formulÁrio para pedido de autorizaÇÃo de projeto de … · 2020. 12. 4. · largo da academia...

____________________________________________________________________________ LARGO DA ACADEMIA NACIONAL DE BELAS ARTES, 2 – 1249-105 LISBOA TLF. 21 323 95 00 FAX 21 323 95 65

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FORMULÁRIO PARA PEDIDO DE AUTORIZAÇÃO DE PROJETO DE UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS PARA FINS CIENTÍFICOS

Este formulário inclui sete secções:

• Secção 1: Detalhes administrativos sobre o projeto, pessoas e estabelecimentos envolvidos

• Secção 2: Informações sobre o projeto

• Secção 3: Objetivos e benefícios potenciais do projeto

• Secção 4: Informações sobre os animais

• Secção 5: Informações sobre os procedimentos e o desenho experimental

• Secção 6: Resumo não técnico do projeto

• Secção 7: Declaração de responsabilidades Todas as questões têm que ser respondidas, mesmo que a sua resposta seja “Não Aplicável” ou os campos do formulário que não serão utilizados para resposta, são devidamente rasurados. As respostas têm que ser redigidas com texto bem legível e em português.

SECÇÃO 1: DETALHES ADMINISTRATIVOS SOBRE O PROJETO, PESSOAS E ESTABELECIMENTOS ENVOLVIDOS

REFERÊNCIA DO PROJETO 1.1. Título do projeto de utilização de animais:

LIMBo - Zooming the LInk between diet and brain health: how phenolic Metabolites modulate Brain inflammation

1.2. Nome do investigador responsável pela realização do projeto:

Maria Cláudia Godinho Ferreira Dias Nunes dos Santos

ENTIDADE E ESTABELECIMENTO/LOCAL 1.3. Entidade. Indicar a entidade que levará a cabo o projeto de utilização de animais:

NOVA Medical School – CEDOC - CHRONIC DISEASES RESEARCH CENTRE/Lisbon

1.4. Este projeto envolve a colaboração com outras entidades? Se sim, forneça o nome das entidades envolvidas e detalhes da colaboração.

No


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1.5. Utilizador. Indicar o nome do utilizador que levará a cabo o projeto de utilização de animais:

Maria Cláudia Godinho Ferreira Dias Nunes dos Santos (Principal Investigator) Rafael Carecho (PhD student) Catarina Pinto (Technician) Diogo Carregosa (PhD student) Natasa Loncarevic-Vasiljkovic (PostDoc)

1.6. Estabelecimento(s) onde os animais serão alojados e onde serão realizados procedimentos:

NOVA Medical School – CEDOC - CHRONIC DISEASES RESEARCH CENTRE/Lisbon

1.7. No caso de a realização dos procedimentos se pretender fazer num local diferente de um estabelecimento de um utilizador, indique qual e forneça uma justificação científica para isso acontecer.

PESSOAS 1.8. Investigador responsável:

Nome: Maria Cláudia Godinho Ferreira Dias Nunes dos Santos

Qualificações académicas: PhD in Plant Biochemistry and Regulation, Faculty of Sciences, University of Lisbon (FC-UL), Portugal

Funções desempenhadas na entidade referida em 1.3.:

Principal Investigator

Entidade/Departamento onde trabalha: CEDOC – NOVA Medical School

Morada: Edifício CEDOC II | Rua Câmara Pestana 6 | 1150-082 | Lisboa

Telefone: 962916486

Telefax:

Endereço email: [email protected]

Tem/teve algum projeto autorizado nos últimos 5 anos? Se sim, qual a designação e data de autorização:

No

Refira se tem formação em “ciência de animais de laboratório” e, se sim, liste os cursos que frequentou (com referência à data e local de realização):

IGC’s Practical Couse on Laboratory Animal Science in Mouse and Zebrafish (1-4 October 2018, IGC, Oeiras) FELASA Accredited Course 020/08F - Laboratory Animal Science Course (9-20 de Setembro de 2019, i3S, IBMC, Porto)

Refira a data de autorização emitida pela DGAV como pessoa para executar determinadas funções (por exemplo, conceção de procedimentos e projetos, realização de procedimentos em animais, etc):

License to perform procedures on animals and Design of procedures and projects (rats, mice and zebra fish) granted on October 24, 2019.


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1.9. Pessoa responsável pela realização de procedimentos nos animais:

Nome: Rafael Carecho

Qualificações académicas: Master

Funções desempenhadas no projeto de utilização de animais (por exemplo, realização de procedimentos em animais, prestação de cuidados a animais):

Rafael Carecho will be responsible for the management of animal colonies, experimental procedures and sample collection, while ensuring respecting good practices/strategies for animal welfare.

Se fôr estudante, indicar o estatuto: (ex, sem licenciatura/mestrado/PhD/outros)

PhD student

Entidade/Departamento onde trabalha/estuda: CEDOC – NOVA Medical School /ITQB Universidade NOVA de Lisboa


Telefone:

Telefax:


Descreva a sua experiência e competência na manipulação e/ou envolvimento na utilização de animais:

Rafael has already worked with laboratory mice, being involved during his master in a project working with a triple transgenic mouse model where the brain was the main focus. He gathered a lot of expertise following all the procedures of management, handling and manipulation with expertise people.


SPCAL 20h Theoretical Course on Laboratory Animal Sciences designed according to the FELASA recommendations for Category B (24/09/2018) IGC’s Practical Couse on Laboratory Animal Science in Mouse and Zebrafish (1-4 October 2018, IGC, Oeiras)


License to perform procedures on animals (rats, mice and zebra fish) granted on January 30, 2019.

1.10. Outras pessoas envolvidas:

Nome: Catarina de Jesus Garcia Pinto

Qualificações académicas: Master in Biological Engineering


Catarina Pinto will participate in carrying out procedures on animals in providing care to animals on which scientific procedures are carried out.



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Entidade/Departamento onde trabalha/estuda: CEDOC – NOVA Medical School


Telefone:

Telefax:



Since obtaining the license for animal experimentation, Catarina has developed experiments at IGC, conducting more than 15 experiments with SPF and germ-free mice. The experiments include inoculation of animals and regular sampling of feces and organ collection at the end of each experimental procedure.


IGC-CCU’s Practical Course on Animal Handling and Experimentation in Mice and Zebrafish (6-9 May 2014) Introductory Course in Laboratory animal Science (Online didactic resource follows the FELASA recommendations) (21 October 2013)


License to perform procedures on animals (rats, mice and zebra fish) granted on September 17, 2014

1.10. Outras pessoas envolvidas:

Nome: Diogo Carregosa

Qualificações académicas: Master in Biochemistry for Health


Diogo Carregosa will be responsible for carrying out experimental work and collecting samples, as well as ensuring that good animal experimentation practices are applied throughout the experiment.


PhD student



Telefone:

Telefax:



After obtaining his license, Diogo has been practicing mouse manipulation and organ collection under the close supervision of highly experienced colleagues, techniques that are extremely relevant for the project.


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IGC-CCU’s Practical Course on Animal Handling and Experimentation in Mice and Zebrafish (7-11/10/2019) Introductory Course in Laboratory animal Science (Online didactic resource follows the FELASA recommendations) (18/10/2019)


License to perform procedures on animals (rats, mice and zebra fish) granted on December 4, 2019

10. Outras pessoas envolvidas:

Nome: Natasa Loncarevic-Vasiljkovic

Qualificações académicas: PhD in Neurobiology


Natasa Loncarevic-Vasiljkovic will be responsible for carrying out experimental work and collecting samples, as well as ensuring that good animal experimentation practices are applied throughout the experiment.




Telefone:

Telefax:



Natasa is experienced in various murine models. She was working with different strains of laboratory rats and mice, being involved in a project working with a triple and 5xFAD transgenic mouse model, where the brain was the focus.


Natasa Loncarevic-Vasiljkovic attended and completed the Laboratory Animal Science (LAS) Course, University of Belgrade (20/01/2020) and the module on Portuguese LAS Legislation organized by CONGENTO/ Fundação Champalimaud on 20/7/2020.


License asked on 20/03/2020

Para cada pessoa adicional, copiar a tabela 1.10. e preencher em conformidade


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SECÇÃO 2: INFORMAÇÕES SOBRE O PROJETO

CONTINUAÇÃO DE PROJETO/UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS 2.1. Continuação de projeto/utilização de animais. Se pretende obter uma autorização para continuar o trabalho desenvolvido noutro projeto/utilização de animais previamente autorizado, refira a designação do mesmo(a), a data de autorização e a data de término.

