faculdade de ciÊncias biolÓgicas e da saÚde … · jesus miranda, meu muito obrigada ... bom...

FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

Programa de Pós-Graduação Strictu-Sensu em Educação Física

TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO E RESISTIDO ASSOCIADO À

ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA

PREVIAMENTE AO INFARTO DO MIOCÁRDIO EM RATOS: EFEITOS NA

FUNÇÃO CARDÍACA, AUTONÔMICA E PERFIL INFLAMATÓRIO

CATARINA DE ANDRADE BARBOZA

São Paulo – SP

Junho/2017

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CATARINA DE ANDRADE BARBOZA

TREINAMENTO FÍSICO AERÓBICO E RESISTIDO ASSOCIADO À

ESTIMULAÇÃO COLINÉRGICA POR BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA

PREVIAMENTE AO INFARTO DO MIOCÁRDIO EM RATOS: EFEITOS NA

FUNÇÃO CARDÍACA, AUTONÔMICA E PERFIL INFLAMATÓRIO

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação

em Educação Física, área de concentração:

escola, esporte, atividade física e saúde, da

Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde,

como requisito para obtenção do Título de

Doutor em Educação Física.

Orientador: Prof. Dr. Érico Chagas Caperuto

Co- Orientador: Prof. Dr. Bruno Rodrigues

São Paulo

2017

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“A maioria não fracassa.

A maioria desiste!”

“Não tente ser uma pessoa só de sucesso. Em vez disso, seja uma pessoa de valor”

Albert Einstein

“O melhor guerreiro não é aquele que sempre vence.

E sim aquele que volta para guerra sem medo.”

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DEDICATÓRIA

Dedico essa tese aos meus pais João (em memória) e Francisca, meus exemplos de

vida. Que me mostraram que trabalho, dedicação, honestidade e viagens, nos ensina,

enobrecem, nos realiza e, portanto nos faz feliz!

Obrigada por cada dia, por cada mimo, por cada sonho realizado e por cada momento

inesquecível. Tenho certeza, que meu pai, onde estiver, está feliz com a minha

continuidade.

E a minha mãe, eu sendo filha única, temos uma a outra. E como dupla, sempre me

apoiou, financiou, incentivou e compreendeu a importância e as dificuldades desse

período. Muito obrigada, Mãe!!!

A minha família, que justamente nesse período do doutorado teve que ser guerreira em

superar a dor da perda de pessoas especiais e importantes, como meu primo Xande e

minha avó Iracema.

Ao meu afilhado, o super Arthur, que resgatou em mim a criança que estava

adormecida.

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Bruno Rodrigues, meu primeiro orientador, agradeço por seu

expertise, uma mente alimentada pelo conhecimento, que reflete em suas produções e

suas conquistas profissionais. Obrigada pelo trabalho conjunto desde o mestrado.

Ao Prof. Dr. Érico Chagas Caperuto, agradeço profundamente por ter aceito me

orientar no final deste processo, em que seu perfil de encorajar os alunos foi de extrema

importância para mim. Graças a sua confiança e seus conselhos rompi barreiras, encarei

novos desafios e com isso espero seguir caminhando rumo a novas conquistas. Obrigada

pela parceria e pelos desafios que conseguimos transpor e pela conclusão deste ciclo.

Aos amigos do laboratório, Leandro Yanase, Nicole Carrozzi, Luiza Melanie,

Juliana Cristina, Gabriel Honorato o meu muito obrigada. Encerro essa tese graças à

parceria e o companheirismo que tivemos ao longo dos últimos seis anos, nos quais

trabalhamos juntos. E quem convive demais, briga, faz as pazes, chora, se diverte e hoje

podemos comemorar juntos. O grupo foi desfeito, mas cada passo dado com este trabalho,

eu o fiz por mim e por vocês. Que a minha realização, seja a semente em vocês!

Aos amigos de outros laboratórios, Nathalia Bernardes e Danielle Dias meu

sinceros agradecimentos por terem sido as primeiras a me mostrar que na pesquisa

científica a parceria faz o trabalho. E que caráter, generosidade e esforços não se mede e

nem muda. A Christiane Malfitano, obrigada por me mostrar que competência está

acima da política. E que é preferível se juntar ao loucos, do que aos falsos. Jacqueline

Machi, o que dizer de alguém que evoluiu e se transformou em referência, em amiga e

em parceira nos desafios profissionais?! Obrigada por todos os esforços para me

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incentivar e viabilizar o intercambio científico que fiz na reta final. E que venham as

próximas viagens.

Agradeço imensamente aos colaboradores do Lab. de Hipertensão do InCor,

Leandrão, Maikon, Katia Scapini, Paula Cruz, Oscar, Pamela, Dudu, Isabel, Dr.

Paulo e em especial a Dra Maria Claudia Irigoyen e Dra Katia de Angelis que foram

fundamentais para execução deste trabalho. Muito obrigada pela colaboração e

comprometimento.

Ao colaborador e espero que novo parceiro, o farmacêutico Prof. Dr André

Fukushima cuja competência e conhecimento foi de extrema valia na facilitação e

entendimento do fármaco utilizado neste trabalho. Obrigada pela disponibilidade de

sempre e pela enorme contribuição na qualificação.

A Coordenadora do programa de pós graduação, Profa. Dra. Maria Luiza de

Jesus Miranda, meu muito obrigada pelo apoio, pelas intervenções e pelas cartas de

referência que me possibilitaram experiências enriquecedoras.

A Larissa, que no momento delicado, com sua experiência e realidade latente me

incentivou, encorajou, me mostrou que fazer o que gosta, com humildade, bom caráter e

dedicação fará a vida ser mais colorida, o que inclui momentos cinzas.

Aos meus amigos espalhados pelo mundo, Juliana Nicolau, Miriam, Leonor,

Grupo Brunetti e alunos, que perto ou longe, os que entraram e aos que se foram, muito

obrigada por nunca terem me deixado sozinha. Nos momentos mais delicados e nos mais

festivos, por WhatsApp ou nos bares, sempre tive vocês ao meu redor.

A FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio

financeiro para a realização deste trabalho, sob número do processo 2014/06669-2.

8

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... 10

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... 11

RESUMO ....................................................................................................................... 14

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 18

1.1. Infarto do Miocárdio ............................................................................................ 19

1.2. Infarto do Miocárdio e Disfunção Autonômica ................................................... 20

1.3. Disfunção Autonômica e Resposta Inflamatória ................................................. 21

1.4. Treinamento Físico Aeróbico e Resistido ............................................................ 24

1.5. Estimulação Colinérgica por Brometo de Piridostigmina ................................... 28

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 31

2.1. Geral ..................................................................................................................... 31

2.2. Específicos ........................................................................................................... 31

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 32

3.1. Animais e Grupos ................................................................................................ 32

3.2. Sequência Experimental ...................................................................................... 33

3.3. Procedimentos Experimentais .............................................................................. 33

3.3.1. Testes de Esforço, Carga Máxima e Treinamento Físico .............................. 33

3.3.2. Tratamento com Brometo de Piridostigmina ................................................ 34

3.3.3. Infarto do Miocárdio ..................................................................................... 35

3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas ....................................................................... 35

3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial (PA) ............................................ 40

3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo ................................................. 41

3.3.7. Tônus Vagal e Tônus Simpático ................................................................... 41

3.3.8. Avaliação da Modulação Autonômica .......................................................... 41

3.3.9. Atividade de Acetilcolinesterase ................................................................... 42

3.3.10. Concentração de Citocinas .......................................................................... 43

3.3.11. Análise Estatística ....................................................................................... 43

4. RESULTADOS ......................................................................................................... 44

4.1 Peso Corporal ........................................................................................................ 44

4.2 Capacidade Física ................................................................................................. 45

4.3. Avaliações Ecocardiográficas .............................................................................. 47

4.3.1. Variáveis Morfométricas ............................................................................... 47

4.3.2. Função Ventricular ........................................................................................ 51

4.5. Variáveis Autonômicas Cardiovasculares ........................................................... 56

9

4.6. Concentração de citocinas inflamatórias ............................................................. 59

5. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 72

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 83

7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 84

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Peso corporal. ................................................................................................. 44

Figura 2. Teste de esforço em esteira rolante. ............................................................... 45

Figura 3. Teste de carga máxima ................................................................................... 46

Figura 4. Área de infarto ............................................................................................... 48

Figura 5. Massa do ventrículo esquerdo. ....................................................................... 49

Figura 6. Diâmetro final do ventrículo esquerdo em diástole. ...................................... 50

Figura 7. Espessura relativa da parede. ......................................................................... 51

Figura 8. Fração de ejeção do ventrículo esquerdo. ...................................................... 52

Figura 9. Relação entre as ondas e e a ........................................................................... 53

Figura 10. Índice de desempenho miocárdico .............................................................. 54

Figura 11. Tônus simpático (ts), tônus vagal (tv) .......................................................... 56

Figura 12. Concentração de IFN-γ – interferon gama no ventrículo esquerdo ............. 60

Figura 13. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no ventrículo esquerdo ................... 61

Figura 14. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no ventrículo esquerdo. ........ 62

Figura 15. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no ventrículo

esquerdo .................................................................................................................. 63

Figura 16. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no ventrículo esquerdo ............... 64

Figura 17. Concentração de IFN-γ – interferon gama no sóleo. ................................... 65

Figura 18. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no sóleo. ......................................... 66

Figura 19. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no sóleo. ................................ 66

Figura 20. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no sóleo ............... 67

Figura 21. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no sóleo ...................................... 68

Figura 22. Relação il-10/ TNF-α no ventrículo esquerdo (ve) e no sóleo i. ................. 69

Figura 23. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no soro. .......................................... 70

Figura 24. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no soro ....................................... 71

11

LISTA DE ABREVIATURAS

C Grupo controle

SI Grupo sedentário + infarto

SPI Grupo Sedentário + PIR + infarto

TAI Grupo Treinado aeróbico + infarto

TAPI Grupo Treinado aeróbico + PIR + infarto

TRI Grupo Treinado resistido + infarto

TRPI Grupo Treinado resistido + PIR + infarto

DCV Doenças cardiovasculares

IM Infarto do miocárdio

VE Ventrículo esquerdo

FC Frequência cardíaca

PA Pressão arterial

PAS Pressão arterial sistólica

PAD Pressão arterial distólica

PAM Pressão arterial média

PIR Brometo de Piridostigmina

PDF Pressão diastólica final

12

+dP/dt Derivada de contração

VFC Variabilidade da frequência cardíaca

VAR-IP Variância do intervalo de pulso

AF Alta frequência

BF Baixa frequência

AF/BF Balanço simpáto-vagal

DP-IP Desvio padrão de intervalo de pulso

RMSSD

Raiz quadrada da média dos quadrados das

diferenças dos intervalos R-R normais e

sucessivos

TF Treinamento físico

SERCA2 Ca²+ ATPase do retículo sarcoplasmático

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VO2máx Consumo máximo de oxigênio

DDVE Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo

DSVE Diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo

PPDIA Espessura diastólica da parede posterior

MVE Massa do ventrículo esquerdo

ERP Espessura relativa da parede

13

FE Fração de ejeção

VEC Velocidade de encurtamento circunferencial

Relação E/A Razão da velocidade da onda E e da onda A

TDE Tempo de desaceleração da onda E

TRIV Tempo de relaxamento isivolumétrico

IDM Índice de desempenho miocárdio

14

RESUMO

No contexto das doenças cardiovasculares (DCV), a alta incidência do infarto do

miocárdio (IM) consiste em um enorme problema de saúde pública, cujas complicações,

como redução funcional do miocárdio, associado a disfunção autonômica e alterações no

sistema imunológico elevam os índices de mortalidade em todo o mundo. Assim,

diferentes estratégias terapêuticas tem sido estudadas afim de prevenir e/ou atenuar tais

disfunções. Portanto, com intuito de obter redução na morbidade e mortalidade, o

treinamento físico (TF), aeróbio e mais recentemente, o resistido, tem sido recomendado

na prevenção/manejo das DCV por apresentar benefícios frente a diferentes fatores de

risco. Por outro lado, a administração de brometo de piridostigmina (PIR), um inibidor

da acetilcolinesterase, tem demonstrado potencial benéfico em diferentes patologias,

dentre elas a insuficiência cardíaca, promovendo melhora na função cardíaca e

autonômica. Nesse sentido, o objetivo principal do presente estudo foi avaliar os efeitos

da estimulação colinérgica prolongada com o PIR, na função ventricular e autonômica,

bem como o impacto no perfil inflamatório associado ao TF aeróbico ou resistido prévio

ao IM. Para tal, foram utilizados ratos Wistar macho, dividido em (n=9, por grupo):

controle (C), sedentário + IM (SI), sedentário + PIR + infarto (SPI), treinamento aeróbio

+ IM (TAI), treinamento aeróbio + PIR + infarto (TAPI), treinamento resistido + IM

(TRI), treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI), submetidos a 60 dias de TF aeróbico

ou resistido associados ao tratamento farmacológico com PIR (0,14 mg/ml/dia). Como

resultados, houve melhora adicional na capacidade física dos grupos treinados associados

com tratamento. A área de IM foi menor nos animais tratados com PIR e de forma

semelhante, a fração de ejeção foi aumentada nos grupos tratados com PIR. A

sensibilidade barorreflexa também estava melhorada nos grupos treinados e tratados,

tendo sido mais responsivo ao treinamento aeróbico. O que também foi observado no

15

tônus vagal, aumentada nos grupos tratados isoladamente. Já no tônus simpático, tanto o

tratamento e o TF, isoladamente, quanto a associação, foram eficazes em prevenir o

aumento dessa variável. No entanto, uma redução adicional do tônus simpático foi

evidenciada nos grupos associação. Assim, tais dados sugerem que o efeito preventivo da

estimulação colinérgica com PIR isoladamente foi evidenciado na redução das alterações

cardíacas, melhora da função ventricular e das respostas imunológicas. Assim como a

associação entre os tipos de TF e o tratamento com PIR se mostrou eficaz em prevenir a

redução da capacidade física de acordo com as especificidade do treinamento, e do tônus.

