fabiana ramos nascimento · poderoso refúgio, quem o descobriu, ... de ultrassom, forneceu um...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
FABIANA RAMOS NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DO SOLVENTE E DAS CONDIÇÕES DE PROCESSO PARA A
EXTRAÇÃO DIFERENCIAL DE ISOFLAVONAS E SAPONINAS DA SOJA
RIO DE JANEIRO
2013
Fabiana Ramos Nascimento
AVALIAÇÃO DO SOLVENTE E DAS CONDIÇÕES DE PROCESSO PARA A
EXTRAÇÃO DIFERENCIAL DE ISOFLAVONAS E SAPONINAS DA SOJA
Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone
RIO DE JANEIRO
2013
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Ciências de Alimentos, Instituto de Química, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre
em Ciência de Alimentos
N244
Nascimento, Fabiana Ramos.
Avaliação do solvente e das condições de processo para a extração
diferencial de isoflavonas e saponinas da soja / Fabiana Ramos
Nascimento. -- Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2013.
96f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em
Ciência de Alimentos, Rio de Janeiro, 2013.
Orientador: Daniel Perrone.
1. Soja. 2. Saponinas. 3. Extração diferencial de Isoflavonas. 4.
Planejamento de Experimentos. I. Perrone, Daniel. (Orient). II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química.
Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. III. Título.
CDD: 664.001
AVALIAÇÃO DO SOLVENTE E DASCONDIÇÕES DE PROCESSO PARA A
EXTRAÇÃODIFERENCIAL DE ISOFLAVONAS E SAPONINAS DA SOJA
Fabiana Ramos Nascimento
Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós graduação em Ciências de
Alimentos, do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências de Alimentos.
Aprovada por:
Rio de Janeiro
2013
_______________________________________________________
Presidente, Prof. D.Sc. Daniel Perrone Moreira, IQ/UFRJ
______________________________________________________
Prof.D.Sc. Maria Alice Zaur Coelho, EQ/UFRJ
_____________________________________________________
Prof. D.Sc. Ronoel Luiz de Oliveira Godoy, Embrapa/CTAA
Dedico a meus pais, em especial minha amada e querida mãe,
que com amor incondicional permaneceu firme em meu auxílio.
A minha avó materna (in memoriam) que pelo seu exemplo de luta e coragem até o fim
me impulsionou a continuar e completar esta árdua tarefa.
AGRADECIMENTOS
À Deus, meu Senhor, que me concedeu fortaleza, saúde e ânimo.
Aos meus avós paternos e maternos (in memoriam) que com todo esforço, amor e dedicação
geraram e criaram seus filhos que hoje chamo de pais.
Aos meus pais Paulo Cesar e Telma, por todos os ensinamentos, amor e “puxões de orelha”,
agradeço por serem o alicerce de minha vida e minha história.
Ao meu querido irmão Paulo, com quem aprendi o que é viver em comunhão com o próximo,
não é fácil, mas é bom demais, Te amo!
À minha pequena princesa Camila, que trouxe muita alegria à minha vida!
À minha família, meus primos e primas, tios e tias, minha madrinha Hélia e meu padrinho
Pedro (in memoriam), minha cunhada querida e meus bebês Renan, Maria Rosa e Bernardo,
obrigado por estarem presentes em minha vida.
Ao professor Daniel Perrone pela oportunidade, confiança, além do valioso auxilio e
motivação para que pudesse enfrentar os desafios impostos pela pesquisa científica. Obrigada
por toda a atenção, disponibilidade, paciência e dedicação em me orientar em todos os
momentos.
Aos professores Alexandre Guedes e Verônica Calado, que estiveram sempre presente e
disponíveis para auxiliar-me.
Aos meus amigos, em especial Vanessa Rezende, Suellen Gomes, Karla Leal, Vivianne
Magalhães, Nathalia Sales e Fabricio Oliveira, o que seria de mim sem vocês, não tem como
retribuir em palavras todo o bem que me fazem! Como diz a escritura: “Amigo fiel é um
poderoso refúgio, quem o descobriu, descobriu um tesouro...” (Eclo 6, 14).
A equipe LBNA: Nivea, André, Michele, Gisele, Juliana, Vanessa Naciuk obrigada pela
ajuda, troca de experiências e companhia durante esses dois anos.
Ao CNPq pelo apoio financeiro;
A todos que contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigada!
“Combati o bom combate, terminei a minha corrida, conservei a fé.”
2 Timóteo 4:7
“Do meu telescópio eu via Deus caminhar!
A maravilhosa disposição e harmonia do universo só pode
ter tido origem segundo o plano de um Ser que tudo sabe e tudo pode.
Isto fica sendo a minha última e mais elevada descoberta”.
Isaac Newton
"Não te mandei eu? Esforça-te, e tem bom
ânimo. Não te pasmes, nem te espantes,
porque o Senhor teu Deus é contigo por
onde quer que andares."
Josué 1:9
RESUMO
Nascimento, Fabiana Ramos. AVALIAÇÃO DO SOLVENTE E DAS CONDIÇÕES DE
PROCESSO PARA A EXTRAÇÃO DIFERENCIAL DE ISOFLAVONAS E
SAPONINAS DA SOJA. Rio de Janeiro, 2013. Dissertação (Mestrado em Ciência de
Alimentos). Instituto de Química Universaidade Federal do Rio de Janeiro.
Os potenciais efeitos benéficos à saúde associados ao consumo da soja e de seus subprodutos
estão relacionados aos compostos bioativos presentes, em especial isoflavonas e saponinas.
Entretanto, a classe de compostos responsável por um dado efeito biológico não está ainda
esclarecida. Portanto, é de grande interesse a obtenção de extratos de soja contendo classes
específicas de fitoquímicos. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi avaliar a composição
do solvente e as condições de processo para a extração diferencial de isoflavonas e saponinas
da soja. Para tal, foi empregado um planejamento de misturas (água: 0 a 100%; etanol: 0 a
100%; acetato de etila: 0 a 40%) acoplando a um planejamento fatorial completo (tempo de
extração em vortex: 2 a 6 min; ultrassom: 0 a 5 min). A extração com uma mistura ternária
composta por água, etanol e acetato de etila (40:40:20), por 2 min em vortex e sem emprego
de ultrassom, forneceu um extrato contendo os teores máximos de saponinas, flavonoides e
compostos fenólicos. Apesar do baixo rendimento, a extração com etanol puro, por 2 min em
vortex e sem uso de ultrassom, permitiu a obtenção de um extrato enriquecido
diferencialmente em saponinas. A aplicação dessas condições de extração em experimentos
em maior escala (tempo de extração em agitador orbital: 15 a 120 min; ultrassom: 0 a 5 min)
permitiu obter-se um extrato rico em saponinas (6,5 mg/g), flavonoides (1,3 mg EG/g) e
compostos fenólicos (1,6 mg EAG/g) e um outro extrato enriquecido diferencialmente em
saponinas (3,3 mg/g) em relação a flavonoides (0,42 mg EG/g) e isento de compostos
fenólicos. Esses extratos foram caracterizados em detalhe por CLAE-DAD-EM. No extrato
obtido com a mistura ternária, foram determinados os teores de 9 compostos fenólicos
minoritários, sendo 6 deles identificados pela primeira vez em soja. Nesse mesmo extrato, o
teor de isoflavonas totais foi de 14,1 mg/g, 56 vezes maior do que aquele avaliado pelo ensaio
espectrofotométrico para flavonoides. Nos extratos etanólicos o teor máximo de saponinas foi
de 0,11 mg/g, 86 vezes menor do que aquele encontrado por meio do ensaio
espectrofotométrico. A susceptibilidade desse método à presença de interferentes e a
avaliação de somente três saponinas pela técnica de CLAE-DAD-EM, poderiam explicar essa
discrepância. Dessa maneira, a seletividade do etanol para saponinas precisa ainda ser
confirmada em estudos futuros.
Palavras-chave: Soja; Saponinas; Isoflavonas; Extração; Planejamento de Experimentos
ABSTRACT
Nascimento, Fabiana Ramos. EVALUATION OF PROCESS CONDITIONS FOR THE
DIFFERENTIAL EXTRACTION OF SOY ISOFLAVONES AND SAPONINS. Rio de
Janeiro, 2013. Dissertation (Master in Food Science). Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Brazil.
The potential health benefits associated with the consumption of soy and soy-based foods
have been mainly related to bioactive compounds present, mainly isoflavones and saponins.
However, the class of compounds responsible for a given biological effect is not yet clear.
Therefore, it would be of great interest to obtain extracts containing isolated classes of
specific soy phytochemicals. In this sense, the aim of this study was to evaluate the solvent
composition and process conditions for the differential extraction of soy isoflavones and
saponins. For this purpose, we employed a mixture design (water: 0 to 100%; ethanol: 0 to
100%; ethyl acetate: 0 to 40%) coupled to a full factorial design (vortex extraction time: 2 to 6
min; ultrasound: 0 to 5 min). Extraction with a ternary mixture consisting of water, ethanol
and ethyl acetate (40:40:20), for 2 min on vortex and without ultrasound bath, yielded an
extract containing maximum levels of saponins, flavonoids and phenolic compounds. In spite
of showing a low yield, extraction with pure ethanol for 2 min on vortex and without
ultrasound bath differentially extracted saponins. Application of these extraction conditions
on larger scale experiments (orbital shaker extraction time: 15 to 120 min; ultrasound: 0 to 5
min) yielded an extract rich in saponins (6.5 mg/g), flavonoids (1.3 mg GE/g) and phenolic
compounds (1.6 mg GAE/g) and another extract enriched differentially in saponins (3.3 mg/g)
in relation to flavonoids (0.42 mg GE/g), and free phenolic compounds. These extracts were
characterized in detail by HPLC-DAD-MS. In the extract obtained with the ternary mixture, 9
minor phenolic compounds were quantified, 6 of them identified for the first time in soybean.
In this extract, the content of total isoflavones was 14.1 mg/g, 56 times higher than that
measured by the spectrophotometric assay for flavonoids. In the ethanolic extracts, the
maximum content of total saponins was 0.11 mg/g, 86 times lower than those measured by
the spectrophotometric assay. The susceptibility of this method to the presence of interferents,
as well as the evaluation only three saponins by HPLC-DAD-MS, could explain this
discrepancy. Thus, ethanol’s selectivity towards saponins still needs to be confirmed in future
studies.
Keywords: Soy; Saponins; Isoflavones; Solvent extraction; Experimental design
Resumos publicados em anais e congressos:
1. Ramos, F.; Torres, A.G.; Perrone, D. Efeito de diferentes misturas de solventes na
extração diferencial de compostos fenólicos e saponinas de soja. XIX Congresso
Brasileiro de Engenharia Química (COBEQ), Búzios, Rio de Janeiro, 2012. Resumo
expandido aceito em 6 de julho de 2012.
2. Ramos, F.; Torres, A. G.; Perrone, D. Efect of binary solvent mixtures on the
differential extraction of soy phenolic compounds and saponins. XVI Congreso de
la Sociedad Latinoamericana de Nutrición (SLAN), Havana, Cuba, 2012. Trabalho
aceito em 30 de julho de 2012.
3. Ramos, F.; Silva, F.; Calado, V. M. A.; Torres, A. G.; Perrone, D. Antioxidant
capacity and differential extraction of phenolic compounds, flavonoids and saponins
from soy using mixture and factorial experimental designs. XVI Congreso de la
Sociedad Latinoamericana de Nutrición (SLAN), Havana, Cuba, 2012. Trabalho
aceito em 3 de agosto de 2012.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20 18
2.1. Soja 20 18
2.1.1 Histórico 20 18
2.1.2 Relevância econômica 22 19
2.1.3 Características gerais 23 20
2.2. Composição química da soja e de seus produtos comerciais 27 23
2.3. Compostos bioativos 33 29
2.3.1 Isoflavonas 35 31
2.3.2 Saponinas 34 32
2.3.3. Principais efeitos dos compostos bioativos no metabolismo 39 35
2.4. Extração de compostos bioativos de origem vegetal 45 41
2.4.1 Planejamento de experimentos: principais contribuições para a
otimização da extração diferencial
47 43
3. OBJETIVO 50 47
3.1. Objetivo geral 50 47
3.2. Objetivos específicos 50 47
4. MATERIAIS E MÉTODOS 51 48
4.1. Reagentes 51 48
4.2. Amostras 51 48
4.3. Extração diferencial de compostos bioativos 51 49
4.3.1. Estudo Preliminar 51 49
4.3.1.1. Misturas binárias de solventes 51 49
4.3.1.2. Extração 52 49
4.3.2. Planejamento de experimentos 52 49
4.3.2.1 Etapa de seleção de amostras 52 49
4.3.2.2.. Misturas ternárias de solventes 52
4.3.2.3. Extração 55 52
4.3.3. Extração com o reagente polivinilpirrolidona (PVP) adicionado
ao solvente
56 52
4.3.4. Extração em maior escala 56 53
4.4. Análise de compostos fenólicos totais por espectrofotometria 56 53
4.5. Análise de flavonoides totais por espectrofotometria 56 53
4.6. Análise de saponinas totais por espectrofotometria 57 54
4.7. Capacidade Antioxidante 58 54
4.8. Análise de isoflavonas e saponinas por CLAE-DAD-EM 59 55
4.9. Análise dos compostos fenólicos minoritários por CLAE-DAD-
EM
60 56
4.10. Análises estatísticas 61 57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 62 58
5.1. Estudo preliminar: extração com misturas binárias de solventes 62 58
5.2. Planejamento de experimentos: extração com misturas ternárias
de solventes
65 61
5.2.1. Seleção de amostras 65 61
5.2.2. Solventes selecionados 65 61
5.2.3. Efeito das diferentes misturas ternárias de solventes e dos
diferentes fatores associados
66 62
5.3. Avaliação dos extratos após extração em maior escala 74 70
5.4. Caracterização detalhada dos extratos obtidos após experimentos
em larga escala por CLAE-DAD-EM
77 72
6. CONCLUSÕES 83 79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84 80
LISTA DE SIGLAS
AHA American Heart Association
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agencia nacional de Vigilância Sanitária
ASA American Soybean Association
BBI Inibidor de Bowman-Birk
CLAE-DAD-EM Cromatografia de Alta Eficiência com detetor de arranjo de
Diodos acoplado a Espectrômetro de Massas
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
CPS Concentrados Proteicos de Soja
DDMP 2,3-dehidro-2,5-dihidroxi-6-metil-4(H)-pirano-4-ona
EAG Equivalente de Ácido Gálico
EG Equivalente de Genisteína
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAO Food and Agriculture Organization
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
HDL Lipoproteína de Alta Densidade
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPS Isolados Proteicos de Soja
KTI Inibidor de Kunitz
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
MSDS Material Safety Data Sheet
n.d. Não determinado
ND Não Detectado
PVP Polivinilpirrolidona
RDC Resolução da Diretoria Coligada
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
WHO World Health Organization
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Cultura de soja no Brasil 21
Figura 2: Produção mundial de soja 22
Figura 3: Morfologia da soja e características do grão de soja 23
Figura 4: Produtos e subprodutos da soja em grão 25
Figura 5: Estrutura química dos principais compostos fenólicos encontrados nos
vegetais
34
Figura 6: Estrutura química dos flavonoides 35
Figura 7: Estruturas químicas das isoflavonas da soja 36
Figura 8: Estrutura química do isopreno 36
Figura 9: Biossíntese de terpenos 37
Figura 10: Representação da estrutura química das saponinas da soja 38
Figura 11: Percentuais de extração de compostos fenólicos totais e saponinas, em
relação à condição máxima de extração, utilizando diferentes solventes puros e
misturas binárias.
64
Figura 12: Superfícies de resposta das variáveis dependentes (teor de saponinas
totais (A), flavonoides (B) e compostos fenólicos(C)) geradas pelo programa
Statistica 7.0.
71
Figura 13: Superfícies de resposta sobrepondo os valores de teor mínimo de
flavonoides (representado por ) e de compostos fenólicos (representado por )
sobre o valor de teor máximo de saponinas totais (representado por ), tendo como
ponto de convergência ideal para a obtenção de um extrato rico em saponinas e
pobre em compostos fenólicos o item representado pelo símbolo ( ).
72
Figura 14: Correlações entre os teores de saponinas totais, flavonoides e compostos
fenólicos e a atividade antioxidante medida pelos ensaios de TEAC e FRAP.
73
Figura 15: Correlação entre os ensaios de FRAP e TEAC 73
Figura 16: Teores de saponinas totais (A), flavonoides (B) e compostos fenólicos
(C) nos extratos obtidos na escala do planejamento de experimentos e em maior
escala, em diferentes condições de extração.
75
Figura 17: Influência do tempo de extração sobre os teores de saponinas totais (A) e
flavonoides (B) nos extratos obtidos nos experimentos em maior escala, utilizando
etanol puro como solvente.
76
Figura 18: Cromatogramas típicos por CLAE-DAD-EM da análise de isoflavonas e
saponinas nos extratos de soja obtidos com a mistura ternária (A) e com etanol (B).
78
Figura 19: Cromatogramas típicos por CLAE-DAD-EM da análise de compostos
fenólicos minoritários nos extratos de soja obtidos com a mistura ternária (A) e com
etanol (B).
81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição centesimal (g/100g, base seca) da soja e de seus
subprodutos.
27
Tabela 2: Composição em ácidos graxos (%) de diferentes cultivares de soja. 28
Tabela 3: Composição em carboidratos da soja em grão (g/100g, base seca). 29
Tabela 4: Teor de minerais da soja em grão. 30
Tabela 5: Teores de vitaminas da soja em grão. 30
Tabela 6: Composição média de aminoácidos das proteínas das cultivares de soja e
comparação com o padrão da FAO (1985).
31
Tabela 7: Misturas de solventes geradas pelo planejamento de misturas com
restrição
53
Tabela 8: Condições de extração geradas pelo planejamento fatorial completo com
ponto central.
54
Tabela 9: Experimentos gerados pela associação do planejamento de misturas com
restrição ao planejamento fatorial completo.
54
Tabela 10: Gradiente de eluição para análise de isoflavonas e saponinas por
CLAE-DAD-EM.
59
Tabela 11: Gradiente de eluição para análise de compostos fenólicos por CLAE-
DAD-EM.
60
Tabela 12: Teores de compostos fenólicos totais e saponinas em amostra de fibra
de soja submetida à extração com diferentes solventes puros e suas misturas
binárias.
62
Tabela 13: Teores de fenólicos totais e saponinas nas amostras comerciais de
produtos à base de soja submetida à extração com metanol 80%.
65
Tabela 14: Teores de saponinas, flavonoides e compostos fenólicos totais e razão
entre os teores de saponinas e compostos fenólicos (sap/fen) nos extratos obtidos a
partir do planejamento de mistura acoplado ao planejamento fatorial completo.
67
Tabela 15: Teores de saponinas (mg/g), compostos fenólicos (mg EAG/g) e
flavonoides (mg EG/g) em extratos selecionados do planejamento de misturas
associado ao planejamento fatorial completo.
70
Tabela 16: Teores de saponinas (mg/100g) nos extratos obtidos nos experimentos
em maior escala, utilizando diferentes solventes e tempos de extração
79
Tabela 17: Teores de isoflavonas (mg/100g) nos extratos obtidos nos experimentos
em maior escala, utilizando diferentes solventes e tempos de extração
80
Tabela 18: Teores de compostos fenólicos minoritários (mg/100g) nos extratos
obtidos nos experimentos em maior escala, utilizando diferentes solventes e tempos
de extração
82
18
1. INTRODUÇÃO
A soja (Glycine max L. Merrill) é uma semente oleaginosa pertencente à família
Fabaceae (Leguminosae) e tem sua origem atribuída ao continente asiático. De acordo com
dados da safra 2010/2011, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de soja
(IBGE, 2011). Projeções indicam que o Brasil se tornará, já em 2013, no maior produtor e
exportador mundial (Conab 2012/2013).
Nos países ocidentais, o consumo de soja é crescente e ocorre, principalmente, de
maneira indireta, através de produtos industrializados à base desse grão. Além disso, a soja e
os seus produtos também são consumidos por indivíduos vegetarianos, intolerantes à lactose
ou alérgicos à proteína do leite de vaca (Genovese & Lajoulo, 2002).
Estudos epidemiológicos indicam que consumo da soja e de seus subprodutos está
associado à redução da prevalência e à possível prevenção de algumas enfermidades crônico-
degenerativas (Potter, 1996). A associação entre a ingestão de produtos à base de soja e os
seus potenciais efeitos benéficos à saúde está relacionada aos compostos bioativos presentes
nestes produtos, em especial isoflavonas e saponinas (Genovese & Lajoulo, 2002).
As isoflavonas pertencem à classe dos flavonoides e apresentam atividade antioxidante,
efeitos cardioprotetores (Heim et al., 2002), além de serem consideradas fitoestrógenos, por
apresentarem atuação biológica similar ao hormônio estradiol (Adlercreutz et al., 1995). As
saponinas de soja são compostos glicosídeos complexos e sua porção aglicona apresenta
estrutura triterpenóide pentacíclica (Shi et al., 2004). Diversos efeitos benéficos relacionados
às saponinas da soja vêm sendo observados em estudo in vitro e em estudos com animais, tais
como: atividade hipocolesterolêmica (Potter et al., 1996); atividade anticâncer de cólon
(Wang & Nixon, 2001) e atividade antioxidante (Ruiz et al., 1996). Apesar dos diversos
efeitos biológicos relatados para as saponinas de soja, há uma relativa escassez de estudos
sobre esses compostos, o que se deve principalmente à limitação na obtenção de padrões
comerciais e à dificuldade analítica em função da sua complexidade estrutural.
Em 1999, a agência reguladora de alimentos e medicamentos dos EUA (FDA, Food
and Drug Administration) autorizou a utilização de uma alegação de saúde na rotulagem de
alimentos à base de soja, sobre os benefícios do consumo de proteína de soja na prevenção de
doenças cardiovasculares. A recomendação da FDA indica o consumo diário de 25 g de
proteína de soja para que tal benefício seja obtido. Já no Brasil, a ANVISA, por meio da
19
Resolução nº. 19 de 1999, permitiu a alegação de propriedade funcional para a proteína de
soja, devido ao seu potencial efeito benéfico na redução do colesterol (ANVISA, 1999).
Entretanto, os estudos clínicos com seres humanos que investigaram o efeito da
ingestão de fitoquímicos presentes na fração proteica da soja apresentaram resultados muitas
vezes contraditórios, principalmente aqueles relacionados ao efeito hipocolesterolêmico da
soja. O mecanismo no qual a proteína de soja, as saponinas ou as isoflavonas administradas
isoladamente atuam não são bem elucidados dependendo assim de mais informação sobre
qual fração bioativa da soja é responsável por determinado efeito benéfico.
Dessa maneira, seria de grande interesse a obtenção de extratos contendo classes
específicas de fitoquímicos, de forma a possibilitar a relação entre tal classe de compostos
(isoflavonas, saponinas ou outra) e posterior elucidação dos mecanismos moleculares
envolvidos. Uma das maneiras possíveis para a obtenção de tais extratos seria a extração de
alimentos à base de soja com diferentes misturas de solventes e em diferentes condições de
extração.
20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Soja
2.1.1. Histórico
A soja tem sua origem atribuída ao continente asiático, sobretudo nas regiões norte e
central da China, onde essas plantas rasteiras se desenvolviam principalmente ao longo do rio
Yang-Tsé (Hymowitz, 1970; Bonato & Bonato, 1987). As primeiras citações ao grão
aparecem no período entre 2883 e 2838 A.C., quando a soja era considerada um grão sagrado,
ao lado do arroz, do trigo, da cevada e do milheto. Um dos primeiros registros do grão está no
livro “Pen Ts’ao Kong Mu”, que descrevia as espécies botânicas chinesas a pedido do
Imperador Shen Nung (Hymowitz, 1970; Bonato & Bonato, 1987; Embrapa Soja, 2000).
A evolução da soja iniciou-se com o surgimento de plantas oriundas de cruzamentos
naturais entre duas espécies selvagens que foram domesticadas e melhoradas cientificamente,
principalmente na região oriental do Norte da China. Desde então, a soja começou a ser
introduzida no Sul da China e, com o fim da guerra entre China e Japão, a soja foi
disseminada por toda a Ásia, chegando à Coréia, ao Japão e a outros países do atual sudeste
asiático, porém registros indicam uma lenta expansão, apenas no século III D.C. (Hymowitz,
1970; Probst & Judd, 1973).