No

DATAS DO PROJETO 2.2. Datas do projeto:

Especifique a duração requerida para a autorização do projeto/utilização de animais(1):

5 years

Data proposta para o início: 01/06/2020

Data prevista para o término: 30/04/2025 (1) De notar que, de acordo com o nº 3, do artigoº 46º do Decreto-Lei, a duração máxima permitida para a realização de um

projeto é de cinco anos.

SUBMISSÃO DO PROJETO AO ÓRGÃO RESPONSÁVEL PELO BEM-ESTAR DOS ANIMAIS 2.3. O projeto foi previamente submetido ao Órgão responsável pelo bem-estar dos animais (ORBEA) do estabelecimento onde os animais vão estar alojados? Se sim, anexe, ao presente pedido de autorização, o parecer não vinculativo emitido pelo ORBEA sobre o projeto em apreço.

Yes

FINANCIAMENTO E RECURSOS PARA A REALIZAÇÃO DO PROJETO 2.4. Financiamento e recursos para realização do projeto. Indique se dispõe de financiamento e de recursos adequados (por ex., instalações, equipamento, staff, conhecimento adequado, etc) para realização deste projeto e descreva sumariamente. Se dispõe de financiamento, indique qual a entidade financiadora.

Funding is provided through the European project financed by ERC (Project No. 804229). PhD students, laboratory technicians and post-docs, as well as all charges related to carrying out the experiments are included in the project. The iNOVA4Health Research Unit (Grant LISBOA-01-0145-FEDER-007344), which is co-funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência e do Ensino Superior, through national funds, and by FEDER under the PT2020 Partnership Agreement is acknowledged. In addition, the PhD student Rafael Carecho has his own PhD scholarship (PD/BD/135492/2018).


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The facilities, staff and knowledge are adequate to carry out the project. The researchers involved have experience in animal experimentation and we have collaborations with CEDOC researchers who have extensive experience in the same animal model to be use in this project.

RISCOS DE SAÚDE E/OU SEGURANÇA PARA OUTROS ANIMAIS, PESSOAS OU PARA A COMUNIDADE

2.5. O projeto envolve riscos de saúde e/ou de segurança para outros animais alojados nas instalações, pessoas ou para a comunidade? Se sim, indique quais dos seguintes riscos de saúde e/ou de segurança estão envolvidos com o projeto, forneça detalhes e refira que medidas foram tomadas para minimizar esses riscos. Does the project involve health and / or safety risks for other animals housed on the premises, people

or the community? If so, please indicate which of the following health and / or safety risks are

involved with the project, provide details and state what measures have been taken to minimize these

risks.

Gases anestésicos Yes , Isoflurane / halothane

Carcinogénios ou teratogénios Yes, paraformaldehyde

Material químico perigoso ou substâncias citotóxicas (não incluindo os gases anestésicos)

Yes, MPTP

Organismos ou materiais biologicamente perigosos (por exemplo, vírus, bactérias, fungos, etc). Especifique que grau de risco biológico está associado ao organismo.

No

Risco de radiação No

Potenciais zoonoses No

Outros No

At the end point of the experiment Isoflurane/Halotane, a gas anesthetic, will be used together with

Ketamine/xylasine to ensure deep anesthesia, preventing any possibility for animals to feel pain when

performing preparation for perfusion, terminal heart puncture for blood collection and first moments of

perfusion. To avoid potential harm from the Isoflurane/Halotane for the researchers performing the

perfusion, the entire procedure will be done in the ventilated hood.

For the purpose of brain tissue fixation paraformaldehyde will be used. As a formaldehyde releasing agent,

paraformaldehyde is a potential carcinogen. To avoid potential harm from the paraformaldehyde for the

researchers performing the brain tissue collection, the entire procedure will be done in the ventilated hood.

As for the animals receiving MPTP, a Special Animal Safety Protocol (SASP) will be provided by the Animal

Facility to inform researchers on how to do the handling of animals that are administered with this hazardous

chemical (MPTP) as well as how to perform the housing of these animals withinin the first 72 hours. Thus,

during the first 72 hours after the MPTP injection, animals should not be handled by the vivarium personnel

or removed from the cages.

Lipopolyssacharides (LPS) will be used for the neuroinflammatory model. LPS is known to have endotoxin

activity causing inflammatory response and pyretic activity causing fever. Nevertheless, LPS will be


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administrated at doses far below what appear to cause animal death and research has proven that repeated

injection of doses of almost 100x above the ones included in this project can only cause death after multiple

injections on the course of 60 days for the particular mice strain and age (Lew et al., 2013). LPS is not

known to bioaccumulate and it is processed by healthy mice, having no signs in urine or feaces. Direct

contact will LPS is not known to cause any consequent at the doses used in this project unless if inhaled,

yet solubilized LPS prevents this situation. However, to protect the handlers from accidental causes, normal

good laboratory/working practice will be applied.


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SECÇÃO 3: OBJECTIVOS E BENEFÍCIOS POTENCIAIS DO PROJETO 3.1. O artigo 5º do Decreto-Lei requer que um programa de trabalho utilizando animais seja realizado para os seguintes fins. Para o efeito, deverá selecionar o que se aplicar ao projeto proposto:

X a) Investigação fundamental

X b) Investigação translacional ou aplicada, tendo em vista um dos seguintes fins:

X i. A prevenção, a profilaxia, o diagnóstico ou o tratamento de doenças, de problemas de saúde ou de outras situações anormais ou dos seus efeitos nos seres humanos, nos animais ou nas plantas;

X ii. A avaliação, a deteção, a regulação ou a alteração das condições fisiológicas nos seres humanos, nos animais ou nas plantas;

iii. O bem-estar dos animais e a melhoria das condições de produção dos animais criados para fins agrícolas;

c) Desenvolvimento, produção ou controlo da qualidade, da eficácia e da segurança de medicamentos, géneros alimentícios, alimentos para animais e outras substâncias ou produtos, para um dos objetivos mencionados na alínea b);

d) Proteção do ambiente natural no interesse da saúde ou do bem-estar do homem ou dos animais;

e) Investigação destinada à conservação das espécies;

f) Ensino superior ou formação para aquisição, manutenção ou melhoria das qualificações profissionais;

g) Inquéritos no domínio da medicina legal.

3.2. Faça uma descrição do contexto global do projeto selecionando uma de entre as seguintes hipóteses e respondendo às questões:

X Para investigação: Qual é a posição atual do projeto na área de trabalho e de que modo o mesmo irá ajudar a acrescentar conhecimento, progresso ou colmatar uma necessidade clínica, por exemplo, relativamente ao estado atualmente existente? The project is based on the putative effect of (poly)phenols, present in the human diet, on brain’s health. Thus, with these animal approaches, we intend to attain an integrated perception of dietary phenolics effects on brain in a mice model of neuroinflammation and a mice model of Parkinson’s Disease (PD). By this we will have established the grounds for a more robust understanding of the brain signaling pathways and cell targets that are affected by phenolic metabolites (PMs) and overall contribute for a healthy brain, furthering the nutritional/clinical application of dietary phenolics. In addition, we may inspire to the pharmaceutical industry the use of specific PMs as prodrugs.

Para satisfazer requisitos regulamentares: Quais são os requisitos ou as guidelines regulamentares relevantes?

Para fins de produção ou diagnóstico: Quais são os prováveis pedidos que justifiquem a necessidade do produto ou do serviço durante o tempo da autorização do projeto?


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Para ensino: Quais são as necessidades de formação subjacentes ao pedido de utilização de animais?

3.3. Faça uma descrição dos objetivos do projeto. O que é proposto alcançar, descobrir ou produzir com a realização deste projeto? Os objetivos devem ser específicos para o projeto em apreço, realistas e alcançáveis.

The main goals proposed for this project are in line with the perception of berries phenolics effects on

brain in a pathologic context. To achieve this knowledge, we intend to perform a nutritional intervention

to study the effect of a diet rich in (poly)phenols on mice models of neuroinflammation and Parkinson’s

disease.

Concretely, we aim to supplement the animal diet with a mixture of lyophilized berries (blueberries, raspberries and blackberries), both in a preventive approach and therapeutic approach. The animals will be fed daily with 2g/day of lyophilized puree of berries. In the end we intent to evaluate: i) the differences in microbiota composition due to the diet; ii) berries phenolic metabolites on circulation, metabolic fate and brain uptake; iii) the capacity of berries phenolic metabolites to mitigate neuroinflammation using behavior and biological markers. These objectives will be done for both neurodegenerative models in study.