Dessa forma, a associação entre tais estratégias terapêuticas apresentam impacto

relevante pelos benefícios do treinamento físico aeróbio/resistido na cardioproteção aos

efeitos deletérios da isquemia miocárdica.

Palavras-chave: Treinamento físico prévio; Brometo de piridostigmina; Infarto do

miocárdio.

16

ABSTRACT

In the context of cardiovascular diseases (CVD), the high incidence of myocardial

infarction (MI) is a huge public health problem, whose complications such as functional

reduction of the myocardium associated with autonomic dysfunction and alterations in

the inflammatory profile raise the mortality worldwide. Thus, different therapeutic

strategies have been studied in order to prevent and / or mitigate such dysfunctions.

Therefore, in order to obtain a reduction in morbidity and mortality, exercise training

(ET), aerobic and, more recently, resistance training, has been recommended in the

prevention / management of CVD because it presents benefits against different risk

factors. On the other hand, the administration of pyridostigmine bromide (PYR), an

acetylcholinesterase inhibitor, has demonstrated beneficial potential in different

pathologies, among them heart failure, promoting improvement in cardiac and autonomic

function. In this sense, the main goal of the present study was to evaluate the possible

effects of prolonged cholinergic stimulation with the PYR, in the ventricular and

autonomic function, as well as the impact on the inflammatory profile associated with the

aerobic or resistance training prior to MI. Male Wistar rats were divided in (n = 9, per

group): control (C), sedentary + MI (SI), sedentary + PYR + infarcted (SPI), aerobic

training + infarcted (TAI), aerobic training + PYR+ infarcted (TAPI), resistance

+infarcted (TRI), resistance training + PYR + infarcted (TRPI), submitted to 60 days of

aerobic or resistance training combined with pharmacological treatment with PYR (0.14

mg / ml / day). As results, there was an additional improvement in the physical capacity

of the trained groups associated with treatment. The MI area was smaller in the PYR

treated animals and similarly, the ejection fraction was increased in the PYR treated

groups. Baroreflex sensitivity was also improved in trained and treated groups, and was

17

more responsive to aerobic training. This was also observed in the vagal tonus, increased

in the groups treated alone. In the sympathetic tone, both the treatment and the ET, alone,

as well as the combination, were effective in preventing the increase of this variable.

However, an additional reduction of sympathetic tone was evidenced in the combined

groups. Thus, such data suggest that the preventive effect of cholinergic stimulation with

PYR alone was evidenced in the reduction of cardiac alterations and improvement of

ventricular function. As well as the combined between ET types and PYR treatment has

been shown to be effective in preventing physical capacity reduction according to training

specificity and tone. Thus, the combined between such therapeutic strategies has a

relevant impact by the benefits of aerobic / resistance training in cardioprotection to the

deleterious effects of myocardial ischemia.

Key words: Prior exercise training; Pyridostigmine bromide; Myocardial infarction.

INTRODUÇÃO

18

1. INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares (DCV) são as principais causas de morbidade

e contribuem significativamente para os custos elevados em saúde pública, sendo

uma das principais causas de mortalidade em todo mundo (1). O crescente número

de estudos na área da cardiologia tem como metas a identificação, a prevenção e

o controle, tanto dos fatores de risco, como dos efeitos secundários associados as

DCV que desencadeiam e aumentam a incidência da mortalidade.

Dentre as DCV, o infarto do miocárdio (IM) é uma das mais prevalente e

com o maior índice de mortalidade. Nos Estados Unidos estima-se que a cada 44

segundos um indivíduo sofra um IM e, cerca de 49% das mortes por DCV são

atribuídas ao evento isquêmico cardíaco (1). No Brasil, segundo a Sociedade

Brasileira de Cardiologia (SBC), em 2015 foram registrados 346.896 óbitos por

DCV.

De acordo com a necropsia, 95% dos óbitos por IM apresentava no mínimo

uma artéria coronariana epicárdica principal com estreitamento luminal grave ou

oclusão total com placa aterosclerótica típica . Assim, o desenvolvimento da placa

aterosclerótica coronariana pode comprometer o fluxo coronariano, resultando em

isquemia miocárdica.

Ao longo dos anos e com a alta prevalência de IM alguns fatores de risco

foram identificados e associados a doença arterial coronariana (DAC). Com

características modificáveis estão a hipertensão arterial, o tabagismo,

dislipidemia, obesidade, diabetes e a inatividade física. (119).

INTRODUÇÃO

19

1.1. Fisiopatologia do Infarto do Miocárdio

O IM é uma doença isquêmica do coração, que leva a necrose da musculatura

miocárdica, devido ao desbalanço entre oferta e demanda, gerando uma deficiência de

fluxo sangüíneo e consequentemente a falta de suprimento de oxigênio para o miocárdio

(112).

A convergência comum da maioria dos fatores risco, podendo ser a primeira

manifestação da doença arterial coronariana (DAC) ou ocorrendo repetidamente em

pacientes com a doença estabelecida (2). O IM, em sua grande maioria, resulta de

aterosclerose das artérias coronárias, placas que causam o estreitamento luminal da árvore

coronariana, geralmente com trombose sobreposta. Ocorre então, agregação plaquetária

e depósito de fibrina, posteriormente culminando na formação do trombo agudo

evoluindo para o IM (3). Portanto, o IM é um processo dinâmico que não ocorre

instantaneamente, mas evolui progressivamente durante algumas horas.

Após a oclusão da coronária, os miócitos supridos por essa artéria perdem a

capacidade contrátil podendo apresentar áreas de dissincronismo, discinesia, hipocinesia

e acinesia. Por outro lado, o miocárdio não infartado apresenta hipercinesia como

resultado de mecanismos compensatórios agudos, como ativação do sistema nervoso

simpático e mecanismo de Frank-Starling (2-4). Adicionalmente, o IM inicia um processo

de remodelamento ventricular, o qual é caracterizado pela progressiva dilatação do

ventrículo esquerdo (VE), rearranjo da estrutura da parede ventricular e aumento da massa

muscular remanescente (5). O rearranjo ventricular após a isquemia miocárdica do

ventrículo esquerdo passa pela disfunção ventricular em cascata, caracterizada pela

aumento da pressão diastólica final, cujo o reflexo é a diminuição da contratilidade na

sístole e a redução do debito cardíaco. No entanto, estes mecanismos de compensação

INTRODUÇÃO

20

possuem uma capacidade limitada de sustentação da função cardíaca e, quando o tecido

contrátil remanescente deixa de manter a hemodinâmica em condições de normalidade, o

indivíduo evolui para insuficiência cardíaca (IC) (3).

Experimentalmente, a oclusão dos ramos da artéria coronária vem sendo

amplamente utilizada pelos pesquisadores no intuito de melhor compreender os efeitos

cardíacos, autonômicos e hemodinâmicos do IM (6-8). Nosso grupo vem se dedicando há

alguns anos no estudo das alterações induzidas pelo IM individualmente (9,10) ou

associado a diferentes fatores de risco, como a hipertensão arterial (11,12), a privação dos

hormônios ovarianos (13), a denervação sinoaórtica (14) e o diabetes (15-20). Além disso,

nesses trabalhos também testamos diferentes abordagens terapêuticas no manejo das

complicações advindas do IM, bem como na mortalidade dos animais estudados. Dentre

estas intervenções podemos destacar: o treinamento físico (10,13,19), a terapia com

células tronco, mesenquimais e da medula óssea, in situ (12) e endovenosamente (11),

bem como a terapia gênica com fator de crescimento vascular derivado do endotélio

(VEGF, in situ) (18).

1.2. Infarto do Miocárdio e Disfunção Autonômica

O desequilíbrio autonômico crônico entre simpático e parassimpático constitui um

elemento fundamental da fisiopatologia da IC após um evento isquêmico (21-23) e é

acompanhado por anormalidades no controle cardiorrespiratório reflexo, ou seja, prejuízo

do barorreflexo, maior ativação do ergorreflexo e quimiorreflexo (21,24,25). Nesse

sentido, o controle reflexo da circulação comandado pelos pressorreceptores tem sido

reconhecido como um importante preditor de risco após evento cardiovascular. O estudo

ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) forneceu

evidências clínicas do valor prognóstico da sensibilidade do barorreflexo e da

variabilidade da frequência cardíaca (VFC) na mortalidade após o IM, independente da

INTRODUÇÃO

21

fração de ejeção e de arritmias ventriculares (21). Além disso, Kleiger et al. (26),

estudando pacientes do - Multicenter Post Myocardial Infarction Program -, encontrou

risco relativo de mortalidade cinco vezes maior naqueles pacientes que apresentavam

reduzida VFC se comparados aos que apresentavam níveis aumentados dessa variável.

Paralelamente, dados experimentais também apontam para o prejuízo da função

autonômica em animais após a oclusão da artéria coronária. De fato, em nosso grupo

temos consistentemente evidenciado que, após o IM crônico, os animais apresentam

maior disfunção barorreflexa, redução da VFC total, da modulação parassimpática, bem

como aumento da modulação simpática em relação aos animais não infartados

(9,10,13,14,16,18-20,27).

O significado clínico e prognóstico do aumento da atividade simpática após um

evento isquêmico e, consequentemente, na IC já está claramente estabelecido (28), tanto

que o bloqueio beta adrenérgico tornou-se um elemento padrão na terapia desses

pacientes (29). Por outro lado, a redução do tônus parassimpático, embora já demonstrada

a mais de 40 anos (30), tem recebido menos atenção. Reduzido tônus parassimpático,

além do prejuízo do barorreflexo e da VFC são indicativos de mau prognóstico em

pacientes com IC e após um IM (21,31,32). Dessa forma, intervenções no sentido de

detectar, prevenir e/ou atenuar a disfunção autonômica cardiovascular, principalmente

associada à redução da atividade vagal, têm sido visto como importantes estratégias no

manejo das alterações provocadas pelo IM (21).

1.3. Disfunção Autonômica e Resposta Inflamatória

O processo inflamatório, concomitante a elaboração de citocinas são partes

integrantes da resposta a uma lesão tecidual e desempenha um papel particularmente ativo

após o IM. As citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator de necrose tumoral-alfa

INTRODUÇÃO

22

(TNF-α), interleucinas-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-10 (IL-10), são

liberadas logo após a lesão isquêmica aguda e podem regular a sobrevivência dos miócitos

ou apoptose, bem como desencadear uma resposta celular inflamatória adicional (33).

Cronicamente, as citocinas podem mediar a reparação e o remodelamento cardíaco,

ativando a formação de matriz de metaloproteinases e colágeno, além de regular as

integrinas, a angiogênese e a mobilização de células progenitoras (33). Após o aumento

inicial da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias na região infartada, seus níveis

normalmente começam a diminuir em direção a linha de base após uma semana de IM

(35). No entanto, segundo Ono et al. (35), se o tamanho do IM for grande, ou se houver

outros fatores de estresse em curso no miocárdio, a expressão gênica de citocinas pode

permanecer significativamente elevada na região não infartada, mesmo após 20 semanas

de IM. Além disso, os mesmos autores evidenciaram que os níveis de citocinas, como a

IL-1β, estão associados ao diâmetro diastólico do VE e a deposição de colágeno na área

infartada após 8 e 20 semanas da indução do IM.

Dessa forma, aguda e/ou cronicamente, a liberação de citocinas (pró-

inflamatórias) desfavoravelmente afeta a função do VE, exerce efeito inotrópico negativo

(36), induz anormalidades no metabolismo cardíaco e promove o remodelamento

miocárdico, conduzindo assim à IC (37,38). Adicionalmente, a ativação do sistema imune

promove o desenvolvimento de disfunção endotelial, atrofia e apoptose do músculo

esquelético na IC (39,40).

