Extrao e Purificao de ProtenasExistem muitas protenas diferentes em uma nica clula. Para estudar detalhadamente as caractersticas de uma protena necessrio obter uma amostra homognea que consista apenas o tipo de molcula que se quer analisar. A separao e o isolamento, ou purificao de protenas, so etapas que devem ser realizadas para obter a protena em estudo isolada de outros contaminantes. medida que os passos da purificao so executados, feita uma tabela de recuperao e pureza da protena para verificar o que foi ganho.Exemplo de um Esquema de Purificao de Protenas: Purificao da Enzima Xantina Desidrogenase de um Fungo Frao V Pr At Ati Porcenta Fat olume otena ividade vidade gem de or de (mL) Total Total Especfica Recuperao Purificao (mg) 1. Extrato 3 22. 2. 0,1 0,1 100 bruto .800 800 460 08 08 2. Precipitado 1 2.8 1. 0,4 3,9 em sal 65 00 190 25 48 4 3. Cromatografia de 6 10 72 16, troca nica 5 0 0 7,2 29 94 4. 4 14, 55 38, 5,3 Cromatografia de 0 5 5 3 23 2 peneira molecular 5. Cromatografia de 27 152 3,9 imunoafinidade 6 1,8 5 ,108 11 9 CAMPBELL, Mary K. e FARRELL, Shawn O. Bioqumica, vol. 1.

Etapas para extrao de protenas O mtodo a ser aplicado depende das caractersticas mecnicas do tecido de origem, bem como da localizao da protena na clula. Se a protena de interesse estiver localizada no citosol da clula, sua liberao exige apenas o rompimento (lise) das clulas. Isso pode ser feito atravs do mtodo mais simples de rompimento da clula, o mtodo de lise osmtica, onde as clulas so suspendidas em uma soluo hipotnica e se rompem depois de um tempo devido grande quantidade de gua que entra nas clulas. Porm, esse mtodo no eficaz nas clulas que contm parede celular, sendo necessrio usar outros mtodos para essas clulas. O uso de enzimas, como a lisozima, que degrada quimicamente a parede celular bacteriana, s vezes eficaz para essas clulas. Detergentes e alguns solventes orgnicos, como a acetona ou tolueno, tambm so teis para lisar clulas, mas deve-se tomar certo cuidado para que no desnature as protenas de interesse. Mtodos mecnicos de lise celular tambm podem ser utilizados, como o uso de um homogeneizador (um tubo de vidro dentro do qual o tecido esmagado com o uso de um pisto que se encaixa de forma justa no interior do tubo), uma prensa francesa (um

aparelho que cisalha as clulas esguichando-as sob alta presso atravs de um pequeno orifcio, arrebentando-as), ou um sonicador (que rompe as clulas por meio de vibraes ultra-snicas). Caso a protena esteja em complexos subcelulares, como complexo de Golgi ou mitocndrias, uma purificao considervel da protena pode ser obtida separando-se o complexo subcelular do resto do material da clula. Isso pode ser feito por centrifugao diferencial, um processo em que o lisado celular centrifugado em uma velocidade que remove apenas os componentes celulares que so mais densos do que aquele que se deseja isolar, seguida de uma centrifugao a uma velocidade que sedimenta a protena de interesse. medida que o homogenato celular submetido a foras g crescentes, diferentes componentes celulares terminam no pellet. Salting out O seguinte mtodo o salting out, onde a protena que se quer isolar separada do componente subcelular por meio da extrao com solues salinas concentradas. A adio de sal, geralmente sulfato de amnio, na soluo faz com que parte da gua ligada s protenas seja removida para que haja uma ligao on-dipolo entre o sal e a protena. Deste modo, as protenas que estavam dissolvidas na soluo ficam retidas nos sais. Com menos gua entre si, as protenas comeam a se interagirem (ligaes hidrofbicas) e formam um precipitado no tubo. O precipitado retirado por filtrao. Dilise A dilise, processo de precipitao de protenas, ocorre ao retirar o sal que est aderido s protenas, coloca-se a soluo com protenas a purificar em um saco de dilise membrana formada de substncias altamente polimerizadas que constituem uma peneira molecular que depois mergulhado em uma soluo hipotnica. Por efeito da difuso simples, os sais de sulfato de amnio, que esto em maior concentrao no saco de dilise iro passar pela membrana (que no permite a passagem de protenas) para o meio hipotnico, a fim de estabelecer o equilbrio de concentraes. Ao atingir o equilbrio, a soluo onde est o saco de dilise substituda por mais outra soluo hipotnica, e vai repetindo o mtodo at que na soluo com as protenas tenha a menor quantidade de sal possvel. Como resultado desta etapa obtm-se uma soluo com protenas parcialmente puras. Cromatografia Nesta tcnica, uma mistura de substncia a ser fracionada dissolvida em um fluido lquido ou gasoso, conhecido como fase mvel. A soluo resultante percolada atravs de uma coluna contendo uma matriz slida, denominada fase estacionria. A interao de cada um dos solutos com a fase estacionria age de forma a retardar o seu fluxo pela matriz, e a maneira com que isso ocorre varia conforme as propriedades do soluto e as caractersticas da matriz. Dependendo da escolha da coluna, as protenas podem ser separadas de acordo com a sua carga (IEX cromatografia de troca inica),