3.4. Refira quais são os benefícios prováveis deste projeto e a razão por que valerão a pena para contrabalançar o sofrimento e efeitos adversos infligidos aos animais a envolver no projeto?

This project will provide solid knowledge foundations for future implementation of an adequate phenolic supplementation in diet for a healthy brain. Despite the paradigmatic public acceptance that a phenolic-rich diet brings beneficial impacts to the brain health, we are lacking a mechanistic understanding of how their intake can directly mediate improvements in brain functions. Only by addressing this knowledge gap, scientific data on phenolics can be translated to specific brain function improvements either in a preventive or therapeutic context.

3.5. Liste algumas referências bibliográficas e/ou guidelines regulamentares que suportem a necessidade do projeto e/ou os benefícios prováveis indicados para o mesmo, assim como de quaisquer modelos específicos propostos para serem utilizados nos procedimentos a realizar.

Why animals

Figueira I et al., Polyphenols Beyond Barriers: A Glimpse into the Brain. Current Neuropharmacology.

4, 562-594 (2017). Degan D et al., The Role of Inflammation in Neurological Disorders. Current Pharmaceutical Design. 14, 1485-1501 (2018) Carregosa D et al., Low-Molecular Weight Metabolites from Polyphenols as Effectors for Attenuating Neuroinflammation. J. Agric. Food Chem. 68, 1790-1807 (2020). Figueira I et al., Polyphenols journey through blood-brain barrier towards neuronal protection. Scientific Reports 7, Article number: 11456 (2017). Hafezparast M et al., Mouse models for neurological disease. The Lancet Neurology 4, 215-224 (2002).

Justification for number of animals (sex bias)


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Kujawska and Jodynis-Liebert. Polyphenols in Parkinson’s Disease: A Systematic Review of In Vivo

Studies. Nutrients,10, 642; (2018). doi:10.3390/nu10050642

Beery and Zucker. Sex Bias in Neuroscience and Biomedical Research. Neurosci Biobehav Rev.; 35(3):

565–572 (2011).

Evidences suggesting Female Vs Male differences on behavior, Blood Brain barrier integrity and neuronal death: Erickson, M. A. et al. Genetics and sex influence peripheral and central innate immune responses and blood-brain barrier integrity. PLoS One 13, e0205769 (2018). Liu, Y. et al. Endotoxin induces a delayed loss of TH-IR neurons in substantia nigra and motor behavioral deficits. Neurotoxicology 29, 864–870 (2008). Evidences suggesting Female vs Male differences in gut microbiome composition: Wankhade, U. D. et al. Sex-Specific Changes in Gut Microbiome Composition following Blueberry Consumption in C57BL/6J Mice. Nutrients 11, 313 (2019). Evidences suggesting gut microbiome alteration in mice on a dietary intervention model Tu, P. et al. Characterization of the Functional Changes in Mouse Gut Microbiome Associated with Increased Akkermansia muciniphila Population Modulated by Dietary Black Raspberries. ACS Omega 3, 10927–10937 (2018).

Gloria E. Meredith et al., MPTP Mouse Models of Parkinson’s Disease: An Update. Journal of

Parkinson’s Disease. 1, 19-33 (2011). Justification for using C57BL/6 in neuroinflammation Nava Catorce, M. and Gevorkian, G. LPS-induced Murine Neuroinflammation Model: Main Features and Suitability for Pre-clinical Assessment of Nutraceuticals. Current Neuropharmacology, 14 (2),155-164. (2016) Neuroinflammation model in mice and behavioral testing: Zhao, J. et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Sci. Rep. 1–12 (2019). doi:10.1038/s41598-019-42286-8 LPS toxicity: Lew WYW. Et al., Recurrent Exposure to Subclinical Lipopolysaccharide Increases Mortality and

Induces Cardiac Fibrosis in Mice. PLoS ONE 8(4): e61057.


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SECÇÃO 4: INFORMAÇÔES SOBRE OS ANIMAIS

APLICAÇÃO DOS 3Rs REPLACEMENT (SUBSTITUIÇÃO) 4.1. Explique por que não é possível alcançar os objetivos do projeto através da utilização de métodos alternativos que não utilizem animais e indique que fontes e referências bibliográficas consultou para encontrar possíveis alternativas:

We will use a mouse model of neuroinflammation to confirm the protective effect of phenolic metabolites of low molecular weight that result from the metabolism of microbiota (Carregosa D et al., 2020) in the brain and validate the previously identified molecular targets for some of these molecules (Figueira I et al., 2017). After a series of in vitro and in silico tests that we performed (Figueira I et al., 2017), we need to use in vivo models to confirm our results in a much more complex and biologically relevant model. In fact, neurological diseases depend not only on neuronal death, but also on the restructuration of the brain organization and response and the possible consequences on behavior that cannot be recapitulated outside a living organism. Thus, it is of crucial importance to evaluate the neuroprotective potential of low molecular weight (poly)phenol metabolites in mammalian species (mice) in order to obtain relevant findings that could be extrapolated to human population. Since they share many physiological processes with humans, replicating symptoms of human conditions, rodent models constitute the appropriate way to answer disease questions. Moreover, mice develop a range of behavioural changes that resemble those in the human pathology and that can be scored and allow for intergroup comparison. The behavioral testing, that will be conducted within this project, will give us direct insight into the LMW (poly)phenol metabolites potential for neuroprotection. This will be achieved by estimating their effects on LPS- and PD-related symptomatology via battery of behavioral and biological tests. Due to their relatively short lifespan, mice represent an efficient tool to speed research, and the exponential knowledge acquired on their genetics during the past years allowed mimicking many human pathological conditions (Hafezrapast M et al., 2002). The mouse is therefore the most refined species’ choice for this experimental procedure and the critical limits are readily accessible and measurable though simple behavioural tests.

4.2. Que alternativas (totais ou parciais) considerou e irão ser utilizadas para alcançar os objetivos do projeto? Indique as fontes consultadas.

We had already explored a series of in vitro and in silico tests (Figueira I et al., 2017) that require now in vivo models for our results validation.

REDUCTION (REDUÇÃO) 4.3. Número de animais a serem utilizados.

The minimal number of animals (mice) necessary to achieve a size effect attaining statistical significance was calculated based on (i) our own preliminary data and expected variability for the experimental models and procedures to be performed herein; (ii) on a power of 90% with a significance level of 5%, using the One-way ANOVA (Kruskal-Wallis) or t test (Mann-Whitney) statistical tests.


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We planned to use 2 experimental models (Parkinson’s Disease and neuroinflammation) and test for each two approaches (preventive and therapeutic). For all trials we intend to use a mixture of lyophilized berries (blueberries, raspberries and blackberries) supplementing the animal diet, both in the preventive approach and therapeutic approach. The animals will be fed daily with 2g/day of lyophilized puree of berries. In both experimental models 8 experimental groups will be present.

1) Animals to be used as Parkinson’s Disease model (PD model) For the investigation of neuroprotective potentials of berries, testing whether active components from the berries interfere with MPTP metabolisms and toxokinetics is crucial. This will be achieved by giving the berries to mice either before or after MPTP administration and then collecting the striatum to determine the half-life of MPP+. For that purpose, we will set up a pilot study containing 3 groups of mice (as showed below). The results obtained within pilot study will serve us to establish the most appropriate experimental design which will ensure that the interference of the active components of berries with MPTP metabolism and toxokinetics does not occur.

Pilot-study: 24 mice (4 male and 4 female mice in each group): Group 1: Standard diet + MPTP (pilot group for control) Group 2: Berries-enriched diet + MPTP (pilot group for preventive approach) Group 3: MPTP + berries-enriched diet (pilot group for therapeutic approach)

Study: 208 mice (96 males and 112 females) - 8 experimental groups (12 male mice and 14

female mice in each group):

The animals will be divided into two subgroups according to preventive or therapeutic model:

A) Preventive approach (Berries-enriched diet before MPTP induced pathology): Group 1: Standard diet + single saline injection Group 2: Berries-enriched diet + single saline injection Group 3: Standard diet + single MPTP injection Group 4: Berries-enriched diet + single MPTP injection B) Therapeutic approach (Berries-enriched diet simultaneously to MPTP induced pathology): Group 5: Single saline injection + standard diet Group 6: Single saline injection + berries-enriched diet Group 7: Single MPTP injection + standard diet Group 8: Single MPTP injection + berries-enriched diet Note: The projected higher number of females to be used in this model is justified by the more prevalent side effects in females associated to MPTP injections.