A origem da ativação imune após um evento isquêmico possui muitas linhas de

investigação e ainda é incerta. Existem ao menos cinco hipóteses que tratam dos

principais estímulos à elaboração da resposta inflamatória após um evento (41); porém,

uma delas, tem chamado atenção dos pesquisadores nos últimos anos. Essa hipótese

aponta para redução da participação parassimpática em sendo a principal mediadora da

INTRODUÇÃO

23

ativação da resposta inflamatória (41). Estudos conduzidos pelo grupo de Kevin J. Tracey

têm contribuído de forma importante para a hipótese de relação direta entre a ativação

parassimpática e resposta do sistema imunológico. Este grupo inicialmente descreveu que

a ativação do nervo vago (eletricamente ou por agonistas colinérgicos) reduz a resposta

inflamatória em modelos experimentais de sepse, posteriormente sendo postulada como

a teoria do "reflexo inflamatório".

Nesse sentido, o Sistema Nervoso Autónomo (SNA), caracterizado pelas duas vias

eferente: sistema nervo simpático e sistema nervoso parassimpático assume um papel

regulado da inflamação. Cuja a influência do sistema nervoso simpático apresenta efeito

pró-inflamatórios por promover a elevação de TNF pela estimulação de receptores α2-

adrenérgicos, e anti-inflamatório por promover a diminuição de TNF pelos receptores β2-

adrenérgicos. Enquanto o sistema nervo parassimpático, via nervo vago, é sensível aos

níveis aumentados de TNF e IL-1, respondendo com Acetilcolina (ACh) para a redução

do TNF sendo predominantemente anti-inflamatório, conforme ilustração 1.

Ilustração 1. Mecanismo de interação do SNC na regulação inflamatória

INTRODUÇÃO

24

Como sistema modulador da resposta inflamatória, o aumento da atividade do

sistema parassimpático é descrito pela estimulação de macrófagos com ACh, que inibe a

produção de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL-1, IL-6 e IL-18). Com a atenção

voltada a esse sistema, verificou-se que a estimulação do nervo vago era capaz de reduzir

a produção de várias citocinas inflamatórias (TNFα, IL-1, HMGB-1) (120).

Nesse sentido, Borovicova et al. (47) demonstraram que a injeção de endotoxina

(lipopolissacarídeo) em animais que foram submetidos à estimulação do nervo vago

resultou na reduzida liberação de macrófagos e citocinas inflamatórias sistêmicas, sem

afetar de liberação de IL-10. No entanto, a transecção do nervo vago aboliu esta proteção.

Além disso, em culturas de macrófagos humanos, acetilcolina inibiu a liberação de TNF-

α quando estas foram submetidas ao tratamento com endotoxina. Estes resultados indicam

que o nervo vago desempenha um papel importante na resposta imunológica (47).Em

humanos, a redução da VFC está significante associada com níveis elevados de citocinas

inflamatórias (IL-6) e proteína C reativa (PCR) (48). Lanza et al. (49) evidenciaram que

os níveis séricos de PCR foram significativamente associados com a VFC reduzida em

pacientes com angina instável. Esta associação também tem sido observada em indivíduos

saudáveis, pacientes com doença arterial coronariana estável e com IC (50). Dessa forma,

prevenindo e/ou atenuando a disfunção autonômica desencadeada pelo IM, poderia

induzir uma elaboração da resposta inflamatória menos intensa, a ponto de reduzir o

comprometimento estrutural e funcional cardíaco, bem como de sistemas periféricos.

1.4. Treinamento Físico Aeróbico e Resistido

Dentre os fatores de risco para o desenvolvimento das DCV, encontra-se a

inatividade física. Para a Organização Mundial da Saúde (OMS), o indivíduo ativo regular

é aquele que pratica alguma atividade física pelo menos três vezes por semana, em seu

INTRODUÇÃO

25

tempo livre, com duração mínima de 30 minutos. No Brasil, o Diesporte aponta que a

população mais jovem é a que mais pratica atividade física. Nas faixas entre 15 e 19 anos

os declarados sedentários são 32,7%, já na faixa 20 a 24 anos o número sobe para 38,1%.

A partir daí, a pesquisa aponta que 45,9% dos brasileiros não praticam esporte ou

atividade física e vai crescendo continuamente até atingir 64,4% dos brasileiros entre 65

e 74 anos (PNAD – IBGE, 2015).

Os primeiros indícios de que a atividade física estava relacionada a saúde ou bem

estar, data de 2500ª.C. na China, em que os registro feitos por Hua To mostram que havia

uma relação entre os exercícios organizados e a promoção da Saúde. (123). Na Grécia

Antiga, filósofos como Hipócrates e Platão acreditavam que a atividade física era

importante para o bem-estar e no tratamento de doenças e incapacidades (122). Tais

observações seguiram com o passar do tempo, isso porque já no século XVIII, o italiano

Romazzinni (1940) observou que estafetas (corredores) apresentam bem-estar em relação

a péssima saúde de trabalhadores sedentários. Assim, os benefícios e mecanismos

potencias por meio dos quais o exercício físico pode reduzir o risco de eventos cardíacos,

seguiram sendo analisados por estudos epidemiológicos dentre eles se destaca um dos

primeiros que foi o Estudos de funcionários públicos Britânicos (Morris et al., 1953), que

observou o risco de cardiopatia associado a atividade física entre cobradores e motorista

de ônibus.

Dessa forma, postulou-se que a atividade física reduz o risco de doenças cardíacas

por meio de alguns mecanismos, como pela ação direta ao coração, aumentando o

suprimento de oxigênio para o miocárdio, reduzindo a demanda e o trabalho miocárdico,

induzindo a bradicardia de repouso e manutenção da pressão arterial, com significativa

redução do tônus simpático. Outras alterações como, aumento do diâmetro e da dilatação

INTRODUÇÃO

26

das artérias coronarianas e da formação de colaterais, também são alguns dos benefícios

atrelados a pratica continua de exercício físico. (FUSTER 1992; KRAMSCH, 1981).

Os benefícios cardiovasculares, autonômicos, metabólicos e anti-inflamatórios de

um estilo de vida fisicamente ativo têm levado muitos investigadores a sugerirem o

treinamento físico (TF) de moderada intensidade como uma conduta não farmacológica

importante na prevenção e no tratamento dos fatores de risco e das DCV (51-55). As

evidências de que o TF é uma ótima ferramenta no tratamento de pacientes com DAC

estabelecida, com ou sem IM, são bastante relevantes e amplamente conhecidas (56,57).

Uma das adaptações positivas ao TF, geralmente associada à redução da

mortalidade, é a do sistema nervoso autonômico. Estudos clássicos como os de Billman

et al. (58) e Hull et al. (59) já sugeriam que esta intervenção reduz a mortalidade de

indivíduos após um IM, principalmente associada ao aumento do tônus vagal e redução

da atividade simpática. De fato, La Rovere et al. (51) evidenciaram que o TF modificou

favoravelmente a sobrevida em longo prazo de pacientes infartados, sendo esta associada

a uma clara mudança do equilíbrio autonômico em direção a um aumento da atividade

vagal. Experimentalmente, para o nosso grupo de pesquisa, os principais benefícios

funcionais, bioquímicos e moleculares do TF aeróbico após o IM parecem estar também

associados à melhora da função autonômica (9,10,13).

Além dos benefícios na função autonômica, Adamapoulus et al. (60)

demonstraram uma redução na concentração plasmática de marcadores inflamatórios

periféricos após 12 semanas de TF aeróbico em pacientes com IC moderada a severa,

sugerindo uma correlação entre a melhora na tolerância ao exercício e a atenuação do

processo inflamatório. Em um modelo experimental de IC, Batista et al. (61) observaram

que o TF aeróbico em ratos infartados aumentou a razão IL-10/TNF-α no músculo sóleo

INTRODUÇÃO

27

dos animais, ressaltando o efeito anti-inflamatório do exercício após um evento

isquêmico.

Apesar dos benefícios do TF aeróbico estarem bem descritos em pacientes com

DAC, IM ou IC, as consequências do TF resistido per se nessas populações dispõem de

evidências menos sólidas. Em pacientes com IC, apesar das anormalidades no músculo

esquelético estarem bem descritas, o TF resistido vinha sendo tradicionalmente

desencorajado em virtude das preocupações em promover comprometimento da função

do VE e potencial efeito adverso no remodelamento cardíaco, principalmente decorrente

do aumento da pós-carga. Pu et al. (2001) afirmam que as respostas hemodinâmicas, bem

como o remodelamento cardíaco não tem sido demonstrado por pacientes com IC que

realizaram o TF resistido. Nesse sentido, nos últimos anos o TF resistido vem sendo

discutido e por vezes recomendado para pacientes com IC, baseado em parte na lógica de

que esta forma de treinamento pode ser mais eficaz em reverter à atrofia muscular

esquelética do que o exercício aeróbico, e que o aumento da força/resistência podem

melhorar a qualidade de vida dessa população. O TF resistido tem atenuado a perda da

massa muscular, melhora da força, da resistência, bem como o consumo máximo de

oxigênio em pacientes com IC. No entanto, ainda são escassos os estudos que tratam dos

efeitos do TF resistido no remodelamento cardíaco, na disfunção ventricular, bem como

no perfil hemodinâmico e autonômico desencadeados pelo IM.

Sob diferente perspectiva, no que tange aos benéficos do TF quando realizado

previamente a um evento cardíaco, adaptações vasculares, sistêmicas, neuro-humorais e

cardiopulmonares ao exercício têm se mostrado bastante eficazes em prevenir

complicações cardiometabólicas, bem como minimizar os efeitos deletérios da isquemia

seguida de reperfusão (68). De fato, dados epidemiológicos indicam que o exercício físico

regular reduz o risco de morte durante a reperfusão clínica após a isquemia (69). Nesse

INTRODUÇÃO

28

contexto, pesquisadores vêm buscando os possíveis mecanismos cardioprotetores do

exercício físico à isquemia e reperfusão. Mecanismos tais como a formação de vasos

colaterais (70), elevação das heat shock proteins 70 (71), aumento da expressão da

ciclooxigenase miocárdica (72), proteção antioxidante (73), bem como o papel anti-

inflamatório do exercício físico (74) têm sido apontados como desencadeadores de

cardioproteção. Entretanto, poucos estudos têm relatado os efeitos do TF previamente à

isquemia permanente em animais e, dentre eles, os resultados são contraditórios (75-78).

Experimentalmente, Dayan et al. (75) demonstraram que 3 semanas de natação

antes do IM atenuaram o remodelamento e melhoraram a função ventricular de animais

treinados. De maneira semelhante, Freimann et al. (76) observaram que o treinamento de

natação prévio ao IM reduziu o tamanho da cicatriz, aumentou a densidade capilar, bem

como promoveu adaptações gênicas relacionadas o metabolismo enérgico. Em

contrapartida, Veiga et al. (77,78) não observaram adaptações positivas da natação na

função ventricular, na área de IM e no perfil hemodinâmico de ratos treinados

previamente ao IM. Recentemente, Bozi et al. (79) demonstraram que o TF aeróbico de

moderada intensidade em esteira, realizado previamente, atenuou a disfunção e

deterioração estrutural cardíaca promovida pelo IM, e tais benefícios foram associados

com a preservação das propriedades morfológicas e contráteis dos cardiomiócitos.

1.5. Estimulação Colinérgica por Brometo de Piridostigmina.

A busca por fármacos com ação cardioprotetora, capazes de reduzir a ocorrência

e as complicações dos eventos cardíacos em pacientes coronariopatas e/ou infartados, é

de grande relevância. Estudos anteriores têm demonstrado que a estimulação colinérgica

permite um aumento da resposta vagal e inflamatória em pacientes após um IM agudo,

onde sabidamente existe uma diminuição da atividade parassimpática (80,81).

INTRODUÇÃO

29

O sistema nervoso autônomo, pela sua divisão parassimpática apresenta um

neurotransmissor ganglionar e pós-ganglionar, a Acetilcolina (Ach), que é um

neurotransmissor liberado pelo terminal nervoso quando o corpo necessita de estímulos

específicos, na maioria das vezes, contração ou relaxamento muscular, que por sua vez é

inativada pela enzima Acetilcolinesterase (AchE). No sistema nervoso simpático, o

neurotransmissor ganglionar também é a Ach, no entanto, nos órgãos efetores o

neurotransmissor é a Noradrenalina e a adrenalina, essa, liberada pela medula da adrenal.

(Edilberto, 2008).

A acetilcolina exerce as suas ações através da estimulação dos receptores

nicotínicos (nAcCor) e muscarínicos (mAcCor), no entanto, o efeito anti-inflamatório é

associado a subunidade α7 do recetor nicotínico da acetilcolina (a7nAcCor), em que

somente a estimulação deste subtipo gera uma resposta anti-inflamatória relevante (129).