A propagação da soja rumo ao ocidente ocorreu principalmente após o
estabelecimento de rotas comerciais europeias marítimas e terrestres nos séculos XV e XVI.
O primeiro plantio experimental na Europa só ocorreu em 1739, quando o Jardim Botânico de
Paris recebeu sementes enviadas da China por missionários. Em 1790, foi cultivada pela
primeira vez no Jardim Botânico Real, em Kew, na Inglaterra (Shurtleff & Aoyagi, 2011). Na
Europa, em 1873, o professor Friedrich Haberlandt, da Universidade de Viena, obteve
dezenove variedades oriundas do Japão e da China, para exposição. Em 1876, foram
distribuídas sementes para vários países: Áustria, Alemanha, Polônia, Hungria, Suíça e
Holanda (Hymowitz, 1970; Bonato & Bonato, 1987; Shurtleff & Aoyagi, 2008).
No Ocidente, a primeira referência do comportamento genético da soja data de 1804
no Estado de Pensilvânia, EUA. No entanto, o interesse pelos produtores americanos iniciou-
se em 1880, quando o Departamento de Agricultura dos EUA iniciou testes em soja e
21
incentivou agricultores a plantá-la para o uso como ração animal (Hymowitz, 1970; Bonato &
Bonato, 1987; Shurtleff & Aoyagi, 2011).
Foi somente após o final da Primeira Guerra Mundial, em 1919, que o grão de soja se
tornou um item de comércio exterior importante. Em 1921, foi fundada a American Soybean
Association (ASA), um marco da consolidação da cadeia produtiva da soja em esfera mundial.
Em 1940, no auge do seu cultivo como forrageira, foram cultivados, nesse país, cerca de dois
milhões de hectares com tal propósito (Shurtleff & Aoyagi, 2011).
No Brasil, o cultivo foi introduzido em 1882 no Estado da Bahia por Gustavo D’utra.
Já no Rio Grande do Sul, trazida dos Estados Unidos, sua utilização restringiu-se à
alimentação suína até a década de 1950. Em 1957, ganhou rapidamente a adesão dos
produtores, devido ao bom preço, forte mercado consumidor e impacto à proteção da terra,
uma vez que durante o seu ciclo vegetativo, e por ser uma leguminosa, a soja enriquece o solo
fixando nitrogênio através de simbiose com bactérias (Bonato & Bonato, 1987; Franco,
2004). O melhoramento genético e as adaptações tecnológicas possibilitaram a introdução da
cultura em outras regiões e, desta maneira, a soja consolidou sua posição de maior cultura no
Brasil (Figura 1). Nesse contexto, sua importância econômica tornou-se muito expressiva,
gerando progresso e desenvolvimento para as diversas regiões de cultivo (Morais e Silva,
1996; Barbosa e Assumpção, 2001;).
Figura 1: Cultura de soja no Brasil
22
2.1.2. Relevância econômica
A soja é o quarto grão mais produzido mundialmente, atrás do milho, trigo e arroz.
Considerando-se a safra 2010/2011, os Estados Unidos são o país que detém a maior
produção mundial da oleaginosa, seguido do Brasil, segundo maior produtor e exportador
mundial do grão, e da Argentina, como observa-se na Figura 2 (Embrapa, 2010; FAO, 2010).
Figura 2: Produção mundial de soja (adaptado de FAOSTAT, 2012).
Dentre os principais estados produtores brasileiros, destacam-se Mato Grosso, Paraná
e Rio Grande do Sul. De acordo com dados do IBGE, em 2011 o crescimento da cultura
expandiu-se tão rapidamente que, em maio desse ano, a produção foi recorde, chegando a
74,3 milhões de toneladas (IBGE, 2011). A companhia Nacional de Abastecimento (Conab)
realizou algumas projeções para a safra 2012/2013, sendo estimados recordes de área plantada
e de produção, entre 80,1 milhões e 83,0 milhões de toneladas. Se tais estimativas forem
confirmadas, o Brasil se tornará o maior produtor e exportador mundial de soja (Conab
2012/2013).
75,3 milhões de toneladas
49 milhões de toneladas
Produção mundial de soja em grãos
Outros produtores mundiais
49,9 milhões de toneladas 19%
EUA 90,6 milhões de toneladas
34%
Brasil
28%
Argentina
19%
Safra 2010/2011 (264,8 milhões de toneladas)
23
2.1.3. Características gerais
A soja (Glycine max L. Merrill) é uma semente oleaginosa pertencente à família
Fabaceae (Leguminosae) e apresenta grande diversidade morfológica e genética devido ao
grande número de cultivares existentes, oriundos dos esforços científicos que buscaram
melhorar a produtividade e a resistência da soja à pragas e doenças (Horan, 1974). A soja é
uma leguminosa anual, com altura de 0,3 a 2,0 m, apresentando ramificação variada, com
ciclo de 80 a 200 dias. Nas raízes podem ser obsevados nódulos resultantes da simbiose entre
bactérias e a planta. Nestes nódulos ocorrem trocas como fornecimento de nitrogênio para a
planta e de carboidratos para a bactéria (Sediyama, et al., 1985).
Na Figura 3 observa-se que além das flores, a espécie é composta por um fruto, um
tipo de vagem achatada, reta e pouco curvada, com comprimento de 2 a 7 cm de largura
variando entre 1 e 2 cm. Sua coloração, quando madura, pode variar do amarelo-palha muito
claro, passando pelo cinza-claro até o quase preto (Sediyama et al., 1985). A semente da soja
é constituída por tegumento (parte externa), hilo (cicatriz deixada pela separação do fruto e da
semente) e cotilédones (primeiras folhas embrionárias, com função de armazenar nutrientes),
podendo apresentar variações quanto à forma, cor e tamanho. O cotilédone representa 90% do
peso da semente e contém praticamente todo o óleo e proteína do grão em suas estruturas
(Hymowitz & Newell, 1981; FAO, 1992; Seo, et al., 1993; Menezes, et al., 1997).
Figura 3: Morfologia da soja e características do grão de soja
Aproximadamente 90% da soja produzida no Brasil é utilizada como insumo para a
produção de ração animal e de óleos e gorduras. O consumo direto do grão de soja como parte
da dieta humana, apesar de ainda pequeno em países ocidentais, tem apresentado tendência
24
crescente, principalmente devido às investigações realizadas nas últimas décadas, que indicam
que o grão possui excelente composição nutricional e alto teor de fitoquímicos. Além disso, a
soja e os alimentos à base desse grão são amplamente utilizados como substitutos para a
proteína animal por indivíduos vegetarianos e crianças com alergia ao leite de vaca ou
intolerantes à lactose (FAO, 1997; AAP, 1998).
Os derivados da soja podem ser divididos em quatro grupos: produtos não
desengordurados, produtos do farelo desengordurado, produtos do óleo bruto e produtos de
tradição oriental (Figura 4) (Horan, 1974; Cabral & Modesta, 1981). Dentre os produtos não
desengordurados, destaca-se a farinha integral de soja, que é um produto obtido diretamente
dos grãos de soja e contém, no mínimo, 40% de proteína e 20% de lipídios. A composição
química da farinha integral de soja é muito variável, dependendo da variedade, das condições
de cultura, do armazenamento e do processamento. Outro produto desse grupo é o extrato
solúvel de soja, também conhecido como “leite de soja”, obtido por extração aquosa dos grãos
de soja. Nesse produto, para eliminar o sabor e o odor desagradáveis, provocados pela ação de
lipoxigenases, usam-se tratamentos adicionais, tais como remoção completa da casca,
trituração com água quente, maceração dos grãos com pH alcalino, trituração dos grãos com
ácidos, adição de flavorizantes, entre outros (ANVISA/CNNPA – nº 14, 1978).
Em relação aos produtos do farelo desengordurado, destacam-se a farinha e o farelo,
que são os produtos menos refinados das proteínas de soja. Ambos têm a mesma composição,
variando apenas o tamanho da partícula. São produtos normalmente utilizados como ração
para animais devido ao seu alto teor proteico (40 a 55% de proteína) e altos níveis de
aminoácidos essenciais, sendo excelente fonte de lisina. O tratamento térmico, usado para
inibir ou inativar fatores tóxicos, também melhora a biodisponibilidade de metionina,
considerado o aminoácido limitante do farelo de soja (Ferrari et al., 2005; Silva, 2006).
25
Figura 4: Produtos e subprodutos da soja em grão (Fonte: Endres, 2001).
26
Além disso, esses produtos são importantes para a indústria, sendo usados tanto para
enriquecer alimentos quanto na obtenção de concentrados proteicos de soja (CPS) e isolados
proteicos de soja (IPS). Quando empregado para uso humano, esses produtos precisam ser
submetidos a procedimentos especiais, com o objetivo de prevenir a desnaturação de
proteínas, o que resulta em uma coloração leve (Horan, 1974). Os CPS são obtidos a partir da
farinha desengordurada por lavagem com álcool etílico, água fervente ou ligeiramente
acidificada a pH 4,5, e contêm, no mínimo, 70% de proteínas. Nesse processo de lavagens,
componentes como açúcares simples, alguns minerais e o ácido fítico são arrastados,
deixando as proteínas e os carboidratos. Os CPS são utilizados na obtenção de produtos
cárneos, sopas e farinhas especiais (Horan, 1974). Os IPS são obtidos pela extração aquosa
das proteínas e recuperação por precipitação, seguida por secagem, e contêm, no mínimo,
90% de proteína. A proteína texturizada, denominada popularmente como “carne de soja”, é
utilizada pela indústria como ingrediente para a fabricação de embutidos, massas, molhos e
pães.
O óleo bruto, obtido a partir do grão extraído por solvente ou prensagem, apresenta
uma série de impurezas solúveis em gordura, cuja remoção é indispensável para proporcionar
adequado sabor, odor, aparência e estabilidade. Estas impurezas presentes no óleo cru são
lecitina, minerais (ferro, cobre e manganês), ácidos graxos livres, peróxidos e seus derivados,
e pigmentos (carotenos). O óleo refinado apresenta excelente valor comercial. A lecitina é
formada principalmente por fosfolipídios, sendo utilizada como emulsificante na produção de
margarinas e maionese, além de ser considerado um produto nutracêutico (Awazuhara et al.,
1998; Taylor & Kabourek, 2003).
Produtos obtidos a partir da soja in natura são os produtos tipicamente asiáticos,
como Shoyu (molho obtido após fermentação dos grãos de soja em mistura com cereais),
Misso (obtido pela fermentação de soja e cereais), Natto (menos consumido que os dois
primeiros), Tempeh, Tofu (alimento não fermentado da soja, cujas proteínas são coaguladas e
precipitadas por adição de sais de cálcio e magnésio, em geral sulfato de cálcio), além de
Kori-tofu, Yuba e Kinako (soja torrada, produzida a partir do grão descascado e livre de
impurezas, com aparência de um amendoim torrado). Dentre os produtos in natura não
característicos da dieta asiática, destaca-se a fibra de soja, preferencialmente do tipo solúvel
(30%), obtida a partir da extração do grão após maceração, utilizada especialmente na
dietoterapia e na indústria alimentícia (Taylor & Kabourek, 2003).
Outro subproduto obtido da industrialização do grão da soja que vem ganhando
destaque no cenário nacional devido à crescente produção brasileira é a casca de soja. Depois
27
de classificado e limpo, o grão de soja é seco até se alcançar cerca de 10% de umidade, fase
na qual este é submetido à quebra. Nessa etapa a casca se solta, correspondendo a cerca de 7 a
8% do peso do grão (Rhee, 2000). A casca de soja pode ser empregada como um suplemento
energético, usada principalmente como ração animal, por apresentar elevada digestibilidade
da sua fração fibrosa. Essa característica é atribuída principalmente aos baixos teores de
lignina e elevados de pectina (carboidrato estrutural da parede celular), o que proporciona sua
rápida e completa degradação no rúmen. A fração de carboidratos não fibrosos da casca da
soja é composta principalmente por pectina (62%), enquanto amido e açúcares simples estão
presentes em menor proporção (Rhee, 2000). Embora a soja seja considerada uma excelente
fonte proteica, no Brasil o consumo da oleaginosa na forma direta ou em produtos como
ingredientes principais é limitada, principalmente, devido à determinados atributos sensoriais
desagradáveis característicos destes produtos e à falta de hábito pelos consumidores
brasileiros.
2.2. Composição química da soja e de seus produtos comerciais
A composição química dos grãos de soja e de seus subprodutos é apresentada na
Tabela 1. Essa composição pode variar de acordo com as condições climáticas e do solo,
além das condições de armazenamento e de processamento do grão. Em função do
melhoramento genético das plantas, é possível obter um teor proteico do grão variando de 40
a 45%, sendo que o teor de lipídeos pode alcançar níveis entre 18 a 20%. Geralmente, um
aumento de 1% no teor de proteínas é acompanhado por uma diminuição de 0,5% em óleo
(Anderson et al., 1995; FAO, 1997; Embrapa Soja, 2000; Liu, 2000; Soares et al., 2005;
Reynolds et al., 2006).
Tabela 1: Composição centesimal (g/100g, base seca) da soja e de seus subprodutos.
Produtos Proteína Lipídio Carboidrato Fibra Umidade Cinzas
Soja em grão 42,6 20,0 nd1 5,3 11,0 5,0
Farinha de soja integral 40,5 20,5 25,6 2,3 6,6 4,5
Leite de Soja 3,5 2,2 nd nd nd Nd
Concentrado proteico de soja 72,0 1,0 17,5 4,5 nd 5,0
Farinha de soja desengordurada 56,0 1,0 33,5 3,5 nd 6,0
Isolado proteico de soja 96,0 0,1 0,3 0,1 nd 3,5
Adaptado de Circle & Smith, 1972; Pringle, 1974; Cabral & Modesta, 1981; 1Não disponível.
28
O óleo de soja está dentre os óleos mais consumidos na dieta humana, sendo composto
por componentes não-glicerídicos, como os fosfatídeos (lecitinas e cefalinas) e
esfingomielinas, de uma pequena parcela de matéria não saponificável, que engloba uma
diversidade de compostos, como pigmentos, esteróis (ergosterol, sitosterol), tocoferóis,
tocoquinonas, pró-vitamina A, entre outros (Privett et al., 1974; Faria et al., 2002) e,
principalmente, glicerídeos, que são produtos da esterificação de uma molécula de glicerol
com três moléculas de ácidos graxos. No óleo de soja destacam-se os ácidos graxos
insaturados (ácidos graxos monoinsaturados: 23%; ácidos graxos poli-insaturados: 58%) e
saturados (15%). O óleo de soja apresenta em sua composição ácidos graxos essenciais
(linoléico ou 18:2 ω-6 e α-linolênico ou 18:3 ω-3), que participam da síntese dos ácidos
araquidônico (20:4 ω -6) e docosahexaenóico (DHA, 22:6 ω-3), importantes precursores de
prostaglandinas e outros eicosanoides (Privett et al., 1973; Wilson & Rinne, 1974). O
percentual de ácido linoléico é inicialmente alto no grão imaturo e diminui em função do
amadurecimento (Privett et al., 1973; Wilson & Rinne, 1974; Liu, 1999). Vieira et al. (1999)
investigaram a composição de ácidos graxos de seis cultivares distintos de soja e relataram
que os diferentes cultivares apresentavam diferenças qualitativas e quantitativas em relação
aos teores de ácidos graxos (Tabela 2).
Tabela 2: Composição em ácidos graxos (%) de diferentes cultivares de soja.
Cultivar C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 Saturados Insaturados
IAS-4 0,06 9,40 0,14 3,82 21,15 57,19 7,51 13,28 85,99
EMBRAPA-4 0,03 9,27 0,14 2,87 39,93 42,46 4,64 12,17 87,17
Davis 0,08 11,84 0,06 3,39 24,87 53,08 5,92 15,31 83,93
BR-16 0,07 10,49 0,06 4,52 23,56 53,57 6,84 15,08 84,03
Iguaçu 0,04 9,62 0,04 3,87 22,38 56,54 6,65 13,53 85,61
IAS-5 0,07 8,06 0,12 3,65 24,17 55,47 7,69 11,78 87,45
Fonte: Vieira, et al., 1999
A soja comercial, apesar de conter cerca de 30% de carboidratos totais, não é
considerada como um alimento que favoreça o aumento da glicemia, pois o teor de açúcares
livres corresponde a apenas 8% do total, sendo destes 60% sacarose e o restante rafinose,
estaquiose, melibiose, galactose, ramnose, pinitol, verbascose e maltopentoses (Tabela 3).
Oligossacarídeos, fibra, rafinose e estaquiose não são digeridos no organismo humano, mas
consumidos preferencialmente por bactérias presentes no cólon, o que está relacionado à
29
flatulência e às dores abdominais causadas pelo consumo de soja e seus produtos (Cristofaro
et al., 1974; Liener, 1994). O amido é encontrado somente em sementes verdes, mesmo assim
em pequenas quantidades (Hymowitz, 1972; Markley, 1974). As fibras alimentares como a
celulose estão presentes na casca do grão de soja, representando 64% desta e podem ser
classificadas como solúveis ou insolúveis. Outros polímeros semelhantes à celulose, como as
pentosanas, galactanas, hemicelulose e dextrinas também podem ser encontradas na soja e
também não são hidrolisados pelas enzimas digestivas humanas. As fibras solúveis presentes
são as pectinas, gomas, mucilagens e algumas hemiceluloses, que são responsáveis pelo
retardo do esvaziamento gástrico. As fibras insolúveis são a celulose, lignina e hemicelulose,
sendo pouco fermentáveis e responsáveis pelo aceleramento do trânsito intestinal (Rivas,
2006).
Tabela 3: Composição em carboidratos da soja em grão
(g/100g, base seca).
Carboidrato Teor médio na soja integral
Celulose 4,0
Hemicelulose 15,0
Estaquiose 3,8
Rafinose 1,1
Sacarose 5,0
Outros açúcares 5,1
Adaptado: Markley, 1974
Os minerais ou compostos inorgânicos compõe cerca de 5% do grão de soja. Os mais
frequentemente detectados são cálcio, ferro, zinco, potássio, sódio, magnésio, fósforo,
enxofre, cloro, iodo, cobre, manganês e alumínio (Tabela 4). Dentre esses, aqueles que estão
em maior proporção são o potássio, o fósforo e o cálcio. É importante ressaltar que
aproximadamente 43% do fósforo apresenta-se ligado ao ácido fítico, e quase todo o fósforo
restante faz parte dos fosfolipídios, o que dificulta sua biodisponibilidade (Jaffe, 1981; Liener,
1981; Erdman & Fordyce, 1989).
30
Tabela 4: Teor de minerais da soja em grão.
Mineral Teor
Cálcio (mg/100g) 220 – 280
Fósforo (mg/100g) 590 – 660
Ferro (mg/100g) 8 – 18
Potássio (mg/100g) 340 – 380
Sódio (mg/100g) 1670 – 2090
Magnésio (mg/100g) 220 – 240
Enxofre (mg/100g) 410
Iodo (mg/kg) 0,01
Cobre (mg/kg) 12
Adaptado: Shurpalekar, 1961, citado por Rivas, 2006.
As principais vitaminas presentes na soja são tiamina, riboflavina, niacina, ácido
pantotênico e ácido fólico, todas do complexo B e hidrossolúveis. As principais vitaminas
lipossolúveis encontradas são as vitaminas K e E, presentes no óleo de soja refinado, sendo
essa última um antioxidante natural, importante tanto para a conservação do óleo comercial
quanto para o organismo humano (Smith & Circle, 1975; Messina et al., 1994) (Tabela 5).
Tabela 5: Teores de vitaminas da soja em grão.
Vitamina Teor
Pró vitamina A (µg/100g) 12
E (µg/100g) 1,8
Tiamina (µg/100g) 0,83
Riboflavina (mg/100g) 0,3
Niacina (mg/100g) 2,2
Adaptado de Kagawa, 1995.
A proteína de soja é amplamente utilizada em muitos alimentos como ingrediente
funcional e nutricional (Hettiarachchy & Kalapathy, 1997; Liu, 2000). Sabe-se que a proteína
de soja tem inúmeras funções fisiológicas e que sua qualidade é relacionada ao teor de
aminoácidos, digestibilidade e capacidade de suprir os aminoácidos essenciais adequados às
necessidades humanas. Além disso, nos EUA a Food and Drug Administration (FDA)
aprovou a alegação de saúde sobre o papel da proteína soja na redução do risco de doença
cardíaca coronária (Liu, 1997; FDA, 1999). Já no Brasil, a ANVISA, por meio da Resolução
31
nº. 19 de 1999 permitiu a alegação de propriedade funcional para a proteína de soja, devido
ao seu potencial efeito benéfico na redução do colesterol (ANVISA, 1999).
Grande parte da proteína encontra-se em corpúsculos contidos nas células
cotiledonares e a maioria dos cultivares de soja apresenta conteúdo proteico que pode oscilar
de 30 a 45%. Os maiores componentes da proteína da soja são proteínas de armazenamento
denominadas β-conglicinina e glicinina, representando 65% a 80% do total de proteínas
(Penha et al., 2007). Essas proteínas são denominadas antigênicas e podem causar reações de
hipersensibilidade na mucosa intestinal.
Os aminoácidos histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, cistina, fenilalanina,
tirosina, treonina, triptofano e valina, estão presentes em quantidades maiores que as
recomendadas pelo padrão de referência (FAO/WHO) para adultos e crianças em idade pré-
escolar (Vieira et al., 1999). Entretanto, são limitados os teores dos aminoácidos sulfurados,
especialmente metionina, e também de treonina, quando comparados aos encontrados em
alimentos de origem animal (Liu, 1997).
Vieira et al. (1999) avaliaram seis diferentes cultivares de soja e observaram que as
mesmas apresentaram grande quantidade de aminoácidos essenciais e, portanto, podem ser
consideradas fonte de proteína de excelente qualidade para a nutrição de seres humanos
(Tabela 6).
Tabela 6: Composição média de aminoácidos das proteínas das cultivares de soja e
comparação com o padrão da FAO (1985).
Aminoácidos FAO (g/100g de proteína) Média das cultivares
(g/100g de proteína) 2 a 5 anos Adultos
Essenciais
Histidina 1,9 1,6 2,07
Isoleucina 2,8 1,3 3,87
Leucina 6,6 1,9 7,55
Lisina 5,8 1,6 6,25
Sulfurados (Met + Cys) 2,5 1,7 3,62
Aromáticos (Phe + Tyr) 6,3 1,9 9,53
Treonina 3,4 0,9 3,87
Triptofano 1,1 0,5 1,57
Valina 3,5 1,3 4,27
Total aminoácidos essenciais 33,9 12,7 42,58
Não essenciais
Arginina -- -- 7,15
Alanina -- -- 4,10
Ácido aspártico -- -- 13,85
Ácido glutâmico -- -- 21,48
Glicina -- -- 3,67
Prolina -- -- 8,00
Serina -- -- 5,13
Adaptado: Vieira, 1999.
32
A soja não deve ser ingerida crua, uma vez que o grão contém compostos
considerados fatores antinutricionais, como hemaglutininas, inibidores de tripsina, lectinas,
fatores de flatulência (oligossacarídeos), enzimas como lipoxigenase e urease, e ácido fítico.
Esses fatores podem reduzir a qualidade das proteínas e sua utilização no organismo, assim
como afetar a biodisponibilidade de minerais (Liu, 1999; Monteiro et al., 2003).
A soja integral contém cerca de 7 a 9% de inibidores de protease, localizados no
cotilédone do grão e que apresentam a capacidade de inibir a atividade proteolítica de
algumas enzimas do sistema digestivo de animais e seres humanos (Brandon & Friedman,
2002; Penha et al., 2007; Esteves et al., 2010). Na soja existem dois tipos de inibidores da
tripsina, o inibidor de Kunitz (KTI) e o inibidor da tripsina e quimotripsina de Bowman-Birk
(BBI). O processamento térmico da soja diminui o teor desses compostos, o que também pode
ser alcançado através do melhoramento genético dos grãos, sem prejuízo para a qualidade da
proteína (Monteiro et al., 2004; Miura et al., 2005; Machado et al., 2008; Andrade et al.,
2010).
Lipoxigenases são enzimas que pertencem a um grupo de proteínas de ferro não heme
amplamente distribuídas na soja e que podem representar até 2% da proteína de grãos de soja
(Loiseau et al., 2001). O sabor característico de “feijão cru” (beany flavor) da soja deve-se a
compostos voláteis de baixo peso molecular, resultantes da oxidação de ácidos graxos
insaturados, especialmente linoleico e linolênico, catalisada por essas enzimas. Além de
alterar o sabor da soja, essas substâncias tornam o seu óleo rançoso e reduzem a vida de
prateleira de seus derivados (Goossens, 1974). As lipoxigenases são facilmente inativadas
pelo calor (Huang et al., 1982; Kwok & Niranjan, 1995).