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Total: Pilot-study + Study (subgroup A+B): 232 mice (104 males and 120 females)

Experimental unit: individual mouse

2) Animals to be used as Neuroinflammation model

Within the Neuroinflammation model, the information whether the experimental design is appropriate to achieve required level of inflammation is crucial. For that purpose, we will set up a pilot study containing 2 groups of mice (as showed below). The results obtained within pilot study will give us information about the validity of the particular LPS model in terms of the level of inflammation it induces. Also, it will enable us to estimate the anti-inflammatory potential of the treatment used in this study (berries-enriched diet), allowing us to adjust experimental settings before starting the experiment.

Pilot-study: 16 mice (4 male and 4 female mice in each group): Group 1: Standard diet + LPS (pilot group for control) Group 2: Berries-enriched diet + LPS (pilot group for preventive approach)

Study: 192 mice (96 males and 96 females) - 8 experimental groups (12 male mice and 12

female mice in each group):

The animals will be divided into two subgroups according to preventive or therapeutic model:

A) Preventive approach (Berries-enriched diet before LPS induced pathology):

Group 1: Standard diet + saline injection for 7 days

Group 2: Berries-enriched diet + saline injection for 7 days

Group 3: Standard diet + LPS injection for 7 days

Group 4: Berries-enriched diet + LPS injection for 7 days

B) Therapeutic approach (Berries-enriched diet simultaneously to LPS induced pathology):

Group 5: Saline injection for 7 days + Standard diet

Group 6: Saline injection for 7 days + Berries-enriched diet

Group 7: LPS injection for 7 days + Standard diet

Group 8: LPS injection for 7 days + Berries-enriched diet

Total: Pilot-study + Study (subgroup A+B): 208 mice (104 males and 104 females)

Experimental unit: individual mouse

3) Overall number of animals that will be used for both PD and Neuroinflammation model, including the animals for pilot experiments for both models is: 440 C57BL/6J mice.


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4.4. Forneça justificação sobre o número de animais a ser utilizado, especificando os princípios do desenho experimental usados para calcular o número de animais a incluir em cada grupo experimental ou de tratamento, incluindo grupos controlo, de cada um dos procedimentos que farão parte do projeto. Indique quais as fontes de aconselhamento consultadas para esse efeito. The high number of animals that will be used within this study is due to the inclusion of animals of both sexes into the trial. Male bias was evident in 8 disciplines and most prominent in neuroscience, with single-sex studies of male animals outnumbering those of females 5.5 to 1 (Beery and Zucker, 2011). More than 90% of the studies related to the use of polyphenols in the PD models are conducted on male animals (reviewed in Kujawska and Jodynis-Liebert, 2018). In order to fill the gap in knowledge it is essential to evaluate the effects of polyphenols in both male and female animals. Moreover, since this study is oriented towards the applicability of the obtained results, our goal is to seek for the compounds that will be relevant not only for men but for both men and women. As stated, the minimal number of animals (mice) necessary to achieve statistical significance was calculated based on (i) our own preliminary data and expected variability for the experimental models and procedures; (ii) on a power analysis of 90% and a significance level of 5%, using the One-way ANOVA (Kruskal-Wallis) or t test (Mann-Whitney) statistical tests.

4.5. Foi considerada alguma colaboração com outro estabelecimento (interno ou externo) para reduzir o número de animais utilizados (utilização conjunta dos animais) (por exemplo, diferentes órgãos do mesmo animal são usados em mais de um laboratório)?

Yes. We currently have internal collaborations with others research groups in CEDOC using the same animal model. The pancreas of the animals from PD trial and LPS trial will be tested for purposes other than this project. Moreover, we are also sharing the animals for PD model with another group in CEDOC.

REFINEMENT (REFINAMENTO) 4.6. Forneça informações sobre a escolha da espécie animal, procedimento(s) e limites críticos e explique por que razão são os mais refinados para o objetivo requerido.

There are three animal groups that are commonly used for modelling human diseases, and Neuroinflammation or PD are no exception. Those groups are: rodents, non-human primates (NHP), and non-mammalian species. Each group has its own advantages and limitations that determine the suitability for a given experiment. Experimental rodent models and in particularly laboratory mice, have been widely used for the last decades on biological research. Since they share many physiological processes with humans, replicating symptoms of human conditions, rodent models constitute the appropriate way to answer disease questions. Due to their relatively short lifespan, they represent an efficient tool to speed research, and the exponential knowledge acquired on their genetics during the past years allowed mimicking many human pathological conditions. Fully recognized by the scientific literature, we will use the Mus musculus (C57BL/6J), known as the common laboratory mouse. PD will be trigger by the acute administration of MPTP, while the neuroinflammation will be triggered by sub-acute administration of LPS. Since different strains display different sensitivities in response to MPTP and LPS, our choice for C57BL/6J was based in the literature as one of the strain more sensitive to develop the desired phenotypes and also one of the most used (Gloria E. Meredith et al. 2011;


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Catorce and Gevorkian, 2016). Mice develop a range behavioral changes that resemble those in the human pathology and that can be scored and allow for intergroup comparison. Non-mammalian models, including drosophila and Caenorhabditis (C.) elegans, have been used in a small proportion of experimental PD studies over the past decades. These models are suitable for studying fundamental principles governing cellular, genetic, and network changes resulting from dopaminergic loss. However, studies in non-mammalian species are, so far, used in a small fraction of PD models and can be challenging to translate to humans. The mouse is therefore the most refined species’ choice for this experimental procedure and the critical limits are readily accessible and measurable though simple behavioural tests. At this respect, signs and manifestations mentioned under section 4.7 will be taken as endpoints, as appropriate for this purpose, as mild to moderate severity procedures are to be used in this project. Animals will be frequently monitored by highly trained personnel (on a daily or every two days basis) and in case of an unexpected increase in severity (to severe), mice will be immediately euthanized.

4.7. Para cada procedimento do projeto, forneça detalhes sobre como minimizar o sofrimento dos animais a envolver. For each project procedure, provide details on how to minimize the suffering of the animals to be involved.

Proposed experimental design requires animals to be single housed in order to accurately determine the food consumption of each animal per day and collection of faeces. Once animals reach the age of 10 weeks, they will be removed from their home cages. However, to avoid social isolation stress, we will house 2 animals per cage, separated by a clear acrylic barrier with small openings for mutual communication (sniffing) of the animals within the same cage. The introduction of material for nesting and hiding in order to reduce stress levels. In the case of symptomatic animals, we will make food and water more accessible so the animals will not have to elevate in their hind limbs to access it, reducing the discomfort of the animals. Mild to moderate severity procedures are to be used in this project. Substantial efforts will be made to maintain at minimum the number of mice necessary to accomplish our goals. To minimize and to control suffering, general animal health and welfare conditions will be rigorously monitored. This will imply following up signs of disruption, including, but not restricted to: abnormal/laboured breathing, rough hair coat, hunched posture, lethargy, subdued behaviour, lack of movement, prostration, dehydration, body condition (assessed by scoring the degree of flesh and fat covering bony protuberances, for which the score will be kept as ≥ 2, i.e. distinct (not sharp) bony protuberances and shallower indentations between vertebra), exudates around eyes and/or nose, bleeding from any orifice, skin lesions or any other condition limiting or causing difficulty to eat or drink, or causing moderate discomfort, pain or distress. Care will be taken to ensure that any animal exhibiting signs of severe suffering or distress, included on the normal condition disruption (described above), will be euthanized. Clinical signs including ≥ 20% weight loss, abnormal/labored breathing, rough hair coat, lethargy and body condition score ≤ 2 will also determine immediate euthanasia. Animal health and welfare will be monitored daily, by highly trained personnel who will recognize early signs of morbidity and, in case, euthanize the affected animal. Overall, vigilance, prompt recognition of suffering and rapid euthanasia will aid in minimizing suffering as much as possible. Moderate situations will be recorded, and future control approaches will be discussed with the veterinary of the animal facility.


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4.8. Para cada um dos procedimentos em que se preveja infligir uma severidade de grau Moderado ou Severo aos animais, justifique a razão para que a realização dos mesmos seja necessária.