Em busca de mecanismos para induzir a estimulação colinérgica, está a utilização

de inibidores da acetilcolinesterase, como o brometo de piridostigmina (PIR), que por

exemplo, têm se mostrado eficientes (82). Apesar de seus efeitos amplamente conhecidos

na profilaxia contra intoxicação por organofosforados (83) e no tratamento da Miastenia

Gravis (84), hiatos existem sobre o impacto desse fármaco nas alterações autonômicas

ocasionadas pelo IM. A estimulação colinérgica aguda com PIR causou bradicardia e

reduziu o intervalo QT, sem efeitos colaterais importantes em pacientes com doença

coronariana (85). Em pacientes com IC, o fármaco aumentou significativamente a

recuperação da frequência cardíaca no primeiro minuto após o exercício físico máximo

(82), melhorou o pulso de oxigênio (indicador de volume sistólico), bem como a

frequência cardíaca de reserva (86). Experimentalmente, Yu et al. (87) demonstraram que

o tratamento com PIR (30 mg/kg/dia) aumentou a angiogênese após o IM em ratos.

Recentemente, nosso grupo testou a influência do tratamento com brometo de

INTRODUÇÃO

30

piridostigmina por 7 dias (0,14 mg/ml/dia) na função autonômica de ratos após o IM. O

grupo infartado tratado melhorou a frequência cardíaca intrínseca e o tônus vagal, bem

como reduziu o tônus simpático e a área de infarto em relação ao grupo infartado placebo

(88). Além disso, foi demonstrado que a administração em longo prazo de PIR aumentou

o tônus vagal cardíaco e reduziu o tônus simpático, atenuando o remodelamento cardíaco

e disfunção ventricular esquerda durante a progressão da insuficiência cardíaca em ratos.

Nesse cenário, a PIR parece ser um fármaco interessante por melhorar a função

autonômica e sua resposta ao exercício físico em pacientes infartados ou com IC, além de

induzir alterações autonômicas e estruturais importantes em animais submetidos à

oclusão da artéria coronária, conforme evidenciado na literatura. No entanto, várias

perguntas emergem diante desses achados clínicos e experimentais, como: o TF prévio é

suficiente para desencadear efeitos cardioprotetor independentemente do tipo de

treinamento? A associação do TF aeróbico com a administração de PIR pode desencadear

efeitos positivos adicionais na função autonômica e, consequentemente, na resposta

inflamatória ao IM? O TF resistido, realizado isoladamente antes do IM, é uma prática

que induz a um fenótipo cardioprotetor? Por fim, a associação do TF resistido com a

administração de PIR pode desencadear efeitos positivos adicionais na função

autonômica e, consequentemente, na resposta inflamatória ao IM?

OBJETIVOS

31

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

O objetivo geral do presente estudo foi avaliar as respostas ventriculares,

hemodinâmicas, autonômicas e inflamatórias da isquemia miocárdica em ratos

previamente submetidos ao TF aeróbico ou resistido, associados ao tratamento com

brometo de piridostigmina.

2.2. Específicos

Estudar as respostas ventriculares, hemodinâmicas, autonômicas e inflamatórias

da isquemia miocárdica em ratos previamente submetidos ao TF aeróbico ou resistido,

associados ao tratamento com brometo de piridostigmina, por meio das seguintes

avaliações:

Área de IM e morfometria cardíaca

Função ventricular

Pressão arterial e frequência cardíaca:

Sensibilidade barorreflexa

Tônus vagal, tônus simpático e frequência cardíaca intrínseca

Modulação autonômica

Marcadores inflamatório

MATERIAIS E MÉTODOS

32

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais e Grupos

Foram utilizados ratos Wistar machos (230-260g) provenientes do biotério da

Universidade São Judas Tadeu (USJT). O presente estudo teve a aprovação da Comissão

de Ética em Uso de Animais de Experimentação da USJT (CEUA/USJT - 008/2013). Os

animais foram mantidos agrupados, em ambiente com temperatura (22o–24oC) e com luz

controlada em ciclo de 12 horas (claro/escuro). Água ou PIR e comida foram oferecidas

de modo irrestrito, sendo que a dieta foi normoproteica (12% de proteínas). Os animais

foram divididos nos seguintes grupos experimentais (n=9 por grupo):

Controle Sham (C)

Sedentário + infarto (SI)

Sedentário + PIR + infarto (SPI)

Treinamento aeróbico + infarto (TAI)

Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI)

Treinamento resistido + infarto (TRI)

Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI)

Os animais foram treinados/tratados por 2 meses e, ao final desse período, foram

submetidos ao IM ou cirurgia fictícia sem a oclusão da artéria coronária (Sham). As

análises propostas foram realizadas na primeira semana após o IM ou Sham.


33

3.2. Sequência Experimental

A sequência experimental está descrita a seguir:

Onde: IM – infarto do miocárdio; TE – teste de esforço máximo; TCM – teste de carga

máxima; ECO – Avaliação ecocardiográfica.

3.3. Procedimentos Experimentais

3.3.1. Testes de Esforço, Carga Máxima e Treinamento Físico

Todos os grupos estudados foram submetidos a um protocolo de teste de esforço

máximo (TE) em esteira ergométrica e um teste de carga máxima (TCM) em escada

adaptada para ratos (com aproximadamente 54 degraus verticais e 0,5 cm de espaço entre

eles) ao início, aos 30 dias e ao final dos programas de TF aeróbico e resistido. Os animais

foram adaptados em esteira ergométrica (10 minutos a 0,3 Km/h) durante 3 dias. O TE

consistiu em colocar o animal correndo na esteira a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo que

esta carga foi incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até que o animal atingisse a

exaustão. Este protocolo de TE apresenta correlação significativa com a medida do

consumo direto de oxigênio em ratos machos, o que nos confere validade e fidedignidade

para prescrição e controle do TF. Após o teste inicial, os grupos que realizaram o

treinamento aeróbico foram submetidos a um protocolo de TF em esteira ergométrica


34

com velocidade e carga progressiva durante 2 meses (5 dias por semana) e intensidade de

60 a 75% da velocidade máxima atingida no TE.

Na adaptação à escada, os animais foram colocados nos degraus inferiores e

adaptados ao ato de escalar, sem nenhum peso. No topo da escada os animais encontraram

uma gaiola (20x20x20 cm) onde descansaram por 120 segundos. Este procedimento foi

realizado por 3 dias até que os animais escalassem voluntariamente a escada 3 vezes

consecutivas. O teste de carga máxima consistiu em uma escalada com carga inicial de

75% do peso corporal. Após 2 minutos de descanso, um peso adicional de 15% do peso

corporal foi aplicado no aparato da cauda, e assim sucessivamente, com descansos de 2

minutos entre cada escalada, até que o animal não conseguisse completar a subida. O

protocolo de TR foi realizado durante 2 meses, 5 dias por semana, com intensidade

moderada (40-60% da carga máxima de subida normalizada), conforme recomendado

para pacientes com doença cardiovascular, 15 escaladas por sessão e 1 minuto de

descanso entre cada escalada.

3.3.2. Extração e Tratamento com Brometo de Piridostigmina

Para a realização do tratamento com Brometo de Piridostigmina, foi realizada a

etapa de extração do fármaco comercial Mestilon® 60 mg. Para tal, foi realizada a

trituração dos comprimidos de uma cartela com Blíster em grau de vidro com pistilo até

a obtenção de um pó. O pó foi diluídos em água potável filtrada, em balão volumétrico

de 2L. A solução obtida, foi colocada em banho de ultrassom até assegurar completa

dissolução do brometo de piridostigmina e em seguida foi filtrada, utilizando filtração a

vácuo com funil de Buckener, 1Kitassato e bomba de vácuo. Após o processo de extração,

foi retirada uma alíquota de 1ml para comparação com curva padrão de 14mg/ml

comparada com padrão de brometo de piridostigmina Sigma®.


35

Assim, o tratamento com brometo de piridostigmina (0,14 mg/mL) foi realizado

por via oral na água de beber, com o consumo médio de solução ingerida por dia de

50ml/rato, sendo que a dose diária ingerida de brometo de piridostgmina foi de

aproximadamente 15mg/rato, considerando que peso médio dos ratos foi em torno de

350g, a dose diária corrigida pelo peso do animal foi então de aproximadamente

40mg/Kg/dia do fármaco (88,92), por 60 dias.

3.3.3. Indução do Infarto do Miocárdio

Após o treinamento/tratamento, os animais foram anestesiados com uma mistura

de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal, submetidos à

respiração artificial em pressão positiva (Harvard Aparattus©, Model 683, Holliston,

MA) e a artéria coronária descendente anterior esquerda ocluída a aproximadamente 1mm

de sua origem, abaixo da extremidade do átrio esquerdo (fio mononylon 6.0).

Posteriormente, incisão torácica foi fechada (fio mononylon 5.0) e o pneumotórax

retirado. Os músculos afastados foram reposicionados e a pele suturada (fio mononylon

4.0). Os animais receberam 30000 UI de Benzilpenicilina Benzatina (Penretard, Cibran,

Tanquá, RJ, Brasil, i.m.) e foram colocados em ambiente aquecido para recuperação (9-

20). A cirurgia fictícia Sham ocorreu de forma semelhante, exceto pela ligadura da artéria.

3.3.4. Avaliações Ecocardiográficas

As avaliações ecocardiográficas foram realizadas 2 dias após o IM. Essas

avaliações foram realizadas seguindo as recomendações do Comitê de Padronização do

Modo M da Sociedade Americana de Ecocardiografia (93).

Em cada avaliação, foram analisados parâmetros de função sistólica (como a

fração de ejeção e a fração de encurtamento do VE); parâmetros de função diastólica

(como o tempo de relaxamento isovolumétrico, a relação entre as ondas E e A, bem como


36

o tempo de desaceleração da onda E); a área de infarto; e morfometria cardíaca (como a

espessura relativa da parede, massa do ventrículo esquerdo, diâmetros sistólico e

diastólico finais), previamente padronizados pelo nosso grupo (9-12,15-19,94).

Para a realização do exame ecocardiográfico, os animais foram anestesiados com

uma solução intraperitoneal de Cetamina (80 mg/kg) e Xilazina (12mg/kg), e tiveram a

região torácica devidamente tricotomizada, sendo mantidos em decúbito lateral para a

realização do exame ecocardiográfico com aparelho SEQUOIA 512 (ACUSON,

Corporation, Mountain View, CA-EUA). O transdutor utilizado foi linear e multi

frequencial (10-14mHz), que permite imagens bidimensionais e monodimensionais

simultâneas, além da análise de fluxo por efeito Doppler espectral. A profundidade de

imagem trabalhada foi de 2cm.

Foram utilizadas as janelas longitudinais para esternais direitas para a obtenção

dos cortes longitudinal e transversal; e as janelas longitudinais paraesternais esquerdas

para a obtenção dos cortes apicais (duas, quatro e cinco câmaras). As medidas lineares

foram realizadas nas imagens obtidas pelo modo-M, conforme descrito por Schiller et al.

(1979), com as seguintes medidas: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE),

diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (DSVE) e espessura diastólica da parede

posterior (PPDIA). A massa ventricular esquerda (MVE) foi então obtida a partir da

fórmula: 1,047 x ((SIVDIA+VEDIA+PPDIA)3-VEDIA3) onde: 1,047 representam a

densidade do miocárdio, validada em ratos por Fard et al. (2000). A espessura relativa da

parede (ERP) foi calculada levando-se em consideração as medidas de PPDIA e DDVE.

A função sistólica foi avaliada pela fração de ejeção (FE, em %) pelo método

Simpson modificado, por se mostrar mais fidedigno em corações infartados, e também


37

pela velocidade de encurtamento circunferencial (VEC, em circ/seg 10-4), cujas fórmulas

estão a seguir:

Simpson modificado: onde L = comprimento do

ventrículo esquerdo dividido em 20 discos (i= 1 a i= 20) da base ao ápice, com o diâmetro

de cada disco determinado em duas visões apicais (a e b). Com este procedimento feito

tanto na diástole como na sístole. A velocidade de encurtamento circunferencial foi obtida

pela seguinte fórmula: VEC = (VEDIA-VESIS)/(VEDIA x TE), onde TE = tempo de

ejeção.

A função diastólica foi analisada utilizando-se os índices derivados da curva de

velocidade de fluxo diastólico mitral e do fluxo sistólico da via de saída do VE, obtidos

pela técnica de Doppler pulsátil. A curva de velocidade do fluxo diastólico foi obtida a

partir da imagem apical quatro câmaras posicionando-se o volume amostra próximo à

face ventricular da valva mitral. Foram determinadas: a) onda E – maior valor da

velocidade de fluxo inicial do enchimento ventricular (enchimento rápido do ventrículo);

b) onda A – maior valor da velocidade de fluxo telediastólico mitral (correspondente à

contração atrial); c) a relação E/A - razão entre a velocidade máxima da onda E e a

velocidade máxima da onda A; d) tempo de desaceleração da onda E (TDE) – tempo (em

milissegundos, ms), entre o pico da onda E e o ponto em que a rampa de desaceleração

intercepta a linha de base da curva de velocidade do fluxo diastólico mitral. A curva de

velocidade dos fluxos para análise do tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) foi

obtida posicionando-se o volume amostra numa posição intermediária entra a valva mitral

e a via de saída do VE. Foi determinado o TRIV (em milissegundos, ms) entre o final do

fluxo sistólico na via de saída do VE e o início do fluxo diastólico mitral.


