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CENTRO UNIVERSITÁRIO CESMAC
ANARELLE GONÇALVES DE AZEVEDO
POTENCIALIZAÇÃO DA AÇÃO DE ANTIFÚNGICOS COM EXTRATO AQUOSO DE ALHO (ALLIUM SATIVUM) FRENTE
A ESPÉCIES DE Candida
MACEIÓ - AL
2017/2
ANARELLE GONÇALVES DE AZEVEDO
POTENCIALIZAÇÃO DA AÇÃO DE ANTIFÚNGICOS COM EXTRATO AQUOSO DE ALHO (ALLIUM SATIVUM) FRENTE
A ESPÉCIES DE Candida
Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito parcial, para conclusão do curso de Biomedicina do Centro Universitário Cesmac, sob a orientação da professora Aryanna Kelly Pinheiro Souza.
MACEIÓ – AL
2017/2
AGRADECIMENTOS
Dedico essa concretização a Deus!
Por ser luz e amparo em todos os momentos e por ter estabelecido vínculos tão especiais
durante meu percurso como graduanda!
POTENCIALIZAÇÃO DA AÇÃO DE ANTIFÚNGICOS COM EXTRATO AQUOSO DE ALHO (ALLIUM SATIVUM) FRENTE A ESPÉCIES DE Candida
THE POTENTIALIZATION OF THE ANTIFUNGAL ACTION OF THE AQUEOUS EXTRACT OF GARLIC (ALLIUM SATIVUM) FRONT OF CANDIDA SPECIES
Anarelle Gonçalves de Azevedo¹;
Aryanna Kelly Pinheiro Azevedo²
1. Acadêmica em Biomedicina pelo Centro Universitário CESMAC.
2. Docente, orientadora do Centro Universitário CESMAC.
RESUMO
Leveduras do gênero Candida são patógenos oportunistas rotineiramente isolados em pacientes imunocomprometidos, na qual a sua resistência às drogas antifúngicas tem aumentado nos últimos anos tornando-se necessária a pesquisa por novos fármacos, sendo assim, o objetivo deste estudo foi verificar a potencialização da ação de antifúngicos com extrato aquoso de alho (Allium sativum) frente a espécies de Candida. Para isso, foram obtidas cepas de isolados clínicos de Candida albicans, Candida tropicalis e Candida krusei cedidas por um laboratório particular de Maceió-AL. As espécies foram testadas frente aos antifúngicos fluconazol, cetoconazol, itraconazol associados ao extrato aquoso de alho utilizando-se a técnica de disco difusão em ágar saboraud dextrose. Ambas as espécies demonstraram-se ser sensíveis dose dependente, necessitando da possibilidade de novos estudos para a inclusão de produtos naturais nas drogas de uso terapêutico.
Palavras-chave: Antifúngico. extrato aquoso de alho. resistência. terapia alternativa.
ABSTRACT
Yeasts of the genus Candida are opportunistic pathogens routinely isolated in immunocompromised patients, in which their resistance to antifungal drugs has increased in recent years, making it necessary to investigate new drugs, thus, the objective of this study was to verify the potentiation of the action of antifungal agents with aqueous extract of garlic (Allium sativum) against Candida species. For this, strains of clinical isolates of Candida albicans, Candida tropicalis and Candida krusei were obtained from a private laboratory in Maceió-AL. The species were tested against the antifungal fluconazole, ketoconazole, itraconazole associated with the aqueous garlic extract using the disk diffusion technique in saboraud agar dextrose. Both species have been shown to be sensitive dose dependent, necessitating the possibility of further studies for the inclusion of natural products in drugs for therapeutic use.
Keywords: Antifungal. aqueous extract of garlic. resistance. alternative therapy.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 7
2. METODOLOGIA ..................................................................................................... 8
2.1 TIPO DE ESTUDO ................................................................................................ 8
2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS FÚNGICAS ......................................................... 8
2.3 OBTENÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE ALHO ................................................. 8
2.4 ANTIFÚNGICO E O TESTE DE ASSOCIAÇÃO COM EXTRATO DE ALHO ........ 8
2.5 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS .............................................................. 9
3. RESULTADOS ...................................................................................................... 10
4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 10
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 12
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 13
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1. INTRODUÇÃO
O gênero Candida é constituído de aproximadamente 200 diferentes espécies
de leveduras, sendo estes, patógenos oportunistas frequentemente isolados das
mucosas de indivíduos normais (DALAZEN et.al., 2011). As principais espécies de
interesse clínico são Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, e C. tropicalis
(CASTRO et.al., 2006).
Em pacientes imunodeprimidos podem causar infecção conhecida como
candidíase ou candidose, em diversos sítios anatômicos. Entre as infecções
invasivas, é importante citar a relevância clínica dos casos de infecção de corrente
sanguínea, progressão conhecida como candidemia ou candidíase hematogênica
(ÁLVARES et.al., 2007).