The expected level of severity of procedures that will be applied within the study is - Moderate (for the MPTP-injected animals) and Mild (for the LPS-injected animals). In case of an unexpected increase in severity (to severe), mice will be immediately euthanized. Acute dose of MPTP will be employed to induce PD, while a sub-acute dose of LPS will be employed to induce neuroinflammation, and if any shift of severity, from moderate to severe, will be observed, the animals will be immediately euthanized to prevent further suffering. As previously described, general animal health and welfare conditions will be daily monitored. A detailed description of the procedures has been reported under section 5.2.

4.9. Uma vez iniciado o projeto, os animais vivos serão removidos da instalação onde estão alojados? Se sim, explique qual a razão, indique como será feito o transporte, para que local serão levados, por quanto tempo e se retomam para a instalação de origem ou para outra.

No

ANIMAIS 4.10. Espécie animal a utilizar no projeto.

Mus musculus (laboratory mouse)

4.11. Irão ser utilizadas formas fetais de mamíferos ou formas larvares de alimentação autónoma? Se sim, especifique.

No

4.12. Estirpe(s) a utilizar.

C57BL/6J

4.13. Estatuto genético dos animais a utilizar:

X Tipo selvagem

Geneticamente alterados sem fenótipo nocivo

Geneticamente alterados com fenótipo nocivo.

4.14. Animais geneticamente alterados. Especifique se o projeto em apreço envolve:

A utilização de animais geneticamente alterados de linhagens existentes e sem problemas de bem-estar (sem fenótipo nocivo). - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Quais os efeitos adversos esperados e não esperados para os animais que serão submetidos aos procedimentos do projeto. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta a ocorrência desses efeitos adversos.

No


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A utilização de animais geneticamente alterados de linhagens existentes e com problemas de bem-estar (com fenótipo nocivo). - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Descreva o impacto da alteração do genótipo no bem-estar do animal. - Quais os efeitos adversos esperados e não esperados para os animais que serão submetidos aos procedimentos do projeto. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta o fenótipo dos animais e/ou a ocorrência de efeitos adversos.

No

Criação de uma nova linhagem de animais geneticamente alterados. - Descreva brevemente o(s) gene(s) e a função do gene(s) que foi alterado(s) e qual a razão porque este mapa genético é essencial para o seu projeto. - Descreva o impacto esperado da alteração do genótipo no bem-estar do animal. - Que cuidados especiais (médico-veterinários, de maneio, alojamento, etc) poderão ser considerados utilizar tendo em conta o fenótipo esperado dos animais.

No

4.15. Origem dos animais (estabelecimento, país, etc)

NOVA Medical School | Faculdade de Ciências Médicas, Rodent facility, Lisbon, Portugal or Jackson Laboratory (https://www.jax.org).

4.16. Os animais a serem utilizados neste projeto foram especificamente criados para serem utilizados para fins científicos? Se não, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais os animais a utilizar neste projeto não foram especificamente criados para fins científicos.

Yes

4.17. Os animais a serem utilizados neste projeto foram capturados no meio selvagem? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais os animais precisam de ser capturados no meio selvagem.

No

Se sim, tem um parecer favorável emitido pelo Instituto da Conservação da Natureza e das Florestas para a captura dos animais? Em caso afirmativo, anexe a este pedido de autorização de projeto, cópia desse mesmo parecer.

N/A

4.18. Os animais a serem utilizados neste projeto são errantes ou assilvestrados de alguma espécie animal doméstica? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais um animal errante ou assilvestrado de uma espécie doméstica precisa de ser utilizado neste projeto.

No


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4.19. Os animais a serem utilizados neste projeto pertencem a alguma espécie ameaçada de extinção? Se sim, forneça uma justificação científica sobre as razões pelas quais é necessário utilizar uma espécie ameaçada de extinção neste projeto.

No

CARACTERÍSTICAS DO MANEIO A PRESTAR AOS ANIMAIS 4.20. No caso de ser feito enriquecimento ambiental ao alojamento dos animais, descreva-o.

The animals will be kept in SPF conditions according to the protocols approved by the Animal Welfare Body of CEDOC. The introduction of materials for building nests and hiding places is planned.

4.21. Os animais a utilizar no projeto necessitam de condições de alojamento especiais? Se sim,

especifique que condições e justifique a necessidade das mesmas terem que ser utilizadas. Do the

animals to be used in the project need special housing conditions? If so, specify which conditions

and justify the need for them to be used.

Yes. The animals receiving MPTP need to be hold in conventional cages with a filter top in the first 72 hours after the injection. Since MPTP is metabolized in its highly toxic form - MPP and most of it is excreted through the urine and feces of the animals in first 72 hours following injection, the cages will have a disposable plastic liner to contain the hazardous by-products excreted by the animals, that will be disposed of in a fume hood according to Animal Facility Biosafety guidelines.

4.22. Os animais a utilizar no projeto necessitam de dieta alimentar ou de abeberamento especiais? Se sim, especifique. Special dietary needs and water management, please specify

Yes. Half of the entire number of animals participating in the experiment (total of 220) will be fed with the special food enriched with lyophilized berry mixture.

4.23. Os animais a utilizar no projeto necessitam de prestação de cuidados ou de atenção especiais? Se sim, especifique. Special care and atention, please specify.

Yes, MPTP mice will require water bottle caps with a longer sipping tube to enable recovering animals to drink while in a lower position.

-Mice under MPTP treatment might have special nesting needs due to difficulties on locomotion, daily

monitorization of these animals, the use of soft enrichment to ease nesting behavior is contemplated.

4.24. Os animais serão alojados individualmente? Se sim, forneça detalhes das circunstâncias, período de tempo e justificação para que se faça o alojamento individual.

Yes, the proposed experimental design requires animals to be single housed when reach 10 weeks of age and throughout the duration of experiment in order to accurately monitor the food consumption of each animal daily and collection of faeces. In order to avoid social isolation stress, we will house 2 animals per cage, separated by a clear acrylic barrier with small openings for mutual communication (sniffing) of the animals within the same cage. Also, the cages of animals will be equipped with cardboard tubes for hiding and play, as well as with the nesting material, in order to reduce stress in animals by enriching their environment.


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REUTILIZAÇÃO DE ANIMAIS 4.25. Algum dos animais a utilizar neste projeto foi previamente usado num outro estudo/utilização para fins científicos? Se sim, em que condições? Justifique a necessidade de envolvimento do mesmo neste projeto. De notar que para um animal poder ser reutilizado, têm que estar satisfeitas as condições referidas nas alíneas a) a d), do ponto 1, do artigo 16º, do Decreto-Lei nº 113/2013. Assim, forneça informações sobre: o título do projeto prévio em que foi utilizado, a severidade efetiva do procedimento a que ficou sujeito, estado geral de saúde e de bem-estar do animal, parecer médico-veterinário sobre o envolvimento do animal num novo procedimento, tendo em conta a duração de vida do animal.

No


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SESSÃO 5: INFORMAÇÕES SOBRE OS PROCEDIMENTOS E O DESENHO EXPERIMENTAL

SEQUÊNCIA DE ACONTECIMENTOS

5.1. Faça uma descrição completa e exata, acompanhada por uma linha temporal, de todos os eventos e procedimentos (devidamente identificados e numerados) que irão acontecer a cada animal (ou grupo de animais), desde a altura em que são obtidos até à altura em que o projeto é finalizado. No caso de melhorar a clareza da descrição do plano do projeto, ilustre as diferentes etapas acima mencionadas com um fluxograma ou um esquema.