38

Além das avaliações da função sistólica e diastólica separadamente, utilizamos

outro método de avaliação funcional combinado, o índice de desempenho miocárdico

(IDM), derivado de intervalos obtidos pelo Doppler pulsátil. Validado em camundongos

por Broberg et al. (2003) e já padronizada pelo nosso grupo em ratos infartados

(Rodrigues et al., 2012), o IDM é conceitualmente simples e representa a razão do tempo

total gasto na atividade isovolumétrica (contração e relaxamento isovolumétricos) pelo

tempo de ejeção. Para tanto, mede-se o tempo de relaxamento da válvula mitral (a), que

corresponde à soma do tempo de contração isovolumétrica, tempo de ejeção e tempo de

relaxamento isovolumétrico. O tempo de ejeção é obtido pela medida da duração do fluxo

de via de saída do ventrículo esquerdo (b). Pela fórmula (a)-(b) / b, podemos então obter

o IDM.

A região de infarto foi delimitada de acordo com a cinética das paredes do

miocárdio, avaliadas pelas seguintes janelas ecocardiográficas: longitudinal paraesternal

direita, transversal (ao nível dos músculos papilares) e apical (2 e 4 câmaras). Regiões

hipocinéticas (espessamento sistólico abaixo do normal) e acinéticas (ausência de

espessamento durante a sístole) foram consideradas como infartadas. Desta forma, a área

de infarto foi delimitada através da razão destas regiões com a área total das paredes

miocárdicas do VE. Moisés et al. (2000) e Nozawa et al.(2006), utilizando-se desta

metodologia, demonstraram altíssima sensibilidade e especificidade para a delimitação

da área de infarto do miocárdio em ratos, com 100% de confiabilidade quando comparada

a estudos anatomopatológicos. Além disso, nosso grupo tem utilizado essa medida em

diversos estudos, sendo muito bem padronizada pelo nosso grupo de pesquisa (Mostarda

et al., 2010; Jorge et al., 2011; Rodrigues et al., 2011; Rodrigues et al., 2012). Todas as

medidas seguiram as recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia.


39

Dessa forma, as variáveis ecocardiográficas analisadas nos grupos experimentais

foram:

Variáveis Morfométricas:

Área de infarto

MVE – Massa do VE (absoluta);

DDVE – Diâmetro diastólico do VE;

DSVE – Diâmetro sistólico do VE;

ERP – Espessura relativa da parede.

Variáveis de Função Sistólica:

FE – Fração de Ejeção;

VEC – Velocidade de Encurtamento Circunferencial.

Variáveis de Função Diastólica:

TRIV – Tempo de Relaxamento Isovolumétrico;

TDE – Tempo de Desaceleração da Onda E;

E/A – Relação entre as ondas E e A.

Variável de Função Global:

IDM - Índice de Desempenho Miocárdico.


40

3.3.5. Canulação e Registro da Pressão Arterial Direta e Sistema

Nervoso Autonômico Cardiovascular

Para análise do sistema nervoso autônomo foram utilizados diferentes ferramentas

de avaliação, como:

Modulação autonômica cardiovascular: Análise de variabilidade da frequência

cardíaca (intervalo RR) e da pressão arterial (por meio da análise espectral).

Reflexo do barorreceptor cardíaco: para se investigar as respostas autonômicas

cardiovasculares reflexas.

Comportamento tônico do sistema nervoso autônomo cardíaco: por bloqueio

farmacológico com atropina e propranolol

Após as avaliações ecocardiográficas, os animais foram anestesiados com uma

mistura de Cetamina (80 mg/Kg) e Xilazina (12 mg/Kg) por via intraperitoneal e realizada

a implantação de cateteres na veia jugular (para administração de drogas) e na artéria

carótida (para registro direto da PA e FC). Cada animal foi mantido em uma caixa

individual padrão durante a realização das avaliações hemodinâmicas sistêmicas que são

iniciadas 24 horas após a canulação. Com o animal acordado, a cânula arterial é conectada

a uma extensão de 20 cm, permitindo livre movimentação do animal pela caixa, durante

todo o período do experimento. Esta extensão é conectada a um transdutor

eletromagnético de pressão (Kent Instruments®) que por sua vez, é conectado a um pré-

amplificador (Stemtech). Sinais de PA são gravados durante um período de 30 minutos

em um microcomputador equipado com um sistema de aquisição de dados (DATAQ

Instruments, DI-158U), permitindo análise dos pulsos de pressão, batimento-a-batimento,

com uma frequência de amostragem de 2KHz por canal para estudo dos valores de PA e

FC (9,10,13,14,16,19,20).


41

3.3.6. Avaliação da Sensibilidade do Barorreflexo

Após o registro da PA, com os animais em condições de repouso, a sensibilidade

dos pressorreceptores são testadas através de doses crescentes da infusão de fenilefrina e

de nitroprussiato de sódio. A sensibilidade barorreflexa é avaliada pelo índice calculado

pela divisão de variação da FC pela variação da PAM (9,10,13,14,16,19,20).

3.3.7. Tônus Vagal e Tônus Simpático

Após a avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores e com o retorno da FC e

da PA a valores próximos dos obtidos no registro basal, é realizada a injeção de atropina

(3 mg/kg) e PA e FC são registradas por 8 minutos. Ainda sob efeito da atropina, é

realizada a injeção de propranolol (4 mg/kg) e PA e FC são registradas por 8 minutos.

Com o duplo bloqueio farmacológico atinge-se a FC intrínseca. No dia seguinte, repete-

se o mesmo procedimento descrito anteriormente invertendo-se a sequência das injeções

dos fármacos (bloqueio invertido). O tônus simpático é calculado pela subtração da

máxima FC alcançada após bloqueio do parassimpático com atropina menos a FC

intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina + propranolol). Já o tônus simpático

é calculado pela subtração da mínima FC atingida após o bloqueio simpático com

propranolol, menos FC intrínseca, observada após o duplo bloqueio (atropina +

propranolol) (13).

3.3.8. Modulação autonômica

A variabilidade da FC e da PA sistólica foi avaliada no domínio do tempo

(variância) e no domínio da frequência usando a Transformada Rápida de Fourrier. Em

resumo, neste método, séries temporais do intervalo de pulso e da PA sistólica são

divididas em segmentos de 350 batimentos com sobreposição de 50%. Um espectro é


42

obtido para cada um dos segmentos via o recurso de Levinson-Durbin, com a ordem

modelo escolhido de acordo com critério do Akaike, variando entre 10 e 14. Os

componentes oscilatórios dos espectros são quantificados em 2 faixas de frequência:

baixa frequência (BF: 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (AF: 0,75-4,0 Hz). A potência do

espectro é calculada para cada componente reconhecível nas faixas de BF e AF

integrando-se os espectros dos componentes. A potência é expressa como a intensidade

de BF e AF. Os segmentos que apresentam oscilações muito lentas (<0,1 Hz), que

contribuem para mais de 70% da variabilidade total, são considerados não estacionários

e portanto descartados do estudo (14,20).

3.3.9. Atividade de Acetilcolinesterase

Para determinar a magnitude da inibição de acetilcolinesterase pelo tratamento

com a PIR, amostras de 200 µl de sangue foram centrifugadas a 5000 rpm durante 15 min

e 100 µl de plasma foram congeladas a -20o C. A atividade de acetilcolinesterase foi

determinada por kit imunológico Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Ilustração 2: Avaliação do Sistema Nervoso Autonômico Cardiovascular. (Barboza, CA)


43

3.3.10. Concentração de Citocinas

Após as avaliações citadas acima os animais foram pesados e eutanasiados por

decapitação. O VE e o plasma foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e

armazenados em freezer -80º C. As proteínas dos tecidos foram extraídas em tampão (Tris

base 100nM, pH 7,5; EDTA 10nM; fluoreto de sódio 100nM; pirofosfato de sódio 10nM;

ortovanadato de sódio 10nM; aprotinina 10µg/ml; leupeptina 1µg/ml; PMSF 2nM) e

incubadas com Triton X100 – 10% por 30 minutos em gelo. Imediatamente após, a

amostra foi centrifugada a 13.000 rpm, a 4º C, durante 20 minutos e os sobrenadantes

submetidos à quantificação proteica pelo método Bradford, utilizando-se uma curva

padrão de 50 a 1.000 µg/ml de albumina bovina sérica e reagente de Bradford (coomassie

brilliant blue 0,01%, etanol 47%, ácido fosfórico 4,5% e água destilada q.s.p); a

absorbância foi determinada em 595 nM (9,15,19,95). As avaliações quantitativas das

citocinas IL-1β, IL-6, IL-10 e TNFα foram realizadas por Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay (ELISA) no ventrículo esquerdo e em amostras de músculo

esquelético (sóleo) e soro dos animais.

3.3.11. Análise Estatística

Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média. Depois de

confirmar que todas as variáveis contínuas foram normalmente distribuídas pelo teste de

Kolmogorov-Smirnov, os testes de análise de variância (ANOVA) de duas vias e para

medidas repetidas foram devidamente aplicados para análise dos dados seguidos do post-

hoc de Bonferroni. Valores de P<0,05 foram considerados significativos.

RESULTADOS

44

4. RESULTADOS

4.1 Peso Corporal

O peso corporal (Figura 1) no início do protocolo foi semelhante entre os grupos.

No entanto, ao final do protocolo todos os grupos experimentais apresentaram aumento

do peso corporal em relação às suas respectivas avaliações iniciais. Os grupos

experimentais TAI, TAPI, TRI e TRPI apresentaram redução do peso corporal se

comparados ao grupo C. Adicionalmente, os grupos TAPI, TRI e TRPI também

apresentaram redução do peso corporal em relação ao grupo SI. Já os grupos TAPI e TRI

reduziram o peso corporal em relação ao grupo SPI e, no caso dos animais TRI, a redução

ocorreu também em relação aos animais TAI.

Figura 1. Peso corporal avaliado ao início e após as cirurgias Sham e infarto do

miocárdio nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário +

PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico +

PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

C SI SPI TAI TAPI TRI TRPI

Inicial Pós-Sham/IM

## #

#

##

*†‡

*

*†‡¥

*†

gra

mas

RESULTADOS

45

+ PIR + infarto (TRPI). # P<0,05 vs. Avaliação inicial; * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs.

SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI.

4.2 Capacidade Física

Na Figura 2, é possível observar que não há diferença entre os grupos no teste de

esforço em esteira rolante realizado ao início do protocolo. Ao final do período de

treinamento/tratamento, os animais dos grupos TAI, TAPI, TRI e TRPI apresentaram

aumento da capacidade física em relação aos grupos sedentários C, SI e SPI. Após a

indução do IM, o grupo SI e SPI apresentaram redução da capacidade aeróbia em relação

ao grupo C. No entanto, esta queda não foi observada nos grupos TAI e TRI. Já os animais

dos grupos TAPI e TRPI apresentaram aumento dessa variável em relação aos grupos C,

SI e SPI, bem como em relação aos seus respectivos controles não tratados (TAI e TRI).

Por outro lado, o grupo TAPI apresentou um aumento adicional dos valores de teste de

esforço em relação ao grupo TRPI.

Figura 2. Teste de esforço em esteira rolante avaliado ao início, ao final dos períodos

de treinamento/tratamento e após as cirurgias Sham e infarto do miocárdio nos

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5


Inicial Final Pós-Sham/IM

Km

/h

**

*†‡

†‡

*†‡¥

*†‡¥

*†‡¥

†‡¥

*†‡£$

*†‡£$

RESULTADOS

46

grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto

(SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto

(TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR +

infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI;

£ vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.

Ao início do estudo, todos os grupos experimentais evidenciaram semelhante

resultado no teste de carga máxima (Figura 3). Ao final dos períodos de

treinamento/tratamento, os grupos TRI e TRPI aumentaram os valores atingidos no teste

em comparação aos grupos C, SI e SPI, bem como em relação aos grupos TAI e TAPI,

respectivamente. Após as cirurgias Sham e de IM, os grupos TRI e TRPI continuaram

com valores aumentados obtidos no teste em comparação aos grupos C, SI, SPI, TAI e

TAPI, porém, vale ressaltar que os animais do grupo TRPI obtiveram um aumento

adicional no teste de carga máxima se comparado ao grupo TRI.

Figura 3. Teste de carga máxima realizado em escada adaptada para ratos avaliado

ao início, ao final dos períodos de treinamento/tratamento e após as cirurgias Sham

0

100

200

300

400

500

600


Inicial Final Pós-Sham/IM

*†‡¥

*†‡£

*†‡¥£

*†‡¥£$

gra

ma

s

RESULTADOS

47

e infarto do miocárdio nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI),

Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI),

Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto

(TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs.

SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.

4.3. Avaliações Ecocardiográficas

Os grupos experimentais foram submetidos à avaliação ecocardiográfica de

morfometria e função cardíaca após a cirurgia de indução do infarto ou cirurgia Sham, ao

final dos protocolos de treinamento/tratamento ou acompanhamento. Os parâmetros

analisados serão apresentados em variáveis morfométricas e função ventricular.