As lectinas, ou fito-hematoglutininas, estão presentes em maior quantidade em
leguminosas e gramíneas e apresentam diversas propriedades biológicas, como a aglutinação
de células sanguíneas (linfócitos e eritrócitos). Algumas lectinas são resistentes à hidrólise
enzimática no trato digestivo, e, portanto, podem reagir com as células epiteliais do intestino,
interferindo na absorção e utilização de nutrientes e, consequentemente, provocando
deficiências no desenvolvimento (Silva & Silva, 2000; Ritt, 2005). Os teores típicos de
lectinas na soja variam de 2,1 a 5,7 mg/g, podendo ser reduzido por processamento térmico
(Machado et al., 2008; Gu et al., 2010; Paucar-Menacho et al., 2010).
O ácido fítico é um ácido orgânico abundante em cereais e leguminosas e compõe as
reservas de fosfato e minerais da planta. Na soja e seus derivados, o teor de ácido fítico varia
de 1% a 1,5% em peso seco dos grãos. Em função de sua densidade eletrônica, a molécula de
ácido fítico apresenta alta capacidade de ligação com cátions bivalentes, como o cobre, zinco,
33
cobalto, magnésio, ferro e cálcio, formando sais de baixa solubilidade, o que dificulta a
absorção intestinal desses minerais, em especial cálcio, ferro, magnésio e zinco, ocasionando
a diminuição da sua biodisponibilidade (Gu et al., 2010).
2.3. Compostos bioativos
Com a crescente popularização de medicamentos fitoterápicos, os compostos biativos
de origem vegetal têm sido exaustivamente estudados (Diniz et al., 2007). Esses compostos
não estão normalmente envolvidos nas funções vitais destes vegetais, participando do seu
metabolismo secundário. Os compostos bioativos apresentam características químicas
diversas e bem complexas, englobando diferentes classes como terpenos, alcalóides,
glicosídeos, compostos fenólicos, entre outros (Matos, 1997; Stringheta, 2004).
Dentre as inúmeras classes de compostos bioativos, os compostos fenólicos ou
polifenóis são aqueles que apresentam uma das maiores diversidade de estruturas. Essa grande
variedade deve-se ao fato de que os mesmos contêm diferentes grupamentos ligados
(hidroxilas, metilas, metoxilas, etc.), em número e posição variáveis, e podem estar
conjugados ou não com açúcares ou outros compostos (Simões et al., 1999; Heim et al.,
2002). Os polifenóis são produtos gerados a partir metabolismo secundário de vegetais
(Simões et al., 1999). Sua origem biossintética está relacionada às vias do ácido chiquímico
(carboidratos) e do acetato-malato (malonil-CoA e acetil-CoA) (Mann, 1996). Em comum, os
compostos fenólicos apresentam potencial para atuarem como antioxidantes (Simões et al.,
1999; Naczk e Shahidi, 2004).
As principais classes de compostos fenólicos incluem fenóis neutros, ácidos fenólicos,
flavonoides e outros fenólicos (Figura 5) (Naczk e Shahidi, 2004; Oliveira, 2005; Dimitrios,
2006).
34
Figura 5: Estrutura química dos principais compostos fenólicos encontrados nos vegetais
(adaptado: Manach, et al., 2004)
Dentre os compostos fenólicos apresentados na Figura 5, os que estão presentes na
soja e seus subprodutos são os ácidos fenólicos, que são divididos em dois subgrupos
derivados dos ácidos hidroxibenzóico (ácido gálico, p-hidroxibenzóico, vanílico e siringico) e
hidroxicinâmico (m-cumárico, p-cumárico, cafeico, ferúlico e sinápico) (Potter et al., 1985;
Kim et al., 2006; Hanan et al., 2008) e as isoflavonas, que pertencem a classes dos
flavonoides. Os flavonoides possuem 15 átomos de carbono e se encontram distribuídos em
mais de 2.000 espécies do reino vegetal, nas mais diversas famílias (Figura 6).
Desempenham importante papel na fisiologia vegetal, uma vez que atuam na proteção
contra agentes oxidantes (Salisbury & Ross, 1992).
35
Figura 6: Estrutura química dos flavonoides (adaptado: Manach, et al., 2004)
2.3.1. Isoflavonas
Embora os flavonoides sejam encontrados em várias famílias de plantas e em
diferentes tecidos, as isoflavonas possuem distribuição restrita em alimentos, estando
presentes em apenas algumas famílias botânicas, como a do grão-de-bico, feijão e, em
especial, da soja, que é a espécie botânica que contém a maior quantidade de isoflavonas, na
faixa de 0,1 a 0,4% em peso seco (Tsukamoto et al., 2001; Devi et al., 2008).
O conteúdo de isoflavonas da soja varia de acordo com o local de crescimento do grão,
do genótipo, da temperatura e da interação desses fatores durante a maturação. Segundo
Tsukamoto et al. (1995), cerca de 80 a 90% do total de isoflavonas dos grãos encontram-se
nos cotilédones, sendo que o restante fica no hipocótilo. As isoflavonas correspondem a, no
mínimo, 72% dos compostos fenólicos presentes na soja e em alimentos derivados desse grão.
Apresentam-se subdivididas em quatro grupos (Figura 7): agliconas, β-glicosídeos, acetil
glicosídeos e malonil glicosídeos, com três compostos em cada um deles, com os núcleos
genistina, daidzina e glicitina.
36
Figura 7: Estruturas químicas das isoflavonas da soja (Adaptado de Lee & Choung)
As isoflavonas são biologicamente ativas no organismo humano, desencadeando
efeitos benéficos à saúde (Seo & Morr, 1984; Kao, et al., 2008; Hu, et al., 2008). De acordo
com Barbosa et al. (2006), as diferenças de estrutura química das isoflavonas podem
influenciar na sua atividade biológica, biodisponibilidade e efeitos fisiológicos. No entanto,
de maneira geral, a biodisponibilidade das isoflavonas no corpo humano depende da
capacidade das β-glicosidases da microbiota intestinal em hidrolisar as formas glicosiladas
das isoflavonas às formas aglicona (Carrão-Panizzi et al., 2003; Lee et al., 2003; Lee et al.,
2007). Segundo Kao et al. (2008), as formas aglicona possuem maior biodisponibilidade e
maior atividade biológica do que as formas conjugadas.
2.3.2. Saponinas
Os terpenos são compostos que abrangem uma vasta variedade de metabólitos
secundários, com uma grande variedade estrutural. Esses compostos ocorrem naturalmente
em vegetais e apresentam importante função de proteção. Os terpenos ou terpenoides podem
ser classificados de acordo com o número de unidades de isoprenos presentes na estrutura. O
isopreno consiste num hidrocarboneto alifático, incolor, volátil, com 5 átomos de carbono e
duas ligações duplas conjugadas (Figura 8) (Raven et al., 2001).
Figura 8: Estrutura química do isopreno
O ácido mevalônico é o precursor dos terpenos, que são formados a partir de
metabólitos secundários (Figura 9). Os terpenos são formados através da justaposição
37
sucessiva de isopentenilpirofosfatos, dando origem a todos as classes: monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). Embora o
metabolismo secundário não seja necessário para que o vegetal complete seu ciclo de vida, ele
desempenha um papel importante na interação das plantas com o meio. Desse modo, produtos
secundários possuem um papel contra ataque de patógenos, atração de organismos benéficos,
como polinizadores, dispersores de semente e micro-organismos simbiontes. Além disso,
possuem ação protetora em relação ao estresse associado à mudança de temperatura,
exposição à luz UV e à deficiência de nutrientes minerais (Dixon, 2001).
Figura 9: Biossíntese de terpenos (Adaptado: Taiz & Zeiger, 2004).
As saponinas são compostos glicosídeos complexos (Figura 10), presentes em uma
grande variedade de plantas. A porção aglicona das saponinas pode apresentar estrutura
esteroidal ou triterpenoide, sendo essa última o caso das saponinas presentes na soja. A
estrutura triterpenoide pode estar ligada a uma ou mais moléculas de açúcares, como glicose,
ramnose, galactose, entre outras, sendo classificadas, dessa maneira, em monodesmosídicas
(uma cadeia de açúcar), bidesmosídicas (duas cadeias de açúcares), ou tridesmosídicas (três
cadeias de açucares) (Shi et al., 2004). Esta classe de compostos apresenta propriedades
surfactante e detergente, atuando como agentes emulsificantes.
38
Figura 10: Representação da estrutura química das saponinas da soja (Adaptado de Fang et
al., 2004)
A porção aglicona das saponinas é também denominada como sapogenina. Na soja o
teor de saponinas está em torno de 0,1 a 0,3%. As saponinas de soja podem ser divididas em
três principais grupos: A, B e E (Hu et al., 2002).
As saponinas do grupo A parecem ser de ocorrência natural na soja e são classificadas
de acordo com sua ordem de eluição na cromatografia líquida e sua hidrólise ácida produz
uma aglicona comum, o sapogenol A.
O grupo B apresenta diversos componentes, dentre eles o sapogenol B e as saponinas
de soja I, II, III, IV e V, sendo as saponinas deste grupo as mais abundantes na soja (cerca de
70%). As saponinas do grupo B conjugadas ao radical DDMP (2,3-dehidro-2,5-dihidroxi-6-
metil-4(H)-pirano-4-ona) são denominadas saponinas βa, βg, αg, γg e γa, podendo ser
convertidas às saponinas I, II, III, IV, e V, respectivamente, quando perdem o grupamento
DDMP. Estudos demonstraram que aquecimento prolongado, extração ou armazenamento
após colheita podem liberar esse radical de saponinas DDMP-conjugadas presentes no
cotilédone do grão, devido a processos químicos ou enzimáticos (Zhang & Popovick, 2009).
Hu et al. (2002) estudaram o efeito de diferentes tratamentos sobre os teores de saponinas de
vários produtos à base de soja e observaram que as saponinas DDMP-conjugadas foram os
principais componentes da farinha de soja bruta, enquanto as saponinas não conjugadas foram
as formas principais em produtos processados. É importante destacar que o radical DDMP é
responsável pela atividade antioxidante das saponinas DDMP-conjugadas.
As saponinas de soja do grupo E são formadas após a hidrólise ácida. Grande parte dos
grupos de saponinas de soja descritos são formados devido à alteração das estruturas químicas
após os processos de extração e análise (Vasantha et al., 2003; Li-Hsun, et al., 2007; Zhang,
et al., 2009).
39
2.3.3. Principais efeitos dos compostos bioativos da soja no metabolismo
Dentre os compostos bioativos presentes na soja e em seus subprodutos, as isoflavonas
recebem maior atenção, em especial as formas agliconas. A genisteína, por exemplo, de
acordo com alguns estudos, apresenta ação anticâncer (Adlercreutz & Mazur, 1997; Rostagno
et al., 2009), enquanto as isoflavonas agliconas, de maneira geral, são associadas à prevenção
da osteoporose em mulheres (Potter et al., 1998; Esteves & Monteiro, 2001), possuindo
também atividade antioxidante, antifúngica e antimutagênica (Miyazawa et al., 1999; Lee et
al., 2005; Benavent et al., 2008).
Assim como para as isoflavonas, diversos efeitos benéficos foram relacionados às
saponinas da soja, com destaque para a atividade hipocolesterolêmica (Potter et al., 1996).
Outros efeitos também já foram observados, principalmente, em estudos in vitro e com
animais, tais como: atividade antiviral (como adjuvantes em vacinas contra o HIV-1,
citomegalovírus e Toxoplasma gondii) (Yang et al., 2005); atividade anticâncer de cólon (Rao
et al., 1977; Wang & Nixon, 2001). Além disso, conforme mencionado anteriormente, alguns
estudos relataram que as saponinas de soja conjugadas com DDMP apresentam atividade
antioxidante (Yoshiki et al., 1996; Ruiz et al., 1996).
Os benefícios do uso da proteína da soja em substituição à proteína animal foram
objeto de inúmeros estudos, a partir da constatação de que a população asiática, grande
consumidora de alimentos à base de soja, apresenta menor incidência de doenças crônicas
degenerativas quando comparada a outras populações (Heim et al, 2002). Os japoneses
consomem cerca de 55 g/dia de proteína de soja, enquanto que a população ocidental consome
menos que 5 g/dia (Anderson et al, 1995).
Em 1999, a FDA (Food and Drug Administration, agência reguladora e fiscalizadora
dos alimentos nos EUA) autorizou uma alegação de saúde relacionada à proteína de soja,
indicando um consumo de 25 g por dia, para que efeitos benéficos relacionados à prevenção
de doenças cardiovasculares, como a diminuição dos níveis de colesterol, fossem alcançados.
Dentre os efeitos benéficos associados à ingestão de compostos bioativos presentes na
soja e nos produtos derivados desse grão, a modulação do metabolismo do colesterol é um dos
que vem sendo mais exaustivamente estudados, com o intuito de elucidar os mecanismos de
ação envolvidos, assim como determinar quais fitoquímicos são responsáveis por tais efeitos.
Os estudos clínicos realizados com seres humanos e animais, além de ensaios in vitro,
que investigaram o efeito da ingestão de fitoquímicos presentes na fração proteica da soja
apresentaram resultados muitas vezes contraditórios. Contudo, de maneira geral, os benefícios
40
da ingestão da soja para a prevenção de doenças crônicas vêm sendo associados
principalmente às isoflavonas, enquanto outros fitoquímicos como as saponinas recebem
menor atenção da comunidade científica.
Lucas et al. (2001) trataram do possível papel das saponinas na mediação da atividade
hipercolesterolêmica da proteína de soja. Apesar desta atividade ser tão bem estabelecida a
ponto da FDA ter aprovado uma alegação de saúde relacionando o consumo de proteína de
soja com a redução de risco doença cardíaca coronariana, segundo Lucas et al. (2001), a
proteína de soja comercial geralmente contém altos teores de isoflavonas, saponinas e outros
fitoquímicos que podem, por si só, influenciar no metabolismo do colesterol. Dessa maneira,
portanto, talvez seja errôneo que tal alegação de saúde não especifique um requisito de
composição característica para esses materiais à base de proteína de soja. Não obstante,
também é possível que a proteína purificada possa exercer outros efeitos no metabolismo.
O estudo do efeito das saponinas naturais e sintéticas sobre o metabolismo de
diferentes organismos pode trazer informações importantes para o controle da
hipercolesterolemia. A capacidade das saponinas em formar complexos insolúveis com o
colesterol é assunto de grande interesse. A interação entre esses componentes leva à
formação de micelas entre as saponinas e o colesterol e sais biliares, através da ligação da
porção hidrofóbica da saponinas (sapogenina) e o núcleo lipofílico do colesterol (Topping et
al., 1980; Cheeke, 1999).
Estudos com animais verificaram o efeito benéfico das saponinas de soja sob o
metabolismo do colesterol. Lee et al. (1970) investigaram a ação das saponinas de soja na
redução do colesterol plasmático e da excreção fecal de ácidos em 4 suínos machos. Os
autores observaram que, ao submeter esses animais a uma dieta com baixo teor de colesterol e
20g de saponinas por dia, não foi observada alteração nas concentrações de LDL ou HDL
colesterol. No entanto, houve um aumento da excreção de ácidos biliares e de esteróis neutros,
o que poderia favorecer a redução do colesterol plasmático.
Oakenfull et al. (1979) investigaram os efeitos da alimentação com isolados contendo
saponinas sobre as concentrações de lipídios plasmáticos e de ácidos biliares nas fezes de
ratos. Nesse estudo, um grupo de animais consumiu uma dieta pobre em colesterol e um
padrão comercial sintético de saponina (informações quanto à origem botânica não foram
fornecidas) e o outro grupo consumiu uma dieta rica em colesterol e saponinas. A partir dos
resultados encontrados, os autores concluíram que as saponinas reverteram parcialmente a
hipercolesterolemia causada pela dieta rica em colesterol, aumentando a taxa de excreção de
ácidos biliares e de esteróis neutros, sugerindo que dietas contendo saponinas isoladas ou
41
alimentos ricos em saponinas (como os grãos de soja) são hipocolesterolêmicas e por tanto,
benéficas ao homem.
Um resultado semelhante foi relatado por Sidhu & Oakenfull (1986) ao investigarem a
ação da saponina isolada a partir de um extrato etanólico de soja no intestino de ratos fêmeas,
submetidas a uma dieta hiperproteica e hiperlipídica. Os autores concluíram que as saponinas
exerceram ação hipocolesterolêmica e sugeriram que, possivelmente, a ingestão de alimentos
que contenham saponinas seria capaz de reduzir a concentração plasmática de colesterol em
indivíduos hipercolesterolêmicos.
Contudo, ao contrário do observado em modelos animais, um estudo similar em
humanos apresentou resultados menos consistentes. Calvert et al. (1981) analisaram o efeito
hipocolesterolêmico das saponinas, através da suplementação de dez homens
hipercolesterolêmicos com dois tipos diferentes de farinha de soja, contendo 4 e 22g de
saponinas, respectivamente. Após a análise dos lipídios plasmáticos e dos ácidos biliares e
esteróis neutros nas fezes dos voluntários, os autores concluíram que as saponinas presentes
nas farinhas não exerceram qualquer ação hipocolesterolêmica.
Com relação às proteínas da soja, as primeiras evidências acerca do seu potencial
efeito hipocolesterolêmico foram observados em modelos animais. No início da década de
80, Terpestra et al. (1981) realizaram experimentos com 57 ratos fêmeas divididas em 5
grupos de acordo com diferentes níveis de colesterol sérico, sendo em seguida oferecida uma
dieta com diferentes proporção de proteína de soja e de caseína. Os autores concluíram que a
proteína de soja dessa dieta foi capaz de reduzir os níveis séricos de colesterol em ratos
hipercolesterolêmicos. No entanto, os autores afirmaram que mais estudos deveriam ser
realizados a fim de elucidar o mecanismo deste fenômeno.
Já Hrabek-Smith et al. (1989) avaliaram o efeito de dietas ricas em caseína ou em
proteína de soja semipurificada sobre aos níveis séricos de HDL (lipoproteína de alta
densidade) e LDL (lipoproteína de baixa densidade) em coelhos de laboratório. Os autores
relataram que os animais que foram alimentados com a dieta rica em caseína apresentaram
níveis séricos elevados de colesterol, em especial LDL, ao passo que aqueles que foram
alimentados com a dieta rica em proteína de soja semipurificada apresentaram níveis normais
de colesterol sérico, com um leve aumento da fração HDL. Os autores supuseram, assim, que
uma dieta rica em proteína de origem vegetal, em especial a proteína de soja, foi eficiente
para oferecer um bom aporte proteico, além de manter os níveis ótimos de colesterol sérico.
Lucas et al. (2000) investigaram o efeito da proteína de soja na redução do colesterol
de 48 hamsters fêmeas, ovariectomizadas ou não ovariectomizadas. Ambos os grupos foram
42
submetidos a dois tratamentos: dieta rica em caseína e isenta de colesterol; dieta contendo o
isolado proteico de soja depletado da isoflavona (através de extração etanólica). Observou-se
que, no grupo suplementado com proteína de soja isolada, houve diminuição dos níveis
séricos de triglicerídeos, o que permitiu aos autores concluírem, então, que a proteína de soja
exerce função importante no efeito hipocolesterolêmico e não somente as isoflavonas.
Mais recentemente, Fukui et al. (2004) investigaram a ação hipocolesterolêmica de
produtos à base de soja em 30 ratos machos, que foram submetidos a uma dieta enriquecida
em colesterol. Os animais foram divididos em 5 grupos, suplementados com: caseína (grupo
controle); proteína de soja; proteína de soja lavada com etanol; proteína de soja acrescida do
extrato etanólico; caseína adicionada do extrato etanólico. Os autores verificaram que, dentre
os componentes presentes no isolado protéico de soja, somente a própria proteína intacta
apresentou ação hipocolesterolêmica. Entretanto, os autores relataram que os componentes
presentes nos extratos etanólicos ainda deveriam ser investigados em maior detalhe, sugerindo
que o efeito hipocolesterolêmico poderia ser atribuído a outros componentes diferentes
daqueles presentes na fração etanólica, rica em isoflavonas e saponinas segundo os autores.
Um estudo utilizando células em cultura demonstrou que subunidades isoladas da
proteína da soja participam da regulação positiva do LDL colesterol, já que foram observados
receptores para a β-conglicinina em células hepáticas, sugerindo assim que estas seriam
responsável pela produção adequada de lipoproteínas pelo fígado (Duranti et al., 2004). Esse
resultado foi análogo aos efeitos da proteína de soja sobre o metabolismo lipídico observados
em estudos com animais, sugerindo que a β-conglicinina (subunidade 7S da globulina da soja)
seja responsável pelo efeito substancial nos lipídios plasmáticos.
De maneira conjunta, estes estudos apontam que a diminuição da absorção intestinal
de colesterol e o aumento da excreção fecal de esteroides são os principais mecanismos
responsáveis pelo efeito hipocolesterolêmico da proteína de soja quando comparado à caseína.
A partir dos estudos em modelos animais, inúmeros estudos clínicos com seres
humanos foram realizados a fim de investigar a potencial resposta hipocolesterolêmica do
consumo da proteína de soja. No estudo realizado por Widhalm et al. (1993) 19 crianças com
hipercolesterolemia poligênica diagnosticada ou com predisposição à doença foram separadas
em 3 grupos: o primeiro grupo consumiu uma dieta com baixos teores de gordura, o segundo
uma dieta com baixo teores de colesterol e o terceiro uma dieta onde a proteína animal foi
substituída por proteína de soja. Após avaliarem os níveis de colesterol total, triglicerídeos,
LDL colesterol e HDL colesterol, os autores concluíram que o grupo que consumiu proteína
de soja apresentou um melhor resultado em relação aos níveis plasmáticos de colesterol total,
43
havendo também uma melhora nos índices de LDL e HDL colesterol. O mecanismo
envolvido no efeito de redução do colesterol da dieta com proteína da soja em substituição à
proteína animal não foi totalmente compreendido, mas os autores sugeriram que o efeito
benéfico pode estar ligado aos aminoácidos presentes ou ao padrão de dieta que continha
baixos níveis de colesterol e de gordura.
Apesar de estudos relatarem o efeito positivo da proteína de soja na redução do
colesterol plasmático, a presença ou ausência de isoflavonas nessa fração pode ser um fator
que pode causar confusão. Algumas isoflavonas, principalmente genisteína e daidzeína, têm
apresentado efeito hipocolesterolêmico em animais e humanos (Huff et al., 1977).
Existe a hipótese de que as isoflavonas presentes na soja possam inibir o
desenvolvimento da aterosclerose, pois essas possuem propriedades antioxidantes contra a
oxidação do LDL-colesterol. Além disso, as isoflavonas possuem efeitos
hipocolesterolêmicos que ainda estão sendo investigados, como a interação das isoflavonas
com os receptores de estrogênio presentes no organismo, em função da sua similaridade
estrutural (Hall, et al., 2005).
Estudos in vitro, em modelos animais e com seres humanos têm sido realizados a fim
de elucidar a ação das isoflavonas sobre o metabolismo do colesterol. Em um estudo in vitro,
Borradaile et al. (2002) investigaram a ação da genisteína e da daidzeína (padrões comerciais
nas concentrações de 20 a 200 µM) sobre a regulação do metabolismo hepático de lipídios,
especialmente a excreção de ApoB (receptores de membrana do LDL colesterol) e a
expressão das enzimas HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase) e ACAT (acil-
CoA colesterol aciltransferase) em células humanas HepG2. Os autores concluíram que
ambas isoflavonas diminuíram significativamente a expressão de ApoB nas células hepáticas,
sendo um dos mecanismos responsáveis pela ação hipocolesterolêmica das mesmas
(Borradaile et al., 2002).
Já em um modelo animal, Greves et al. (1999) conduziram estudos exploratórios
acerca do efeito hipocolesterolêmico das isoflavonas em 60 macacas fêmeas ovariectomizadas
(condição análoga à menopausa em mulheres), que foram submetidas a três dietas: caseína
(grupo controle); caseína adicionada de um extrato semi-purificado em isoflavonas; e proteína
de soja intacta. A partir dos resultados obtidos, os autores concluíram que a proteína de soja
intacta melhorou o perfil lipídico, reduziu o tamanho das partículas de LDL e alterou a
composição das mesmas, enquanto a adição de um extrato semi-purificado de soja, rico em
isoflavonas, não resultou em ação hipolipídica ateroprotetora ou modificação do perfil
lipoprotéico, como observado para a proteína de soja. Segundo esses autores, portanto, as
44
isoflavonas não demonstraram possuir efeitos benéficos sobre a redução do colesterol
plasmático.