Since proposed experimental design requires animals to be single housed in order to accurately determine the food consumption of each animal per day and collect of feces, once animals reach the age of 10 weeks, they will be removed from their home cages and individually caged (2 animals per cage separated by clear acrylic separator). The animals will be left for 7 days to adjust to isolation. When mice reach 11 weeks of age, they will be divided into 8 different experimental groups for each experimental model (8 groups for MPTP, and 8 groups for LPS) as described below: 1 – PD model:

In the subgroup A (preventive approach), the animals from the group 1 (control group) and group 2 will be injected with a single dose of saline after 6 weeks (t:-42d to t:0d) of being fed with standard diet or berries-enriched diet (mixture of berries (blueberry, raspberry, blackberry)), respectively. Animals from the groups 3 and 4 will follow the same procedure being injected with a single dose of MPTP instead of saline, respectively. All injections will be done using the same procedure (intraperitoneal injection), volume and timeframe


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In the subgroup B (therapeutic approach), the animals from the group 5 (control group) and 6 will be injected with a single dose of saline at day 0, on the same day they will start being differently fed –with standard diet or berries-enriched diet (mixture of berries (blueberry, raspberry, blackberry)), respectively for the next 6 weeks (t:0d to t:43d). The animals in groups 7 and 8 will follow the same experimental procedure but being injected with a single dose of LPS per day, for seven consecutive days, instead of saline. All injections will be done using the same procedure (intraperitoneal injection), volume and timeframe


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2 - Neuroinflammation Model In the subgroup A (preventive approach), the animals from the group 1 (control group) and group 2 will receive a single saline injection per day, for seven consecutive days, after 6 weeks (t:-42d to t:0d) of being fed with standard diet or berries-enriched diet (mixture of berries (blueberry, raspberry, blackberry)), respectively. Animals from the groups 3 and 4 will follow the same experimental procedure but being injected with a single dose of LPS per day, for seven consecutive days, instead of saline. All injections will be done using the same procedure (intraperitoneal injection), volume and timeframe


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In the subgroup B (therapeutic approach), the animals from the group 5 (control group) and the group 6 will start receiving single saline injection per day, for 7 consecutive days (day 0 to day 6). On the day 0 they will start to be fed with standard diet or berries-enriched diet (mixture of berries (blueberry, raspberry, blackberry)), respectively for the next 6 weeks (t:0d to t:42d). The animals from the groups 7 and 8 will follow the same experimental procedure but being injected with a single dose of LPS per day, for seven consecutive days, instead of saline. All injections will be done using the same procedure (intraperitoneal injection), volume and timeframe


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For both experimental models (PD and Neuroinflammation model) blood, faeces and urine collection

will be conducted as designated at the schematics below. The MPTP and LPS protocols are marked blue and orange within the schemes, respectively. Blood drop will be collected from the mice tail, with not less than one-week interval between the sampling. Urine up to 100uL per sampling will be collected in the same timepoints as for faeces. Up to 6 pellets will be collect for each timepoint identified. Additional facultative timepoints for urine and faeces collection are not yet fully defined. Other timepoints for faeces collection will be defined.


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Behaviour testing will be performed on animals in both experimental designs, as indicated below. The battery of behavioural tests for a PD model to be conducted is: Open field, Rotarod, paw grip endurance test, grid test, pole test, rope test and the ink/paw prints test. The battery of the behavioural tests for Neuroinflammation model to be conducted is: Open field, Rotarod, Morris water maze (MWM), passive avoidance test (P.A. test), Y maze and pole test. Behavioural testing will be performed in 3 time points during the experiments (detailed description and schematic representation below). Every time the testing will last for at least 4 consecutive days and will include the necessary training of the animals to perform behavioural tests and testing itself.

• First behavioural testing (marked green on the scheme) will be conducted after adjusting to isolation, once the animals reach the age of 11 weeks. The purpose of this first behavioural testing is to use every single animal that is involved in the experiment as its own control throughout the experiments. That way, the effects of dietary intervention, the effects of MPTP or LPS, as well as the effect of different age of the same mice will also be (individually) evaluated. This first testing is common for both preventive ant therapeutic experimental settings of both MPTP and LPS model.

• Second testing (marked yellow on the scheme) for preventive approach will be conducted when the animals reach the age of 17 weeks, one week before the saline, MPTP or LPS groups get subjected to the injections. In the case of the preventive approach, the purpose of the second testing is to determine whether a pre-treatment with the berry-enriched food itself impacts the animal behaviour. Second testing for therapeutic approach will be conducted when the animals reach the age of 12 weeks, three days after the saline, MPTP or LPS groups get subjected to the injections. In the case of the therapeutic approach, the purpose of the second testing is to determine whether a berry-enriched diet given after the MPTP and LPS injections impacts the animal behaviour.

• The third set of testing (marked blue on the scheme) for preventive approach will be conducted within the four consecutive days starting on day 3 and finishing on day 7 after the MPTP injection in the case of PD model. In the case of Neuroinflammation model the third set of testing will be conducted within the eight consecutive days starting on day 1 of LPS injections and finishing one day after the last LPS injection. On the testing days the animals will be injected with LPS in the morning, and behavioural tests will start at noon. The third testing will provide us with the information whether pre-treatment with berries can diminish behavioural changes induced by MPTP or LPS. In the case of therapeutic approach, the third set of behavioural testing will be done 6 weeks after the injections (18 weeks of age).

All above-mentioned behaviour tests will require training. The timescale for the training and testing is depicted bellow: PD model:


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Neuroinflammation model:

Moreover, from the moment of separation of the animals, each animal will get carboard tubes for play

and hiding, as well as nest building material in form of shredded paper. The nest building represents an

indicator of health and welfare in laboratory mice. Thus, observation of nest building behaviour provides

a refinement to health and well-being assessment on a day to day basis. Since both MPTP and LPS

are shown to disrupt the nest-building behaviour of mice, nest building will be scored throughout the

experiment. This will represent an additional behavioural parameter to determine whether polyphenols

are capable of lessening deficits in the nest building behaviour caused by MPTP or LPS.

All animals involved in the experiment will be daily handled by the same researchers that will give the

i.p injections and conduct the behavioural tests. This way the animals will get used to the researchers

and procedures they will undergo during the experiment, which will lessen the level of stress of the

animals. We will also use the modified restraint method during the substance application (Stuart and


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Robinson, 2010, Scientific Reports), meaning the animals will not be fully restraint in order to avoid

significant level of stress it causes.

Global (life-time experience) severity expected:

PD model – Moderate

LPS Model - Mild

DESENHO EXPERIMENTAL

5.2. Para cada um dos procedimentos que irão ser realizados a cada animal (ou grupo de animais), preencher a tabela em baixo, indicando e descrevendo cada item contido na mesma:

Título do procedimento: MPTP-induced Parkinson’s Disease (PD) model

Nº do procedimento: 1

Justificação/relevância para a realização do procedimento:

MPTP is a potent and selective nigrostriatal dopaminergic neurotoxin that in mice produces many of the neuropathological features of idiopathic Parkinson’s disease in humans. MPTP produces nigrostriatal dopaminergic degeneration and locomotor impairment.

Espécie animal: Laboratory mouse, Mus musculus, C57BL/6J

10-weeks-old, males and females

Nº de animais a utilizar: Pilot study: 24 mice (12 males and 12 females) PD model experiment: 208 mice (96 males and 112 females) Total of animals: 232 mice (108 males and 124 females)

Técnica utilizada: PD will be induced by intraperitoneal administration of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP, single injection, 40 mg/kg).

Duração do procedimento: 1 minute per animal for the injection; A single dose of the MPTP will be used for the development of neurological condition (PD). In the preventive approach the procedure will be done at day 46th of the experiment, while in the therapeutic approach the procedure will be done at 4th day of the experiment.

Frequência do procedimento: Once.

Anestesia associada: No.

Analgesia associada?: No. The analgesia will not be used because of the absence of pain stimuli.

Estabelecimento de limites críticos:

Locomotor dysfunction will be assessed by measuring the time of performance of C57BL/6J mice in several behavior tests. Severe locomotor dysfunction, as severe forelimb, hindlimb incoordination and/or locomotor disabilities of C57BL/6J mice will constitute end-point criteria to sacrifice the animals in question. In addition, C57BL/6J mice exhibiting general ill-health signs, e.g. normal/labored breathing, rough hair coat, hunched posture, lethargy, subdued behavior, lack of movement, prostration, dehydration, weight


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loss ≥ 20% and body condition score (BCS)≤ 2, exudates around eyes and/or nose, bleeding from any orifice, skin lesions or any other condition limiting or causing difficulty to eat or drink, or causing moderate discomfort, pain or distress will also be immediately euthanized.

Efeitos adversos do procedimento no bem-estar animal:

Acute dosage of MPTP will be induced to assess the symptoms associated with this neurodegenerative condition. Adverse effects might occur in C57BL/6J mice and include sliding, forelimb-hindlimbs incoordination, and movement disability. In this case, these symptoms will be registered and discussed with the veterinary of the animal facility, expert in recognizing signs of morbidity.

Classificação de severidade do procedimento proposta (1):

As above, the aim is to avoid severe suffering. During the experiment, the level of severity will be limited to Moderate. At the end of the experiment or if the severity of the animal condition is determined to cause suffering beyond what could be expected under normal circumstances, this will be used as a criterion for experiment termination and mice will be euthanized. In this case, this will serve to retrospectively reassess the level of severity of the disease induced.

Destino dos animais no final do procedimento:

After this experimental protocol mice will be behaviorally tested. After this, mice will be deeply anesthetized, the blood will be collected directly from the heart, animals will be perfused, and organs will be collected post-mortem for further analysis.