Candida albicans é a espécie mais frequente, responsável por 50 a 70% de
todas as infecções invasivas por este patógeno. É um fungo dimórfico, que se
apresenta sob formas leveduriformes (blastoconídios) no estado saprofítico, estando
associado à colonização assintomática; ou como formas filamentosas (pseudo-hifas
e hifas verdadeiras), observadas em processos patogênicos. Em condições de
crescimento adequadas, pode ocorrer a formação de clamidosporos (LOYOLA et.al.,
2013).
A resistência aos antifúngicos pode ocorrer quando células de fungos
susceptíveis passam a ser resistentes devido ao contato prévio com a droga ou é
inerente ao próprio microrganismo. Esta resistência ocorre quando há alterações em
genes que reduzem o acúmulo intracelular do medicamento e a inativação da
mesma (SILVA et.al., 2012).
O Allium sativum é uma planta herbácea pertencente à família Liliaceae e
constitui uma das 600 espécies dentro do gênero Allium caracterizada por um bulbo
dividido em bulbilhos (BAND et.al., 2010). Análises dos constituintes fitoquímicos do
alho revelaram a presença de proteínas, ácidos graxos, carboidratos, flavonoides,
vitaminas e saponinas esteroidais com considerável ação terapêutica (FONSECA
et.al., 2014). O alho apresenta componente antifúngico denominado, ajoene. Sua
alta concentração de zinco, selênio e outras substâncias favorecem o aumento da
produção de células do sistema humoral, melhorando também o sistema
imunológico (RODRIGUES et.al., 2009).
8
Assim, frente à resistência das espécies de Candida aos antifúngicos
sintéticos observa-se o uso de produtos naturais, na tentativa de obter-se melhor
desempenho sobre tais microorganismos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi
verificar a potencialização da ação de antifúngicos com extrato aquoso de alho
(Allium sativum) frente a espécies de Candida.
2. METODOLOGIA
2.1 Tipo de Estudo:
Estudo experimental.
2.2 Obtenção das amostras fúngicas:
Obteve-se as seguintes cepas de isolados clínicos: Candida albicans,
Candida tropicalis e Candida krusei, cedidas por um laboratório particular de Maceió-
AL. As amostras foram etiquetadas e transportadas em caixa de isopor, para o
Laboratório Escola de Farmácia e Análises Clínicas do Centro Universitário
CESMAC.
2.3 Obtenção do extrato aquoso de alho:
Foram utilizados 13g de alho, em seguida, foram acrescidos 65mL de água
fervida, deixando em repouso por 24 horas. Após o tempo mencionado, os resíduos
foram coados em um funil de vidro contendo algodão estéril em seu interior e
submetidos ao mesmo processo, com o tempo de 12 horas. Posteriormente,
juntaram-se ambos os líquidos para aquecimento em chapa elétrica (temperatura
aproximadamente 75ºC) até conseguir o extrato. Em seguida, o extrato foi submetido
a um processo de filtragem, nitrocelulose (0,22 μm) estéril, sendo retirada uma
alíquota e semeada em ágar nutriente para avaliar a esterilização (ALMEIDA et al.,
2013; Oliveira et al., 2016). Ao final do processo obteve-se uma concentração de
0,1g/L.
2.4 Antifúngico e o teste de associação com extrato de alho:
Após a obtenção dos extratos, realizou-se a técnica Kirby-Bauer, o teste de
susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA) onde preconiza-se o semeio em tapete
da suspensão dos microorganismos, correspondentes a 0,5 da escala de McFarland,
9
em placas de ágar sabouraud dextrose, com o auxílio de swab. Os testes foram
realizados com discos impregnados com fluconazol (25ug/mL), cetoconazol
(15ug/mL), itraconazol (30ug/mL), também utilizou-se a associação de cada
medicamento com o extrato de alho, e um disco contendo apenas o extrato puro,
respectivamente.
Os discos de papel filtro foram inoculados nas concentrações dos antifúngicos
e no extrato de alho e posteriormente colocados sobre o semeio da suspensão das
espécies de Candida.
2.5 Interpretação dos resultados:
Para interpretação dos resultados foram utilizados como parâmetro dos halos
inibitórios os valores sugeridos pelo NCCLS (Clinical and Laboratory Standards
Institute) M44-A como concentração inibitória mínima (CIM). As amostras de
Candida sp. foram interpretadas conforme os parâmetros da tabela 1.
Tabela 1: Interpretação da variação dos halos frente aos antifúngicos utilizados.
Antifúngico
Variação do Halo (mm)
Sensível Sensível dose
Dependente (SDD)
Resistente
Fluconazol
≥19
18-15
≤14
Cetoconazol
≥ 28
27-21
≤ 20
Itraconazol
≥23
22-14
≤ 13
Fonte: NCCLS M44-A
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3. RESULTADOS
Tabela 2: Média dos halos de inibição em triplicata dos antifúngicos fluconazol,
cetoconazol e itraconazol em milímetros associados ou não ao extrato aquoso de
alho.