Contudo, Wiseman et al. (2000) buscaram investigar os efeitos de uma dieta
enriquecida com soja contendo isoflavonas sobre a peroxidação lipídica e a resistência à
oxidação de LDL em 24 indivíduos saudáveis (19 homens e 5 mulheres). Os resultados
obtidos após a suplementação com duas dietas diferentes, uma contendo proteína de soja
texturizada rica em isoflavona e outra similar, porém empobrecida em isoflavonas por
extração etanólica, indicaram que o consumo de soja contendo quantidades naturais de
isoflavonas reduziu a peroxidação lipídica e aumentou a resistência da LDL à oxidação, o que
pode ser considerado um efeito significativo para a redução do risco de aterosclerose, doenças
cardiovasculares e câncer em geral.
Mais recentemente, Fernandes et al. (2006) avaliaram uma publicação de
aconselhamento da American Heart Association (AHA) de 2006, que visava esclarecer as
repercussões das isoflavonas de soja, não só para a saúde cardiovascular, mas também para
outros efeitos clínicos. A publicação da AHA foi produzida a partir da meta análise de 19
estudos randomizados, dando destaque para os seguintes resultados: o impacto das
isoflavonas foi nulo sobre os níveis de HDL-colesterol, LDL-colesterol, triglicerídeos e os
valores de pressão arterial; não se observou melhora dos sintomas vasomotores relacionados à
menopausa; os resultados foram controversos no tocante à perda da massa óssea após a
menopausa; a eficácia e segurança na prevenção ou tratamento dos cânceres de mama e de
endométrio ainda não foram estabelecidas. Em relação aos efeitos adversos, a AHA expressou
bastante prudência.
Os resultados conflitantes encontrados nesses estudos devem-se, possivelmente, em
muitos casos, à caracterização incompleta dos compostos bioativos presentes nos alimentos
e/ou extratos testados. Assim sendo, até o presente momento, não é possível afirmar quais
seriam os compostos bioativos presentes em produtos derivados da soja responsáveis pelo seu
efeito hipocolesterolêmico. Os mecanismos de ação da proteína de soja, das saponinas ou das
isoflavonas, quando administradas isoladamente, não foram ainda completamente elucidados.
Para tal, depende-se de um maior conhecimento acerca de qual fração bioativa da soja é
responsável por determinado efeito benéfico.
Dessa maneira, seria de grande interesse a obtenção de extratos contendo classes
específicas de fitoquímicos, de forma a possibilitar a relação entre tal classe de compostos
(isoflavonas, saponinas ou outra) e elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos. Uma
das maneiras possíveis para a obtenção de tais extratos seria a extração de alimentos à base de
45
soja com diferentes misturas de solventes, combinados ao uso de aditivos auxiliadores da
extração.
2.4. Extração de compostos bioativos de origem vegetal
Os processos de extração visam extrair compostos bioativos de interesse de materiais
brutos. Entretanto, como a composição desses materiais é normalmente bastante complexa,
ocorre a extração de moléculas de diferentes classes funcionais durante esse processo. Nesse
sentido, etapas prévias adicionais podem ser necessárias para remoção de compostos
indesejáveis. As técnicas de extração mais comuns são: extração com solventes; extração sem
solventes (fluido supercrítico, extração em fase sólida); utilização de membranas sólidas
(diálise e ultrafiltração) (Schwartzberg, 1980).
A extração com solventes é um método clássico, comumente utilizado para extrair
compostos biativos em vegetais devido à facilidade de uso, eficiência e ampla aplicabilidade.
Os solventes utilizados nesse processo irão depender das características dos compostos a
serem extraídos (Hwang et al., 2002; Pedersen-Bjergaard, et al., 2000). A extração com
solvente pode ser empregada para a extração de materiais líquidos (extração líquido-líquido)
ou sólidos (extração sólido-líquido).
Duas variantes da extração com solventes são a extração líquida pressurizada e
extração acelerada com solvente, que envolvem o uso de solventes orgânicos sob pressão e
oferecem vantagens semelhantes. A utilização de solventes sob pressão a temperaturas
elevadas pode melhorar a eficiência dos processos tradicionais resultando em menor tempo de
extração e menor consumo de solvente, porém poderá ocorrer perda significativa dos
compostos de interesse (Zhang & Popovick, 2009).
Os processos de extração com solvente são afetados por inúmeras variáveis de
processo, tais como temperatura, tempo, pH, razão amostra/volume do solvente, número de
extração individuais, e velocidade e tipo de agitação (orbital, linear, etc.). Assim, essas
variáveis irão desempenhar um importante papel na extração dos compostos de interesse (Kim
et al., 2002; Alissandrakis et al., 2003)
A extração sem o uso de solvente mais comumente utilizada é a extração por fluido
supercrítico é empregada fundamentalmente para compostos de baixa polaridade. Utilizando-
se a extração por fluido supercrítico em condições adequadas de pressão e temperatura, pode-
se conseguir uma maior seletividade na extração e produtos mais purificados, livres de
compostos de degradação. Os índices de recuperação da extração por fluido supercrítico são
46
maiores que os das extrações convencionais (extração líquido-líquido ou extração sólido-líquido),
além de ocasionarem menos poluição ao meio ambiente, já que o uso de solventes clorados é
reduzido em detrimento de fluidos supercríticos de dióxido de carbono, óxido nitroso e
amoníaco. Contudo, esta técnica é relativamente cara devido à necessidade de aquisição de
equipamentos específicos (Hennion, 1999).
A tecnologia de membranas tornou-se uma parte importante da técnica de separação
nas últimas décadas. A principal vantagem da tecnologia de membrana sobre as demais é o
fato de que ela funciona sem a adição de produtos químicos, aliado ao consumo relativamente
baixo de energia e à simplicidade do processo. A tecnologia de separação por membranas
baseia-se no uso de membranas semipermeáveis, que atuam como um filtro que deixa passar
apenas moléculas de tamanho menor que o poro da membrana, retendo partículas com peso
molecular mais elevado. Normalmente ocorre a permeação da água e a manutenção dos
sólidos e outras substâncias em suspensão. Existem vários métodos que possibilitam variar o
peso molecular das substâncias que permeiam através de uma membrana (Rupasinghe et al.,
2003).
As técnicas de extração com solventes podem ser associadas a aditivos, que são
ingredientes adicionados intencionalmente em alimentos sem o propósito de nutrir, com o
objetivo de auxiliar na extração e purificação dos compostos bioativos em vegetais, além de
serem utilizados durante a fabricação, processamento, acondicionamento, transporte ou
manipulação do alimento, com a finalidade de modificar as características químicas, físicas,
biológicas ou sensoriais (Anvisa – RDC 540, 1997).
Alguns aditivos empregados pelas indústrias, em especial de bebidas, tem objetivo de
diminuir a concentração de compostos fenólicos que podem diminuir a qualidade sensorial do
produto. Dentre os aditivos que atuam com essa função, pode-se citar a polivinilpirrolidona
(PVP) e o polietilenoglicol (PEG), ambos sintéticos, e que contêm um número suficiente de
átomos de nitrogênio e oxigênio, respectivamente, para formar ligações de hidrogênio com os
grupos fenólicos dos taninos (Silanikove et al., 2001).
2.4.1. Planejamento de experimentos: principais contribuições para a otimização da extração
diferencial
Como já foi explicado anteriormente, os processos de extração são afetados por
inúmeros fatores, denominados variáveis de processo, tais como o tipo de extração,
quantidade de solvente, temperatura, tempo, pH, uso de aditivos, entre outros. Dessa maneira,
47
a otimização dessas variáveis é de grande interesse para a extração eficiente dos compostos de
interesse.
O planejamento experimental é uma ferramenta amplamente empregada para alcançar
as condições otimizadas de um processo, ao desenvolvimento da formulação de produtos
dentro das especificações desejadas ou simplesmente para avaliar os efeitos ou impactos que
os fatores têm nas respostas desejadas. Dentre as principais técnicas de planejamento
experimental, pode-se citar: planejamento fatorial (completo e fracionado), metodologia por
superfície de resposta, planejamento experimental de mistura e planejamento Simplex
(Rodrigues & Iema, 2005).
Dois tipos principais de variáveis podem influenciar a resposta de um sistema
químico: as de processo e as de mistura. O planejamento fatorial é uma ferramenta estatística
usada para extrair o máximo de informações úteis com o mínimo de experimentos realizados,
visando a otimização das variáveis de um processo em estudo. Os planejamentos fatoriais
utilizam inúmeras variáveis de processo que podem influenciar este sistema de estudo, com
consequente avaliação quantitativa desta influência. Fatores como pH, temperatura, tempo e
proporção entre material e solvente são exemplos de variáveis de processo. Alterações nos
níveis das variáveis de processo podem afetar o resultado experimental através de seus efeitos
principais (efeitos individuais) e de interação com outras variáveis de processo, mas seus
níveis podem ser variados de forma independente uns dos outros durante o modelamento,
como acontece nos planejamentos fatoriais.
Em um planejamento de misturas, as variáveis estudadas são os componentes dessa, e
a resposta medida é uma função da proporção entre eles. A metodologia específica de
superfície de resposta gerada a partir de um planejamento de mistura consiste na determinação
da hipótese a ser testada, seleção das variáveis importantes para o sistema, coleta e análise de
dados, análise da variância e ajuste dos modelos matemáticos em função dos dados coletados.
Uma das caracteísticas do planejamento experimental de mistura é que a soma de todos os
compostos que serão analisados deverá ser 100%. Isto significa que, ao contrário do
planejamento de experimentos fatorial, onde as variáveis são independentes, no planejamento
de misturas os componentes representam proporções e, neste caso, são dependentes entre si.
Além disso, não há restrições quanto ao estado físico dos componentes, de modo que os
mesmos podem ser sólidos, líquidos ou gasosos, desde que as propriedades do sistema
químico sejam definidas pela sua proporção na mistura. Assim, a quantidade de cada
componente do sistema deve ser tratada como uma variável (variável de mistura), que não é
48
independente das demais. Pode-se, ainda, estabelecer limites inferiores e superiores das
proporções dos componentes nas misturas (Barros & Neto et al., 1995; Zauberas et al., 2004).
Em planejamentos de experimentos, a fim de se determinar se certa variável de
resposta apresenta comportamento linear ou não linear, além dos experimentos nos níveis
inferior e superior, deve ser feito um experimento adicional nos níveis médios de cada uma
das variáveis (chamado de ponto central). Nessa condição, é importante realizar um mínimo
de três réplicas, pois a reprodutibilidade do experimento nesse ponto central do plano fatorial
permite estimar o erro experimental global, considerando que este erro é uniforme em todo o
plano experimental (Montgomery, 2001).
No caso específico da extração com solventes, no qual variáveis de processo e de
composição do solvente podem influenciar a resposta desejada, as técnicas de planejamento
fatorial e de planejamento de misturas podem ser associadas, promovendo uma melhor
resposta na obtenção dos resultados e um menor tempo de análise.
49
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar os solventes e as condições de processo para a extração diferencial de
isoflavonas e saponinas da soja.
3.2. Objetivos específicos
Definir, por meio de um experimento de extração preliminar, quais solventes serão
empregados em um estudo de extração utilizando o planejamento de experimentos;
Determinar o produto comercial que será utilizado como matéria-prima para a
produção de extratos à base de soja;
Determinar, por meio do planejamento experimental de misturas acoplado ao
planejamento fatorial, as condições de extração (tempo de extração, uso de ultrassom e
composição do solvente) ótimas para a obtenção de extratos à base de soja;
Avaliar a atividade antioxidante dos extratos obtidos pelos ensaios de FRAP e TEAC e
relacioná-la aos compostos bioativos avaliados;
Aplicar as condições estabelecidas no planejamento experimental em experimentos em
maior escala;
Caracterizar os extratos obtidos quanto aos teores de saponinas, isoflavonas e
compostos fenólicos minoritários por cromatografia líquida de alta eficiência com
detector de arranjo de diodos e acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-
EM).
50
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Reagentes
Nesse estudo foram utilizados os seguintes solventes de grau analítico: metanol,
etanol, acetato de etila, isopropanol, éter etílico, acetonitrila, ácido fórmico (Tedia Brazil® e
Vetec Química Fina®
, Brasil). Foram utilizados padrões analíticos de isoflavonas de soja
(genisteína, genistina, glicitina, gliciteína, daidzina e daidzeína) (Apin Chemicals Ltd®, Reino
Unido), padrões analíticos de outros compostos fenólicos (ácido 3,4-dihidroxibenzóico, ácido
3,4-dihidroxifenilacético, catequina (aglicona), ácido p-hidroxibenzóico, ácido
5-cafeioquínico, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido 2,4- dihidroxibenzóico, ácido caféico,
ácido siríngico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido trans-3-hidroxicinâmico, ácido
benzoico, rutina, miricitina, quercetina, ácido gálico) (Sigma Chemical Co, Alemanha),
mistura comercial de saponinas de soja (Wako Chemicals®, Japão), reagente de Folin-
Ciocalteu (Sigma-Aldrich®), cloreto de alumínio, vanilina e carbonato de sódio (Spectrum
®,
Canadá), ácido sulfúrico 98% (Emsure®, Alemanha), 2,2-azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-
sulfonato, sal de diamônio (ABTS), persulfato de potássio, cloreto férrico, tripiridiltriazina
(TPTZ), sulfato ferroso e polivinilpirrolidona (Merck®, Alemanha). Água Milli-Q
(Millipore®, Brasil) foi utilizada em todos os experimentos.
4.2. Amostras
Para a extração preliminar com misturas binárias de solventes foi adquirida uma
amostra comercial de fibra de soja da marca A.
4.3. Extração diferencial de compostos bioativos
4.3.1. Estudo Preliminar
4.3.1.1. Misturas binárias de solventes
Para a extração diferencial dos compostos bioativos foram utilizados os solventes
puros água, etanol, éter etílico e isopropanol e misturas binárias (v/v) desses solventes em
diferentes proporções: água:etanol (50:50), água:etanol (75:25), água:etanol (25:75),
51
água:isopropanol (50:50), água:isopropanol (75:25), água:isopropanol (25:75), etanol:éter
etílico (50:50), etanol:éter etílico (25:75). As diferentes proporções de solventes avaliados
foram realizadas de acordo com adaptações da literatura.
4.3.1.2. Extração
A amostra de fibra de soja foi submetida à extração, em duplicata, com os solventes
puros e as misturas binárias dos mesmos. Foi realizada também a extração com metanol
aquoso 80% como condição controle, visto que esse solvente é descrito na literatura como
sendo eficiente para a extração de compostos fenólicos totais e saponinas (Shi et al., 2005). A
dois gramas da fibra de soja foram adicionados 10 mL de solvente, sendo a extração realizada
em vortex por 3 min à temperatura ambiente. O extrato obtido foi centrifugado (Sorvall
ST16R, Thermo Scientific, EUA) a velocidade de 3.000 rpm por 15 min e o sobrenadante
coletado em balão volumétrico de 25 mL. O processo de extração foi repetido mais duas
vezes com 10 mL de solvente em cada etapa e os sobrenadantes foram combinados.
4.3.2. Planejamento de experimentos
4.3.2.1. Etapa de seleção de amostras
Foram avaliadas sete marcas comerciais de produtos à base de soja, adquiridas em
supermercados do estado do Rio de Janeiro. Esses produtos diferem-se de acordo com suas
características de produção entre amostras de fibra de soja (obtida a partir das cascas da soja
retiradas durante o processamento industrial do grão) das marcas Ae B, extrato de soja das
marcas A, C, D e E e leite de soja da marca D (extrato de soja, popularemente conhecido
como leite de soja, é o produto obtido a partir da emulsão aquosa resultante da hidratação dos
grãos de soja, seguido de processamento tecnológico adequado, podendo ser submetido à
desidratação total ou parcial).
4.3.2.2. Misturas ternárias de solventes
Após seleção da amostra comercial à base de soja (extrato de soja da marca E),
diferentes misturas ternárias de solventes foram testadas para a extração dos compostos
bioativos de interesse. Essas misturas foram definidas a partir de um planejamento de
52
misturas, ao qual foi aplicado uma restrição de concentração máxima de acetato de etila de
40%. O acetato de etila foi utilizado nas misturas de solventes supondo-se melhorar a extração
diferencial dos compostos de interesse quando associado à água e ao etanol, em especial,
devido à sua polaridade intermediária (índice de polaridade igual à 4,4). Além disso, o acetato
de etila apresenta baixa toxicidade (de acordo com a MSDS - Material Safety Data Sheet) e
sua utilização é permitida pela ANVISA /RDC nº 114 (1999) na concentração máxima de 10
mg/kg. A restrição de concentração máxima desse solvente em 40% foi aplicada ao
planejamento pois concentrações superiores dariam origem a misturas com baixa polaridade
e, consequentemente, baixo rendimento de extração dos compostos de interesse. Assim, foram
definidas nove diferentes misturas, sendo duas adicionais como pontos centrais, totalizando
onze misturas (Tabela 7).
Tabela 7: Misturas de solventes geradas pelo planejamento de misturas com restrição.
* (C) = Ponto Central
Associado ao planejamento de misturas foi realizado um planejamento fatorial
completo com ponto central (22), onde foram considerados os seguintes fatores: tempo de
extração em vortex (2, 4 e 6 min) e tempo de aplicação de banho de ultrassom (0, 2,5 e 5 min)
(Tabela 8).
Mistura Solventes
Água (%) Etanol (%) Acetato de etila (%)
1 100 0 0
2 0 100 0
3 60 0 40
4 0 60 40
5 0 80 20
6 80 0 20
7 50 50 0
8 (C)* 30 30 40
9 (C) 40 40 20
10 (C) 30 30 40
11 (C) 40 40 20
53
Tabela 8: Condições de extração geradas pelo planejamento fatorial completo com ponto
central.
Condição de extração Tempo (min.) Ultrassom (min.)
1 2 0
2 6 0
3 2 5
4 6 5
5 (C)* 4 2,5
6 (C) 4 2,5
* (C) = Ponto Central
Os dois planejamentos associados totalizaram 66 condições de extração independentes
(Tabela 9). As matrizes dos planejamentos de experimentos foram geradas pelo software
Statistica 7.0 (StatSoft®).
Tabela 9: Experimentos gerados pela associação do planejamento de misturas com restrição
ao planejamento fatorial completo.
Experimento Água
(%)
Etanol
(%)
Acetato de
etila (%)
Vortex
(min)
Ultrassom
(min)
1 100 0 0 2 0
2 0 100 0 2 0
3 60 0 40 2 0
4 0 60 40 2 0
5 0 80 20 2 0
6 80 0 20 2 0
7 50 50 0 2 0
8 30 30 40 2 0
9 40 40 20 2 0
10 40 40 20 2 0
11 30 30 40 2 0
12 100 0 0 6 0
13 0 100 0 6 0
14 60 0 40 6 0
15 0 60 40 6 0
16 0 80 20 6 0
17 80 0 20 6 0
18 50 50 0 6 0
19 30 30 40 6 0
20 40 40 20 6 0
21 40 40 20 6 0
22 30 30 40 6 0
23 100 0 0 2 5
54
4.3.2.3. Extração
A amostra de extrato de soja foi submetida à extração com os solventes puros e as
misturas binárias e ternárias (v/v/v) dos mesmos, descritas na Tabela 8. A dois gramas de
24 0 100 0 2 5
25 60 0 40 2 5
26 0 60 40 2 5
27 0 80 20 2 5
28 80 0 20 2 5
29 50 50 0 2 5
30 30 30 40 2 5
31 40 40 20 2 5
32 40 40 20 2 5
33 30 30 40 2 5
34 100 0 0 6 5
35 0 100 0 6 5
36 60 0 40 6 5
37 0 60 40 6 5
38 0 80 20 6 5
39 80 0 20 6 5
40 50 50 0 6 5
41 30 30 40 6 5
42 40 40 20 6 5
43 40 40 20 6 5
44 30 30 40 6 5
45 100 0 0 4 2,5
46 0 100 0 4 2,5
47 60 0 40 4 2,5
48 0 60 40 4 2,5
49 0 80 20 4 2,5
50 80 0 20 4 2,5
51 50 50 0 4 2,5
52 30 30 40 4 2,5
53 40 40 20 4 2,5
54 40 40 20 4 2,5
55 30 30 40 4 2,5
56 100 0 0 4 2,5
57 0 100 0 4 2,5
58 60 0 40 4 2,5
59 0 60 40 4 2,5
60 0 80 20 4 2,5
61 80 0 20 4 2,5
62 50 50 0 4 2,5
63 30 30 40 4 2,5
64 40 40 20 4 2,5
65 40 40 20 4 2,5
66 30 30 40 4 2,5
55
amostra de soja foram adicionados 10 mL de solvente, sendo a extração realizada à
temperatura ambiente em vortex, considerando-se as condições geradas no planejamento
fatorial (tempo de extração e uso de banho de ultrassom) (Tabela 9). O extrato obtido foi
centrifugado (3.000 rpm por 15 min) e o sobrenadante coletado em balão volumétrico de 25
mL. O processo de extração foi repetido mais duas vezes com 10 mL de solvente em cada
etapa e os sobrenadantes foram combinados. Apesar do volume total de solvente utilizado (30
mL) ser superior ao do balão volumétrico, a capacidade do mesmo não foi excedida, uma vez
que parte do solvente utilizado ficou retido no material sólido.
4.3.3. Extração com o reagente polivinilpirrolidona (PVP) adicionado ao solvente
Após a realização das extrações nas condições do planejamento de experimentos,
foram selecionadas três condições de extração para a adição de (PVP), em duas concentrações
diferentes: 0,1% e 1%. Nas três diferentes misturas do planejamento de experimentos
previamente selecionadas: mistura ternárias (água:etanol:acetato de etila 40:40:20); mistura
binária (água:acetato de etila 80:20) e etanol (100%) com utilização de vortex por 2 min e
sem utilização de ultrassom. A 2g da amostra de extrato de soja foi novamente extraída,
porém com a mistura em diferentes proporções do reagente PVP nas condições descritas
anteriormente.
4.3.4. Extração em maior escala
Para a realização da extração em maior escala, dois solventes (etanol puro e mistura
ternária água: etanol: acetato de etila 40:40:20) foram selecionados a partir dos resultados do
planejamento de experimentos. A 20g do extrato de soja foram adicionados 100 mL de
solvente, sendo a extração realizada em placa de agitação orbital à temperatura ambiente por
30 min e velocidade de 300 rpm. O extrato obtido foi centrifugado (300 rpm por 15 min) e o
sobrenadante coletado em balão volumétrico de 250 mL. Cada extração foi realizada em
duplicata.
4.4. Análise de compostos fenólicos totais por espectrofotometria
A análise de compostos fenólicos totais nos extratos foi realizada em triplicata de
acordo com o método descrito por Singleton et al. (1999). Alíquotas de 200 μL do extrato
56
foram transferidas para tubos de ensaios, seguido da adição de 1400 μL de água Milli-Q.
Após homogeneização, foram adicionados 100 μL do reagente de Folin-Ciocalteu e 300 μL de
carbonato de sódio a 20%. A mistura foi, então, levada ao banho-maria por 30 minutos à
temperatura de 40º C. A leitura das absorbâncias a 765 nm foi realizada em leitor de
microplacas Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer). Foram realizadas as análises dos
brancos de solvente. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes de ácido gálico
(EAG) por 100g. A curva padrão foi realizada com seis concentrações conhecidas de ácido
gálico (5, 10, 15, 25, 50 e 65 mg/L) obtidas a partir de uma solução estoque de 5000 mg/L.
4.5. Análise de flavonoides totais por espectrofotometria
A determinação dos teores de flavonoides totais nos extratos foi realizada em triplicata
de acordo com o método descrito por Tail et al. (2008). A alíquotas de 500 μL dos extratos
em tubos de ensaios foram adicionados 500 μL de solução etanólica de cloreto de alumínio
2%. Após homogeneização, os tubos foram armazenados à temperatura ambiente e ao abrigo
de luz por uma hora. A leitura das absorbâncias a 405 nm foi realizada em leitor de
microplacas Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer). A análise dos brancos de
solvente foi realizada. A curva de calibração foi realizada com seis concentrações conhecidas
de genisteína (8, 20, 50, 100, 150 e 200 mg/L), a partir de uma solução estoque de 500 mg/L
de genisteína e os resultados foram expressos em mg de equivalentes de genisteína (EG) por
100 g.