4.3.1. Variáveis Morfométricas

A área de infarto, apresentada na Figura 4, apresentou redução somente nos grupos

tratados, SPI e TAPI vs SI. Já a massa do ventrículo esquerdo (Figura 5), foi aumentada

nos grupos TAI e TRI em relação aos grupos C e SI. Vale ressaltar que os animais TRI

apresentaram aumento adicional dessa variável se comparados aos animais dos grupos

TAI e TAPI. Adicionalmente, os animais TAPI e TRPI demonstraram menores massas

ventriculares em relação aos seus respectivos controles treinados e não tratados (TAI e

TRI, respectivamente).

RESULTADOS

48

Figura 4. Área de infarto avaliada pelo ecocardiograma nos grupos Sedentário +

infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI),

Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI),

Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡

P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs. TRI.

0

10

20

30

40

50

60

SI SPI TAI TAPI TRI TRPI

% †

‡

†

‡£

RESULTADOS

49

Figura 5. Massa do ventrículo esquerdo avaliada pelo ecocardiograma nos grupos

Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI),

Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto

(TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto

(TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs.

TAPI; $ vs. TRI.

Em relação ao diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (Figura 6), foi

observada redução no grupo TAPI em relação ao SI e ao seu controle direto (TAI).

Contrario, houve um aumento entre o grupo TRI vs TAPI. Já a espessura relativa de

parede (Figura 7), foi aumentada no grupo TAI em comparação ao SI e TAPI. O grupo

TRI demonstrou um aumento dessa variável em relação aos grupos C, SI, TAI e TAPI. O

treinamento resistido associado ao tratamento provocou uma queda da espessura relativa

da parede nos animais TRPI em comparação aos animais TRI.

0

0,5

1

1,5

2


gra

mas

¥

*†‡¥£

¥$

*†‡

RESULTADOS

50

Figura 6. Diâmetro final do ventrículo esquerdo em diástole avaliado pelo

ecocardiograma nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI),

Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI),

Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI),

Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). † P<0,05 vs. SI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £

vs. TAPI.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9


cm

†¥

£

RESULTADOS

51

Figura 7. Espessura relativa da parede avaliada pelo ecocardiograma nos grupos





TAPI; $ vs. TRI.

4.3.2. Função Ventricular

Após a indução da isquemia, os grupos SI, TAI, TAPI, TRI e TRPI apresentaram

redução significante da fração de ejeção (Figura 8) em relação ao grupo C. No entanto,

os grupos TAI e TRI melhoraram essa variável em relação ao grupo sedentário (SI). Um

aumento adicional da fração de ejeção foi observado nos grupos SPI, TAPI e TRPI em

relação a seus respectivos controles treinados não tratados (SI,TAI e TRI). Porém, vale

salientar que o grupo TRPI mostrou redução dessa variável em comparação ao grupo

TAPI.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


†‡

¥

*†‡¥

$

RESULTADOS

52

Figura 8. Fração de ejeção do ventrículo esquerdo avaliada pelo ecocardiograma

nos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto



(TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ P<0,05 vs.

TRI.

Após o IM, os animais sedentários (SI) apresentaram aumento da relação E/A

(Figura 9) quando comparados aos animais do grupo C. Todos os tipos de treinamento,

tratados ou não, normalizaram tal variável. No entanto, vale ressaltar que o grupo TAI

apresentou reduzidos valores de relação E/A quando comparado ao grupo SI.

0

15

30

45

60

75


%*

*†

*†‡

†¥

*‡¥£

*†£$

RESULTADOS

53

Figura 9. Relação entre as ondas E e A avaliada pelo ecocardiograma nos grupos




(TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05.

O índice de desempenho miocárdico, um índice de função global que representa

o estresse miocárdico para manter a pressão de perfusão adequada, estava reduzido nos

grupos TAI, TAPI e TRPI em relação ao C, bem como nos animais TAI, TAPI, TRI e

TRPI em comparação ao SI (Figura 10).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


**

†

RESULTADOS

54

Figura 10. Índice de desempenho miocárdico nos grupos Controle Sham (C),

Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico +

infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido

+ infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; †

P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs. TRI.

4.4. Variáveis Hemodinâmicas

Os valores de pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD), média (PAM) e

frequência cardíaca (FC), avaliados de forma direta pela cateterização de artérias e veias

femorais, estão apresentados na Tabela 1. Não foram observadas diferenças nos valores

de PAS, PAD e PAM nos grupos experimentais. No entanto a FC foi reduzida nos grupo

tratado SPI vs SI, sendo que o grupo associação TAPI reduziu não só em relação ao SI,

mas também quando comparado ao C e TAI. Já o grupo TRPI reduziu somente quando

comparado a se controle direto (TRI).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6


*†‡

*†‡

†‡

*†‡

RESULTADOS

55

Observa-se que o grupo SI apresentou uma redução da RT e RB em relação ao

grupo C. No entanto, somente o grupo TAI, TAPI E TRPI foram capazes de prevenir tal

queda (Tabela 1).

Tabela 1. Pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e média (PAM),

frequência cardíaca (FC), resposta taquicárdica (RT) e bradicárdica (RB) nos




(TRPI).


PAS (mmHg) 122±2 115±3 125±4 117±4 125±3 117±3 124±3

PAD(mmHg) 86±3 80±3 85±2 84±2 83±4 87±2 85±5

PAM(mmHg) 98±3 92±2 99±5 95±4 100±4 100±2 98±6

FC (bpm) 319±5 339±9 291±6† 331±4‡ 289±7*†¥ 345±8‡£ 310±5$

RT

(bpm/mmHg)

3,31±0,24 1,59±0,12* 2,05±0,08* 2,89±0,05†‡ 2,98±0,08†‡ 1,89±0,15*¥£ 2,11±0,10*¥£

RB

(bpm/mmHg)

-2,03±0,12 -0,59±0,02* -1,87±0,05† -2,01±0,07† -2,15±0,04† -0,90±0,09*‡¥£ -1,80±0,06†£$

RESULTADOS

56

Valores expressos em média ± EPM. ANOVA de dois caminhos e pós-hoc de Bonferroni.

PAS – pressão arterial sistólica; PAD – pressão arterial diastólica; PAM – pressão arterial

média; FC – frequência cardíaca; RT – resposta taquicárdica; RB – resposta bradicárdica

* P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs.

TRI.

4.5. Variáveis Autonômicas Cardiovasculares

O grupo SI demonstrou um aumento do tônus simpático, bem como redução do

tônus vagal quando comparado ao grupo C (Figura 11). Os grupos SPI, TAI, TAPI, TRI

e TRPI apresentaram redução o tônus simpático em relação ao grupo SI. No entanto, vale

ressaltar que somente os grupos TAI, TAPI e TRPI foram eficazes em aumentar o tônus

vagal em relação ao grupo SI.

Figura 11. Tônus simpático (TS), tônus vagal (TV) nos grupos Controle Sham (C),

Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento aeróbico +

infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI), Treinamento resistido

+ infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; †

P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £ vs. TAPI; $ vs. TRI.

0

20

40

60

80

100

120

140


BP

M

TÔNUS SIMPÁTICO TÔNUS VAGAL

†

*†

† ††‡

†

†

*‡¥£

†$

*

*

†‡

RESULTADOS

57

A avaliação da modulação autonômica do intervalo de pulso e da pressão arterial

sistólica pode ser observada na Tabela 2.

Após o IM, os animais do grupo SI apresentaram prejuízo da variabilidade do

intervalo de pulso, evidenciada pelos parâmetros de variância do intervalo de pulso (Var-

PI), raiz quadrada da média das diferenças dos intervalos RR sucessivos (RMSSD),

bandas de baixa (BF) e alta (AF) frequências, bem como do balanço autonômico (BF/AF)

quando comparados ao grupo C. No entanto, o treinamento físico aeróbico realizado

previamente ao IM foi capaz de prevenir tais alterações, conforme mostrado no grupo

TAI.

Em relação à avaliação da variabilidade da PA sistólica, o grupo SI mostrou

valores aumentados da banda de BF (indicativa de modulação simpática periférica), bem

como redução do índice alfa (representativo do barorreflexo espontâneo) em relação ao

grupo C. No entanto, o grupo TAI apresentou melhores valores desses parâmetros quando

comparado ao grupo I (Tabela 2).

RESULTADOS

58

Tabela 2. Variabilidade do intervalo de pulso e da pressão arterial sistólica nos

grupos Controle Sham (C)Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI),



(TRPI).

C I PI TAI TAPI TRI TRPI

DP-IP (bpm) 11,1±0,8 9,0±0,8 7,8±0,4 10,7±1,4 9,6±0,6 7,9±0,9 8,8±0,4

Var-IP (ms2) 116±17 23±3* 61±6 108±21† 100±13† 75±15 80±8

RMSSD (ms2) 6,6±0,2 4,3±0,2* 5,9±0,3 8,4±0,6†‡ 8,2±0,3†‡ 6,7±0,8† 6,8±0,2†

BF (ms2) 5,8±1 0,8±0,1* 3,0±0,8 6,3±0,9† 5,7±0,9† 3,7±0,9 6,9±0,9†‡

BF (%) 26,7±2,6 14,9±1,4 22,3±3,1 27,3±3,3 30,1±2,8 21,8±4,1 30,1±5,5

AF (ms2) 15±1 4,6±0,3* 12,5±0,9† 16±1,4† 15,2±1,1† 10,7±2,5† 12,4±1,1†

AF (%) 73,2±2,7 85,1±1,4 77,3±3,0 72,6±3,3 66,2±6,6 69,9±9,2 73,1±6,2

BF/AF 0,38±0,05 0,18±0,02 0,31±0,06 0,39±0,06 0,44±0,08 0,32±0,09 0,58±0,08†

Var-PAS

(mmHg2)

28,9±3 29,4±6 31,3±4 25,9±2 20,2±2,8 17,1±3,1 16,6±2,6

BF (mmHg2) 5,8±0,6 7,5±1,0 5,9±0,8 4,0±0,3† 3,8±0,2† 4,3±0,2† 4,1±0,5†

Índice Alfa

(BF, ms/mmHg)

1,0±0,1 0,4±0,04* 0,8±0,07 1,4±0,20†‡ 1,1±0,10† 1,1±0,20† 1,4±0,1†‡

RESULTADOS

59

Valores expressos como média ± EPM. ANOVA de dois caminhos e pós-hoc de

Bonferroni. DP-IP - Desvio padrão do intervalo de pulso; Var-PI - Variância do intervalo

de pulso; RMSSD - Raiz quadrada da média das diferenças dos intervalos RR sucessivos;

BF - Banda de baixa frequência; AF - Banda de alta frequência; Var-PAS – variância da

pressão arterial sistólica; BF - Banda de baixa frequência; Índice Alfa – barorreflexo

espontâneo. * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI.

4.6. Concentração de citocinas inflamatórias

As avaliações das citocinas inflamatórias, foram realizadas somente no ventrículo

esquerdo e no sóleo dos animais. Podendo observar que as concentrações de IFN-γ

(Figura 12) e IL-6 (Figura 13) estavam aumentados no grupo SI em relação ao C. O

tratamento com piridostigmina e os treinamentos físicos aeróbico e resistido, previamente

ao IM, foram eficazes em prevenir o aumento de IFN-γ e IL-6 nos grupos SPI (só o IFN-

γ), TAI, TRI e TRPI em relação ao SI. No entanto, o grupo TAPI apresentou redução

adicional dos níveis de IFN-γ em relação aos grupos C, SI, SPI, TAI e TRI. No que tange

aos valores de IL-6, ambos os grupos treinados e tratados (TAPI e TRPI) apresentaram

redução dessa citocina em relação a todos os grupos experimentais.

Os níveis de IL-1β (Figura 14) foram reduzidos nos grupos TAI em relação ao SI.

Já os grupos TAPI e TRPI mostraram redução adicional dessa variável em relação aos

grupos C, SI e SPI. O grupo TRI evidenciou uma redução da IL-1β em comparação aos

grupos SI e SPI.

Em relação ao TNF-α (Figura 15), os animais TAI apresentaram uma redução dos

níveis dessa citocina em relação ao grupo SPI. Já o grupo TRI, mostrou diferenças com

os grupos SI, SPI e TAI. Por outro lado, os grupos treinados e tratados (TAPI e TRPI)

RESULTADOS

60

mostraram redução adicional dessa variável em relação aos grupos C, SI, SPI, bem como

se comparados aos seus respectivos controles não tratados (TAI e TRI, respectivamente).

A concentração de IL-10 (Figura 16) foi aumentada no grupo SPI quando

comparado aos grupos C e SI. Os grupos TAI e TRI evidenciaram uma redução dessa

variável se comparados aos grupos SI e SPI. Já nos grupos TAPI e TRPI, foram

observadas reduções dos níveis de IL-10 em relação ao C, SI e SPI. No entanto, vale

ressaltar que o grupo TRPI apresentou uma redução adicional dessa variável em

comparação ao TAI e TRI.

