado. O grau de severidade (cumulativa) espera-se ligeiro a moderado. No final da experiência, todos os animais usados no contexto deste projeto serão anestesiados e eutanasiados para obtenção de tecido.

Aplicação dos 3Rs

1.Replacement (Substituição) Refira a razão por que precisa utilizar animais e por que não pode usar alternativas não-animais

O estudo das conexões do sistema nervoso central requer uma análise das redes neuronais que não pode ser analisada em modelos de linhas celulares. Desta forma, torna-se absolutamente necessário a obtenção de tecido cujo processo de maturação e desenvolvimento foi realizado num orgão intacto.

2.Reduction (Redução) Explique como garantirá que serão utilizados os números mínimos de animais

Todo o desenho experimental, incluindo a análise estatística, foi concebido para reduzir o número de animais utilizados.

3.Refinement (Refinamento) Explique a escolha da(s) espécie e a razão porque o modelo(s) animal que serão usados são os mais refinados, tendo em conta os objetivos. Explique as medidas gerais que serão tomadas para minimizar os custos de bem-estar (danos) aos animais.

O sistema nervoso dos roedores, nomeadamente dos ratos, apresenta muitas semelhanças com o sistema nervoso humano, permitindo abordar questões relevantes para a fisiologia humana. Todos os animais serão manuseados pelos experimentadores (habituação) para reduzir o impacto dos dias sucessivos de experiência. Todos os animais serão mantidos em grupos com sistemas de enriquecimento ambiental e social.

Para uso oficial O projeto será submetido a avaliação retrospetiva?

Sim Não Observações

Notas: (1) Elimine Sim ou Não, conforme apropriado.

(2) Com esta opção deverá ser escolhido, pelo menos, um fim/objetivo adicional.

Jaime da Cunha Branco

formulÁrio para pedido de autorizaÇÃo de projeto de … · 2020. 8. 21. · largo da academia...

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