Se o destino dos animais for a occisão, refira qual o método de occisão a utilizar (2):

Euthanasia by over-dose of i.p. administered ketamine/xylazine anesthesia in the dose of 2.5ml/kg.

Título do procedimento: Lipopolysaccharide (LPS) neuroinflammation model



One of the most common and easy ways to induce neuroinflammation is through chronic systemic inflammation. Lipopolysaccharide (LPS) is a potent substance described to be present in circulation upon bacterial infection and can lead in chronic inflammation leading to the systemic release of inflammatory cytokines capable of inducing neuroinflammation.

Espécie animal: Mus musculus, strain C57BL/6J. 10 weeks of age. Male and female mice.

Nº de animais a utilizar: Pilot study: 16 mice (8 males and 8 females)

Neuroinflammation study: 192 (12 males + 12 females per group)

Total number of animals (Pilot + Study): 208 mice (104 males + 104

females)

Técnica utilizada: Intraperitoneal injection of LPS


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Duração do procedimento: 1/2 minutes per animal for the single injection; The injections will be

applied for 7 consecutive days for the development of inflammatory

condition. In the preventive approach the procedure will be done from

day 46th to day 52nd of the experiment, and for the therapeutic approach

from the day 7th until the day 13th from the beginning of the experiment.

Frequência do procedimento: One injection per day, for 7 consecutive days to induce one-time

neuroinflammation.

Anestesia associada?: No.

Analgesia associada?: No. The analgesia will not be used because of the absence of pain

stimuli.


No major adverse effects are expected upon this procedure and therefore no specific post-procedure care measures would need to be taken afterwards. Mice displaying overt clinical signs, e.g. normal/labored breathing, rough hair coat, hunched posture, lethargy, subdued behavior, lack of movement, prostration, dehydration, weight loss >/= 20% /BCS </= 2, exudates around eyes and/or nose, bleeding from any orifice, skin lesions or any other condition limiting or causing difficulty to eat or drink, or causing moderate discomfort, pain or distress will be immediately euthanized.


Chronic doses of LPS administration has no impact on mice survival for the doses used in this study. Nevertheless, in the first 2 hours after administration decreased locomotion, hunched posture and lack of appetite might be observed. In any case, mice seem to recover from this effect quickly.


During the experiment, the level of severity will be limited to mild, i.e. no significant impairment of the well-being or general condition of the animals treated are expected to be observed.


After this experimental protocol mice will be tested for behavior. In the last day of the experiment, they will be deeply anesthetized, the blood will be collected directly from the heart, animals will be perfused, and organs will be collected post-mortem for further analysis.


Euthanasia by over-dose of i.p. administered ketamine/xylazine

anesthesia in the dose of 2.5ml/kg.

Título do procedimento: Dietary supplementation in PD and Neuroinflammation model



The polyphenols have been shown to act as a potent anti-inflammatory and neuroprotective agents. The aim of this procedure is to estimate the potential of dietary polyphenols to attenuate pathological changes induced by MPTP and LPS. The procedure itself is not invasive, since


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it represents dietary supplementation, and not reduction of either food amount or main nutrients.

Espécie animal: Mus musculus, strain C57BL/6J. 10 weeks of age. Male and female mice.

Nº de animais a utilizar: In both experimental groups (PD and Neuroinflammation group) the

groups: 2,4,6 and 8 will receive berries supplementation. Including a

pilot study, the total of 220 animals for both PD and Neuroinflammation

model will be fed with berry-enriched diet.

Técnica utilizada: The dietary supplementation represents the main part of the experimental setup. The normal diet will be enriched with a mixture of berries in a way not to alter the nutritional profile of the standard diet (2 g/day of lyophilized puree of berries in the standard mice chow). Both, mice fed with standard diet, as well as mice in the enriched diet will be pair fed throughout the experiment. Constant monitoring of the diet will be made in order to determine whether feeding habits and amount of food eaten per day differs between the control group and mice on berries-enriched diet.

Duração do procedimento: 7 weeks

Frequência do procedimento: Animals will be on the supplemented-diet regimen constantly for 7

weeks (during entire experiment)

Anestesia associada?: No

Analgesia associada?: No


Mice will be weighted weekly. Loss of 20% or more of body weight will lead to euthanasia.


No adverse aspects are expected.


Below threshold


After this experimental protocol mice will be behaviorally tested, anesthetized. After this, mice will be deeply anaesthetised, the blood will be collected directly from the heart, animals will be perfused, and organs will be collected post mortem for further analysis.


Euthanasia by over-dose of i.p. administered ketamine/xylazine

anesthesia in the dose of 2.5ml/kg.

Título do procedimento: Intracardiac blood collection under anaesthesia and whole-body perfusion



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This procedure represents the end point of experiment and will serve for blood and tissue collection for further analysis.

Espécie animal: Laboratory mouse, Mus musculus, C57BL/6J, males and females

Nº de animais a utilizar: Total of animals: 440 mice (212 males and 228 females)

Técnica utilizada: Animals will be deeply anesthetized, the chest of the animals will be surgically opened, and the blood will be taken directly from the heart using syringe and the needle. After that, the whole-body perfusion will be done with appropriate volume of ice-cold PBS to wash the blood from blood vessels in order to obtain blood-free tissues for further analysis.

Duração do procedimento: Total of 30 minutes per animal will be needed for blood collection, whole-body perfusion and sampling.

Frequência do procedimento: Once

Anestesia associada: Ketamine/Xylazine (1ml/kg) + Isoflurane if needed

Analgesia associada?: No.


N/A


N/A


Non-recovery


N/A


N/A

(1) A classificação de severidade deverá ter em conta as categorias (Não recuperação, Ligeiro, Moderado e Severo) e

os critérios de atribuição dispostos no Anexo IV, do Decreto-Lei nº 113/2013, de 7 de Agosto. (2) A occisão dos animais deverá ser feita utilizando um método adequado referido no Anexo II do Decreto-Lei nº

113/2013, de 7 de Agosto. No caso de ser previsto outro método de occisão diferente, qual a justificação científica para isso ocorrer e que provas científicas tem que permitam concluir que o método proposto é, pelo menos, tão humano quanto os contidos no referido anexo.

Procedimentos cirúrgicos. Quando forem realizados procedimentos cirúrgicos deverão também ser incluídas informações sobre os seguintes assuntos:

• Se a cirurgia implicará recobro dos animais ou não;

• Cuidados/procedimentos pré-cirúrgicos a realizar aos animais;

• Descrição dos procedimentos cirúrgicos, incluindo uma descrição sobre o local anatómico de acesso;

• Cuidados pós-cirúrgicos a realizar aos animais;

• Medicação intra-operatória (que substância, dose, frequência e via de administração)

N/A


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Quando o procedimento for a administração de uma substância, refira de que substância se trata, veículo (se necessário) e em que dose (mg/kg de peso vivo), volume, frequência e via será feita a sua administração.

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) - 40 mg/Kg body weight (single dose) by intraperitoneal injection. Lipopolysaccharide (LPS) – 0.250 mg/kg body weight in saline totaling 100uL via intraperitoneal injection for a period of seven consecutive days.

Quando o procedimento for a administração de um produto biológico/agente infeccioso, refira de que produto/espécie/estirpe se trata e em que dose, frequência e local e via será feita a sua administração.

N/A

Quando o procedimento for a colheita de uma amostra biológica (incluindo para genotipagem), refira de que tecido ou fluído se trata e o volume, frequência, local e via de colheita que serão realizadas.

Faeces – Periodic sampling (see 5.1- Sequence of Events) and at the end of the experiment (1 to 6 pellets per collection). Total number of collections to be defined. Fecal pellets will be collected directly from the animal during the every-day handling. Urine – Periodic sampling (see 5.1- Sequence of Events) and at the end of the experiment (50 to 150 uL per collection). Total number of collections to be defined. Blood – Collected throughout the experimental design (see 5.1- Sequence of Events). Crucial blood collection will be needed to evaluation the identification and quantification of dietary derived microbiota metabolites, and quantification by ELISA of inflammatory before and after the use of the inflammatory triggers. A drop of blood from the mice will be collected (with a minimal interval of 1 week for recovery). At the end of the experimental design upon termination collection of the total volume of blood will be performed by cardiac puncture. Brain (ex-vivo)– collection of the complete organ by the end of the experiment, after euthanasia. Single brain will be used for all necessary molecular analyses (PCR, ELISA, Western blot, IHC) thus the number of animals per group will be reduced without losing the number of samples required for proper statistical analysis. Moreover, every single data obtained by any molecular method used in the study, will be easily linked to individual behavior of the animal to which these molecular data belong. This way, we will get more accurate data, while at the same time lessening the number of animals necessary to conduct the study.