Figura 12. Concentração de IFN-γ – interferon gama no ventrículo esquerdo dos






0

5

10

15

20

25

30

35

40


pg

/ g

pro

t

*

††

*†‡¥

†£ †

RESULTADOS

61

Figura 13. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no ventrículo esquerdo dos grupos






0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


*

†

*†‡¥

†‡£

*†‡¥$

pg

/ g p

rot

RESULTADOS

62

Figura 14. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no ventrículo esquerdo dos




infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI.

0

20

40

60

80

100

120

140

160


†

*†‡

†‡

*†‡

pg/

g p

rot

RESULTADOS

63

Figura 15. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no ventrículo

esquerdo dos grupos Controle Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR

+ infarto (SPI), Treinamento aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR

+ infarto (TAPI), Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido +

PIR + infarto (TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs.

TAI; £ vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


‡

*†‡¥

†‡£

*†‡¥$

pg

/ g p

rot

RESULTADOS

64

Figura 16. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no ventrículo esquerdo dos






Em relação ao sóleo, a expressão de IFN- oi reduzida nos grupos TAI, TAPI e

TRI em comparação aos grupos não treinados (C, SI e SPI). No entanto, houve aumente

significante no grupo TRPI em elação aos grupos TAI, TAPI e TRI.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


*†

†‡

*†‡

†‡

*†‡¥$

pg

/ g p

rot

RESULTADOS

65

Figura 17. Concentração de IFN-γ – interferon gama no Sóleo dos grupos Controle

Sham (C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento

aeróbico + infarto (TAI), Treinamento aeróbico + PIR + infarto (TAPI),

Treinamento resistido + infarto (TRI), Treinamento resistido + PIR + infarto


TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.

Já na IL-6 e IL1- (Figura 18 e 19, respectivamente) os grupos associação TAPI

e TRPI diminuíram em relação aos grupos C, SI e SPI, mas vale ressaltar que os grupos

treinamento isolado (TAI e TRI) apresentaram redução acentuada em relação aos

demais.

0

2

4

6

8

10

12

14

16


pg/µ

g p

rot

*†‡

‡

*†‡

¥£$

RESULTADOS

66

Figura 18. Concentração de IL-6 – interleucina 6 no sóleo dos grupos Controle Sham

(C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento





Figura 19. Concentração de IL-1β – interleucina 1 beta no sóleo dos grupos Controle


0

15

30

45


pg/µ

g p

rot

*†‡

†‡¥

*†‡£

*†‡¥$

0

20

40

60

80

100

120

140


pg/µ

g p

rot *

*

*†‡

†‡¥

*†‡£

†‡¥$

RESULTADOS

67



(TRPI). * P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI.

Nos resultados de TNF-α e IL-10, o grupo SPI e TRI tiveram aumento em ambas

em relação aos demais grupos. No entanto, o grupo SPI com aumento adicional.

Figura 20. Concentração de TNF-α – fator de necrose tumoral alfa no sóleo dos




infarto (TRPI). *P<0,05 vs. C; † P<0,05 vs. SI; ‡ P<0,05 vs. SPI; ¥ P<0,05 vs. TAI; £

vs. TAPI; $ P<0,05 vs. TRI.

0

5

10

15

20

25


pg/µ

g p

rot

*†

‡ ‡

*‡¥£

‡$

RESULTADOS

68

Figura 21. Concentração de IL-10 – interleucina 10 no sóleo dos grupos Controle






Na relação IL-10/TNF-α no ventrículo esquerdo, representados na Figura 22, os

grupos associação (TAPI e TRPI) apresentaram aumento adicional em relação ao

grupos C, SI, SPI, Tai e TRI. Enquanto o grupo TRI estava reduzido quando comparado

ao TAPI. Já no tecido muscular (sóleo) houve aumento em todos os grupos

experimentais (SPI, TAI, TAPI, TRI, TRPI) em relação aos controle (C e Si), sendo que

o treinamento aeróbio isolado (TAI) teve aumento adicional em relação aos demais

grupos.

0

5

10

15

20


pg/µ

g p

rot

*†

‡

‡‡

‡¥

RESULTADOS

69

Figura 22. Relação IL-10/ TNF-α no ventrículo esquerdo (VE) e no sóleo dos grupos






Para avaliar o perfil inflamatório sistêmico foram analisadas interleucinas no soro.

E como resultado, houve redução significante da IL- 6 nos grupos tratados (SPI, TAPI e

TRPI) com redução adicional evidenciada no grupo SPI. Sendo que somente os grupos

SI e TRI apresentaram redução da IL-10, enquanto os grupos associação (TAPI e TRPI)

apresentaram aumento significante dessa varável.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

VE SÓLEO


†

*†‡

†¥

*‡¥£¥$

*†

£

*

RESULTADOS

70

Figura 23. Concentração de IL-6 – Interleucina 6 no soro dos grupos Controle Sham

(C), Sedentário + infarto (SI), Sedentário + PIR + infarto (SPI), Treinamento





0

0,5

1

1,5

2


pg/µ

g p

rot

*†

†‡

*†¥†‡

*†‡¥

RESULTADOS

71

Figura 24. Concentração de IL-10 – Interleucina 10 no soro dos grupos Controle






0

0,05

0,1

0,15

0,2


pg/µ

g p

rot

*

†

£

†$

DISCUSSÃO

72

5. DISCUSSÃO

Este estudo avaliou os efeitos preventivos da estimulação colinérgica por

tratamento com brometo de piridostigmina associado ou não ao treinamento físico

aeróbio/resistido em ratos submetidos ao infarto do miocárdio sobre a função autonômica

cardiovascular, função ventricular e marcadores inflamatórios. Dessa forma, o

treinamento físico associado com o tratamento farmacológico foi capaz de prevenir os

efeitos deletérios causados pelo infarto do miocárdio, bem como, a diminuição da

capacidade física, da modulação autonômica, com normalização das bandas de baixa e

alta frequência, reduzida da variabilidade da FC e potencializar a sensibilidade

barorreflexa cardíaca, pela aumento da resposta taquicárdica, modificando o

comportamento tônico para o coração, reduzindo a disfunção ventricular, assim como,

marcadores pró-inflamatórios no tecido cardíaco.

O treinamento físico tem sido extensivamente investigado por promover efeitos

positivos, e portanto, reduzir diferentes fatores de risco para doença arterial coronariana.

Por outro lado, a inibição da acetilcolinesterase, por meio do brometo de piridostigmina

também tem sido investigado por apresentar um potencial benéfico em algumas

patologias, dentre elas, a insuficiência cardíaca, no qual tem demonstrado promover

melhora na função cardíaca (97).

Os principais achados do treinamento físico prévio ao infarto do miocárdio foram

que o treinamento aeróbio foi mais eficaz em manter a performance miocárdica e reduzir

o drive simpático adicionalmente ao exercício resistido. No entanto, ambos os

treinamentos apresentaram mecanismos cardioprotetores, uma vez que foram eficientes

em reduzir a hiperatividade simpática, considerando que a variabilidade cardiovascular

em pacientes com insuficiência cardíaca tem sido utilizada como marcador de risco de

eventos arrítmicos graves e de mortes cardíacas associadas disfunção cardíaca (26)(51),

DISCUSSÃO

73

bem como a redução de concentração de citocinas inflamatórias no ventrículo esquerdo.

Ainda que tais efeitos pareçam ser benéficos, o tratamento com o brometo de

piridostigmina foi capaz de melhorar a disfunção ventricular esquerda, assim como as

alterações morfológicas observadas nos ratos infartados.

O infarto do miocárdio, por oclusão coronariana pode gerar uma dilatação

ventricular aguda, caracterizada pela distensão da região infartada. Essa alteração é

consequência do deslizamento de grupos musculares necróticos devido à desintegração

do colágeno interfibrilar, em que também se observa um acúmulo anormal de colágeno

(105), cujas alterações morfológicas levam ao remodelamento cardíaco. Por

consequência, a interrupção do metabolismo aeróbico no coração leva à produção

inadequada de fosfato de creatinina e trifosfato de adenosina e acúmulo de produtos de

degradação. Tais alterações induzidas pelo IM leva a perda de contratilidade e morte de

cardiomiócitos (106). No entanto, tais alterações são potencialmente reversíveis por conta

da morte celular não ser imediata, pois apenas a isquemia intensa, por pelo menos 20-30

minutos, leva a necrose dos cardiomiócitos (107).

Autores já observaram que os exercícios físicos causaram alterações

morfofuncionais. Em que o TF de predomínio aeróbio estimula a hipertrofia cardíaca

excêntrica, que por consequência melhora contratilidade refletindo na função sistólica,

prevenindo assim eventos cardíacos. Enquanto o treinamento de força, em virtude da

sobrecarga de pressão no ventrículo esquerdo, induziu hipertrofia concêntrica, que

resultou em aumento no diâmetro dos miócitos pela adição de novos sarcômeros. No

entanto, ambos tiveram hipertrofia cardíaca fisiológica mediadas pelo treinamento físico

(108 e 109).

DISCUSSÃO

74

Conforme a literatura, o treinamento físico é um importante auxilio na prevenção

e manejo das doenças cardiovasculares por agir em diferentes fatores de risco e assim

prover benefícios inerente ao seu estimulo. Tanto estudos com treinamento de natação ou

em esteira apresentaram importantes resultados, como a ausência de disfunção ventricular

(98), como a atenuação da disfunção cardíaca e da capacidade física (79). O que vale

ressaltar que neste estudo o TF aeróbio também foi capaz de manter a morfologia do

ventrículo esquerdo preservada, o que refletiu na manutenção da função sistólica e

diastólica. Ainda que o TF prévio tenha evitado a amplitude de alguns dos efeitos

deletérios advindos da isquemia miocárdica, tais resultados não são unânimes, isso

porque Brooks et al., (1987) em seu estudo, cujo os animais foram treinados previamente

ao IM, não observou nenhuma alteração responsiva que promovesse cardioproteção

Em relação a inibição da acetilcolinesterase pelo brometo de piridostigmina, que

aumenta a disponibilidade de acetilcolina na fenda sináptica, via receptores muscarínicos

e nicotínicos e inibição da adenilato-ciclase, exerce efeitos inotrópicos positivos ou

negativos, podendo reduzir a contratilidade miocárdica.

Ao que tudo indica, a ausência de consenso a respeito dos desfechos protetores do

TF prévio está relacionada ao tipo de treinamento. Isso porque Freimann (76), depois de

7 dias de treinamento de natação (aeróbio) observou redução na área de infarto, assim

como redução do colágeno por diminuição da apoptose (9), que por sua vez está

relacionada ao aumento de colaterais que promove a alteração do fenótipo cardíaco. No

entanto, nem o protocolo de TF aeróbio e nem o TF resistido aplicado em nosso estudo

foram eficientes em reduzir a área de IM. Embora os grupos que foram tratados e

treinados com o brometo de piridostigmina apresentaram uma menor área de infarto.

DISCUSSÃO

75

No que tange o TF resistido houve um aumento da espessura relativa da parede e

da massa do VE por características do tipo de treinamento, ainda que o aplicado neste

estudo tenha sido treinamento resistido dinâmico. Caracterizada uma hipertrofia

ventricular, os grupos resistidos não mantiveram função sistólica normalizadas,

observado pela redução da fração da ejeção e aumento da relação E/A.

Tais adaptações advindas do TF podem estar relacionadas ao volume de

treinamento e entre os tipos, aeróbio e resistido. Isso porque estudo anterior do nosso

grupo (29), cujo o TF resistido foi de alta intensidade (80%) apresentou um aumento de

miócitos do VE e da expressão de SERCA2.

Neste protocolo experimental observamos que os grupos tratados com o brometo

de piridostigmina apresentaram menor incidência de isquemia, com menor área de IM.

Isso porque o aumento da biodisponibilidade da acetilcolina estaria associada a

diminuição da expressão de colágeno, o que contribui para a preservação dos

cardiomiócitos (100). Corroborando com a literatura, observamos também que a

administração do fármaco potencializou a redução do remodelamento e da disfunção

ventricular esquerda (101). Isso porque ambos TF associados ao tratamento

farmacológico apresentaram efeitos semelhantes tanto nas alterações morfométricas,

como funcionais.

A redução da área de IM também pode estar associada a bradicardia observada

nos grupos treinados associado ao brometo de piridostigmina. Isso porque, a estimulação

colinérgica aumentou a disponibilidade de acetilcolina no nó sinusal, que tem como

função iniciar o potencial de ação celular. Com a bradicardia, o período diastólico

aumenta, aumentando assim a perfusão coronariana. Esse aumento da reserva coronariana

DISCUSSÃO

76

ocasionada pelo TF prévio e com a estimulação colinérgica pode ter contribuído para um

melhor remodelamento cardíaco.