4.6. Análise de saponinas totais por espectrofotometria
A análise de saponinas totais foi realizada em triplicata de acordo com adaptações do
método descrito por Shiau et al. (2009). As alíquotas de 100 μL dos extratos em tubos de
ensaios foram adicionados 100 μL de solução etanólica de vanilina 10%. Após
homogeneização os tubos foram levado à banho de gelo por 5 minutos e adicionaram-se 1000
μL de solução de ácido sulfúrico 72%. Após nova homogeneização, os tubos foram levados
ao banho-maria por 10 minutos à temperatura de 60ºC e, em seguida, ao banho de gelo por
mais cinco minutos. A leitura das absorbâncias a 535 nm foi realizada em leitor de
microplacas Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer). A análise dos brancos de
solvente foi realizada. A curva de calibração foi realizada com seis concentrações conhecidas
de saponinas de soja (0,10; 0,20; 0,25; 0,40; 0,80 e 1,00 mg/mL), a partir de uma solução
57
estoque de 1,00 mg/mL de saponinas, preparada a partir da mistura comercial. Os resultados
foram expressos em mg de saponinas totais por 100g.
4.7. Capacidade Antioxidante
O ensaio de TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) foi realizado em
triplicata como descrito por Charurin et al. (2002), com algumas adaptações. As amostras
foram previamente diluídas com água Milli-Q em uma proporção de 1:10 (v/v). O radical
ABTS foi preparado no dia anterior à analise da seguinte forma: misturou-se 7mM do
reagente ABTS com 2,45 mM de persulfato de potássio em água Milli-Q, sendo a solução
mantida ao abrigo de luz em temperatura ambiente. No dia da análise, a solução de radical
ABTS foi diluída (1:50) em água Milli-Q, de maneira a obter uma solução com absorbância
de 0,68 a 0,72 em 720nm. O ensaio foi realizado em microplaca, onde adicionaram-se 10 L
da amostra. Em seguida, o injetor automático de um leitor de microplacas (Wallac 1420
Muitlabel Counter, Perkin Elmer) dispensou 190 µL da solução de radical ABTS, mantida em
banho maria à 37 ºC. A placa foi agitada e mantida a temperatura de 37ºC por 6 min, sendo
então feita a leitura da absorbância em 720 nm. A curva de calibração foi realizada utilizando
solução estoque padrão de Trolox a 2 mM com concentrações conhecidas (0,05; 0,1; 0,25;
0,5; 0,75 µmol de Trolox/L). Os resultados foram expressos em mmoles Trolox/g.
O ensaio de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) foi realizado em triplicata
como descrito por Benzie & Strain (1996), com algumas adaptações. O reagente de FRAP foi
preparado no dia da análise, utilizando o tampão acetato 300 mM (pH 3,6), cloreto férrico 20
mM e TPTZ 10 mM, na proporção de 10:1:1 (v/v/v) e uma alíquota de 20 µL da amostra
previamente diluída (1:10 v/v). O ensaio foi realizado em microplaca, onde adicionaram-se 20
L da amostra. Em seguida, o injetor automático de um leitor de microplacas (Wallac 1420
Muitlabel Counter, Perkin Elmer) dispensou 180 µL da solução do reagente de FRAP,
mantida em banho maria à 37 ºC. A placa foi agitada e mantida a temperatura de 37ºC por 4
min, sendo então feita a leitura da absorbância em 595 nm. A curva de calibração foi realizada
utilizando o solução estoque de sulfato ferroso a 10 mM com concentrações conhecidas (50;
100; 200; 400; 600; 750 µmol Fe +2
/L). Os resultados foram expressos em µmol de ferro
reduzido/g.
58
4.8. Análise de isoflavonas e saponinas por CLAE-DAD-EM
A análise cromatográfica foi realizada de acordo com a metodologia descrita por
Fonseca (2012). O sistema cromatográfico (Shimadzu, Kioto, Japão) consistiu em uma bomba
quaternária (LC-10ADvp), injetor manual (8125 Rheodyne, com loop de 20 μL), detector de
arranjo de diodos (SPD-M10Avp) e um forno para coluna (CTO-10ASvp). O sistema
cromatográfico foi acoplado a um espectrômetro de massas (LC-MS 2010, Shimadzu, Kioto,
Japão) equipado com uma fonte de íons do tipo electrospray. A separação cromatográfica foi
realizada em coluna C18 (5μm, 150 x 2,1 mm, Kromasil), mantida a temperatura constante de
40 ºC. A fase móvel consistiu em um gradiente (Tabela 10) entre uma solução aquosa com
0,3% de ácido fórmico (eluente A) e acetonitrila com 0,3% de ácido fórmico (eluente B), com
vazão de 0,3 mL/min e tempo total de corrida de 30 minutos.
Tabela 10: Gradiente de eluição para análise de isoflavonas e saponinas por CLAE-
DAD-EM.
Para a detecção por EM utilizou-se a fonte de ionização por electronspray no modo
positivo para isoflavonas e saponinas, com fluxo de nitrogênio de 3,0 L/min e monitoramento
seletivo de íons (SIM).
Os compostos foram identificados com base na comparação com o tempo de retenção
e a razão massa-carga (m/z) do íon pseudomolecular de seus respectivos padrões analíticos
comerciais adquiridos. Para os compostos que não possuíam padrões comerciais disponíveis,
a identificação foi realizada através do íon pseudomolecular na espectrometria de massas.
A quantificação foi realizada por calibração externa. Em relação às isoflavonas, foi
utilizado o sinal do DAD a 250 nm. Os teores das isoflavonas malonilglicosiladas e
acetilglicosiladas foram determinados a partir da curva de calibração do padrão de isoflavona
β-glicosilada correspondente, fazendo-se o ajuste para as diferenças de peso molecular. Para
as saponinas foi utilizado o sinal do EM, íon-base de m/z 423, sendo o mesmo um fragmento
característico das três saponinas (B-I, B-II e B-III) analisadas. A quantificação das saponinas
Tempo (min.) Eluente A (%) Eluente B (%)
0,03 85 15
1,00 77 23
17,00 77 23
23,00 50 50
30,00 85 15
59
B-II e B-III foi realizada de maneira conjunta, pois as mesmas não foram separadas na
cromatografia.
A concentração das soluções dos padrões variou de 0,1 a 5,0 μg/mL para as
isoflavonas daidzina, glicitina, genistina, daidzeína, gliciteína, genisteína e de 0,5 a 20,0
μg/mL para as saponinas B-I, B-II e B-III. As curvas de calibração obtidas apresentaram
valores de R2 maiores que 0,9956.
4.9. Análise de compostos fenólicos minoritários por CLAE-DAD-EM
Os compostos fenólicos foram identificados e quantificados, seguindo a metodologia
de John & Sahidi (2010), com algumas adaptações. O sistema cromatográfico utilizado foi o
mesmo descrito no item anterior. A separação cromatográfica foi realizada em coluna C18
(5μm, 150 x 2,1 mm, Kromasil), mantida a temperatura constante de 40ºC. A fase móvel
consistiu em um gradiente (Tabela 11) entre uma solução aquosa com 0,3% de ácido fórmico
(eluente A), metanol (eluente B) e acetonitrila (eluente C), com vazão de 0,4 mL/min e tempo
total de corrida de 20 minutos.
Tabela 11: Gradiente de eluição para análise de compostos fenólicos por CLAE-DAD-EM.
Para a detecção por EM utilizou-se a fonte de ionização por electronspray no modo
negativo, fluxo de nitrogênio de 3 L/min e SIM.
Os compostos foram identificados com base na comparação com o tempo de retenção
e a razão massa-carga (m/z) do íon pseudomolecular de seus respectivos padrões analíticos
comerciais adquiridos. A quantificação foi realizada por calibração externa utilizando-se o
sinal do íon pseudomolecular de cada composto.
Tempo (min.) Eluente A (%) Eluente B (%) Eluente C (%)
0,03 84 15,25 0,75
7,00 66 32,45 1,55
14,00 50 47,65 2,35
20,00 31 65,85 3,15
60
4.10. Análises estatísticas
Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão. As diferenças entre os
teores de compostos bioativos dos extratos obtidos foram avaliadas por ANOVA com pós-
teste de Tukey. Foram consideradas significativas diferenças com p < 0,05. Associações entre
os teores de compostos bioativos nos extratos e sua atividade antioxidante foram avaliadas por
correlação de Pearson. O planejamento de experimentos foi realizado utilizando o software
Statistica 7.0 e as demais análises estatísticas foram realizadas com o software Prism
(GraphPad, versão 6.0).
61
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Estudo preliminar: extração com misturas binárias de solventes
Os teores de compostos fenólicos totais e de saponinas totais na amostra de fibra de
soja submetida à extração utilizando-se os diferentes solventes puros e as misturas binárias de
solventes testados são apresentados na Tabela 12.
Tabela 12: Teores de compostos fenólicos totais e saponinas em amostra de fibra de soja
submetida à extração com diferentes solventes puros e suas misturas binárias1.
Solvente de extração Compostos fenólicos totais
(mg EAG2/g)
Saponinas totais
(mg/g)
Água 1,19 ± 0,04ª 6,68 ± 0,08a
Etanol ND3 2,33 ± 0,06
b
Isopropanol ND n.d.4
Éter etílico ND 1,68 ± 0,15c
Água:etanol (75:25) 0,93 ± 0,06b,d
11,36 ± 0,22d
Água:etanol (50:50) 1,15 ± 0,03a,b
16,42 ± 0,26e
Água:etanol (25:75) 1,06 ± 0,00c,f
14,36 ± 0,14f
Água:isopropanol (75:25) 0,98 ± 0,03c,d,f
n.d.
Água:isopropanol (50:50) 1,01 ± 0,05c,d
n.d.
Água:isopropanol (25:75) 0,84 ± 0,00e n.d.
Etanol:éter etílico (50:50) 0,10 ± 0,00g 2,03 ± 0,09
b,c
Etanol:éter etílico (25:75) 0,10 ± 0,01g 1,69 ± 0, 10
c
Metanol:água (80:20) 0,90 ± 0,06e,f
12,56 ± 0,11i
1Os resultados estão expressos na forma de média ± desvio-padrão (n=3). Médias na mesma coluna com
letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (ANOVA com pós-teste de Tukey; p<0,05); 2EAG: equivalentes de ácido gálico;
3ND: não detectado;
4n.d.: não determinado.
Os teores de compostos fenólicos e saponinas observados na amostra de fibra de soja
analisada no presente trabalho estão de acordo com os resultados relatados na literatura para
outras amostras de alimentos à base de soja, independentemente do uso de diferentes
combinações de solventes (Barbosa et al., 2006; Jin et al., 2006 ). Cabe ressaltar que os
resultados obtidos para os teores de compostos fenólicos são uma boa aproximação dos teores
de isoflavonas, visto que em alimentos à base de soja um mínimo de 72% dos compostos
fenólicos presentes são isoflavonas (Seo & Morr, 1984). Além disso, a amostra de fibra de
soja analisada nesse estudo apresentou teor mais elevado de saponinas do que de compostos
fenólicos totais, o que contraria o senso comum de que esses tipos de alimentos possuem
majoritariamente isoflavonas como compostos bioativos.
Foi observado que a utilização de diferentes solventes influenciou na extração dos
compostos fenólicos e das saponinas presentes na fibra de soja. A extração máxima de
62
compostos fenólicos ocorreu quando foram utilizados os solventes água pura (1,19 mg
EAG/g) e água:etanol (50:50) (1,15 mg EAG/g). A extração máxima de saponinas ocorreu
quando a mistura binária dos solventes água:etanol (50:50) (16,42 mg/g) foi utilizada. A
extração com metanol aquoso 80% foi realizada pois esse solvente é considerado como sendo
adequado para extrair simultaneamente isoflavonas e saponinas de alimentos à base de soja,
conforme já mencionado anteriormente (Coward et al., 1993; Tsao & Deng, 2004; Shi et al.,
2005). Entretanto, apesar dos teores de compostos fenólicos totais e de saponinas extraídos
utilizando metanol aquoso 80% terem sido elevados, esse solvente não foi aquele que
proporcionou a extração máxima desses compostos.
A utilização de etanol, isopropanol e éter etílico puros, assim como misturas binárias
contendo éter etílico, foram ineficientes para a extração dos compostos fenólicos presentes na
amostra de fibra de soja. É interessante notar que a eficiência de extração de compostos
fenólicos dependeu fortemente da presença de água na mistura utilizada. Lapornik et al.
(2005) e Liyana-Pathirana & Shahidi (2005) relataram que a água, combinada com outros
solventes orgânicos, contribui para criar um meio moderadamente polar, favorecendo a
extração de compostos fenólicos totais em grãos integrais e farelo de trigo. Turkemn et al.
(2006) verificaram que acetona aquosa 50% foi o solvente mais eficiente para a extração de
compostos fenólicos de erva-mate. Contudo, esses autores relataram que, diferentemente do
que observou-se no presente estudo, a água pura foi o solvente menos eficiente para a
extração de compostos fenólicos de erva-mate e chá preto.
Em relação à extração de saponinas, foi observado que as misturas binárias de água e
etanol foram aquelas mais eficientes, mesmo quando comparadas aos mesmos solventes
puros. Güçlü-Üstündağ et al. (2007) avaliaram o efeito de diferentes solventes (água, metanol,
etanol e misturas binárias de etanol e água nas proporções de 50:50 e 80:20) na extração
acelerada com solvente e na extração ultrassônica de saponinas de uma gramínea utilizada
como ração animal e verificaram que a mistura de etanol e água (80:20) foi a mais eficiente
para a extração das saponinas. Shiau et al. (2009) relataram que a mistura de etanol e água
(50:50) foi eficiente para a extração de saponinas presentes em frutos do gênero Sapindus. Os
resultados desses trabalhos publicados na literatura corroboram aqueles observados no
presente estudo de que misturas binárias de água e etanol são eficientes para a extração de
saponinas.
Assim como para a extração de compostos fenólicos, a utilização de éter etílico e das
misturas binárias contendo esse solvente foi ineficiente para a extração de saponinas da
amostra de fibra de soja. Não foi possível realizar a análise de saponinas nos extratos que
63
continham isopropanol como solvente, em qualquer proporção, pois o branco desse solvente
apresentou coloração intensa, sendo considerado, portanto, um interferente.
Os percentuais de extração de compostos fenólicos totais e de saponinas utilizando
água, etanol, éter etílico e suas misturas binárias, assim como metanol aquoso 80%, em
relação à condição máxima de extração de cada uma dessas classes de compostos são
apresentados na Figura 11. A partir da análise dos resultados apresentados nessa figura é
possível afirmar que na condição de extração máxima para compostos fenólicos (água pura),
somente 41% da quantidade de saponinas presentes na fibra de soja foi extraída. Dessa
maneira, a utilização de água pura favorece o empobrecimento de saponinas da fibra de soja,
ao mesmo tempo em que apresenta excelente rendimento para extração de compostos
fenólicos.
Figura 11: Percentuais de extração de compostos fenólicos totais e saponinas, em relação à
condição máxima de extração, utilizando diferentes solventes puros e misturas binárias.
Em contrapartida, na condição que apresenta o melhor rendimento para a extração de
saponinas (água:etanol 50:50), não ocorreu um empobrecimento do teor de compostos
fenólicos presentes na fibra de soja. Para a obtenção de um extrato empobrecido em
compostos fenólicos e enriquecido em saponinas, o uso de etanol e éter etílico puros seria os
mais adequados. Apesar de ambos os solventes apresentarem baixo rendimento para a
extração de saponinas, os extratos etanólico ou etéreo obtidos são isentos de compostos
fenólicos. O rendimento obtido pelo uso de etanol (14%) foi significativamente superior
64
aquele obtido pelo uso do éter etílico (10%) e, desta forma, o etanol seria a opção mais
adequada para a extração diferencial de saponinas e compostos fenólicos totais.
5.2. Planejamento de experimentos: extração com misturas ternárias de solventes
5.2.1. Seleção das amostras
As sete amostras comerciais de produtos à base de soja foram submetidas à extração
com metanol 80% e os teores de compostos fenólicos totais e de saponinas totais foram
determinados nesses extratos (Tabela 13). O teor de saponinas totais não pôde ser
determinado na amostra de fibra de soja da marca B, pois algum componente da formulação
do produto, provavelmente um carboidrato, foi interferente na reação colorimétrica.
Considerando o baixo rendimento do extrato rico em saponinas obtido no experimento
preliminar, a amostra a ser utilizada no planejamento de experimentos foi selecionada de
acordo com a razão entre os teores de saponinas e de compostos fenólicos, assim como o
teor absoluto de saponinas. Assim, a amostra de extrato de soja da marca E foi selecionada,
uma vez que apresentou a maior razão entre saponinas e compostos fenólicos (40,0), assim
como o maior teor de saponinas totais (31,3 mg/g).
Tabela 13: Teores de fenólicos totais e saponinas nas amostras comerciais de produtos à base
de soja submetida à extração com metanol 80%.
Amostra (marca) Compostos fenólicos
(mgEAG/g)
Saponinas totais
(mg/g)
Razão
saponinas/compostos fenólicos
Fibra de Soja (A) 2,21 ± 0,62 15,2 ± 0,52 6,90
Extrato de Soja (B) 2,27 ± 0,05 18,4 ± 2,72 8,10
Fibra de Soja (B) 0,90 ± 0,06 12,6 ± 0,11 13,9
Extrato de Soja (C) 0,79 ± 0,01 17,4 ± 2,61 22,1
Leite de Soja (D) 1,68 ± 0.06 nd2 Nd
Extrato de soja (D) 0,83 ± 0,03 27,1 ± 0,03 32,7
Extrato de soja (E) 0,78 ± 0,05 31,3 ± 1,82 40,0
1Resultados expressos como média ± desvio-padrão (n=3); Coeficiente de Variação (CV) < 10%; EAG: equivalentes de ácido
gálico; 2nd: não determinado
5.2.2. Solventes selecionados
Avaliando-se os resultados do estudo preliminar de extração com misturas binárias, a
água e o etanol foram selecionados como solventes para o planejamento de misturas ternárias
65
em função da sua elevada polaridade (índices de polaridade de Burdick & Jackson: água =
9,0; etanol = 5,2) e eficiência observadas para a extração das duas classes de compostos
bioativos. Já o isopropanol (índice de polaridade = 3,9) e o éter etílico (índice de polaridade =
2,8), solventes mais apolares e que supostamente poderiam favorecer a extração das
saponinas, não apresentaram resultados satisfatórios, sendo ineficientes tanto para extração de
compostos fenólicos quanto para extração de saponinas. Além disso, o isopropanol puro e as
suas misturas binárias foram considerados como interferentes na análise de saponinas totais.
Outra desvantagem desses dois solventes é sua toxidez, que apesar de moderada, poderia
dificultar a utilização destes extratos em estudos in vivo posteriores.
Com o objetivo de introduzir um solvente de menor polaridade, selecionou-se o
acetato de etila, pois o mesmo apresenta polaridade intermediária (índice de polaridade = 4,4).
Além disso, o acetato de etila apresenta baixa toxicidade (LD50 em ratos = 4100 mg/kg;
MSDS – Material Safety Data Sheet) e, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), de acordo com a Resolução no 104 de 1999, sua utilização em alimentos é
permitida, desde que o produto final apresente, no máximo, 10 mg/kg do solvente.
A adição de um solvente de menor polaridade poderia promover a extração diferencial
dos compostos bioativos de interesse. Jin et al. (2006) utilizaram mistura aquosa de etanol
para melhorar a performance de extração de saponinas de soja e observaram um percentual de
recuperação de extração de aproximadamente 98% de saponinas de soja. Spigno et al. (2006)
afirmaram que solventes como metanol, etanol, acetona, propanol e acetato de etila são
comumente utilizados para extração de compostos fenólicos em alimentos, por melhorar a
solubilidade destes compostos, e consequentemente o rendimento de extração. Os mesmos
autores também afirmaram que a adição de água melhora a taxa de extração desses
compostos.
5.2.3. Efeito das diferentes misturas ternárias de solventes e dos diferentes fatores associados
Para avaliar o efeito da composição do solvente e das variáveis de processo sobre a
extração das diferentes classes de compostos bioativos, foram utilizadas as 66 condições
previamente determinadas pelo planejamento de experimentos de misturas associado ao
planejamento fatorial completo (22). Em cada extrato obtido, foram determinados os teores de
saponinas totais, flavonoides totais e compostos fenólicos totais e calculada a razão entre
saponinas totais e compostos fenólicos (Tabela 14).
66
Tabela 14: Teores de saponinas, flavonoides e compostos fenólicos totais e razão entre os
teores de saponinas e compostos fenólicos (sap/fen) nos extratos obtidos a partir do
planejamento de mistura acoplado ao planejamento fatorial completo1 (continua na página
seguinte).