Antifúngicos e
Associações
Candida
albicans
Candida
tropicalis
Candida
Krusei
Fluconazol 0mm 0mm 13mm
Fluconazol + alho 0mm 0mm 16mm
Itraconazol 0mm 9mm 22mm
Itraconazol + alho 9mm 17mm 27mm
Cetoconazol 21mm 25mm 32mm
Cetoconazol + alho 16mm 21mm 37mm
Allium sativum 0mm 5mm 18mm
Fonte: Dados da pesquisa.
4. DISCUSSÃO
A espécie Candida albicans quando inoculada ao antifúngico Cetoconazol não
associado, apresentou maior eficácia, sendo sensível a dose dependente.
Efetivando uma média aritmética (µ) de 28,7 e quando associada mostrando uma (µ)
de 24,3.
Com relação a Candida tropicalis, a associação do Itraconazol com o extrato
de alho mostrou-se estatisticamente significativa, no entanto pelo padrão de
interpretação do documento NCCLS M44-A, o mesmo mostrou-se sensível a dose
dependente. Apresentando uma (µ) de 9,0 e quando vinculada a combinação ao
extrato de alho obteve-se uma (µ) de 17,0.
Para a espécie Candida krusei o antifúngico Fluconazol associado ou não
com o extrato de alho, não apresentou diferença estatística. Considerando o
sensível dose dependente mediante aos resultados obtidos: (µ) 13,2 e quando
associado (µ) 16,0. O mesmo aconteceu com o antifúngico Cetoconazol, onde a
média do tamanho dos halos, mostraram-se semelhantes, não havendo diferença
estatística: (µ) 32,7 e associado (µ) 32,7.
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Este experimento obteve resultados, demonstrando que o extrato aquoso de
alho possui propriedades antifúngicas, no entanto, o mesmo apresenta a
necessidade de novos estudos, para poder ser incluso em terapias alternativas para
espécies de Candida.
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5. CONCLUSÃO
O resultado do experimento foi satisfatório demonstrando que há princípio
ativo no Allium sativum para as espécies de Candida. Por conseguinte, para a
espécie Candida albicans, não houve a potencialização do extrato aquoso de alho,
mas sim sua inibição quando associada. Para a espécie Candida tropicalis pôde ser
avaliada após o teste, o aumento do halo de inibição após junção ao extrato, no
entanto, após verificação estatística o mesmo mostrou-se ser sensível dose
dependente de acordo com os parâmetros do documento NCCLS M44-A. O mesmo
aconteceu para a espécie Candida krusei. Efetivando príncipio ativo no alho para as
espécies fúngicas, mas padecendo de novas metodologias para a inclusão de
produtos naturais, como extratos de temperos na função de agentes de uso
terapêutico para a espécie Candida tropicalis e Candida krusei.
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REFERÊNCIAS
ÁLVARES, CA. et.al. Candidíase vulvovaginal: fatores predisponentes do hospedeiro e virulência das leveduras. J Bras Patol Med Lab, v. 43 , n. 5, p. 319-327, 2007.
ALMEIDA GD. et al. Extrato aquoso de Allium sativum potencializa a ação dos
antibióticos vancomicina, gentamicina e tetraciclina frente Staphylococcus
aureus. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. Minas Gerais, v 34, n
4, 2013.
BAUER, AW. et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single
disk method. Am. J. Clin. Pathol. v.36, p.493-496, 1966.
BAND, SC. et.al. Extratos de alho e alecrim na indução de faseolina em feijoeiro e fungitoxicidade sobre Colletotrichum lindemuthianum. Ciência Rural, Santa Maria, v.40, n.9, p.1881-1887, set, 2010. CASTRO, TL. et.al. Mecanismos de resistência da Candida sp wwa antifúngicos. Infarma, v.18, nº 9/10, 2006. DALAZEN, D., et.al. Comparação do perfil de suscetibilidade entre isolados clínicos de Candida spp. orais e vulvovaginais no Sul do Brasil. J Bras Patol Med Lab, v. 47 , n. 1, p. 33-38, 2011. FONSECA, MG., et al. Avaliação da atividade antimicrobiana do alho (Allium sativum Liliaceae) e de seu extrato aquoso. Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.16, n.3, supl. I, p.679-684, 2014. Loyola, ABAT. et.al. Ocorrência e perfil de suscetibilidade de Candida sp em hemoculturas de um hospital universitário. Medicina, Ribeirão Preto, 46(4): 398-403, 2013. OLIVEIRA, GKGO., et.al. Atividade atibaciteriana e antifúngica de temperos e eras utilizados na culinária brasileira. Maceió, UNIT, 2016 (Comunicação entre autor). SILVA, S., Candida glabrata,Candida parapsilosis andCandida tropicalis: biology, epidemiology,pathogenicityand antifungal resistance. FEMS Microbiol Re, v.36 288–3, 2012. RODRIGUES, MM. Avaliação in vitro da atividade antifúngica do Allium sativum sobre cepas de candida albicans Isoladas de cavidade bucal. R. Periodontia, V. 19, N. 02, 2009.