Neste estudo experimental, a cirurgia para a ligadura da artéria coronária

descendente anterior, ao provocar uma isquemia, levou a uma lesão do tecido cardíaco,

estabelecendo o infarto do miocárdio, caracterizado por uma redução da função sistólica

e da sensibilidade barorreflexa. Esta alteração no valor basal da FC está associada as

alterações significativas nos parâmetros de variabilidade cardiovascular. O tratamento

com brometo de piridostigmina modificou o comportamento da FC basal, mas não o da

PA, tanto em animais sedentários tratados, como treinados associados ao tratamento

farmacológico. Soares et al (2004) e Rocha et al. (2016) também encontraram redução da

FC em ratos saudáveis tratados com inibidor da acetilcolinesterase. Essa diminuição da

FC indica um deslocamento do controle autonômico cardíaco em direção a um

predomínio da atividade parassimpática e/ou uma atenuação da atividade simpática

cardíaca, ainda que não tenha alterado a frequência cardíaca intrínseca desses animais,

sendo que nos estudos anteriormente citados, ambos encontraram diferença na frequência

cardíaca intrínseca.

A possibilidade de deslocamento do controle autonômico se apresenta pela

alteração dos valores absolutos dos dois componentes espectrais de maior interesse, como

aumento da banda de alta frequência, representativa de modulação parassimpática, e

significativa redução da banda de baixa frequência, representativa de modulação

simpática em todos os grupos experimentais (tratados e/ou treinados), embora a relação

BF/AF esteja inalterada. No domínio do tempo, uma redução da variância ou do desvio

padrão (RMSSD - a raiz quadrada da variância) dos intervalos RR, é indicativa de uma

modulação vagal diminuída (26), o que foi expressivamente observada neste estudo.

Ainda que haja variabilidade individual dos parâmetros espectrais de variabilidade da

DISCUSSÃO

77

frequência cardíaca em ratos (117), a indução do infarto nos animais sedentários que não

foram tratados com brometo de piridostigmina e nem submetidos a nenhum treinamento

físico, apresentaram diferenças significantes quanto aos valores absolutos da

variabilidade total (VAR-IP), e demais parâmetros, como, os componentes espectrais BF

e AF.

No entanto vale ressaltar, que tais resultados expressivos a respeito da VFC foram

observados nos grupos combinados (treinamento + tratamento), e apenas o valore da

banda de AF estava aumentada no grupo sedentário tratado com brometo de

piridostigmina, indicando uma ação estimulante do fármaco sobre a modulação da

atividade vagal cardíaca por aumentar a biodisponibilidade sináptica de ACh no sistema

nervoso periférico, incluindo o sistema parassimpático (113).

Segundo o TASK FORCE, (1996), tais parâmetros espectrais também tiveram

essas medida em unidades normalizadas, no qual o procedimento de normalização

envolve o cálculo da contribuição relativa das bandas de BF e de AF para variância total.

No entanto, não foram encontradas diferenças estatísticas nos valores normalizados neste

estudo, assim como em trabalhos publicados, em que ratos foram infartados previamente

e a VFC analisada ao longo da evolução da doença, não apresentou alteração (116)(118).

O infarto do miocárdio é caracterizado por uma atividade simpática severamente

deprimida nos valores apresentados, dirigida tanto ao coração quanto aos vasos, bem

como uma reduzida atividade vagal cardíaca (115). A possível explicação para esse

comportamento, em que os valores da banda de BF se apresentam saturados, seria a

reduzida responsividade do nó sinusal ao estimulo simpático ou ainda pela perda do

comportamento oscilatório decorrente da saturação de potenciais de ação conduzidos

pelas fibras simpáticas (114). No presente estudo, esse comportamento também foi

DISCUSSÃO

78

observado, em que os valores representativos de modulação simpática para o coração,

banda de BF estava significantemente reduzido, o qual foi normalizado pela intervenção

do treinamento aeróbio e pela associação com o tratamento farmacológico.

Nossos resultados demonstraram que nenhuma intervenção proposta neste estudo

alterou a FC intrínseca, no entanto, o TF aeróbio aumentou a sensibilidade barorreflexa.

E essa melhora na regulação da sensibilidade barorreflexa pode ter contribuído para

prevenção da hiperatividade simpática cardíaca. Como a sensibilidade barorreflexa está

diminuída nos grupos sedentários, isto reforça a relação entre a diminuição dos

pressorecpetores estarem contribuindo para a saturação da modulação simpática após o

IM.

Ainda que o TF resistido não tenha apresentado melhora na sensibilidade

barorreflexa, a resposta bradicárdica estava aumentada no grupo associação (treinamento

+ tratamento), possivelmente por influência do fármaco, cujas células do nó sinusal que

faz a regulação batimento-a-batimento da frequência cardíaca seja principalmente

controlada pelo nervo vago. Refletindo assim, na modulação parassimpática e do tônus

vagal, devido à sua resposta de transdução de sinal mais rápida por efeito da inibição da

acetilcolinesterase. Tais achados demostram que o treinamento resistido associado ao

brometo de piridostigmina foi eficaz em aumentar os parâmetros representativos de

modulação vagal, como RMSSD, Banda de alta frequência, índice α e tônus vagal.

Tal relação, entre a melhor regulação da sensibilidade barorreflexa associada a

melhor modulação autonômica e tônica para o coração, foi diretamente responsiva ao

treinamento físico, entretanto, o TF aeróbio foi determinante na amplitude dos benefícios,

bem como o tratamento com o brometo de piridostigmina quando associado ao TF

resistido.

DISCUSSÃO

79

Sabemos que o infarto do miocárdio desencadeia uma reação inflamatória, que

por sua vez pode influenciar nas alterações morfofuncionais e que é responsável pelo

reparo cardíaco. A cicatrização do tecido danificado pela morte de cardiomiócitos

induzido pela isquemia passa pela fase inflamatória, que é determinada pela ativação de

quimiocinas e citocinas que vão recrutar leucócitos, neutrófilos e macrófagos para região

necrosada (123). Os macrófagos por sua vez são responsáveis pela remoção das células

mortas e pela liberação de citocinas e fatores de crescimento. Nessa fase, há uma

diminuição dos mediadores inflamatórios e um aumento de fibroblastos e células

endoteliais aumentando a micro vascularização. É postulado que as alterações

moleculares e celulares levam a mudanças estruturais associadas a cicatrização da área

infartada influenciando o remodelamento ventricular (123).

A hipoperfusão miocárdica leva ao desbalanço redox, aumentando as espécies

reativas de oxigênio em que se inicia a desregulação da cascata da inflamação. (103-104).

No entanto, o exercício aeróbio pode contribuir para atenuação da disfunção contrátil, da

necrose e do desbalanço oxidativo advindos do infarto do miocárdio(125). A resposta

positiva ao exercício físico é explicado pela capacidade do músculo cardíaco em adaptar-

se a sobrecarga hemodinâmica mediada pelas respostas citoprotetoras dos miócitos (37).

Dessa forma, observamos que tanto o TF aeróbio, assim como o resistido prévio

impediram o aumento na concentração de citocinas como TNF-α, IFN-, IL-1 e IL-6 no

tecido cardíaco, que por sua vez estão envolvidas no remodelamento cardíaco, assim

como no aumento da função ventricular. No entanto, na literatura, as espécies reativas de

oxigênio produzidas durante o exercício elevam a sinalização de TNF-α e IL-1β, porém

isso se dá na fase tardia da cardioproteção (128). Mas vale ressaltar que neste estudo, os

grupos associados ao brometo de piridostigmina apresentaram redução adicional na

concentração de IFN- e da IL-6. Isso porque o treinamento físico aumenta a atividade

DISCUSSÃO

80

enzimática mitocondrial, induzindo um fenótipo resistente a apoptose (126). Assim, os

efeitos multifuncionais e contraditórios das citocinas dificultam a interpretação do

impacto funcional frente a isquemia miocárdica.

Ou seja, o TF isoladamente se mostrou eficaz em reduzir as concentrações de

marcadores inflamatórios após o IM, no entanto, tal benefício foi potencializado quando

associado os diferentes tipos de TF ao tratamento com o brometo de pridostigmina. A

potencialização observada também foi evidenciada por ROCHA et al (102), cujo o

aumento na estimulação colinérgica pela piridostigmina aumentou o recrutamento de

citocinas anti-inflamatórias após 3 dias do IM, ainda que administração do inibidor de

acelticolinesterase após o IM não tenha alterado a expressão de CD4+ e CD8+ em células

no miocárdio infartado e peri-infartado, mas observaram que houve aumento de

Linfócitos T (células Treg) no sangue periférico (102).

Hanemaaijer et al (1993) sugerem que mediadores inflamatórios e citocinas sejam

regulados centralmente. Contudo, a inibição dos marcadores inflamatórios observados

neste estudo, como a redução do TNF-α observada nos grupos treinados/tratados estaria

relacionada ao aumento do tônus vagal e da banda de alta frequência, representativo de

modulação parassimpática. Isso porque o brometo de piridostigmina faz uma estimulação

seletiva pelo agonista da subunidade α-7 do ramo periférico da via anti-inflamatória

colinérgica. Essa interação foi descrita por Tracey (2002) como “reflexo-inflamatório”,

cuja a proposta é de que a modulação inflamatória deve ocorrer pela ativação eferente do

nervo vagal, liberando ACh que estimula macrófagos inibindo a produção de citocinas

pró-inflamatórias, obtendo como reflexo a resposta parassimpática aos órgão reguladores

do sistema imunológico.

DISCUSSÃO

81

Portanto, além da estimulação vagal, a inibição da acetilcolinesterase também se

mostrou eficaz em reduzir a produção de citocina pró-inflamatórias como demonstrado

em estudo com modelo animal de Sepsi (110). Em que tanto fibras ascendentes como as

descendentes vagais informam ao sistema nervoso central do estado inflamatório dos

tecidos modulando a resposta inflamatória (110).

Recentemente, tem sido questionado que sistema colinérgico anti-inflamatório

tenha como responsável a estimulação vagal mediado pelo baço, uma vez que fibras

colinérgicas não foram encontradas no baço (110). Tal reflexão foi observada pela

presença de receptores α7nAcCoR nos neurônios pós-ganglionares simpáticos do gânglio

celíaco. Assim, a estimulação vagal libera ACh que, via α7nAcCoR, ativa neurónios

simpáticos pós-ganglionares no gânglio celíaco. E como um ciclo, as fibras nervosas

seguem do nervo esplênico modulando a função das células imunes do baço via receptores

adrenérgicos. (110 e 111). Corroborando com os achados de Rocha et al, em que a

regulação celular de linfócitos T, culminando com a liberação de ACh estariam atuando

em macrófagos esplênicos.

Assim, evitando a hiperatividade simpática, mediada pelos receptores β-

adrenérgico, entende-se que estimulação vagal, induzida pelo tratamento com brometo de

piridostigmina produziu um efeito anti-inflamatório por aumento da libertação de

catecolaminas no baço e consequente estimulação de receptores β2 adrenérgicos.

Contudo, a ativação do sistema vagal parece induzir um efeito predominante anti-

inflamatório, ainda que haja uma importante supressão da resposta inflamatória mediada

pelo sistema simpático (110).

Dessa forma, o treinamento físico associado ao fármaco inibidor da

acetilcolinesterase pode ser uma importante ferramenta na manutenção de

DISCUSSÃO

82

barorreceptores no controle do sistema nervoso autonômico cardíaco e no remodelamento

cardíaco, uma vez que a melhora da sensibilidade barorreflexa, simpatoinibidor, foi

correlacionada com o aumento da angiogênese na isquemia miocárdica (102- 21).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

83

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Assim, o efeito preventivo da estimulação colinérgica por brometo de

piridostigmina associado ao treinamento físico sobre a função ventricular e a modulação

autonômica cardiovascular associada a marcadores inflamatórios no modelo animal de

infarto do miocárdio, evidenciaram melhora da capacidade aeróbia, em que também

houve prevenção da perda de capacidade física após IM e no remodelamento ventricular,

onde a associação de treinamento / tratamento reduziu o impacto na disfunção do VE e

na morfometria cardíaca. Assim como, o aumento na modulação vagal devido ao

tratamento com o brometo de piridostigmina associado com o TF sugerem que os efeitos

anti-inflamatórios associados ao fármaco colinérgico são dependentes.

Demonstrando que o tratamento com o brometo de piridostigmina está associado

a melhora da modulação vagal e a menor inflamação tecidual relacionada ao sistema

colinérgico e imunológico. Tais alterações não foram associados a melhora

hemodinâmica, mas com aumento da sensibilidade barorreflexa induzida pelo TF aeróbio

foi possível estabelecer a bradicardia de repouso nos animais treinados.

No presente estudo, o TF resistido, isoladamente, não evidenciou importantes

alterações preventivas ao IM em ratos. No entanto, TF resistido tem demonstrado um

papel importante tanto na composição corporal, como na capacidade física e na qualidade

de vida, prevenindo e atenuando os fatores de risco para as DCV.

Portanto, o treinamento físico associado a inibição da acetilcolinesterase são

estratégias viáveis para futuros ensaios clínicos que podem melhorar os resultados em

pacientes.

REFERÊNCIAS

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faculdade de ciÊncias biolÓgicas e da saÚde … · jesus miranda, meu muito obrigada ... bom...

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