Exp2
Saponinas
totais (mg/g)
Flavonoides
(mgEG/g)
Compostos
fenólicos
(mgEAG/g)
Razão
sap/fen
1 11,5 ± 1,0 0,74 ± 0,04 1,28 ± 0,11 8,7 ± 1,8
2 4,3 ± 0,4#,‡
0,46 ± 0,15 ND3 ∞
3 12,2 ± 0,2 0,82 ± 0,07 2,17 ± 0,01 5,6 ± 0,1
4 4,7 ± 0,5#,‡
1,36 ± 0,08 0,08 ± 0,02 56,9 ± 18,6†
5 5,3 ± 0,4 1,07 ± 0,11 0,04 ± 0,01 139,3 ± 37,3*
6 13,3 ± 1,0 0,41 ± 0,03‡ 2,74 ± 0,07
*,† 4,8 ± 0,3
7 17,5 ± 0,5* 2,32 ± 0,01
* 2,97 ± 0,10
* 5,9 ± 0,1
8 18,5 ± 1,2* 2,30 ± 0,15
* 2,94 ± 0,08
* 6,3 ± 0,5
9 19,3 ± 2,2* 2,15 ± 0,16
*,† 2,76 ± 0,01
*,† 7,0 ± 0,8
10 15,5 ± 5,1*,†
2,35 ± 0,19* 2,62 ± 0,30
*,† 6,0 ±2,3
11 19,6 ± 0,8* 2,46 ± 0,04
* 3,02 ± 0,11
* 6,5 ± 0,3
12 7,8 ± 0,1 0,67 ± 0,03 2,63 ± 0,01*,†
3,0 ± 0,0
13 3,5 ± 1,3#,‡
0,20 ± 0,02#,‡
0,23 ± 0,02 14,8 ± 4,5
14 5,1 ± 0,7 ‡ 0,81 ± 0,02 2,01 ± 0,08 2,6 ± 0,4
15 2,5 ± 0,1#,‡
0,19 ± 0,00#,‡
0,22 ± 0,05 12,0 ± 3,3
16 5,8 ± 0,4 0,19 ± 0,00#,‡
ND ∞
17 14,3 ± 1,0*,†
0,70 ± 0,03 2,03 ± 0,13 7,3 ± 0,9
18 11,9 ± 0,1
1,71 ± 0,08 2,52 ± 0,14*,†
4,9 ± 0,0
19 13,3 ± 1,4
1,70 ± 0,07
2,37 ± 0,15†
5,8 ± 1,1
20 14,8 ± 1,1*,†
2,53 ± 0,12*
2,71 ± 0,09*,†
5,4 ± 0,8
21 15,9 ± 0,8*,†
2,41 ± 0,05*
2,60 ± 0,09*,†
6,4 ± 0,5
22 13,5 ± 0,8
1,94 ± 0,21†
2,74 ± 0,02*,†
4,8 ± 0,2
23 9,9 ± 0,8 0,51 ± 0,03 1,58 ± 0,21 6,6 ± 1,4
24 1,9 ± 0,0
#,‡ 0,13 ± 0,02
#,‡ ND ∞
25 14,5 ± 0,2*,†
0,65 ± 0,00
2,79 ± 1,02*,†
5,6 ± 2,1
26 1,2 ± 0,0#,‡
0,09 ± 0,01#,‡
ND ∞
27 0,3 ± 0,1#
0,10 ± 0,01#,‡
ND ∞
28 12,5 ± 0,6 0,60 ± 0,03 0,71 ± 0,00 17,6 ± 1,2
29 15,3 ± 1,7*,†
1,22 ± 0,04 2,93 ± 0,20* 5,2 ± 0,3
30 15,0 ± 1,4*,†
1,29 ± 0,05 2,68 ± 0,22*,†
5,6 ± 0,2
31 16,0 ± 0,9*,†
1,45 ± 0,06 2,93 ± 0,08* 5,5 ± 0,4
32 16,2 ± 0,8*,†
1,29 ± 0,06
2,88 ± 0,15*,†
5,6 ± 0,5
33 16,2 ± 0,5#,‡
1,65 ± 0,17 2,66 ± 0,08*,†
6,1 ± 0,1
34 9,5 ± 1,0 0,67 ± 0,03 2,66 ± 0,08*,†
3,6 ± 0,5
35 2,3 ± 0,0#,‡
0,34 ± 0,01#,‡
ND ∞
36 8,4 ± 0,3 0,57 ± 0,02 1,68 ± 0,07 5,0 ± 0,2
37 2,9 ± 0,2#,‡
0,34 ± 0,03#,‡
ND ∞
38 3,0 ± 0,0#,‡
0,73 ± 0,27 ND ∞
39 9,8 ± 0,8 0,71 ± 0,06 2,39 ± 0,08 4,1 ± 0,4
40 14,8 ± 1,1*,†
1,71 ± 0,05 2,98 ± 0,04* 5,0 ± 0,4
41 15,4 ±1,5 *,†
1,64 ± 0,07 2,47 ± 0,03*,†
6,2 ± 0,6
42 14,2 ± 1,5*,†
1,79 ± 0,13 2,56 ± 0,08*,†
5,5 ± 0,3
43 15,4 ± 0,0*,†
1,51 ± 0,11 2,79 ± 0,13*,†
5,4 ± 0,0
67
44 15,8 ± 0,3*,†
1,65 ± 0,03 2,71 ± 0,25#,‡
5,9 ± 0,5
45 7,6 ± 0,2 0,80 ± 0,06 1,05 ± 0,06#,‡
7,2 ± 0,5
46 2,5 ± 0,1#,‡
0,22 ± 0,02#,‡
ND ∞
47 2,5 ± 0,3#,‡
0,81 ± 0,04 0,45 ± 0,05 5,1 ± 1,0
48 2,5 ± 0,3#,‡
0,27 ± 0,00#,‡
ND ∞
49 2,5 ± 0,2#,‡
0,18 ± 0,00#,‡
ND ∞
50 3,2 ± 0,3#,‡
0,68 ± 0,01 0,56 ± 0,06 5,8 ± 0,1
51 12,5 ± 0,3 1,53 ± 0,06 2,07 ± 0,06#,‡
6,0 ± 0,3
52 13,8 ± 0,1† 1,18 ± 0,02 1,91 ± 0,03 7,2 ± 0,1
53 8,5 ± 0,8 1,48 ± 0,15 1,15 ± 0,10 7,4 ± 0,2
54 12,7 ± 0,3 1,34 ± 0,02 1,89 ± 0,09#,‡
6,7 ± 0,3
55 12,5 ± 0,7 1,47 ± 0,06 1,80 ± 0,07#,‡
7,1 ± 0,5
56 6,1 ± 0,2 0,74 ± 0,01 2,48 ± 0,12#,‡
2,5 ± 0,2
57 2,8 ± 0,3#,‡
0,07 ± 0,01#,‡
ND ∞
58 12,7 ± 0,8 0,82 ± 0,02 1,35 ± 0,40#,‡
9,5 ± 2,9
59 2,6 ± 0,6#,‡
0,22 ± 0,02#,‡
0,03 ± 0,01‡ 95,2 ± 43,7
†
60 3,4 ± 0,0#,‡
0,10 ± 0,01#,‡
ND ∞
61 2,4 ± 0,3#,‡
0,66 ± 0,02 0,79 ± 0,06# 3,0 ± 0,4
62 10,4 ± 1,1
1,25 ± 0,03
2,78 ± 0,13#,‡
3,7 ± 0,2
63 7,1 ± 1,1 1,17 ± 0,03 2,12 ± 0,09#,‡
3,4 ± 0,6
64 14,4 ± 0,1*,†
1,52 ± 0,14 2,63 ± 0,03#,‡
5,4 ± 0,0
65 15,0 ± 1,0*,†
1,52 ± 0,10 2,46 ± 0,09 6,1 ± 0,5
66 16,0 ± 0,4*,†
1,31 ± 0,02 2,52 ± 0,12*,†
6,2 ± 0,4 1Valores expressos como média ± desvio-padrão de três replicatas. Em cada coluna, os valores máximos
(símbolos * e † sobrescritos) e mínimos (símbolos # e ‡ sobrescritos) foram avaliados por ANOVA seguida de
pós-teste de Tukey (p<0,05). 2As condições de cada experimento estão apresentadas na Tabela 9.
3Não
Detectado. Nesses casos, a razão tende ao infinito (∞) pois o teor de compostos fenólicos foi igual a zero.
Avaliando os resultados obtidos, nota-se que as condições em que ocorreu,
simultaneamente, o máximo de extração de saponinas totais, flavonoides e compostos
fenólicos totais (p<0,05) foram aquelas dos experimentos 7, 8, 9, 10, 11, 20 e 21. Nesses
experimentos, o teores de saponinas, flavonoides e compostos fenólicos variaram entre 14,8 e
19,6 mg/g, 2,15 e 2,53 mg EG/g e 2,60 e 3,02 mg EAG/g, respectivamente. É interessante
notar que todos esses experimentos empregaram uma das misturas ternárias de água, etanol e
acetato de etila geradas pelo planejamento de experimentos (30:30:40 ou 40:40:20), com
exceção do experimento 7 que utilizou uma mistura binária de água e etanol (50:50). Além
disso, em nenhum desses experimentos foi empregado o ultrassom, um dos fatores avaliados
através do planejamento fatorial completo (22). Cabe ressaltar ainda que os experimentos 9 e
11 e 8 e 10 são duplicatas dos pontos centrais do planejamento e apresentaram o mesmo
comportamento, conforme esperado.
Considerando os experimentos que proporcionaram o máximo de extração de
saponinas totais, observou-se que as condições de extração também levaram à extração
máxima de compostos fenólicos. Consequentemente, nenhuma destas condições foi adequada
68
para a obtenção de um extrato rico em saponinas e pobre em isoflavonas. Dessa maneira, para
a obtenção de um extrato o mais purificado possível em relação às saponinas, foi utilizado
como primeiro critério de escolha os experimentos nos quais não foram identificados
compostos fenólicos pelo método de análise espectrofotométrico. 13 condições experimentais
satisfizeram esse primeiro critério, sendo elas: 2, 16, 24, 26, 27, 35, 37, 38, 46, 48, 49, 57 e
60.
É interessante notar que em nenhum desses experimentos o solvente utilizado continha
água na sua composição. Essa observação está de acordo com alguns estudos publicados na
literatura que indicam que a extração de compostos fenólicos é fortemente influenciada pela
quantidade de água que é aplicada no sistema de extração (Liyana-Pathirana & Shahidi,
2005). Os solventes utilizados nos experimentos citados foram o etanol puro ou misturas
binárias de etanol e acetato de etila (80:20 ou 60:40). Essa observação foi confirmada pelo
diagrama de Pareto (modelo representativo dos efeitos que são estatisticamente importantes)
gerado no planejamento, em que os efeitos do acetato de etila e do etanol na composição da
mistura de solvente foram significativos para a extração das saponinas totais.
O segundo critério utilizado foi selecionar a condição para a obtenção de um extrato
purificado em saponinas, desta forma selecionou-se os teores absolutos de saponinas totais e
flavonoides. Dessa maneira, das 13 condições pré-selecionadas, duas destacaram-se, pois
apresentaram teores elevados de saponinas totais e teores baixos de flavonoides (p < 0,05):
experimento 2, no qual foi utilizado etanol puro como solvente de extração e experimento 16,
no qual foi utilizado a mistura binária de etanol e acetato de etila (80:20). Nessas condições,
os teores de saponinas totais e de flavonoides foram de 4,3 e 5,8 mg/g e 0,46 e 0,19 mg EG/g,
respectivamente.
Considerando que o etanol é um solvente com menor custo, menos poluente,
renovável e de menor toxicidade (Lutermann et al., 1998; Kim et al., 2005; Hill et al., 2006),
selecionou-se as condições do experimento 2 (solvente de extração = etanol puro; agitação em
vortex = 2 minutos; sem uso de ultrassom) para a obtenção do extrato purificado em
saponinas.
Como o rendimento proporcionado pela condição do experimento 2 foi baixo,
selecionou-se também uma condição alternativa, no intuito de aumentar o rendimento em
relação às saponinas, com um pequeno comprometimento da pureza em relação à presença de
compostos fenólicos. Para tal fim, o experimento 28, no qual utilizou-se como solvente a
mistura binária de água e acetato de etila (80:20), agitação em vortex por 2 minutos e
ultrassom por 5 minutos, foi selecionado. O teor de saponinas totais obtido nesse experimento
69
foi de 12,5 mg/g, significativamente maior (p < 0,05) que aquele obtido no experimento 2 (4,3
mg/g), ao passo que o teor de flavonoides foi de 0,60 mg EG/g não sendo, portanto,
significativamente diferente (p < 0,05) daquele obtido no experimento 2 (0,46 mg EG/g).
Cabe destacar que no experimento 28, foi utilizado o ultrassom, que de acordo com Vinatoru
(2001) ajuda na extração de compostos bioativos, oferecendo vantagens como a redução do
tempo de extração e da temperatura, preservando os compostos termolábeis.
Os resultados relativos aos experimentos selecionados para a obtenção de um extrato
rico em todas as classes de compostos bioativos (experimentos 9 e 11) e de um extrato rico
em saponinas e pobre em isoflavonas (experimentos 2 e 28) são apresentados na Tabela 15.
Tabela 15: Teores de saponinas (mg/g), compostos fenólicos (mg EAG/g) e flavonoides (mg
EG/g) em extratos selecionados do planejamento de misturas associado ao planejamento
fatorial completo1.
Experimento Solvente de extração Vortex
(min)
Ultrassom
(min) Saponinas Flavonoides
Compostos
fenólicos
9 (C)2 H2O/EtOH/AcOEt (40:40:20) 2 0 19,3 ± 2,2 2,15 ± 0,16 2,76 ± 0,01
11(C) H2O/EtOH/AcOEt (40:40:20) 2 0 19,6 ± 0,8 2,46 ± 0,04 3,02 ± 0,11
2 EtOH 2 0 4,3 ± 0,4 0,46 ± 0,15 ND3
28 H2O/AcOEt (80:20) 2 5 12,5 ± 0,6 0,60 ± 0,03 0,71 ± 0,00 1Coeficiente de variação (CV) de todas as extrações < 10%; EAG: equivalentes de ácido gálico; EG: equivalentes de
genisteína. 2Os experimentos 9 e 11 são replicatas do ponto central (C) do planejamento. 3Não detectado.
Nessas condições selecionadas, foi avaliado o efeito da adição de PVP na extração dos
compostos de interesse. A PVP é um polímero solúvel em água e em alguns solventes
orgânicos amplamente utilizados por indústrias alimentícias. Esse polímero foi adicionado às
misturas de solventes nas concentrações de 0,1% e 1% (p/v). Entretanto, quando adicionado
na mistura binária de água e acetato de etila (80:20) na concentração de 1%, o polímero
promoveu a formação de duas fases, impedindo a extração dos compostos de interesse. Nos
outros solventes, a adição de 1% de PVP impossibilitou as análises espectrofotométricas, já
que houve formação de coloração intensa com o branco dos diferentes solventes utilizados.
Quando adicionado aos solventes na concentração de 0,1%, o polímero não promoveu
separação de fases nem ocasionou interferência analítica. Contudo, nesses extratos não foram
detectados os compostos de interesse. Supõe-se que o polímero pode ter ocasionado um efeito
do tipo salting-out, competindo pelo solvente e diminuindo a solubilização dos compostos
bioativos nos mesmos.
A partir dos resultados obtidos no planejamento de misturas acoplado ao planejamento
fatorial completo, foram geradas superfícies de resposta que permitem avaliar como os fatores
influenciam as variáveis de resposta. Na Figura 12 são apresentadas as superfícies de
70
resposta (saponinas totais, flavonoides e compostos fenólicos) geradas pelo planejamento de
misturas, fixando-se as variáveis de processo do planejamento fatorial (vortex = 2 min;
ultrassom = 5 min).
Fitted Surface; Variable: Teor de Flavonoides (mgEG/g)
DV: Teor de Flavonoides (mgEG/g); R-sqr=.8839; Adj:.7679
Model: Quadratic
0,14
0,12
0,10
0,80
0,60
0,40
0,20
0
0%
25%
50%
75%
100%
Acetato de Etila (%): 30%
25%
50%
75%
100%
Água (%): 1
0% 25% 50% 75% 100%
Etanol (%): 2
Fitted Surface; Variable: Teor de compostos fenólicos (MgEAG/g)
DV: Teor de compostos fenólicos (MgEAG/g); R-sqr=.89; Adj:.7801
Model: Quadratic
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0%
25%
50%
75%
100%
Acetato de Etila (%): 30%
25%
50%
75%
100%
Água (%): 1
0% 25% 50% 75% 100%
Etanol (%): 2
(B)
(C)
Fitted Surface; Variable: Teor de Saponinas totais (mg/g)
DV: Teor de Saponinas totais (mg/g); R-sqr=.9601; Adj:.9202
Model: Quadratic
20,00
16,00
12,00
8,00
4,0
0%
25%
50%
75%
100%
Acetato de Etila (%): 30%
25%
50%
75%
100%
Água (%): 1
0% 25% 50% 75% 100%
Etanol (%): 2
(A)
Figura 12: Superfícies de resposta das variáveis dependentes (teor de saponinas totais (A),
flavonoides (B) e compostos fenólicos(C)) geradas pelo programa Statistica 7.0.
Considerando-se as regiões de máximo de saponinas (Figura 12A) e de mínimo de
compostos fenólicos (Figura 12A) e de flavonoides (Figura 12C), podemos selecionar uma
região de sobreposição das mesmas (Figura 13). Essa região representa as misturas de
solvente ideais (quantidades de água, etanol e acetato de etila variando de 15% a 35%, 15% a
35% e 50% a 62%, respectivamente) para a obtenção de um extrato rico em saponinas e pobre
em compostos fenólicos e flavonoides. É importante ressaltar que nessa região, as quantidades
de acetato de etila são superiores àquelas testadas experimentalmente (máximo de 40%). Não
71
foi encontrada, no entanto, nenhuma região que fosse a sobreposição das regiões de mínimo
de saponinas e de máximo de flavonoides e de compostos fenólicos.
Fitted Surface; Variable: Teor de Saponinas totais (mg/g)
DV: Teor de Saponinas totais (mg/g); R-sqr=.9601; Adj:.9202
Model: Quadratic
20,00
16,00
12,00
8,00
4,0
0%
25%
50%
75%
100%
Acetato de Etila (%): 3
0%
25%
50%
75%
100%
Água (%): 1
0% 25% 50% 75% 100%
Etanol (%): 2
Figura 13: Superfícies de resposta sobrepondo os valores de teor mínimo de flavonoides
(representado por ) e de compostos fenólicos (representado por ) sobre o valor de teor
máximo de saponinas totais (representado por ), tendo como ponto de convergência ideal
para a obtenção de um extrato rico em saponinas e pobre em compostos fenólicos o item
representado pelo símbolo ( ).
A atividade antioxidante de todos os 66 extratos obtidos através do planejamento de
experimentos foi determinada pelos ensaios de FRAP e TEAC. Foram encontradas
correlações entre a atividade antioxidante e os teores de compostos fenólicos (r > 0,51; p =
0,0001), flavonoides (r > 0,51; p = 0,0001) e saponinas (r > 0,46; p = 0,0001) (Figura 14).
Apesar dos valores de correlação não terem sido elevados, possivelmente devido aos
inúmeros interferentes analíticos e as várias condições de extração utilizadas, todos foram
significativos.
Os resultados encontrados são consistentes com estudos da literatura, nos quais
demonstrou-se que a atividade antioxidante de produtos derivados da soja está relacionada
principalmente aos compostos fenólicos presentes, em especial às isoflavonas. Barbosa et al.
(2006) analisaram a soja e produtos derivados do grão e relataram que a atividade
antioxidante desses produtos variou significativamente, o que estava associado não apenas aos
teores de compostos fenólicos totais, mas também às formas de isoflavonas presentes. Além
disso, já foi relatado na literatura que as saponinas também podem apresentar atividade
72
antioxidante, principalmente as saponinas de soja do grupo B que estão ligadas ao radical
DDMP (Yoshiki et al. 1998; Hu et al. 2002).
r= 0,57p= 0,0001
r= 0,46p= 0,0001
r= 0,51p= 0,0001
r= 0,56p= 0,0001
C o m p o s to s fe n ó lic o s (m g E A G /g )
TE
AC
(
mo
l T
rolo
x/g
)
0 1 2 3 4
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
C o m p o s to s fe n ó lic o s (m g E A G /g )
FR
AP
(
mo
l F
e+
2/g
)
0 1 2 3 4
0
2
4
6
8
1 0
r= 0,70p= 0,0001
r= 0,51p= 0,0001
Figura 14: Correlações entre os teores de saponinas totais, flavonoides e compostos fenólicos
e a atividade antioxidante medida pelos ensaios de TEAC e FRAP.
Também foi encontrada correlação positiva significativa entre os valores de atividade
antioxidante medidas pelos ensaios de FRAP e TEAC (r = 0,32; p = 0,0099) (Figura 15),
sugerindo assim que os componentes antioxidantes nos extratos são capazes tanto de reduzir o
complexo TPTZ-Fe3+
na reação do ensaio FRAP quanto converter o cátion-radical ABTS à
sua forma não-radicalar na reação do ensaio TEAC.
r= 0,32 p= 0,0099
Figura 15: Correlação entre os ensaios de FRAP e TEAC
73
5.3. Avaliação dos extratos após extração em maior escala
A partir da seleção das condições experimentais ótimas para a obtenção de extratos
ricos em todas as classes de compostos bioativos e extratos ricos em saponinas e pobres em
isoflavonas (Tabela 15), novos experimentos foram realizados nessas condições em maior
escala, com um aumento de 10 vezes nas quantidades de amostra e solvente. Contudo, nesses
experimentos em maior escala, a extração em vortex foi substituída pela extração em placa de
agitação orbital. Como a agitação orbital é menos eficiente que o vortex, o tempo de extração
foi ajustado para 15 minutos, em comparação com os 2 minutos empregados em todas as
condições do planejamento selecionadas.
Os teores de saponinas totais, flavonoides e compostos fenólicos nos extratos obtidos
na escala do planejamento de experimentos e em maior escala, nas diferentes condições
experimentais, são apresentados na Figura 16. Observou-se que os teores de saponinas totais
nos extratos obtidos nos experimentos em maior escala foram significativamente menores
(40,5 % em média) do que aqueles obtidos no planejamento de experimentos (Figura 16A).
Esse mesmo comportamento foi observado para flavonoides (Figura 16B) e compostos
fenólicos (Figura 16C) quando a mistura ternária de solventes foi utilizada. A menor extração
de compostos bioativos nos experimentos em maior escala em comparação com aqueles do
planejamento ocorreu, provavelmente, devido à menor eficiência do agitador orbital em
comparação com o vortex.
74
Te
or
de
Sa
po
nin
as
To
ta
is (
mg
/g)
H 2 O /E tO H /A c O E t (4 0 :4 0 :2 0 ) H 2 O /A c O E t (8 0 :2 0 ) E tO H (1 0 0 )
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
E x tra ç ã o p la n e ja m e n to d e e xp e rim e n to s
E x tra ç ã o m a io r e s c a la
*
*
*
(A )
Te
or
de
Fla
vo
no
ide
s (
mg
EG
/g)
H 2 O /E tO H /A c O E t (4 0 :4 0 :2 0 ) H 2 O /A c O E t (8 0 :2 0 ) E tO H (1 0 0 )
0
1
2
3
E x tra ç ã o p la n e ja m e n to d e e xp e rim e n to s
E x tra ç ã o m a io r e s c a la
(B )
*
Te
or
de
Co
mp
os
tos
fe
nó
lic
os
(m
gE
AG
/g)
H 2 O /E tO H /A c O E t (4 0 :4 0 :2 0 ) H 2 O /A c O E t (8 0 :2 0 ) E tO H (1 0 0 )
0
1
2
3
4
E x tra ç ã o p la n e ja m e n to d e e xp e rim e n to s
E x tra ç ã o m a io r e s c a la
(C )
*
*
Figura 16: Teores de saponinas totais (A), flavonoides (B) e compostos fenólicos (C) nos
extratos obtidos na escala do planejamento de experimentos e em maior escala, em diferentes
condições de extração. O asterisco representa diferença significativa (p < 0,05) entre as
diferentes escalas de extração.
75
Em relação aos teores de flavonoides, não houve diferença significativa entre os
experimentos de diferente escala, quando empregou-se a mistura binária de água e acetato de
etila ou etanol puro (Figura 16B). Surpreendentemente, quando a mistura binária de água e
acetato de etila foi utilizada, o teor de compostos fenólicos no extrato obtido no experimento
em maior escala foi maior (65,6%) do que aquele obtido no experimento na escala do
planejamento (Figura 16C). A extração em maior escala utilizando a mistura binária de água
e acetato de etila, correspondente ao experimento 28 do planejamento, e que havia sido
selecionada como uma alternativa para o aumento do rendimento de extração de saponinas,
não foi adequada para obter um extrato rico em saponinas e pobre em isoflavonas. Ao
contrário do observado no planejamento, o extrato obtido no experimento em maior escala
continha quantidades elevadas de compostos fenólicos.
Conforme já mencionado, quando etanol puro foi utilizado como solvente o teor de
saponinas totais no extrato obtido no experimento em maior escala foi menor do que aquele
obtido no experimento do planejamento. No intuito de aumentar o rendimento de extração de
saponinas, novos experimentos foram realizados, empregando-se maiores tempos de extração
em agitador orbital (30; 60 e 120 min). Os teores de saponinas totais e flavonoides nesses
extratos são apresentados na Figura 17. Em todos os extratos avaliados, não foi possível
detectar a presença de compostos fenólicos.
Te
or
de
Sa
po
nin
as
To
tais
(m
g/g
)
0
1
2
3
4
1 5 m in 3 0 m in 6 0 m in 1 2 0 m in
a
b
c
d
(A )
Te
or
de
Fla
vo
no
ide
s (
mg
EG
/g)
0 .0 0
0 .0 5
0 .1 0
0 .1 5
0 .2 0
1 5 m in
1 5 m in 3 0 m in 6 0 m in 1 2 0 m in
a
b
c
a , b
(B )
Figura 17: Influência do tempo de extração sobre os teores de saponinas totais (A) e
flavonoides (B) nos extratos obtidos nos experimentos em maior escala, utilizando etanol
puro como solvente. Letras minúsculas acima das barras indicam diferenças significativas
(p < 0,05).
Em comparação com a condição inicial, quando a amostra foi extraída por 15 min, os
teores de saponinas totais aumentaram significativamente (p < 0,05) quando a mesma foi
76
extraída por 30 e 60 min (40 e 47%, respectivamente). Prolongando-se a extração por 120
min, observou-se uma diminuição no teor de saponinas totais em relação aos tempos de
extração de 30 e 60 min, mas sendo ainda superior ao tempo inicial de 15 min.
O aumento do tempo de extração em relação à condição inicial levou à diminuição dos
teores de flavonoides nos extratos, provavelmente devido a oxidação dos mesmos. Um
comportamento semelhante foi encontrado no estudo de Derkyi et al. (2011) após a extração
de compostos fenólicos da casca do pinheiro. Esse resultado foi positivo, pois favoreceu a
pureza dos extratos em relação às saponinas. Dessa maneira, para a obtenção, em maior
escala, de um extrato enriquecido em saponinas e empobrecido em isoflavonas, as condições
de extração foram: solvente = etanol; tempo de agitação = 60 min; ultrassom = 0 min.
5.4. Caracterização detalhada dos extratos obtidos após experimentos em larga escala por
CLAE-DAD-EM
A caracterização detalhada dos compostos bioativos presentes nos extratos foi
realizada através da técnica de CLAE-DAD-EM. Essa técnica é mais sensível e específica
quando comparada às determinações espectrofotométricas para essas classes de compostos.
Cada amostra foi submetida a duas análises cromatográficas. Na primeira análise determinou-
se os teores de saponinas e de isoflavonas (Figura 18), ao passo que na segunda determinou-
se os teores de outros compostos fenólicos não isoflavonoides.