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SECÇÃO 6: RESUMO NÃO TÉCNICO DO PROJETO De notar que, de acordo com a alínea b), do artigo 43º do Decreto-Lei nº 113/2013, de 7 de Agosto, no pedido de autorização de um projeto deverá ser incluído um resumo não técnico do projeto, e considerou-se de utilidade que o mesmo faça parte da presente secção. O resumo deverá ser redigido claramente usando termos não técnicos, sempre que possível, por forma a poder ser facilmente entendido por um leigo. Para além disso, de acordo com o artigo 49º do Decreto-Lei, o projeto deverá ser explicado salvaguardando sempre a propriedade intelectual e as informações confidenciais que identifiquem quer as pessoas envolvidas no projeto quer o estabelecimento onde os animais serão alojados. O resumo não técnico será posteriormente publicitado no sítio da Internet da DGAV.

Modelo de Resumo não técnico de projeto experimental

Título do projeto LIMBo

Duração do projeto 5 anos

Palavras-chave (máx. 5) Neurodegeneração, Neuroinflamação, Polifenóis, Doença de Parkinson

Fim/objetivo do projeto

(de acordo com Artº 5º) (1)

Investigação fundamental Sim

Investigação translacional ou aplicada

Sim

Uso regulamentar e produção de rotina

Não

Proteção do ambiente natural no interesse da saúde ou do bem-estar do homem ou dos animais

Não

Investigação destinada à conservação das espécies;

Não

Ensino superior ou formação para aquisição, manutenção ou melhoria das qualificações profissionais

Sim

Inquéritos no domínio da medicina legal

Não

Manutenção de colónias de animais geneticamente alterados (2)

Não

Descreva os Objetivos do Projeto (ex., incógnitas científicas ou necessidades científicas/clínicas a serem abordadas, etc)

O projeto tem por objetivo compreender o efeito de compostos fenólicos, presentes nos pequenos frutos que fazem parte da dieta normal do ser humano, na saúde do cérebro, bem como o seu efeito no contexto de doença, tanto em processos inflamatórios genéricos como em casos mais específicos como a doença de Parkinson.

Quais são os potenciais benefícios que possam derivar deste projeto (como poderia a ciência avançar ou

Para alcançar os objetivos acima mencionados, pretendemos realizar uma intervenção nutricional para estudar o efeito de uma dieta rica em (poli)fenóis em


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os seres humanos ou outros animais poderiam beneficiar com o projeto)?

modelos de neuroinflamação e doença de Parkinson em ratinho. Concretamente, avaliaremos a capacidade dos (poli)fenóis, presentes nos pequenos frutos, para mitigar a neuroinflamação; construir uma visão integrada desses efeitos incluindo também a contribuição da microbiota intestinal; analisar o resultado da intervenção nutricional em ratinhos sintomáticos da doença de Parkinson. As repostas que serão obtidas neste projeto podem dar indicações de um ou vários compostos fenólicos os quais podem ser utilizados posteriormente pela indústria farmacêutica no desenvolvimento de medicamentos que permitam minorar/combater os sintomas provocados por doenças neurodegenerativas como é o caso, por exemplo, da doença de Parkinson, a qual é o foco deste trabalho.

Que espécies animais e números aproximados de animais serão utilizados?

Murganho/Ratinho - Mus musculus, estirpe C57BL/6J, variante selvagem. Serão usados um total de 440 animais durante os 5 anos de duração o projeto, divididos por 4 ensaios que incluem 2 modelos experimentais das doenças (doença de Parkinson e neuroinflamação) e contemplando tanto uma abordagem preventiva como uma abordagem terapêutica.

No contexto do que é proposto fazer-se aos animais, quais são os efeitos adversos esperados e o grau provável/esperado de severidade? O que acontecerá aos animais no final da realização do projeto?

Todos os procedimentos e modelos utilizados têm em perspetiva evitar níveis de severidade elevados. Os modelos de doença utilizados neste projeto estão desenhados para induzir um nível ligeiro a moderado de severidade. Os animais aos quais foi induzida a doença neurológica deverão apresentar sintomas semelhantes aos da doença de Parkinson, sendo expectável um nível de severidade moderado. Os animais aos quais for induzida neuro-inflamação, deverão apresentar sintomas de severidade ligeira. Os animais serão eutanasiados sempre que os níveis de severidade aumentarem além do grau esperado.

Aplicação dos 3Rs

1.Replacement (Substituição)

Refira a razão por que precisa utilizar

animais e por que não pode usar

alternativas não-animais

Após vários testes in vitro e in silico realizados pelo grupo, é necessário utilizar modelos animais de modo a validar os resultados obtidos anteriormente num modelo muito mais complexo e biologicamente mais relevante, e que nos permita extrapolar nossas descobertas para o ser humano. Serão feitos esforços substanciais para manter no mínimo o número de ratinhos necessários para atingir nossos objetivos. Para minimizar e controlar o sofrimento, as condições gerais de saúde e bem-estar animal serão monitorizadas diariamente.

2.Reduction (Redução) O cálculo do número de animais a usar neste projeto teve em conta (1) a variabilidade estimada entre as respostas individuais dos animais a cada estímulo experimental


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Explique como garantirá que serão utilizados os números mínimos de animais

(baseada em estudos preliminares); (2) o uso de testes estatísticos com intervalo de confiança e teste de significância ajustados ao tipo de dados a obter, por forma a garantir que será utilizado o número mínimo de animais necessário para a análise estatística poder obter diferenças entre grupos que sejam estatisticamente significativas. A partir de cada animal vão ser ainda efetuados diversos estudos comportamentais e recolhas de material biológico para usar em estudos histológicos, moleculares e de patologia clínica, maximizando assim a diversidade de dados obtidos a partir de cada unidade experimental e evitando a repetição de experiências. A estirpe de animais a usar é sempre a mesma, C57BL/6, para minimizar a variação de resposta individual aos estímulos.

3.Refinement (Refinamento) Explique a escolha da(s) espécie e a razão porque o modelo(s) animal que serão usados são os mais refinados, tendo em conta os objetivos. Explique as medidas gerais que serão tomadas para minimizar os custos de bem-estar (danos) aos animais.

O modelo de indução de doença de Parkinson a usar neste projeto é dos mais comuns na comunidade científica da área de estudo, permitindo uma ampla comparação inter-estudos. Este modelo implica a indução da morte de neurónios dopaminérgicos através da administração do agente químico MPTP, efeito este apenas conseguido em primatas e ratinho. Deste modo, o ratinho é a escolha mais apropriada para este projeto. O modelo de neuroinflamação utilizando LPS, em especial na estirpe neste estudo, é também um dos modelos mais utilizados pela comunidade, devido às suas características comportamentais que permitem obter uma resposta translacional para humanos. Este modelo reproduz a inflamação sistémica e no cérebro, demonstrando como uma resposta intensa do sistema imune pode conduzir à morte neuronal, alterações comportamentais e marcadores de doenças neurodegenerativas que podem observados de forma criteriosa em ratinhos. Todos os procedimentos e metodologia de indução de doença aqui utilizados foram adaptados para garantir um nível baixo de severidade, e qualquer aumento inesperado de severidade para grau moderado/severo determinará a eutanásia do animal. Durante o decorrer da experiência os animais serão monitorizados diariamente com vista à deteção de sinais associados ao agravamento do estado clínico do animal, p.ex. dificuldades respiratórias, alterações no aspeto/brilho da pelagem, posturas corporais indicativas de dor e desconforto, letargia, passividade e falta de resposta a estímulos, prostração, sinais de desidratação, lesões cutâneas, diarreia crónica, hemorragias, perda acentuada de peso (≥20%) ou qualquer outra situação que condicione ou


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limite a ingestão de comida e ou água; e serão imediatamente eutanasiados.

Para uso oficial

O projeto será submetido a avaliação retrospetiva?

Sim Não Observações

Notas: (1) Elimine Sim ou Não, conforme apropriado. (2) Com esta opção deverá ser escolhido, pelo menos, um fim/objetivo adicional.

formulÁrio para pedido de autorizaÇÃo de projeto de … · 2020. 12. 4. · largo da academia...

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