sua hidrofobicidade (HIC cromatografia de interao hidrofbica), seu tamanho (GF filtrao em gel) ou pela sua capacidade de se ligar a grupos qumicos particulares. A cromatografia de troca inica consiste na aplicao de um pequeno volume da soluo protica a purificar no topo da coluna preenchida com um trocador de ons, e a coluna lavada com uma soluo tampo de baixa salinidade. Atravs do processo de eluio quando a coluna vai sendo lavada com o tampo as protenas com afinidade relativamente baixa pelo trocador movem-se mais rapidamente pela coluna do que as protenas que se ligam ao trocador de ons com afinidades mais altas. Logo, as protenas com maior afinidade ao trocador de ons (de carter positivo ou negativo) iriam sair da coluna por ltimo. Aps a primeira eluio, faz-se outra aplicando um tampo com maior salinidade, onde os sais iro quebrar as ligaes das protenas e do trocador de ons por competio. Para retirar o sal da soluo protica utiliza-se a etapa da dilise. Para identificar quais dos tubos que possuem a soluo esto com protenas, faz-se o teste de absorvncia de UV em comprimentos de onda especficos (280nm para protenas [pois cadeias aromticas de His, Phe, Trp e Tyr apresentam alta absorvncia nesses comprimentos de onda]), e se necessrio, podem ser detectadas por suas atividades enzimticas biolgicas. A Cromatografia de Gel Filtrao, tambm chamada de peneira molecular ou cromatografia por excluso de tamanho, separa as molculas de acordo com o tamanho. A fase estacionria consiste em um gel formado por esferas de um material hidratado e espongiforme (geralmente dextrana, agarose ou poliacrilamida) contendo poros que abrangem uma faixa de tamanho molecular j conhecido, geralmente de tamanho bem pequeno. Ao adicionar a soluo protica na matriz e posteriormente o solvente, as molculas grandes iro passar pela matriz com mais rapidez que as molculas menores, isso porque as molculas menores ficam retidas nos poros das esferas do gel. Logo, molculas maiores ficariam nos primeiros tubos de coleta da soluo filtrada. A cromatografia de afinidade baseia-se nas funes biolgicas da protena que se liga coluna. O tipo mais comum envolve um ligante (pequena biomolcula especfica, por exemplo, anticorpo), que imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a celulose ou poliacrilamida. A protena a analisar passa depois atravs da coluna e liga-se a ela pelo seu ligante, enquanto que outras protenas passaro normalmente at sarem da coluna. A separao da protena alvo normalmente feita, atravs da competio entre ligantes e protenas, que pode ser feita adicionando mais ligantes soluo. Isto um mtodo muito eficiente de purificao, uma vez que se baseia numa especificidade biolgica da protena que se pretende analisar, tal como a afinidade de uma enzima a um substrato ou a ligao entre antgeno e anticorpo.