77
Figura 18: Cromatogramas típicos por CLAE-DAD-EM da análise de isoflavonas e
saponinas nos extratos de soja obtidos com a mistura ternária (A) e com etanol (B).
(1) = daidzina; (2) = glicitina; (3) = genistina; (4) = malonil genistina; (5) = acetil daidizina;
(6) = acetil glicitina + malonil daidzina; (7) = Daidzeína; (8) = gliciteína; (9) = genisteína;
(10) = saponina I; (11) saponina II+III.
Os teores de saponinas nos extratos são apresentados na Tabela 16. Os teores de
saponinas totais variaram entre 2,23 e 11,49 mg/100g nos extratos obtidos com etanol puro,
enquanto o teor no extrato obtido com a mistura ternária foi de 22,43 mg/100g. Observou-se
que o aumento do tempo de extração de 15 para 120 min levou a um aumento da concentração
de saponinas totais (p < 0,05). Outros estudos na literatura que empregaram a CLAE-EM para
a análise de saponinas em diferentes cultivares de soja relataram teores totais que variaram
entre 260,5 e 904,3 mg/100g (Hu et al., 2002; Fang et al., 2004; Kim et al., 2006), 11 e 40
vezes maiores, respectivamente, que o encontrado no presente estudo quando a mistura
ternária foi utilizada como solvente de extração. Entretanto, considerando-se somente os
teores das saponinas avaliadas no presente estudo (B-I, B-II e B-III) nas amostras analisadas
nesses estudos, os valores encontrados variaram entre 16,8 e 754,6 mg/100g. Apesar
da grande variabilidade desses teores, o valor encontrado no presente estudo encontra-se
dentro da faixa de valores relatados.
78
Tabela 16: Teores de saponinas (mg/100g) nos extratos obtidos nos experimentos em maior
escala, utilizando diferentes solventes e tempos de extração1,2
Saponina Etanol 100% H2O/EtOH/AcOEt
(40:40:20) 15 min 30 min 60 min 120 min
B-I 1,44±0,13ª 3,94±1,09ª 2,55±0,04ª 8,47±0,39b 16,95±1,51
c
B-II + B-III 0,79±0,15ª 1,68±0,34ª 1,06±0,21ª 3,04±0,11b 5,48±0,46
c
Totais 2,23±0,28ª 5,62±1,43ª 3,61±0,24ª 11,49±0,50b 22,43±1,97
c
1Média± DP, n = 2; 2Médias na mesma coluna com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (ANOVA
com pós-teste de Tukey; p<0,05).
A saponina B-I foi o composto majoritário, correspondendo a 71%, em média, do teor
de saponinas totais. O restante (29%) correspondeu às saponinas B-II e B-III. Esse perfil está
de acordo com os dados de Fang et al. (2004), que relatam que a saponina B-I é o principal
composto dessa classe em soja (aproximadamente 83%). Entretanto, outros trabalhos
relataram um perfil diferente para as saponinas de soja, no qual as formas ligadas ao DDMP
foram mais representativas (42% a 97% do teor de saponinas totais). Levando-se em
consideração que no presente estudo os teores de saponinas obtidos pela análise
espectrofotométrica foram muito maiores (aproximadamente 86 vezes) do que aqueles obtidos
pela análise cromatográfica é provável que as saponinas conjugadas ao DDMP sejam as
majoritárias na amostra analisada. Essa hipótese é reforçada pela correlação positiva
encontrada entre a atividade antioxidante medida pelos ensaios de FRAP e TEAC e o teor de
saponinas medido pelo ensaio espectrofotométrico. Como já mencionado, somente as
saponinas ligadas ao grupamento DDPM apresentam atividade antioxidante (Yoshiki et al.
1998; Hu et al. 2002). Cabe destacar, entretanto, que o método espectrofotométrico é mais
sujeito à interferentes do que a análise por CLAE-DAD-EM. Além disso, a análise
espectrofotométrica utiliza como padrão uma mistura de saponinas comercial de perfil
desconhecido, ao passo que a cromatografia é realizada com padrões analíticos puros e bem
caracterizados.
Os teores de isoflavonas nos extratos são apresentados na Tabela 17. Os teores de
isoflavonas totais variaram entre 5,11 e 13,85 mg/100g nos extratos obtidos com etanol puro,
enquanto o teor no extrato obtido com a mistura ternária foi de 1412,49 mg/100g. Observou-
se que o aumento do tempo de extração de 15 para 120 min levou a um aumento da
concentração de isoflavonas totais (p < 0,05). Os teores de isoflavonas em produtos
comerciais à base de soja encontram-se em uma faixa bastante ampla, variando de 60 a 2800
mg/100g (Seo & Morr, 1984). Essa grande variabilidade deve-se tanto às diferenças de
processamento desses alimentos quanto aos teores de isoflavonas nos próprios grãos de soja,
79
que dependem de diversos fatores como clima, local de plantio, genética, entre outros. Wang
& Murphy (1994) relataram que o teor de isoflavonas em grãos de soja colhidos em dois anos
diferentes foram de 12 e 33 mg/100g. Outro aspecto que deve ser levado em consideração
quando da comparação de dados de diferentes estudos da literatura, é a metodologia de
extração das isoflavonas da matriz do alimento. Já foi relatado na literatura que diversos
fatores da extração, tais como o solvente (Murphy et al., 2002), o tempo de contato e a
agitação (Carrão-Panizzi et al., 2002) influenciam significativamente nos teores de
isoflavonas.
Tabela 17: Teores de isoflavonas (mg/100g) nos extratos obtidos nos experimentos em maior
escala, utilizando diferentes solventes e tempos de extração1,2
Isoflavona Etanol 100% H2O/EtOH/AcOEt
(40:40:20) 15 min 30 min 60 min 120 min
Daidzina 0,89 ± 0,04ª 1,54 ± 0,10ª 1,74 ± 0,25ª 1,67 ± 0,04ª 418,76 ± 34,67b
Glicitina ND3 ND ND 0,23 ± 0,08ª 70,96 ± 5,29
b
Genistina 1,651 ± 0,17ª 2,90 ± 0,095ª 2,43 ± 0,06ª 3,18 ± 0,16ª 470,33 ± 34,45b
Malonil genistina ND ND ND ND 8,82 ± 0,13 ª
Acetil daidzina 0,11 ± 0,00ª 2,1 ± 0,05ª 0,68 ± 0,03ª 0,48 ± 0,01ª 89,27 ± 7,03b
Acetil glicitina ND ND ND ND 10,22 ± 0,73ª
Malonil daidzina 0,10 ± 0,06ª 0,26 ± 0,07ª 0,36 ± 0,06ª 0,28 ± 0,13ª 161,00 ± 12,32b
Daidzeína 0,63 ± 0,75ª 2,02 ± 0,14ª 0,42 ± 0,02ª 2,63 ± 0,01ª 62,77 ± 4,23b
Gliciteína 0,09 ± 0,03ª 8,31 ± 0,22b 0,13 ± 0,01ª 1,65 ± 0,58ª 51,01 ± 3,09 ª
,c
Genisteína 1,36 ± 0,46ª 3,26 ± 0,66ª 5,03 ± 1,64ª 3,72 ± 0,50ª 69,34 ± 6,81b
Totais 5,11 ± 0,62ª 11,01± 0,92ª 10,80 ± 1,84ª 13,85 ± 1,27ª 1412,49 ± 108,82b
1Média± DP, n = 2; 2Médias na mesma coluna com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (ANOVA
com pós-teste de Tukey; p<0,05); 3Não detectado.
Nos extratos obtidos com etanol, os teores de isoflavonas determinados pela análise
cromatográfica (5,11 a 13,85 mg/100g) foram semelhantes aqueles encontrados utilizando-se
o ensaio espectrofotométrico para flavonoides (3,0 a 15,7 mgEG/100g). Entretanto, no extrato
obtido com a mistura ternária, os teores de isoflavonas foram maiores quando analisados por
CLAE-DAD-EM (1412,49 mg/100g) em comparação com a espectrofotometria (131,1
mgEG/100g). Essa diferença deve-se, provavelmente, ao fato da análise espectrofotométrica
ser realizada utilizando-se um único padrão (genisteína, no caso do presente trabalho), o que
pode acarretar subestimação ou superestimação dos resultados, em função de diferentes
fatores de resposta dos flavonoides na metodologia analítica.
Apesar das isoflavonas comporem a principal classe de compostos fenólicos na soja e
em produtos derivados do grão (Seo & Morr, 1984), no presente estudo investigaram-se,
ainda, outros compostos fenólicos minoritários, flavonoides e não-flavonoides, nos extratos
80
obtidos nos experimentos em maior escala. Dos 17 compostos fenólicos para os quais
dispunha-se de padrão comercial, 9 compostos fenólicos foram detectados por CLAE-DAD-
EM no extrato obtido com a mistura ternária (Figura 19A), enquanto que apenas 5 desses
compostos foram identificados nos extratos etanólicos (Figura 19B).
Figura 19: Cromatogramas típicos por CLAE-DAD-EM no modo SIM (-) da análise de
compostos fenólicos minoritários nos extratos de soja obtidos com a mistura ternária (A) e
com etanol (B). (1) = ácido gálico; (2) = ácido 3,4-dihidroxi-benzóico; (3) catequina
(aglicona); (4) = ácido 2,4-dihidroxi-benzóico; (5) = ácido cafeico; (6) = ácido p-cumárico;
(7) = rutina; (8) = miricetina; (9) = quercetina.
No extrato obtido utilizando-se a mistura ternária, identificaram-se três compostos da
classe dos ácidos hidroxi-benzóicos (ácidos gálico, 3,4-dihidroxi-benzóico e 2,4-dihidroxi-
benzóico), dois compostos da classe dos ácidos hidroxi-cinâmicos (ácidos cafeico e p-
cumárico) e quatro flavonoides (catequina, rutina, miricetina e quercetina). Seis desses
compostos (3,4-dihidroxi-benzóico, 2,4-dihidroxi-benzóico, catequina, rutina, miricetina e
81
quercetina) foram identificados pela primeira vez em soja, até o limite do nosso
conhecimento. Entretanto, já foram descritos na literatura outros 5 compostos fenólicos em
soja (ácidos 4-hidroxibenzóico, salicílico, ferúlico, 2,5-dihidroxi-benzóico e vanílico) (Potter
et al., 1986; Kim et al., 2005).
Os teores de compostos fenólicos minoritários nos extratos são apresentados na
Tabela 18. Os teores variaram entre 0,37 e 1,18 mg/100g nos extratos obtidos com etanol
puro, enquanto o teor no extrato obtido com a mistura ternária foi de 16,00 mg/100g. A
principal classe de compostos fenólicos minoritários foram os flavonoides, seguidos dos
ácidos hidroxi-cinâmicos e hidroxi-benzóicos. Nos extratos etanólicos, essas classes
corresponderam a 78%, 16% e 6% do total de compostos fenólicos minoritários,
respectivamente, ao passo que no extrato obtido utilizando-se a mistura ternária como
solvente, as mesmas corresponderam a 84%, 8% e 8%.
Tabela 18: Teores de compostos fenólicos minoritários (mg/100g) nos extratos obtidos nos
experimentos em maior escala, utilizando diferentes solventes e tempos de extração1,2
Composto Etanol (100%) H2O/EtOH/AcOEt
(40:40:20) 15 min 30 min 60 min 120 min
Ácido gálico 0,05 ± 0,02ª 0,04 ± 0,01ª 0,04 ± 0,00a 0,03 ± 0,00
a 0,15 ± 0,10
a
Ácido 3,4-dihidroxibenzóico ND3 ND ND ND 0,77 ± 0,24
a
Ácido 2,4-dihidroxibenzóico ND ND ND ND 0,43 ± 0,21a
Ácido caféico 0,02 ± 0,01ª 0,03 ± 0,00a,b
0,16 ± 0,01 a,b
0,17 ± 0,00 a,b
0,49 ± 0,26b
Ácido p-cumárico ND ND ND ND 0,75 ± 0,19ª
Catequina (aglicona) ND ND ND ND 0,06 ± 0,05ª
Rutina 0,02 ± 0,00a 0,02 ± 0,00
a 0,02 ± 0,00
a ND 0,59 ± 0,17
b
Miricetina 0,34 ± 0,30ª 0,13 ± 0,01ª 0,20 ± 0,11ª 0,02 ± 0,00a 6,13 ± 3,04
b
Quercetina 0,75 ± 0,68 a,b
0,44± 0,01ª 0,73 ± 0,39 a,b
0,15 ± 0,04a 6,65 ± 3,25
b
Total 1,18 ± 1,02ª 0,66 ± 0,01ª 1,14 ± 0,49ª 0,37 ± 0,05ª 16,00 ± 7,52b
1Média± DP, n = 2; 2Médias na mesma coluna com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (ANOVA
com pós-teste de Tukey; p<0,05); 3Não detectado.
Os teores de compostos fenólicos minoritários analisados em todos os extratos por
CLAE-DAD-EM foram significativamente menores do que a diferença entre os teores de
compostos fenólicos e de flavonoides determinados espectrofotometricamente. Contudo, os
teores de compostos fenólicos totais determinados por essa última metodologia estão de
acordo com dados da literatura, que relatam amostras de soja contendo entre 494 e 622 mg
EAG/100g (Malenčić et al., 2012).
82
6. CONCLUSÕES
No estudo preliminar, verificou-se que a utilização de água pura seria adequada para
empobrecer a fibra de soja em saponinas e extrair os compostos fenólicos, em especial
isoflavonas, com um bom rendimento. Além disso, para a obtenção de um extrato
empobrecido em isoflavonas e rico em saponinas, o uso de etanol foi o mais adequado, apesar
do baixo rendimento observado.
A análise de compostos fenólicos e saponinas em sete amostras comerciais de fibra e
extrato de soja apontou o extrato da marca E como tendo o perfil de compostos ativos mais
favoráveis para a obtenção dos extratos de interesse utilizando o planejamento de
experimentos. Os extratos obtidos apresentaram atividade antioxidante medida pelos ensaios
de FRAP e TEAC, sendo essa atividade relacionada à presença de flavonoides, assim como de
saponinas nas amostras.
Apesar de apresentar baixo rendimento, o etanol puro foi selecionado como solvente
ideal para a obtenção de extratos ricos em saponinas e empobrecidos em flavonoides.
Entretanto, não foi possível determinar condições de extração para a obtenção de extratos
ricos em flavonoides e empobrecidos em saponinas. A utilização de uma mistura ternária
contendo água, etanol e acetato de etila como solvente proporcionou o máximo de extração de
ambas as classes de compostos bioativos, sendo ainda mais eficiente do que a metodologia
empregada na maioria dos estudos da literatura, que utiliza metanol 80% aquoso para a
extração.
Aplicando-se as condições de extração determinadas no planejamento de experimentos
em maior escala e após a otimização do tempo de extração, o etanol manteve-se seletivo para
a extração diferencial de saponinas.
Contudo, em função de discrepâncias entre os teores de saponinas avaliados pelos
métodos cromatográfico e espectrofotométrico, a seletividade do etanol precisa ainda ser
confirmada em estudos futuros. A análise de outras saponinas, em especial aquelas
conjugadas ao DDMP seria muito relevante, porém não estão disponíveis os padrões
comerciais das mesmas. Nesse sentido, o isolamento das saponinas de soja por cromatografia
semi-preparativa está em andamento.
De maneira geral, este trabalho demonstra que a utilização de diferentes misturas de
solventes e parâmetros de extração é uma ferramenta promissora para a obtenção de extratos
contendo classes específicas de compostos bioativos da soja.
83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AAP. American Academy of Pediatrics, Committee on Nutrition. Soy protein based
formulas: recommendations for use in infant feeding. Pediatrics, v.101, p. 148-153, 1998;
Adlercreutz, C.H.; Goldin, B.R.; Gorbach, S.L.; Hockerstedt, K.A.; Watanabe, S.; Hämäinen,
E.K.; Markkanen, M.H; Mäkela, T.H.; Wähäla, K.T.; Hase, T.A.; Fotsis, T. Soybean
phytoestrogen intake and cancer risk. Journal of Nutrition, v.125, p. 757-770, 1995.
Adlercreutz, C.H. & Mazur, W. Phyto-oestrogens and Western diseases. , v. 29, p. 95-120,
1997.
Alissandrakis, E.; Daferera, D.; Tarantilis, P.A.; Polissiou, M.; Harizanis, P.C. Ultrasound-
assisted extraction of volatile compounds from citrus flowers and citrus honey. Food
Chemistry, v.82, 575-582, 2003.
Andrade, P.J.; Ferronato, A.; Campelo Junior, J.H.; Caneppele, M.A.B. Qualidade física dos
grãos de soja, cultivar tmg115rr, submetidos à simulação de chuva durante o
retardamento de colheita. Scientia Agraria, Curitiba, v.11, p.281-292, 2010.
Angelo, P. M.; Jorge, N. Compostos fenólicos em alimentos – Uma breve revisão. Revista
Instituto Adolfo Lutz, v.66, p.1-9, 2007.
Anderson, J. W.; Johnstone, B. M.; Cook-Newell, M. E. Meta-analysis of the effects of soy
protein intake on serum lipids. The new england journal of medicine, v. 333, p. 276–282,
1995.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasil. Portaria SVS/MS n.º 104, de 14
de maio de 1999. Regulamento Técnico sobre Aditivos Aromatizantes/Aromas. Diário
Oficial da União. Brasília - DF, 17 maio 1999.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasil. Portaria nº 540, de 27 de outubro
de 1997. Aprova o Regulamento Técnico: Aditivos Alimentares - definições, classificação
e emprego. Diário Oficial da União. Brasília, DF, 28 de outubro de 1997.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasil. Resolução CNNPA n° 14/78.
Padrão de Identidade e Qualidade para Farinha Desengordurada de Soja, Proteína
Texturizada de Soja, Proteína Concentrada de Soja, Proteína Isolada de Soja e Extrato
de Soja. Diário Oficial da União, Brasília, 28 de agosto de 1978. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/anvisalegis/resol/14_78.htm>. Acesso em: 28 de dezembro de
2012.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasil. Resolução nº 19, de 30 de abril
de 1999. Regulamento Técnico de procedimentos para registro de alimento com
84
alegação de propriedades funcionais e ou de saúde em sua rotulagem. Diário Oficial da
União, Brasília, de 03 de maio de 1999. Disponível em:
<http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/727a7f004745792d8641d63fbc4c6735/RESOL
UCAO_19_1999.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em: 23 de dezembro de 2012.
Awazuhara, K.; Baba, M. Antigenicity of the proteins in soy lecithin and soy oil in
soybean allergy. Clinical & Experimental Allergy, v. 28, p. 1559-1564, 1998.
Barbosa, M. Z.; Assumpção, R. Ocupação territorial da produção e da agroindústria da
soja no Brasil, nas décadas de 80 e 90. Informações Econômicas, São Paulo, v. 31, p. 7- 16,
nov. 2001.
Barbosa, A.C.L.; Hassimotto, N.M.A.; Lajolo, F.M.; Genovese, M.I. Teores de isoflavonas e
capacidade antioxidante da soja e produtos derivados. Ciência e Tecnologia de Alimentos,
v.26, p.921-926, 2006.
Barro Neto, B.; Scarmínio, I.S. e Bruns, R.E. Planejamento e Otimização de Experimentos.
Editora Unicamp-Campinas, 1995.
Belitz H, Grosch W. Food Chemistry, 2ª Edição inglesa. Springer. Berlin. 1999.
Benzie, I.F.F. & Strain, J.J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant
Power”: The FRAP Assay. Analytical Biochemistry, v. 239, p. 70-76, 1996.
Benavent, M.A.; Silván, J.M.; Moreno, F.J.; Villamiel, M.; Castillo, M. D. Protein quality,
antigenicity, and antioxidant activity of soy-based foodstuffs. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v.56, p. 6948-6505, 2008.
Bonato, E.R.; Bonato, A.L.V. A soja no Brasil: história e estatística. Londrina-
EMBRAPA-CNPSo, p. 61, 1987. (EMBRAPA-CNPSo. Documentos, 21).
Borradaile, N.M.; Dreu, L.E.; Wilcox, L.J.; Edwards, J.Y.; Huff, M.W. The soy
phytoestrogens, genistein and daidzein, reduce apolipoprotein B secretion from HepG2
cells through multiple mechanisms. Biochemical Journal, v. 366, p. 531–539, 2002.
Brandon, D.L. & Friedman, M. Immunoassays of soy protein. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v. 50. p. 6635-6642, 2002.
Cabral, L. C.; Della Modesta, R. C. Soja na alimentação humana. Rio de Janeiro:
EMBRAPA/CTAA, p. 54, 1981.
Calvert, G.D.; Blight, L.; Illman, R.J.; Topping, D.L.; Potter, J.D. A trial of the effects of
soya-bean flour and soya-bean saponins on plasma lipids, faecal bile acids and neutral
sterols in hypercholesterolaemic men. British Journal of Nutricional, v. 45, p. 277-281,
1981.
85
CONAB-Companhia Nacional de Abastecimento. Levantamento da Safra de Grãos
2012/2013 (Área Plantada, Produtividade e Produção). Brasília, DF. Disponível em:
<http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/12_11_08_09_10_48_boletim_portug
ues_novembro_2012.pdf>, Acesso em: 26 de dezembro de 2012.
Coward L; Barners N.C; Setchell K.D.R.; Barners S. Genistein, Daidzen, and their b-
glucoside conjugates: Antutumor isoflavonas in soybean foods from American and
Asian diets. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 41, p. 1961-1967, 1993.
Carrão-Panizzi, M.C.; Simão, A.S. & Kikuchi, A. Efeitos de genótipos, ambientes e de
tratamentos hidrotérmicos na concentração de isoflavonas agliconas em grãos de soja.
Pesquisa Agropecuária brasileira, Brasília, v. 38, p. 897-902, 2003.
Chang, L.H.; Chang, C.M. J. Continuous hot pressurized fluids extraction of isoflavones
and soyasaponins from defatted soybean flakes. Journal of the Chinese Institute of
Chemical Engineers, v. 38, p. 313-319, 2007.
Charurin, P.; Ames, J. M.; del Castillo, M. D. Antioxidant Activity of Coffee Model
Systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p. 3751–3756, 2002.
Cheeke, P.R. Actual and potential applications of Yucca schidigera and Quillaja
saponaria saponins in human and animal nutrition. Proceedings of the American Society
of Animal Science, p. 1-9, 1999.
Choi, Y.B., & Kim, K.S. Purification of isoflavone from soybean hypocotyls using various
resins. Korean Journal of Environmental Health, v. 31, p. 221–226, 2005.
Cristofaro, E.; Mattu, F. & Wuhrmann, J. J. Involvement of the raffinose family of
oligosaccharide in flatulence. In Sipple, H., McNutt, K. (eds.). Academic Press, p. 231,
1974.
Devi, A.M.K.; Gondi, M.; Sakthivelu, G.; Giridhar, P.; Rajasekaran, T.; Ravishankar, G.A.
Functional attributes of soybean seeds and products, with reference to isoflavone content
and antioxidant activity. Food Chemistry, v. 114, p. 771–776, 2009.
Derkyi, N.S.A.; Adu-Amankwa, B.; Sekyere, D.; Darkwa, N.A. Optimum Acetone and
Ethanol Extraction of Polyphenols from Pinus caribaea Bark: Maximizing Tannin
Content Using Response Surface Methodology. Chemical Product and Process Modeling,
v. 6, p. 1-22, 2011.
Dimitrios, B. Sources of natural phenolic antioxidants. Trends in Food
Science &Technology, v. 17, p. 505–512, 2006.
86
Diniz, A. C. B. D.; Astarita, L. V.; Santarem, E. R. Alteração dos metabólitos secundários
em plantas de Hypericum perforatum L. (Hypericaceae) submetidas à secagem e ao
congelamento. Acta Botânica Brasílica, v. 21, p. 443-450, 2007.
Dixon, R. A. Natural products and plant disease resistance. Nature, v. 411, p. 843-847,
2001.
Duranti, M; Lovati, M.R.; Dani, V.; Barbiroli, A.; Scarafoni, A.; Castiglioni, S.; Ponzone, C.
& Morazzoni, P. The α’ subunit from soybean glycinin globulin lowers plasma lipids and
upregulates liver -VLDL receptors in rats fed a hypercholestemic diet. Journal of
Nutrition, v.134, p. 1334-1339, 2004.
EMBRAPA Soja - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Soja na alimentação,
2000. Disponível em: <http://www.cnpso.embrapa.br/soja_alimentacao/index.php> Acesso
em: 30 de dezembro de 2012.
EMBRAPA Soja - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária. Soja em números (safra
2010/2011). 2011. Disponível em:
<http://www.cnpso.embrapa.br/index.php?op_page=294&cod_pai=17>. Acesso em: 03 de
janeiro 2013.
EMBRAPA Soja. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. História da soja, 2000.
Disponível em: <http://www.cnpso.embrapa.br/index.php?cod_pai=8&op_page=112> Acesso
em: 30 de dezembro de 2012.
Endres, J.G. Soy protein products: Characteristics, nutritional aspects, and utilization.
AOCS Press. Champaign, Illinois, p. 79, 2001.
Esteves, E.A.; Monteiro, J.B.R. Efeitos benéficos das isoflavonas de soja em doenças
crônicas. Revista de Nutrição, Campinas, v.14, p. 43-52, 2001.
Esteves, E.A.; Martino, H.S.D; Oliveira, F.C.E.; Bressan, J.; Costa, N.M.B. Chemical
composition of a soybean cultivar lacking lipoxygenases (LOX2 and LOX3). Food
Chemistry, v. 122, p. 238-242, 2010.
FAOSTAT-Food And Agriculture Organization Statistical. Disponível em:
<http://faostat.fao.org/site/291/default.aspx>. Acesso em: 30 de dezembro de 2012.
FAO-Food And Agriculture Organization. Technology of production of edible flours and
protein products from soybeans, 1992. Disponível em:
<http://www.fao.org/docrep/t0532E/t0532E00.htm>. Acesso em: 30 de dezembro de 2012.
FAO-Food And Agriculture Organization. Food and Agricultural commodities production,
2010. Disponível em: <http://faostat.fao.org/DesktopDefault.aspx?PageID=339&lang=en>.
Acesso em: 03 de janeiro de 2013.
87
FAO/WHO-Food And Agriculture Organization/World Health Organization. Energy and
protein requirements, 1985. Disponível em:
<http://www.fao.org/docrep/003/AA040E/AA040E00.HTM>. Acesso em: 04 de janeiro de
2013.
FAO-Food And Agriculture Organization. Food, Nutrition and Agriculture: Emerging
problems with food allergens, 1997. Disponível em: <
http://www.fao.org/docrep/003/X7133M/x7133m03.htm >. Acesso em: 03 de janeiro de
2013.
FDA. Food and Drug Administration. Food labeling: Health claims; soy protein and
coronary heart disease. Federal Register. 1999. Disponível em: <
http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?fr=101.82> Acesso
em: 4 de janeiro de 2013.
Fang, N; Yu, S.; Badger, T.M. Comprehensive phytochemical profile of soy protein
isolate. Journal of Agriculltural and Food Chemistry, v. 52, p. 4012-4020, 2004.
Faria, A.A.; Leles, M.I.G.; Ionashiro, M., Zuppa, T.O., Antoniosi Filho, N.R. Estudo da
Estabilidade Térmica de Óleos e Gorduras Vegetais por TG/DTG e DTA. Eclética
Química, v. 27, p. 111-119, 2002.
Fedeniuk, R.W.; Shand, P.J. Theory and methodology of antibiotic extration from
matrices. Journal of Chromatography A, v.812, p.3-15, 1998.
Fernandes, L.F.C.; Aldrighi, A.P. S.; Aldrighi, J.M. Prescrever ou não isoflavonas de soja à
mulher no climatério? Revista da Associação Médica Brasileira, v. 52, n. 3, p. 132, 2006.
Ferrari, R. A.; Oliveira, V. S.; Scabio, A. Biodiesel de soja: taxa de conversão em esteres
etílicos, caracterização físico-química e consumo em gerador de energia. Química Nova,
v. 28, p. 19-23, 2005.
Fonseca, N. D. Isoflavonas e saponinas em fórmulas infantis à base se soja: perfil e
estimativa de consumo por lactentes no Brasil. Rio de Janeiro – RJ. Dissertação (Mestre
em Ciências de Alimentos) - Programa de pós graduação em Ciências de Alimentos,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
Fukui, k.; Tachibana, N.; Fukuda, Y.; Takamatsu, K; Sugano, M. Ethanol washing does not
attenuate the hypocholesterolemic potencial of soy protein. Nutrition, v. 20, p. 984-990,
2004.
Genovese, M. I.; Lajolo, F. M. Isoflavones in soy-based foods consumed in Brazil: levels,
distribution, and estimated intake. Journal of. Agriculture and. Food Chememistry, v.50, p.
5987-5993, 2002.
88
Goossens, A.E. Protein foods; flavors and off-flavors. Food engineering. v. 46, p. 59-60,
1974.
Greaves, K. A.; Parks, J. S.; Williams, J. K. & Wagner, J. D. Intact dietary soy protein, but
not adding an isoflavone-rich soy extract to casein, improves plasma lipids in
ovariectomized cynomolgus monkeys. Journal of Nutrition, v. 129, p. 1585–1592, 1999.
Gu, C.M.; Pan, H.B.; Sun, Z.W.; Qin, G.X. Effect of Soybean Variety on Antinutritional
factors content, and growth performance and nutrients metabolism in Rat. International
Journal of Molecular Sciences, v. 11, p. 1048-1056, 2010.
Güçlü-Üstündağ, Ö.; Balsevich, J.; Mazza, G. Pressurized low polarity water extraction of
saponins from cow cockle seed. Journal of Food Engineering, v. 80, p. 619–630, 2007.
Hall, W.L.; Vafeiadou, K.; Hallund, J.; Bugel, S.; Koebnick, C.; Reimann, M.; Ferrari, M.;
Branca, F.; Talbot, D.; Dadd, T.; Nilsson, M.; Dahlman-Wright, K.; Gustafsson, J.A.;
Minihane, A.M.; Williams, C.M. Soy-isoflavone-enriched foods and inflammatory
biomarkers of cardiovascular disease risk in postmenopausal women: interactions with
genotype and equol production. American Journal of Clinical Nutrition, v. 82, p. 1260–
1268, 2005.
Heim, K.E.; Tagliaferro, A.R.; Bobilya, D.J. Flavonoids antioxidants: chemistry,
metabolism and structure-activity relationships. Journal of Nutritional Biochemistry, v.13,
p. 572-584, 2002.
Hennion, M.C. Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with
liquid chromatography. Journal of Chromatography A. v. 856, p. 3-54, 1999.
Hettiarachchy, N.S. & Kalapathy, U. Solubility and Emulsifying Properties of Soy Protein
Isolates Modified by Pancreatin. Journal of Food Science, v. 62, p. 1110-1115, 1997.
Hill, J.; Nelson, E.; Tilman, D.; Polasky, S.; Tiffany, D. Environmental, economic, and
energetic costs and benefits of biodiesel and ethanol biofuels. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, v. 103, p. 11206–11210, 2006.
Horan, F.E. Soy Protein Products and Their Production. Journal of the American Oil
Chemists' Society, v. 51, p. 67-73, 1974.
Hrabek-Smith J.M.; Kurowska, E.M.; Carroll, K.K. Effects of cholesterol-free, semipurified
diets containing different levels of casein or soy protein on distribution of cholesterol
and protein among serum lipoproteins of rabbits. Atherosclerosis. v. 76, p. 125-130, 1989.
89
Hu, J.; Lee, S.; Hendrich, S.; Murphy, P. A. Quantification of the Group B Soyasaponins
by High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v. 50, p. 2587-2594, 2002.
Huang, H.-P.; Cheng, C. F.; Lin, W. Q.; Yang, G. X.; Song, J. Y. & Ren, G. Y. Antitumor
activity of total saponins from Dolichos falactus Klein. Acta Pharmacologica Sinica, v. 3,
p. 386, 1982.
Huff, M.W.; Hamilton, R.M.G.; Carrol, K.K. Plasma cholesterol levels in rabbits fed low
fat, cholesterol-free, semipurified diets: effects of dietary proteins, protein hydrolisates
and amino acid mixtures. Atherosclerosis, v.28, p.186-195, 1977.
Hymowitz, T. & Newell, C. A. Taxonomy of the Genus Glycine, Domestication
and Uses of Soybeans. Economic Botany, v. 35, p. 272-288, 1981.
Hymowitz, T. On the Domestication of the Soybean. Economic Botany, v. 24, p. 408-421,
1970.
IBGE-Instituto Brasileiro De Geografia E Estatística. Levantamento sistemático da
produção agrícola pesquisa mensal de previsão e acompanhamento das safras agrícolas
no ano civil. Disponível em:
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_201101.pdf>
Acesso em: 4 de janeiro de 2013.
Jin, M.; Yang, Y.; Sua, B.; Rena, Q. Rapid quantification and characterization of
soyasaponins by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray
mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 1108, p. 31–37, 2006.
John, J.A.; Shahidi, F. Phenolic compounds and antioxidant activity of Brazil nut
(Bertholletia excelsa). Journal of Functional Food, v. 2, p. 196–209, 2010.
Kagawa, A. Standard table of food composition in Japan. University of Nutrition for
Women, p. 104-105, 1995.
Kao, T.H.; Chien, J.T.; Chen, B.H. Extraction yield of isoflavones from soybean cake as
affected by solvent and supercritical carbon dioxide. Food Chemistry, v. 107, p. 1728–
1736, 2008.
Kim, K.; Weller, C.; Hanna, M. & Gennadios, A. Heat curing of soy protein films at
selected temperatures and pressures. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, v, 35, p.
140-145, 2002.
Kim, S.; Dale, B.E. Environmental aspects of ethanol derived from no-tilled corn
grain:Nonrenewable energy consumption and greenhouse gas emissions. Biomass
Bioenerg, v. 28, p. 475–489, 2005.
90
Kim, J. A.; Jung, W. S.; Chun, S. C.; Yu, C. Y.; Ma, K. H.; Gwag, J. G.; Chung, I. M. A
correlation between the level of phenolic compounds and the antioxidant capacity in
cooked-with-rice and vegetable soybean (Glycine max L.) varieties. European Food
Research and Technology, v. 224, p. 259–270, 2006.
Kim, E. H.; Kim, S. H.; Chung, J. I.; Chi, H. Y.; Kim, J. A.; Chung, I. M. Analysis of
phenolic compounds and isoflavones in soybean seeds (Glycine max (L.) Merill) and
sprouts grown under different conditions. European Food Research and Technology, v.
222, p. 201–208, 2006.
Kwok, K.C. & Niranjan, K. Review: Effect of thermal processing on soymilk. International
Journal of Food Science & Technology, v. 30, p.263–295, 1995.
Lapornik, B.; Prošek, M.; Wondra, A. G. Comparison of extract prepared from plant by-
products using different solvents and extraction time. Journal of Food Engineering, v. 71,
p. 214- 501, 2005.
Lee, J.H. & Choung, M.G. Determination of optimal acid hydrolysis time of soybean
isoflavones using drying oven microwave assited methods. Food Chemistry, v. 129, p. 577-
582, 2011.
Lee, S. O.; Simons, A. L.; Murphy, P. A. & Hendrich, S. Female Golden Syrian Hamsters
Soyasaponins Lowered Plasma Cholesterol and Increased Fecal Bile Acids. Experimental
Biology and Medicine, v. 230, p. 472-478, 2005.
Lee, M.H. & Lin, C.C. Comparison of techniques for extraction of isoflavones from the
root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized solvent extractions. Food Chemistry.
v. 105, p. 223-228, 2007.
Liener, I.E. Implications of antinutritional components in soybeanfoods. Food Science
and Nutrition, v.34, p. 31-67, 1994.
Liu K. Expanding soybean food utilization. Food Technology, v. 54, p. 46-58, 2000.
Liu, K. Soybeans chemistry technology and utilization. Chapman & Hall. 2 ed, p. 532,
1997.
Liyana-Pathirana, C.; Shahidi, F. Optimization of extraction of phenolics compounds from
wheat using response surfase methodology. Food Chemistry, v. 93, p. 45-56, 2005.
Loiseau, J.; Vu, B.L.; Macherel, M.H.; Le Deunff, Y. Seed lipoxygenases: occurrence and
functions. Seed Science Research, v.11, p. 199–211, 2001.
91
Lucas, E.A.; Khalil, D.A; Daggy, B.P.; Arjmandi, B.H. Ethanol-Extracted Soy Protein
Isolate Does Not Modulate Serum Cholesterol in Golden Syrian Hamsters: A Model of
Postmenopausal Hypercholesterolemia. The Journal of Nutrition, v. 13, p. 211-214, 2001.
Lutermann, C.; Willems, E.; Dott, W.; Hollender, J. Effects of various binary and ternary
phases on the extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons from contamined soils.
Journal of Chromatography A, v. 816, p. 201-211, 1998.
Malenčić D.; Cvejić J.; Miladinović J. Polyphenol content and antioxidant properties of
colored soybean seeds from central Europe. Journal of Medicinal Food, v. 15, p. 89–95,
2012.
Manach, C.; Scalbert, A.; Morand, C.; Rémésy, C.; Jime´nez, L. Polyphenols: food sources
and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition, v. 79, p. 727–747, 2004.
Mann, J. Chemical aspects of biosynthesis. Oxford Science publications, p. 44, 1994.
Markley, K.S. Soybean and soybean products. Interscience Publishers, v. 2, 1974.
Messina, M.; Messina, V.; Serchell, K. The Simple Soybean and Your Health. Avery
Publishimg Group, 1994.
Menezes, N. L.; Garcia, A. C.; Rubin, S. A. L.; Bernardi, G. E. Caracterização de vagens e
sementes de soja. Ciência Rural, v.27, p. 387-391, 1997.
Miura, E. M. Y.; Silva, R. S. S. F.; Mizubuti, I.Y.; Ida, E. I. Cinética de inativação de
Inibidores de Tripsina e de Insolubilização de Proteínas de diferentes cultivares de soja.
Revista Brasileira de Zootecnia, v. 34, p. 1659-1665, 2005.
Monteiro, M. R. P.; Moreira, M. A.; Costa, N. M. B.; Oliveira, M. G. A.; Pires, C. V.
Avaliação da digestibilidade protéica de genótipos de soja com ausência e presença do
inibidor de tripsina Kunitz e lipoxigenases. Brazilian Journal of Food Technology, v. 6, p.
99-107, 2003.
Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons, ed. 5, 2001.
MSDS - Material Safety Data Sheet Ethyl Acetate. Disponível em:
<http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927165>. Acesso em: 27 de dezembro de
2012.
Naczk M, Shaidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of
Chromatography, v. 1054, p. 95-111, 2004.
92
Oakenfull, D.G.; Fenwick, D.E.; Hood, R.L.; Topping, D.L.; Illman, R.J. & Storer, G.B.
Effects of saponins on bile acids and plasma lipids in the rat. British Journal of Nutricion.
v. 42, p. 209-216, 1979.
Paucar-Menacho, L.M., Berhow, M.A., Mandarino, J.M.G.; Gonzalez de Mejia, E., Chang,
Y.K. Optimisation of germination time and temperature on the concentration of
bioactive compounds in Brazilian soybean cultivar BRS 133 using response surface
methodology, Food Chemistry, v. 119, p. 636-642, 2010.
Penha, L. A. O.; Fonseca, I. C. B.; Mandarino, J. M.; Benassi, V. T. A. soja como alimento:
valor nutricional, benefícios para a saúde e cultivo orgânico. Boletim do Centro de
Pesquisa de Processamento de Alimentos, v.25, p. 91-102, 2007.
Potter, S.M.; Baum, J. A.; Teng, H.; Stillman, R.J.; Shay, N.F. & Erdman, J.W. Soy protein
and isoflavones: their effects on blood lipids and boné density in postmenopausal
women. American Journal of Clinical Nutrition, v. 68, p. 1375-1379, 1998.
Potter, S. M. Overview of proposed mechanisms for the hypocholesterolemic effect of
soy. Journal of Nutricion, v. 125, p. 606-611, 1995.
Potter, S.M.; Pertile, J.; Berber-Jimenez, M.D. Soy protein concentrate and isolated soy
protein similarly lower blood serum cholesterol but differently affect thyroid hormones
in hamsters. Journal of Nutrition, v. 126, p. 2007-2011, 1996.
Porter, P. M.; Banmiairt, W. L. & Hassett, J. J. Phenolic acids and flavonoids in soybean
root and leaf extracts. Environmental and Experimental Botany, v. 26, p. 65-73, 1986.
Privett, O.S.; Dougherty, K.A.; Erdahl, W.L. & Stolyhwo, A. Studies on the Lipid
Composition of Developing Soybeans. Journal of The American Oil Chemists' Society, v.
50, p. 516-520, 1973.
Probst, A. H. & R. W.Judd. Origin, U.S. history and development, and world distribution.
In: Soybeans: Improvement, Production, and Uses. American Society of Agronomy,
Caldwell, B. E., p. 115, 1973.
Raven, P. H.; Evert, R. F. & Eichhorn, S. E. Biologia Vegetal. Guanabara Koogan S.A., 6
ed., p. 906, 2001.
Rhee, K.C. Processing technology to improve soy utilization. In: Drackley, J.K. Soy in
animal nutrition. Savoy: Federation of Animal Science Societies, p.46-55, 2000.
Reynolds, K.; Chin, A.; Lees, K. A.; Nguyen, A.; Bujnowski, D.; He, J. A meta
analysis of the effect of soy protein supplementation on serum lipids. American Journal of
Cardiology, v. 98, p. 633-640, 2006.
93
Ritt, A. B. B. Urease de soja [Glycine Max (L.) Merril]: expressão em tabaco (Nicotiana
tabacum) e atividade fungicida e/ou fungistática. Rio Grande do Sul – RS. Tese (Doutora
em Biologia celular e molecular) – Centro de biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2005.
Rivas, M.B. Soja – Qualidade de vida e saúde com prazer e sabor. Editora Assessoria
Gráfica e Editorial, 2006.
Rodrigues, M. I. & Iemma, A. F. Planejamento de experimentos e otimização de
processos: Uma estratégia sequencial de planejamentos. Casa do Pão Editora, 1 ed., 2005.
Rostagno, M. A.; Villaresa, A.; Guillamóna, E.; García-Lafuentea, A.; Martíneza, J.A.
Review: Sample preparation for the analysis of isoflavones from soybeans and soy foods.
Journal of Chromatography A, v. 1216, p. 2-29, 2009.
Ruiz, J.M.; Bachelet, G.; Caumette, P.; Donard, O. F. X. Three decades of tributyltin in the
coastal environment with comphasis on Arcachon Bay. Environmental Pollution, v. 90, p.
195-203, 1996.
Rupasinghe, H. P. V.; Chung-Ja, C. J.; Poysa, V.; Berardo, C.; Bewley, J. D.; Jenkinson, J.
Soyasapogenol A and B Distribution in Soybean (Glycine max L. Merr.) in Relation to
Seed Physiology, Genetic Variability, and Growing Location. Journal of Agriculture and
Food Chemistry, v. 51, p. 5888–5894, 2003.
Salisbury, F. B. & Ross, C. W. Plant physiology. Wadsworth , 4 ed., p. 682, 1992.
Sediyama, T.; Pereira, M.G.; Sediyama, C.S.; Gomes, J.L.L. Cultura da soja: I parte.
Universidade Federal de Viçosa, p. 96, 1985.
Seo, Y. W.; Specht, J. E.; Graef, G. L.; Graybosch, R. A. Inheritance of red-buff seed coat
in soybean. Crop Science, v. 33, p. 754-758, 1993.
Seo, A. & Morr, C.V. Improved high performance liquid chromatographic analysis of
phenolic acids and isoflavonoids from soybean protein products. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v. 32, p. 530–533, 1984.
Shiau, I.; Shih, T.; Wang, Y.; Chen, H.; Lan, H.; Lin, H.; Yang, B.; Ko, C.; Murase, Y.
Quantification for Saponin from a Soapberry (Sapindus mukorossi Gaertn) in Cleaning
Products by a Chromatographic and two Colorimetric Assays. Journal of the Faculty of
Agriculture Kyushu University, v. 54, p. 215–221, 2009.
Singleton, V. L.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R.M. Analysis of total phenols and other
oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods in
Enzymology, v. 299, p. 152-178, 1999.
94
Shi, Y.; Lan, F.; Matson, C.; Mulligan, P.; Whetstine, J.R.; Cole, P.A.; Casero, R.A.; Shi, Y.
Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Molecular
Cell, v. 119, p. 941–953, 2004.
Shi, Y.J., Matson, C., Lan, F., Iwase, S., Baba, T., and Shi, Y. Regulation of LSD1 histone
demethylase activity by its associated factors. Molecular Cell, v. 19, p. 857–864, 2005.
Shurpalekar, S.R.; Chandrasckhara, M.R.; Swaminathan, M.; Subrahmanyan, V. Chemical
composition and nutritive value of soybean and soybean products. Food Science, v. 10, p.
52-64, 1961.
Shurtleff, W. & Aoyagi, A. William J. Morse: history of his work with soybeans and
soyfoods (1884-1959) - extensively annotated bibliography and sourcebook including
Charles Vancouver Piper and Palemon Howard Dorsett. Soyinfo Center. Lafayette, CA,
2011. Disponível em: <http://www.soyinfocenter.com/pdf/143/Horv.pdf> Acesso em: 3 de
janeiro de 2013.
Sidhu, G.S. & Oakenfull, D.G. A mechanism for the hypocholesterolemic activity of
saponins. British Journal of Nutrition, v. 55, p. 643-649, 1986.
Shurtleff, W. & Aoyagi, A. Friedrich Haberlandt--history of his work with soybeans and
soyfoods (1876-2008): extensively annotated bibliography and sourcebook. Soyinfo
Center. Lafayette, CA, 2008. Disponível em: <
http://www.soyinfocenter.com/pdf/125/Habe.pdf> Acesso em: 3 de janeiro de 2013.
Silanikove, N.; Perevolotsky, A.; Provenza, F.D. Use of tannin-binding chemicals to assay
for tannins and their negative postingestive effects in ruminants. Animal Feed Science
and Technology, v. 91, p. 69-81, 2001.
Smith, A.K.; Circle, S.J. Processing Soy Flours, Protein Concentrates and Protein
Isolates. In: Soybeans Chemistry and Technology, Smith, K. and J. Circle. AVI Publishing
Co., Westport, CT., p: 339-397, 1976.
Spigno,G; Pizzorno, T.; De Faveri, D. M. Cellulose andhemicelluloses recovery from grape
stalks. Bioresource Technology, v. 99, p. 4329–4337, 2008.
Taie, H. A. A.; El-Mergavi, R.; Radwan, S. Isoflavonoids, flavonoids, phenolic acids
profiles and antioxidant activity of soybean seeds as affectedby organic and bioorganic
fertilization. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences, v. 2, p.
207-213, 2008.
Taiz, L.; Zeiger, E. Fisiologia vegetal. Artmed, p. 449-484, 2004.
Taylor, S. L. & Kabourek, J. L. Soyfoods and allergies: separating fact from fiction. The
Soy Connection, v. 11, 2003.
95
Topping, D. .L.; Trimble, R. P. Illman, R. J. Prevention Of Dietary Hypercholesterolemia
In Rat By Soy Flour High And Low In Saponins. Nutrition Reports International, v. 22, p.
1513-1519, 1980.
Turkmen, N.; Sari, F. & Velioglu, Y. S. Effect of extraction solvents on concentration and
antioxidant activity of black and black mate. Advances in Biomedical Research, v. 364, p.
1790-5125, 2006
Tsukamoto, Y., K. Morigiwa, M. Ueda and P. Sterling, 2001. Microcircuits for night vision
in mouse retina. Journal Neuroscience,v. 21, p. 8616-8623, 2001.
Tsao R.; Deng Z. Separation procedures for naturally occurring antioxidant
phytochemicals. Journal of Chromatography B, v. 812, p. 85–99, 2004.
Zhang, W. & Popovick, D. G. Chemical and Biological Characterization of Oleanane
Triterpenoids from Soy. Molecules. v. 14, p. 2959-2975, 2009.
Zauberas, R. T.; Gomes, P. L. S.; Diniz, Bosch, C. A. R. Planejamento estatístico de
experimentos aplicado ao desenvolvimento de formulações para revestimentos
cerâmicos Statistical design of experiments applied to the development of formulation. v.
50, p. 33-37, 2004.
Werdman, J.J.; Fordyce, E.J. Soy products and the human diet. American Journal of
Clinical Nutrition, v. 49, p. 725-737, l989.
Wang, H. & Murphy, P. Isoflavone content in commercial soybean foods. Journal of
Agriculture and Food Nutrition, v. 42, p. 1666-1673, 1994.